JP2023065708A - 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】大腸菌によって、外来タンパク質を培養液中に生産するための方法であって、該タンパク質が培養液中に分泌され、かつ培養上清の粘性上昇が抑制されることにより、培養後の後処理工程に負荷のかからない、培養上清から直接精製することができる方法の提供。【解決手段】外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び、外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養し、当該外来タンパク質を培養上清中に分泌させる、当該外来タンパク質の製造方法。【選択図】なし
Description
本発明は、大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法に関する。
遺伝子組換え技術を用いた組換えタンパク質の生産には、様々な宿主が用いられている。例えば、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞といった動物細胞や、大腸菌や酵母といった微生物等が挙げられる。微生物においては、動物細胞と比較して短時間かつ低コストで目的タンパク質を生産できるというメリットがある。とりわけ、大腸菌は最も研究されている微生物の一つで、短時間で増殖し、かつ取扱いも容易なことからタンパク質生産において頻繁に利用されている。
大腸菌を用いたタンパク質生産において、一般的には、細胞内でタンパク質が生産されるため、発酵培養後に培養液を菌体と培養上清に分離し、ペリプラズム抽出、または、超音波や溶菌酵素であるリゾチーム等による細胞破壊、もしくは、封入体（インクルージョンボディー）の回収等の操作を行う必要があり、さらには、目的のタンパク質を多種・多量の宿主由来物質から精製する必要があることから、これらの後処理工程が目的タンパク質の生産コストに大きく影響する。
大腸菌を用いたタンパク質生産において、目的タンパク質を細胞外に分泌する方法を用いることができれば、培養上清と菌体との分離作業のみにより、ペリプラズム抽出や菌体破壊といった更なる後処理工程を行うことなく、培養上清から直接的に精製することができる。
これまでに、膜タンパク質の一種であるｌｐｐの遺伝子に突然変異を有する大腸菌を使用して、組換えタンパク質の培養上清中への分泌が報告されている（特許文献１）。
また、非特許文献１では大腸菌における様々な膜タンパク質をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてゲノム編集した膜タンパク質欠損株を用い、外来蛍光タンパク質の細胞外への分泌生産の検討が行われており、生産された該タンパク質の細胞外への分泌が報告されている。その中で、大腸菌の外膜構造維持に関わるペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）欠損株においても該タンパク質の細胞外への分泌が確認されている。一方で、培地中へのＤＮＡの漏出も観察されている。一般的にＤＮＡの細胞外への漏出は培養上清の粘性増大の要因となることが報告されている（非特許文献２）。
培養上清の粘性が増大した場合、後処理工程での膜処理におけるフィルターろ過性の低下、クロマトグラフィーでの精製時におけるカラム圧の上昇等、培養後の後処理工程に負荷がかかり、生産効率の低下や生産コストの増加の要因となる。
一方、種々の部分欠損を有するＰａｌをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用い、Ｐａｌ欠損株に対して形質転換することで、Ｐａｌ欠損株では失われている外膜の整合性が完全にまたは一部相補されることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、これはＰａｌがＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＯｍｐＡといった他の膜タンパク質やペプチドグリカンと相互作用することで、Ｐａｌの外膜の整合性に寄与することを明らかにしたものであり、外来タンパク質の分泌生産能については不明である。
Ｗｅｎ Ｇａｏ 他著、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ． Ｂｉｏｌ．， ７， １２９１－１３０２（２０１８）
Ｊｏｓｅｐｈ Ｍ． Ｎｅｗｔｏｎ 他著， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．， ３２（４）， １０６９－１０７６（２０１６）
Ｃａｓｃａｌｅｓ Ｅ．ａｎｄ Ｌｌｏｕｂｅｓ Ｒ著，，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１（３），８７３－８８５（２００４）
本発明は、目的タンパク質を培養上清中に分泌させるとともに、培養上清の粘性上昇を低減する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、大腸菌の膜タンパク質であるＰａｌに部分変異を有するタンパク質をコードする遺伝子を有し、Ｐａｌの機能が低減した大腸菌を用いることで、目的タンパク質の培養上清中への分泌生産を実現し、かつ培養上清の粘性上昇が低減することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明では以下の発明が提供される。
（１）外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養し、当該外来タンパク質を培養上清中に分泌させる、当該外来タンパク質の製造方法。
（２）前記大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量が、Ｐａｌに部分変異を有さない大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量よりも増加している（１）に記載の方法。
（３）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、又は配列番号１のアミノ酸配列に部分変異を有さず、かつシグナルペプチドに部分変異を有する（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１の３位から１７位、１９位から１２１位、および１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる１つ以上のアミノ酸配列、及び／又は配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する（１）～（３）に記載の方法。
（５）前記部分変異が、１つ以上のアミノ酸の欠損、置換または挿入である（１）～（４）に記載の方法。
（６）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列である、（１）～（５）に記載の方法。
