CN109988802B - 一种高效分泌表达人源fgf21蛋白的表达盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及利用枯草芽孢杆菌高效表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF21)基因的方法。首先，本发明通过在目的蛋白基因5’端添加不同类型的cistron顺反子序列，调节目的蛋白基因的转录和翻译效率，从而优化其可溶性表达水平，可应用于不同类型的异源蛋白优化表达。其次，本发明还优化了二硫键相关基因构建了促进rhFGF21二硫键折叠效率；过表达分子伴侣系统构建了适于rhFGF21蛋白折叠效率；敲除胞外多种蛋白酶基因构建了提高rhFGF21胞外稳定性的枯草芽孢杆菌基因工程菌株，最终提供了一种具有良好应用前景的能够高效分泌表达rhFGF21蛋白质的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。

Description

一种高效分泌表达人源FGF21蛋白的表达盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用芽孢杆菌高效表达重组人成纤维细胞生长因子21(rhFGF21)蛋白的方法。

背景技术

蛋白表达技术是现代生物学的核心技术之一，表达蛋白不仅可用于生物学研究，也可以提供商业化的蛋白制品，如重组疫苗、重组胰岛素、细胞因子等产品。目前常用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，但是它们都各有明显的优缺点。大肠杆菌表达系统研究最充分且有多种选择，最常用的是Novagen的pET表达系统，其利用噬菌体的T7RNA聚合酶可专一性地转录T7启动子后的目的基因。尽管具有表达效率高，培养成本低等优点，但是缺点也非常明显：蛋白容易形成包涵体，复性难度和成本较高；大肠杆菌不能对蛋白进行糖基化修饰；细胞壁含有脂多糖(内毒素)，不易完全去除。另外一个常用的表达系统是酵母表达系统，其具有表达量高，可诱导，蛋白分泌到胞外易于纯化，并且具有一定的翻译后修饰能力等优点，但是缺点是部分表达产物易降解，表达量不可控，大于30KDa的蛋白几乎不能分泌。昆虫细胞和动物细胞表达系统的特点是具有完整的修饰系统，表达产物具有或者类似的天然活性，没有内毒素污染，但是表达量低，周期长，技术要求高，生产成本高。

枯草芽孢杆菌是经美国FDA认证的一种对环境无害的(GRAS)革兰氏阳性细菌，全基因组测序已经完成，其作为工程菌具有很大的优势，原因在于：芽孢杆菌的胞外蛋白可以直接分泌到培养基中；芽孢杆菌分泌的蛋白无内毒素，较为安全；被认为非常适合遗传操作，并已成为被广泛应用于实验室研究的模式生物；生产的益生菌及利用其生产的发酵产品已广泛应用于医药养殖业中。重组人成纤维细胞生长因子21(recombinant humanfibroblast growth factor 21，rhFGF21)是近些年研究开发的一种有望成为治疗胰岛素抵抗的2型糖尿病的理想药物。试验研究表明，rhFGF21是一种特异性新型代谢因子，作用于肝脏、胰岛和脂肪组织。具有降低血糖血脂、改善胰岛素抵抗和改善胰岛β细胞功能的作用。动物试验表明rhFGF21可有效调节患有糖尿病动物的血糖，对2型糖尿病动物即胰岛素抵抗类糖尿病有显著疗效；可有效改善1型和2型糖尿病动物的糖耐受，效果优于胰岛素；并与胰岛素有协同作用，有长效降糖效果(Nishimura,Nakatake et al.2000)。rhFGF21是FGF家族中目前发现的唯一没有促有丝分裂的基因，FGF21对糖脂毒性和细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡有局部保护作用，可大大降低临床用药风险。

目前针对FGF21的表达主要集中在大肠杆菌和酵母菌中进行，大肠杆菌作为蛋白表达宿主细胞存在分泌效率低，具有内毒素，已引起免疫反应等不利因素，会导致后续蛋白质纯化工艺成本提高；酵母菌作为真菌其具有较好的蛋白质分泌能力，但最适生长温度一般为30℃左右，生长较慢且发酵工艺中需用大量冷却水，不利于节能减排。此外，目前常用的酵母表达系统一般利用甲醇作为诱导物及碳源，存在一定的生产安全隐患，因此进一步提高了生产成本。本发明采用枯草芽孢杆菌作为宿主细胞，其具有高分泌能力、生长迅速，是一种生物安全菌株，不存在致病性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以芽孢杆菌作为宿主菌，通过构建含有cistron顺反子的rhFGF21表达盒，并通过优化rhFGF21的转录、翻译、转运等能力，提高其可溶性表达分泌能力，从而有利于工业化应用。

