CN102471774B

CN102471774B - 包含甘露糖启动子的载体和甘露糖启动子

Info

Publication number: CN102471774B
Application number: CN201080035390.6A
Authority: CN
Inventors: 孙天齐; J·埃尔滕布克纳; C·基茨亚克
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2030-08-02
Also published as: MX2012001672A; US20120202246A1; EP2284273B1; AU2010283807A1; JP5794985B2; BR112012002973B1; DK2284273T3; EA032045B1; KR20120040740A; TW201111504A; ES2394668T3; MX317816B; EP2284273A1; IL218025A0; US9163247B2; CL2012000363A1; BR112012002973A2; EA201200186A1; WO2011018376A1; CA2770557C

Abstract

本发明涉及在原核宿主中可表达的载体，和包含枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子的甘露糖可诱导启动子的核酸序列，其中所述载体和核酸序列可分别适合用于转化宿主细胞以表达编码多肽的异源核酸序列，尤其是在高细胞密度发酵中。

Description

包含甘露糖启动子的载体和甘露糖启动子

本发明涉及在原核宿主细胞中可表达的载体，其包含甘露糖可诱导的启动子，该启动子用于，编码例如多肽、例如重组蛋白的核酸的异源表达。

具体地，本发明涉及用于在宿主中异源表达的新的载体，其包含可操作地连接于转录单元的甘露糖操纵子的启动子区，所述转录单元包含对于所述宿主而言为异源的核酸序列，而所述核酸序列的表达受到所述甘露糖操纵子的启动子区的控制。此外，本发明涉及这些载体用于异源表达编码例如多肽、例如重组蛋白的核酸的用途。

已经描述了很多用于在原核系统中异源表达编码例如多肽的核酸(结构基因)的系统。为此，以包含可操作地连接于启动子的目标结构基因的核酸序列的载体转化宿主，所述启动子是能够使结构基因被转录的核酸序列。通过适当的诱导，启动子被激活并允许结构基因的转录。诱导可以在阴性或阳性控制下。

在阴性控制诱导中，阻抑子与启动子结合并阻止结构基因的转录。如果存在合适的诱导子，则阻抑子被失活而转录被允许。

在阳性控制诱导中，当与激活子结合之后，启动子被激活，其中激活子与启动子的结合由合适的诱导子介导。

典型的诱导子可以是：原核宿主代谢所需的底物，例如，不同种类的糖。

本发明涉及阳性可诱导系统，其中，在存在适当的底物即诱导子时，激活子与启动子结合，这会启动可操作地连接于所述启动子的基因的转录。

到目前为止，原核宿主系统中的多数异源基因表达系统都专有性地依赖于细菌启动子的有限的集合。所以，可以用作诱导子的底物的数目也是有限的。

此外，异源表达系统的产率依赖于可利用的经转化的原核宿主的数目。因此，需要能够生长至高细胞密度的原核宿主系统，即，允许快速增殖而不在细胞分裂时丧失载体。

发明内容

根据本发明，通过提供下列新的载体而实现了这些和其它目标，其将通过以下说明书而变得明显，所述新的载体包含可操作地连接于转录单元的甘露糖操纵子的启动子区，所述转录单元包含对于所述宿主而言为异源的核酸序列，而所述核酸序列的表达受到所述甘露糖操纵子的启动子区的控制。

还提供了所述新的载体用于核酸序列在原核宿主中的受控的异源表达的用途；在宿主中可表达的分离且纯化的核酸序列，其包含甘露糖操纵子的启动子区；以所述载体或所述分离且纯化的核酸序列转化的原核宿主；使用所述载体或所述分离且纯化的核酸序列在宿主中生产多肽的方法；以及以所述载体或所述分离且纯化的核酸序列转化的原核宿主在发酵、特别是高细胞密度发酵中的用途。

通过参考随附的示例性附图和随附的权利要求，通过阅读以下详细描述，其它方面和优点对于本领域技术人员将会变得明显。

附图说明

图1：用于绘制manP启动子的转录起始位点的来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的核酸序列，其中腺嘌呤核苷酸处的转录起始位点以高亮标示，推导的-35和-10盒以斜体标示，manR的终点和lys基因的起点以箭头标示，限制性位点BglII、XbaI、AflII和NdeI以下划线标示。

图2：包含manP启动子的启动子区的核酸序列，鸟嘌呤核苷酸处的转录起始位点以高亮标示，推导的-10和-35盒以斜体标示，manR基因的起点以箭头标示，HindIII限制性位点和推定的cre序列以下划线标示。

图3：分别包含于pSUN291、pSUN384.1和pSUN385.2中的获自枯草芽孢杆菌的核酸序列，所述序列包含manR启动子的启动子区，lacZ的起点以箭头标示，限制性位点以下划线标示。

图4：根据本发明的表达载体pSUN279.2的质粒图谱。

图5：包含根据本发明的质粒pSUN279.2、pSUN284.1或pSUN291的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性。

图6：获自枯草芽孢杆菌的核酸序列，其包含来自枯草芽孢杆菌的manP启动子的启动子区，包括manR的C-末端，manR与manP之间的基因间区域被报告基因lacZ替换，转录起始位点，-35和-10盒以粗体标示，manR的终点和lacZ的起点以箭头标示，限制性位点以下划线标示。

图7：含有质粒pSUN279.2以及如图6所示的含有不同长度的核酸序列片段的其它质粒的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性。

图8：含有具有如图3所示的核酸序列的载体pSUN291、pSUN384.1或pSUN345.2的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性。

图9：根据本发明的表达载体pMW168.1的质粒图谱。

图10的图显示了枯草芽孢杆菌3NA中pMW168.1的质粒稳定性测试结果，其中含有质粒的细胞的procental部分相对于世代数作图。

图11-14的图显示了在运行1至运行4中，干生物质浓度相对于发酵持续时间的对数作图，以及在发酵运行1至运行4中，荧光信号(RFU)相对于发酵持续时间的作图。

图15和16的图是在发酵运行5和运行6中，荧光信号相对于发酵持续时间的作图。

图17：根据实验4a“质粒pMW168.1的构建”而获得的启动子起始区的示意结构。

图18：质粒pMW168.1的构建流程图；和

图19：SDS page图。

发明详述

如本文所使用，提供了以下定义以促进理解本发明。

“在宿主中可表达的载体”或“表达载体”是重组或合成产生的多核酸构建体，其具有允许在宿主细胞中转录特定核酸序列的一系列指定的多核酸元件。通常而言，这种载体包括转录单元，其包含可操作地连接于启动子的待转录的特定核酸序列。在宿主中可表达的载体可以是例如自主或自我复制性质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。

术语“宿主”、“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可相互替换地使用，是指其中导入了本发明的一种或多种载体或分离且纯化的核酸序列的原核细胞。要理解，此类术语不仅是指特定的主题细胞，而且是指此类细胞的子代或潜在子代。由于突变或环境影响，在随后的世代中可能发生某些修饰，所以，此类子代事实上可能与亲代细胞不同，但是仍然包括在如本文使用的术语的范围内。

术语“包括”一般意义是“包括”，也就是说，允许存在一个或多个其它特征或成分。

如本文使用的“启动子”是指控制转录单元之表达的核酸序列。“启动子区”是能够与细胞中的RNA聚合酶结合并起始下游(3’方向)编码序列之转录的调节区。在启动子区内有负责结合RNA聚合酶的蛋白结合结构域(共有序列)，例如推定的-35盒和Pribnow盒(-10盒)。此外，启动子区可以包含转录起始位点和调节蛋白的结合位点。

“甘露糖操纵子”是指枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子。在甘露糖操纵子中鉴定了3个基因(Kunst F.N.等人，“The complete genomesequence of gram-positive bacterium Bacillus subtilis”，Nature 390，pages 249 to 256(1997))。

第一个基因，manP，编码甘露糖特异性酶成分(转运子)，其属于果糖-通透酶家族。第二个基因，manA，编码甘露糖-6-磷酸异构酶，而第三个基因yjdF的功能是未知的。在这3个基因的上游并与它们相同的方向上，有调节基因manR，其编码ManR，ManR是甘露糖操纵子的激活子。

由三个基因manP-manA-yjdF组成的甘露糖操纵子(以下合称“manP”)处于manP启动子控制之下，该启动子本身是阳性调节的。另外一种启动子，manR启动子，负责manR的表达，manR对于manP启动子的甘露糖依赖性诱导是必需的。

manR启动子区还包含manR基因的分解代谢物调节蛋白结合位点(分解代谢物应答元件(cre))。

“Cre序列”是指位于分解代谢基因上游(5’方向)的核酸序列。cre序列结合分解代谢物控制蛋白(CCP)，阻止碳分解代谢物阻抑(CCR)中的分解代谢基因的表达。

“甘露糖操纵子的启动子区”意指调节manP的表达以及具有或不具有cre序列的manR的表达的启动子区。

本文所提及的“manP启动子”至少包括：-35区、Pribnow盒和ManR结合位点。

本文所提及的“manR启动子”至少包括：推定的-35区、Pribnow盒、ManR结合位点和可选的cre序列。

D-甘露糖也被称作“甘露糖”，其是葡萄糖的2-差向立体异构体并且存在于甘露聚糖和异甘露聚糖多糖、糖蛋白和多种其它糖缀合物中。

“CcpA”意思是“分解代谢物控制蛋白A”，其为普遍性调节蛋白，并且能够激活或抑制一些分解代谢操纵子的激活。在甘露糖操纵子的情况下，CcpA通过与cre序列结合而发挥阻抑作用。