（１）外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養し、当該外来タンパク質を培養上清中に分泌させる、当該外来タンパク質の製造方法。
（２）前記大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量が、Ｐａｌに部分変異を有さない大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量よりも増加している（１）に記載の方法。
（３）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、又は配列番号１のアミノ酸配列に部分変異を有さず、かつシグナルペプチドに部分変異を有する（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１の３位から１７位、１９位から１２１位、および１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる１つ以上のアミノ酸配列、及び／又は配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する（１）～（３）に記載の方法。
（５）前記部分変異が、１つ以上のアミノ酸の欠損、置換または挿入である（１）～（４）に記載の方法。
（６）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列である、（１）～（５）に記載の方法。
本発明のＰａｌを部分変異させた大腸菌で外来タンパク質を生産することにより、培養上清中に目的の外来タンパク質を分泌させることができる。また、本発明によって、分泌生産に伴う培養上清の粘性上昇が抑制され、後処理工程への負荷軽減により効率的に目的の外来タンパク質を生産できる方法が提供される。
［部分変異を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌］
本発明において、「部分変異」とは遺伝子、もしくはタンパク質を部分的に変異させることを意味し、部分変異の種類としては、１つ以上のアミノ酸の部分的な置換、部分的な欠損、部分的な挿入が挙げられる。本発明で用いられる「部分変異を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌（以下、「Ｐａｌ部分変異株」と呼称する）」とは、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を部分的に変異させ、Ｐａｌ（配列番号１）を部分的に変異させた大腸菌であり、Ｐａｌ（配列番号１）に部分変異を有していない場合でも、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３）をコードする遺伝子（配列番号４）を部分的に変異させ、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３）を部分的に変異させた大腸菌も含む。部分変異させるシグナルペプチドは、他のシグナルペプチド、例えば、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、Ｌｐｐ、ＰｈｏＥ等であっても良い。
本発明において、「部分変異」とは遺伝子、もしくはタンパク質を部分的に変異させることを意味し、部分変異の種類としては、１つ以上のアミノ酸の部分的な置換、部分的な欠損、部分的な挿入が挙げられる。本発明で用いられる「部分変異を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌（以下、「Ｐａｌ部分変異株」と呼称する）」とは、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を部分的に変異させ、Ｐａｌ（配列番号１）を部分的に変異させた大腸菌であり、Ｐａｌ（配列番号１）に部分変異を有していない場合でも、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３）をコードする遺伝子（配列番号４）を部分的に変異させ、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３）を部分的に変異させた大腸菌も含む。部分変異させるシグナルペプチドは、他のシグナルペプチド、例えば、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、Ｌｐｐ、ＰｈｏＥ等であっても良い。
本発明において、前記部分変異は部分欠損であることが好ましい。「部分欠損」とは遺伝子、もしくはタンパク質を部分的に欠損させることを意味し、「部分欠損を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌（以下、「Ｐａｌ部分欠損株」と呼称する）」とは、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を部分的に欠損させ、Ｐａｌ（配列番号１）を部分的に欠損させた大腸菌であり、配列番号３または４に部分欠損を有する場合も含む。Ｐａｌに部分欠損を施す箇所は文献に記載されているものを適用した（Ｃａｓｃａｌｅｓ Ｅ．ａｎｄ Ｌｌｏｕｂｅｓ Ｒ著，（２００４年），Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１（３），８７３－８８５）。
Ｐａｌ部分変異株は、Ｐａｌをコードする遺伝子を欠損させたＰａｌ欠損株に部分変異を有するＰａｌをコードした遺伝子を有する遺伝子を導入し、部分変異を有するＰａｌを発現させることで作製することも可能であるが、本発明では、ｐａｌ（配列番号１）が部分変異した大腸菌を用いることが好ましく、前記部分変異は部分欠損であることがより好ましい。
前記Ｐａｌの部分変異は、Ｐａｌのシグナルペプチド、配列番号１の３位から１７位、１９位から１２１位、および１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる一つ以上のアミノ酸配列の部分変異であることが好ましい。
本明細書では、３位のアミノ酸から１７位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号５）をコードしている遺伝子（配列番号６）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１株、１９位のアミノ酸から４３位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号７）をコードしている遺伝子（配列番号８）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ２株、４４位のアミノ酸から６２位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号９）をコードしている遺伝子（配列番号１０）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ３株、６２位のアミノ酸から９３位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