JP2022509215A - バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞におけるタンパク質産生増強のための新規なプロモーター配列及びその方法 - Google Patents

バチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞におけるタンパク質産生増強のための新規なプロモーター配列及びその方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022509215000001
本開示は一般に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（宿主）細胞におけるタンパク質産生増強のための新規なプロモーター配列及びその方法に関する。本明細書に記載するように、本開示の新規なプロモーター配列は、目的のタンパク質をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレームに作動可能に連結された場合、工業的に関連するタンパク質の大規模生産での使用に特に適している。
【選択図】図１

Description

本開示は、一般に、細菌学、微生物学、分子生物学、遺伝学、酵素学、工業用タンパク質産生などの分野に関する。より詳しくは、本開示の特定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（宿主）細胞においてタンパク質産生増強表現型を得るための新規プロモーター配列及びその方法に関する。本明細書に記載するように、本開示の新規なプロモーター配列は、目的のタンパク質をコードする遺伝子（又はオープンリーディングフレーム）に作動可能に連結された場合、工業用関連タンパク質の大規模生産での使用に特に適している。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７７２，３６３号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
「ＮＢ４１３１８－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１９年１１月２１日に作成され、サイズは１７６ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのグラム陽性菌は、その優れた発酵特性と高い収率（例えば、培養物１リットル当たり最大２５グラム；Ｖａｎ Ｄｉｊｌ ａｎｄ Ｈｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業用関連タンパク質を産生するための微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、食品、繊維、洗濯、医療／歯科用機器（洗浄）、膜（洗浄）薬品工業などに必要なα－アミラーゼ（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）及びプロテアーゼ（Ｂｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の生産でよく知られている（Ｗｅｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生物（例えば、内毒素としても知られるリポ多糖類（ＬＰＳ））を全く含まないタンパク質を産生するので、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の「安全性適格推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、それらの産生物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「安全食品認定（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）の評価を獲得した（Ｏｌｅｍｐｓｋａ－Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
したがって、微生物宿主細胞内でのタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体、ペプチドなど）の産生は、バイオテクノロジー分野において特に関心が高い。同様に、１種以上の目的のタンパク質を産生及び／又は分泌させるための宿主細胞の最適化は、特に工業バイオテクノロジーの状況においては非常に重要であり、タンパク質が工業的に大量生産される場合、タンパク質収量の僅かな改善が極めて重要な意味を有する。より詳細には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、工業的重要性の高いバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞の例であり、したがって、タンパク質発現／産生の増強／増量のためにそのような宿主細胞の遺伝子を改変し操作し得ることは、新規且つ改善されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の産生株構築のために非常に望ましい。
例えば、遺伝子（又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））によってコードされる目的のタンパク質（例えば、酵素）の組み換え産生は一般に、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列）が、プロモーター（核酸）配列の下流（３’）に置かれ、且つプロモーター（核酸）配列に作動可能に連結された発現カセット（すなわち、所与の宿主細胞での使用に好適なコンストラクト／ベクター／カセット）を構築することによって達成される。したがって、プロモーター配列は、プロモーター配列の下流（３’）にある遺伝子（又は、ＯＲＦ）の上流（５’）に配置され、且つ作動可能に連結される（すなわち、作動可能な組み合わせで）。
同様に、発現カセットは種々の技術（例えば、形質転換）によって宿主細胞に導入され、所望の目的のタンパク質（ＰＯＩ）の発現／産生が、ＰＯＩの発現／産生に必要な好適条件下で（形質転換された）宿主細胞を培養することによって達成され得る。例えば、国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレットは、一般に、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のリボソームプロモーターを含む、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生するためのプロモーター、発現ベクター、微生物、及び方法を開示している。
宿主細胞における遺伝子の発現に使用するための多数のプロモーターが一般的に知られているが、新規なプロモーター（核酸）配列が当該技術分野において依然として要求されており、そして未だその要求は達成されていない。より詳細には、このような継続し、且つ未達成の要求には、以下に限定されるものではないが、新規なプロモーター（核酸）配列の特定、そのプロモーター機能性の増強、そのプロモーター活性の増加、タンパク質産生増強表現型などが含まれる。以下に提示し、記載し、そして例示するように、本開示は、新規なプロモーター配列を得、タンパク質産生増強表現型などを含むそのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞（例えば、タンパク質産生（宿主）細胞、細胞工場）を構築する、そのような強く要望され、且つ達成されていない要求に関する。
本開示は一般に、タンパク質産生増大表現型などを有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を作製し、且つ構築するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、新規プロモーター（核酸）配列、このような新規プロモーターを含む発現カセット、及びタンパク質生産性増強表現型を含むその改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞に関する。
したがって、本開示の特定の実施形態は、関連するプロモーター核酸配列である。特定の実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号３９に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号３９のヌクレオチド位３０のチミン（Ｔ）、配列番号３９のヌクレオチド位８９のチミン（Ｔ）、配列番号３９のヌクレオチド位９０のグアニン（Ｇ）、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のチミン（Ｔ）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。他の実施形態では、本開示のプロモーター核酸配列は、配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも２つの変異を含む。他の実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも３つの変異を含む。特定の他の実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも４つの変異を含む。他の実施形態では、プロモーター核酸配列は、配列番号４０を含む。他の実施形態では、本開示のプロモーター核酸配列は、プロモーターの下流（３’）に位置し、且つプロモーターに作動可能に連結された、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。特定の実施形態では、目的のタンパク質（ＰＯＩ）は酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。さらに他の実施形態では、プロモーター配列は、その上流（５’）にあり、それに作動可能に連結された、１つ以上のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、プロモーター配列は、（３’）下流の天然ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列、又はその改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、天然のａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８５を含む。
したがって、本開示の特定の他の実施形態は、配列番号４０、配列番号５８又は配列番号５９を含むプロモーター核酸配列に関する。特定の実施形態では、配列番号４０、配列番号５８又は配列番号５９を含むプロモーター核酸配列はさらに、プロモーターの下流（３’）に位置し、且つプロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はＯＲＦを含む。特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。別の実施形態では、配列番号４０、配列番号５８又は配列番号５９を含むプロモーター核酸配列は、その上流（５’）にあり、且つそれに作動可能に連結された１つ以上のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、配列番号４０、配列番号５８又は配列番号５９を含むプロモーター核酸配列は、（３’）下流の天然ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列、又はその改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結されている。別の実施形態では、天然のａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８５を含む。
本開示の特定の他の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６０とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を対象としており、このハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、配列番号３９の等価なヌクレオチド位３０、８９、９０又は９１に対して、３０、８９、９０又は９１から選択されるヌクレオチド位に少なくとも１つの変異を含む。特定の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、配列番号４０を含む。別の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、配列番号５８を含む。他の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、配列番号５９を含む。特定の他の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６０とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、プロモーターの下流（３’）に位置し、且つプロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はＯＲＦをさらに含む。特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、その上流（５’）にあり、それに作動可能に連結された１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。特定の他の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６０とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、（３’）下流の天然ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列、又はその改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、天然のａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８５を含む。
したがって、特定の他の実施形態は、本明細書に開示される新規なプロモーター配列を含む遺伝子組み換えバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。特定の他の実施形態は、本明細書に開示される新規なポリヌクレオチド配列を含む遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。他の実施形態は、本開示の新規プロモーターを含む発現カセット、又は本開示の新規ポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。さらに他の実施形態は、本開示の発現カセットを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。
したがって、特定の他の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６０とハイブリダイズするプロモーター核酸配列を含む変異体Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に関し、その変異体プロモーター配列は、配列番号３９の等価なヌクレオチド位３０、８９、９０又は９１に対して、３０、８９、９０又は９１から選択されるヌクレオチド位に少なくとも１つの変異を含む。
他の実施形態では、本開示は、（３’）下流５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結された（５’）上流プロモーター配列を含むプロモーター領域核酸配列に関し、そのプロモーター配列は、配列番号８２に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８２のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８２のヌクレオチド７４にチミン（Ｔ）を含む。特定の実施形態では、プロモーター領域核酸配列は、天然の５’－ＵＴＲ配列又は改変５’－ＵＴＲ配列を含む。特定の実施形態では、５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８４の天然のａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列、又はそのバリアントａｍｙＬ５’－ＵＴＲ配列である。別の実施形態では、プロモーター領域核酸配列が配列番号８５の天然ａｐｒＥ５’－ＵＴＲ配列、又はそのバリアントａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列を含む。
したがって、他の実施形態は、配列番号６５を含むプロモーター領域核酸配列を対象としている。別の実施形態は、配列番号６７を含むプロモーター領域核酸配列を対象としている。別の実施形態では、配列番号６５を含むプロモーター領域核酸配列は、プロモーター領域の下流（３’）に位置し、且つプロモーター領域に作動可能に連結された、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含む。特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。別の実施形態では、酵素はヒドロラーゼである。他の実施形態では、プロモーター領域配列は、その上流（５’）にあり、それに作動可能に連結された、１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。
特定の他の実施形態では、本開示は、配列番号８２のヌクレオチド配列を含む天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーターに由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーターに関し、その改変プロモーターは、配列番号８２に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８２のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８２のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含む。別の実施形態では、改変ａｍｙＬプロモーターは、プロモーターの下流（３’）に位置し、且つプロモーターに作動可能に連結された、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。別の実施形態では、プロモーターは、その上流（５’）にあり、それに作動可能に連結された、１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。
したがって、特定の他の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６５のポリヌクレオチド配列又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。したがって、他の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６７又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。別の実施形態は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号８３又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列に関する。
他の実施形態は、本開示の新規プロモーター領域を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。
特定の実施形態は、配列番号８３の改変プロモーターを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。
したがって、特定の他の実施形態は、本開示の新規プロモーター領域を含む発現カセットに関する。特定の実施形態では、発現カセットは、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーターを含む。