“增强子”是增强转录单元之转录的核酸序列，与转录单元的身份、该序列相对于转录单元的位置或该序列的方向无关。本发明的载体可选地可以包括增强子。

如本文使用的“转录单元”是指通常被转录为单一的RNA分子的核酸序列。转录单元可以包含一个基因(单顺反子)或2个基因(双顺反子)或更多个基因(多顺反子)，它们编码功能上相关的多肽分子。

当核酸分子被置于与另一核酸序列有功能上的关系时，其为“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则该启动子与该编码序列可操作地连接；如果转录起始区例如核糖体结合位点的位置是促进多肽的翻译，则该转录起始区例如核糖体结合位点可操作地连接于编码该多肽的核酸序列。可以通过在方便的限制性位点的连接而实现连接。如果此类位点不存在，则根据常规做法使用合成的寡核苷酸适体或接头。

如本发明中提及的“核酸”或“核酸序列”或“分离且纯化的核酸或核酸序列”可以是DNA、RNA或DNA/RNA杂合体。当核酸或核酸序列位于载体中时，其通常是DNA。本文所提及的DNA可以是任何多聚脱氧核苷酸序列，包括例如：双链DNA，单链DNA，双链DNA、其中一条或两条链由两个或更多个片段组成，双链DNA、其中一条或两条链具有连续的磷酸二酯骨架，含有一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA，双链DNA、其中DNA链是完全互补的，双链DNA、其中DNA链仅是部分互补的，环状DNA，共价闭合DNA，线性DNA，共价交叉连接DNA，cDNA，化学合成的DNA，半合成的DNA，生物合成的DNA，天然分离的DNA，酶消化的DNA，剪切的DNA，标记的DNA、例如放射标记的DNA和荧光标记的DNA，含有一个或多个非天然存在的核酸种类的DNA。DNA序列可以通过标准化学技术合成，例如，磷酸三酯法或通过自动化合成方法和PCR方法。纯化且分离的DNA序列也可以通过酶学技术产生。

本文提及的RNA可以是例如单链RNA，cRNA，双链RNA，双链RNA、其中一条或两条链由两个或更多个片段组成，双链RNA、其中一条或两条链具有连续的磷酸二酯骨架，含有一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的RNA，双链RNA、其中RNA链是完全互补的，双链RNA、其中RNA链仅是部分互补的，共价交联的RNA，酶消化的RNA，剪切的RNA，mRNA，化学合成的RNA，半合成的RNA，生物合成的RNA，天然分离的RNA，标记的RNA、例如放射标记的RNA和荧光标记的RNA，含有一个或多个非天然存在的核酸种类的RNA。

“变体”或“序列的变体”意指与参考序列相差保守性核酸置换的核酸序列，其中一个或多个核酸被置换为具有相同性质的其它核酸。变体还包括简并序列，具有删除和插入的序列，只要此类修饰序列显示出与参考序列相同的功能(功能上等价)。

如本文使用的术语“多肽”、“肽”、“蛋白”、“多肽的”和“肽的”可相互替换地使用，它们是指通过α氨基与相邻残基的羧基之间的肽键彼此连接起来的一系列氨基酸残基。

术语“分离且纯化的核酸序列”是指根据本发明的核酸序列所处的状态。核酸序列将不含或实质上不含天然与其结合的物质，例如在它们的天然环境下或它们的制备环境(例如细胞培养物，当此类制备物是通过重组技术在体外或体内进行时)下与其共存的其它核酸。

术语“转化”、“转化的”或“将核酸导入宿主细胞”意思是：细胞外的核酸例如载体(其具有或不具有伴随它的物质)进入宿主细胞的任何过程。术语“转化的细胞”意思是其中导入了细胞外的核酸、并因此携带所述细胞外的核酸的细胞或其子代。所述核酸可以导入细胞中使得该核酸可作为染色体整合物或作为染色体外元件复制。使用例如表达载体转化适当的宿主细胞可以通过熟知的方法进行，例如微注射、电穿孔、颗粒轰击或通过化学方法，例如磷酸钙介导的转化，描述于例如Maniatis等人1982，Molecular Cloning，A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory或Ausubel等人1994，Currentprotocols in molecular biology，John Wiley and Sons。

“异源核酸序列”或“异源于宿主的核酸序列”意思是编码对于宿主而言为异源的表达产物(“异源表达”或“异源产物”)例如多肽的核酸序列，即源自不同于宿主的供体的核酸序列或化学合成的核酸序列，它们编码对于宿主而言为异源的表达产物例如多肽。当宿主是特定的原核物种时，异源核酸序列优选源自不同的属或科，更优选来自不同的目或纲，特别是来自不同的门(division)，最特别是来自生物的不同的界(empire)。

在导入宿主细胞之前，源自不同于宿主的供体的异源核酸序列可以被修饰，修饰是通过突变、插入、删除或置换单一核酸或异源核酸序列的一部分，只要此类修饰的序列显示出与参考序列相同的功能(功能上等价)。本文所提及的异源核酸序列还包括源自生物的不同的界(empire)的核酸序列，例如来自真核生物的(真核起源的)，例如已被用于噬菌体显示文库的人类抗体，以及其中的单一核酸或核酸序列的一部分已经根据原核宿主的“密码子使用情况”被修饰的那些。

在本发明的意义内，术语“异源核酸序列”或“异源于宿主的核酸序列”还包括衍生于宿主并编码在该宿主中天然表达的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列被插入到本发明的载体中并处于本发明的甘露糖操纵子的启动子区控制下。

“转录起始区”是促进转录起始的信号区，其包含用于核糖体结合位点的序列，例如Shine Dalgarno序列。

通常而言，转录起始区位于转录起始位点的下游，并可操作地连接于待表达的基因。

“转录终止区”是指引起RNA聚合酶终止转录的序列。转录终止区通常是转录单元的一部分，其能够避免其它附近基因的不想要的转录或从其它潜在启动子的转录，并且能够增加mRNA的稳定性。

“抗体”是指：在被抗原刺激之后，由免疫系统的B细胞产生的一类浆蛋白。哺乳动物(例如人类)抗体是IgG、M、A、E或D类别的免疫球蛋白。用于本发明目的的术语“抗体”包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、抗独特型抗体和存在于自身免疫疾病、例如糖尿病、多发性硬化和类风湿性关节炎中的自身抗体以及嵌合抗体。

在一个方面，本发明提供了在宿主中可表达的载体，其包含可操作地连接于转录单元的甘露糖操纵子的启动子区，所述转录单元包含对于该宿主而言为异源的核酸序列，而所述核酸序列的表达受到所述甘露糖操纵子的启动子区的控制。

根据本发明的载体优选为自主或自我复制型质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。宿主/载体的多种组合可用于表达本发明的核酸序列。

例如，有用的表达载体可以由染色体的区段、非染色体和/或合成的核酸序列组成。

合适的载体包括具有特定宿主范围的载体，例如分别特异于例如枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的载体，以及具有宽宿主范围的载体，例如用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的载体。

可以使用“低拷贝”、“中等拷贝”以及“高拷贝”质粒。

例如，在枯草芽孢杆菌中，低拷贝质粒是pAMbeta1，中等拷贝质粒是pBS72衍生物，高拷贝质粒是pUB110。

根据本发明，甘露糖操纵子的启动子区分别包括manR启动子区和manP启动子区。

图1显示了来自枯草芽孢杆菌的核酸序列，包括manR的C末端、manR与manP之间的基因间区域、后跟作为报告基因的溶葡球菌酶基因lys。

包含manP的启动子区的本发明的核酸序列优选包括图1的核酸序列，从bp-80至lys的起始密码子(SEQ ID NO：1)，更优选为图1的核酸序列，从bp-80开始并包括bp-1，即，bp+1处的转录起始位点A的上游(SEQ ID NO：2)。

