CN112888787A - 新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细菌菌株，其含有至少一种编码重组蛋白质的基因，其特征在于其含有由以下组成的开放阅读框：(i)编码介导所述蛋白质向周质的易位的N‑末端信号肽的DNA片段，其连接至(ii)编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及(iii)编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。本发明还涉及一种用于使用根据本发明的细菌菌株发酵生产重组蛋白质的方法。如此，可能实现与现有技术相比培养基中的重组蛋白的增加的量。

Description

新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途
本发明涉及一种新型细菌lpp突变体及其在分泌生产重组蛋白质的发酵方法中的用途。
近年来，重组蛋白质药物(药物蛋白质/生物制品)的市场增长强劲。特别重要的蛋白质药物为真核生物蛋白质，特别是哺乳动物蛋白质和人蛋白质。重要的药物蛋白质(药物活性蛋白质)的实例为细胞因子、生长因子、蛋白质激酶、蛋白质和肽激素以及抗体和抗体片段。由于药物蛋白质的生产成本仍然很高，因此一直在寻求更有效并因此更具成本效益的方法和其生产系统。
通常，重组蛋白质在哺乳动物细胞培养物或在微生物体系中产生。与哺乳动物细胞培养物相比，微生物体系的优势在于，以这种方式可在更短的时间内以更低的成本生产重组蛋白质。因此，细菌特别适合于重组蛋白质的生产。由于其广泛研究的遗传学和生理学、较短的传代时间和简单的操作，革兰氏阴性细菌肠杆菌(Escherichia coli)目前是生产重组蛋白质最常用的生物。特别有吸引力的是这样的生产方法，其中靶蛋白质被细菌细胞以正确折叠直接释放到发酵培养基中，因为这免去了复杂的细胞破裂和可能的无益的蛋白质重折叠过程。细胞外生产的另一优势为，由于靶蛋白质的积累不受周质或细胞质空间的限制，将靶蛋白质释放到培养基中通常可以提高产物产量。
适用于细胞外生产靶蛋白质的是，例如，所谓的大肠杆菌的“渗漏(leaky)”菌株，由于细胞包膜的某些结构元件的缺失或改变，其将位于周质中的蛋白质排放到培养基中的程度增加。这种“渗漏”菌株的外膜中脂蛋白的比例可能改变，尤其是某些Braun的质脂蛋白(lpp)的突变体中(Inouye等，1977,J.Bact.132,308-313页；Suzuki 1978,Mol.Gen.Genet.167,1-9页；Giam等，1984,Eur.J.Biochem.141,331-379页)。
已经公开了异源蛋白质的工业规模生产方法，其中使用大肠杆菌的不同lpp突变体来实现将靶蛋白质释放到发酵培养基中(US 2008/0254511 A1，US 5,223,482 A)。
但是，由于细胞裂解的趋势较高，“渗漏”菌株在某些异源靶蛋白质的生产中具有以下缺点：尽管采取了某些稳定细胞的措施例如，向培养基中添加增加量的Ca和Mg离子(见US 2008/0254511 A1)，它们仍相对较早且强烈地发生裂解，结果是，首先，缩短了蛋白质的生产阶段并因此产物收率低于其在较长的生产阶段的情况中的可能收率。以及其次，细胞裂解导致培养基粘度升高，这尤其可归因于细胞裂解时释放的DNA。结果，靶蛋白质的后续纯化和回收变得更困难，且这又导致不必要的高处理成本。
本发明的目的为提供一种用于生产重组靶蛋白质的发酵方法中使用的突变的细菌菌株，其中靶蛋白质的主要部分在培养过程中被分泌到发酵培养基中，并且存在于培养基中的靶蛋白质的量高于现有技术中公开的细菌菌株的情况，即，靶蛋白质将以增加的产量存在于培养基中。
该目的通过含有至少一种编码重组蛋白质的基因的细菌菌株实现，其特征在于：
所述细菌菌株含有由以下组成的开放阅读框：
I编码介导所述蛋白质向周质的易位的N-末端信号肽的DNA片段，其连接至
ii编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及
iii编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，其与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。
该细菌菌株优选特征在于其为革兰氏阴性细菌，特别优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的细菌菌株，特别优选大肠杆菌种的菌株。
开放阅读框(ORF)是指DNA或RNA的位于起始密码子和终止密码子之间并编码蛋白质的氨基酸序列的区域。ORF也称为编码区域。
ORF被非编码区域包围。因此，基因是指含有用于产生生物活性RNA的所有基本信息的DNA片段。因此，基因不仅含有通过转录产生单链RNA拷贝的DNA片段，而且还含有参与该拷贝过程的调控的其他DNA片段。由于基因含有至少一个ORF，因此基因也编码至少一种蛋白质。
在ORF中，DNA的碱基三联体(triplet)在每种情况下编码特定的氨基酸或终止信号。被编码为用于形成蛋白质的构件的氨基酸也称为蛋白质原氨基酸。
在本发明的上下文中以单数使用的术语“一种/该重组蛋白质”还可以意指多种不同的重组蛋白质。优选考虑1至3种不同的重组蛋白质，特别优选1种重组蛋白质或2种不同的重组蛋白质。该重组蛋白质也称为靶蛋白质。
大肠杆菌Lpp野生型基因的DNA序列(SEQ ID No.1，以EcoGene accessionNo.EG10544公开)编码未加工的Lpp蛋白质(Lpp前蛋白质)，其由78个氨基酸组成(SEQ IDNo.2)。在此，前60个核苷酸编码信号肽，该信号肽控制蛋白质分泌到周质中，并在易位(加工)后被切割掉。分别位于加工的Lpp野生型蛋白质的N-末端和C-末端的为半胱氨酸残基(Cys)和赖氨酸残基(Lys)(参见图1B)，其均被细胞翻译后修饰，从而确保Lpp蛋白质的完整功能，即外膜与肽聚糖层(也称为细菌细胞壁)的连接(Giam等，1984,J.Biol.Chem.259,5601-5605页)。术语Lpp、Lpp蛋白质、野生型Lpp蛋白质和Lpp野生型蛋白质在本发明中同义使用，并且在技术文献中也称为脂蛋白、胞壁脂蛋白(murein lipoprotein)或Braun的质脂蛋白。蛋白质Lpp由基因lpp(lpp基因、野生型lpp基因、Lpp野生型基因)编码。
根据本发明的细菌菌株含有ORF，该ORF由编码N-末端信号肽的DNA片段、lpp(N)和lpp(C)组成。所述ORF编码的蛋白质为Lpp融合蛋白质。在本发明的上下文中，Lpp融合蛋白质应理解为是指由两个Lpp蛋白质(下文称为Lpp部分，每个部分对应于可能突变的Lpp野生型蛋白质)组成并以未加工的形式携带信号肽(SP)的融合蛋白质。图1A示意性地表示未加工形式的这种融合蛋白质。在这种情况下，与未加工形式的融合蛋白质的信号肽连接的N-末端部分(Lpp(N))与C-末端部分(Lpp(C))连接。Lpp(N)和Lpp(C)可以直接连接或通过由一个至多于一个氨基酸组成的氨基酸接头序列(L)连接。
融合蛋白质的两个Lpp部分的每一个的氨基酸序列在每种情况下可以对应于加工的Lpp野生型序列，或者与加工的Lpp野生型序列相比在氨基酸序列中包含至多十个突变，两个Lpp部分的突变不一定是相同的。在本发明中，Lpp融合蛋白质也称为2xLpp蛋白质，并由2xlpp基因编码。
Lpp融合蛋白质的氨基酸序列中可能存在的突变包括取代(氨基酸置换)、缺失(氨基酸不存在)和插入(其他氨基酸插入)。
在根据本发明的菌株中，编码Lpp融合蛋白质的2xlpp基因存在于染色体上或质粒上。优选地，编码Lpp融合蛋白质的基因位于染色体上。
优选地，该细菌菌株的特征在于其不含有编码与加工的野生型Lpp蛋白质相比具有至少80％同一性的蛋白质的其他基因。经加工的野生型Lpp蛋白质的序列如SEQ ID No.2氨基酸21至氨基酸78所示。
特别优选地，根据本发明的细菌菌株不含有野生型lpp基因。因此优选其中Lpp融合蛋白质是所述菌株中出现的唯一Lpp形式的细菌菌株。在该实施方案中，该细菌菌株不形成Lpp野生型蛋白质，并且除了Lpp融合蛋白质之外，不形成通过氨基酸置换衍生自Lpp野生型蛋白质的Lpp变体。
优选地，Lpp(N)和Lpp(C)经由由一个至多于一个氨基酸，特别优选一个至20个并且尤其优选一个至10个氨基酸组成的接头连接。原则可能的接头序列是任何所需顺序的全部20个蛋白质原氨基酸。优选的构成接头序列的氨基酸为甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。在特别优选的实施方案中，接头序列由三个甘氨酸残基组成。