したがって、本開示の特定の他の実施形態は、（ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、カセットは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）上流（５’）に位置し、それに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、そのプロモーターは、配列番号３９に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０におけるＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも１つの改変を含む工程と、（ｂ）導入された発現コンストラクトを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の改変細胞をＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、工程（ｃ）の改変細胞は、同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦの上流（５’）に位置し、且つそれに作動可能に連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチド発現カセットを含み、そのプロモーターは配列番号３９を含む、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、ＰＯＩをより多く産生する、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強のための方法を対象としている。特定の実施形態では、プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも２つの変異を含む。他の実施形態では、プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも３つの変異を含む。別の実施形態では、プロモーターは、配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも４つの変異を含む。本方法の他の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。本方法の別の実施形態では、酵素はヒドロラーゼである。本方法の別の実施形態では、プロモーターは、その上流（５’）にあり、それに作動可能に連結された、１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。特定の実施形態では、プロモーター配列は、（３’）下流の天然ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列、又はその改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結されている。本方法の他の実施形態では、天然ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８５を含む。
本開示の特定の他の実施形態は、（ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、カセットは、配列番号６５に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を有する上流プロモーター領域を含み、その上流プロモーター領域は目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と作動可能に連結されている工程と、（ｂ）導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の改変細胞をＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、工程（ｃ）の改変細胞は、配列番号６５に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にアデニン（Ａ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にチミン（Ｔ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にグアニン（Ｇ）を有する上流プロモーター領域を含み、その上流プロモーター領域は同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、ＰＯＩをより多く産生する、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強のための方法に関する。本方法の特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。
別の実施形態は、本開示は、（ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、カセットは、配列番号６７に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を有する上流プロモーター領域を含み、その上流プロモーター領域は目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と作動可能に連結されている工程と、（ｂ）導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の改変細胞をＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、工程（ｃ）の改変細胞は、配列番号６７に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にアデニン（Ａ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にチミン（Ｔ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にグアニン（Ｇ）を有する上流プロモーター領域を含み、その上流プロモーター領域は同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、ＰＯＩをより多く産生する、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強のための方法に関する。本方法の特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。
別の実施形態では、本開示は、（ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、カセットは、配列番号８３に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８３のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８３のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８３のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を有する上流プロモーターを含み、その上流プロモーターは目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と作動可能に連結されている工程と、（ｂ）導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の改変細胞をＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、工程（ｃ）の改変細胞は、配列番号８３に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８３のヌクレオチド位７２にアデニン（Ａ）、配列番号８３のヌクレオチド位７３にチミン（Ｔ）、及び配列番号８３のヌクレオチド位７４にグアニン（Ｇ）を有する上流プロモーターを含み、その上流プロモーターは同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、ＰＯＩをより多く産生する、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強のための方法に関する。本方法の特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素である。他の実施形態では、酵素は、ヒドロラーゼである。
図１は、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）、新規（合成）ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）、新規（合成）ｒｒｎＩｐ２－２プロモーター（配列番号５８）及び新規（合成）ｒｒｎＩｐ２－３プロモーター（配列番号５９）の核酸配列アラインメントを示す。図１に示すように、－３５及び－１０プロモーター配列領域は下線を引いたヌクレオチドで示し、推定転写開始部位（ＴＳＳ）は太い下線を引いたヌクレオチドで示し、二重下線を引いた「Ｇ」ヌクレオチドはＴＳＳの可視化を補助する。
図２は、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）及びその相補配列（配列番号６０；図２Ａ）、合成ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）及びその相補配列（配列番号６１；図２Ｂ）、合成ｒｒｎＩｐ２－２プロモーター（配列番号５８）及びその相補配列（配列番号６２；図２Ｃ）、並びにｒｒｎＩｐ２－３プロモーター（配列番号５９）及びその相補配列（配列番号６３；図２Ｄ）を示す。
図３は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域（ＰａｍｙＬ－１；配列番号６４）及び新規（合成）ａｍｙＬプロモーター領域（ＰａｍｙＬ－２；配列番号６５）の核酸配列アラインメントを示す。図３に示すように、－３５及び－１０プロモーター配列領域は下線を引いたヌクレオチドで示し、５’－ＵＴＲ配列はイタリック体のヌクレオチドで示し、推定転写開始部位（ＴＳＳ）は太字ヌクレオチド、及びＰａｍｙＬ－２に対するＰａｍｙＬ－１のＴＳＳの可視化を補助する二重下線を引いた「Ｇ」ヌクレオチドで示す。
図４は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８２）及び合成ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８３）のアラインメントを示し、推定転写開始部位（ＴＳＳ）を太字ヌクレオチド、及び合成ａｍｙＬプロモーターに対する天然ａｍｙＬプロモーターのＴＳＳの可視化を補助する下線を引いた「Ｇ」ヌクレオチドで示す。
図５は、合成ＰａｍｙＬ－３プロモーター領域（配列番号６６）及び合成Ｐａｍｙｌ－４プロモーター領域（配列番号６７）の核酸配列アラインメントを示す。図５に示すように、推定転写開始部位（ＴＳＳ）を太字ヌクレオチドで示し、その後にイタリック体のヌクレオチドで示す５’－ＵＴＲ配列が続き、二重下線を引いた「Ｇ」ヌクレオチドはＰａｍｙＬ－４に対するＰａｍｙＬ－３のＴＳＳの可視化を補助する。
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする合成核酸配列である。
配列番号２は、Ｎ末端核局在シグナル（ＮＬＳ）配列のアミノ酸配列である。
配列番号３は、Ｃ末端ＮＬＳ配列のアミノ酸配列である。
配列番号４は、デカ－ヒスチジン（１０－Ｈ）タグを含むアミノ酸配列である。
配列番号５は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーターを含む核酸配列である。
配列番号６は、Ｃａｓ９フォワードプライマー核酸配列である。
配列番号７は、Ｃａｓ９リバースプライマー核酸配列である。
配列番号８は、プラスミドｐＫＢ３２０骨格の核酸配列である。
配列番号９は、プラスミドｐＫＢ３２０の核酸配列である。
配列番号１０は、ｐＫＢ３２０フォワードプライマー核酸配列である。
配列番号１１は、ｐＫＢ３２０リバースプライマー核酸配列である。
配列番号１２は、Ｃａｓ９「リバースシーケンシングプライマー１」核酸配列である。
配列番号１３は、Ｃａｓ９「リバースシーケンシングプライマー２」核酸配列である。
配列番号１４は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー１」核酸配列である。
配列番号１５は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー２」核酸配列である。
配列番号１６は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー３」核酸配列である。
配列番号１７は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー４」核酸配列である。
配列番号１８は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー５」核酸配列である。
配列番号１９は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー６」核酸配列である。
配列番号２０は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー７」核酸配列である。
配列番号２１は、合成ｐＲＦ６９４核酸配列である。
配列番号２２は、合成ｐＲＦ７４８核酸配列である。
配列番号２３は、合成二重ターミネーター核酸配列である。
配列番号２４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｐｓＬプロモーター（核酸）配列である。
配列番号２５は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードする合成核酸配列である。
配列番号２６は、ラムダファージｔ０ターミネーター核酸配列である。
配列番号２７は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｈｆＮ遺伝子である。
配列番号２８は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｈｆＮ標的部位である。
配列番号２９は、ｙｈｆＮ ＶＴドメインをコードする合成核酸配列である。
配列番号３０は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｈｆＮ標的部位ＰＡＭ配列である。
配列番号３１は、合成ｙｈｆＮガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列である。
配列番号３２は、ｙｈｆＮ ｇＲＮＡをコードする合成ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ）である。
配列番号３３は、合成ｙｈｆＮ ｇＲＮＡポリヌクレオチド（ＤＮＡ）発現カセットである。
配列番号３４は、合成ｐＲＦ７９３核酸配列である。
配列番号３５は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｈｆＮ遺伝子座を含むポリヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、合成ｐＲＦ７４８フォワードプライマー配列である。
配列番号３７は、合成ｐＲＦ７４８リバースプライマー配列である。
配列番号３８は、ｙｈｆＮ遺伝子座の５’側の領域にフランキングするＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）核酸（配列）である。
配列番号３９は、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター核酸配列である。
配列番号４０は、合成ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター核酸配列である。
配列番号４１は、合成Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ａｐｒターミネーター配列である。
配列番号４２は、ｙｈｆＮ遺伝子座の３’側の領域にフランキングするＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）核酸（配列）である。
配列番号４３は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子である。
配列番号４４は、合成ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼカセットである。
配列番号４５は、合成ｒｒｎＩｐ２－１＿α－アミラーゼカセットである。
配列番号４６は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）５’ｌｙｓＡホモロジーアームである。
配列番号４７は、合成改変ａｐｒＥ５’ＵＴＲである。
配列番号４８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｌａｔシグナル配列である。
配列番号４９は、バリアントサイトファーガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種α－アミラーゼをコードする合成ＤＮＡ配列である。
配列番号５０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｌａｔターミネーター配列である。
配列番号５１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）３’ｌｙｓＡホモロジーアームである。
配列番号５２は、合成ｌｙｓＡフォワードプライマーである。
配列番号５３は、合成ｌｙｓＡリバースプライマーである。
配列番号５４は、合成ＤＮＡ１０３２である。
配列番号５５は、合成ＤＮＡ１０３３である。
配列番号５６は、合成ＤＮＡ１０３４である。
配列番号５７は、合成ＤＮＡ１０３５である。
配列番号５８は、合成ｒｒｎＩｐ２－２プロモーター配列である。
配列番号５９は、合成ｒｒｎＩｐ２－３プロモーター配列である。
配列番号６０は、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列（配列番号３９）の相補配列である。
配列番号６１は、合成ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター配列（配列番号４０）の相補配列である。
配列番号６２は、合成ｒｒｎＩｐ２－２プロモーター配列（配列番号５８）の相補配列である。
配列番号６３は、合成ｒｒｎＩｐ２－３プロモーター配列（配列番号５９）の相補配列である。
配列番号６４は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８２）及び天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８４）を含む、本明細書でＰａｍｙＬ－１と名付けられた天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域である。
配列番号６５は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８４）に作動可能に連結された合成ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８３）を含む、本明細書でＰａｍｙＬ－２と名付けられた合成ａｍｙＬプロモーター領域である。
配列番号６６は、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８５）に作動可能に連結された天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８２）を含む、本明細書でＰａｍｙＬ－３と名付けられた合成ａｍｙＬプロモーター領域である。
配列番号６７は、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８５）に作動可能に連結された合成ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８３）を含む、本明細書でＰａｍｙＬ－４と名付けられた合成ａｍｙＬプロモーター領域である。
配列番号６８は、トランケート型成熟Ｂ．デラミフィカンス（Ｂ．ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼをコードする天然ＤＮＡ配列である。
配列番号６９は、合成プライマー配列である。
配列番号７０は、合成プライマー配列である。
配列番号７１は、合成プライマー配列である。
配列番号７２は、合成プライマー配列である。
配列番号７３は、合成プライマー配列である。
配列番号７４は、合成プライマー配列である。
配列番号７５は、合成プライマー配列である。
配列番号７６は、合成プライマー配列である。
配列番号７７は、合成プライマー配列である。
配列番号７８は、ＰａｍｙＬ－１＿プルルナーゼ発現カセットである。
配列番号７９は、ＰａｍｙＬ－２＿プルルナーゼ発現カセットである。
配列番号８０は、ＰａｍｙＬ－３＿プルルナーゼ発現カセットである。
配列番号８１は、ＰａｍｙＬ－４＿プルルナーゼ発現カセットである。
配列番号８２は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列である。
配列番号８３は、合成ａｍｙＬプロモーター配列である。
配列番号８４は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙｌ ５’－ＵＴＲ配列である。
配列番号８５は、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列である。
詳細な説明
本開示は一般に、タンパク質生産性増強表現型などを有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の（宿主）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を構築／作製するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、新規プロモーター（核酸）配列、その新規発現コンストラクト、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞などに関する。
したがって、本開示の特定の実施形態は、改変（又は変異体）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。他の実施形態は、その中に導入された１つ以上の新規なプロモーター（核酸）配列（例えば、「改変」又は「合成」プロモーター配列）を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。他の実施形態では、その１つ以上のプロモーター配列は、目的のタンパク質をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている。他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する（親）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較してタンパク質生産性が増強された表現型を含む。特定の他の実施形態は、内因性（天然）プロモーター（核酸）配列を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関し、それから誘導される改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種娘細胞は、その改変（非天然）プロモーター配列を含む。
Ｉ．定義
本明細書に記載される、目的の１種以上の異種及び／又は内因性タンパク質を産生する改変細胞、並びにその方法を考慮して、以下の用語及び句が定義される。本明細書で定義されていない用語には、当該技術分野で通常使用されている意味が与えられるべきである。
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の組成物及び方法を実施又は試験するためにも使用できるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。本明細書で引用した刊行物及び特許は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。したがって、本開示の特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
本明細書で定義されるように、「親細胞」又は「親（宿主）細胞」は、互換的に使用され得、「未改変（の）」親細胞を指す。
本明細書で使用する場合、「改変細胞」又は「改変（宿主）細胞」は、互換的に使用され得、改変細胞が由来する「親」宿主細胞中に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組み換え（宿主）細胞を指す。
特定の実施形態では、親（未改変）細胞は、特に、改変娘細胞と比較する場合、又はそれに対して、「対照細胞」と称し得る。
本明細書で使用する場合、親（未改変）細胞（すなわち、対照細胞）における目的のタンパク質（ＰＯＩ）の発現及び／又は産生が、改変（娘）細胞における同じＰＯＩの発現及び／又は産生と比較する場合、「改変」及び「未改変」細胞は、同一条件（すなわち、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。
本明細書で使用する場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種」細胞には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種、例えば、以下に限定されないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属は、再分類されている種、例えば、以下に限定されないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されている「Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むことが意図されている。
本明細書で使用する場合、用語「野生型」及び「天然」は、互換的に使用され、天然において見出される遺伝子、タンパク質、タンパク質ミックス、細胞、又は菌株を指す。
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コーディング配列（又は、機能的ＲＮＡ）の転写を制御できる核酸配列を一般に指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の下流（３’）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよく、天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよく、合成核酸セグメントを含んでいてもよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、種々のレベルのＲＮＡ転写産物に、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で遺伝子の発現を最も多く類似のレベルで引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、殆どの場合に調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることは確認されている。
本明細書で使用する場合、「機能的プロモーター」及び「プロモーター機能」などの用語は、特に、コーディング配列（又は機能的ＲＮＡ）の転写を、コーディング配列の上流（５’）に配置され、コーディング配列と作動可能に組み合わされた場合に、制御し得る核酸配列を指す。例えば、プロモーター機能は、当業者に知られたプロモーター機能／プロモーター活性アッセイによって、容易に評価、推定、試験、測定などし得る。
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター活性」は、プロモーター機能の定性的又は定量的推定をいう。例えば、未知の（候補／試験）プロモーター（核酸）配列のプロモーター活性は、（例えば、当該技術分野で一般に知られている１つ以上のプロモーター活性アッセイを用いて）評価し、既知の（対照）プロモーター配列のプロモーター活性と比較することができる。したがって、このようなプロモーター活性測定／アッセイは、発現速度、時間的発現、空間的発現などを調べるために使用され得る。プロモーター活性を試験／測定する方法は、多くの場合、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））の発現に基づいており、目的のプロモーター配列は、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の上流（５’）に配置され、且つレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に作動可能に連結される。例えば、目的のプロモーター配列（又は、例えば、１つ以上の変異、欠失、置換を含む、多くのそのバリアント）は、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の上流（５’）で目的のプロモーター配列を作動可能に連結し、レポーター遺伝子における変化を検出／測定することによって試験し得る。したがって、ＧＦＰ、ＲＦＰなどの蛍光レポーター遺伝子は、当業者が、例えば、蛍光シグナルの変化を検出することによって、プロモーター活性を測定することを可能にする（Ｓｏｌｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋｒａｕｓｓ、２０１３）。
本開示の特定の実施形態では、プロモーター機能（又は活性）は、発現カセット（コンストラクト）を好適な宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞）に導入することによって評価される。例えば、特定の実施形態では、好適な宿主細胞は、（ａ）候補（試験）発現カセット又は（ｂ）対照発現カセットを含む。より詳細には、（ａ）候補（試験）発現カセットは、目的のタンパク質（例えば、酵素）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流（５’）に位置し、且つそれに作動可能に連結された候補（試験）プロモーター配列を含み、（ｂ）対照カセットは、同じ目的のタンパク質（例えば、同じ酵素）をコードするオープンリーディング（ＯＲＦ）の上流（５’）に位置し、且つそれに作動可能に連結された対照プロモーター配列を含む。したがって、候補（試験）プロモーター配列と直接比較するために選択される対照プロモーター配列は、既知の機能又は活性を有する任意のプロモーター配列であり得る。特定の実施形態では、対照プロモーター配列は、配列番号３９の核酸配列を含む。例えば、特定の実施形態において、本開示の適切な宿主細胞は（ａ）導入された「コントロール」発現カセット又は（ｂ）導入された「候補」（試験）発現カセットのいずれかを含み、ここで、２つの宿主細胞は続いて培養され（すなわち、同一の条件下で）、そして２つの宿主細胞（すなわち、候補細胞対コントロール細胞）の間で発現／産生される目的のタンパク質の量が直接比較される。
本明細書で使用する場合、「天然バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター」（以下、「ｒｒｎＩｐ２」プロモーターと略す）は、配列番号３９に示すヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用する場合、「改変ｒｒｎＩｐ２」プロモーター、「合成ｒｒｎＩｐ２」プロモーター、「バリアントｒｒｎＩｐ２」プロモーター、「変異体ｒｒｎＩｐ２」プロモーター、「変異ｒｒｎＩｐ２」プロモーターなどの句は、配列番号３９の「天然ｒｒｎＩｐ２」プロモーターに由来する遺伝子改変プロモーター配列を指す。例えば、特定の実施形態では、本開示の改変（非天然）ｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（１～９１位）に関して少なくとも１つの改変ヌクレオチド位を含み、その少なくとも１つの改変ヌクレオチド位は、配列番号３９の１位、８９位、９０位又は９１位から選択される。
他の実施形態では、本開示の改変（非天然）ｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（１～９１位）に関して少なくとも２つの改変ヌクレオチド位を含み、その少なくとも２つの改変ヌクレオチド位は、配列番号３９の１位、８９位、９０位又は９１位から選択される。
他の実施形態では、本開示の改変（非天然）ｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（１～９１位）に関して少なくとも３つの改変ヌクレオチド位を含み、その少なくとも３つの改変ヌクレオチド位は、配列番号３９の１位、８９位、９０位又は９１位から選択される。
他の実施形態では、本開示の改変（非天然）ｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（１～９１位）に関して少なくとも４つの改変ヌクレオチド位を含み、その少なくとも４つの改変ヌクレオチド位は、配列番号３９の１位、８９位、９０位及び９１位から選択される。
本明細書で使用する場合、「ｒｒｎＩｐ２－１」プロモーターは、配列番号４０に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号４０のヌクレオチド位３０位にチミン（Ｔ）、ヌクレオチド位８９位にチミン（Ｔ）、ヌクレオチド位９０位にグアニン（Ｇ）、及びヌクレオチド位９１位にチミン（Ｔ）を含む。特定の他の実施形態では、「ｒｒｎＩｐ２－１」プロモーターは、配列番号４０に対し少なくとも９０％～約９９％の配列同一性を含み、且つ配列番号４０のヌクレオチド位３０位にチミン（Ｔ）、ヌクレオチド位８９位にチミン（Ｔ）、ヌクレオチド位９０位にグアニン（Ｇ）、及びヌクレオチド位９１位にチミン（Ｔ）を含む。
本明細書で使用する場合、「ｒｒｎＩｐ２－２」プロモーターは、配列番号５８に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５８のヌクレオチド位８９にＴ、ヌクレオチド位９０にＧ、及びヌクレオチド位９１にＴを含む。特定の他の実施形態では、「ｒｒｎＩｐ２－２」プロモーターは、配列番号５８に対し少なくとも９０％～約９９％の配列同一性を含み、且つ配列番号５８のヌクレオチド位８９にＴ、ヌクレオチド位９０にＧ、及びヌクレオチド位９１にＴを含む。
本明細書で使用する場合、「ｒｒｎＩｐ２－３」プロモーターは、配列番号５９に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５９のヌクレオチド位３０にＴを含む。特定の他の実施形態では、「ｒｒｎＩｐ２－３」プロモーターは、配列番号５９に対し少なくとも９０％～約９９％の配列同一性を含む。
本明細書で使用する場合、「合成」ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター、「合成」ｒｒｎＩｐ２－２プロモーター、「合成」ｒｒｎＩｐ２－３プロモーター、「改変」ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター、「改変」ｒｒｎＩｐ２－２プロモーター、「改変」ｒｒｎＩｐ２－３プロモーターなどの用語は、１つ以上の（非天然）ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列（すなわち、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列；配列番号３９とは対照的に）を指す。
したがって、特定の実施形態では、本開示の合成、バリアント、又は改変ｒｒｎＩｐ２プロモーター（例えば、ｒｒｎＩｐ２－１、ｒｒｎＩｐ２－２、ｒｒｎＩｐ２－３）は、目的のタンパク質をコードする遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結された場合に、増強されたプロモーター機能又は活性（例えば、タンパク質生産性増強表現型）を含む。特定の関連する実施形態では、本開示の合成、バリアント、又は改変ｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列と比較して、増強されたプロモーター機能又は活性を含む。
したがって、特定の他の実施形態では、内因性天然ｒｒｎＩｐ２プロモーターを含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞が、本開示の方法にしたがって改変され、それに由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、本開示の変異（非天然）ｒｒｎＩｐ２プロモーターを含む。
天然のｒｒｎＩｐ２プロモーター、又はそれに由来するバリアント（改変）ｒｒｎＩｐ２プロモーター（例えば、ｒｒｎＩｐ２－１、ｒｒｎＩｐ２－２、ｒｒｎＩｐ２－３）に関連して、本明細書で使用する場合、所与の「核酸配列」（すなわち、本明細書中に開示されるｒｒｎＩｐ２プロモーター配列）中のヌクレオチドの「位置」は、配列番号３９の天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーターを参照して（５’から３’方向に読まれる）番号付けられる。このｒｒｎＩｐ２プロモーター配列は（例えば、図１Ａ～図１Ｃに示すように）ヌクレオチド１～９１を含む。
例えば、図１Ａ～図１Ｃに示すように、本明細書に記載される候補（試験）プロモーター（核酸）配列は、本明細書に記載のアラインメントアルゴリズム及び／又は関連技術分野において知られるアラインメントアルゴリズムを使用して、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列（配列番号３９；ヌクレオチド位１～９１）とアラインされ得、ここで、配列番号３９の天然プロモーター配列とアラインする候補（試験）配列中のヌクレオチド位置は、天然配列中の対応するヌクレオチドを参照して番号付けすることができる。例えば、図１Ａに示すように、本開示の新規（合成）ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター配列（すなわち、配列番号４０）は、天然バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列（すなわち、配列番号３９）とアラインされ、３０位、８９位、９０位及び９１位の４つのヌクレオチドが、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）と新規ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）との間で異なっている。したがって、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列に対する配列相同性（又は同一性）を確立するために、当業者は、当業者に知られる配列アラインメントアルゴリズム、ソフトウェア、及びその方法を使用して、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列を目的の１つ以上の候補（試験）プロモーター配列と容易に比較し得る。
特定の実施形態では、新規バリアントｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列又は配列番号６０のその相補配列と（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸配列を含む。例えば、特定の実施形態では、新規バリアントｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号６０を含む相補ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列と（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸配列を含み、そのハイブリダイズするバリアント配列は、配列番号３９の天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列中の同じ位置に対して、３０、８９、９０又は９１から選択される位置に少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。したがって、他の実施形態では、（ストリンジェントなハイブリッド化条件下で）ハイブリダイズする本開示の新規バリアントｒｒｔＩｎｐ２プロモーター配列は、ヌクレオチド位８９のＴ、ヌクレオチド位９０のＧ、及びヌクレオチド位９１のＴを含む（すなわち、配列番号３９と比較して、ヌクレオチド位８９～９１にＡ、Ａ、Ａを含む）。他の実施形態では、（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする新規バリアントｒｒｎＩｐ２プロモーターは、配列番号４０、５８又は５９を含む。
本明細書で使用する場合、以下「ＰａｍｙＬ－１」と略される天然バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）「ａｍｙＬプロモーター領域」は、配列番号６４に示すヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用する場合、以下「ＰａｍｙＬ－２」と略される改変（合成）「ａｍｙＬプロモーター領域」は、配列番号６５に示すヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、改変（合成）ＰａｍｙＬ－２配列は、配列番号６４に対し少なくとも９０％～約９９％の配列同一性を含み、且つ配列番号６４のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号６４のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号６４のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含む。
天然ＰａｍｙＬ－１配列及び改変（合成）ＰａｍｙＬ－２配列に関連して、本明細書で使用する場合、所与の「核酸配列」中のヌクレオチドの「位置」は、配列番号６４の天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域ＰａｍｙＬ－１を参照して（５’から３’方向に読まれる）番号付けされ、この天然ＰａｍｙＬ－１プロモーター領域配列は、配列番号６４のヌクレオチド位１～１００（すなわち、図３に示すように、５’から３’へ）を含む。
例えば、図３に示すように、天然ＰａｍｙＬ－１プロモーター領域は、配列番号６４のヌクレオチド位１～７４を含む天然のａｍｙＬプロモーター配列、及び配列番号６４のヌクレオチド位７５～１００を含む天然ａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列を含み、改変（合成）ＰａｍｙＬ－２プロモーター領域は、配列番号６５のヌクレオチド位７５～１００を含む天然ａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結された配列番号６５のヌクレオチド位１～７４を含む改変ａｍｙＬプロモーター配列を含む。