图2和图3显示了来自枯草芽孢杆菌的核酸序列，包括manR的启动子区，bp+1处的转录起始位点G，推定的cre序列，bp+1与manR之间的转录起始区，以及manR的一部分，其中manR被lacZ替换。包含manR的启动子区的本发明的核酸序列优选包括图3的核酸序列，从bp-122至lacZ的起始密码子(SEQ ID NO：3)，更优选，图3的核酸序列，从bp-122至bp+7，即包括推定的cre序列(SEQ ID NO：4)，特别地，图3的核酸序列，从bp-122至bp-1，即，bp+1处的转录起始位点G的上游(SEQ ID NO：5)。

manP和manR的启动子区都包含ManR的结合位点。本发明还包括互补于SEQ ID NO：1-5任一项的序列及其变体。

用于本发明中的甘露糖操纵子的启动子区，例如manP启动子区、manR启动子区(含有或不含cre序列)以及根据序列SEQ ID NO：1-5的启动子区，其互补序列或其变体，通常是来自枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子或来自其它原核生物的功能等价的启动子区，特别是长杆菌科(bacilaceae)的生物。其它原核生物的功能等价的启动子区包括：可以被D-甘露糖诱导的启动子区，即，相对于不存在甘露糖时，在存在甘露糖时具有更高表达活性的启动子区。

在很多原核生物例如硬壁菌门(Firmicutes)例如枯草芽孢杆菌中，甘露糖操纵子参与D-甘露糖的代谢。

枯草芽孢杆菌可以使用很多不同的糖作为碳源。己糖例如葡萄糖和D-甘露糖主要通过磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)摄取。在PTS中，各个己糖在摄取过程中同时被磷酸化并转运至细胞。特异性糖底物的摄取和利用经历碳分解代谢物阻抑(CCR)。在存在葡萄糖(枯草芽孢杆菌的优选糖底物)的情况下，用于摄取和利用其它底物的基因例如甘露糖操纵子的转录被抑制。

已经广泛地研究了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖依赖性CCR的机制，其是本领域已知的(Stülke J.等人，“Regulation of carbon catabolism inBacillus species”，in Annu.Rev.Microbiol.54，2000，pages 849-880)。

根据本发明的转录单元通常还包括处于所述转录单元的翻译起始点(起始密码子)上游的翻译起始区，而翻译起始区可操作地连接于核酸序列。翻译起始区通常位于转录单元的翻译起始点(可以是ATG、GTG或TTG)的紧接上游。

翻译起始区可以是甘露糖操纵子中的manP基因或manR基因的转录单元的翻译起始区。

甘露糖操纵子的manP基因或manR基因的翻译起始区可以部分或完全被其它翻译起始区替换。例如，可以使用tufA(延伸因子Tu)和gsiB(应激蛋白；Jürgen等人，1998，Mol.Gen.Genet.258，538-545)的翻译起始区，二者都是来自枯草芽孢杆菌。

以下分别显示了tufA和gsiB的核酸序列，起始密码子以粗体标示，限制性位点以下划线标示，Shine-Dalgarno序列以高亮标示。

通过适当选择转录起始区，可以增强mRNA的稳定性，这是基因表达中的重要特征。mRNA的稳定性的特征在于其特异性的半衰期。

除了转录起始区之外，翻译的起始点以及可选地，起始点之后的数个基因密码子，例如大约5-6个密码子，也可以被替换，例如，在如上所示的tufA和gsiB的核酸序列中。

翻译起始区还可以包含编码可操作地连接于本发明的异源核酸序列的信号序列的序列。信号序列通常位于转录单元的翻译起始点(可以是ATG、GTG或TTG)的紧接下游。

在使用双顺反子或多顺反子转录单元的情况下，可以使用可操作地连接于每个顺反子的不同或相同的信号序列。在这种情况下优选使用不同的信号序列。所使用的信号序列可以是原核或真核的信号序列。通常使用原核信号序列。

编码用于本发明的表达载体中的信号序列的DNA序列可以从商业上获得或化学地合成。例如，可以根据固相亚磷酰胺三酯方法合成信号序列，其描述于例如Beaucage&Caruthers，1981，TetrahedronLeHs.22，1859-1862，如Van Devanter et.Al.，Nucleic Acids Res.12：6159-6168(1984)中所描述。寡核苷酸的纯化可以通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC进行，如Pearson&Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中所描述。

转录单元通常还包含转录终止区。

优选地，使用强烈的转录终止区以避免启动子“读通”转录单元后进入侧翼质粒序列以及从其它质粒启动子进入转录单元。此外，在存在此类转录终止区的情况下观察到mRNA的稳定化。

强烈的转录终止区的合适的实例具有来自枯草芽孢杆菌168的tufA的3’区的核酸序列5’-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3’，其是商业上可获得的。

根据本发明的异源核酸序列编码对于宿主而言是外源的表达产物。如果宿主是原核物种，例如枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，则目标核酸序列更优选为来自另一个纲，例如γ变形杆菌纲(proteobacteria)，例如来自例如Burkholderia属，特别是来自不同的门，例如古细菌，最特别是来自真核生物，例如哺乳动物，特别是人类。然而，异源核酸序列可以根据宿主的“密码子使用情况”被修饰。根据本发明的异源序列通常是目标基因。目标基因优选编码异源多肽例如结构性、调节性或治疗性蛋白，或结构性、调节性或治疗性蛋白的N-或C-末端与其它蛋白(“标签”)例如绿色荧光蛋白的融合物或其它融合蛋白。异源核酸序列还可以编码可以以RNA例如反义RNA形式使用的转录物。

蛋白可以以不可溶的聚集物的形式产生，或是以存在于宿主细胞的细胞质或周质空间和/或细胞外培养基中的可溶性蛋白的形式产生。优选地，蛋白以存在于宿主细胞的周质空间和/或细胞外培养基中的可溶性蛋白的形式产生。

目标异源蛋白可以是人类、哺乳动物或原核生物来源的。其它蛋白有：来自微生物(病毒和细菌)病原体以及来自肿瘤的的抗原，例如糖蛋白和碳水化合物。其它蛋白有：酶，例如凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、脱氢酶、核酸酶、葡聚糖酶、氧化酶、α-淀粉酶、氧化还原酶、脂酶、酰胺酶、腈水解酶(nitril hydratase)、酯酶或腈水解酶(nitrilase)。

在本发明中，信号序列和异源核酸序列在表达载体内排列的顺序和间隔可以变化。在优选实施方式中，信号序列在编码例如目标多肽的核酸序列的5’(上游)。信号序列和编码例如目标多肽的核酸序列可以彼此间隔0至大约1000个氨基酸。在优选实施方式中，信号序列和编码例如目标多肽的核酸序列彼此直接相邻，即间隔0个核酸。

优选地，本发明的载体包含根据SEQ ID NO：1-5的任一序列的核酸序列、其互补序列及其变体。

本发明中还包括根据本发明的载体用于核酸序列在原核宿主中的受控异源表达的用途。

表达通过加入合适的诱导子而启动。甘露糖操纵子的诱导子是能够诱导甘露糖操纵子的manR启动子区或manP启动子区的甘露糖或其衍生物。可以通过原核宿主可获得的诱导子的量来调节表达。

在另一个方面，本发明提供了分离且纯化的核酸序列，其包含甘露糖操纵子的启动子区。优选地，分离且纯化的核酸序列包含甘露糖操纵子的manP启动子和/或manR启动子。更优选地，分离且纯化的核酸序列包含SEQ ID NO：1-5的任一序列。包含甘露糖操纵子的启动子区的分离且纯化的核酸序列可以可操作地连接于包含编码多肽的核酸序列的转录单元，其中编码多肽的核酸序列的表达受到甘露糖操纵子的启动子区的控制。

根据本发明的分离且纯化的核酸序列可以包含完整或一部分的调节基因manR的序列。

至少manR启动子的分离且纯化的核酸序列可以包含cre序列。

可以根据本领域熟知的标准的PCR程序和方法来分离本发明的分离且纯化的核酸序列。分离且纯化的DNA序列还可以包含如本领域已知的一个或多个调节序列，例如，增强子，其通常用于表达核酸序列所编码的产物。

为了选择成功且稳定地以本发明的载体或分离且纯化的核酸序列转化的宿主细胞，可以将编码可选择标志物(例如对抗生素的抗性)的基因与目标核酸序列一起导入宿主细胞。编码可选择标志物的基因可以位于载体中或分离且纯化的核酸序列中或可以可选地以单独的形式、例如在单独的载体上而被共同导入。可以使用多种可选择标志物，包括赋予抗生素例如奇放线菌素、潮霉素、氨比西林和四环素抗性的那些。可以按照需要改变抗生素的量以产生选择性条件。通常使用一种可选择标志物。

在载体为穿梭载体的情况下，可以使用对于合适的宿主为普遍性的标志物。例如，在载体为在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都可复制的的穿梭载体的情况下，可以使用编码粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的奇放线菌素-腺苷酰基转移酶的抗性标志物基因，其赋予对奇放线菌素的抗性。

报告基因例如荧光蛋白也可以随着目标核酸序列一起导入宿主细胞中，以确定转化的效率。

合适的报告基因是，例如，编码增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的那些和编码β-半乳糖苷酶的lacZ。这两种报告基因都是商业上可获得的并且是被广泛使用的。

