WO2021200784A1 - 大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 - Google Patents

大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2021200784A1
WO2021200784A1 PCT/JP2021/013185 JP2021013185W WO2021200784A1 WO 2021200784 A1 WO2021200784 A1 WO 2021200784A1 JP 2021013185 W JP2021013185 W JP 2021013185W WO 2021200784 A1 WO2021200784 A1 WO 2021200784A1
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amino acid
pal
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acid sequence
strain
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PCT/JP2021/013185
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智久 ▲徳▼永
陶三 西山
康二朗 石黒
和信 水口
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株式会社カネカ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a foreign protein using Escherichia coli.
  • Various hosts are used for the production of recombinant proteins using gene recombination technology.
  • animal cells such as CHO (Chinese Hamster Ovaly) cells
  • microorganisms such as Escherichia coli and yeast, and the like can be mentioned.
  • Microorganisms have the advantage of being able to produce the target protein in a short time and at low cost as compared with animal cells.
  • Escherichia coli is one of the most studied microorganisms and is frequently used in protein production because it grows in a short time and is easy to handle.
  • proteins are generally produced intracellularly. Therefore, after fermentation and culture, the culture solution is separated into bacterial cells and culture supernatant, and periplasm extraction, or ultrasonic waves or lytic enzyme is used. Since it is necessary to perform operations such as cell destruction by a certain lysoteam or recovery of inclusion bodies, and further, it is necessary to purify the target protein from a large amount of host-derived substances. The post-treatment step has a great influence on the production cost of the target protein.
  • Patent Document 1 a recombinant protein is secreted into a culture supernatant using Escherichia coli having a mutation in the gene of lpp, which is a kind of membrane protein.
  • Non-Patent Document 1 various membrane proteins in Escherichia coli are genome-edited using CRISPR / Cas9, and a membrane protein-deficient strain is used to study the extracellular secretory production of foreign fluorescent proteins. It has been reported that the protein is secreted extracellularly. Among them, the extracellular secretion of the peptidoglycan-binding lipoprotein (Pal) -deficient strain involved in the maintenance of the outer membrane structure of Escherichia coli has been confirmed. On the other hand, leakage of DNA into the medium has also been observed. In general, it has been reported that extracellular leakage of DNA causes an increase in the viscosity of the culture supernatant (Non-Patent Document 2).
  • the post-culture post-treatment process is overloaded, such as a decrease in filter filterability in the film treatment in the post-treatment process and an increase in column pressure during purification in chromatography, resulting in production efficiency. This causes a decrease in production costs and an increase in production costs.
  • An object of the present invention is to provide a method for secreting a target protein in a culture supernatant and reducing an increase in viscosity of the culture supernatant.
  • the present inventors use Escherichia coli having a gene encoding a protein having a partial mutation in Pal, which is a membrane protein of Escherichia coli, and having reduced Pal function. Therefore, they have found that the secretory production of the target protein into the culture supernatant is realized and the increase in viscosity of the culture supernatant is reduced, and the present invention has been completed.
  • a method for producing a foreign protein which comprises a step of culturing Escherichia coli containing a gene encoding a peptidoglycan-binding lipoprotein (Pal) having a partial mutation and a gene encoding the foreign protein.
  • Method. The method according to (1), further comprising a step of recovering the secreted foreign protein from the culture supernatant of Escherichia coli.
  • the amount of the foreign protein secreted into the culture supernatant by Escherichia coli is larger than the amount secreted into the culture supernatant of the foreign protein by Escherichia coli having no partial mutation in Pal (1) or (2). The method described.
  • Pal having the partial mutation has a partial mutation in the amino acid sequence of the signal peptide, and the signal peptide having the partial mutation has a partial mutation in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 (1) to (4).
  • the method described in any of. (8) One or more amino acid sequences in which the Pal having the partial mutation is selected from the amino acid sequences at positions 3 to 17, 19 to 121, and 123 to 152 of SEQ ID NO: 1 and / Alternatively, the method according to any one of (1) to (4), which has a partial variation in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. (9) The method according to any one of (1) to (8), wherein the partial mutation is a deletion, substitution or insertion of one or more amino acids.
  • the Pal having the partial mutation has an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 33 to 37 and 39 to 41, an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 33 to 37 and 39 to 41, and 85% or more of the sequences.
  • (1)-(6) which comprises an amino acid sequence having the same identity, or an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 33 to 41, in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added.
  • Pal having the partial mutation has a partial mutation in the amino acid sequence of the signal peptide, and the signal peptide having the partial mutation is 85% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • the Pal having the partial mutation has the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19, SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15. , 17, and 19 have an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in any of 1, 17, and 19, or an amino acid shown in any of SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19.
  • Escherichia coli which contains a gene encoding a peptidoglycan-binding lipoprotein (Pal) having a partial mutation, and the Pal having the partial mutation is at least one selected from the following (a) and (b).
  • a method for producing a host Escherichia coli for producing a foreign protein which comprises the following steps (i) and (ii).
  • the target foreign protein can be secreted into the culture supernatant. Further, the present invention provides a method capable of efficiently producing a target foreign protein by suppressing an increase in viscosity of the culture supernatant due to secretory production and reducing the load on the post-treatment step.
  • Lane M is a marker and indicates 15 kDa. Lane 1 shows the BL21 (DE3) strain, lane 2 shows the Pal1 strain, and lane 3 shows the Pal2 strain. It is a figure which shows the result of SDS-PAGE analysis of the culture supernatant which concerns on Example 4 of this invention. Lane M is a marker and indicates 15 kDa. Lane 1 shows the BL21 (DE3) strain, lane 2 shows the Pal1 strain, and lane 3 shows the Pal2 strain. It is a growth curve of each Escherichia coli strain in the culture in the semi-synthetic medium which concerns on Example 6 of this invention. ⁇ indicates Pal4 strain, ⁇ indicates Pal8 strain, ⁇ indicates BL21 (DE3), ⁇ indicates Pal1 strain, and ⁇ indicates Pal2 strain.
  • the present invention is a method for producing a foreign protein, which comprises a step of culturing Escherichia coli containing a gene encoding a peptidoglycan-binding lipoprotein (Pal) having a partial mutation and a gene encoding the foreign protein.
  • the method for producing a foreign protein of the present invention (hereinafter, also simply referred to as “the method of the present invention”) has many of the above characteristics as compared with the method using Escherichia coli having no partial mutation of Pal. It has the advantage that the target protein can be secreted into the culture medium. Further, the method of the present invention has an advantage that the increase in viscosity of the culture supernatant is suppressed and subsequent treatment such as protein purification can be easily performed.
  • the present invention also comprises a gene encoding a peptidoglycan-binding lipoprotein (Pal) having a partial mutation, wherein the Pal having the partial mutation is at least one selected from the following (a) and (b).
  • the Pal having the partial mutation is at least one selected from the following (a) and (b).
  • I will provide a.
  • the Escherichia coli of the present invention can express the foreign protein by introducing a foreign gene encoding the foreign protein of interest.
  • the target protein can be stably produced.
  • the present invention further provides a method for producing a host Escherichia coli for producing a foreign protein, which comprises the following steps (i) and (ii). (I) Step of adding a partial mutation to the gene encoding the peptidoglycan-binding lipoprotein (Pal) of Escherichia coli; and (ii) The gene encoding the foreign protein of interest in the modified Escherichia coli. The process of introducing.
  • production method By the method for producing host Escherichia coli of the present invention (hereinafter, also simply referred to as "production method"), the above-mentioned Escherichia coli of the present invention can be produced and the above-mentioned method of the present invention can be realized.
  • partial mutation means partial mutation of a gene or protein, and the types of partial mutation include partial substitution, partial deletion, and partial deletion of one or more amino acids. Insertion is mentioned.
  • the "Escherichia coli containing a gene encoding a Pal having a partial mutation (hereinafter referred to as” Pal partial mutant strain ”)" used in the present invention is a gene encoding Pal (SEQ ID NO: 1) on the E. coli genome (hereinafter referred to as "Pal partial mutant strain").
  • SEQ ID NO: 2 is partially mutated and Pal (SEQ ID NO: 1) is partially mutated, and even when Pal (SEQ ID NO: 1) does not have a partial mutation, the signal peptide of Pal (SEQ ID NO: 1) It also includes Escherichia coli in which the gene encoding SEQ ID NO: 3) is partially mutated (SEQ ID NO: 4) and the signal peptide of Pal (SEQ ID NO: 3) is partially mutated.
  • the signal peptide to be partially mutated may be another signal peptide such as OpPA, OpF, Lpp, PhoE and the like.
  • the partial mutation is a partial defect.
  • "Partial deficiency” means partial deficiency of a gene or protein
  • "Escherichia coli containing a gene encoding a Pal having a partial deficiency (hereinafter referred to as” Pal partial deficiency strain ")" Escherichia coli in which the gene (SEQ ID NO: 2) encoding Pal (SEQ ID NO: 1) on the Escherichia coli genome is partially deleted and Pal (SEQ ID NO: 1) is partially deleted.
  • Pal partial deficiency strain Escherichia coli in which the gene (SEQ ID NO: 2) encoding Pal (SEQ ID NO: 1) on the Escherichia coli genome is partially deleted and Pal (SEQ ID NO: 1) is partially deleted.
  • Pal partial deficiency strain Escherichia coli in which the gene (SEQ ID NO: 2) encoding Pal (SEQ ID NO: 1) on the Escherichia coli genome is partially deleted and Pal (SEQ
  • the Pal partial mutant strain can also be prepared by introducing a gene having a PAL-encoding gene having a partial mutation into a Pal-deficient strain lacking a Pal-encoding gene and expressing the Pal having a partial mutation.
  • Escherichia coli in which Pal (SEQ ID NO: 1) is partially mutated, and it is more preferable that the partial mutation is partially deficient.
  • the partial mutation of Pal is preferably a mutation of one or more amino acids selected from the 1st to 152nd positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Further, the partial mutation of Pal is a portion of one or more amino acid sequences selected from the amino acid sequences of positions 3 to 17, 19 to 121, and 123 to 152 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is preferably a mutation.
  • the partial mutation of Pal is the signal peptide of Pal and the N-terminal side of Pal, specifically, positions 1 to 83 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44 (positions 1 to 21 of SEQ ID NO: 3 + SEQ ID NO: 1). 1st to 62nd positions), especially 1st to 77th positions (1st to 21st positions of SEQ ID NO: 3 + 1st to 56th positions of SEQ ID NO: 1), and 22nd to 46th positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44. It is preferably a mutation of one or more amino acids selected from (positions 1 to 45 of SEQ ID NO: 1).
  • the E. coli strain having a gene (SEQ ID NO: 6) encoding Pal (SEQ ID NO: 5) lacking the amino acid at position 3 to 17 on the genome is Pal1 strain, and the 19th position.