该表达盒可以表达其他的蛋白，即其他任意异源蛋白均可用cistron表达盒来表达。

第一方面，本发明提供了一种含cistron顺反子的rhFGF21表达盒，该表达盒选自以下结构a或b：

a：A-B-C-B-D-E；

b：A-B-C-D-E；

其中，A为启动子；B为核糖体结合位点RBS；C为cistron顺反子；D为编码目的蛋白的核苷酸序列；E为终止子。

所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述cistron顺反子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-7所示；其中，核苷酸序列为SEQ ID NO：1-5的cistron顺反子位于结构a；核苷酸序列为SEQ ID NO：6-7的cistron顺反子位于结构b；

优选地，所述cistron顺反子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述编码rhFGF21的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述RBS序列为TAAGGAGG。

第二方面，本发明提供了一种表达载体，其含有第一方面所述的表达盒。

第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有第一方面所述的表达盒或第二方面所述的表达载体。

第四方面，本发明提供了另一种宿主细胞，该宿主细胞在第三方面所述特征的基础上还过表达了分子伴侣，所述分子伴侣为BLSecA、CsaA、DnaK、Ffh、Ftsy、groESL、PrsA、QsSecA、Scr、SRP或YrbF中的任意一种或其组合；

优选地，所述分子伴侣为CsaA、DnaK、Ffh、Ftsy、QsSecA或SRP中的任意一种或其组合；

更优选地，所述分子伴侣为DnaK。

第五方面，本发明提供了另一种宿主细胞，该宿主细胞在第三、四方面所述特征的基础上还过表达了转运蛋白，所述转运蛋白为secE、sipV、sipW、secY、secYEG、secA、dnaK-prsA、secDF、sipS、或sipU中的任意一种或其组合；

优选地，所述转运蛋白为secE、sipV、sipW、secY、secYEG、secA或secDF中的任意一种或其组合；

更优选地，所述转运蛋白为secY和/或secYEG。

第六方面，本发明提供了另一种宿主细胞，所述宿主细胞在第三-五方面所述特征的基础上还过表达了信号肽，所述信号肽为pelb、phod、pel、ywbn、lipa、prota、ywmc、dacb、npre、yddt、yoqm或yvce中的任意一种或其组合；优选地，所述信号肽为nprE、yddT或yvc中的任意一种或其组合。

第七方面，本发明提供了另一种宿主细胞，所述宿主细胞在第三-六方面所述特征地基础上还优化了与二硫键折叠相关的蛋白，所述优化方式为过表达氧化还原酶DsbA和或弱化硫氧还蛋白TrxA。

由于芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等被认为是生理特征十分相似的菌株，其中解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等菌株与枯草芽孢杆菌的基因组具有高度的相似性，大约有70-80％的编码基因序列与枯草芽孢杆菌具有高同源性，此外，上述菌株与枯草芽孢杆菌在基因组大小、GC含量、rRNA、tRNA水平上也高度相似，因此在枯草芽孢杆菌中开发的DNA表达元件和载体可拓展应用至多种芽孢杆菌属菌株中，具有良好的可拓展性和广泛适应性。故上述第三至第七方面所述的宿主细胞，其为芽孢杆菌；优选地，其为枯草芽孢杆菌；更优选地，该宿主细胞的胞外蛋白酶bpr、epr、vpr、nprB、mpr或wprA中的任意一种或其组合缺失。

第八方面，本发明提供如第一方面所述表达盒或第二方面所述表达载体或第三至第七方面所述宿主细胞在表达成纤维细胞生长因子21中的应用。

附图说明

图1是含顺反子cistron的rhFGF21表达盒结构示意图：A为表达盒结构1，B为表达盒结构2。

图2是含有cistron顺反子表达盒结构的rhFGF21枯草芽孢杆菌表达菌株24h的细胞裂解液SDS-PAGE分析胶图：其中图2A为SDS-PAGE电泳胶图，图2B为基于图2A胶图通过软件分析得到的与对照组Ct相比，各菌株rhFGF21蛋白的相对表达表达量柱状图。24h Celllysate是菌株细胞裂解液即指示蛋白rhFGF21的胞内总体表达量。M：蛋白maker；Ev：菌株1A751细胞裂解液；Ct：1A751F细胞裂解液(对照组)；1：菌株CIS1细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量；2：菌株CIS2细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量；3：菌株CIS3细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量；4：菌株CIS4细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量；5：菌株CIS5细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量；6：菌株CIS6细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量；7：菌株CIS7细胞裂解液中蛋白rhFGF21表达量。