本发明的另一个方面是提供以本发明的载体转化的原核宿主，其中所述载体包含甘露糖操纵子的启动子区。优选地，载体包含SEQ IDNO：1-5的任一项，其互补序列或其变体。

有多种原核宿主细胞可用于被本发明的甘露糖操纵子的甘露糖可诱导的启动子区转化。这些宿主可以包括：革兰氏阳性细胞的菌株，例如芽孢杆菌属和链霉菌属，或革兰氏阴性细胞的菌株，例如大肠杆菌和假单胞菌属。优选地，宿主细胞是革兰氏阳性细胞，特别是硬壁菌门(Firmicutes)，更优选地，宿主细胞是芽孢杆菌属。

可以使用的芽孢杆菌是例如下列菌株：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等。优选地，宿主细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。

可以使用的大肠杆菌是例如菌株TG1、W3110、DH1、XL1-Blue和Origami，它们是商业上可获得的。

合适的宿主细胞是商业上可获得的，例如，从培养物保藏中心，例如DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)获得。例如，芽孢杆菌可以从Bacillus Genetic Stock Center获得。

宿主细胞可以代谢或不代谢甘露糖。通常能够摄取并代谢甘露糖的宿主细胞例如枯草芽孢杆菌可以被修饰以使其缺失与甘露糖的摄取和/或代谢相关的一个或多个功能。可以通过例如抑制或阻断编码蛋白的基因(例如编码甘露糖-6-磷酸-异构酶的manA基因)之表达来实现与甘露糖的摄取和/或代谢相关的一个或多个功能的缺失。这可以通过已知的技术例如转位子支持的诱变或敲除诱变来进行。

通常，原核宿主对应于所选的信号序列，例如，在使用芽孢杆菌的信号序列的情况下，宿主细胞通常是相同的杆菌科的成员，更优选地，宿主细胞是芽孢杆菌菌株。

优选地，使用具有磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)的宿主。特别地，具有PTS系统的宿主是芽孢杆菌目(Bacillales)、特别是芽孢杆菌属的微生物，更优选是枯草芽孢杆菌；或者是肠杆菌目(Enterobacteriales)、优选为埃希氏菌属的微生物，更优选为大肠杆菌。

CCR的主要元件是分解代谢物控制蛋白A(CcpA)，其能够结合cre序列，例如SEQ ID NO：3和4中的推定的cre序列。在各个基因的CcpA转录的结合状态下，manR被抑制。

在不存在葡萄糖和存在诱导子、例如D-甘露糖的情况下，没有通过CcpA的结合造成的抑制，甘露糖操纵子的基因的转录通过调节蛋白(ManR)与甘露糖操纵子的启动子区的结合位点的结合而被启动。

本发明人惊奇地发现，manR不仅是manP启动子区的调节蛋白，而且是manR本身的自我调节子。

本发明还提供了在宿主细胞中产生多肽的方法，包括以下步骤：

a)构建载体，

b)以所述载体转化原核宿主；

c)允许在合适的条件下在细胞培养系统中表达所述多肽；

d)从细胞培养系统中回收所述多肽。

所使用的载体、其构建以及原核宿主的转化如上文所述，而载体中包含的异源核酸序列编码多肽。

作为细胞培养系统，可以使用培养管、摇瓶或细菌发酵器中的连续或不连续培养，例如批式培养或补料分批培养。

为了培养宿主细胞，可以使用本领域已知的常规培养基，例如复合培养基，例如“营养物酵母肉汤培养基(nutrient yeast brothmedium)”，如Kortz等人1995，J.Biotechnol.39，59-65描述的含有甘油的培养基，如Kulla等人，1983，Arch.Microbiol，135，1描述的矿物盐培养基，如Wilms等人，2001，Biotechnol.Bioeng.73，95-103描述的用于大肠杆菌发酵的批式培养基或如Bertram等人，1051，J.Bacteriol.62，293-300描述的LB培养基。

培养基含有合适的碳源，例如糖，例如葡萄糖，作为宿主细胞生长的底物。用作底物的碳源不同于诱导子。

可以视需要对培养基进行改良，例如加入另外的成分，例如缓冲液、盐、维生素、氨基酸、抗生素或其它微量营养素，如本领域技术人员一般所知晓。

在细胞的培养过程中也可以使用不同的培养基或培养基的组合。

优选地，用作基础培养基的培养基中不应该包括诱导子，以实现甘露糖启动子区的严格调控。

可以在培养物达到决定性参数后开始加入诱导子。此类决定性参数的实例有：光密度(OD)，其指示培养物的细胞浓度；或者，碳源的浓度，所述碳源不同于诱导子。

例如，在本发明的方法中，可以在培养物达到合适的OD时加入诱导子，这取决于特定的培养系统。对于摇瓶中的批式培养物，作为决定性参数的典型的OD₆₀₀是大约0.3或更高。

通常，将原核宿主的培养基中的诱导子例如甘露糖的量调节为大约10g/l，优选大约5g/l，更优选大约2g/l。

然而，可以根据特定的发酵过程的需要调整所添加的诱导子的量。

可以根据特定的培养系统选择添加诱导子的方式(诱导方案)。

通过添加模式可以进一步调节宿主细胞的生长速率和表达速率。

例如，可以在合适的时间段内不连续地或连续地添加甘露糖。在不连续模式下(impact induction)，可以仅在诱导点添加一次，或在合适的间隔添加2次或数次。合适的模式取决于培养系统并且可以由本领域技术人员容易地确定。

例如，在连续模式中，可以以恒定速率或渐减/渐增速率添加甘露糖。

还可以在选定的培养时间间隔、例如在培养物的指数生长期间的选定的时间间隔进行连续添加。另外，也可以使用不连续与连续诱导方案的组合。

根据本发明的补料分批培养的一个实施方式，在批式阶段，细胞生长至OD₆₀₀为20至30的细胞密度，然后，通过加入主要碳源和甘露糖的混合物而使培养转变为补料阶段。在补料阶段，主要碳源与甘露糖的比例可以变化，合适的比例为3∶1至1∶3。通过改变主要碳源与甘露糖的比例，可以控制表达速率。

合适的pH范围是例如6-8，优选7-7.5，合适的培养温度是10至40℃，优选30至37℃。

通常温育细胞尽可能长的时间，直至积累了最大量的表达产物和/或生物质，优选为1小时至20天，更优选为5小时至3天。

就生物质的产量而言，表达产物的量取决于所用的培养系统。

在摇瓶培养的情况下，以本发明的载体转化的宿主通常可以产生数量为0.5g/l培养基的表达产物。使用发酵器以批式和/或补料分批模式进行培养，通常可以获得数量大于0.5g/l发酵液、优选大于1g/l，更优选大于1.3g/l的表达产物。

另外，在使用本发明的宿主细胞的发酵过程中，可以获得高细胞密度：至少10至30 OD₆₀₀，特别是至少50 OD₆₀₀，优选大约250 OD₆₀₀或更高，更优选至少500 OD₆₀₀，最优选至少1000 OD₆₀₀。特别地，在根据本发明的补料分批过程中，可以获得50 OD₆₀₀至大于1000 OD₆₀₀的细胞密度。

例如，1 OD₆₀₀对应于平均大约0.322g干物质/升。因此，100 OD₆₀₀值对应于32.2g干物质/升；500 OD₆₀₀对应于161g干物质/升。

此外，根据本发明的宿主细胞允许实现高复制率而不损失载体。

在宿主细胞中表达之后，可以从宿主细胞的培养物中回收表达的产物，例如目标多肽。为了获得最大产率的表达产物，通常在培养结束时收获细胞并裂解，例如通过溶菌酶处理、超声或氟氏粉碎器而裂解。因此，通常首先是以宿主细胞的粗裂解物的形式获得多肽。然后可以通过本领域已知的标准的蛋白纯化程序纯化它们，所述程序可以包括：差别化沉淀、分子筛色谱、离子交换色谱、等电聚焦、凝胶电泳、亲和和免疫亲和色谱。这些熟知的且常规使用的方法描述于例如Ausubel等人(见上文)和Wu等人(eds.)，Academic Press Inc.，N.Y.；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology。例如，为了纯化重组产生的免疫球蛋白，可以使用免疫亲和色谱，通过穿过含有其上结合了靶分子的树脂的柱子而纯化免疫球蛋白，所述靶分子可以与所表达的免疫球蛋白特异性结合。

本发明还涉及用于在原核宿主中细胞内异源表达编码例如多肽的核酸的方法和工具。特别地，本发明涉及载体和此类载体的用途，用于使用本发明的载体在原核宿主中细胞内表达异源多肽的用途。

在细胞内表达时，多肽是在细胞质中表达，并且不从细胞质被转运至非细胞质位置。多肽可以以包涵体或可溶性形式在细胞质中表达。用于从细胞、特别是从细胞提取物中分离和纯化多肽的程序也是熟知的。