本明細書で使用する場合、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）「ａｍｙＬプロモーター」配列は、配列番号８２に示すヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用する場合、改変（合成）「ａｍｙＬプロモーター」配列は、配列番号８３に示すヌクレオチド配列を含み、且つ配列番号８３のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８３のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８３のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含む。特定の実施形態では、改変（合成）ＰａｍｙＬプロモーター配列は、配列番号８２に対し少なくとも９０％～約９９％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８２のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８２のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含む。
天然のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列及び改変ａｍｙＬプロモーター配列に関連して、本明細書で使用する場合、所与の「核酸配列」中のヌクレオチドの「位置」は、配列番号８２の天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列を参照して（５’から３’方向に読まれる）番号付けされ、この天然ａｍｙＬプロモーター配列は、配列番号８２のヌクレオチド位１～７４（すなわち、図４に示すように、５’から３’へ）を含む。例えば、図４に示すように、天然ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８２）は、７２、７３及び７４にそれぞれヌクレオチドＡ、Ｔ及びＧを含み、改変ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８３）は、ヌクレオチド位７２、７３及び７４にそれぞれヌクレオチドＴ、Ｇ及びＴを含む。
本明細書で使用する場合、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）「ａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ」配列は、配列番号８４に示すヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用する場合、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）「ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ」は、配列番号８５に示すヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用する場合、以下「ＰａｍｙＬ－３」と略される改変（合成）「ａｍｙＬプロモーター領域」は、配列番号６６に示すヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用する場合、以下「ＰａｍｙＬ－４」と略される改変（合成）「ａｍｙＬプロモーター領域」は、配列番号６７に示すヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、改変（合成）ＰａｍｙＬ－４配列は、配列番号６６に対し少なくとも９０％～約９９％の配列同一性を含み、且つ配列番号６６のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号６６のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号６６のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含む。
したがって、合成ＰａｍｙＬ－３プロモーター領域及び合成ＰａｍｙＬ－４プロモーター領域に関連して、本明細書で使用する場合、所与の「核酸配列」中のヌクレオチドの「位置」は、配列番号６６の合成ＰａｍｙＬ－３プロモーター領域を参照して（５’から３’方向に読まれる）番号付けされ、このＰａｍｙＬ－３プロモーター領域配列は、配列番号６６のヌクレオチド位１～１３２（すなわち、図５に示すように、５’から３’へ）を含む。
例えば、図５に示すように、合成ＰａｍｙＬ－３プロモーター領域（配列番号６６）は、配列番号６６のヌクレオチド位７５～１３２を含む天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列（例えば、配列番号８５）に作動可能に連結された、配列番号６６のヌクレオチド位１～７４を含む天然ａｍｙＬプロモーター配列（例えば、配列番号８２）を含む。同様に、図５に示すように、合成ＰａｍｙＬ－４プロモーター領域（配列番号６７）は、配列番号６７のヌクレオチド位７５～１３２を含む天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列（例えば、配列番号８５）に作動可能に連結された、配列番号６７のヌクレオチド位１～７４を含む改変ａｍｙＬプロモーター配列（例えば、配列番号８３）を含む。
したがって、図５に示すように、ＰａｍｙＬ－３プロモーター領域（配列番号６６）は、ヌクレオチド位７２、７３及び７４にそれぞれヌクレオチドＡ、Ｔ及びＧを含み、ＰａｍｙＬ－４プロモーター領域（配列番号６７）は、ヌクレオチド位７２、７３及び７４にそれぞれヌクレオチドＴ、Ｇ及びＴを含む。
ＰａｍｙＬ－１プロモーター領域（配列番号６４）、ＰａｍｙＬ－２プロモーター領域（配列番号６５）、ＰａｍｙＬ－３プロモーター領域（配列番号６６）及びＰａｍｙＬ－４プロモーター領域（配列番号６７）に関連して、本明細書で使用する場合、「プロモーター領域」又は「プロモーター領域配列という用語は、下流（３’）５－ＵＴＲ配列に作動可能に連結された上流（５’）プロモーター配列を少なくとも含む核酸配列を指す。
本明細書で使用する場合、「核酸」は、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列、及びそれらの断片若しくは部分、並びにセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れを表していても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。
本明細書で使用する場合、用語「３’－非翻訳領域」は、「３’－ＵＴＲ」と略され、用語「５’－非翻訳領域」は「５’－ＵＴＲ」と略される。
本明細書で使用する用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（すなわち、そのコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコーディング配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には、隣接し、且つリーディング期にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、適当な制限部位でのライゲーション又はシームレスアセンブリー法によって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来の手法にしたがって使用される。
本明細書で使用する場合、「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’、非コーディング配列）、配列内又は下流（３’、非コーディング配列）に位置し、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造及び他のＲＮＡ安定性モチーフを含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。したがって、用語「発現」には、以下に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などのポリペプチドの産生に関与する任意の工程が含まれる。
本明細書で使用する場合、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞が「増加した」（即ち、親細胞と比較して）量の目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現する／産生する」などの句で使用される複合語「発現／産生する」は、本開示のそのような「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞におけるタンパク質の発現及び産生に関与する任意のステップを含むことが意図されている。
本明細書で使用する場合、「発現の増加」、「発現の増強」、「ＰＯＩの発現の増加」、「産生の増加」、「ＰＯＩの産生の増加」などの用語は、「改変」バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞を指し、ここで、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は、常に同じＰＯＩを発現／産生する「未改変」バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（親）細胞と比較して（相対的）である。
同様に、本明細書で使用する場合、「改変宿主細胞が（未改変）親宿主細胞と比較して「増加した量の」１種以上の目的のタンパク質を「発現／産生する」などの句において使用した場合の「増加した量」は、特に、改変宿主細胞内で発現／産生した目的のタンパク質（ＰＯＩ）の「増加した量」を指すが、この「増加した量」は常に同じＰＯＩを発現／産生する（未改変）親Ｂ．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関し、ここで改変及び未改変細胞は、同じ条件（例えば、培地、温度、ｐＨなどの同じ条件）下で増殖／培養／発酵させられる。例えば、増加した量のＰＯＩは、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において発現した内因性ＰＯＩであっても異種ＰＯＩであってもよい。
したがって、本明細書で使用する場合、タンパク質産生を「増加させる」又は「増加した」タンパク質産生は、産生したタンパク質（例えば、目的のタンパク質）の増加した量を指す。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地中へ分泌（又は、輸送）されてもよい。特定の実施形態では、目的のタンパク質は、培養培地中へ産生（分泌）される。タンパク質産生の増加は、例えば、親宿主細胞と比較して、より高い最大レベルのタンパク質若しくは酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性など）として、又は産生される総細胞外タンパク質として検出され得る。
本明細書で使用する「タンパク質生産性が増強された表現型」を含む改変細胞としては、以下に限定されないが、増強／増加した体積生産性、増強／増加した炭素変換効率を含む変異細胞、増強／増加したタンパク質収率を含む改変細胞、増強／増加した比タンパク質生産性を含む改変細胞が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「タンパク質生産性が増強された表現型」及び「タンパク質生産性が増加された表現型」という句は、互換的に使用することができる。
本明細書で使用する場合、未改変（親）細胞対改変（バリアント／娘）細胞における「タンパク質生産性が増強／増加された表現型」について記載する場合に、「親」及び「バリアント」細胞が同じ条件（例えば、培地、温度、ｐＨなどの同じ条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。
本明細書で使用する用語「導入する（こと）」は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを「細胞に導入する（こと）」などの句で使用する場合、ポリヌクレオチドを細胞に導入するための当該技術分野で知られる方法を含み、こうした方法としては、以下に限定されないが、プロトプラスト融合、天然又は人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。
本明細書に記載のポリヌクレオチド（若しくは核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」が含まれることは理解されている。
したがって、用語「遺伝子」は、タンパク質のコーディング配列の全部又は一部を含む、アミノ酸の特定配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’側－非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’側－ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）並びにコーディング配列を含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「コーディング配列」は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コーディング配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレーム（以下では、「ＯＲＦ」）によって決定されて、通常はＡＴＧ開始コドンで始まる。コーディング配列には、一般的に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組み換えヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書で定義する場合、「オープンリーディングフレーム」（以下、「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を表す一連の２つ以上のコドン、及び（ｉｉｉ）終止コドンからなる（天然型であるか、非天然型であるか、又は合成であるかにかかわらず）連続するリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列を意味し、ＯＲＦは、５’側から３’側の方向に読まれる（又は、翻訳される）。
本明細書で定義する場合、「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、配列内又はその下流（３’非コーディング配列）に位置し、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。
本明細書で定義する場合、「導入する（こと）」という用語は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを「細菌細胞に導入する（こと）」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入する（こと）」などの句で使用する場合、ポリヌクレオチドを細胞に導入するための当該技術分野で知られる方法を含み、こうした方法としては、以下に限定されないが、プロトプラスト融合、天然又は人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション、接合などが挙げられる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照）。
本明細書で使用する場合、「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組み換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、一般的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ又は遺伝子）を細胞に挿入することによって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換対象の細胞には天然に存在しない配列）であってもよい。本明細書で使用する場合、「形質転換」は、ＤＮＡが、染色体組み込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外因性ＤＮＡを宿主細胞に導入することを指す。本明細書で使用する場合、「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」、及び「ＤＮＡコンストラクト」は、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡを指す。形質転換ＤＮＡは、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。一部の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、ホモロジーボックスに隣接された入来配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。
本明細書で使用する「入来配列」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体に導入されるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、入来配列は、ＤＮＡコンストラクトの一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（すなわち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。いくつかの実施形態では、入来配列は、１種以上の目的のタンパク質、遺伝子及び／又は変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。いくつかの実施形態では、非機能的配列は、遺伝子の機能を崩壊させるために遺伝子に挿入され得る。別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。さらなる実施形態では、入来配列は、２つの相同ボックス（例えば、上流及び下流のホモロジーアーム）を含む。
本明細書で使用する「ホモロジーボックス」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より具体的には、ホモロジーボックスは、本発明による目的の染色体遺伝子座に直接フランキングする領域と、約８０～１００％の配列同一性、約９０～１００％の配列同一性、又は約９５～１００％の配列同一性を有する上流又は下流の領域である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内にＤＮＡコンストラクトが組み込まれる場所を指示し、もしあれば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、ホモロジーボックスには、約１塩基対（ｂｐ）～２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、ホモロジーボックスは、約１ｂｐ～１０．０ｋｂ、１ｂｐ～５．０ｋｂ、１ｂｐ～２．５ｋｂ、１ｂｐ～１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ～２．５ｋｂを含む。ホモロジーボックスはまた、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、ホモロジーボックス（ホモロジーアーム）によってフランキングされ、このホモロジーボックスは、遺伝子のコード領域に直接フランキングする核酸配列を含む。
本開示のさらに別の実施形態では、ＤＮＡアレイ解析（例えば、本明細書に記載したトランスクリプトーム解析）によって決定される不適切な時間に活性である遺伝子の欠失、崩壊、不活化又は下方制御は、目的のタンパク質の発現を増強する。本明細書で使用する場合、「トランスクリプトーム解析」は、遺伝子転写の解析を指す。
本明細書で使用する場合、用語「選択可能マーカーコーディングヌクレオチド配列」は、宿主細胞内で発現することができ、選択可能マーカーの発現が、発現した遺伝子を含有する細胞に、対応する選択的作用物質の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与する、ヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用する場合、用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が目的入来ＤＮＡを取り込めたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。一般的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外因性配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