图3是过表达/弱化关于二硫键折叠相关酶的rhFGF21枯草芽孢杆菌表达菌株24h发酵菌液SDS-PAGE分析胶图：其中图3A为SDS-PAGE电泳胶图，图3B为基于图3A胶图通过软件分析得到的与对照组Ct相比，各菌株rhFGF21蛋白的相对表达表达量柱状图。24hSupernatant是菌株细胞裂解液的上清即指示蛋白rhFGF21的胞内可溶性表达量。M：蛋白maker；Ev：1A751发酵菌液；Ct：1A751F发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量(对照组)；T-protA：Trx2发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；D-protA：DSB2发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量。

图4是过表达分子伴侣的rhFGF21枯草芽孢杆菌表达菌株24h发酵菌液SDS-PAGE分析胶图：其中图4A为SDS-PAGE电泳胶图，图4B为基于图4A胶图通过软件分析得到的与对照组Ct相比，各菌株rhFGF21蛋白的相对表达表达量柱状图。24h Supernatant是菌株细胞裂解液的上清即指示蛋白rhFGF21的胞内可溶性表达量。M：蛋白maker；Ev：1A751发酵菌液；Ct：1A751F发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量(对照组)；BLSecA：CC1发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；CsaA：CC2发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK：CC3发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；Ffh：CC4发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；Ftsy：CC5发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；groESL：CC6发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；PrsA：CC7发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；QsSecA：CC8发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；Scr：CC9发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SRP：CC10发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；YrbF：CC11发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量。

图5是敲除胞外蛋白酶的rhFGF21枯草芽孢杆菌表达菌株24h发酵上清液SDS-PAGE分析胶图：其中图5A为SDS-PAGE电泳胶图，图5B为基于图5A胶图通过软件分析得到的与对照组Ct相比，各菌株rhFGF21蛋白的相对表达表达量柱状图。24h Medium是菌株发酵上清液即指示蛋白rhFGF21的胞外分泌表达量。M：蛋白maker；Ev：1A751发酵菌液；Ct：CIS5发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量(对照组)；5：Kno6f发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量。

图6是携带有信号肽的rhFGF21枯草芽孢杆菌表达菌株24h发酵上清液SDS-PAGE分析胶图：其中图6A为SDS-PAGE电泳胶图，图6B为基于图6A胶图通过软件分析得到的与对照组Ct相比，各菌株rhFGF21蛋白的相对表达表达量柱状图。24h Medium是菌株发酵上清液即指示蛋白rhFGF21的胞外分泌表达量。M：蛋白maker；Ev：1A751发酵菌液；5*：Kno6f发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量(对照组)；DnaK-pelB：Kno6csp1发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-lipA：Kno6csp2发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-protA：Kno6csp3发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-ywmC：Kno6csp4发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-phoD：Kno6csp5发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-pel：Kno6csp6发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-ywbN：Kno6csp7发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；dacB：Kno6csp8发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；nprE：Kno6csp9发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；yddT：Kno6csp10发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；yoqm：Kno6csp11发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；yvcE：Kno6csp12发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量。

图7是过表达转运蛋白的rhFGF21枯草芽孢杆菌表达菌株表达菌株24h发酵上清液SDS-PAGE分析胶图：其中图7A为SDS-PAGE电泳胶图，图7B为基于图7A胶图通过软件分析得到的与对照组Ct相比，各菌株rhFGF21蛋白的相对表达表达量柱状图。24h Medium是菌株发酵上清液即指示蛋白rhFGF21的胞外分泌表达量。M：蛋白maker；Ev：1A751发酵菌液；Ct：Kno6f发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量(对照组)；SecE：TC1发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SipV：TC2发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SipW：TC3发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SecY：TC4发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SecYEG：TC5发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SecA：TC6发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；DnaK-PrsA：TC7发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；Qs-SecA：CC8发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SecDF：TC8发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SipS：TC9发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量；SipU：TC10发酵菌液中蛋白rhFGF21表达量。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

具体实施方式

1.细菌菌株和生长条件：

大肠杆菌DH5α和枯草芽抱杆菌1A751(BGSC，USA)用作主要宿主，用于克隆和表达。大肠杆菌于37℃生长于LB液体培养基(Luria S.E.等人,Virology 12,1960,348-390)和LB琼脂平板，其中补充了100μg/ml氨苄青霉素。枯草芽孢杆菌于37℃生长于LB液体培养基和SR发酵培养基。液体培养基和琼脂平板分别补充了20μg/ml卡那霉素或5μg/ml氯霉素。为了诱导麦芽糖启动子，加入无菌过滤的或高压灭菌的D-麦芽糖至1％(w/v)的最终浓度。