优选的是，该细菌菌株的特征在于，由lpp(N)和lpp(C)编码的氨基酸序列与野生型Lpp蛋白质的氨基酸序列的不同之处在于：
i)对于Lpp(N)，存在于野生型Lpp蛋白质中的C-末端氨基酸赖氨酸被突变，或
ii)对于Lpp(C)，存在于野生型Lpp蛋白质中的N-末端氨基酸半胱氨酸被突变。
在一个特别优选的实施方案中，与Lpp野生型蛋白质相比，在Lpp(N)的情况下C-末端赖氨酸残基发生突变，并且在Lpp(C)的情况下N-末端半胱氨酸残基发生突变。特别优选地，所述残基缺失(参见图1C)。该突变旨在防止通常在所述氨基酸残基处发生的翻译后修饰。
SEQ ID No.3(在图1C中示意性地表示)示出了仍未加工的Lpp融合蛋白质的特别优选的序列的实例，该Lpp融合蛋白质含有信号肽(氨基酸1-20)、Lpp(N)ΔLys78(氨基酸21-77)和Lpp(C)ΔCys21(氨基酸81-137)，其中Lpp(N)ΔLys78和Lpp(C)ΔCys21分别与Lpp野生型序列的区别仅在于C-末端赖氨酸残基的缺失和N-末端半胱氨酸残基的缺失，并通过由三个甘氨酸残基组成的接头序列彼此连接。在本发明的上下文中，所述蛋白质被命名为2xLppΔ。2xLppΔ蛋白质由SEQ ID No.16中所示的DNA片段编码。所述DNA片段命名为2xlppΔ。
优选地，该细菌菌株的特征在于，在由lpp(N)或lpp(C)编码的氨基酸序列中的至少一个中，在氨基酸位置77代替精氨酸而存在的是任何其它蛋白质原氨基酸(基于未加工的野生型Lpp蛋白质的氨基酸的编号和序列)。特别优选将两个Lpp部分的至少一个中的位置77的精氨酸残基置换为半胱氨酸残基(R77C置换)。
原则上，来自大肠杆菌的脂蛋白的所有信号肽都可以作为使Lpp融合蛋白质易位到周质中的信号肽。实例为脂蛋白Lpp、Pal、NlpI、NlpB和OsmB的信号肽(Hayashi and Wu1990,J.Bioenerg.Biomembr.22,451-471页)。在本发明的上下文中，信号肽可以包含相应的野生型序列或由其通过一个或多个突变衍生的序列。Lpp融合蛋白质的信号肽优选包含野生型Lpp蛋白质的信号肽序列，其氨基酸序列与野生型Lpp蛋白质的信号肽相比在至多8个位置存在差异。
优选地，该细菌菌株的特征在于，N-末端信号肽为与野生型Lpp蛋白质的信号肽具有至少80％同一性的氨基酸序列。特别优选地，Lpp融合蛋白质的信号肽的氨基酸序列与野生型Lpp蛋白质的信号肽的氨基酸序列相同，特别优选地，核苷酸序列也相同。野生型Lpp蛋白质的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2的氨基酸1-20所示，而核苷酸序列如SEQ IDNo.1的核苷酸1-60所示。
优选地，该细菌菌株的特征在于，N-末端信号肽在氨基酸位置14含有某种非甘氨酸的其他蛋白质原氨基酸，并且在所有其他氨基酸位置与野生型Lpp蛋白质的信号肽相同。
特别优选地，该细菌菌株的特征在于，N-末端信号肽的位置14蛋白质原氨基酸为天冬氨酸。在这种情况下，在位置14存在天冬氨酸残基而非甘氨酸残基(G14D置换)，并且所有其它氨基酸位置均与野生型Lpp蛋白质的信号肽相同。
2xlpp基因的表达可以由在大肠杆菌中起作用的任何启动子调控。在这种情况下，优选的是在大多数生长条件具有组成型活性的启动子(例如，σ70-依赖性启动子)，诸如，例如，基因gapA、rpiA、mppA、lpp、catB、tufB和proC的启动子，以及没有调节活性操纵子区域的天然或人工启动子，诸如，例如，tetA启动子、lac启动子、tac启动子和trp启动子。启动子可以包含天然序列或通过碱基置换调节其强度。
在一个优选的实施方案中，该细菌菌株的特征在于，编码2xLpp蛋白质的开放阅读框而不是编码野生型Lpp蛋白质的开放阅读框位于染色体中。在已经将染色体Lpp野生型ORF替换为Lpp融合蛋白质的ORF的这些菌株中，Lpp融合蛋白质的表达受天然lpp启动子的调控。这意味着，2xlpp基因处于启动子的调控，该启动子也负责野生型Lpp蛋白质的表达。
用于产生根据本发明的Lpp融合蛋白质的基因的方法是本领域技术人员已知的。
这种基因通常首先在体外产生，且然后导入进细胞中。用于Lpp融合蛋白质的基因可以，例如，通过剪接各自编码融合蛋白质的两个Lpp部分之一的两个DNA分子(Horton等，2013,BioTechniques 54,129-133页)，以Lpp野生型基因的DNA为模板，借助于“重叠延伸”PCR方法来产生。或者，也可以通过基因合成的方式完整地产生2xlpp基因。
如果Lpp融合蛋白质的基因要通过质粒在细胞中表达，则必须先将该基因克隆到质粒中。适用于此目的的是在所选细菌菌株中可繁殖的所有已知质粒，诸如，例如，已知表达载体诸如pJF118EH、pKK223-3、pUC18、pBR322、pACYC184、pASK-IBA3或pET的衍生物。用于将2xlpp基因整合入质粒以及用于将质粒转化入细菌细胞的方法是本领域技术人员已知的。
或者，也可以通过各种标准方式将体外产生的2xlpp基因整合至宿主细胞的染色体中。这种整合可以发生在天然lpp基因位点，结果是最初位于那里的Lpp野生型基因被2xlpp基因取代，或者发生在染色体的另一位点。
整合到染色体中可以，例如，借助Link等，(1997,J.Bacteriol.179,6228-6237页)所描述方法的手段，通过同源重组的机制实现。为此，必须首先将编码Lpp融合蛋白质的基因克隆到质粒pKO3中，然后将其导入进细胞中。然后用Link等所描述的步骤对这些转化体进行操作，其中将编码Lpp融合蛋白质的基因整合入染色体中。
或者，按照Sun等，(2008,Appl.Environ.Microbiol.74,4241–4245页)所描述的方法，也可以将含有2xlpp基因的DNA片段直接转化进细胞中，并在所需位点整合至染色体中。这涉及利用反选择原理。首先，在将要整合进细胞染色体的2xlpp基因所需的基因座导入的是含有cat基因和枯草芽孢杆菌的sacB基因的表达盒，cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，及sacB基因编码果聚糖蔗糖酶。所述盒的整合可以通过Datsenko and Wanner(2000,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97,6640-6645页)的方法进行，有可能通过氯霉素抗性的选择鉴定正确的整合体。这些细胞对氯霉素具有抗性，并且由于表达了sacB基因而对蔗糖敏感。然后，用线性DNA片段转化这些细胞，所述片段含有2xlpp基因，并且所述片段的侧翼包含与所需基因座同源的DNA序列，以确保DNA片段在那里的位点特异性整合。由于在蔗糖存在下的生长能力的恢复，可以鉴定其中已经实现cat-sacB盒置换为2xlpp基因的细胞。利用对整合位点特异的寡核苷酸进行PCR，并对PCR产物进行后续测序，最终实现了2xlpp基因正确整合进染色体的验证。
优选地，该重组蛋白质为异源蛋白质。在本发明的上下文中，异源蛋白质应理解为是指不属于细菌菌株的蛋白质组(即，完整的天然蛋白质的集合)的蛋白质。
优选地，该异源蛋白质为真核生物蛋白质，特别优选地，含有一个或多个二硫键或以其功能形式作为二聚体或多聚体存在的蛋白质，即，该蛋白质具有四级结构并由多个相同(同源)或不同(异源)亚基组成。
最重要的异源蛋白质种类包括抗体及其片段、细胞因子、生长因子、蛋白质激酶、蛋白质激素、脂质运载蛋白质、anticalins、酶、结合蛋白质和分子支架以及由其衍生的蛋白质和药理学上有效的肽。所述蛋白质类别的实例尤其是重链抗体及其片段(例如，纳米抗体)、单链抗体、干扰素、白介素、白介素受体、白介素受体拮抗剂、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、白血病抑制剂、干细胞生长因子、肿瘤坏死因子、生长激素、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子、血管生成抑制剂、组织纤溶酶原激活剂、凝血因子、胰蛋白质酶抑制剂、弹性蛋白质酶抑制剂、补体成分、缺氧诱导的应激蛋白质、原癌基因产物、转录因子、病毒组成型蛋白质、胰岛素原、甲状旁腺激素、尿激酶原、促红细胞生成素、血小板生成素、神经营养蛋白质、蛋白质C、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、肾素、溶菌酶、P450、前凝乳酶原、脂皮质蛋白质、reptin、血清白蛋白、链激酶、替奈普酶、CNTF和环糊精糖基转移酶。