１１）をコードしている遺伝子（配列番号１２）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ４株、９４位のアミノ酸から１２１位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１３）をコードしている遺伝子（配列番号１４）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ５株、１２３位のアミノ酸から１５２位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１５）をコードしている遺伝子（配列番号１６）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ６株、１２６位のアミノ酸から１２９位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１７）をコードしている遺伝子（配列番号１８）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ７株、１４４位のアミノ酸から１４７位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１９）をコードしている遺伝子（配列番号２０）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ８株とする。
本発明では、前記配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すＰａｌをコードする遺伝子（配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０）を含む大腸菌を用いることが好ましい。
本発明では、前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有していても良い。前記配列同一性は９０%以上がより好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
本発明においてアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｐプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Ｘとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Ｘと評価対象アミノ酸配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
本発明では、前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列であっても良い。「１もしくは複数個」は、例えば１～８０個、好ましくは１～７０個、好ましくは１～６０個、好ましくは１～５０個、好ましくは１～４０個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、好ましくは１～２個、好ましくは１個である。
使用される大腸菌株はＫ１２株由来のＷ３１１０やＢ株由来のＢＬ２１等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
任意の大腸菌株のゲノムにおいて、部分変異を有したＰａｌ遺伝子を作製する方法は、当業者の公知の方法、例えば、適正なオリゴヌクレオチドをプライマーとしたオーバーラップＰＣＲ法や全合成法が挙げられる。
作製した部分変異を有するＰａｌ遺伝子を宿主細胞へ組み込む方法は公知の方法を適宜使用することができ、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ システム（Ｄａｔｓｅｎｋｏ Ｋ．Ａ．，ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ Ｂ． Ｌ．著（２０００年），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９７（１２），６６４０－６６４５）や宿主細胞の相同組換え機構によって組み込まれる方法（Ｌｉｎｋ Ａ． Ｊ．他著（１９９７年），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７９，６２２８－６２３７）等が挙げられるが、特に、大腸菌ゲノム以外の外来遺伝子がゲノム上に組み込まれないＬｉｎｋ他において記載された方法が好ましい。
この際、部分変異を有するＰａｌ遺伝子の組換えベクターを作製する方法は、ライゲーション法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃ社）、ＰＣＲ法、全合成法等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。また、組換えベクターを宿主細胞へ導入するためには、例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の方法で可能だが、特にこれらに限定されるものではない。
外来タンパク質の生産量・分泌量を増加させるために、Ｐａｌ部分変異株において、ＦｋｐＡ、Ｄｓｂ、ＳｕｒＡなどのペリプラズム性シャペロンの共発現を組み合わせることも可能である。
［発現ベクター］
Ｐａｌ部分変異株において、外来タンパク質を生産することが可能である。本明細書において、「外来タンパク質」とは、宿主細胞外部から組み込まれた遺伝子にコードされているタンパク質で、形質転換を行っていない宿主細胞が通常発現しないタンパク質のことを意味する。本発明において、外来タンパク質を培養上清中に分泌させるためには、大腸菌の細胞質からペリプラズム空間へ移行されなければならない。そのために、外来タンパク質をコードしている遺伝子の５´末端側にペリプラズム移行シグナル配列が付加していることが必要である。大腸菌内で機能を発揮するペリプラズム移行シグナルとして、例えば、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＳｔＩＩ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