2.实验材料：

所有的化学品都获自Sigma-Aldrich或Merck。合成的DNA寡核昔酸购自金唯智Genewiz。限制性酶，T4多聚核苷酸激酶和T4DNA连接酶购自NewEngland Biolabs.。以来自Fermentas的高保真DNA聚合酶在来自Eppendorf的热循环仪上进行PCR。

3.DNA的制备和转化：

使用Tiangen或Omega的DNA制备试剂盒，根据生产商的说明书，从大肠杆菌和枯草芽抱杆菌或从琼脂糖凝胶分离DNA。在所有实施例中均使用标准的分子技术。使用如ChungC.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1989,21722175描述的质粒DNA转化大肠杆菌。根据改进的“Paris方法”(HarwoodC.R.MolecularBiologicalMethods for Bacillus,1990,John Wiley&SonsLtd.,England)，使用质粒DNA或DNA片段转化枯草芽抱杆菌。

4.枯草芽孢杆菌基因无痕敲除：

根据改进的“基于AraR的枯草芽孢杆菌基因敲除方法”(Liu S,Endo K,etal.Microbiology.2008；154(Pt 9):2562–2570.)进行基因无痕敲除。首先利用同源重组原理将携带同源臂的受阿拉伯糖启动子调控的壮观霉素抗性基因片段“Para-spc”通过转化方法转入枯草芽孢杆菌1A751菌株中，替换基因组上的AraR基因，构建原始的基因敲除原始菌，其带有壮观霉素抗性。需要敲除基因X时，分别克隆X基因的上游1Kb片段(命名为UP)、下游1Kb片段(命名为DN)、待敲除基因X片段(命名为G)以及带有AraR基因和氯霉素抗性基因cat的筛选片段(命名为CR)，利用overlap-PCR方法将上述4个片段以“UP-DN-CR-G”的顺序融合为一个片段，并通过转化方法转入枯草芽孢杆菌1A751中进行同源重组，以氯霉素抗性筛选转化子。将得到的转化子在壮观霉素抗性LB平板上验证，选取在氯霉素上生长、而在壮观霉素上不生长的转化子作为阳性转化子。将阳性转化子在无抗性的LB培养基中以37℃，200rpm培养16小时，取10uL菌液涂布于壮观霉素抗性平板上进行筛选，将得到的转化子通过菌落PCR进行验证，确定基因是否敲除。将菌落PCR验证正确的菌株作为敲除X基因的菌株进行保存。

所用到的寡核苷酸：

表1实施例中所用寡核苷酸序列

表2实施例中构建的质粒和菌株及其特性

来源于真核细胞的外源蛋白rhFGF21在野生型的枯草芽孢杆菌中的表达量较低且多为包涵体，为实现rhFGF21在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，本发明采用以下技术措施：

实施例1.构建含cistron顺反子的rhFGF21表达盒优化rhFGF21翻译效率促进蛋白表达水平

1.1含顺反子的rhFGF21表达盒的设计

为了提高rhFGF21的表达量，本发明将cistron顺反子插入在rhFGF21表达载体中，形成含cistron顺反子的rhFGF21表达盒。插入cistron的目的在于使mRNA的二级结构发生改变，RBS从原始的茎环结构暴露出来，易于招募更多的核糖体，增强了核糖体与RBS的结合，提高蛋白的翻译效率。图1为含cistron顺反子的rhFGF21表达盒结构示意图。图1A的结构为：启动子-RBS-cistron(1-5)-RBS-rhFGF21-终止子，cistron1-cistron5分别是gfp，luc，glvA，rdpe，gsiB基因序列的前18bp加终止密码子TGA，其序列为SEQ ID NO：1-5。RBS序列一般为：5’-AGGAGG-3’，本发明所用RBS序列为：5’-TAAGGAGG-3’。此外，cistron尾部含有终止密码子，不影响目的蛋白的结构和活性。图1B的结构为：启动子-RBS-cistron(6-7)-rhFGF21-终止子，cistron6-cistron7分别是420pep和hexa pep的基因序列的前18bp加终止密码子TGA，TGA与rhFGF21的起始密码子错位融合，共用4个碱基，其序列为SEQ ID NO：6-7。420pep和hexapep是(Kirkpatrick RB et al.2002)经筛选得到的短肽，其内部含有RBS，在目的基因前插入这类短肽能够调节rhFGF21的转录和翻译，提高目的蛋白正确折叠的效率。