衍生自分子支架的蛋白质的实例尤其为，(衍生自CTLA-4的)evibodies，(金黄色葡萄球菌的蛋白质A的)affibodies、(人A结构域家族的)avimers、(转铁蛋白质的)transbodies、(锚蛋白质重复蛋白质的)DARPins、(纤连蛋白质III的)adnectin、(硫氧还蛋白质的)肽适体、(微蛋白质的)微体、(泛素的)affilins、α-晶状体蛋白质、卡律蝎毒素(charybdotoxin)、四连接素(tetranectin)、RAS结合蛋白AF-6的PDZ结构域、蛋白质抑制剂的Kunitz型结构域。
由多个蛋白质亚基组成的特别优选的蛋白质种类为抗体。因此，特别优选地，该细菌菌株的特征在于，异源蛋白质为抗体或抗体片段。抗体广泛用于研究、诊断和治疗，因此需要特别有效且在工业规模上可能的生产方法。
功能性Fab抗体片段和全长抗体也可以通过本发明方法的方式在细胞外产生。在这方面，优选的全长抗体为IgG类和IgM类的抗体，特别是IgG类的抗体。
在生产功能性Fab抗体片段时，细胞必须同时合成轻链(LC)(其包含VL和CL结构域)和重链(HC)(其包含VH和CH1结构域)的相应片段，然后将其分泌到周质中，并最后到发酵培养基中。然后在细胞质外，两条链组装以形成功能性Fab片段。
为了将重组靶蛋白质从细胞质分泌到周质中，需要将框内产生(produced inframe)的蛋白质的ORF的5'端与用于蛋白质输出的信号序列的3'端连接。原则上，适于此目的的是允许借助于Sec或TAT器进行易位的所有信号序列。现有技术中描述了各种信号序列，例如以下基因的信号序列：phoA、ompA、pelB、ompF、ompT、lamB、malE、葡萄球菌蛋白质A、StII和其他(Choi和Lee,Appl.Microbiol.Biotechnol.64(2004),625-635)。
根据本发明，用于将重组靶蛋白质从细胞质分泌到周质中的优选的是大肠杆菌的phoA基因或ompA基因的信号序列，或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)M5a1的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的信号序列，或US 2008/076157 A1中公开的源自该信号序列的序列。特别优选肺炎克雷伯氏菌M5a1的CGTase的信号序列(如EP0448093中所公开的，且在本发明中如序列SEQ ID No.4所示的)，以及由其衍生的具有SEQ ID No.5的序列(其也在US 2008/076157 A1中公开)。
包含由信号序列和重组靶蛋白质的ORF组成的框内融合体的DNA分子通过本领域技术人员已知的方法产生。例如，可以首先使用寡核苷酸作为引物通过PCR的方式扩增靶蛋白质的基因，然后使用常见的分子生物学技术将其连接至包含信号肽序列的DNA分子，且其与靶蛋白质的基因类似地产生，以形成框内融合体，即，包含信号序列和靶蛋白质基因的连续阅读框。或者，也可以通过基因合成的方式产生包含上述两个功能片段的完整DNA分子。然后可以将该信号序列-重组基因融合体导入载体(例如质粒)中，然后通过转化的方式将其导入宿主细胞中，或者通过已知方法将其直接整合至宿主细胞的染色体中。优选地，将信号序列-重组基因融合体导入质粒中，并用所述质粒转化宿主细胞。
为了将由多个不同亚基组成的重组靶蛋白质从细胞质分泌到周质中，需要将要产生的所有亚基的基因(靶基因)分别功能性地连接至用于蛋白质输出的信号序列。在这方面，各种亚基的基因可以与相同或不同的信号序列连接。优选与不同的信号序列连接，特别优选的是，一个亚基与大肠杆菌的phoA基因或ompA基因的信号序列连接，以及另一亚基与肺炎克雷伯氏菌M5a1的CGTase的信号序列的连接，该信号序列具有序列SEQ ID No.4或由其衍生的序列，诸如，例如，序列SEQ ID No.5。
然后可以将各个亚基的信号序列-靶基因融合体导入载体(例如质粒)中，或通过已知方法直接整合至宿主细胞的染色体中。在这方面，可以将各个亚基的信号序列-靶基因融合体克隆到不同但彼此相容的质粒上，或者可以将其克隆到一个质粒上。在这方面，基因融合体可以在一个操纵子中组合，或者它们可以分别在不同的顺反子中表达。在此优选在一个操纵子中组合。两个基因构建体可以同等地整合到宿主细胞的染色体中，在一个操纵子中组合或分别在不同的顺反子中组合。在此也优选在一个操纵子中组合。
优选地，提供在所选细菌菌株中具有表达信号(启动子、转录起始位点、翻译起始位点、核糖体结合位点、终止子)功能的由信号序列和编码要分泌的重组蛋白质的ORF组成的DNA表达构建体(信号序列-靶基因融合体)。
适合作为编码重组靶蛋白质的基因的启动子是本领域技术人员已知的所有启动子，实例首先是诱导型启动子，诸如lac、tac、trc、lambda PL、ara或tet启动子或由其衍生的序列。其次，还可以通过使用组成型启动子(诸如，例如，gapA启动子)实现永久表达。然而，也可以使用通常与要产生的重组蛋白质的基因连接的启动子。
然后使用本领域技术人员已知的方法(例如，转化)，将该表达构建体(启动子-信号序列-编码重组蛋白质的序列)导入形成Lpp融合蛋白质的细胞中。用于产生重组蛋白质的表达构建体例如被导入载体，例如质粒，诸如，例如已知表达载体如pJF118EH、pKK223-3、pUC18、pBR322、pACYC184、pASK-IBA3或pET的衍生物。适合作为质粒选择标记的是编码对例如氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素或其它抗生素具有抗性的基因。
因此，根据本发明，优选使用这样的细菌菌株，其中编码与编码在所选细菌菌株中有活性的信号肽的信号序列功能性连接的重组蛋白质的ORF优选还具有在所选细菌菌株中有功能的表达信号，优选启动子、转录起始位点、翻译起始位点、核糖体结合位点和终止子。
本发明还提供了一种发酵生产重组蛋白质的方法，其中将根据本发明的细菌菌株在发酵培养基中培养，发酵后从细胞中去除发酵培养基，并从发酵培养基中分离蛋白质。
细胞(其表达Lpp融合蛋白质的基因并含有由信号序列和编码要分泌的蛋白质并与功能性表达信号连接的重组基因组成的DNA表达构建体)的培养(发酵)通过本领域技术人员已知的常规发酵方法，在生物反应器(发酵罐)中实现。
发酵优选在常规生物反应器(例如，搅拌罐、泡罩塔发酵罐或气升式发酵罐)中进行。特别优选搅拌罐式发酵罐。
发酵包括在液体培养基中培养蛋白质生产菌株的细胞16-150h，同时持续监测并精确控制各种参数(诸如，例如，营养进料、氧分压、培养物的pH和温度)。培养时间优选为24-72h。
培养基原则上(发酵培养基)可能为本领域技术人员已知的用于培养微生物的所有常用培养基。
在这方面，作为用于培养细菌细胞的培养基，可以使用向其中加入确定比例的复合组分(诸如，例如，蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、糖蜜或玉米浆)的复合培养基或低盐培养基(minimal salts media)。对于生产药物蛋白质优选的是化学上限定的盐培养基(chemically defined salts media)，即，与完全培养基相反，其具有精确限定的底物组成。
用于培养细菌细胞(诸如，优选地，大肠杆菌细胞)的合适的低盐培养基的实例，尤其为M9基础培养基、改良的基础培养基或Riesenberg矿质培养基(Kangwa等，,2015,AMBExpr 5,70页)以及US 2008/0254511 A1中所述的培养基FM4。
在根据本发明的方法中，表达Lpp融合蛋白质的基因，以及编码与编码信号肽的信号序列框内连接的重组蛋白质的基因的细菌菌株，相对于含有Lpp野生型蛋白质的菌株在相对短的发酵时间内生长以形成相对高的细胞密度，并且同时将所述重组蛋白质分泌到盐培养基中。
原则上，用于发酵的主要碳源可以为细胞可利用的所有糖、糖醇或有机酸或其盐。在这方面，优选使用葡萄糖、乳糖或甘油。特别优选葡萄糖和乳糖。还可能的是多个不同碳源的组合添加。此外，可以在发酵开始将碳源最初完全加入发酵培养基中，或者开始时最初不加入碳源或仅加入一部分碳源，并且随发酵过程添加碳源。在这方面特别优选的是一个实施方案，其中首先加入一部分碳源，然后添加一部分碳源。特别优选地，最初以10-30g/l的浓度加入碳源，并且当浓度下降至小于5g/l时开始添加，并且配置为使得浓度保持在5g/l以下。
培养物中的氧分压(pO2)优选在10％至70％饱和度之间。优选20％至60％之间的pO2；特别优选地，在20％至40％饱和度之间的pO2。
培养物的pH优选在pH 6至pH 8之间。优选地，将pH设置在6.5至7.5之间；特别优选地，培养物的pH保持在6.8至7.2之间。
培养物的温度优选在15℃至45℃之间。优选20℃至40℃的温度范围，特别优选25℃至35℃的温度范围，并且非常特别优选30℃。