  • the Escherichia coli strain having the gene (SEQ ID NO: 8) encoding the Pal (SEQ ID NO: 8) lacking the amino acid at position 43 from the amino acid is Pal2 strain, and the amino acid at position 44 to 62 is missing.
  • the E. coli strain having the gene (SEQ ID NO: 10) encoding the Pal (SEQ ID NO: 9) on the genome is Pal3 strain, and the Pal lacking the amino acid at position 62 to 93 (SEQ ID NO: 11).
  • a Pal8 strain is an Escherichia coli strain having a gene (SEQ ID NO: 20) encoding a Pal (SEQ ID NO: 19) lacking the amino acid at the 147th position from the amino acid at the position on the genome.
  • an Escherichia coli strain having a gene encoding Pal (SEQ ID NO: 33) in which the amino acid at position 2 to 17 (positions 23 to 38 of SEQ ID NO: 44) is deleted is used.
  • Pal9 strain an Escherichia coli strain having a gene encoding Pal (SEQ ID NO: 34) in which serine at position 2 (position 23 of SEQ ID NO: 44) is replaced with alanine on the genome is from Pal10 strain and amino acid at position 14.
  • the Escherichia coli strain having a gene encoding Pal (SEQ ID NO: 35) lacking the 17th amino acid (35th to 38th of SEQ ID NO: 44) on the genome is Pal11 strain, and the 40th amino acid is 45th.
  • the E. coli strain having the gene encoding Pal (SEQ ID NO: 37) lacking (positions 37 to 63 of SEQ ID NO: 44) is the Pal13 strain, and the leucine at the 14th position is replaced with asparagine.
  • the E. coli strain having the gene encoding the signal peptide (SEQ ID NO: 38) on the genome is Pal14 strain, and the amino acid at position 19 to 38 (positions 40 to 59 of SEQ ID NO: 44) is deficient.
  • the E. coli strain having the gene encoding (SEQ ID NO: 39) on the genome is Pal15 strain, and Pal (sequence number 44) lacking the amino acid at position 3 to 12 (positions 24 to 33 of SEQ ID NO: 44) is deficient.
  • the E. coli strain having the gene encoding the number 40) on the genome is the Pal16 strain, and the Pal (SEQ ID NO: 41) lacking the amino acids at positions 12 to 31 (positions 33 to 52 of SEQ ID NO: 44).
  • the Escherichia coli strain having the gene encoding () on its genome is referred to as Pal17 strain.
  • the gene encoding PAL shown in any of the above SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19 (SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, And 20)
  • Escherichia coli containing any of 20 it is preferable to use Escherichia coli containing any of 20).
  • Escherichia coli containing the gene encoding PAL shown in SEQ ID NO: 5, 7 or 9 (SEQ ID NO: 6 or 8).
  • the Pal having the partial mutation is the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19, especially the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 7 or 9. And may have 85% or more sequence identity.
  • the sequence identity is more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 98% or more, or 99% or more.
  • the present invention may include an Escherichia coli comprising a gene encoding the Pal or signal peptide shown in any of SEQ ID NOs: 33 to 41, particularly a gene encoding the Pal or the signal peptide shown in SEQ ID NO: 37. preferable.
  • the Pal having the partial mutation has 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 33 to 37 and 39 to 41, particularly the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37. Is also good.
  • the sequence identity is more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 98% or more, or 99% or more.
  • Escherichia coli having a partial mutation in the signal peptide of Pal may be used, and the signal peptide having the partial mutation referred to here has 85% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38. You may.
  • the sequence identity is more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, and most preferably 98% or more, or 99% or more.
  • sequence identity of the amino acid sequence can be obtained by using a method well known to those skilled in the art, sequence analysis software, or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence analysis software or the like.
  • sequence identity of a certain amino acid sequence to be evaluated with the amino acid sequence X means that the amino acid sequence X and the amino acid sequence to be evaluated are aligned and a gap is introduced as necessary. It is a value expressed in% of the frequency at which the same amino acid appears at the same site in the amino acid sequence including the gap portion when the degree of amino acid matching between the two is set to the highest.
  • the Pal having the partial mutation is the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, and 19, especially the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, 7 or 9. In the amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added.
  • one or more amino acids are substituted or deleted in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 33 to 37 and 39 to 41, particularly in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37. , And / or an added amino acid sequence.
  • the signal peptide having the partial mutation may be an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 38.
  • "1 or more” is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, preferably 1 to 60, preferably 1 to 50, preferably 1 to 40, preferably 1 to 1. 30, preferably 1 to 20, preferably 1 to 15, preferably 1 to 10, preferably 1 to 5, preferably 1 to 4, preferably 1 to 3, preferably 1 to 2.
  • Escherichia coli strain used examples include W3110 derived from the K12 strain and BL21 derived from the B strain, but the Escherichia coli strain is not particularly limited thereto.
  • Examples of a method for producing a Pal gene having a partial mutation in the genome of any Escherichia coli strain include a method known to those skilled in the art, for example, an overlap PCR method using an appropriate oligonucleotide as a primer and a total synthesis method.
  • a known method can be appropriately used, and a Red-recombinase system (Datsenko KA, and Wander B. L. (2000), Proc) can be used as appropriate. Nat. Acad. Sci. USA, 97 (12), 6640-6645) and methods of incorporation by the homologous recombination mechanism of host cells (Link A. J. et al. (1997), J. Bacteriol., 179, 6228-6237) and the like, and in particular, the method described in Link et al., In which a foreign gene other than the Escherichia coli genome is not integrated into the genome, is preferable.
  • methods for preparing a recombinant vector of the Pal gene having a partial mutation include a ligation method, In-Fusion (Clontec), a PCR method, a total synthesis method, and the like, but are not particularly limited thereto. No. Further, in order to introduce the recombinant vector into a host cell, for example, when Escherichia coli is used as a host, a method such as a calcium chloride method or an electroporation method can be used, but the present invention is not particularly limited thereto.
  • periplasmic chaperones such as FkpA, Dsb, and SurA in the Pal partial mutant strain.
  • the term "foreign protein” means a protein encoded by a gene integrated from the outside of a host cell, which is not normally expressed in an untransformed host cell.
  • the foreign protein in order for the foreign protein to be secreted into the culture supernatant, it must be transferred from the cytoplasm of Escherichia coli to the periplasmic space. Therefore, it is necessary that the periplasmic transition signal sequence is added to the 5'end side of the gene encoding the foreign protein.
  • the periplasmic translocation signal exerting a function in Escherichia coli include, but are not limited to, PelB, OpPA, PhoA, OpF, StII and the like.
  • the "expression vector” in the present invention means an artificially constructed nucleic acid molecule having a function of expressing a gene in an expression cassette integrated into an expression vector in a transformed host cell.
  • the expression vector includes a cloning site containing one or more restriction enzyme recognition sequences, an overlapping region for using Clontec's In-Fusion cloning system, marker genes such as drug resistance genes, and self-replicating sequences. Etc. can be possessed.
  • the expression vector include a plasmid vector and an artificial chromosome, but a plasmid vector is preferable because vector preparation and transformation of an Escherichia coli strain are easy.
  • the plasmid include, but are not limited to, known expression vectors such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, and pBluescript.
  • the "expression cassette” is composed of a gene encoding a promoter and a foreign protein, and may include a terminator.
  • promoters examples include, but are not limited to, promoters known to those skilled in the art, such as lac promoter, tac promoter, ara promoter, tet promoter, and T7 promoter.
  • the drug resistance marker gene of the plasmid vector in the present invention is not particularly limited in the Escherichia coli strain provided in the present invention. Specific examples include a kanamycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, a tetracycline resistance gene, a chloramphenicol resistance gene, and the like, and selection is made according to the resistance in a medium containing kanamycin, ampicillin, tetracycline, and chloramphenicol, respectively. Is possible.
  • a Pal partial mutant strain into which the above expression vector has been introduced is provided, and the Escherichia coli strain can be selectively obtained using the drug resistance obtained by the drug resistance gene contained in the expression vector as an index. ..
  • protein secretion in Escherichia coli means that the protein expressed in the cytoplasm is transferred to the periplasmic space.
  • the secretory production in the present invention is to produce a foreign protein in the culture supernatant by culturing the above-mentioned Escherichia coli strain, or a simpler operation than a conventional periplasm extraction operation, for example, an operation such as an osmotic shock method.
  • an operation such as an osmotic shock method.
  • the foreign protein existing in the periplasmic space is transferred to the outside of the cell by an operation such as adding an additive to the culture solution, and preferably, the foreign protein is produced in the culture supernatant.
  • a foreign protein that is not secreted in the parent strain or the wild type strain that has not been genetically modified is secreted in the culture supernatant.
  • the amount of foreign protein secreted into the culture supernatant can be determined by a method known to those skilled in the art, for example, band intensity comparison, Western blotting method, ELISA method and the like.
  • the culture supernatant provided in the present invention can proceed to the purification step without the need for a DNA removal operation such as nuclease treatment, and the foreign protein secreted in the culture supernatant is fungied by an operation such as centrifugation. After removing the body, it can be recovered directly.
  • known purification methods such as salting out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fractionation precipitation method using acetone, ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange, etc. Techniques such as chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and ultrafiltration can be used alone or in combination as appropriate.
  • the recovered foreign protein can be used as it is, but it can also be used afterwards with modifications that bring about pharmacological changes such as PEGylation and modifications that add functions such as enzymes and isotopes. Moreover, various formulation treatments may be used.
  • the medium for culturing the above-mentioned E. coli strain transformed with the expression vector can be any medium as long as it contains a nutrient source assimilated by E. coli, and the above-mentioned nutrient source includes glucose, sucrose, lactose, maltose and the like.
  • a nitrogen source such as ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, or corn steep liquor, and other nutrient sources such as inorganic salts and vitamins are appropriately mixed and mixed can be used.
  • a nitrogen source such as ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, or corn steep liquor, and other nutrient sources such as inorganic salts and vitamins are appropriately mixed and mixed
  • glucose or glycerol as a carbon source.
  • a medium containing a natural component such as yeast extract or a synthetic medium not containing them It is possible to culture in a medium containing a natural component such as yeast extract or a synthetic medium not containing them, and the type of medium is not limited. Further, the culture method is not particularly limited, and batch culture, fed-batch culture, continuous culture and the like are applied.
  • foreign proteins produced include enzymes derived from microorganisms, proteins derived from multicellular organisms such as animals and plants, and the like. Examples thereof include phytase, protein A, protein G, protein L, amylases, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, fluorescent protein and the like. It is not limited to these. In particular, biopharmaceutical proteins are preferred.
  • proteins for biopharmaceuticals include partial antibodies such as VHH, scFv, and Fab, cytokines, growth factors, protein kinases, protein hormones, Fc fusion proteins, and human serum albumin (HSA) fusion proteins.
  • amino acids constituting the foreign protein may be natural, non-natural, or modified. Further, the amino acid sequence of the protein may be artificially modified or may be designed by de-novo.