1.2含cistron顺反子的rhFGF21表达载体的构建

本发明所用的复制型表达载体pMATE是在质粒pMA5的基础上将质粒pMA5中的启动子P_HpaII替换为以麦芽糖为诱导剂的启动子P_MalA，启动子P_MalA的序列如SEQ ID NO：8所示。在本发明中，我们将人源的rhFGF21根据大肠杆菌密码子偏好性进行了密码子优化，得到rhFGF21，其序列为SEQ ID NO：9。以pMATE为骨架，利用CPEC PCR cloning方法(NatureProtocols,6,242–251,2011)在pMATE质粒上，启动子P_MalA后插入rhFGF21基因，具体方法为在pMATE质粒的启动子P_MalA末端上下游分别设计引物pMATE-vector.F/R反向PCR扩增pMATE质粒，同时设计引物rhFGF21-insert.F/R从基因合成的rhFGF21片段上扩增rhFGF21基因，其中rhFGF21-insert.F/R引物的5末端分别带有pMATE质粒目的插入位点两侧20bp的同源序列。将扩增得到的rhFGF21基因插入片段和pMATE载体片段切胶回收后，按照摩尔比1:1的比例添加到PCR体系中进行PCR反应，所得的PCR产物直接转化大肠杆菌，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性转化子，提取质粒后送金唯智公司进行测序鉴定，测序正确的质粒命名为pMATEF。以质粒pMATEF为模板，设计引物CIS1.F/R—CIS7.F/R，分别将cistron1-cistron7的核酸序列均分为两部分(前10bp和后11bp)分别添加在上下游引物的5’端，进行反向PCR，待PCR完成后，胶回收PCR产物。将胶回收的产物经T4多聚核苷酸激酶和T4DNA连接酶反应后，转化大肠杆菌DH5α经氨苄抗性LB平板筛选阳性转化子并引物验证后，委托金唯智测序公司将转有构建的待测质粒pMATEFc1-pMATEFc7等的大肠菌株进行测序，结果与目的序列一致，证明pMATEFc1-pMATEFc7质粒构建成功。

将上述载体构建成功后，与质粒pMATEF一起分别转化枯草芽孢杆菌1A751，经卡纳抗性LB平板筛选阳性转化子并引物验证后得到表达菌株对照组1A751F和CIS1，CIS2，CIS3，CIS4，CIS5，CIS6，CIS7进行摇瓶发酵。将活化后的表达菌株分别接种于LB发酵培养基中，250ml的锥形瓶装液量25ml，卡纳抗性，0h添加麦芽糖诱导剂1％(w/v)的最终浓度。取诱导24h的发酵液进行SDS-PAGE分析，如图2A所示，在分子量约为26kDa处出现一条特异性蛋白条带，与rhFGF21的理论分子量基本一致,从图2B的柱状图可知，与未添加cistron顺反子表达盒结构的对照组Ct相比，CIS1，CIS2，CIS3，CIS4，CIS5，CIS6，CIS7的表达水平均有明显提高，其中最优的为CIS5，说明cistron1，cistron2，cistron3，cistron4，cistron5，cistron6，cistron7对提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达均具有促进作用，其中cistron5的促进作用最为显著。

实施例2.通过优化二硫键帮助rhFGF21正确折叠以获得高产量可溶性表达

rhFGF21蛋白内部含有一个二硫键，由于枯草芽孢杆菌中二硫键相关的折叠酶种类和表达水平均比较低，因此存在不能正确形成或形成错误折叠的FGF21蛋白内的二硫键等风险。针对这一情况，本发明分别以pDL载体(来源于BGSC)为骨架，克隆并构建了携带有氧化还原酶DsbA的整合型载体pDF-d(构建方法同实施例1)以及构建弱化硫氧还蛋白TrxA的载体ptrx1，即将基因TrxA的启动子替换为表达强度较弱的启动子P_spac(构建方法同实施例1)。载体pDF-d和ptrx1分别转化枯草芽孢杆菌1A751，经氯霉素抗性LB平板筛选并引物验证后得到突变菌株DSB1和Trx1，帮助催化二硫键的形成。将表达载体pMATEF5(见

实施例5)转化于上述宿主菌株中，得到表达菌株DSB2和Trx2。经摇瓶发酵评价进行SDS-PAGE分析，如图3A所示，重组菌DSB2和Trx2在分子量约为30kDa处出现一条特异性蛋白条带，与信号肽protA-rhFGF21的理论分子量基本一致。图中的对照组Ct是表达载体pMATEF5转化野生型1A751菌株的对照菌。从图3B可知，与对照相比，重组菌Trx2，DSB2的表达水平均有明显提高，其中最优的为Trx2，说明弱化trxA或者过表达DsbA对提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达具有促进作用。