本发明的甘露糖启动子是有利的，因为它们可以被严格地调控，被常见的和非毒性的并因此在工业上有用的化合物诱导。

此外，本发明的甘露糖启动子和包含此类甘露糖启动子的载体在细胞中是稳定的，即使在细胞多次复制之后也不会丧失。因此，使用根据本发明转化的宿主细胞的发酵可以获得高细胞密度。

本领域技术人员将认识到：除了那些具体描述之外，本文描述的本发明可以进行变化和修饰。要理解，本发明包括所有此类不脱离本发明的精神或基本特征的变化和修饰。本发明还包括本说明书中单独或联合提及或记载的所有的步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或更多个所述步骤或特征的任意和所有的组合。因此，本公开内容被认为是在所示例的所有方面并不限于此，本发明的范围由随附的权利要求所决定，在等同意义和范围内的所有变化都包括在其中。本说明书中引用的所有参考文献都通过引用方式全文并入本文。

通过参考以下实施例将更完整地理解前述说明书。然而这些实施例是实施本发明的示例性方法，不是意在限制本发明的范围。

实施例

1)甘露糖操纵子的manR启动子和manP启动子的启动子区的分离和鉴定

如果没有其它说明，则使用的是如下的材料和方法：

细菌菌株和生长条件

大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron C.等人，Gene 33，1985，103-119)和枯草芽孢杆菌3NA(Michel J.F.等人，J.Appl.Bacteriol.33，1970，220-227)用作主要宿主，用于克隆和表达。大肠杆菌于37℃生长于LB液体培养基(Luria S.E.等人，Virology 12，1960，348-390)和LB琼脂平板，其中补充了100μg/ml氨比西林或奇放线菌素。枯草芽孢杆菌于37℃生长于LB液体培养基和C或S最简培养基(Martin-Verstraete I.等人，J.Mol.Biol.214，1990，657-671)。液体培养基和琼脂平板分别补充了100μg/ml奇放线菌素、10μg/ml卡那霉素或5μg/ml erythromycin。为了诱导甘露糖启动子，加入无菌过滤的或高压灭菌的D-甘露糖至0.2％(w/v)的最终浓度。

材料

所有的化学品都获自Sigma-Aldrich(Taufkrichen，Germany)，Fluka(Buchs，Germany)或Merck(Darmstadt，Germany)。合成的DNA寡核苷酸购自Eurofins MWG Operon(Ebersberg，Germany)。限制性酶和DNA修饰酶购自Roche Applied Science(Mannheim，Germany)或New England Biolabs.(Frankfurt am Main，Germany)。以来自Fermentas(ST.Leon-Rot，Germany)的高保真DNA聚合酶在来自Biozym的MiniCycler上进行PCR。

DNA的制备和转化

使用Qiagen(Hilden，Gemrany)或Roche(Mannheim，Germany)的DNA制备试剂盒，根据生产商的说明书，从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或从琼脂糖凝胶分离DNA。在所有实施例中均使用标准的分子技术。

使用如Chung C.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1989，2172-2175描述的质粒DNA转化大肠杆菌。根据改进的“Paris方法”(Harwood C.R.Molecular Biological Methods for Bacillus，1990，JohnWiley&Sons Ltd.，England)，使用质粒DNA转化枯草芽孢杆菌。

β-半乳糖苷酶活性测定

在37℃以10μl甲苯处理0.9ml Z-缓冲液中的0.1ml待测细胞30分钟。根据Miller的方法(Miller J.H.，1972，experiments inmolecular genetics，Cold Spring Harbor，NY)，在22℃以邻-硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷测定β-半乳糖苷酶的活性。

所用的寡核苷酸

表1

实验1

分离具有甘露糖操纵子的启动子区的DNA片段并测定manR启动子和manP启动子的转录起始位点

通过使用Qiagen的DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Hilden，Germany)分离枯草芽孢杆菌168的染色体DNA。

使用引物s4693/s4694从所获得的DNA通过PCR扩增具有完整manR、具有推定的manR启动子和manR与manP之间的基因间区域的大约2.3kb的DNA片段。

所获得的大约2.3kb的DNA片段用于引物延伸实验，以测定manR启动子和manP启动子的转录起始位点。

为了分离用于引物延伸的mRNA，从大肠杆菌载体pIC20HE(Altenbuchner等人，1992，Methods Enzymol.216，457-466)和枯草芽孢杆菌载体pUB110(MacKenzie等人，1986，Plasmid 15，93-103)构建了穿梭因子。载体含有lys基因作为报告基因，其编码来自模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶的成熟形式(Recsai等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1127-1131)。

将所述2.3kb的DNA片段克隆进入该高拷贝pUB110衍生物，克隆于溶葡球菌酶基因的上游。得到的质粒被称作pSUN178.4，并将其导入枯草芽孢杆菌3NA。

含有质粒pSUN178.4的枯草芽孢杆菌3NA生长于含有卡那霉素的LB培养基中。在指数生长期，以0.2％的甘露糖诱导培养物。在37℃生长1小时之后，收获经诱导和未经诱导的细胞。使用Qiagen-RNeasyMini试剂盒分离总RNA。

使用在5’末端以Cy5标记的引物s5006、s5007、s5097和s5098。

引物s5006和s5007分别杂交于相对于溶葡球菌酶基因的起始密码子+21至+50和+76至+105处。引物s5097和s5098分别杂交于相对于manR的起始密码子的+81至+101和+131至+153处。

使用相同的引物用于pSUN178.4的质粒DNA的测序反应，其用作大小标准物。使用来自Roche的AMV-逆转录酶和T7-DNA聚合酶，分别用于逆转录和DNA测序。在变性聚丙烯酰胺测序凝胶(GEhealthcare)上分析逆转录和测序的产物。所使用的所有其它试剂均由Amersham Pharmacia Biotech AutoRead测序试剂盒提供。

通过使用引物s5006来测定manP启动子的转录起始位点。使用相同引物进行质粒pSUN178.4的DNA测序反应，并在相同的变性凝胶上运行，以进行比较。图1显示了manP启动子周围的DNA序列，A(腺嘌呤核苷酸)处的转录起始位点以高亮标示。推导的-10和-35盒以斜体标示，manR基因的终点和lys基因的起点以箭头标示，Bgl-II、XbaI、AflII和NdeI的限制性位点以下划线标示。

按照如上就manP启动子所描述的RNA分离和DNA测序方法来测定manR启动子的转录起始位点，区别在于：使用引物s5098，其与manR基因结合。

在图2和3中显示了manR启动子区的DNA序列，G(鸟嘌呤核苷酸)处的转录起始位点以高亮标示，推导的-10和-35盒以斜体标示，lys基因和manR基因的起点分别以箭头标示。以下划线标示出了限制性位点和推定的cre序列。

当通过甘露糖诱导细胞时，从manR启动子的转录、尤其是从manP启动子的转录强烈增加，如通过引物延伸实验中强得多的信号所示。

所用的引物如上文表1所示。

实验2

根据实验1的引物延伸实验定位出了manP启动子的转录起始位点在manR与manP的起点之间的基因间区域的3’端附近。为了更精确地确定manP启动子区，通过PCR扩增逐步缩短所述2.3kb DNA片段，将所获得的不同长度的序列片段克隆回至相同的基本表达载体中并研究表达情况。

a)基本表达载体的构建

构建了含有无启动子的lacZ(作为报告基因)表达载体。该表达载体被设计为能够在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中复制的穿梭载体并被命名为pSUN272.1。

以NdeI和XmaI从pLA2(Haldimann A.等人，2001，J.Bacteriol.183，6384-6393)切割报告基因lacZ并连接进入pJOE5531.1，其为鼠李糖可诱导的表达载体pWA21(Wegerer等人，2008，BMC.Biotechnol.8，2)的衍生物，其中在XmaI位点含有枯草芽孢杆菌tufA转录终止子。向该质粒中的AflII/MunI限制性位点之间插入一对寡核苷酸s4956/4957，以将相同的tufA转录终止子加入至lacZ的上游。从而通过终止子避免从质粒启动子“读通”进入lacZ，以及从lacZ“读通”进入侧翼质粒序列。使用寡核苷酸s4833/4835从质粒pDG1730(Geurout-Fleury等人，1996，Gene 180，57-61)扩增了用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌二者的奇放线菌素抗性基因spc并插入至如上所获得的质粒中。另外，通过删除BspHI/HindIII片段缩短了大肠杆菌载体部分。然后，将具有枯草芽孢杆菌pMTLBS72(Lagodich等人，2005，Mol.Biol.(Mosk)39，345-348)的复制区的EcoRI/SphI片段连接进入该质粒。

通过以AflII和NheI消化并连接，将实验1中获得的2.3kb DNA片段插入进入pSUN272.1中的lacZ的前面，从而获得具有如图4所示的质粒图谱的表达载体pSUN279.2。