Ｐａｌ部分変異株において、外来タンパク質を生産することが可能である。本明細書において、「外来タンパク質」とは、宿主細胞外部から組み込まれた遺伝子にコードされているタンパク質で、形質転換を行っていない宿主細胞が通常発現しないタンパク質のことを意味する。本発明において、外来タンパク質を培養上清中に分泌させるためには、大腸菌の細胞質からペリプラズム空間へ移行されなければならない。そのために、外来タンパク質をコードしている遺伝子の５´末端側にペリプラズム移行シグナル配列が付加していることが必要である。大腸菌内で機能を発揮するペリプラズム移行シグナルとして、例えば、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＳｔＩＩ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明における「発現ベクター」とは、形質転換後の宿主細胞において、発現ベクターに組み込まれた発現カセット中の遺伝子が発現する機能を有する人為的に構築された核酸分子のことを意味する。発現ベクターは発現カセットに加えて、１つ以上の制限酵素認識配列を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃ社のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム等を用いるためのオーバーラップ領域、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、自己複製配列等を有することができる。発現ベクターは、例えば、プラスミドベクターや人工染色体が挙げられるが、ベクター調製や、大腸菌株の形質転換が容易であることから、プラスミドベクターの方が好ましい。プラスミドとしては、公知の発現ベクターである、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
「発現カセット」とは、プロモーターおよび外来タンパク質をコードしている遺伝子より構成され、ターミネーターを含んでも良い。
使用するプロモーターとしては、当業者において公知のプロモーター、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａプロモーター、ｔｅｔプロモーター、Ｔ７プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
本発明におけるプラスミドベクターの薬剤耐性マーカー遺伝子は、本発明で提供される大腸菌株では特に限定されるものではない。具体的な例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられ、それぞれカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールを含む培地における耐性により選択することが可能である。
［外来タンパク質の分泌生産］
本発明では、上記の発現ベクターが導入されたＰａｌ部分変異株が提供され、その大腸菌株は発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子により得られる薬剤耐性を指標に、選択的に得ることが可能である。
本発明では、上記の発現ベクターが導入されたＰａｌ部分変異株が提供され、その大腸菌株は発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子により得られる薬剤耐性を指標に、選択的に得ることが可能である。
一般に当業者の中で、大腸菌におけるタンパク質の分泌とは細胞質内で発現したタンパク質がペリプラズム空間に移行されることを示す。本発明における分泌生産とは、上記大腸菌株を培養することで培養上清中に外来タンパク質を生産すること、または、従来のペリプラズム抽出操作、例えば、浸透圧ショック法等の操作よりも簡便な操作、例えば、培養液に添加剤を加える等といった操作でペリプラズム空間に存在する外来タンパク質を菌体外に移行させることを表し、好ましくは、培養上清中に外来タンパク質を生産することである。
上記大腸菌株を培養することで培養上清中に外来タンパク質を生産することにおいて、親株または遺伝子組換え操作がなされていない野生型株において分泌されない外来タンパク質が培養上清中に分泌されている、または、親株または野生型株おける培養上清中への外来タンパク質分泌量に対して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、または５．０倍以上であることを表す。培養上清中への外来タンパク質の分泌量は、当業者に公知の方法、例えば、バンド強度比較、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などにより決定することができる。
本発明で提供される培養上清はヌクレアーゼ処理等のＤＮＡ除去の操作を必要とせずに精製工程に進むことができ、その培養上清中に分泌された外来タンパク質は遠心分離等の操作で菌体を除いた後、直接的に回収することができる。その回収方法については、公知の精製法、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿等）、溶媒沈殿（アセトン又はエタノール等による蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独または適当に組み合わせて用いることができる。
回収された外来タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。
発現ベクターで形質転換された上記大腸菌株を培養するための培地は、大腸菌が資化する栄養源を含むものであれば何でも使用でき、上記栄養源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、グリセロール等の糖アルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができるが、特にグルコースやグリセロールを炭素源として用いることが好ましい。酵母エキスといった天然成分を含むものを用いる培地でも、それらを含まない合成培地でも培養することが可能で、培地の種類は限定されるものではない。また、培養方法も特に限定されず、バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養等が適用される。
生産される外来タンパク質の例としては、微生物由来の酵素類、動物や植物といった多細胞生物由来のタンパク質等が挙げられる。例えば、フィターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、及び蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定はされるものではない。特に、バイオ医薬品用タンパク質が好ましい。
バイオ医薬品用タンパク質として、例えば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなどの部分抗体、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン、Ｆｃ融合タンパク質、およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質等が挙げられる。
上記外来タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変がなされているものでもよいし、ｄｅ－ｎｏｖｏで設計されたものでもよい。
大腸菌の培養は通常一般の条件により行うことができ、例えば、ｐＨは６～８、好ましくは６．５～７．５、より好ましくは６．９～７．１、温度は１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃、より好ましくは２５～３０℃、溶存酸素濃度は１０～８０％、好ましくは２０～６０％、より好ましくは３０～４０％で、培養時間は２０～１５０時間培養することにより行うことができる。また、必要に応じて、栄養素又は誘導物質をショットや流加により培地に供給することができる。