「存在する選択可能マーカー」は、形質転換対象の微生物の染色体上に所在するマーカーである。存在する選択可能マーカーは、形質転換ＤＮＡコンストラクト上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者にはよく知られている。上記のように、マーカーは抗微生物剤耐性マーカー（例えば、ａｍｐＲ、ｐｈｌｅｏＲ、ｓｐｅｃＲ、ｋａｎＲ、ｅｒｙＲ、ｔｅｔＲ、ｃｍｐＲ及びｎｅｏＲ）であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、並びにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノムに存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において、並びに染色体組み込みカセット及び組み込みプラスミドの染色体増幅を含む実施形態において、特に有用である。本発明により有用な他のマーカーとしては、セリン、リシン、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、及びβ－ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で定義する場合、宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、多くは、細胞の中心的な代謝には通常関与しない遺伝子を持ち、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外エレメントを指す。そのようなエレメントは、任意のソースに由来する、線状又は環状で、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡからなる自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であり得、それらにおいては、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる固有の構成に、多くのヌクレオチド配列が結合又は再結合している。
本明細書で使用する場合、「形質転換カセット」は、遺伝子（又は、そのＯＲＦ）を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子又はＤＮＡセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。したがって、この用語は、様々な宿主細胞間を輸送するために設計された核酸コンストラクトを指す。ベクターとしては、「エピソーム」（すなわち、自律的に複製するか、又は宿主生物の染色体に組み込むことができる）である、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。
「発現ベクター」は、細胞内に異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者には知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組み換え又は合成的に生成される核酸コンストラクト（すなわち、これらは、上述したベクター若しくはベクターエレメントである）を指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片内に組み込むことができる。通常、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトには、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も含まれる。所定の実施形態では、本開示のＤＮＡコンストラクトは、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。
本明細書で使用する場合、「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入する際に使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。適切なベクターの選択及び／又は構成は、十分に当業者の知識の範囲内である。
本明細書で使用する場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用される環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクトを指し、多くの細菌及び一部の真核生物において、染色体外の自己複製、条件付きの自己複製又は複製しない遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクトを指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「目的のタンパク質」又は「ＰＯＩ」という用語は、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞中で発現することが望まれる目的ポリペプチドを指し、このＰＯＩは、増強／増大したレベル（すなわち、「未改変」（親）細胞と比較して）で発現することが好ましい。したがって、本明細書で使用する場合、ＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質、抗体などであり得る。
同様に、本明細書で定義する場合、「目的遺伝子」又は「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子又はオープンリーディングフレーム）を指す。「目的のタンパク質」をコードする「目的遺伝子」は、天然型遺伝子、変異遺伝子又は合成遺伝子であってよい。
特定の実施形態では、本開示の改変細胞は、親細胞に比較して異種ＰＯＩ又は内因性ＰＯＩをより多く産生する。特定の実施形態では、本開示の改変細胞によって産生されるＰＯＩの増加量は、親細胞と比較して、少なくとも０．０５％の増加、少なくとも０．１０％、少なくとも１．０％の増加、少なくとも５．０％の増加、又は５．０％超の増加である。非限定的な例として、特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素（例えば、ヒドロラーゼ）であり、改変細胞によって産生されるＰＯＩのレベルの増加（すなわち、その非改変親と比較して）は、酵素活性の増加及び／又は比生産性（Ｑｐ）の増加として検出又は測定される。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、また、非アミノ酸によって分断されていてもよい。ポリポチペプチドという用語はまた、自然に、或いは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化成分との結合などの任意の他の操作若しくは改変によって、改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
特定の実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリザーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅ）、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせ）などの商業的に関連する工業用の目的のタンパク質をコードする。
本明細書で使用する「バリアント」ポリペプチドは、一般的には組み換えＤＮＡ技術による、１個以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失による親（若しくは参照）ポリペプチドに由来するポリペプチドを指す。バリアントポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドと異なる可能性があり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義され得る。
好ましくは、バリアントポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用する場合、「バリアント」ポリヌクレオチドは、バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、この「バリアントポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと特定の程度の配列相同性／同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（又は、その相補体）とハイブリダイズする。好ましくは、バリアントヌクレオチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。
本明細書で使用する場合、「変異」は、核酸配列内のあらゆる変化又は変更を指す。点変異、欠失変異、サイレント変異、フレームシフト変異、スプライシング変異などを含む数種類の変異が存在する。変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）、又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株による継代によって）行われ得、或いは自然発生的に起こり得る。
本明細書で使用する場合、ポリペプチド又はその配列に関連して、用語「置換」は、１つのアミノ酸の別のアミノ酸との置き換え（すなわち、置換）を意味する。
本明細書で定義する場合、「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。
本明細書で定義する場合、「異種」遺伝子、「非内因性」遺伝子、又は「外来」遺伝子は、通常は宿主生物に見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子（又はＯＲＦ）を指す。本明細書で使用する場合、用語「外来」遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。
本明細書で定義する場合、「異種」核酸コンストラクト又は「異種」核酸配列は、その中でそれが発現する細胞に対して天然ではない配列の部分を有する。
本明細書で定義する場合、「異種制御配列」は、天然では目的遺伝子の発現を調節（制御）するために機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、その中にそれらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内因性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられている。「異種」核酸コンストラクトは、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一又は異なる制御配列／ＤＮＡコーディング（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質又はタンパク質の前駆体形の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、一般的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外因性であってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、一般的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
用語「由来する」には、用語「～から生じた」、「～から得られた」、「～から入手可能な」及び「から作成された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料若しくは組成物が別の材料若しくは組成物にその起源が見出されるか、又は他の特定の材料若しくは組成物を参照して記載できる特徴を有することを示す。
本明細書で使用する場合、用語「相同性」は、相同ポリヌクレオチド又は相同ポリペプチドに関する。２つ以上のポリヌクレオチド又は２つ以上のポリペプチドが相同である場合、これは、それらの相同のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有することを意味している。２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列が、本明細書で定義するように相同であるほどの十分に高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で知られるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）を使用して２つの配列をアラインさせることにより好適に調べることができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）。ＤＮＡ配列比較のために以下の設定でＧＡＰを使用：ＧＡＰ作成ペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）５．０及びＧＡＰ伸長ペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．３。
本明細書で使用する場合、用語「同一性パーセント（％）」は、配列アライメントプログラムを使用してアラインさせたときの、ポリペプチドをコードする核酸配列間又はポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸又はアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
本明細書で使用する場合、用語「比生産性」は、所定の期間にわたって、細胞１個当たり、単位時間当たりに産生するタンパク質の総量を指す。
本明細書で定義する場合、用語「精製（された）」、「単離（された）」又は「濃縮（された）」は、生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、それが本来結合している、天然型の一部若しくは全部の構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを指す。そのような単離若しくは精製は、最終組成物中に望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質又は酵素を除くための、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈澱若しくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、又は勾配による分離などの当該技術分野で知られる分離技術によって実施することができる。精製又は単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物又は他の酵素若しくは化学物質を添加することができる。
本明細書で使用する場合、用語「ＣｏｍＫポリペプチド」は、ｃｏｍＫ遺伝子の産物；コンピテンスの発達の前の最終自己調節制御スイッチとして作用する転写因子として定義され；ＤＮＡ結合及び取り込み並びに組み換えに関与する後期コンピテンス遺伝子の発現の活性化に関与する（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｚｕｂｅｒ，１９９８，Ｈａｍｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ｃｏｍＫ核酸配列を含み、発現するプラスミド（ｐＢＬ．ｃｏｍＫ）を配列番号４３に示す。
本明細書で使用する場合、「相同遺伝子」は、異なるが通常は関連する種に由来する、相互に対応し、且つ相互に同一又は極めて類似する１対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（すなわち、新規な種の発生）によって分離された遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、及び遺伝子重複によって分離されてきた遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
本明細書で使用する場合、「オルソログ」及び「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。
本明細書で使用する場合、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での重複に関係する遺伝子を指す。オルソログは進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログはいくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの新しい機能を生じる。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビン（これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「相同性」は、配列類似性又は同一性を指すが、同一性が好ましい。この相同性は、当該技術分野で知られる標準技術を使用して決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照）。
本明細書で使用する場合、「アナログ配列」は、遺伝子の機能が、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する遺伝子と実質的に同じである配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。アナログ配列は、既知の配列アラインメント法によって決定される。一般に使用されるアラインメント法はＢＬＡＳＴであるが、配列をアラインさせる際に他の方法もまた使用される。
本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られているように、核酸鎖がその相補鎖と塩基対を形成するによって結合するプロセスを指す。核酸配列は、２つの配列が中～高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、Ｔｍ－５℃（プローブのＴｍを５°下回る）程度で、「高ストリンジェンシー」はＴｍを約５～１０℃下回って、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍを約１０～２０℃下回って、そして「低ストリンジェンシー」はＴｍを約２０～２５℃下回って、起こる。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列ホモログを同定又は検出するために用いることができる。中～高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｐｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中における約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中における室温（ＲＴ）での２回の洗浄、並びに０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中における４２℃でのさらなる２回の洗浄が挙げられる。中間ストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍｌ変性断片処理済みサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、続いて１×ＳＳＣ中、約３７～５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。当業者は、プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などを調整する方法を知っている。
本明細書で使用する場合、「組み換え」は、異種核酸配列の導入によって改変されている、又は細胞がそのように改変された細胞に由来する細胞又はベクターへの言及が含まれる。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内の同一形態においては見出されない遺伝子を発現する、又はヒトが意図的に介入した結果として、さもなければ異常に発現する、過少発現する、若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え」、「組み換える（こと）」又は「組み換え」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の集合体であり、この集合体は、キメラ遺伝子を発生させる。
本明細書で使用する場合、「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列にフランキングされている）。特定の実施形態では、入来配列は、両側でホモロジーボックスにフランキングされている。また別の実施形態においては、入来配列及びホモロジーボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各ホモロジーボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどこに新規なコンストラクトが組み込まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指示する。他の実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、不活化染色体セグメントの一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
本明細書で使用する場合、用語「スタッファー配列」は、ホモロジーボックス（一般的には、ベクター配列）にフランキングしている任意のエクストラＤＮＡを指す。しかし、この用語は、任意の非相同ＤＮＡ配列を包含する。いかなる理論によっても限定されるものではないが、スタッファー配列は細胞がＤＮＡ取り込みを開始するために重要ではない標的を提供する。
ＩＩ．リボソームＲＮＡプロモーター配列