  • Culturing of E. coli can usually be carried out under general conditions, for example, pH 6-8, preferably 6.5-7.5, more preferably 6.9-7.1, temperature 15-42 ° C.
  • the culture is preferably 20 to 37 ° C., more preferably 25 to 30 ° C.
  • the dissolved oxygen concentration is 10 to 80%, preferably 20 to 60%, more preferably 30 to 40%
  • the culture time is 20 to 150 hours. Can be done by.
  • nutrients or inducers can be supplied to the medium by shot or fed-batch, if necessary.
  • the inducer is appropriately selected depending on the promoter to be used. For example, in direct induction of the lac promoter or tac promoter or indirect induction of the T7 promoter by expressing T7 RNA polymerase with the lac promoter, lactose or isopropyl- ⁇ -Thiogalactopyranoside (IPTG) and the like are used.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -Thiogalactopyranoside
  • protein expression can be induced by adding it so that the final concentration is 0.1 to 2.0 mM, more preferably 0.2 to 1.0 mM.
  • the timing of inducing the expression of the foreign protein is not particularly limited as long as the foreign protein is expressed and secreted into the culture supernatant, but is preferably the early logarithmic growth phase, the middle logarithmic growth phase, or the late logarithmic growth phase. , Particularly preferably in the late logarithmic growth phase.
  • the Escherichia coli used in the method of the present invention has a growth ability equal to or higher than that of Escherichia coli into which a foreign gene has been similarly introduced into a wild-type strain.
  • the term "equivalent or higher growth ability" as used herein means that the viable cell concentration in the culture solution when the growth curve reaches the plateau is 80% or more with respect to the comparison target, and 85% or more is preferable. , 90% or more is more preferable, and 95% or more is further preferable.
  • the viscosity of the culture supernatant can be evaluated by measuring the amount of liquid flowing through the culture supernatant from which the cells have been separated using a syringe filter or a centrifugal filtration device. Further, as described in Non-Patent Document 2, a rheometer or a viscometer may be used, and since DNA leakage from the host contributes to an increase in viscosity in the culture supernatant, DNA Dye Binding Assay for the Measurement of Residual E.I. It is also good to compare and evaluate with a DNA quantification kit such as colli Host Cell DNA (Cygnus), but it is not limited by these.
  • a DNA quantification kit such as colli Host Cell DNA (Cygnus), but it is not limited by these.
  • the viscosity of the obtained Escherichia coli culture supernatant is preferably sufficiently low.
  • it is preferably significantly lower than the culture supernatant of a total Lpp-deficient strain into which a foreign gene has also been introduced.
  • the amount of liquid that can be filtered with a 0.45 ⁇ m hole or 0.22 ⁇ m hole hydrophilic syringe filter (PTFE, cellulose acetate, etc.) is more than twice that of the culture supernatant of the Lpp total deficient strain. Is preferable.
  • the BL21 (DE3) strain was used as the Escherichia coli strain as the parent strain.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA isolation and purification DNA isolation and purification
  • restriction enzyme treatment cloning of modified DNA, transformation, etc.
  • PCR used Prime STAR HS DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) or the like.
  • QIAook Gel Production Kit QIAGEN or the like was used.
  • Gene synthesis was used to prepare DNA fragments other than PCR.
  • the plasmid vector used for transformation is the constructed vector of Escherichia coli E. coli. It was prepared by introducing it into E. coli DH5 ⁇ competent cell (Takara Bio Inc.) and culturing and amplifying the obtained transformant. Extraction of the plasmid from the plasmid-carrying strain was performed using FastGene plasmid Mini Kit (Nippon Gene).
  • the cloning vector used is a cloning vector modified from pTH18cs (National Institute of Genetics: NIG) and has a tetracycline resistance gene.
  • the expression vector used is characterized by having a multicloning site containing EcoRI and XhoI recognition sequences, a T7 expression system, a canamycin resistance gene, a self-renewal initiation sequence, and a lac repressor gene.
  • BL21 (DE3) strain which is the parent strain, as a comparison target for the amount of foreign protein secreted into the culture supernatant of the Pal partial deficient strain, and all Lpp prepared using the Red-recombinase system as a comparison target for the viscosity of the culture supernatant.
  • a deficient strain hereinafter referred to as " ⁇ Lpp" was used. Although ⁇ Lpp secretes and produces foreign proteins, the problem is that the culture supernatant containing the foreign proteins has high viscosity and low filter filterability, so that a large load is applied to the post-treatment step.
  • Example 1 Preparation of Pal1 strain A partial Pal-deficient strain of Escherichia coli BL21 (DE3) strain was prepared from Link A. coli. J. The method was carried out with reference to the other method (J. Bacteriol., 1997, 179, 6228-6237). For homologous recombination on the genome of 500 bp upstream and downstream of the pal gene containing the signal sequence, which contains the Pal1 gene encoding Pal1 in which the amino acid at the 3rd position to the 17th position of Pal (SEQ ID NO: 1) is deleted. In order to prepare a DNA fragment (SEQ ID NO: 21) having the required homology arm, the genome of the BL21 (DE3) strain (base sequence: Accession No.
  • PCR was performed using Primer 1 (SEQ ID NO: 22) and Primer 2 (SEQ ID NO: 23), Primer 3 (SEQ ID NO: 24) and Primer 4 (SEQ ID NO: 25), and each PCR product was mixed. After that, PCR using Primer 1 and Primer 4 was performed to obtain a target DNA fragment. This DNA fragment has a restriction enzyme recognition sequence of EcoRI on the 5'end side and SalI on the 3'end side.
  • the DNA fragment and cloning vector prepared above were cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI. Ligation was performed using each cleaved DNA fragment.
  • the plasmid (pPal1) thus prepared was transformed into a DH5 ⁇ strain by the calcium chloride method, and a pPal1 carrying strain was selected using a medium containing tetracycline.
  • the pPal1 obtained in the BL21 (DE3) strain was transformed by the calcium chloride method, and a pPal1 holding strain was selected using a medium containing tetracycline.
  • the gene recombination operation until the Pal1 strain is obtained is described in Link A. J. It was carried out based on other methods.
  • the strain prepared as described above was designated as a Pal1 strain.
  • Example 2 Preparation of Pal2 strain The same method as in Example 1 was carried out. A homology arm required for homologous recombination on the genome of 200 bp upstream and downstream outside the pal gene containing the signal sequence, which contains the Pal2 gene encoding Pal2 lacking the amino acid at position 19 to 43 of Pal. Primer 5 (SEQ ID NO: 27) and Primer 6 (SEQ ID NO: 28), Primer 7 (SEQ ID NO: 29) and Primer using the genome of the BL21 (DE3) strain as a template in order to prepare the DNA fragment having (SEQ ID NO: 26).
  • PCR using 8 (SEQ ID NO: 30) was performed, each PCR product was mixed, and then PCR using Primer 1 and Primer 4 was performed to obtain a target DNA fragment.
  • This DNA fragment has a restriction enzyme recognition sequence of EcoRI on the 5'end side and SalI on the 3'end side.
  • the DNA fragment and cloning vector prepared above were cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI. Ligation was performed using each cleaved DNA fragment.
  • the plasmid (pPal2) thus prepared was transformed into a DH5 ⁇ strain by the calcium chloride method, and a pPal2-bearing strain was selected using a medium containing tetracycline.
  • the pPal2 obtained in the BL21 (DE3) strain was transformed by the calcium chloride method, and a pPal2-bearing strain was selected using a medium containing tetracycline.
  • the gene recombination operation until the Pal2 strain is obtained is described in Link A. J. It was carried out based on other methods.
  • the strain prepared as described above was designated as a Pal2 strain.
  • Example 3 Production of nanobody (VHH) in a synthetic medium using a partially Pal-deficient strain Anti-Fc VHH having a signal peptide PelB (SEQ ID NO: 31) and a His tag on the C-terminal side was encoded.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 32) was prepared by gene synthesis. The DNA fragment and the expression vector were cleaved with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and the DNA fragments cleaved with the restriction enzymes were mixed and ligated. The obtained VHH expression vector was introduced into BL21 (DE3), Pal1 strain and Pal2 strain by an electroporation method and transformed. Expression vector-bearing strains were selected with kanamycin-containing medium (50 mg / L).
  • Expression was induced by adding isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) (Carbonsis) to a final concentration of 0.2 mM in the late logarithmic growth phase, and at the same time, 80%.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the (w / w) glycerol solution was added at a constant rate.
  • the temperature was set to 30 ° C. at the start of the culture, and the temperature was 25 ° C. after the induction of expression.
  • the pH was 10% NH.
  • the value was maintained at 7.0 by appropriately adding 4 OH or 10% H 2 SO 4 , and the dissolved oxygen concentration was maintained at 30% by cascade control of the number of stirrings and the aeration rate.
  • the gel was washed with water for 30 minutes, stained with a staining solution (Bio-Safe CBB G-250 stain, Bio-Rad) for 45 minutes, and then decolorized with water.
  • a staining solution Bio-Safe CBB G-250 stain, Bio-Rad
  • the parent strain BL21 (DE3) was also cultured under the same conditions using the expression vector used in Example 3, and SDS-PAGE electrophoresis and CBB staining were performed. As a result, a band was observed in the region corresponding to the molecular weight estimated from the amino acid sequence of VHH (Fig. 1).
  • the Pal1 strain was 6.7 times as much as the parent strain, and Pal2.
  • a VHH band could be detected in the strain at 6.9 times the intensity (Table 1).
  • Table 1 the VHH band intensity in the culture supernatant of the parent strain is set to 1, and the VHH band intensity in the culture supernatant of the Pal1 strain and the Pal2 strain is shown.
  • Example 4 Production of VHH in a semi-synthetic medium using a partially deficient Pal strain
  • the expression vector and strain used were the same as those used in Example 3.
  • Semi-synthetic medium 2.5L 1.0g / L NH 4 Cl ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), 9.0g / L Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), 3 .0g / L Na 3 PO 4 ⁇ 12H 2 O ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), 20g / L glucose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), 20g / L yeast extract (Oriental yeast Co., Ltd., red label), 1.0g / L MgSO 4 ⁇ 7H 2 O ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), 0.006g / L MnCl 2 ⁇ 4H 2 O ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade), 0.05g / L FeSO 4 ⁇ A pre
  • Expression induction was carried out by adding IPTG to a final concentration of 0.8 mM 24 hours after the start of culturing.
  • the temperature was set to 30 ° C. at the start of culturing, and the cells were cultivated at a temperature of 25 ° C. after induction of expression.
  • the pH was maintained at a value of 7.0 by appropriately adding 10% NH 4 OH or 10% H 2 PO 4 , and the dissolved oxygen concentration was maintained in the feed solution (144 g / L glucose, 423 g / L).
  • yeast extract was maintained at 13g / L MgSO 4 ⁇ 7H 40 % by feed rate of 2 O).