实施例3.通过优化分子伴侣系统帮助rhFGF21正确折叠以获得高产量可溶性表达

分子伴侣具有调节胞内多肽折叠、装配，并介导蛋白质跨膜转运等多重功能。目前利用大肠杆菌或枯草芽胞杆菌表达外源蛋白rhFGF21时，由于缺乏有效的蛋白折叠，rhFGF21无法被折叠成正确的蛋白构象，最终在细胞内形成无活性的包涵体蛋白，从而影响到rhFGF21的表达水平。因此，本发明以pDL载体(来源于BGSC)为骨架，分别克隆并构建了携带有BLSecA，CsaA，DnaK，Ffh，Ftsy，groESL，PrsA，QsSecA，Scr，SRP，YrbF等分子伴侣基因的整合型载体(构建方法同实施例1)，分别命名为：pDF1-pDF11并转化至枯草野生型菌株1A751中，经氯霉素抗性LB平板筛选并引物验证后得到突变菌株CHAP1，CHAP2，CHAP3，CHAP4，CHAP5，CHAP6，CHAP7，CHAP8，CHAP9，CHAP10，CHAP11。将表达载体pMATEFc5分别转化于上述宿主菌株中，得到表达菌株CC1，CC2，CC3，CC4，CC5，CC6，CC7，CC8，CC9，CC10，CC11。经摇瓶发酵评价，SDS-PAGE的分析结果如图4A所示，上述重组菌在分子量约为26kDa处出现一条特异性蛋白条带，与rhFGF21的理论分子量基本一致。从图4B结果来看，与对照组Ct相比，过表达CsaA，DnaK，Ffh，Ftsy，QsSecA，SRP的重组菌胞内的可溶性表达量均有提升，其中过表达DnaK的重组菌可溶性表达量提升的最多，说明过表达DnaK对提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达具有显著的促进作用。

实施例4.通过敲除胞外蛋白酶来获得rhFGF21的高产量分泌表达

枯草芽胞杆菌分泌的外源蛋白经常会被菌体自身分泌的胞外蛋白酶降解，严重影响目的蛋白的产量。所以蛋白酶相关基因的敲除能够提升外源蛋白在枯草芽胞杆菌系统中的分泌量。本发明通过ARA3基因敲除方法对枯草芽孢杆菌1A751中的bpr、epr、vpr、nprB、mpr、wprA 6个胞外蛋白酶基因进行了无痕敲除，构建了Kno6菌株。以CIS5菌株作为对照，将表达质粒pMATEFc5转化至Kno6菌株中，构建了Kno6f菌株。将菌株CIS5和Kno6f摇瓶发酵并进行SDS-PAGE表达水平评价，从图5A结果可知，与对照组相比，Kno6f菌株的胞外培养基组分中可见明显的大小约为26kDa的rhFGF21蛋白条带，而对照组CIS5胞外培养基组分中并无明显的rhFGF21目的蛋白条带。从图5B结果显示，Kno6的rhFGF21蛋白表达量远高于对照组，此结果说明枯草芽孢杆菌胞外蛋白酶的敲除对维持rhFGF21的胞外稳定性具有明显的促进作用。