优选地，该方法的特征在于，在去除发酵培养基后，从发酵培养基中纯化重组蛋白质。从粗产物中纯化分泌蛋白质可以通过本领域技术人员已知的常规纯化方法进行，如现有技术中已知的。通常，在第一步骤中，借助分离方法(诸如离心或过滤)将分泌的靶蛋白质与细胞分离。然后可以(例如通过超滤)将靶蛋白质浓缩，及然后通过标准方法(诸如沉淀、层析或超滤)进一步纯化。在此特别优选诸如亲和层析的方法，其利用已经正确折叠的蛋白质的天然构象。
表达2xlpp基因和重组靶蛋白质的细菌菌株的特别优点为存在于培养基中的靶蛋白质的量高于现有技术中公开的细菌菌株的情况。
实施例3(参见表1)提供了这一点的清楚证据。当使用表达2xlppΔ的细菌菌株(JE5512 2xlppΔ/pJF118ut-CD154)时，在培养上清液中测得的抗-CD154 Fab滴度为：以绝对值(即，归一化为相同体积)，几乎是使用已知lpp3突变体(JE5512lpp3/pJF118ut-CD154)时的两倍，并且是野生型菌株JE5512/pJF118ut-CD154确定值的多倍。
实施例4(表2)也证实，当使用表达2xlppΔ的细菌菌株(JE5512 2xlppΔ/pCGT)时，以绝对值，测量的培养上清液中的CGTase的量最高。
增加的产量应理解为是指释放到培养基中的重组蛋白质的产量为根据(使用含有重组蛋白质基因的野生型细菌菌株和/或含有重组蛋白质基因并另外表达使细菌细胞包膜不稳定的蛋白质的野生型细菌菌株)现有技术水平可生产的培养基中重组蛋白质产量的至少1.1倍，优选至少1.5倍，及特别优选至少1.8倍。
表达2xlpp基因和重组靶蛋白质的细菌菌株的另一优点为靶蛋白质的主要部分在培养过程中分泌到发酵培养基中。
实施例3(见表1)再次提供了这一点的清楚证据。而当使用表达2xlppΔ的细菌菌株(JE5512 2xlppΔ/pJF118ut-CD154)，在培养上清液中测量到几乎60％的抗-CD154 Fab滴度，当使用已知的lpp3突变体(JE5512 lpp3/pJF118ut-CD154)时其仅为低于50％，而在野生型菌株JE5512/pJF118ut-CD154情况下仅为低于7％。
同样在实施例4中，当使用表达2xlppΔ的细菌菌株(JE5512 2xlppΔ/pCGT)时，可以在培养上清液中测量几乎60％的重组靶蛋白质(CGTase)。
将重组靶蛋白质的主要部分分泌到培养基中应当理解为是指，基于总共产生的靶蛋白质的量，优选以重量超过50％，特别优选以重量超过55％存在于培养基中。
与使用“渗漏”细菌菌株相反，根据本发明的细菌菌株具有以下优点：它们可以以稳定的方式培养，即，即使在培养后期，培养物的光密度(其为完整细胞数量的量度)也仅仅降低一点。结果，与“渗漏”细菌菌株相比，蛋白质生产阶段得以延长，产物产量得以提高，并且没有由于细胞裂解时释放的DNA所导致的培养基的粘度升高。最后所提到的简化了靶蛋白质的后续纯化和回收，并且这进而对处理成本具有积极影响。
图1显示了未加工的Lpp融合蛋白质(A，2xLpp)与未加工的Lpp野生型蛋白质(B，Lpp，SEQ ID No.2中所示序列)和实施例中所用的未加工的Lpp融合蛋白质(C，2xLppΔ，SEQID No.3中所示序列)的比较的示意图。
图1中使用的缩写具有以下含义：
SP，信号肽
Cys，氨基酸半胱氨酸
Lys，氨基酸赖氨酸
Gly，氨基酸甘氨酸
L，可能存在的接头序列，由0-20个氨基酸组成
Lpp，Lpp野生型蛋白质的氨基酸序列
Lpp(N)，Lpp的氨基酸序列的位于N-末端拷贝，其基于Lpp野生型序列，在至多10个氨基酸位置具有突变
Lpp(C)，Lpp的氨基酸序列的位于C-末端拷贝，其基于Lpp野生型序列，在至多10个氨基酸位置具有突变
Lpp(N)ΔLys78，Lpp的氨基酸序列的位于N-末端拷贝，其基于Lpp野生型序列，在位置78缺失氨基酸赖氨酸
Lpp(C)ΔCys21，Lpp的氨基酸序列的位于C-末端拷贝，其基于Lpp野生型序列，在位置21缺失氨基酸半胱氨酸
-，破折号表示氨基酸的缺失
图2显示了表达质粒pJF118ut-CD154的示意图。
图2中所使用的缩写具有以下含义：
tac p/o：tac启动子/操纵子
EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点
cgt-SP：CGTase的信号肽
HC：Fab片段CD154重链的ORF
phoA-SP：phoA信号肽
LC：Fab片段CD154轻链的ORF
His-Tag：Fab片段轻链的C-末端的His标签
rrnB：终止子
blaβ-内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)
ColE1：ColE1复制起点
TcR：四环素抗性基因
lacIq：tac启动子的阻遏物
实施例
以下实施例用于进一步阐明本发明而非限制本发明。
所用的所有分子生物学和微生物学方法诸如聚合酶链反应(PCR)，基因合成，DNA的分离和纯化，通过限制酶、Klenow片段和连接酶对DNA的修饰，转化，P1转导等均以本领域技术人员已知的方式进行，描述于文献中或由相应的制造商推荐。所用的寡核苷酸购自Metabion International AG(Planegg/Germany)。
实施例1：产生形成Lpp融合蛋白质(2xLppΔ蛋白质)的大肠杆菌JE5512菌株(2xlppΔ突变体)
1.生产大肠杆菌菌株JE5512 lpp::cat-sacB pKD46
用于产生形成Lpp融合蛋白质的菌株的起始菌株为大肠杆菌Lpp野生型菌株JE5512(HfrC man pps)(Hirota等，1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,1417-1420页，菌株可获自国立遗传学研究所微生物遗传学实验室(National Institute of Genetics,Microbial Genetics Laboratory)，NBRP大肠杆菌，1111Yata,Mishima,Shizuoka,411-8540JAPAN)。
在该菌株中，首先用表达盒代替染色体野生型lpp基因的编码区域(SEQ ID No.1中的核苷酸1-237)，该表达盒不仅包含氯霉素乙酰转移酶的基因(cat；UniProtNo.P62577)，还包含枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的果聚糖蔗糖酶的基因(sacB；UniProtNo.P05655)。为此目的，用作借助PCR扩增所述cat-sacB盒的模板的是质粒pKO3的衍生物(Link等，1997,J.Bacteriol.179,6228-6237页；对于pKO3的序列，参见http://arep.med.harvard.edu/labgc/pKO3v.html)，其中，通过用限制酶SmaI和Bst1107I切割并重新连接大小为4729个碱基对的片段，cat基因和sacB基因之间的大部分区域已被去除。所得质粒命名为pKO3-Delta-M13。使用作为模板的pKO3-Delta-M13和寡核苷酸lpp-cat-sac-fw(SEQ ID No.6)和lpp-cat-sac-rev(SEQ ID No.7)进行PCR以扩增cat-sacB盒。在这种情况下，lpp-cat-sac-fw的前60个核苷酸与在5'侧的lpp的开放阅读框(ORF)的序列同源，并且lpp-cat-sac-rev的前60个核苷酸与在3'侧的lpp ORF的序列同源。结果为含有cat-sacB盒的线性DNA片段。
用质粒pKD46(Coli Genetic Stock Center CGSC#:7739)转化菌株JE5512，及这得到菌株JE5512 pKD46。菌株JE5512 pKD46的感受态细胞用含有cat-sacB盒的线性DNA片段进行转化，该感受态细胞根据Datsenko和Wanner(2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97,6640-6645页)的信息产生。在含有20mg/L氯霉素的LB琼脂平板上对使cat-sacB盒进入JE5512染色体的野生型lpp ORF位置的整合进行选择。以这种方式获得的是其中野生型lppORF已完全被cat-sacB盒(JE5512 lpp::cat-sacB pKD46)置换的细胞。使用寡核苷酸pykF(SEQ ID No.8)和ynhG2(SEQ ID No.9)，以氯霉素抗性细胞的染色体DNA为模板，借助PCR证实在染色体中正确位置实现的整合。然后，菌株JE5512lpp::cat-sacB pKD46的细胞表达编码氯霉素乙酰转移酶的基因cat和编码果聚糖蔗糖酶的基因sacB，而不是Lpp野生型基因。