所使用的引物如上文表1所示。

b)测定载体pSUN279.2的表达效率

将a)中所获得的质粒pSUN279.2和pSUN272.1导入枯草芽孢杆菌3NA中。后者作为背景对照。携带该质粒或另一质粒的枯草芽孢杆菌3NA菌株在含有奇放线菌素的LB培养基中生长，在指数生长期，向培养物中加入0.2％甘露糖、0.2％甘露糖+0.2％葡萄糖以诱导，或不加糖(非诱导对照)。诱导1小时后，通过Miller的测验法测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果显示于图5和7。

含有pSUN279.2的枯草芽孢杆菌的非诱导培养物已经显示出非常高的基础水平的β-半乳糖苷酶活性。甘露糖的存在引起β-半乳糖苷酶活性进一步增加4倍，而甘露糖+葡萄糖引起的活性次之，但仍然远高于基础水平。结果清楚地证明：pSUN279.2中见到的启动子活性可能来源于manR与manP之间的区域，来自manR的上游区域，或来自二者。

因此，通过在SfoI与NruI之间切割如图4所示的pSUN279.2的2.3kb DNA片段而从pSUN279.2中删除manR的上游区域以及manR的多数部分，以产生质粒pSUN284.1。

得到的pSUN284.1的核酸序列如图6所示。

以质粒pSUN284.1转化枯草芽孢杆菌3NA，按照上文描述测定表达效率。结果显示于图5。如图5所示，相对于枯草芽孢杆菌3NA中的pSUN279.2，枯草芽孢杆菌3NA中的这种删除了manR的载体pSUN284.1仅显示出大约一半的β-半乳糖苷酶活性基础水平，由甘露糖诱导引起了更强的增加，同样，在存在葡萄糖的情况下的大幅下降。这些结果证明：manP启动子位于manR与manP之间并显示manR的染色体拷贝数足以调节低拷贝质粒中的所有的manP启动子拷贝。

c)manP启动子区的定位

为了定位manP的启动子区，除了缩短的pSUN284.1的DNA片段之外，通过使用限制性酶在如图6所示的manP启动子的转录起始位点上游的限制性位点处的不同位置切割，从2.3kb的DNA片段制备了进一步缩短的序列片段。

在manP的转录起始位点的上游删除至bp-81和bp-80引起产生了包含SEQ ID NO：1的第二个删除序列。在manP的转录起始位点的上游删除至bp-41和bp-40引起产生了另一个删除(第三删除序列)。

通过限制性酶EcoRV和NheI，分别将使用引物s4802/s5203和s5262/s5203扩增的PCR产物插入至pSUN272.1，按照上文2b)中构建质粒pSUN284.1相似的方式构建包含第二删除序列的质粒pSUN290和包含第三删除序列的质粒pSUN297.5。

将质粒插入枯草芽孢杆菌3NA并按照b)中所述进行培养。诱导1小时后，按照上文b)中所述测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果显示于图7。

如图7所示，就通过甘露糖诱导LacZ而言，含有pSUN290和pSUN284.1的菌株没有显示出显著性差异。然而，在含有具有第三删除序列的pSUN297.5的枯草芽孢杆菌3NA中，甘露糖的诱导被完全消除，基础表达水平接近于0。从这些结果说明，manP甘露糖启动子区的ManR结合位点位于manP的转录起始位点的bp-80与-35之间。

实验3：manR启动子的确定

a)cre序列的鉴定

由于多数CCR是通过分解代谢物控制蛋白A(CcpA)介导的，所以使用Clone Manager程序中的DNA比对功能在整个甘露糖操纵子中进行了各个结合位点(cre序列)的搜索。为了进行比对，使用了以下cre共有序列：5’-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3’。

仅在manR的启动子区中发现了一个推定的cre序列，如图2和3所示，其位于-10盒的下游。

本发明的SEQ ID NO：3包括从bp-122至lacZ的起始密码子的区域。SEQ ID NO：4包括从bp-122至bp+7(含端点)的区域，本发明的SEQ ID NO：5包括从bp-122至bp-1(含端点)的序列，如图3所示。

b)manR启动子的表达效率的评估

为了评估manR启动子的表达效率，按照上文描述构建了类似于pSUN284.1的表达载体并命名为pSUN291。为此，使用引物s5208/s5209，使用线性化质粒DNA pSUN279.2作为模板，扩增了包括推定的manR-启动子和manR上游大约600bp的DNA片段，并通过以KpnI和AflIII消化并连接而插入至质粒pSUN272.1中的lacZ的前面。

DNA序列显示于图3。

将质粒pSUN291导入枯草芽孢杆菌3NA并按照上文实验2b)中的描述测定β-半乳糖苷酶的活性。

结果显示于图5。其中，基础表达已经相当高，通过加入0.2％的甘露糖进一步增加了大约3倍。加入葡萄糖引起β-半乳糖苷酶活性被抑制至接近基础表达水平。

结果表明：manR启动子不仅是弱的组成型启动子，而且受到甘露糖和CCR调节。

c)manR启动子区的定位

如实验2c)一样，为了进一步定位manR DNA序列的启动子区，通过使用限制性酶在如图3所示的manR启动子的转录起始位点上游的限制性位点处的不同位置切割，从pSUN291中包含的DNA序列制备了不同长度的DNA片段。

在图3中，通过在转录起始位点G的上游bp -100和bp -99切割而获得了第一个删除序列，通过在转录起始位点G的上游bp -83和bp -82切割而获得了第二个删除序列。

与实验2c)相似，将获得的第一和第二删除序列导入pSUN272.1，得到的质粒分别被称作pSUN384.1和pSUN385.2。

将每个质粒导入枯草芽孢杆菌3NA，并按照实验2b所述进行培养。诱导1小时之后，按照实验2b所述测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果显示于图8。就通过甘露糖诱导LacZ而言，pSUN384.1相对于pSUN291没有显著性差异。然而，在含有具有第二删除序列的pSUN385.2的枯草芽孢杆菌3NA中，甘露糖诱导被完全消除，基础表达水平接近于0。从这些结果说明，manR启动子区的ManR结合位点位于相对于manR的转录起始位点的bp-99与bp-35之间。

II)甘露糖操纵子的启动子区用于高细胞密度发酵的用途

实验4：转化

测试了携带本发明的启动子区的模式宿主的生长和表达能力。使用如图6所示的、如实验2c中所使用的，在质粒pSUN284.1中导入的manP启动子区的核酸序列，按照下文描述构建了质粒pMW168.1并通过转化导入用作宿主的枯草芽孢杆菌3NA中。

a)质粒pMW168.1的构建

按照实验2a)设计了在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中都可以复制的穿梭载体，区别在于使用eGFP作为报告基因而非使用lacZ。另外，manP的转录起始区被替换为基因gsiB(应激蛋白；Jürgen等人，见上文)的转录起始区。另外，替换了eGFP的起始密码子和起始密码子之后的6个密码子。

所获得的启动子和转录起始区的示意结构如图17所示。

显示了基因的排列(箭头)和具有相关限制性位点的区域(加框)。

一般地，按照图18所示的流程图获得质粒pMW168.1。

在流程图中，所使用的载体DNA、插入DNA和互补寡核苷酸的名称如框中所示，就PCR产物而言，引物和模板DNA在括号中标示，所使用的限制性酶在各自的位点处标示。

使用大肠杆菌JM109进行克隆步骤。

所使用的质粒是pUC18，其是用于PCR产物的具有amp-抗性的阳性选择和克隆载体(Yanosch-Perron等人，见上文)；pWA21，其是用于大肠杆菌的具有amp-抗性的表达和克隆载体(Wegerer等人，2008，BMC Biotechnol.8，2)；pSUN202.4，其是具有manP启动子区和amp及kan抗性的pUB110衍生物，是大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭载体；和pSUN266.1，其是在ter序列与spc之间具有整合位点并具有amp抗性的pUC18衍生物。

所使用的引物的序列如下：

使用互补寡核苷酸并通过单一限制性位点BglII、AflII和BamHI进行转录起始区的替换，包括起始密码子和起始密码子之后的密码子。载体的构建起始于：分别通过互补寡核苷酸s5019和s5020，以来自枯草芽孢杆菌的tufA的翻译起始区替换载体pWA21(Wegerer等人，见上文)的T7基因10的转录起始区。在进一步的克隆步骤中，该转录起始区被gsiB的转录起始区替换。最终的质粒pMW168.1含有来自pUB110的rep基因，包括ori+。

pMW168.1的质粒图谱显示于图9。

b)测定结构稳定性和分离(segregation)

以载体pMW168.1转化枯草芽孢杆菌3NA，测定该载体的结构稳定性以及在细胞分裂(分离)时的稳定繁殖。

以pMW168.1转化的枯草芽孢杆菌3NA预培养于LB_Spc-培养基，然后无选择压力地转移至LB₀-培养基。

温育在37℃进行。在指数生长期的末尾，将每个培养物接种至新鲜的LB₀-培养基。重复该程序直至获得100个世代，这是根据Harwood等人，1990，Molecular Biolegical Methods for Bacillus，John Wiley&Sons Ltd.的改进方法，基于在转移至新鲜培养基的过程中所获得的OD测量值而计算的。