  • Example 3 72 hours after the start of culturing, the culture broth was collected, and the cells and the culture supernatant were separated by centrifugation. SDS-PAGE electrophoresis and CBB staining were performed in the same manner as in Example 3. On the other hand, the parent strain BL21 (DE3) was also cultured under the same conditions using the expression vector used in Example 3, and SDS-PAGE electrophoresis and CBB staining were performed. As a result, a band was observed in the region corresponding to the molecular weight estimated from the amino acid sequence of VHH (Fig. 2).
  • Example 5 Evaluation of filter filterability of culture supernatant
  • the culture supernatants of the Pal1 and Pal2 strains obtained in Examples 3 and 4 were centrifuged again, and 10 mL of the supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m syringe filter. (DISMIC®-25AS, ADVANTEC) was used to evaluate the filter filterability based on the amount of liquid flowing per square cm.
  • the ⁇ Lpp strain was also cultured under the same conditions using the expression vector used in Example 3, and the viscosity of the culture supernatant was evaluated under the same conditions.
  • the ⁇ Lpp strain was prepared by Red-recombinase system with reference to Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Example 6 Growth behavior of Pal1, Pal2, Pal4 and Pal8 strains in a semi-synthetic medium Using the same method as in Examples 1 and 2, Pal4 and Pal8 having a mutation on the C-terminal side of Pal. A strain was prepared.
  • the VHH expression vector used in Example 3 was introduced into the Pal4 and Pal8 strains by the electroporation method and transformed. VHH expression vector-bearing strains were selected with kanamycin-containing medium (50 mg / L).
  • BL21 (DE13), Pal1, Pal2, Pal4 and Pal8 strains into which the VHH expression vector was introduced in the same manner as in Example 3 were added to 2.5 L or 1.0 L of the same semi-synthetic medium used in Example 4.
  • Preculture solutions were added so that the initial OD600 value was 0.03.
  • Expression induction was carried out by adding IPTG to a final concentration of 0.8 mM 24 hours after the start of culturing. The temperature was set to 30 ° C. at the start of culturing, and the cells were cultivated at a temperature of 25 ° C. after induction of expression.
  • the pH was maintained at a value of 7.0 by appropriately adding 10% NH 4 OH or 10% H 2 PO 4 , and the dissolved oxygen concentration was maintained in the feed solution (144 g / L glucose, 423 g / L).
  • yeast extract was maintained at 13g / L MgSO 4 ⁇ 7H 40 % by feed rate of 2 O).
  • the amount of bacteria in the culture solution was quantified by the OD600 value.
  • the growth curve of each strain is shown in FIG. It was confirmed that the growth behavior of the Pal4 strain and the Pal8 strain was deteriorated as compared with BL21 (DE3). On the other hand, it has been shown that the Pal1 strain and the Pal2 strain have almost the same growth behavior as BL21 (DE3). This indicates that the mutant strain having a mutation in the C-terminal region of Pal has decreased culture stability, and the mutant strain having a mutation in the N-terminal region of Pal maintains the culture stability.
  • Example 7 Preparation of Pal mutant strain having a mutation in the N-terminal region
  • Various Pal mutant strains (Pal9 to Pal17) were prepared by the following methods.
  • the preparation of the Pal9 to 13 strain and the Pal15 to 17 strain contains a base sequence encoding a Pal having a defective region or a point mutation at the site shown in Table 4, respectively, and is about upstream and downstream of the pal gene including the signal sequence, respectively.
  • Various DNA fragments having homologous arms required for homologous recombination on the genome were used at 300 bp.
  • a base sequence encoding Pal is included, and a base sequence encoding a signal peptide having a point mutation shown in Table 4 is contained upstream, and 300 bp upstream and downstream outside the pal gene are used on the genome.
  • a DNA fragment having a homology arm required for homologous recombination was used.
  • Each DNA fragment was prepared using overlap PCR. This DNA fragment has a restriction enzyme recognition sequence of EcoRI on the 5'end side and SalI on the 3'end side.
  • various Pal mutant strains (Pal9 to Pal17) were prepared in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • the mutation mode shown in Table 4 shows the mutation site in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 44) of Pal containing the signal peptide.
  • Example 8 Production of nanobody (VHH) using Pal mutant strain A VHH expression vector was introduced into various Pal mutant strains prepared in Example 7 by an electroporation method in the same manner as in Example 3, and transformed. VHH expression vector-bearing strains were selected with kanamycin-containing medium (50 mg / L).
  • TB medium 12 g / l polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 24 g / L yeast extract (Becton, Dickinson and Company), 10 g / L glycerol (Nacalai Tesque, biotechnology grade), 9.4 g / L K 2 HPO
  • Preculture solution was added to 4 (Nacalai Tesque, special grade), 2.2 g / L KH 2 PO 4 (Nacalai Tesque, biotechnology grade) so that the initial OD600 value was 0.01.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the gel was washed with water for 30 minutes, stained with a staining solution (Bio-Safe CBB G-250 stain, Bio-Rad) for 45 minutes, and then decolorized with water.
  • a staining solution Bio-Safe CBB G-250 stain, Bio-Rad
  • the VHH band intensity in the culture supernatant of BL21 (DE3) was 1.
  • the Pal1 strain is 2.1 times
  • the Pal2 strain is 3.9 times
  • the Pal9 strain is 1.3 times
  • the Pal10 is 1.2 times
  • the Pal11 strain is 1.6 times
  • the Pal12 strain is 1.3 times.
  • the VHH band could be detected with an intensity of 3.4 times for the Pal13 strain, 3.1 times for the Pal14 strain, 2.0 times for the Pal15 strain, 1.5 times for the Pal16 strain, and 1.6 times for the Pal17 strain. (Table 5).
  • Example 9 Production of ⁇ -mannosidase using a Pal mutant strain A DNA fragment (SEQ ID NO: 43) having a signal peptide OpPA (SEQ ID NO: 42) and encoding ⁇ -mannosidase was prepared by gene synthesis. This DNA fragment and the expression vector were cleaved with restriction enzymes EcoRI and XhoI, and the DNA fragments cleaved with the restriction enzymes were mixed and ligated. The obtained ⁇ -mannosidase expression vector was introduced into BL21 (DE3), the Pal1 strain and the Pal2 strain prepared in Examples 1 and 2 by the electroporation method, and transformed. ⁇ -mannosidase expression vector-bearing strains were selected with kanamycin-containing medium (50 mg / L).
  • TB medium 12 g / L polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 24 g / L yeast extract (Becton, Dickinson and Company), 10 g / L glycerol (Nacalai Tesque, biotechnology grade), 9.4 g / L K 2 HPO
  • Preculture solution was added to 4 (Nacalai Tesque, special grade), 2.2 g / L KH 2 PO 4 (Nacalai Tesque, biotechnology grade) so that the initial OD600 value was 0.1.
  • Expression induction was carried out by adding IPTG to a final concentration of 1.0 mM 7 hours after the start of culturing. Culturing was carried out at 30 ° C. and 110 rpm.
  • the gel was washed with water for 30 minutes, stained with a staining solution (Bio-Safe CBB G-250 stain, Bio-Rad) for 45 minutes, and then decolorized with water. As a result, a band was observed in the region corresponding to the molecular weight estimated from the amino acid sequence of VHH.
  • a staining solution Bio-Safe CBB G-250 stain, Bio-Rad
  • the ⁇ -mannosidase in the culture supernatant of BL21 (DE3) was measured. Assuming that the band intensity of 1 was 1, the ⁇ -mannosidase band could be detected at 1.4 times the intensity of the Pal1 strain and 3.0 times the intensity of the Pal2 strain (Table 6).