2.生产编码2xLppΔ蛋白质的DNA片段
通过“重叠延伸”PCR(Horton等，2013,BioTechniques 54,129-33)的方法生产编码2xLppΔ蛋白质的DNA片段。为此目的，首先用JE5512的染色体DNA作为模板。这含有野生型lpp基因。
为了产生含有尤其是lpp(N)ΔLys78的DNA片段，使用寡核苷酸lpp-Allel-fw(SEQID No.10)和lpp-2x-rev2(SEQ ID No.11)进行PCR(PCR1)。以PCR1的产物为模板，使用寡核苷酸lpp-Allel-fw(SEQ ID No.10)和lpp-2x-rev3(SEQ ID No.12)进行第二次PCR(PCR2)，结果是PCR1产物在3'侧延伸了41个碱基对。
为了产生尤其含有lpp(C)ΔCys21的DNA片段，使用寡核苷酸lpp-2x-fw2(SEQ IDNo.13)和lpp-Allel-rev(SEQ ID No.14)，以JE5512的染色体DNA为模板，进行PCR(PCR3)。以PCR3产物为模板，使用寡核苷酸lpp-2x-fw3(SEQ ID No.15)和lpp-Allel-rev(SEQ IDNo.14)进行另外PCR(PCR4)，结果为PCR3产物在5'侧延伸了57个碱基对。
使用PCR2和PCR4的产物作为模板，最后进行的是使用寡核苷酸lpp-Allel-fw(SEQID No.10)和lpp-Allel-rev(SEQ ID No.14)作为引物的第五次PCR。由此产生的长度为1005个碱基对的DNA片段尤其含有ORF中的lpp基因的信号序列(SP)，其连接于(在本实施例中)含有在位置78缺失赖氨酸残基密码子的Lpp野生型蛋白质的编码序列(命名为lpp(N)ΔLys78)的DNA片段、(在本实施例中)由三个连续甘氨酸密码子组成的接头序列(L)以及(在本实施例中)含有在位置21缺失半胱氨酸残基密码子的Lpp野生型蛋白质的编码序列(命名为lpp(C)ΔCys21)的C-末端DNA片段，以及此外，lpp基因座的5'和3'区域的分别约300个碱基对(SEQ ID No.16，2xlppΔ)。所述DNA片段形成的2xLppΔ蛋白质如图1C所示。
3.生产大肠杆菌菌株JE5512 2xlppΔ
在下一步中，将cat-sacB盒置换为2xlppΔ。为此，通过Datsenko和Wanner的方法(参见上文)将来自PCR5的产物转化到菌株JE5512 lpp::cat-sacB pKD46的感受态细胞中。在包括7％蔗糖的LB琼脂平板上对使2xlppΔ进入JE5512 lpp::cat-sacB pKD46的染色体的野生型lpp基因起始位置的整合进行选择。由于只有不表达sacB的细胞可以在含蔗糖的培养基上生长，因此可以选择其中cat-sacB盒已被2xlppΔ置换的细胞(JE5512 2xlppΔ)。使用寡核苷酸pykF(SEQ ID No.8)和ynhG2(SEQ ID No.9)，以蔗糖抗性细胞的染色体DNA作为模板，借助PCR证实了在染色体中正确位置的整合。通过PCR产物的测序验证了整合的2xlppΔ的序列。所得菌株命名为JE5512 2xlppΔ。
实施例2：产生含有lpp3等位基因(lpp3突变体)的大肠杆菌JE5512菌株
为了比较的目的，从大肠杆菌菌株JE5512产生含有已知lpp3等位基因而非染色体的Lpp野生型基因的lpp突变体(Giam等，1984,Eur.J.Biochem.141,331-379页)。lpp3等位基因的特征在于突变，该突变导致Lpp蛋白质位置14甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸置换，并导致细胞对周质蛋白质的某些“渗漏”(参见US 2008/0254511 A1)。
使用寡核苷酸lpp-Allel-fw(SEQ ID No.10)和lpp-Allel-rev(SEQ ID No.14)，对lpp3突变体大肠杆菌“W3110 lpp3”的染色体DNA进行PCR(参见US 2008/0254511 A1，实施例3)。如实施例1中所述，将含有lpp3等位基因的PCR产物整合进菌株JE5512lpp::cat-sacB pKD46的染色体中，类似于2xlppΔ。借助如上所述的PCR和测序确认PCR产物正确整合至染色体中。所得菌株命名为JE5512 lpp3。
实施例3：使用2xlppΔ突变体以3l规模发酵生产Fab抗体片段
1.生产质粒pJF118ut-CD154
本实施例描述了与野生型lpp菌株和lpp3突变体相比较，借助于大肠杆菌JE55122xlppΔ菌株产生人源化单克隆抗-CD154抗体5c8的Fab片段，其序列公开于Karpusas等，(2001,Structure 9,321–329页)。将US 2008/0254511 A1中描述的质粒pJF118ut用作克隆和表达抗-CD154 Fab片段的基因的起始载体。pJF118ut保藏于DSMZ-德国微生物和细胞培养中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)(Braunschweig)，保藏号为DSM 18596。将Fab片段的重链(VH-CH1结构域)和轻链(VL-CL结构域)的两个阅读框(在每种情况下包括信号序列)克隆进所述质粒中。为此，进行以下步骤：借助基因合成(Eurofins Genomics)产生具有SEQ ID No.17的DNA片段。其包含由以下组成的基因融合体：
i衍生自SEQ ID No.5的信号序列，以及
ii Fab片段的重链的阅读框，
和由以下组成的基因融合体：
i大肠杆菌的phoA信号序列和
ii Fab片段的轻链的阅读框和
iii在轻链C-末端的由四个氨基酸组成的接头和
iv在接头C-末端的六聚组氨酸标签。
所述DNA片段用限制酶EcoRI和PdmI进行切割，并与已用EcoRI和SmaI切割的表达载体pJF118ut进行连接。所得质粒命名为pJF118ut-CD154，其中抗-CD154 Fab片段的重链和轻链基因的表达受tac启动子的控制。图2显示了质粒pJF118ut-CD154的质粒图谱。
2.生产抗-CD154 Fab抗体片段
为了在发酵罐规模生产抗-CD154 Fab抗体片段，借助CaCl2方法用质粒pJF118ut-CD154转化菌株JE5512、JE5512 lpp3和JE5512 2xlppΔ。借助四环素(20mg/l)进行含质粒细胞的筛选。
在3l搅拌罐发酵罐中进行生产。
1.2l常用于培养大肠杆菌的无机盐培养基(包括15g/l葡萄糖，并富含复合组分(1.5g/l Hy-Express II(Kerry)；1.0g/l Amisoy(Kerry)；0.5g/l Hy-Yest(Kerry)))接种初步培养物(其已在复合培养基(30g/l植物蛋白胨(BD Biosciences)、5g/l酵母提取物(Oxoid)、5g/l NaCl)中在30℃摇瓶培养约6h)至约OD600＝0.01。接种代表发酵的时间点0或发酵开始。在发酵过程中，设定温度为30℃，并通过计量加入NH4OH或H3PO4将pH值保持恒定在7.0。开始时，将培养物以400rpm搅拌，并以2vvm的经无菌过滤器灭菌的压缩空气进行鼓泡。在这些起始条件下，在接种之前已经将氧探针校准至100％饱和。将发酵过程中的O2饱和度的目标值设定为30％。一旦O2饱和度下降到目标值以下，就开始调节级联，以便将O2饱和度恢复至目标值。在这方面，首先将气体供应连续增加至最大5vvm，且然后将搅拌速度连续增加至最大1500rpm。培养开始后10小时开始添加葡萄糖。在计划诱导之前约0.5-1h，温度从30℃降低至27℃。在约21-23h的培养时间后，将异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加至0.1mM来实现诱导表达。
在64h的培养时间之后，收集样品，通过离心从培养基中除去细胞，并借助于夹心ELISA测定法确定培养上清液中Fab片段的含量(参见下文)。为了确定靶蛋白质在整个培养液中的量，即，细胞内和细胞外存在的Fab片段的总和，确定在均质化的培养液中的Fab含量。为此，将150μl的培养液与850μl的100mM Tris/Cl缓冲液(pH 7.4)混合，并使用FastPrep均质器(FastPrep-24TM 5G，MP Biomedicals)使细胞破裂。通过离心除去细胞碎片后，将澄清的上清液用于夹心ELISA测定法。