结果显示于图10。

在大约15个世代之后，99.9％以上的细胞仍然携带着载体，即使在20个世代之后，大约90％的细胞仍然携带着载体。从大约第25个世代开始，越来越多的细胞丧失载体。

为了测定质粒的结构稳定性，在15个世代之后，从20个菌落分离质粒。通过琼脂糖凝胶电泳将大约0.5μg每个分离质粒与分离自大肠杆菌的pMW168.1(作为对照)进行比较。没有观察到所述质粒与对照在运行时的差异，这说明没有发生结构上的变异。

这些结果证明质粒pMW168.1不仅具有高度的结构稳定性，而且是稳定分离的，在发酵中是理想的。

实验5：发酵

使用以包含报告基因eGFP的质粒pMW168.1转化的枯草芽孢杆菌3NA，以不同的诱导方案进行6次发酵运行，并通过观察eGFP的荧光信号进行在线监控。

使用已知的用于大肠杆菌的高细胞密度发酵的培养基作为发酵培养基，该培养基公开于Wilms等人，2001，Biotechnol.Bioeng.73，95-103，如下文所述。

材料和方法

一般地，如果没有另外指明，也使用标准分子技术用于发酵实验。

光密度

根据生产商的说明书，使用Amersham Bioscience Company的分光光度计Ultrospec 1100pro在600nm测定光密度(OD)。

测定干生物质的浓度

使用Ohaus Company的c_x湿度计MB835 Halogen测定干生物质浓度。

分光光度法测定荧光

使用以下测定参数，使用读数器软件X Fluor 4(版本：V4.11)，通过TECAN Company的多功能读数器GENios分别分析eGFP的表达和荧光：

测量参数	值
		感光滤光片	485nm
发射滤光片	535nm
		增益(人工)	60
整合时间	20μs
		闪光次数	3
读数模式	Top

发酵器中的在线荧光测定

在发酵过程中，使用荧光探针(Micropack HPX-2000，High PowerXenon Lightsource of Ocean Optics，Inc.；S2000 fiber opticspectrometer)在线监视eGFP的表达。

测量参数如下：感光滤光片485nm，发射滤光片535nm，滤光片0.6。使用Ocean Optics SpectraSuite Software记录并储存。

荧光表示为相对荧光单位(RFU)。在获得4.000RFU之前的短时间内，将50ms的整合时间改变为25ms，然后改变为10ms。在这些情况下，将测量值分别乘以因子2和5。

预培养物的培养

将单一的菌落置于LB琼脂平板中并在含有0.02％(w/v)酪蛋白氨基酸(CA)和抗生素的5ml Spizizens最简培养基(SMM)中过夜培养。将1ml过夜培养物加入至含有0.02％(w/v)CA和抗生素的20ml SMM中，并在37℃在250ml Erlenmeyer瓶中温育5-6小时(预培养物1)。

将10ml预培养物1加入至含有5g/l葡萄糖的200ml批式培养基中并在37℃在1L的Erlenmeyer瓶中温育8小时(预培养物2)。使用OD₆₀₀为1.2至2.2的预培养物2接种发酵器。

发酵

一般地，根据Wilms等人，2001，Biotechnol.Bioeng.73，95-103的原理进行发酵。

当碳源葡萄糖被完全消耗之后，立即将批式模式转变为补料分批模式。

通过在补料分批阶段指数添加进料溶液，可以获得μ＝0.10h^-1的恒定生长速率，同时避免了由葡萄糖造成的分解代谢物抑制，因为细胞会立即消耗掉葡萄糖。

蛋白分析

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析收获的细胞的粗蛋白提取物，聚丙烯酰胺凝胶由3％浓缩胶和12％分离胶组成，成分如下：

使用Biometra公司的Twin Mini凝胶槽。

为了进行变性，将12μl蛋白混合物的粗提取物与3μl 5x SDS-应用缓冲液混合并在Eppendorf公司的Thermomixer 5438中在95℃温育5分钟。冷却至室温之后，通过离心分离样品并完全加入至凝胶上。

在分离过程中，浓缩胶中的电流是10mA，在溴酚的前端到达浓缩胶之后，电流增加至20mA。1xSDS-运行缓冲液和Roth公司的长度标准物ROTI用于分离。当溴酚的前端完全跑出凝胶之后电泳即完成。为了检测不同的蛋白条带，将凝胶与考马斯染色溶液在室温温育30分钟，随后以脱色溶液在室温处理30分钟。为了从凝胶上除掉剩余的青色背景，将凝胶在7.5％的乙酸中温育数小时。缓冲液和染色以及脱色溶液的组成如下：

基因表达的诱导

为了诱导基因表达，测评了添加诱导子溶液的不同模式(诱导方案)：

1.在给定的时间点加入单一部分[作用诱导(impact induction)]；

2.作用诱导与一定时间间隔的进一步诱导相结合，其中

——进一步诱导为恒定速率，逐步增加数量；或

——进一步诱导为指数增加速率；

3.在达到给定的细胞密度之后启动诱导子溶液的添加

表2：所用的培养基

^＊需另外高压灭菌

痕量元素溶液(TES)	CaCl₂x2 H₂O	0.50g/l
			FeCl₃x6 H₂O	16.70g/l
	Na₂-ED TA	20.10g/l
			ZnSO₄x7 H₂O	0.18g/l
	MnSO₄x H₂O	0.10g/l
			CuSO₄x5 H₂O	0.16g/l
	CoCl₂x6 H₂O	0.18g/l

分别使用2 M NaOH和1 M HCl溶液调节pH。对于琼脂平板，另外添加15g/l BD公司的Euroagar。所有的培养基都在121℃高压灭菌大约30分钟。

发酵运行1：作用诱导

在30升反应器(Bioengineering的D598和D596)中进行发酵运行1。批式体积为8升。接种200-400ml预培养物2(取决于OD₆₀₀)以调整起始OD₆₀₀至0.1。

在批式阶段，温度是30℃，过夜；12小时后，温度增加至37℃。在整个发酵过程中，通过加入24％(v/v)NH₄OH，将pH调节至大约7.0。可以调节通气速率至30L/min。在批式阶段开始时，通气速率是10L/min。

进料培养基I和II的成分显示于下表3。

表3：进料培养基I和II的成分

^＊痕量元素溶液 pH7.0

按照一定比例添加培养基I和II至它们的总体积，即4.2∶1.0(对应于总体进料F的80.8％的培养基I和19.2％的培养基II)。

为了进行诱导，在补料分批阶段开始时，以一个部分加入0.2％(w/v)的D-甘露糖溶液。

干生物质浓度和监视的荧光信号分别显示于图11a和11b。

在图中，干生物质的浓度c_x相对于培养持续时间进行对数作图。批式和补料分批阶段通过垂直线分开。

在535nm发射波长处监视的荧光信号相对于培养阶段作图。箭头指示诱导点。

图11a的结果显示：获得了82.75g DM/l的最大干生物质(DM)浓度，根据11.7L的反应体积，这对应于大约970g DM。

总共消耗了71.5g的诱导子D-甘露糖，在第一次添加时为16g。

在整个补料分批阶段，比生长速率μ为0.10h^-1。

如图11b所示，在第一次添加D-甘露糖之后，在补料分批阶段的前5个小时内，荧光信号强烈增加至最大为大约2,200RFU。然后，信号持续减弱。假设表达率的这种减弱是由于诱导子的消耗和/或由于增加的细胞质量的屏蔽效应(shielding effect)。在37小时后再添加0.5％(w/v)甘露糖溶液引起荧光信号的新的增加，高达2,100RFU。

发酵运行2：以恒定速率组合诱导

重复与运行1相同的程序，区别之处在于：改变诱导子的添加模式。如在运行1中一样，在补料分批阶段的起始点以单一的部分添加0.2％(w/v)D-甘露糖溶液。当RFU达到运行1的荧光信号曲线的拐点即1,500时，开始加入第二部分的诱导子。

在第二次添加步骤中，以恒定速率添加20％(w/v)甘露糖溶液，逐步增加数量，平均速率为0.39g/min，直至添加完所有的第二部分。

结果显示于图12a和12b，显示了干生物质浓度和荧光信号曲线，图例与图11a和11b中相同。在图12b中，通过箭头标示了添加第一部分的时间点与添加第二部分的起始和终止。

如图12a的结果所示，干生物质的最大浓度是67.6gDM/l，根据11.9L的反应体积，这对应于大约804g DM。合计(第一部分和第二部分)添加了70g D-甘露糖。