实施例5.通过筛选信号肽来获得rhFGF21的高效分泌表达

信号肽可以帮助蛋白质前体折叠，帮助蛋白质移位，对蛋白质分泌有重要作用。在枯草芽胞杆菌宿主的系统中，来源于革兰氏阳性菌株的基因通常能够利用自身信号肽进行分泌表达，然而来源于革兰氏阴性菌和真核细胞的胞外蛋白通常需要借助于芽胞杆菌胞外蛋白的信号肽才能够进行表达分泌。所以，针对rhFGF21蛋白，通过筛选信号肽来提高外源蛋白的分泌量。以枯草芽孢杆菌1A751基因组为模板，设计引物SP1.F/R—SP12.F/R，分别将pelB，phoD，pel，ywbN，lipA，protA，ywmC，dacB，nprE，yddT，yoqM，yvcE等基因的信号肽核酸序列(见SEQ ID NO：10-21)扩增出来，以pMATEFc5为模板，设计引物pMATEF-vector.F/R，反向PCR扩增出pMATEFc5的表达载体骨架，通过Gibson酶分别将信号肽片段和表达载体骨架进行体外组装，转化大肠杆菌DH5α经氨苄抗性LB平板筛选并引物验证后，委托金唯智测序公司将转有构建的待测质粒pMATEF1-pMATEF12等的大肠菌株进行测序，结果与目的序列一致，证明pMATEF1-pMATEF12质粒构建成功。此外，本发明将过表达载体pDF3转化敲除菌Kno6，构建了Kno6cs菌株，即将敲除6个胞外蛋白酶的菌株与分子伴侣dnaK过表达载体有效结合，构建出适于rhFGF21蛋白表达分泌的宿主菌。将pMATEF1-pMATEF12表达质粒分别转化至Kno6cs菌株中，构建了Kno6csp1，Kno6csp2，Kno6csp3，Kno6csp4，Kno6csp5，Kno6csp6，Kno6csp7，Kno6csp8，Kno6csp9，Kno6csp10，Kno6csp11，Kno6csp12菌株，并通过摇瓶发酵和SDS-PAGE进行表达水平评价，从图6A结果可知，上述菌株的胞外培养基组分中均可见明显的大小约为26kDa的rhFGF21蛋白条带，图6B中信号肽pelB，pel，lipA，protA，ywmC，dacB，nprE，yddT，yoqM，yvcE均能将rhFGF21蛋白分泌至胞外，其中nprE，yddT，yvcE的分泌量最高，说明信号肽nprE，yddT，yvcE对提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌具有明显的促进作用。

实施例6.通过过表达转运蛋白以获得rhFGF21的高产量分泌表达

Sec及Tat途径相关转运蛋白能够帮助蛋白质跨膜运输，将枯草芽孢杆菌内相关的转运蛋白过表达能够提升外源蛋白在枯草芽胞杆菌系统中的分泌量。本发明以pDL载体(来源于BGSC)为骨架，分别克隆并构建了携带有secE，sipV，sipW，secY，secYEG，secA，dnaK-prsA，secDF，sipS，sipU等转运蛋白基因的整合型载体，分别命名载体为：pDF12--pDF21并转化至枯草野生型菌株1A751中，经氯霉素抗性LB平板筛选并引物验证后得到突变菌株Trans1,Trans2,Trans3,Trans4,Trans5,Trans6,Trans7,Trans8,Trans9,Trans10。将表达载体pMATEFc5分别转化于上述宿主菌株中，得到表达菌株TC1，TC2，TC3，TC4，TC5，TC6，TC7，TC8，TC9，TC10。经摇瓶发酵评价，SDS-PAGE的分析结果如图7A所示，与对照组相比，菌株TC1，TC2，TC3，TC4，TC5，TC6的胞外培养基组分中可见明显的大小约为26kDa的FGF21蛋白条带，由图7B可知，与对照组Ct相比，过表达secE，sipV，sipW，secY，secYEG，secA，secDF的重组菌的rhFGF21蛋白分泌量均有提高，最优的为过表达secY和secYEG。此结果说明过表达转运原件secE，sipV，sipW，secY，secYEG，secA，secDF对提高rhFGF21蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌具有促进作用。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达人源FGF21蛋白的技术及其重组菌株

<130> 2017

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

atgagtaaag gagaagaata a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

atggaagacg ccaaaaacta a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

atgaagaaaa aatcattcta a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 4

atgaaatatg gtatttatta a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 5

atggcagaca ataacaaata a 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 6

atgtatcgat taaataagga ggaataa 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 7

atgttcaagg aggatgattg a 21

<210> 8

<211> 335

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 8

cttttgtccc ctgccttttc taaattcacg cacaattgga tgttttatat aaatgattat 60

aaataattcg gcatgtatcc gaatcgtaca aaagaacctt ttcataagaa ttggaagggc 120

gtatattcac ttaaaattca cagttggtga gactttaaga ttacaaaaaa ggtaaaaaaa 180

ccaaatctct cagacataag gcaaatgaga aatttctcgt gcttggtgaa aaaacactaa 240

agttgatcaa atgacctaag tgcgccaaac gtgttacggg acgagctatc tcatggtata 300

aatggaattg taaaatttat caaggaggtc gtcat 335

<210> 9

<211> 543

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 9

catccgattc cggatagcag cccgctgctg cagtttggtg gtcaggtgcg tcagcgttat 60

ctgtataccg atgatgcgca gcagaccgaa gcacacctgg aaattcgtga agatggtacc 120

gtgggcggtg cggcggatca gagcccggaa agcctgctgc agctgaaagc gctgaaaccg 180

ggtgtgattc agattctggg tgttaaaacc agccgttttc tgtgccagcg tccggatggt 240

gcgctgtatg gcagcctgca ttttgatccg gaagcgtgca gctttcgtga actgctgctg 300

gaagatggtt ataacgtgta tcagagcgaa gcgcatggtc tgccgctgca tctgccgggt 360

aacaaaagcc cgcatcgtga tccggcgccg cgtggtccgg cgcgttttct gccgctgccg 420

ggtctgccgc cggctctgcc ggaaccgccg ggtattctgg ctccgcagcc gccggatgtt 480

ggtagctctg atccgctgtc tatggtgggc ccgagccagg gtcgtagccc gagctatgcg 540

agc 543

<210> 10

<211> 66

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 10

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgctat tactcgcggc tcaacccgca 60