通过本领域技术人员已知的夹心ELISA测定法定量抗-CD154 Fab片段。这涉及使用固定化的抗-Fd重链抗体(The Binding Site，产品编号：PC075)作为捕捉剂，以及氧化物酶缀合的山羊抗-人κ轻链抗体(Sigma，产品编号：A7164)作为检测抗体。通过由过氧化物酶转化发色底物Dako TMB+(Dako，产品编号：S1599)和在450nm的相关吸光度变化实现定量。使用Fab片段“Human Fab/Kappa”(Bethyl Laboratories，产品编号：P80-115)校准ELISA。
表1列出了培养上清液和整个培养物中抗-CD154抗体片段的产量。
表1：发酵64h后培养上清液和整个培养物中的抗-CD154滴度
Figure GDA0002998476700000161
实施例4：使用2xlppΔ突变体以3l规模发酵生产环糊精糖基转移酶
为了以3l规模生产环糊精糖基转移酶(CGTase)，借助CaCl2方法用质粒pCGT转化菌株JE5512、JE5512 lpp3和JE5512 2xlppΔ。借助四环素(20mg/l)进行含质粒细胞的选择。
在US 2008/0254511 A1的实施例4中描述了用于CGTase过表达的质粒pCGT的生产，并且在US 2008/0254511 A1的图4中示出了质粒图谱。实质上，该质粒不仅含有四环素抗性基因，还含有尤其是肺炎克雷伯氏菌的CGTase的结构基因(包括天然的CGTase信号序列)。编码CGTase基因的表达受tac启动子调控。
如实施例3所述，使用菌株JE5512/pCGT、JE5512 lpp3/pCGT和JE5512 2xlppΔ/pCGT进行用于发酵生产CGTase的培养。
发酵64小时后，收集样品，然后借助CGTase活性测定法，基于从淀粉酶促地产生的环糊精(CD)的量确定培养上清液和均质化且澄清的培养液中的CGTase含量(参见实施例3)。
CGTase活性测定
测定缓冲液：5mM Tris HCl缓冲液，5mM CaCl2 x 2H2O，pH 6.5
底物溶液：在测定缓冲液中的10％淀粉溶液(Merck No.1.01252)，pH 6.5
测定混合物：0.2ml底物溶液+0.2ml适当稀释的CGTase样品(培养上清液或均质化且澄清的培养液)
反应温度：40℃
酶测定：
*预调节底物溶液和含CGTase样品的温度(在40℃约5min)
*通过快速混合(漩涡混合器(whirl mixer))底物溶液和含CGTase的样品来制备测定混合物，如果需要，将样品用测定缓冲液稀释，以便在随后的HPLC分析中确定0.9-1.5g/l CD的值；
*在40℃孵育3分钟
*通过加入0.6ml甲醇并快速混合(漩涡混合器)来终止酶反应
*将混合物在冰上冷却(约5min)
*离心(5min，12000rpm)并吸出澄清的上清液
*借助HPLC分析产生的CD量：该分析是在Agilent HP 1100HPLC系统进行的，该系统具有Nucleodur 100-3NH2-RP柱(150mm×4.6mm，Macherey-Nagel)和64％乙腈水溶液(v/v)作为流动相，2.1ml/min的流速。通过RI检测器(1260Infinity RI，Agilent)进行检测，并基于峰面积和α-CD标准品(Cavamax W6-8 Pharma，Wacker)进行定量。
酶活计算：A＝G*V1*V2/(t*MG)[U/ml]
A＝活性，
G＝CD含量(mg/l)
V1＝测定混合物中的稀释因子
V2＝在用于测定之前的含CGT的样品的稀释因子；如果未稀释，则：V2＝1
t＝反应时间(min)
MG＝分子量(g/mol)(MGCD＝973g/mol)
1单位(U)
Figure GDA0002998476700000172
产物(CD)/min
表2显示了分别获得的CGTase产量。
表2：发酵64h后培养上清液中的CGTase产量
Figure GDA0002998476700000171
Figure GDA0002998476700000181
与总蛋白质相比，由JE5512 2xlppΔ/pCGT释放到培养基中的CGTase的比例与抗-CD154 Fab相似-约为58％。
实施例3和4描述了分别使用各种大肠杆菌菌株的医学上相关的Fab抗体片段和工业酶的发酵生产。在这两种情况下，就释放到培养基中的靶蛋白质的量而言，与Lpp野生型菌株和具有“渗漏表型”的lpp 3突变体相比，根据本发明的2xlppΔ突变体显示出优越性。
Figure GDA0002998476700000191
序列表
<110> 瓦克化学股份公司
<120> 新型细菌lpp突变体及其在重组蛋白质的分泌生产中的用途
<130> Co11805
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 237
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> gene
<222> (1)..(237)
<223> coding sequence of the lpp wild-type gene
<400> 1
atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60
tgctccagca acgctaaaat cgatcagctg tcttctgacg ttcagactct gaacgctaaa 120
gttgaccagc tgagcaacga cgtgaacgca atgcgttccg acgttcaggc tgctaaagat 180
gacgcagctc gtgctaacca gcgtctggac aacatggcta ctaaataccg caagtaa 237
<210> 2
<211> 78
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PROPEP
<222> (1)..(78)
<223> unprocessed Lpp wild-type protein
<400> 2
Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser Ser
20 25 30
Asp Val Gln Thr Leu Asn Ala Lys Val Asp Gln Leu Ser Asn Asp Val
35 40 45
Asn Ala Met Arg Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala Arg
50 55 60
Ala Asn Gln Arg Leu Asp Asn Met Ala Thr Lys Tyr Arg Lys
65 70 75
<210> 3
<211> 137
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> PROPEP
<222> (1)..(137)
<223> unprocessed 2xLppΔ protein
<400> 3
Met Lys Ala Thr Lys Leu Val Leu Gly Ala Val Ile Leu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser Ser
20 25 30
Asp Val Gln Thr Leu Asn Ala Lys Val Asp Gln Leu Ser Asn Asp Val
35 40 45
Asn Ala Met Arg Ser Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala Arg
50 55 60
Ala Asn Gln Arg Leu Asp Asn Met Ala Thr Lys Tyr Arg Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Ser Asn Ala Lys Ile Asp Gln Leu Ser Ser Asp Val Gln Thr Leu
85 90 95
Asn Ala Lys Val Asp Gln Leu Ser Asn Asp Val Asn Ala Met Arg Ser
100 105 110
Asp Val Gln Ala Ala Lys Asp Asp Ala Ala Arg Ala Asn Gln Arg Leu
115 120 125
Asp Asn Met Ala Thr Lys Tyr Arg Lys
130 135
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae M5a1
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(90)