上に一般的に記載したように、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の新規なプロモーター（核酸）配列に関する。特定の実施形態では、これらの新規なプロモーター配列は、ＰＯＩをコードする遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されており、それらは工業的に関連するタンパク質の大規模生産における使用に特に好適である。特定の実施形態では、このような新規プロモーター配列は、天然のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種リボソームＲＮＡ（ｒｒｎ）プロモーター（核酸）配列の合成バリアントである。
例えば、上記の背景の項で提示したように、国際公開第ＷＯ２０１３／０８６２１９号パンフレットには、一般に、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のリボソームプロモーターを含む、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを生産するためのプロモーター、発現ベクター、微生物、及び方法が開示され、そこに開示されているリボソームプロモーター配列は、グラム陽性微生物細胞におけるタンパク質産生増強のために有用である。これらのリボソームＲＮＡ及びリボソームタンパク質プロモーター配列には、いくつかのＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームＲＮＡプロモーター（「ｒｒｎ」と略記）、例えば、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＩ、及びｒｒｎＥ、並びにいくつかのＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームタンパク質プロモーター（「ｒｐｓ」と略記）、例えば、ｒｐｓＤ及びｒｐｓＪが含まれた。
対照的に、以下の実施例の項に提示し、記載するように、本出願人は、このようなｒｒｎプロモーター（核酸）配列に由来する新規な変異体／バリアントプロモーター配列を同定した。より詳細には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現コンストラクトへアセンブリするためのＤＮＡのルーチン合成の間に、本出願人はコンストラクトのＤＮＡアセンブリを容易にするためにｒｒｎプロモーターの配列を改変し、これらの改変の間に、本出願人は、天然のｒｒｎＩｐ２プロモーター配列と比較して、作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現／産生量が増加した特定のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター変異体（例えば、配列番号４０、５８及び５９などのバリアント／変異ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列）を同定した。
例えば、実施例１に提示し、記載するように、本出願人は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ遺伝子座へ発現カセットを導入するためのａｐｒＥ Ｃａｓ９ターゲティングベクターを構築した。したがって、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現カセットを作製するために、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において作動可能なプロモーター配列及びターミネーター配列に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの上流（５’）にプロモーターが配置され、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの下流（３’）にターミネーターが配置されるように、作動可能に連結した。さらに、本開示の実施例２ではさらに、導入されたヒドロラーゼ発現カセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞の構築について記載する。より詳細には、このようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、（１）（２ａ）天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）をコードするＤＮＡ配列又は（２ｂ）新規（合成）バリアントｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）（これらのプロモーターＤＮＡ配列は（３）例示的な目的のタンパク質（すなわち、ヒドロラーゼ）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている）に作動可能に連結された、ｙｈｆＮ遺伝子の５’側のフランキング領域に相同なＤＮＡ配列（配列番号３８）を有するヒドロラーゼ発現カセットを含み、この発現カセットは（４）Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ａｐｒターミネーター配列（配列番号４１）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に融合されており、ここで、プロモーターはヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列の上流（５’）に位置し、ターミネーターはヒドロラーゼをコードするＤＮＡの下流（３’）に位置する。さらに、このような発現カセットは、ｙｈｆＮ遺伝子の３’側のフランキング領域に相同なＤＮＡ配列（配列番号４２）に作動可能に融合された。例えば、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）を有するヒドロラーゼ発現カセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞コロニーを保存して、「ＳＳ０６６」株と命名し、改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）を有するヒドロラーゼ発現カセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞コロニーを保存して、「ＳＳ０６５」株と命名した。
本開示の実施例３ではさらに、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞ＳＳ０６６）又は改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞ＳＳ０６５）を有するヒドロラーゼ発現カセット（すなわち、実施例３；プロテアーゼ）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞のヒドロラーゼ（すなわち、プロテアーゼ）産生を小規模条件下で評価した。より詳細には、４０時間の増殖後、全細胞培地中のプロテアーゼ濃度を、ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて決定した。例えば、表５（実施例３）は、ＳＳ０６６細胞（すなわち、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）を含む）に対するＳＳ０６５細胞（すなわち、ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）を含む）の（正規化）相対プロテアーゼ発現を示し、プロテアーゼ活性が約２倍に増加したことを示した。
同様に、本開示の実施例４は、例示的なヒドロラーゼ発現カセット（すなわち、実施例４；アミラーゼ）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を提示する。より具体的には、実施例４に記載のアミラーゼ発現カセットを、（１）天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）の制御下、又は（２）改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）の制御下にあるアミラーゼ発現カセットを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入した。より詳細には、天然ｒｒｎＩｐ２アミラーゼカセット及び改変ｒｒｎＩｐ２－１アミラーゼカセットのためのハロー陽性形質転換体を、１％（ｗ／ｖ）の不溶性デンプンを含有するＬ寒天上でストリーク精製して、単一コロニーを精製し、ｒｒｎＩｐ２＿アミラーゼカセットの配列が確認されたカセットを有するコロニーを保存して、「ＢＦ３９９」と命名し、ｒｒｎＩｐ２－１＿アミラーゼカセットの配列が確認されたカセットを有するコロニーを保存して、「ＢＦ４０１」と命名した。
本開示の実施例５では、実施例４で構築されたアミラーゼ発現カセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞（すなわち、ＢＦ３９９細胞及びＢＦ４０１細胞）をさらにアッセイした。例えば、表９に示すように、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（すなわち、配列番号４４カセット）を含むアミラーゼ発現カセット及びバリアントｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（すなわち、配列番号４５カセット）を含むアミラーゼ発現カセットについてアミラーゼの発現／産生を試験して、これらの異なるプロモーターのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるアミラーゼ産生に及ぼす影響を決定した。より詳細には、表９に示すように、バリアントｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０；すなわち、配列番号４５カセット）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（すなわち、配列番号４４カセット）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞よりも平均で３０％多くアミラーゼを産生する。
したがって、本明細書に一般的に記載するように、本開示の特定の実施形態は、タンパク質産生増加表現型などを有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を作製／構築するための組成物及び方法に関する。
ＩＩＩ．バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域配列
上に一般的に記載したように、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の新規なプロモーター（核酸）配列に関する。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の新規プロモーター配列は、ＰＯＩをコードする遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されており、これらの新規プロモーター配列は、工業的に関連するタンパク質の大規模生産における使用に特に好適である。例えば、特定の実施形態は、本明細書に一般的に記載されるように、下流５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結された上流プロモーター配列を含む新規プロモーター配列領域に関する。特定の実施形態では、このような新規プロモーター配列領域は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター（核酸）配列の合成（改変）バリアントである。
例えば、上記のセクションＩＩ（例えば、図１を参照）に一般的に記載されるように、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列（配列番号３９）のヌクレオチド位８９、９０及び９１における３’側アデニン（Ａ）が、ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター配列（配列番号４０；配列番号５８）のヌクレオチド位８９でチミン（Ｔ）に、ヌクレオチド位９０でグアニン（Ｇ）に、及びヌクレオチド位９１でチミン（Ｔ）に変化した場合、（ＴＧＴ）改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０；配列番号５８）の制御下で、目的遺伝子の発現は、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）の制御下で発現される同じ目的遺伝子の発現と比較して有意に増強された。改変ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列のこれらの驚くべき且つ予想外の観察に基づいて、本出願人は、天然の．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域に同様の３’側ヌクレオチド改変を導入することを意図した。
より具体的には、以下の実施例６に記載するように、特定の実施形態では、本出願人は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域（ＰａｍｙＬ－１と命名；配列番号６４）を改変し、この天然のＰａｍｙＬ－１プロモーター領域は天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８２）及び天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８４）を含み、一方、改変ａｍｙＬプロモーター領域（ＰａｍｙＬ－２と命名；配列番号６５）は天然のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８４）に作動可能に連結された改変（合成）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８３）を含む。例えば、図３及び図４を参照されたい。特定の他の実施形態では、出願人はＰａｍｙＬ－３（配列番号６６）及びＰａｍｙＬ－４（配列番号６７）と名付けた合成（ハイブリッド）プロモーター領域を構築し、ハイブリッドＰａｍｙＬ－３プロモーター領域（配列番号６６）は天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８５）に作動可能に連結された天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８２）を含み、ハイブリッドＰａｍｙＬ－４プロモーター領域（配列番号６７）は、天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ５’－ＵＴＲ配列（配列番号８５）に作動可能に連結された改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター配列（配列番号８３）を含む。例えば、図５の核酸配列アラインメントに示すように、推定転写開始部位（ＴＳＳ）は太字ヌクレオチドで示し、その後にイタリック体ヌクレオチドで示された５’－ＵＴＲ配列が続き、二重下線を引いた「Ｇ」ヌクレオチドはＰａｍｙＬ－４に対するＰａｍｙＬ－３のＴＳＳの可視化を補助する。
したがって、実施例６に一般的に記載するように、異種（トランケート型）プルラナーゼ発現カセットをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入した。より具体的には、（トランケート型）プルラナーゼ発現カセットをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入し、細胞は、（ａ）天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域（すなわち、ＰａｍｙＬ－１；配列番号６４）の制御下にある発現カセット、（ｂ）改変プロモーター領域ＰａｍｙＬ－２（配列番号６５）の制御下にある発現カセット、（ｃ）改変プロモーター領域ＰａｍｙＬ－３（配列番号６６）の制御下にある発現カセット、又は（ｄ）改変プロモーター領域ＰａｍｙＬ－４（配列番号６７）の制御下にある発現カセットを含んだ。例えば、実施例６に記載するように、ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット（配列番号７８）の配列が確認されたカセットを有するコロニーをストリーク精製し、保存し、「ＰａｍｙＬ－Ｐｕｌｌｔｒ」と命名し、ＰａｍｙＬ－２プルラナーゼカセット（配列番号７９）の配列が確認されたカセットを有するコロニーをストリーク精製し、保存し、「ＬＤＮ４６１」と命名し、ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセット（配列番号８０）の配列が確認されたカセットを有するコロニーをストリーク精製し、保存し、「ＬＤＮ４６２」と命名し、ＰａｍｙＬ－４プルラナーゼカセット（配列番号８１）の配列が確認されたカセットを有するコロニーをストリーク精製し、保存し、「ＬＤＮ４６３」と命名した。
より詳細には、実施例７にさらに記載するように、出願人は導入された（トランケート型）プルラナーゼ発現カセットを含むバチルス細胞（株）をアッセイして、これらの異なるプロモーター領域がこのような異種プルラナーゼタンパク質産生に及ぼす影響を決定した。例えば、実施例７に示したデータは、ＰａｍｙＬ－２プルラナーゼカセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（配列番号７９；例えば、ＬＤＮ４６１株）が、ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（配列番号７８；ＰａｍｙＬ－Ｐｕｌｌｔｒ．株）よりも平均７８％多いプルラナーゼを産生したことを示す。同様に、実施例７に示したデータは、ＰａｍｙＬ－４プルラナーゼカセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（配列番号８１；ＬＤＮ４６３株）が、ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株（配列番号８０；ＬＤＮ４６２株）よりも平均１６％多いプルラナーゼを産生したことを示す。
したがって、本明細書に一般的に記載するように、本開示の特定の実施形態は、タンパク質産生増加表現型などを有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を作製／構築するための組成物及び方法に関する。
ＩＶ．分子生物学
上で一般的に述べたように、本開示の特定の実施形態は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞に関する。より詳細には、特定の他の実施形態は、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞、並びにタンパク質生産性増加表現型などを有するそのような改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を作製及び構築するためのその方法に関する。したがって、特定の他の実施形態は、１つ以上の遺伝子改変を含む（すなわち、親細胞に対して）、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞の変異体に関する。
本明細書に提示するように、このような新規プロモーター（核酸）配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞における目的のタンパク質をコードする遺伝子又はＯＲＦの発現に特に有用である。他の実施形態は、その新規発現カセット内に含まれる新規プロモーター（核酸）配列に関する。したがって、特定の他の実施形態は、その中に導入された１つ以上の異種発現コンストラクトを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。特定の他の実施形態は、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞により産生される、単離された目的のタンパク質（ＰＯＩ）に関する。したがって、特定の実施形態では、１つ以上のプロモーター配列は、ＰＯＩをコードする遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている。特定の他の実施形態では、この１つ以上のプロモーター配列は、上流（５’）にヌクレオチドをさらに含み、それに作動可能に連結されている。他の実施形態では、遺伝子又はＯＲＦは、下流（３’）にヌクレオチドをさらに含み、それに作動可能に連結されている。
したがって、本開示の特定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を（例えば、遺伝子、ＯＲＦ、プロモーター、ターミネーター、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲなどにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、及び／又は除去におり）遺伝子的に改変するための方法を対象とする。したがって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を遺伝子的に改変するための方法には、（ａ）所与の核酸配列における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、及び／若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子下方制御、（ｆ）Ｃａｓ９媒介編集、（ｇ）部位特異的変異誘発、並びに／又は（ｈ）ランダム変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。したがって、特定の実施形態では、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、当該分野でよく知られた方法、例えば、目的ポリヌクレオチド配列における挿入、破壊、置換、又は欠失などを使用して改変される。