atggcc 66

<210> 11

<211> 168

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 11

atggcatacg acagtcgttt tgatgaatgg gtacagaaac tgaaagagga aagctttcaa 60

aacaatacgt ttgaccgccg caaatttatt caaggagcgg ggaagattgc aggactttct 120

cttggattaa cgattgccca gtcggttggg gcctttgaag taaatgct 168

<210> 12

<211> 63

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 12

atgaaaaaag tgatgttagc tacggctttg tttttaggat tgactccagc tggcgcgaac 60

gca 63

<210> 13

<211> 84

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 13

atgagcgatg aacagaaaaa gccagaacaa attcacagac gggacatttt aaaatgggga 60

gcgatggcgg gggcagccgt tgcg 84

<210> 14

<211> 96

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 14

atgaaatttg taaaaagaag gatcattgca cttgtaacaa ttttgatgct gtctgttaca 60

tcgctgtttg cgttgcagcc gtcagcaaaa gccgct 96

<210> 15

<211> 108

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 15

atgaaaaaga aaaacattta ttcaattcgt aaactaggtg taggtattgc atctgtaact 60

ttaggtacat tacttatatc tggtggcgta acacctgctg caaatgct 108

<210> 16

<211> 69

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 16

atgaagaaaa gattttcact gatcatgatg acaggattgc tttttggatt aacttcacct 60

gcttttgca 69

<210> 17

<211> 81

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 17

atgcgcattt tcaaaaaagc agtattcgtg atcatgattt cttttcttat tgcaaccgta 60

aatgtgaata cagcacatgc t 81

<210> 18

<211> 81

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 18

atgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60

agcctgccag gtgttcaggc t 81

<210> 19

<211> 84

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 19

atgagaaaga aaagagttat tacttgtgtt atggctgcat cattgacttt aggctcactt 60

ttacctgcag gttacgcttc tgca 84

<210> 20

<211> 75

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 20

atgaaattaa gaaaagtatt gactggttct gttttatctc ttggattact cgtttctgct 60

tctcctgcat tcgct 75

<210> 21

<211> 90

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 21

atgagaaaga gtttaattac acttggtttg gcttccgtca tcgggacaag cagttttttg 60

atcccattta caagtaaaac tgcatcggcg 90

Claims (14)

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒选自以下结构a：

a：A-B-C-B-D-E；

其中，A为启动子；B为核糖体结合位点RBS；C为cistron顺反子；D为编码目的蛋白的核苷酸序列；E为终止子；

所述cistron顺反子为gfp，luc，glvA，rdpe或gsiB基因序列的前18bp加终止密码子TGA，其序列为SEQ ID NO：1-5；所述RBS序列为：5’-TAAGGAGG-3’。

2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述目的蛋白为异源蛋白。

3.如权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于，所述目的蛋白为rhFGF21。

4.一种表达载体，其特征在于，其含有权利要求1-3任一所述的表达盒。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求1-3任一所述的表达盒或权利要求4所述的表达载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还过表达了分子伴侣，所述分子伴侣为CsaA、DnaK、Ffh、Ftsy、QsSecA或SRP。

7.如权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还过表达了转运蛋白，所述转运蛋白为secE、sipV、sipW、secY、secYEG、secA或secDF。

8.如权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，信号肽为pelB、pel、lipA、protA、ywmC、dacB、nprE、yddT、yoqM或yvcE。

9.如权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还优化了与二硫键折叠相关的蛋白，所述优化方式为过表达蛋白为氧化还原酶DsbA和/或弱化硫氧还蛋白TrxA。

10.如权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的胞外蛋白酶bpr、epr、vpr、nprB、mpr和wprA的组合缺失。

11.如权利要求5或6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为芽孢杆菌。

12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或短小芽孢杆菌。

13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。

14.权利要求1-3之一所述表达盒或权利要求4所述表达载体或权利要求5-13之一所述宿主细胞在表达成纤维细胞生长因子21中的应用。

Images