<223> signal peptide
<400> 4
atgaaaagaa accgtttttt taatacctcg gctgctattg ccatttcgat tgcattaaat 60
actttttttt gtagcatgca gacgattgct 90
<210> 5
<211> 90
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(90)
<223> artificial signal peptide
<400> 5
atgaaaagaa accgtttttt taatacctcg gctgctattg ccatttcgat tgcattacag 60
atcttttttc cgtccgcttc cgctttcgct 90
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(78)
<223> oligonucleotide lpp-cat-sac-fw
<400> 6
aactttgtgt aatacttgta acgctacatg gagattaact caatctagag ggtattaata 60
gccctgggcc aacttttg 78
<210> 7
<211> 78
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(78)
<223> oligonucleotide lpp-cat-sac-rev
<400> 7
taaacggcag acaaaaaaaa tggcgcacaa tgtgcgccat ttttcacttc acaggtacta 60
acactgcttc cggtagtc 78
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> oligonucleotide pykF
<400> 8
ctcgcgcagt acgtaaatac ttc 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> oligonucleotide ynhG2
<400> 9
cgtctttgct tacactcacg c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> oligonucleotide lpp-Allel-fw
<400> 10
atttgtatat cgaagcgccc tg 22
<210> 11
<211> 80
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(80)
<223> oligonucleotide lpp-2x-rev2
<400> 11
cattcagggt ctgcacatcg ctgctcagtt gatcaatttt ggcgttagag cttccgccac 60
cgcggtattt agtagccatg 80
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> oligonucleotide lpp-2x-rev3
<400> 12
acgcattgca ttaacatcgt ttgacagctg atccactttc gcattcaggg tctgcacatc 60
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(62)
<223> oligonucleotide lpp-2x-fw2
<400> 13
gcgcaaatca gcgcctggat aatatggcaa ccaagtatcg taaataatag tacctgtgaa 60
gt 62
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> oligonucleotide lpp-Allel-rev
<400> 14
cagaagaaca gcagaacgtt c 21
<210> 15
<211> 75
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(75)
<223> oligonucleotide lpp-2x-fw3
<400> 15
caaacgatgt taatgcaatg cgtagcgatg tgcaggcagc aaaggatgat gcagcacgcg 60
caaatcagcg cctgg 75
<210> 16
<211> 1005
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (293)..(706)
<223> expression cassette 2xlppΔ
<400> 16
atttgtatat cgaagcgccc tgatgggcgc tttttttatt taatcgataa ccagaagcaa 60
taaaaaatca aatcggattt cactatataa tctcacttta tctaagatga atccgatgga 120
agcatcctgt tttctctcaa tttttttatc taaaacccag cgttcgatgc ttctttgagc 180
gaacgatcaa aaataagtgc cttcccatca aaaaaatatt ctcaacataa aaaactttgt 240
gtaatacttg taacgctaca tggagattaa ctcaatctag agggtattaa taatgaaagc 300
tactaaactg gtactgggcg cggtaatcct gggttctact ctgctggcag gttgctccag 360
caacgctaaa atcgatcagc tgtcttctga cgttcagact ctgaacgcta aagttgacca 420
gctgagcaac gacgtgaacg caatgcgttc cgacgttcag gctgctaaag atgacgcagc 480
tcgtgctaac cagcgtctgg acaacatggc tactaaatac cgcggtggcg gaagctctaa 540
cgccaaaatt gatcaactga gcagcgatgt gcagaccctg aatgcgaaag tggatcagct 600
gtcaaacgat gttaatgcaa tgcgtagcga tgtgcaggca gcaaaggatg atgcagcacg 660
cgcaaatcag cgcctggata atatggcaac caagtatcgt aaataatagt acctgtgaag 720
tgaaaaatgg cgcacattgt gcgccatttt ttttgtctgc cgtttaccgc tactgcgtca 780
cgcgtaacat attcccttgc tctggttcac cattctgcgc tgactctact gaaggcgcat 840
tgctggctgc gggagttgct ccactgctca ccgaaaccgg ataccctgcc cgacgataca 900
acgctttatc gactaacttc tgatctacag ccttattgtc tttaaattgc gtaaagcctg 960
ctggcagtgt gtatggcatt gtctgaacgt tctgctgttc ttctg 1005
<210> 17
<211> 1599
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(1549)
<223> anti-CD154 expression cassette
<220>
<221> sig_peptide
<222> (25)..(114)
<223> AFA signal sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (115)..(777)
<223> reading frame for HC (VH-CH1)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (800)..(862)
<223> phoA signal sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (863)..(1516)