例えば、特定の実施形態では、改変対象の遺伝子の一部は、コーディング領域、又はコーディング領域の発現に必要とされる調節エレメントであり得る。特定の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種核酸配列（例えば、遺伝子、ＯＲＦ、プロモーター、５’－ＵＴＲなど）は、当該技術分野で知られた方法を使用して改変される。特定の実施形態では、プロモーター（核酸）配列は、当該技術分野で知られた方法を使用して改変される。他の実施形態では、天然バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来するプロモーターは、当該技術分野で知られた方法を使用して改変される。特定の他の実施形態では、本開示のバリアントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロモーターは、合成配列（例えば、ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター；配列番号４０）である。
したがって、特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が減少した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子にフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するように構築されているプラスミドを用い、相同組み換えによって遂行され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で樹立されることを可能にする許容温度で第２の選択可能マーカーと会合しているｐＥ１９４などの感温性プラスミドでバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入され得る。細胞はその後、相同フランキング領域の１つで染色体内に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択するために非許容温度へシフトされる。プラスミドを組み込むための選択は、第２の選択可能マーカーの選択によって実施される。組み込み後、第２の相同フランキング領域での組み換え事象が、選択せずに細胞を数世代にわたり許容温度へシフトすることによって刺激される。細胞をプレーティングして単一コロニーを得、このコロニーを両方の選択可能マーカーの消失について試験する（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３を参照）。したがって、当業者は、完全又は部分的欠失に好適な遺伝子のコーディング配列及び／又は遺伝子の非コーディング配列中のヌクレオチド領域を容易に同定し得る。
他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、それらの転写又は翻訳に必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入するか、置換するか、又は除去することによって構築される。例えば、本明細書に記載するように、本開示の特定の改変プロモーター（核酸）配列は、ヌクレオチド置換（例えば、ヌクレオチド位３０、８９、９０及び９１）を含む。このような改変は、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発などの当該技術分野で知られた手法により、当該技術分野で知られた方法にしたがって実施され得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９及びＳａｒｋａｒ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照）。
別の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照）。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列をインビトロで変異させて欠陥のある核酸配列を生成し、次いで、この核酸配列を親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換して欠陥のある遺伝子を生成する。相同組み換えによって、欠陥のある核酸配列が内因性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片がまた、欠陥のある遺伝子を含有する形質転換体の選択に使用され得るマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合している非複製プラスミド又は感温性プラスミドで導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミド複製を許容しない条件下でそのマーカーを選択することによって実施される。遺伝子置換をもたらす第２の組み換え事象の選択は、選択可能マーカーの消失及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調査することによって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。或いは、欠陥のある核酸配列は、以下に記載するように、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠失を含有し得る。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集によって作製／構築される。例えば、本開示のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロモーター配列は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆ１又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）に結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって編集（又は、破壊、欠失、下方制御）され得、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化されたＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、提供された編集鋳型と組み換えて、プロモーター配列を改変し得る（例えば、実施例１を参照）。したがって、例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（この目的のためには、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）、又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これによりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、目的プロモーターに固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。例えば、目的標的の標的プロモーター部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡコンストラクトを構築するためには、可変標的化ドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’側にある標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組合せは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。
例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化プロモーターの約５００ｂｐの上流（５’）は、編集鋳型を生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの下流（３’）に融合させることができ、その鋳型は、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の機構によって使用される。Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、生来のコンピテンス又は誘導されたコンピテンス）を使用して細胞に同時に送達され得る。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることによる、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、これらの断片は、編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマーを使用して配列決定される。
さらに他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、化学的変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照）を含むがそれらに限定されない当該技術分野においてよく知られる方法を使用して、ランダム変異誘発又は特異的変異誘発によって構築される。遺伝子又はプロモーターの改変は、親細胞に変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が変更されている変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。特異的であってもランダムであってもよい変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることによって実施され得る。さらに、変異誘発は、これらの変異誘発法を任意に組み合わせることにより実施され得る。
本発明の目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。このような薬剤を使用する場合、変異誘発は、一般的には、好適な条件下で最適な変異誘発剤の存在下で変異誘発対象の親細胞をインキュベートするステップ、及び遺伝子の減少した発現を示す、又は発現を示さない変異細胞を選択するステップによって実施される。
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレット（参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を迂回するためにＰＣＲ融合を使用する、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡコンストラクトの作成などの、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示している。国際公開第２００２／１４４９０号パンフレット（参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）は、（１）組み込みプラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コーディング配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム変異誘発、（３）相同組み換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することにより形質転換効率を増大させること、（５）二重交差組み込みを最適化すること、（６）部位特異的変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示する。
当業者は、細菌細胞にポリヌクレオチド配列を導入するための好適な方法をよく知っている（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６７；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，１９８５；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８１及びＭｃＤｏｎａｌｄ，１９８４を参照）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入、並びにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法が知られており、本開示における使用に適している。形質転換法は、本開示のＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入するのに特に好ましい。
一般に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、直接的に形質転換させられる（すなわち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡコンストラクトを増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために中間細胞が使用されない）。ＤＮＡコンストラクトの宿主細胞内への導入には、プラスミド又はベクター内へ挿入することなく、ＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当該技術分野において知られるそれらの物理的及び化学的方法が含まれる。このような方法としては、以下に限定されないが、塩化カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、裸のＤＮＡ法、リポソーム法などが挙げられる。追加の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換される。さらなる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において知られる方法によって改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から欠失、又は実質的に切除される（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。いくつかの実施形態では、宿主染色体由来のベクターの分解は、染色体内のフランキング領域を残すが、一方、固有の染色体領域を除去する。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において広範囲の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製する方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。
Ｖ．目的のタンパク質の産生のためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の培養
本開示の他の実施形態では、本明細書において構築され且つ記載されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞は、タンパク質生産性増強表現型を含む。より具体的には、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、親細胞及び娘細胞が同じ条件下で培養される場合、由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、タンパク質生産性が増強された表現型を含む。したがって、本開示の特定の実施形態は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）を発現／産生する方法に関し、この方法、一般に、そのような細胞を発酵／培養することを含む。
本開示の改変及び未改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を発酵させるために、当該技術分野でよく知られた発酵方法を適用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で培養される。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく醗酵を行わせる。一般に、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御することは頻繁に行われる。バッチ系の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。一般的なバッチ培養では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少又は停止する静止期に進み得る。処理しない場合、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。一般的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系では、実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、知られている。
連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野においてはよく知られている。
したがって、特定の実施形態では、形質転換（改変）宿主細胞によって産生されたＰＯＩは、従来の手順、例えば、宿主細胞を培地から遠心分離若しくは濾過によって分離する、又は必要であれば、細胞を破壊し、上清を細胞破砕物及び細胞片から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。一般的には、清浄化後、上清又は濾液のタンパク質成分を、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって沈澱させる。次いで、沈澱したタンパク質を可溶化させ、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などの様々なクロマトグラフィー法により精製してもよい。
ＶＩ．改変細胞によって産生される目的のタンパク質
前セクションで簡単に述べたように、本発明の細胞、株、ポリヌクレオチド、プロモーター、発現コンストラクト及びそれらの方法は、商業的に重要なタンパク質の産生に使用される。本開示の目的のタンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内因性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩのバリアントであってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質である、すなわち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、好ましくは目的の特性を備えるタンパク質である。
例えば、特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞はそれが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して増加したタンパク質力価を含み、ここで、タンパク質力価は、体積当たりのタンパク質の量（ｇ／Ｌ）と定義される。例えば、力価は、当該技術分野において知られた方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ブラッドフォードアッセイ、ＬＣ／ＭＳなど）によって測定することができる。したがって、特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、又は少なくとも約１０％若しくはそれ以上のタンパク質力価の増加を含む。
特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、増加した体積生産性を示し、ここで、体積生産性は、総発酵時間（ｈ）当たりのバイオリアクターの公称体積（Ｌ）当たりの発酵中に産生されるタンパク質の量（ｇ）と定義される。例えば、体積生産性は、当該技術分野において知られた方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、ブラッドフォードアッセイ、ＬＣ／ＭＳなど）によって測定することができる。したがって、特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、又は少なくとも約１０％若しくはそれ以上の体積生産性の増加を含む。
特定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、増加した全タンパク質収率を示し、ここで、全タンパク質収率は、供給された炭水化物の１グラム当たりの産生されたタンパク質の量（ｇ）と定義される。したがって、本明細書で使用する場合、全タンパク質収率（ｇ／ｇ）は、下記の方程式：
Ｙｆ＝Ｔｐ／Ｔｃ