誘導物質は、使用するプロモータにより適宜選択され、例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターの直接的誘導や、ｌａｃプロモーターでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現させることでのＴ７プロモーターの間接的誘導では、ラクトースやイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などが用いられる。ＩＰＴＧを誘導物質として用いる場合、終濃度が０．１～２．０ｍＭ、より好ましくは０．２～１．０ｍＭとなるように添加することでタンパク質発現誘導を行うことができる。
また、外来タンパク質発現誘導を行うタイミングは、外来タンパク質が発現して培養上清中に分泌されるなら、特に限定されないが、好ましくは対数増殖期初期、対数増殖期中期または対数増殖期後期であり、特に好ましくは対数増殖期後期である。
培養上清の粘性評価については、菌体を分離した培養上清をシリンジフィルターまたは遠心ろ過デバイスなどを用いて、通液量を測定することで評価できる。また、非特許文献２に記載されているように、レオメーターや粘度計を用いてもよいし、宿主由来のＤＮＡ漏出が培養上清中の粘性上昇に寄与していることから、ＤＮＡ Ｄｙｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ ＤＮＡ（シグナス社）といったＤＮＡ定量キットで比較・評価するのも良いが、これらにより限定されるものではない。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
本発明では、親株として大腸菌株はＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。
本発明で用いられる遺伝子組換え技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離および精製、制限酵素処理、改変ＤＮＡのクローニング、形質転換などは、当業者に公知である、また、製造元の添付マニュアルに記載されている方法で実施した。
以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）等を用いた。ＰＣＲ産物や制限酵素反応液の精製では、ＱＩＡｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）等を用いた。ＰＣＲ以外でのＤＮＡ断片の調製は遺伝子合成を用いた。
形質転換に用いるプラスミドベクターは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの抽出はＦａｓｔＧｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社）を用いて行った。
使用したクローニングベクターは、ｐＴＨ１８ｃｓ（国立遺伝学研究所：ＮＩＧ）を改変したクローニングベクターであり、テトラサイクリン耐性遺伝子を有している。
また、使用した発現ベクターは、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの認識配列を含むマルチクローニングサイト、Ｔ７発現系、カナマイシン耐性遺伝子、自己複製開始配列、ｌａｃリプレッサー遺伝子を有することを特徴とする。
Ｐａｌ部分欠損株の培養上清中への外来タンパク質分泌量の比較対象として、親株であるＢＬ２１（ＤＥ３）株、培養上清の粘性の比較対象として、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ システムを用いて作製したＬｐｐ全欠損株（以下、「ΔＬｐｐ」と呼称する）を用いた。ΔＬｐｐは外来タンパク質を分泌生産するものの、課題として、その外来タンパク質を含む培養上清の粘性が高く、フィルターろ過性が低いため、後処理工程に大きな負荷がかかるといったことが挙げられる。
（実施例１）Ｐａｌ１株の作製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰａｌ部分欠損株をＬｉｎｋ Ａ． Ｊ．他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７年 １７９，６２２８－６２３７）の方法を参考に実施した。Ｐａｌの３位のアミノ酸から１７位のアミノ酸が欠損したＰａｌ１をコードするＰａｌ１遺伝子を含み、Ｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ５００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２１）を作製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノム（塩基配列：Ａｃｓｓｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＰ００１５０９（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３９４，６４４－５２（２００９）））を鋳型として、プライマー１（配列番号２２）およびプライマー２（配列番号２３）、プライマー３（配列番号２４）およびプライマー４（配列番号２５）を用いたＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を混合した後、プライマー１およびプライマー４を用いたＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は５´末端側にＥｃｏＲＩ、３´末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰａｌ部分欠損株をＬｉｎｋ Ａ． Ｊ．他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７年 １７９，６２２８－６２３７）の方法を参考に実施した。Ｐａｌの３位のアミノ酸から１７位のアミノ酸が欠損したＰａｌ１をコードするＰａｌ１遺伝子を含み、Ｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ５００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２１）を作製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノム（塩基配列：Ａｃｓｓｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＰ００１５０９（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３９４，６４４－５２（２００９）））を鋳型として、プライマー１（配列番号２２）およびプライマー２（配列番号２３）、プライマー３（配列番号２４）およびプライマー４（配列番号２５）を用いたＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を混合した後、プライマー１およびプライマー４を用いたＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は５´末端側にＥｃｏＲＩ、３´末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。