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Abstract

大腸菌によって、外来タンパク質を培養液中に生産するための方法であって、該タンパク質が培養液中に分泌され、かつ培養上清の粘性上昇が抑制されることにより、培養後の後処理工程に負荷のかからない培養上清から直接精製することができる方法を提供する。　本発明は、外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養し、当該外来タンパク質を培養上清中に分泌させる、当該外来タンパク質の製造方法に関する。

Description

大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法
　本発明は、大腸菌を用いた外来タンパク質の製造方法に関する。
　遺伝子組換え技術を用いた組換えタンパク質の生産には、様々な宿主が用いられている。例えば、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞といった動物細胞や、大腸菌や酵母といった微生物等が挙げられる。微生物においては、動物細胞と比較して短時間かつ低コストで目的タンパク質を生産できるというメリットがある。とりわけ、大腸菌は最も研究されている微生物の一つで、短時間で増殖し、かつ取扱いも容易なことからタンパク質生産において頻繁に利用されている。
　大腸菌を用いたタンパク質生産において、一般的には、細胞内でタンパク質が生産されるため、発酵培養後に培養液を菌体と培養上清に分離し、ペリプラズム抽出、又は、超音波や溶菌酵素であるリゾチーム等による細胞破壊、もしくは、封入体（インクルージョンボディー）の回収等の操作を行う必要があり、さらには、目的のタンパク質を多種・多量の宿主由来物質から精製する必要があることから、これらの後処理工程が目的タンパク質の生産コストに大きく影響する。
　大腸菌を用いたタンパク質生産において、目的タンパク質を細胞外に分泌する方法を用いることができれば、培養上清と菌体との分離作業のみにより、ペリプラズム抽出や菌体破壊といった更なる後処理工程を行うことなく、培養上清から直接的に精製することができる。
　これまでに、膜タンパク質の一種であるｌｐｐの遺伝子に突然変異を有する大腸菌を使用して、組換えタンパク質の培養上清中への分泌が報告されている（特許文献１）。
　また、非特許文献１では大腸菌における様々な膜タンパク質をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてゲノム編集した膜タンパク質欠損株を用い、外来蛍光タンパク質の細胞外への分泌生産の検討が行われており、生産された該タンパク質の細胞外への分泌が報告されている。その中で、大腸菌の外膜構造維持に関わるペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）欠損株においても該タンパク質の細胞外への分泌が確認されている。一方で、培地中へのＤＮＡの漏出も観察されている。一般的にＤＮＡの細胞外への漏出は培養上清の粘性増大の要因となることが報告されている（非特許文献２）。
　培養上清の粘性が増大した場合、後処理工程での膜処理におけるフィルターろ過性の低下、クロマトグラフィーでの精製時におけるカラム圧の上昇等、培養後の後処理工程に負荷がかかり、生産効率の低下や生産コストの増加の要因となる。
　一方、種々の部分欠損を有するＰａｌをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用い、Ｐａｌ欠損株に対して形質転換することで、Ｐａｌ欠損株では失われている外膜の整合性が完全に又は一部相補されることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、これはＰａｌがＴｏｌＡ、ＴｏｌＢ、ＯｍｐＡといった他の膜タンパク質やペプチドグリカンと相互作用することで、Ｐａｌの外膜の整合性に寄与することを明らかにしたものであり、外来タンパク質の分泌生産能については不明である。
特開２００８－７３０４６号公報
Ｗｅｎ　Ｇａｏ　他著、ＡＣＳ　Ｓｙｎｔｈ．　Ｂｉｏｌ．，　７，　１２９１－１３０２（２０１８） Ｊｏｓｅｐｈ　Ｍ．　Ｎｅｗｔｏｎ　他著，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ．，　３２（４），　１０６９－１０７６（２０１６） Ｃａｓｃａｌｅｓ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌｌｏｕｂｅｓ　Ｒ著，，Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１（３），８７３－８８５（２００４）
　本発明は、目的タンパク質を培養上清中に分泌させるとともに、培養上清の粘性上昇を低減する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、大腸菌の膜タンパク質であるＰａｌに部分変異を有するタンパク質をコードする遺伝子を有し、Ｐａｌの機能が低減した大腸菌を用いることで、目的タンパク質の培養上清中への分泌生産を実現し、かつ培養上清の粘性上昇が低減することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明では以下の発明が提供される。
（１）外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養する工程を含む、当該外来タンパク質の製造方法。
（２）前記大腸菌の培養上清から、分泌された外来タンパク質を回収する工程をさらに含む、（１）に記載の方法。
（３）前記大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量が、Ｐａｌに部分変異を有しない大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量よりも多い（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列、及び／又は、シグナルペプチドのアミノ酸配列に部分変異を有する、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から６２位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から４５位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有する、（５）に記載の方法。
（７）前記部分変異を有するＰａｌがシグナルペプチドのアミノ酸配列に部分変異を有し、部分変異を有するシグナルペプチドが、配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（８）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１の３位から１７位、１９位から１２１位、及び１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる１つ以上のアミノ酸配列、及び／又は配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（９）前記部分変異が、１つ以上のアミノ酸の欠損、置換又は挿入である（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号３３～３７及び３９～４１のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号３３～３７及び３９～４１のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３３～４１のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む、（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記部分変異を有するＰａｌがシグナルペプチドのアミノ酸配列に部分変異を有し、部分変異を有するシグナルペプチドが、配列番号３８に示すアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３８に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む、（１）～（４）及び（７）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む、（１）～（４）及び（８）のいずれかに記載の方法。
（１３）部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子を含み、前記部分変異を有するＰａｌが、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１つである、大腸菌：
　（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から６２位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有するＰａｌ；及び
　（ｂ）シグナルペプチドのアミノ酸配列に変異を有するＰａｌ。
（１４）目的の外来タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、（１３）に記載の大腸菌。
（１５）目的の外来タンパク質を発現し、部分変異を有しない大腸菌と比較して、前記目的の外来タンパク質を多量に菌体外に分泌する、（１４）に記載の大腸菌。
（１６）外来タンパク質を製造するための宿主大腸菌の作製方法であって、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、方法：
　（ｉ）大腸菌のペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子に部分変異を加える工程；及び
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた遺伝子が改変された大腸菌に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-064178号の開示内容を包含する。
　本発明のＰａｌを部分変異させた大腸菌で外来タンパク質を生産することにより、培養上清中に目的の外来タンパク質を分泌させることができる。また、本発明によって、分泌生産に伴う培養上清の粘性上昇が抑制され、後処理工程への負荷軽減により効率的に目的の外来タンパク質を生産できる方法が提供される。
本発明の実施例３に係る培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭはマーカーであり１５ｋＤａを示す。レーン１はＢＬ２１（ＤＥ３）株、レーン２はＰａｌ１株、レーン３はＰａｌ２株を示す。 本発明の実施例４に係る培養上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。レーンＭはマーカーであり１５ｋＤａを示す。レーン１はＢＬ２１（ＤＥ３）株、レーン２はＰａｌ１株、レーン３はＰａｌ２株を示す。 本発明の実施例６に係る半合成培地での培養における各大腸菌株の生育曲線である。■はＰａｌ４株、□はＰａｌ８株、●はＢＬ２１（ＤＥ３）、▲はＰａｌ１株、△はＰａｌ２株を示す。
　［本発明の概要］
　本発明は、外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養する工程を含む、当該外来タンパク質の製造方法を提供する。本発明の外来タンパク質の製造方法（以下、単に「本発明の方法」とも称する）は、上記の特徴を有することによって、Ｐａｌの部分変異を有しない大腸菌を使用する方法と比較して、多くの目的タンパク質を培養液中に分泌させることができる、という利点を有する。さらに、本発明の方法では、培養上清の粘性上昇が抑制され、後のタンパク質精製等の処理を行いやすい、という利点を有する。
　本発明はまた、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子を含み、前記部分変異を有するＰａｌが、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１つである、大腸菌を提供する。
　（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から６２位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有するＰａｌ；及び
　（ｂ）シグナルペプチドのアミノ酸配列に変異を有するＰａｌ
　本発明の大腸菌は、目的の外来タンパク質をコードする外来遺伝子を導入することで、当該外来タンパク質を発現することができる。その際に、Ｐａｌの部分変異を有しない大腸菌と比較して、多量の外来タンパク質を菌体外に分泌させることが可能である。また、Ｐａｌの部分変異を有しない大腸菌と同等以上の生育能を有することから、安定的に目的タンパク質を製造可能である。本発明の大腸菌を使用することで、上記の本発明の方法を実現することが可能である。
　本発明は、さらに、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、外来タンパク質を製造するための宿主大腸菌の作製方法を提供する。
　（ｉ）大腸菌のペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子に部分変異を加える工程；及び
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた遺伝子が改変された大腸菌に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程。
　本発明の宿主大腸菌の作製方法（以下、単に「作製方法」とも称する）により、上記の本発明の大腸菌を作製し、上記の本発明の方法を実現することが可能である。
　［部分変異を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌］
　本発明において、「部分変異」とは遺伝子、もしくはタンパク質を部分的に変異させることを意味し、部分変異の種類としては、１つ以上のアミノ酸の部分的な置換、部分的な欠損、部分的な挿入が挙げられる。本発明で用いられる「部分変異を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌（以下、「Ｐａｌ部分変異株」と呼称する）」とは、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を部分的に変異させ、Ｐａｌ（配列番号１）を部分的に変異させた大腸菌であり、Ｐａｌ（配列番号１）に部分変異を有していない場合でも、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３）をコードする遺伝子（配列番号４）を部分的に変異させ、Ｐａｌのシグナルペプチド（配列番号３）を部分的に変異させた大腸菌も含む。部分変異させるシグナルペプチドは、他のシグナルペプチド、例えば、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、Ｌｐｐ、ＰｈｏＥ等であっても良い。
　本発明において、前記部分変異は部分欠損であることが好ましい。「部分欠損」とは遺伝子、もしくはタンパク質を部分的に欠損させることを意味し、「部分欠損を有するＰａｌをコードする遺伝子を含む大腸菌（以下、「Ｐａｌ部分欠損株」と呼称する）」とは、大腸菌ゲノム上のＰａｌ（配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）を部分的に欠損させ、Ｐａｌ（配列番号１）を部分的に欠損させた大腸菌であり、配列番号３又は４に部分欠損を有する場合も含む。Ｐａｌに部分欠損を施す箇所は文献に記載されているものを適用した（Ｃａｓｃａｌｅｓ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌｌｏｕｂｅｓ　Ｒ著，（２００４年），Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１（３），８７３－８８５）。
　Ｐａｌ部分変異株は、Ｐａｌをコードする遺伝子を欠損させたＰａｌ欠損株に部分変異を有するＰａｌをコードした遺伝子を有する遺伝子を導入し、部分変異を有するＰａｌを発現させることで作製することも可能であるが、本発明では、Ｐａｌ（配列番号１）が部分変異した大腸菌を用いることが好ましく、前記部分変異は部分欠損であることがより好ましい。
　前記Ｐａｌの部分変異は、配列番号１のアミノ酸配列における１位から１５２位の中から選ばれる一つ以上のアミノ酸の変異であることが好ましい。また、前記Ｐａｌの部分変異は、配列番号１のアミノ酸配列における３位から１７位、１９位から１２１位、及び１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる一つ以上のアミノ酸配列の部分変異であることが好ましい。
　あるいは、前記Ｐａｌの部分変異は、Ｐａｌのシグナルペプチド及びＰａｌのＮ末端側、具体的には配列番号４４のアミノ酸配列の１位から８３位（配列番号３の１位から２１位＋配列番号１の１位から６２位）、特に１位から７７位（配列番号３の１位から２１位＋配列番号１の１位から５６位）、さらに、配列番号４４のアミノ酸配列の２２位から４６位（配列番号１の１位から４５位）の中から選ばれる一つ以上のアミノ酸の変異であることが好ましい。