<223> reading frame for LC (VL-CL)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1517)..(1546)
<223> linker including His tag
<400> 17
acagaattct aaggaggaaa ttatatgaaa agaaaccgtt tttttaatac ctcggctgct 60
attgccattt cgattgcatt acagatcttt tttccgtccg cttccgcttt cgctcaggtt 120
cagctggtgc agagcggtgc cgaagttgtt aaaccgggtg caagcgttaa actgagctgt 180
aaagcaagcg gctatatttt taccagctat tatatgtatt gggtgaaaca ggcaccgggt 240
cagggtctgg aatggattgg tgaaattaat ccgagcaatg gcgataccaa ttttaatgaa 300
aaatttaaaa gcaaagccac cctgaccgtt gataaaagcg caagcaccgc atatatggaa 360
ctgagcagcc tgcgtagcga agataccgca gtttattatt gtacccgtag tgatggtcgc 420
aatgatatgg atagctgggg tcagggcacc ctggtcaccg ttagcagcgc aagcaccaaa 480
ggtccgagcg tttttccgct ggcaccgagc agcaaaagca ccagcggtgg caccgcagca 540
ctgggttgtc tggttaaaga ttattttccg gaaccggtta cagttagctg gaatagcggt 600
gcactgacca gtggtgttca tacctttccg gcagttctgc aaagcagcgg tctgtatagc 660
ctgagcagcg ttgttaccgt tccgagcagt agcctgggca cccagaccta tatttgtaat 720
gttaatcata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag ttgaaccgaa aagctgctaa 780
taaccatgga gaaaataaag tgaaacaaag cactattgca ctggcactct taccgttact 840
cttcacccct gttaccaaag ccgatattgt gctcacccag agtccggcaa ccctgagcgt 900
tagtccgggt gaacgtgcaa ccattagctg tcgtgcaagc cagcgtgtta gcagcagcac 960
ctatagctat atgcattggt atcagcagaa accgggtcag cctccgaaac tgctgattaa 1020
atatgcaagc aatctggaaa gcggtgttcc ggcacgtttt agcggtagcg gtagtggcac 1080
cgattttacc ctgaccatta gcagcgttga accggaagat tttgccacct attattgtca 1140
gcatagctgg gaaattcctc cgacctttgg tggtggcacc aaactcgaga ttaaacgtac 1200
cgttgcagca ccgagcgtgt ttatctttcc gcctagtgat gaacagctga aaagcggcac 1260
cgcaagcgtt gtttgtctgc tgaataactt ttatccgcgt gaagcaaaag ttcagtggaa 1320
agttgataat gcactgcaaa gcggtaatag ccaagaaagc gttaccgaac aggatagcaa 1380
agatagcacc tatagcctgt caagcaccct gaccctgagc aaagcagatt atgaaaaaca 1440
caaagtgtat gcctgcgaag ttacccatca gggtctgagc agtccggtta caaaaagttt 1500
taatcgtggt gaatgtagct cttctgccca tcaccaccat caccattaat aagcttctag 1560
aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcgac 1599

Claims (15)

1.一种细菌菌株，其含有至少一种编码重组蛋白质的基因，其特征在于，所述细菌菌株含有开放阅读框，所述开放阅读框由以下组成：
i编码介导所述蛋白质向周质的易位的N-末端信号肽的DNA片段，其连接至
ii编码脂蛋白(Lpp(N))的后续DNA序列(lpp(N))，所述脂蛋白与野生型lpp基因编码的脂蛋白Lpp相比，具有至多十个氨基酸的差异，以及
iii编码脂蛋白(Lpp(C))的另一DNA序列(lpp(C))，所述脂蛋白与野生型lpp基因编码的脂蛋白(Lpp)相比，具有至多十个氨基酸的差异。
2.如权利要求1的细菌菌株，其特征在于，所述细菌菌株为大肠杆菌()种的菌株。
3.如权利要求1或2中任一项或两项的细菌菌株，其特征在于，其不含有其他基因，所述其他基因编码与加工的野生型Lpp蛋白质相比具有至少80％的同一性的蛋白质。
4.如权利要求1至3中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，Lpp(N)和Lpp(C)通过由一个至多于一个的氨基酸组成的接头连接。
5.如权利要求1至4中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，lpp(N)和lpp(C)编码的氨基酸序列与野生型Lpp蛋白质的氨基酸序列的区别在于：
对于Lpp(N)，存在于野生型Lpp蛋白质中的C-末端氨基酸赖氨酸不存在，或
对于Lpp(C)，存在于野生型Lpp蛋白质中的N-末端氨基酸半胱氨酸不存在。
6.如权利要求1至5中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，在由lpp(N)或lpp(C)编码的氨基酸序列中的至少一个中，在氨基酸位置77代替精氨酸而存在的是任何其他蛋白质原氨基酸(基于未加工的野生型Lpp蛋白质的氨基酸的编号和序列)。
7.如权利要求6的细菌菌株，其特征在于，在由lpp(N)或lpp(C)编码的氨基酸序列中的至少一个中在位置77的蛋白质原氨基酸为半胱氨酸。
8.如权利要求1至7中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，所述N-末端信号肽为相对于野生型Lpp蛋白质的信号肽具有至少80％同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求8的细菌菌株，其特征在于，所述N-末端信号肽在氨基酸位置14含有某种其他蛋白质原氨基酸，而非甘氨酸，并且在所有其他氨基酸位置与野生型Lpp蛋白质的信号肽相同(基于野生型Lpp蛋白质的信号肽的氨基酸编号和序列)。
10.如权利要求9的细菌菌株，其特征在于，所述N-末端信号肽的位置14的蛋白原氨基酸为天冬氨酸。
11.如权利要求1至10中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，形成所述接头序列的氨基酸选自：甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。
12.如权利要求1至11中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，编码2xLpp蛋白质的开放阅读框位于染色体中，而编码野生型Lpp蛋白质的开放阅读框没有位于染色体中。
13.如权利要求1至12中一项或多项的细菌菌株，其特征在于，所述重组蛋白质为异源蛋白质。
14.一种用于发酵生产重组蛋白质的方法，其特征在于，在发酵培养基中培养如权利要求1至13中一项或多项的细菌菌株，在发酵后将所述发酵培养基与细胞分离，并从所述发酵培养基中分离蛋白质。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在分离所述发酵培养基之后，从所述发酵培养基纯化所述重组蛋白质。
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