上記で作製したＤＮＡ断片およびクローニングベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩによって切断した。各切断されたＤＮＡ断片を用いてライゲーションを行った。このように作製したプラスミド（ｐＰａｌ１）をＤＨ５α株に塩化カルシウム法で形質転換し、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ１保持株を選択した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株に得られたｐＰａｌ１を塩化カルシウム法によって形質転換を行い、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ１保持株を選択した。以下、Ｐａｌ１株を得るまでの遺伝子組換え操作はＬｉｎｋ Ａ．Ｊ．他の方法をもとに実施した。
上記のように作製した株をＰａｌ１株とした。
（実施例２）Ｐａｌ２株の作製
実施例１と同様の方法で実施した。Ｐａｌの１９位のアミノ酸から４３位のアミノ酸が欠損したＰａｌ２をコードするＰａｌ２遺伝子を含み、Ｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ２００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２６）を作製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムを鋳型として、プライマー５（配列番号２７）およびプライマー６（配列番号２８）、プライマー７（配列番号２９）およびプライマー８（配列番号３０）を用いたＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を混合した後、プライマー１およびプライマー４を用いたＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は、５´末端側にＥｃｏＲＩ、３´末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。
実施例１と同様の方法で実施した。Ｐａｌの１９位のアミノ酸から４３位のアミノ酸が欠損したＰａｌ２をコードするＰａｌ２遺伝子を含み、Ｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ２００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２６）を作製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムを鋳型として、プライマー５（配列番号２７）およびプライマー６（配列番号２８）、プライマー７（配列番号２９）およびプライマー８（配列番号３０）を用いたＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を混合した後、プライマー１およびプライマー４を用いたＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は、５´末端側にＥｃｏＲＩ、３´末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。
上記で作製したＤＮＡ断片およびクローニングベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩによって切断した。各切断されたＤＮＡ断片を用いてライゲーションを行った。このように作製したプラスミド（ｐＰａｌ２）をＤＨ５α株に塩化カルシウム法で形質転換し、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ２保持株を選択した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株に得られたｐＰａｌ２を塩化カルシウム法によって形質転換を行い、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ２保持株を選択した。以下、Ｐａｌ２株を得るまでの遺伝子組換え操作はＬｉｎｋ Ａ．Ｊ．他の方法をもとに実施した。
上記のように作製した株をＰａｌ２株とした。
（実施例３）Ｐａｌ部分欠損株を用いた合成培地でのナノボディー（ＶＨＨ）生産
シグナルペプチドＰｅｌＢ（配列番号３１）を有し、かつＣ末側にＨｉｓタグを有するａｎｔｉ－Ｆｃ ＶＨＨをコードしたＤＮＡ断片（配列番号３２）を遺伝子合成によって作製した。このＤＮＡ断片と発現ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し、それぞれ制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションを行った。得られたＶＨＨ発現ベクターをＰａｌ１株およびＰａｌ２株にエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。発現ベクター保持株はカナマイシン含有培地（５０ｍｇ／ｌ）によって選択された。
シグナルペプチドＰｅｌＢ（配列番号３１）を有し、かつＣ末側にＨｉｓタグを有するａｎｔｉ－Ｆｃ ＶＨＨをコードしたＤＮＡ断片（配列番号３２）を遺伝子合成によって作製した。このＤＮＡ断片と発現ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し、それぞれ制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションを行った。得られたＶＨＨ発現ベクターをＰａｌ１株およびＰａｌ２株にエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。発現ベクター保持株はカナマイシン含有培地（５０ｍｇ／ｌ）によって選択された。
合成培地での培養は、ＵＳＲＥ４４５１２Ｅ１を参考に実施した。