　本明細書では、３位のアミノ酸から１７位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号５）をコードしている遺伝子（配列番号６）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１株、１９位のアミノ酸から４３位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号７）をコードしている遺伝子（配列番号８）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ２株、４４位のアミノ酸から６２位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号９）をコードしている遺伝子（配列番号１０）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ３株、６２位のアミノ酸から９３位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１１）をコードしている遺伝子（配列番号１２）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ４株、９４位のアミノ酸から１２１位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１３）をコードしている遺伝子（配列番号１４）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ５株、１２３位のアミノ酸から１５２位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１５）をコードしている遺伝子（配列番号１６）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ６株、１２６位のアミノ酸から１２９位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１７）をコードしている遺伝子（配列番号１８）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ７株、１４４位のアミノ酸から１４７位のアミノ酸が欠損しているＰａｌ（配列番号１９）をコードしている遺伝子（配列番号２０）をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ８株とする。
　本明細書では、２位のアミノ酸から１７位のアミノ酸（配列番号４４の２３位から３８位）が欠損しているＰａｌ（配列番号３３）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ９株、２位（配列番号４４の２３位）のセリンがアラニンに置換されているＰａｌ（配列番号３４）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１０株、１４位のアミノ酸から１７位のアミノ酸（配列番号４４の３５位から３８位）が欠損しているＰａｌ（配列番号３５）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１１株、４０位のアミノ酸から４５位のアミノ酸（配列番号４４の６１位から６６位）が欠損しているＰａｌ（配列番号３６）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌をＰａｌ１２株、１６位のアミノ酸から４２位のアミノ酸（配列番号４４の３７位から６３位）が欠損しているＰａｌ（配列番号３７）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１３株、１４位のロイシンがアスパラギンに置換されているＰａｌシグナルペプチド（配列番号３８）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１４株、１９位のアミノ酸から３８位のアミノ酸（配列番号４４の４０位から５９位）が欠損しているＰａｌ（配列番号３９）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１５株、３位のアミノ酸から１２位のアミノ酸（配列番号４４の２４位から３３位）が欠損しているＰａｌ（配列番号４０）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１６株、１２位のアミノ酸から３１位のアミノ酸（配列番号４４の３３位から５２位）が欠損しているＰａｌ（配列番号４１）をコードしている遺伝子をゲノム上に有する大腸菌株をＰａｌ１７株とする。
　本発明では、前記配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すＰａｌをコードする遺伝子（配列番号６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０のいずれか）を含む大腸菌を用いることが好ましい。特に、配列番号５、７又は９に示すのＰａｌをコードする遺伝子（配列番号６又は８）を含む大腸菌を含むことがより好ましい。
　本発明では、前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、特に配列番号５、７又は９に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有していても良い。前記配列同一性は９０%以上がより好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
　本発明では、前記配列番号３３～４１のいずれかに示すＰａｌ又はシグナルペプチドをコードする遺伝子、特に配列番号３７に示すＰａｌ又は配列番号３８に示すシグナルペプチドをコードする遺伝子を含む大腸菌を含むことが好ましい。
　本発明では、前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号３３～３７及び３９～４１のいずれかに示すアミノ酸配列、特に配列番号３７に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有していても良い。前記配列同一性は９０%以上がより好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
　本発明では、Ｐａｌのシグナルペプチドに部分変異を有する大腸菌が使用されてもよく、ここでいう部分変異を有するシグナルペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有していても良い。前記配列同一性は９０%以上がより好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
　本発明においてアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｐプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Ｘとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Ｘと評価対象アミノ酸配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
　本発明では、前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、特に配列番号５、７又は９に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列であっても良い。
　本発明では、前記部分変異を有するＰａｌは、配列番号３３～３７及び３９～４１のいずれかに示すアミノ酸配列、特に配列番号３７に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列であっても良い。
　本発明では、前記部分変異を有するシグナルペプチドは、配列番号３８に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列であっても良い。
　本発明において、「１もしくは複数個」は、例えば１～８０個、好ましくは１～７０個、好ましくは１～６０個、好ましくは１～５０個、好ましくは１～４０個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、好ましくは１～２個、好ましくは１個である。
　使用される大腸菌株はＫ１２株由来のＷ３１１０やＢ株由来のＢＬ２１等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　任意の大腸菌株のゲノムにおいて、部分変異を有したＰａｌ遺伝子を作製する方法は、当業者の公知の方法、例えば、適正なオリゴヌクレオチドをプライマーとしたオーバーラップＰＣＲ法や全合成法が挙げられる。
　作製した部分変異を有するＰａｌ遺伝子を宿主細胞へ組み込む方法は公知の方法を適宜使用することができ、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　システム（Ｄａｔｓｅｎｋｏ　Ｋ．Ａ．，ａｎｄ　Ｗａｎｎｅｒ　Ｂ．　Ｌ．著（２０００年），Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，９７（１２），６６４０－６６４５）や宿主細胞の相同組換え機構によって組み込まれる方法（Ｌｉｎｋ　Ａ．　Ｊ．他著（１９９７年），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１７９，６２２８－６２３７）等が挙げられるが、特に、大腸菌ゲノム以外の外来遺伝子がゲノム上に組み込まれないＬｉｎｋ他において記載された方法が好ましい。
　この際、部分変異を有するＰａｌ遺伝子の組換えベクターを作製する方法は、ライゲーション法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃ社）、ＰＣＲ法、全合成法等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。また、組換えベクターを宿主細胞へ導入するためには、例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の方法で可能だが、特にこれらに限定されるものではない。
　外来タンパク質の生産量・分泌量を増加させるために、Ｐａｌ部分変異株において、ＦｋｐＡ、Ｄｓｂ、ＳｕｒＡなどのペリプラズム性シャペロンの共発現を組み合わせることも可能である。
　［発現ベクター］
　Ｐａｌ部分変異株において、外来タンパク質を生産することが可能である。本明細書において、「外来タンパク質」とは、宿主細胞外部から組み込まれた遺伝子にコードされているタンパク質で、形質転換を行っていない宿主細胞が通常発現しないタンパク質のことを意味する。本発明において、外来タンパク質を培養上清中に分泌させるためには、大腸菌の細胞質からペリプラズム空間へ移行されなければならない。そのために、外来タンパク質をコードしている遺伝子の５’末端側にペリプラズム移行シグナル配列が付加していることが必要である。大腸菌内で機能を発揮するペリプラズム移行シグナルとして、例えば、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＯｍｐＦ、ＳｔＩＩ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　本発明における「発現ベクター」とは、形質転換後の宿主細胞において、発現ベクターに組み込まれた発現カセット中の遺伝子が発現する機能を有する人為的に構築された核酸分子のことを意味する。発現ベクターは発現カセットに加えて、１つ以上の制限酵素認識配列を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃ社のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム等を用いるためのオーバーラップ領域、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子、自己複製配列等を有することができる。発現ベクターは、例えば、プラスミドベクターや人工染色体が挙げられるが、ベクター調製や、大腸菌株の形質転換が容易であることから、プラスミドベクターの方が好ましい。プラスミドとしては、公知の発現ベクターである、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　「発現カセット」とは、プロモーター及び外来タンパク質をコードしている遺伝子より構成され、ターミネーターを含んでも良い。
　使用するプロモーターとしては、当業者において公知のプロモーター、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ａｒａプロモーター、ｔｅｔプロモーター、Ｔ７プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　本発明におけるプラスミドベクターの薬剤耐性マーカー遺伝子は、本発明で提供される大腸菌株では特に限定されるものではない。具体的な例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられ、それぞれカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールを含む培地における耐性により選択することが可能である。
　［外来タンパク質の分泌生産］
　本発明では、上記の発現ベクターが導入されたＰａｌ部分変異株が提供され、その大腸菌株は発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子により得られる薬剤耐性を指標に、選択的に得ることが可能である。
　一般に当業者の中で、大腸菌におけるタンパク質の分泌とは細胞質内で発現したタンパク質がペリプラズム空間に移行されることを示す。本発明における分泌生産とは、上記大腸菌株を培養することで培養上清中に外来タンパク質を生産すること、又は、従来のペリプラズム抽出操作、例えば、浸透圧ショック法等の操作よりも簡便な操作、例えば、培養液に添加剤を加える等といった操作でペリプラズム空間に存在する外来タンパク質を菌体外に移行させることを表し、好ましくは、培養上清中に外来タンパク質を生産することである。
　上記大腸菌株を培養することで培養上清中に外来タンパク質を生産することにおいて、親株又は遺伝子組換え操作がなされていない野生型株において分泌されない外来タンパク質が培養上清中に分泌されている、又は、親株又は野生型株における培養上清中への外来タンパク質分泌量に対して、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、又は５．０倍以上であることを表す。培養上清中への外来タンパク質の分泌量は、当業者に公知の方法、例えば、バンド強度比較、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などにより決定することができる。
　本発明で提供される培養上清はヌクレアーゼ処理等のＤＮＡ除去の操作を必要とせずに精製工程に進むことができ、その培養上清中に分泌された外来タンパク質は遠心分離等の操作で菌体を除いた後、直接的に回収することができる。その回収方法については、公知の精製法、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿等）、溶媒沈殿（アセトン又はエタノール等による蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独又は適当に組み合わせて用いることができる。
　回収された外来タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。
　発現ベクターで形質転換された上記大腸菌株を培養するための培地は、大腸菌が資化する栄養源を含むものであれば何でも使用でき、上記栄養源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、グリセロール等の糖アルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、又はこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができるが、特にグルコースやグリセロールを炭素源として用いることが好ましい。酵母エキスといった天然成分を含むものを用いる培地でも、それらを含まない合成培地でも培養することが可能で、培地の種類は限定されるものではない。また、培養方法も特に限定されず、バッチ培養、フェドバッチ培養、連続培養等が適用される。
　生産される外来タンパク質の例としては、微生物由来の酵素類、動物や植物といった多細胞生物由来のタンパク質等が挙げられる。例えば、フィターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、及び蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定はされるものではない。特に、バイオ医薬品用タンパク質が好ましい。
　バイオ医薬品用タンパク質として、例えば、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなどの部分抗体、サイトカイン、成長因子、プロテインキナーゼ、タンパク質ホルモン、Ｆｃ融合タンパク質、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タンパク質等が挙げられる。
　上記外来タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変がなされているものでもよいし、ｄｅ－ｎｏｖｏで設計されたものでもよい。
　大腸菌の培養は通常一般の条件により行うことができ、例えば、ｐＨは６～８、好ましくは６．５～７．５、より好ましくは６．９～７．１、温度は１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃、より好ましくは２５～３０℃、溶存酸素濃度は１０～８０％、好ましくは２０～６０％、より好ましくは３０～４０％で、培養時間は２０～１５０時間培養することにより行うことができる。また、必要に応じて、栄養素又は誘導物質をショットや流加により培地に供給することができる。
　誘導物質は、使用するプロモーターにより適宜選択され、例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターの直接的誘導や、ｌａｃプロモーターでＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現させることでのＴ７プロモーターの間接的誘導では、ラクトースやイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などが用いられる。ＩＰＴＧを誘導物質として用いる場合、終濃度が０．１～２．０ｍＭ、より好ましくは０．２～１．０ｍＭとなるように添加することでタンパク質発現誘導を行うことができる。
　また、外来タンパク質発現誘導を行うタイミングは、外来タンパク質が発現して培養上清中に分泌されるなら、特に限定されないが、好ましくは対数増殖期初期、対数増殖期中期又は対数増殖期後期であり、特に好ましくは対数増殖期後期である。