相对于运行1，生物质的产率降低17％。这与补料分批阶段μ＝0.09h^-1的较低的比生长速率相关，而批式阶段的比生长速率是0.43h^-1。

如图12b中的结果所示，在25小时后达到了最大荧光信号，为大约4,900RFU，并持续降低至大约2500RFU。

与运行1相比，运行2中的表达率可以增强120％，生物质浓度稍有下降。

运行3和4：以指数速率组合诱导

在运行3和4中使用3.7L小实验室发酵器(BioengineeringCompany的Kleinlaborfermenter)。批式体积(批式培养基+接种物)合计为1.5L。接种100-200ml预培养物2(取决于OD₆₀₀)以调整起始OD₆₀₀至大约0.1。批式和补料分批阶段的温度都是37℃。在发酵过程中，通过24％(v/v)NH₄OH将pH调节至7.0。在发酵过程中，通气速率恒定为2L/min。通过转子的旋转速度调节氧的输入。在起始时发酵压力是1.3bar，然后增加至1.5bar以增强所需的氧气输入。在碳源葡萄糖完全被消耗之后，将批式操作转变为补料分批操作。

与运行2不同，在运行3和4中，以指数增加的速率进料诱导子溶液。此外，含有葡萄糖的培养基I与含有诱导子的培养基II共同进料。进料培养基I和II的成分如下表4所示：

表4：进料培养基I和II的成分

培养基I和II中的所有成分都单独高压灭菌。

在这两种培养基中均使用85％(v/v)H₃PO₄将pH值调节值3.3，这是因为成分的溶解性的缘故。

通过以下公式计算时间t时的总进料F：

F (t) = (\frac{μ_{set}}{Y_{x / s}} + m) \cdot \frac{C_{x 0} \cdot V_{0}}{C_{s 0}} \cdot e^{μ} {set}^{- t}

其中

m＝维持系数(0.04g g^-1H^-1)

Y_x/s＝与底物相关的生物质的比产率系数(对于葡萄糖而言是0.5)；

C_x0＝补料分批阶段起始时的生物质浓度；

V₀＝补料分批阶段起始时的反应器体积(＝批式体积)

C_s0＝进料溶液中的葡萄糖浓度

对于计算，假设D-甘露糖以与葡萄糖相当的产率系数Y_X/s被枯草芽孢杆菌消耗。

在KLF中，可以分别提供培养基I和II，并且比例可以变化。

a)发酵运行3

生物质浓度和监测的荧光信号显示于图13a和13b，图中的图例与运行1中的相同。

在补料分批阶段的起始，加入0.2％(w/v)甘露糖溶液(总共16g甘露糖)，以50∶50的比例开始指数进料培养基I和II(间隔I)。在斜率降低时，将含有甘露糖的培养基II的部分增加至60％，将总进料F(培养基I和II)增加至125％以维持基于葡萄糖的生长(间隔II)。在大约2小时后，再次监视斜率的降低，将培养基II的部分增加至66.6％，同时增加总进料F至150％(间隔III)。全部培养基II被消耗之后，以100％的总进料以进料培养基I继续进行发酵(图10中未显示)。

运行3的过程和数据总结于下表5：

表5：

总共加入50g甘露糖。

在12h、20h和24h取样，在SDS凝胶上分析表达情况，基于总共10 OD₆₀₀细胞的可溶性蛋白级份。

得到的SDS page显示于图19：

从左边起显示了：(M)长度标准物(1)12小时之后的，未诱导；(2)20小时之后的，诱导8小时；(3)24小时之后的，诱导12小时。

20小时和24小时之后，在大约27kDa出现清晰的带，这表明eGFP的表达(箭头)。

b)发酵运行4

重复与发酵运行3相同的程序，区别之处在于：培养基II(甘露糖)的进料体积增加至总共1.0L。

干生物质浓度和荧光信号显示于图14a和12b，图例与运行1中的相同。

过程和数据总结于下表6：

表6：

总共加入200g甘露糖。

为了补偿在发酵持续大约15小时之后观察到的氮的缺乏，另外以恒定的速率进料(NH₄)₂HPO₄。

在间隔II，达到了最大为10000的RFU，在间隔II的过程中下降至7800RFU。

a)发酵运行5和6：不进行诱导

这两个发酵都在30L的发酵器中进行。

在这两个运行中，以指数增加的葡萄糖进料速率使细胞生长至高细胞密度，在达到高细胞密度之后，替换为恒定的甘露糖进料。

所使用的进料培养基I、II和III显示于下表7：

表7：

发酵运行5

以指数增加速率按照4.2∶1.0添加培养基I和II至它们的总体积。在达到高细胞密度之后，由培养基I和II组成的进料被替换为由比例为20∶80的培养基II和III组成的恒定体积的进料，体积对应于培养基I和II的最后指数进料速率的体积。

荧光信号显示于图15，图例与运行1中的相同。

假设在大约17小时的发酵之后，图15中荧光信号的极小量的增加是由于培养基III的短期泄露。

运行5的过程和数据总结于下表8：

表8：

b)发酵运行6

重复与运行5中相同的程序，不同之处在于：在达到高细胞密度后恒定添加由培养基II和III组成的进料之前，以0.2(w/v)甘露糖溶液(总共16g甘露糖)进行诱导，总共添加600g甘露糖。

荧光信号显示于图16，图例与运行1中的相同。

运行6的过程和数据总结于下表9中：

表9：

运行1至6的评价

为了进行评价，测定了最大荧光时的干生物质浓度c_x，反应器体积V_R，消耗的甘露糖和从开始诱导算起的持续时间，并总结于下表10中：

表10：

基于表10中所示的过程数据，计算了每个运行的生产力，以最大荧光RFU L^-1h^-1表示。此外，表达效率表示为相对荧光：其是基于绝对生物质(gDM)和诱导子的浓度(gman/L)从最大荧光值计算得来。

结果显示于下表11：

表11：

这些结果清楚地显示：使用携带甘露糖启动子的质粒，本发明能够成功用于高细胞密度发酵过程，并通过添加诱导子D-甘露糖而阳性地控制表达。

此外，通过选择诱导方案，视需要可以改变发酵的焦点，根据生物质、表达产物和诱导子消耗使输出量最大化。

就促进下游加工而言，根据运行3的方案即组合诱导与指数进料是特别有利的。

在本文中，相对于生物质产生的高表达产物使进一步的加工、例如纯化步骤等更加有效率，因此节省了时间和花费。

Claims

1.在作为原核宿主细胞的枯草芽孢杆菌中可表达的载体，其包含可操作地连接于转录单元的、枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子的甘露糖可诱导启动子，所述转录单元包括编码多肽的异源核酸序列，其中所述甘露糖可诱导启动子选自：由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成的manP启动子和由SEQ ID NO:3组成的manR启动子。

2.根据权利要求1的载体，其中所述载体包含完整的或一部分的调节性基因manR的序列。

3.权利要求1或2的载体，其中所述载体包括处于所述异源核酸序列上游的分解代谢物应答元件。

4.权利要求1或2的载体，其中所述载体包括位于所述异源核酸序列下游的转录终止序列。

5.根据权利要求4的载体，其中所述转录终止序列衍生自枯草芽孢杆菌的tufA基因的3’区。

6.权利要求1或2的载体，其中所述载体是在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中可复制的穿梭载体。

7.权利要求1或2的载体，其中所述载体包括质粒pUC18的复制起始点和/或pBS72复制子或rep基因以及质粒pUB110的复制起始点。

8.权利要求1或2的载体，其中所述异源核酸序列编码抗体或其片段。

9.权利要求1或2的载体，其中在所述甘露糖可诱导启动子中，manP基因或manR基因的转录起始区被另一基因的转录起始区替换。

10.权利要求9的载体，其中在所述甘露糖可诱导启动子中，manP基因或manR基因的转录起始区被tufA基因或gsiB基因的转录起始区替换。

11.枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子的甘露糖可诱导启动子区的分离且纯化的核酸序列，其中所述甘露糖可诱导启动子选自：由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2组成的manP启动子和由SEQ ID NO:3组成的manR启动子。

12.以权利要求1-10任一项的载体转化的枯草芽孢杆菌原核宿主细胞，其中所述原核宿主细胞经历碳分解代谢物阻抑并包括磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统。

13.用于在作为原核宿主细胞的枯草芽孢杆菌中产生多肽的方法，包括以下步骤：构建权利要求1-10任一项的载体；以所述载体转化原核宿主细胞；通过使转化的宿主细胞在适当的条件下在细胞培养基中生长而允许表达所述多肽；和，从所述细胞或从细胞培养物中回收多肽，其中所述原核宿主细胞经历碳分解代谢物阻抑并包括磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统。

14.根据权利要求13的方法，其中所述宿主细胞首先在存在不同于诱导子的碳源的情况下生长，然后在第二步骤中在存在诱导子的情况下生长。

15.权利要求1-10任一项的载体或权利要求11的分离且纯化的核酸序列用于调节编码多肽的异源核酸序列在作为原核宿主细胞的枯草芽孢杆菌中的表达的用途,其中所述原核宿主细胞经历碳分解代谢物阻抑并包括磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统。