２．５ｌの合成培地（５．２ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社、特級）、４．３６ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、４．０２５ｇ／ｌ ＫＣｌ（和光純薬工業社、特級）、１．０４ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、４．６８ｇ／ｌ クエン酸・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、１１２ｇ／ｌ グリセロール（キシダ化学社、特級）、２５ｍｌ微量元素溶液（１００．４ｇ／ｌ クエン酸・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、５．２２ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、２．０６ｇ／ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、２．０６ｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．８１ｇ／ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．４２ｇ／ｌ ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、１０．０６ｇ／ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．０３ｇ／ｌ Ｈ３ＢＯ３（和光純薬工業社、特級）、０．０２ｇ／ｌ ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級））に初期ＯＤ値が０．１になるように前培養液を加えた。対数増殖期にＮａＨ２ＰＯ４とＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加えた。発現誘導は、対数増殖期後期にイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（カルボンシス社）を終濃度が０．２ｍＭになるように添加することで実施した。それと同時に、８０％（ｗ／ｗ）グリセロール溶液を一定速度で流加した。培養開始時は３０℃の温度に設定し、発現誘導後は２５℃の温度で培養した。また、培養中において、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨまたは１０％Ｈ２ＳＯ４を適宜添加することにより７．０の値に維持し、溶存酸素濃度は攪拌数と通気量のカスケード制御により３０％に維持した。
培養開始から７０時間後に、培養液を回収し、菌体と培養上清を遠心分離により分離した。２μｌの培養上清と２μｌの２×サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－Ｒａｄ社）、０．２Ｍ ＤＴＴ）を混合し、９５℃で５分間処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ’ ＴＭ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）と共に、ｅ－ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ－Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを３０分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ ＣＢＢ Ｇ－２５０ステイン、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により４５分染色したのち、水で脱色した。一方、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）株においても、実施例３で使用した発現ベクターを使用して同様の条件による培養を実施し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＣＢＢ染色を実施した。その結果、いずれもＶＨＨのアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドが認められた（図１）。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥからＶＨＨのバンド強度を撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳおよび画像解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した結果、親株と比較して、Ｐａｌ１株では６．７倍、Ｐａｌ２株では６．９倍の強度で、ＶＨＨのバンドが検出できた（表１）。表１中では、親株の培養上清中のＶＨＨバンド強度を１とし、Ｐａｌ１株、Ｐａｌ２株での培養上清中のＶＨＨバンド強度を示している。
よって、Ｐａｌ遺伝子に部分欠損を有する大腸菌では、外来タンパク質の培養上清中への分泌生産性が向上していることが確認された。
（実施例４）Ｐａｌ部分欠損株を用いた半合成培地でのＶＨＨ生産
使用した発現ベクターおよび菌株は実施例３で使用したものと同様である。
使用した発現ベクターおよび菌株は実施例３で使用したものと同様である。
２．５ｌの半合成培地（１．０ｇ／ｌ ＮＨ４Ｃｌ（和光純薬工業社、特級）、９．０ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、３．０ｇ／ｌ Ｎａ３ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、２０ｇ／ｌ グルコース（和光純薬工業社、特級）、２０ｇ／ｌ 酵母エキス（オリエンタル酵母社、赤ラベル）、１．０ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．００６ｇ／ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．０５ｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級））に初期ＯＤが０．３となるように前培養液を加えた。発現誘導は、培養開始２４時間後にＩＰＴＧを終濃度が０．８ｍＭになるように添加することで実施した。培養開始時は３０℃の温度に設定し、発現誘導後は２５℃の温度で培養した。また、培養中において、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨまたは１０％Ｈ２ＰＯ４を適宜添加することにより７．０の値に維持し、溶存酸素濃度はフィード液（１４４ｇ／ｌ グルコース、４２３ｇ／ｌ 酵母エキス、１３ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の流加速度により４０％に維持した。
培養開始から７２時間後に、培養液を回収し、菌体と培養上清を遠心分離により分離した。実施例３と同様の方法でＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＣＢＢ染色を実施した。一方、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）株においても、実施例３で使用した発現ベクターを使用して同様の条件による培養を実施し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびＣＢＢ染色を実施した。その結果、いずれもＶＨＨのアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドが認められた（図２）。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥからＶＨＨのバンド強度を撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳおよび画像解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した結果、元株と比較して、Ｐａｌ１株およびＰａｌ２株ともに２．１倍の強度で、ＶＨＨのバンドが検出できた（表２）。