　本発明の方法において、使用する大腸菌は、野生型株に同様に外来遺伝子を導入した大腸菌と比較して、同等以上の生育能を有することが好ましい。ここでいう「同等以上の生育能」とは、生育曲線がプラトーに達した時の培養液中の生菌濃度が、比較対象に対して８０％以上となることであり、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。
　培養上清の粘性評価については、菌体を分離した培養上清をシリンジフィルター又は遠心ろ過デバイスなどを用いて、通液量を測定することで評価できる。また、非特許文献２に記載されているように、レオメーターや粘度計を用いてもよいし、宿主由来のＤＮＡ漏出が培養上清中の粘性上昇に寄与していることから、ＤＮＡ　Ｄｙｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｓｉｄｕａｌ　Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　ＤＮＡ（シグナス社）といったＤＮＡ定量キットで比較・評価するのも良いが、これらにより限定されるものではない。
　本発明の方法において、得られる大腸菌培養上清の粘度は、十分に低いことが好ましい。例えば、同様に外来遺伝子を導入したＬｐｐ全欠損株の培養上清と比較して、有意に低いことが好ましい。具体的には、０．４５μｍ孔又は０．２２μｍ孔の親水性シリンジフィルター（ＰＴＦＥ、セルロースアセテート等）でろ過可能な液量がＬｐｐ全欠損株の培養上清と比較して２倍以上であることが好ましい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
　本発明では、親株として大腸菌株はＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた。
　本発明で用いられる遺伝子組換え技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素処理、改変ＤＮＡのクローニング、形質転換などは、当業者に公知である、また、製造元の添付マニュアルに記載されている方法で実施した。
　以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＨＳ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）等を用いた。ＰＣＲ産物や制限酵素反応液の精製では、ＱＩＡｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）等を用いた。ＰＣＲ以外でのＤＮＡ断片の調製は遺伝子合成を用いた。
　形質転換に用いるプラスミドベクターは、構築したベクターを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの抽出はＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社）を用いて行った。
　使用したクローニングベクターは、ｐＴＨ１８ｃｓ（国立遺伝学研究所：ＮＩＧ）を改変したクローニングベクターであり、テトラサイクリン耐性遺伝子を有している。
　また、使用した発現ベクターは、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩの認識配列を含むマルチクローニングサイト、Ｔ７発現系、カナマイシン耐性遺伝子、自己複製開始配列、ｌａｃリプレッサー遺伝子を有することを特徴とする。
　Ｐａｌ部分欠損株の培養上清中への外来タンパク質分泌量の比較対象として、親株であるＢＬ２１（ＤＥ３）株、培養上清の粘性の比較対象として、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　システムを用いて作製したＬｐｐ全欠損株（以下、「ΔＬｐｐ」と呼称する）を用いた。ΔＬｐｐは外来タンパク質を分泌生産するものの、課題として、その外来タンパク質を含む培養上清の粘性が高く、フィルターろ過性が低いため、後処理工程に大きな負荷がかかるといったことが挙げられる。
　（実施例１）Ｐａｌ１株の作製
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のＰａｌ部分欠損株をＬｉｎｋ　Ａ．　Ｊ．他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９７年　１７９，６２２８－６２３７）の方法を参考に実施した。Ｐａｌ（配列番号１）の３位のアミノ酸から１７位のアミノ酸が欠損したＰａｌ１をコードするＰａｌ１遺伝子を含み、シグナル配列を含むｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ５００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２１）を作製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノム（塩基配列：Ａｃｓｓｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＣＰ００１５０９（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　３９４，６４４－５２（２００９）））を鋳型として、プライマー１（配列番号２２）及びプライマー２（配列番号２３）、プライマー３（配列番号２４）及びプライマー４（配列番号２５）を用いたＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を混合した後、プライマー１及びプライマー４を用いたＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は５’末端側にＥｃｏＲＩ、３’末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。
　上記で作製したＤＮＡ断片及びクローニングベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩによって切断した。各切断されたＤＮＡ断片を用いてライゲーションを行った。このように作製したプラスミド（ｐＰａｌ１）をＤＨ５α株に塩化カルシウム法で形質転換し、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ１保持株を選択した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株に得られたｐＰａｌ１を塩化カルシウム法によって形質転換を行い、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ１保持株を選択した。以下、Ｐａｌ１株を得るまでの遺伝子組換え操作はＬｉｎｋ　Ａ．Ｊ．他の方法をもとに実施した。
　上記のように作製した株をＰａｌ１株とした。
　（実施例２）Ｐａｌ２株の作製
　実施例１と同様の方法で実施した。Ｐａｌの１９位のアミノ酸から４３位のアミノ酸が欠損したＰａｌ２をコードするＰａｌ２遺伝子を含み、シグナル配列を含むｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ２００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片（配列番号２６）を作製するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムを鋳型として、プライマー５（配列番号２７）及びプライマー６（配列番号２８）、プライマー７（配列番号２９）及びプライマー８（配列番号３０）を用いたＰＣＲを行い、各ＰＣＲ産物を混合した後、プライマー１及びプライマー４を用いたＰＣＲを行い、目的ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片は、５’末端側にＥｃｏＲＩ、３’末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。
　上記で作製したＤＮＡ断片及びクローニングベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩによって切断した。各切断されたＤＮＡ断片を用いてライゲーションを行った。このように作製したプラスミド（ｐＰａｌ２）をＤＨ５α株に塩化カルシウム法で形質転換し、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ２保持株を選択した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株に得られたｐＰａｌ２を塩化カルシウム法によって形質転換を行い、テトラサイクリンを含む培地を用いてｐＰａｌ２保持株を選択した。以下、Ｐａｌ２株を得るまでの遺伝子組換え操作はＬｉｎｋ　Ａ．Ｊ．他の方法をもとに実施した。
　上記のように作製した株をＰａｌ２株とした。
　（実施例３）Ｐａｌ部分欠損株を用いた合成培地でのナノボディー（ＶＨＨ）生産
　シグナルペプチドＰｅｌＢ（配列番号３１）を有し、かつＣ末側にＨｉｓタグを有するａｎｔｉ－Ｆｃ　ＶＨＨをコードしたＤＮＡ断片（配列番号３２）を遺伝子合成によって作製した。このＤＮＡ断片と発現ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し、それぞれ制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションを行った。得られたＶＨＨ発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｐａｌ１株及びＰａｌ２株にエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。発現ベクター保持株はカナマイシン含有培地（５０ｍｇ／Ｌ）によって選択された。
　合成培地での培養は、ＵＳＲＥ４４５１２Ｅ１を参考に実施した。
　２．５Ｌの合成培地（５．２ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社、特級）、４．３６ｇ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、４．０２５ｇ／Ｌ　ＫＣｌ（和光純薬工業社、特級）、１．０４ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、４．６８ｇ／Ｌ　クエン酸・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、１１２ｇ／Ｌ　グリセロール（キシダ化学社、特級）、２５ｍＬ微量元素溶液（１００．４ｇ／Ｌ　クエン酸・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、５．２２ｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、２．０６ｇ／Ｌ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、２．０６ｇ／Ｌ　ＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．８１ｇ／Ｌ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．４２ｇ／Ｌ　ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、１０．０６ｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．０３ｇ／Ｌ　Ｈ３ＢＯ３（和光純薬工業社、特級）、０．０２ｇ／Ｌ　ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級））に初期ＯＤ６００値が０．１になるように前培養液を加えた。対数増殖期にＮａＨ２ＰＯ４とＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを加えた。発現誘導は、対数増殖期後期にイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（カルボンシス社）を終濃度が０．２ｍＭになるように添加することで実施した。それと同時に、８０％（ｗ／ｗ）グリセロール溶液を一定速度で流加した。培養開始時は３０℃の温度に設定し、発現誘導後は２５℃の温度で培養した。また、培養中において、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ又は１０％Ｈ２ＳＯ４を適宜添加することにより７．０の値に維持し、溶存酸素濃度は攪拌数と通気量のカスケード制御により３０％に維持した。
　培養開始から７０時間後に、培養液を回収し、菌体と培養上清を遠心分離により分離した。２μＬの培養上清と２μＬの２×サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－Ｒａｄ社）、０．２Ｍ　ＤＴＴ）を混合し、９５℃で５分間処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ’　ＴＭ　Ｄｕａｌ　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）と共に、ｅ－ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ－Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを３０分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により４５分染色したのち、水で脱色した。一方、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）株においても、実施例３で使用した発現ベクターを使用して同様の条件による培養を実施し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びＣＢＢ染色を実施した。その結果、いずれもＶＨＨのアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドが認められた（図１）。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥからＶＨＨのバンド強度を撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ及び画像解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した結果、親株と比較して、Ｐａｌ１株では６．７倍、Ｐａｌ２株では６．９倍の強度で、ＶＨＨのバンドが検出できた（表１）。表１中では、親株の培養上清中のＶＨＨバンド強度を１とし、Ｐａｌ１株、Ｐａｌ２株での培養上清中のＶＨＨバンド強度を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　よって、Ｐａｌ遺伝子に部分欠損を有する大腸菌では、外来タンパク質の培養上清中への分泌生産性が向上していることが確認された。
　（実施例４）Ｐａｌ部分欠損株を用いた半合成培地でのＶＨＨ生産
　使用した発現ベクター及び菌株は実施例３で使用したものと同様である。
　２．５Ｌの半合成培地（１．０ｇ／Ｌ　ＮＨ４Ｃｌ（和光純薬工業社、特級）、９．０ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、３．０ｇ／Ｌ　Ｎａ３ＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、２０ｇ／Ｌ　グルコース（和光純薬工業社、特級）、２０ｇ／Ｌ　酵母エキス（オリエンタル酵母社、赤ラベル）、１．０ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．００６ｇ／Ｌ　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級）、０．０５ｇ／Ｌ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社、特級））に初期ＯＤ６００値が０．３となるように前培養液を加えた。発現誘導は、培養開始２４時間後にＩＰＴＧを終濃度が０．８ｍＭになるように添加することで実施した。培養開始時は３０℃の温度に設定し、発現誘導後は２５℃の温度で培養した。また、培養中において、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ又は１０％Ｈ２ＰＯ４を適宜添加することにより７．０の値に維持し、溶存酸素濃度はフィード液（１４４ｇ／Ｌ　グルコース、４２３ｇ／Ｌ　酵母エキス、１３ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の流加速度により４０％に維持した。
　培養開始から７２時間後に、培養液を回収し、菌体と培養上清を遠心分離により分離した。実施例３と同様の方法でＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びＣＢＢ染色を実施した。一方、親株ＢＬ２１（ＤＥ３）株においても、実施例３で使用した発現ベクターを使用して同様の条件による培養を実施し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びＣＢＢ染色を実施した。その結果、いずれもＶＨＨのアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドが認められた（図２）。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥからＶＨＨのバンド強度を撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ及び画像解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した結果、元株と比較して、Ｐａｌ１株及びＰａｌ２株ともに２．１倍の強度で、ＶＨＨのバンドが検出できた（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　よって、Ｐａｌ遺伝子に部分欠損を有する大腸菌では、半合成培地で培養した場合においても、外来タンパク質の培養上清中への分泌生産性が向上していることが確認された。
　（実施例５）培養上清のフィルターろ過性の評価