よって、Ｐａｌ遺伝子に部分欠損を有する大腸菌では、半合成培地で培養した場合においても、外来タンパク質の培養上清中への分泌生産性が向上していることが確認された。
（実施例５）培養上清のフィルターろ過性の評価
実施例３および実施例４で得られたＰａｌ１株およびＰａｌ２株の培養上清を再度遠心分離し、上清１０ｍＬを０．２μｍのシリンジフィルター（ＤＩＳＭＩＣ(R)－２５ＡＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）で処理し、１平方ｃｍあたりの通液量をもとにフィルターろ過性を評価した。一方、ΔＬｐｐ株おいても、実施例３で使用した発現ベクターを使用しての同様の条件で培養し、同様の条件で培養上清の粘性評価を実施した。ここでΔＬｐｐ株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を親株として、特開２００８－７３０４６号を参考に、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍにより作製した。合成培地で培養では、ΔＬｐｐ株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は０．７０ｇであったのに対して、Ｐａｌ１株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は２．５４ｇ以上、Ｐａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は２．５５ｇ以上となった。この時、Ｐａｌ１株およびＰａｌ２株の培養上清は１０ｍＬ全てがフィルターを通過した。
実施例３および実施例４で得られたＰａｌ１株およびＰａｌ２株の培養上清を再度遠心分離し、上清１０ｍＬを０．２μｍのシリンジフィルター（ＤＩＳＭＩＣ(R)－２５ＡＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）で処理し、１平方ｃｍあたりの通液量をもとにフィルターろ過性を評価した。一方、ΔＬｐｐ株おいても、実施例３で使用した発現ベクターを使用しての同様の条件で培養し、同様の条件で培養上清の粘性評価を実施した。ここでΔＬｐｐ株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を親株として、特開２００８－７３０４６号を参考に、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｓｙｓｔｅｍにより作製した。合成培地で培養では、ΔＬｐｐ株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は０．７０ｇであったのに対して、Ｐａｌ１株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は２．５４ｇ以上、Ｐａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は２．５５ｇ以上となった。この時、Ｐａｌ１株およびＰａｌ２株の培養上清は１０ｍＬ全てがフィルターを通過した。
半合成培地での培養では、ΔＬｐｐ株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は０．０７ｇであったのに対して、Ｐａｌ１株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は１．８２ｇ、Ｐａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は１．８７ｇとなった（表３）。
これらのことから、どちらの培地においてもΔＬｐｐの培養上清と比較して、Ｐａｌ１株およびＰａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量が多く、フィルターろ過性が高いことから、培養上清の粘性が抑えられていることが確認できた。
Claims (6)
- 外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養し、当該外来タンパク質を培養液中に分泌させる、当該外来タンパク質の製造方法。
- 前記大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量が、Ｐａｌに部分変異を有さない大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量よりも増加している請求項１に記載の方法。
- 前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、又は配列番号１のアミノ酸配列に部分変異を有さず、かつシグナルペプチドに部分変異を有する、請求項１または２に記載の方法。
- 前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１の３位から１７位、１９位から１２１位、および１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる１つ以上のアミノ酸配列、及び／又は配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、請求項１～３に記載の方法。
- 前記部分変異が、１つ以上のアミノ酸の欠損、置換または挿入である請求項１～４に記載の方法。
- 前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列である、請求項１～５に記載の方法。
Priority Applications (2)
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| JP2020064178A JP2023065708A (ja) | 2020-03-31 | 2020-03-31 | 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 |
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| JP7185006B2 (ja) * | 2018-07-06 | 2022-12-06 | ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト | 発酵法で組換えタンパク質を放出する細菌株 |
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