　実施例３及び実施例４で得られたＰａｌ１株及びＰａｌ２株の培養上清を再度遠心分離し、上清１０ｍＬを０．２μｍのシリンジフィルター（ＤＩＳＭＩＣ（登録商標）－２５ＡＳ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）で処理し、１平方ｃｍあたりの通液量をもとにフィルターろ過性を評価した。一方、ΔＬｐｐ株おいても、実施例３で使用した発現ベクターを使用しての同様の条件で培養し、同様の条件で培養上清の粘性評価を実施した。ここでΔＬｐｐ株は、ＢＬ２１（ＤＥ３）株を親株として、特開２００８－７３０４６号を参考に、Ｒｅｄ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍにより作製した。合成培地で培養では、ΔＬｐｐ株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は０．７０ｇであったのに対して、Ｐａｌ１株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は２．５４ｇ以上、Ｐａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は２．５５ｇ以上となった。この時、Ｐａｌ１株及びＰａｌ２株の培養上清は１０ｍＬ全てがフィルターを通過した。
　半合成培地での培養では、ΔＬｐｐ株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は０．０７ｇであったのに対して、Ｐａｌ１株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は１．８２ｇ、Ｐａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量は１．８７ｇとなった（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　これらのことから、どちらの培地においてもΔＬｐｐの培養上清と比較して、Ｐａｌ１株及びＰａｌ２株の培養上清の１平方ｃｍあたりの通液量が多く、フィルターろ過性が高いことから、培養上清の粘性が抑えられていることが確認できた。
（実施例６）Ｐａｌ１株、Ｐａｌ２株、Ｐａｌ４株及びＰａｌ８株における半合成培地での生育挙動
　実施例１、２と同様の方法を用いて、ＰａｌのＣ末端側に変異を有するＰａｌ４株及びＰａｌ８株を作製した。Ｐａｌ４株及びＰａｌ８株に実施例３で使用したＶＨＨ発現ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。ＶＨＨ発現ベクター保持株はカナマイシン含有培地（５０ｍｇ／Ｌ）によって選択された。
　実施例３と同様にＶＨＨ発現ベクターを導入したＢＬ２１（ＤＥ１３）、Ｐａｌ１株、Ｐａｌ２株、Ｐａｌ４株及びＰａｌ８株について、実施例４で使用したものと同じ半合成培地２．５Ｌ又は１．０Lに初期ＯＤ６００値が０．０３となるように前培養液をそれぞれ加えた。発現誘導は、培養開始２４時間後にＩＰＴＧを終濃度が０．８ｍＭになるように添加することで実施した。培養開始時は３０℃の温度に設定し、発現誘導後は２５℃の温度で培養した。また、培養中において、ｐＨは１０％ＮＨ４ＯＨ又は１０％Ｈ２ＰＯ４を適宜添加することにより７．０の値に維持し、溶存酸素濃度はフィード液（１４４ｇ／Ｌ　グルコース、４２３ｇ／Ｌ　酵母エキス、１３ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）の流加速度により４０％に維持した。培養液中の菌量はＯＤ６００値で定量化した。
　各株の生育曲線を図３に示す。ＢＬ２１（ＤＥ３）と比較すると、Ｐａｌ４株及びＰａｌ８株の生育挙動が悪化していることが確認された。一方で、Ｐａｌ１株及びＰａｌ２株では、ＢＬ２１（ＤＥ３）とほぼ同等の生育挙動であることが示されている。これは、ＰａｌのＣ末端側領域に変異を有する変異株では培養安定性が低下し、ＰａｌのＮ末端側領域に変異を有する変異株では培養安定性が維持されていることを示している。
（実施例７）Ｎ末端側領域に変異を有するＰａｌ変異株の作製
　以下に示す手法で、各種Ｐａｌ変異株（Ｐａｌ９～Ｐａｌ１７）を作製した。Ｐａｌ９～１３株及びＰａｌ１５～１７株の作製には、表４に示す部位に欠損領域又は点変異を有するＰａｌをコードする塩基配列をそれぞれ含み、シグナル配列を含むｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ約３００ｂｐにゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有する各種ＤＮＡ断片を使用した。Ｐａｌ１４株の作製には、Ｐａｌをコードする塩基配列を含み、表４に示す点変異を有するシグナルペプチドをコードする塩基配列を上流に含む、ｐａｌ遺伝子外の上流・下流それぞれ３００ｂｐのゲノム上での相同組換えに必要なホモロジーアームを有するＤＮＡ断片を用いた。各ＤＮＡ断片は、オーバーラップＰＣＲを用いて調製した。このＤＮＡ断片は５’末端側にＥｃｏＲＩ、３’末端側にＳａｌＩの制限酵素認識配列を有する。以下、実施例１、２と同様の方法で各種Ｐａｌ変異株（Ｐａｌ９～Ｐａｌ１７）を作製した。なお、表４に示す変異様式は、シグナルペプチドを含むＰａｌのアミノ酸配列（配列番号４４）における変異部位を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例８）Ｐａｌ変異株を用いたナノボディー（ＶＨＨ）生産
　実施例７で作製した各種Ｐａｌ変異株に実施例３と同様にＶＨＨ発現ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。ＶＨＨ発現ベクター保持株はカナマイシン含有培地（５０ｍｇ／Ｌ）によって選択された。
　５０ｍＬのＴＢ培地（１２ｇ／ｌポリペプトン（日本製薬社）、２４ｇ／Ｌ　酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、１０ｇ／Ｌ　グリセロール（ナカライテスク社、バイオテクノロジーグレード）、９．４ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４（ナカライテスク社、特級）、２．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４（ナカライテスク社、バイオテクノロジーグレード））に初期ＯＤ６００値が０．０１となるように前培養液を加えた。発現誘導は培養開始７時間後にイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（カルボンシス社）を終濃度が１．０ｍＭになるように添加することで実施した。培養は３０℃、１１０ｒｐｍで実施した。
　培養開始から２４時間後に、培養液を回収し、菌体と培養上清を遠心分離により分離した。２μＬの培養上清と２μＬの２×サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－Ｒａｄ社）、０．２Ｍ　ＤＴＴ）を混合し、９５℃で５分間処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ’　ＴＭ　Ｄｕａｌ　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）と共に、ｅ－ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ－Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを３０分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により４５分染色したのち、水で脱色した。その結果、いずれもＶＨＨのアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドが認められた。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥからＶＨＨのバンド強度を撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ及び画像解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養上清中のＶＨＨバンド強度を１とすると、Ｐａｌ１株では２．１倍、Ｐａｌ２株では３．９倍、Ｐａｌ９株では１．３倍、Ｐａｌ１０では１．２倍、Ｐａｌ１１株では１．６倍、Ｐａｌ１２株では１．３倍、Ｐａｌ１３株では３．４倍、Ｐａｌ１４株では３．１倍、Ｐａｌ１５株では２．０倍、Ｐａｌ１６株では１．５倍、Ｐａｌ１７株では１．６倍の強度で、ＶＨＨのバンドが検出できた（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　これは、シグナルペプチドを含むＮ末端側領域に変異を有する大腸菌において、外来タンパク質の培養上清中への分泌生産性が向上していることを示している。
（実施例９）Ｐａｌ変異株を用いたβ－マンノシダーゼ生産
　シグナルペプチドＯｍｐＡ（配列番号４２）を有し、β－マンノシダーゼをコードしたＤＮＡ断片（配列番号４３）を遺伝子合成によって作製した。このＤＮＡ断片と発現用ベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し、それぞれ制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションを行った。得られたβ－マンノシダーゼ発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）、実施例１及び２で作製したＰａｌ１株及びＰａｌ２株にエレクトロポレーション法により導入し、形質転換した。β－マンノシダーゼ発現ベクター保持株はカナマイシン含有培地（５０ｍｇ／Ｌ）によって選択された。
　５０ｍＬのＴＢ培地（１２ｇ／Ｌポリペプトン（日本製薬社）、２４ｇ／Ｌ　酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ, Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１０ｇ／Ｌ　グリセロール（ナカライテスク社、バイオテクノロジーグレード）、９．４ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４（ナカライテスク社、特級）、２．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４（ナカライテスク社、バイオテクノロジーグレード））に初期ＯＤ６００値が０．１となるように前培養液を加えた。発現誘導は培養開始７時間後にＩＰＴＧを終濃度が１．０ｍＭになるように添加することで実施した。培養は３０℃、１１０ｒｐｍで実施した。
　培養開始から２４時間後に、培養液を回収し、菌体と培養上清を遠心分離により分離した。２μＬの培養上清と２μＬの２×サンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－Ｒａｄ社）、０．２Ｍ　ＤＴＴ）を混合し、９５℃で５分間処理をした。本サンプルを分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ’　ＴＭ　Ｄｕａｌ　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）と共に、ｅ－ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ－Ｒ１５Ｌ、ＡＴＴＯ社）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した。泳動後、ゲルを３０分間水洗し、染色液（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により４５分染色したのち、水で脱色した。その結果、いずれもＶＨＨのアミノ酸配列から推定される分子量に相当する領域にバンドが認められた。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥからβ－マンノシダーゼのバンド強度を撮影装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ及び画像解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて測定した結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養上清中のβ－マンノシダーゼのバンド強度を１とすると、Ｐａｌ１株では１．４倍、Ｐａｌ２株では３．０倍の強度で、β－マンノシダーゼのバンドが検出できた（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　外来タンパク質の製造方法であって、部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子、及び外来タンパク質をコードする遺伝子を含む大腸菌を培養する工程を含む、当該外来タンパク質の製造方法。
  2. 　前記大腸菌の培養上清から、分泌された外来タンパク質を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量が、Ｐａｌに部分変異を有しない大腸菌による外来タンパク質の培養上清中への分泌量よりも多い請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列、及び／又は、シグナルペプチドのアミノ酸配列に部分変異を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から６２位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から４５位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有する、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記部分変異を有するＰａｌがシグナルペプチドのアミノ酸配列に部分変異を有し、部分変異を有するシグナルペプチドが、配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号１の３位から１７位、１９位から１２１位、及び１２３位から１５２位のアミノ酸配列の中から選ばれる１つ以上のアミノ酸配列、及び／又は配列番号３に示すアミノ酸配列に部分変異を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記部分変異が、１つ以上のアミノ酸の欠損、置換又は挿入である請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号３３～３７及び３９～４１のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号３３～３７及び３９～４１のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３３～４１のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記部分変異を有するＰａｌがシグナルペプチドのアミノ酸配列に部分変異を有し、部分変異を有するシグナルペプチドが、配列番号３８に示すアミノ酸配列、配列番号３８に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号３８に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む、請求項１～４及び７のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記部分変異を有するＰａｌが、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７及び１９のいずれかに示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列を含む、請求項１～４及び８のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　部分変異を有するペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子を含み、
    　前記部分変異を有するＰａｌが、下記（ａ）及び（ｂ）から選択される少なくとも１つである、大腸菌：
    　（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列の１位から６２位の中から選択される一つ以上のアミノ酸の変異を有するＰａｌ；及び
    　（ｂ）シグナルペプチドのアミノ酸配列に変異を有するＰａｌ。
  14. 　目的の外来タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の大腸菌。
  15. 　目的の外来タンパク質を発現し、部分変異を有しない大腸菌と比較して、前記目的の外来タンパク質を多量に菌体外に分泌する、請求項１４に記載の大腸菌。
  16. 　外来タンパク質を製造するための宿主大腸菌の作製方法であって、下記の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む、方法：
    　（ｉ）大腸菌のペプチドグリカン結合リポタンパク質（Ｐａｌ）をコードする遺伝子に部分変異を加える工程；及び
    　（ｉｉ）（ｉ）で得られた遺伝子が改変された大腸菌に、目的の外来タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程。
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CASCALES, E. ET AL.: "Deletion analyses of the peptidoglycan- associated lipoprotein Pal reveals three independent binding sequences including a TolA bo x", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 51, no. 3, 2004, pages 873 - 885, XP055562131, DOI: 10.1046/j.1365-2958.2003.03881.x *

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