（式中、「Ｙｆ」は全タンパク質収率（ｇ／ｇ）であり、「Ｔｐ」は発酵中に産生した全タンパク質（ｇ）であり、及び「Ｔｃ」は発酵（バイオリアクター）作動中に供給された全炭水化物（ｇ）である）を使用して計算することができる。特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞の全タンパク質収率の増加は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、又は少なくとも約１０％若しくはそれ以上の増加である。
全タンパク質収率はまた、例えば、全タンパク質中に組み込まれる供給された炭素のパーセンテージ（％）として、炭素変換効率／炭素収率として記載することができる。したがって、特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞はそれが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、増加した炭素変換効率（例えば、全タンパク質中に組み込まれる供給される炭素のパーセンテージ（％）の増加）を含む。特定の実施形態では、改変細胞の炭素変換効率の増加（すなわち、親細胞と比較して）は、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、又は少なくとも約１０％若しくはそれ以上の増加である。
特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、ＰＯＩの増加した比生産性（Ｑｐ）を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）の検出は、タンパク質の生産率を評価するために好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中に産生されるタンパク質のグラムであり、「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラムであり、「ｈｒ」は、接種時点からの発酵時間（時間）であり、これは、産生時間及び増殖時間を含む）を使用して決定することができる。したがって、特定の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞は、それが由来する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、又は少なくとも約１０％若しくはそれ以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはそのバリアントＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組合せからなる群から選択される。
特定の実施形態では、ＰＯＩ又はそのバリアントＰＯＩは、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５又はＥＣ６からなる群から選択される酵素委員会（ＥＣ）番号から選択される。
例えば、特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ－乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１－脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ－リポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｚｙｇｅｎａｓｅ））、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。
特定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｓｕｃｒａｓｅ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α－グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４－α－グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２－β－オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２－α－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］－アデニリル－Ｌ－チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール－エステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸ヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セルチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３－フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル－フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ－１，６－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド－１，６－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α－１，６－グルカン－６－グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα－１，２－グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ－アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α－グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド－１，６－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β－アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β－フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４－β－キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド－１，３－β－Ｄ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α－Ｌ－ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α－Ｌ－フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α－Ｎ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド－１，３－α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４－α－ガクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１－β－Ｄ－フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド－１，６－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２－（１，３）－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ－フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ－ポリ－α－ガラクツロニシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ－カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド－１，４－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４－β－セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル－グリコプロテインエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド－１，５－α－Ｌ－アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル－ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル－ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコールペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ－アシル－脂肪族－Ｌ－アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質－Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド－Ｎ（４）－（Ｎ－アセチル－β－グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ－アシル－Ｄ－アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．－（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。
特定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１－エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）－α－Ｄ－グルカン１－α－Ｄ－グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。
さらに他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４－クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ－アミノ酸α－リガーゼ）から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。
本発明の菌株及び方法のこれらや他の態様及び実施形態は、本明細書及び下記の実施例に照らせば、当業者には明白になるであろう。
本発明の特定の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができるが、それらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。
実施例１
ａｐｒＥ Ｃａｓ９ターゲティングベクターの構築
Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ、「ＡＰＫＫＫＲＫＶ」；配列番号２）、Ｃ末端ＮＬＳ（「ＫＫＫＫＬＫ」；配列番号３）及びデカ－ヒスチジンタグ（「ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ」；配列番号４）を含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド（配列番号１）を、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーター（Ｐ－ａｐｒＥ）（配列番号５）に作動可能に連結し、製造業者の使用説明書にしたがってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、以下の表１に示すフォワード（配列番号６）及びリバース（配列番号７）プライマー対を用いて増幅した。
Figure 2022509215000002
プラスミドｐＫＢ３２０（配列番号９）の骨格（配列番号８）を、製造業者の使用説明書にしたがってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、以下の表２に示すフォワード（配列番号１０）及びリバース（配列番号１１）プライマー対を用いて増幅した。
Figure 2022509215000003
ＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏ ｃｌｅａｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ５カラムを製造業者の使用説明書にしたがって使用して精製した。続いて、２つの断片を等モル比で混合するＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、長時間オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＰＯＥ－ＰＣＲ）により、ＰＣＲ産物を組み立てた。以下のＰＯＥ－ＰＣＲ反応サイクルを実行した：９８℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で４分１５秒間を３０サイクル。５μｌのＰＯＥ－ＰＣＲ（ＤＮＡ）を、製造業者の使用説明書にしたがってＴｏｐ１０ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有し、１．５％寒天で固化させた溶原（Ｌ）培地（Ｍｉｌｌｅｒ処方；１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％酵母抽出物（ｗ／ｖ）、１％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ））で選択した。コロニーを３７℃で１８時間増殖させた。コロニーを採取し、Ｑｉａｐｒｅｐ ＤＮＡミニプレップキットを製造業者の使用説明書にしたがって使用してプラスミドＤＮＡを調製し、５５μｌのｄｄＨ２Ｏ中に溶出した。このプラスミドＤＮＡについてサンガーシーケンシングを行い、以下の表３に示すシーケンシングプライマー（配列番号１２～２０）を使用して、正しい組み立てを確認した。
Figure 2022509215000004
正しく組み立てられたプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２１）を使用して、中間体プラスミドｐＲＦ７４８（配列番号２２）を組み立てた。プラスミドｐＲＦ７４８の構築は、中断された合成ｇＲＮＡカセットをプラスミドｐＲＦ６９４のＮｃｏＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングすることによって作製した。このカセットは、ＩＤＴによって合成的に産生され、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）、合成ダブルターミネーター（配列番号２４）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｐｓＬ遺伝子（配列番号２５）、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（配列番号２６）をコードするＤＮＡ、及びラムダファージＴ０ターミネーター（配列番号２７）を含む。
ＲＮＡ発現カセットを含むＤＮＡ断片を、標準的な分子生物学的技術を用いてｐＲＦ６９４に組み入れてプラスミドｐＲＦ７４８を生成し、Ｃａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルプラスミドを生成することができる。
中間体プラスミド、ｐＲＦ７４８を用いて、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ遺伝子座に発現カセットを導入するためのプラスミドを組み立てた。より詳細には、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ遺伝子座におけるｙｈｆＮ遺伝子（配列番号２８）はＣａｓ９標的部位（配列番号２９）を含む。標的部位は、ＰＡＭ配列（配列番号３１）を除去することによって、可変標的化（ＶＴ）ドメイン（配列番号３０）をコードするＤＮＡ配列に変換され得る。ＶＴドメイン（配列番号３０）をコードするＤＮＡ配列は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによって転写された場合に機能性ｇＲＮＡ（配列番号３２）を産生するように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ；配列番号２６）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に融合され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号３３）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において作動可能なプロモーター（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター；配列番号３９）、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ラムダファージｔ０ターミネーター；配列番号２６）に作動可能に連結され得、その結果、プロモーターはｇＲＮＡをコードするＤＮＡの５’側に位置し、ターミネーターはｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’側に位置し、ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号３４）が作製される。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｙｈｆＮ遺伝子（配列番号３６）を標的とするプラスミドｐＲＦ７９３（配列番号３５）を、製造者の使用説明書にしたがってＱ５を使用し、表４に示すフォワード（配列番号３７）及びリバース（配列番号３７）プライマー対を用いてプラスミドｐＲＦ７４８（配列番号２２）を増幅することにより作製した。
Figure 2022509215000005
これらのプライマーは、５’及び３’末端が重複し、ｙｈｆＮ可変ターゲッティングドメインを含む断片を作製するｇＲＮＡの可変ターゲッティング領域を除いて、プラスミド全体（ｐＲＦ７４８）を増幅する。このＰＣＲ産物を、製造業者の使用説明書にしたがってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて分子内集合反応に使用して、プラスミドｐＲＦ７９３（配列番号３５）を作製し、Ｃａｓ９発現カセット及びｙｈｆＮを標的とするｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセットを含むＥ．コリ（Ｅ，ｃｏｌｉ）－Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルプラスミドを生成した。
実施例２
例示的な発現カセットを含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞の生成
本実施例では、出願人はプロテアーゼ発現カセット（例えば、例示的なＰＯＩ）をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞に導入した。より具体的には、発現カセットは、（１）（２ａ）天然Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）をコードするＤＮＡ配列又は（２ｂ）その改変ｒｒｎＩｐ２配列（本明細書では、「ｒｒｎＩｐ２－１プロモーターと命名）（配列番号４０）（これらの天然及び改変プロモーターＤＮＡ配列は（３）成熟（サブチリシン）プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている）に作動可能に連結された、ｙｈｆＮ遺伝子の上流（５’）のフランキング領域に相同なＤＮＡ配列（配列番号３９）を含み、このＤＮＡ配列は（４）Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ａｐｒターミネーター配列（配列番号４１）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に融合されており、ここで、プロモーターはプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の５’側に位置し、ターミネーターはプロテアーゼをコードするＤＮＡの３’側に位置した。最後に、上に示した発現カセットを、ｙｈｆＮ遺伝子の下流（３’）のフランキング領域に相同なＤＮＡ配列（配列番号４２）に作動可能に融合した。
したがって、本実施例では、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｃｏｍＫ遺伝子（配列番号４４；ＰｘｙｌＡ誘導性プロモーターを用いてａｍｙＥ遺伝子座に導入）を含む親Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、１２５ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、１５ｍｌのＬ培地（１ｗ・ｖ－１％トリプトン、０．５％酵母抽出物ｗ・ｖ－１、１％ＮａＣｌ ｗ・ｖ－１）中、３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養した物を、１２５ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、１０ｍｌの新鮮なＬ培地で０．２（ＯＤ６００単位）に希釈した。
培養物が３７℃（２５０ＲＰＭ）で０．９（ＯＤ６００単位）に達するまで、細胞を増殖させた。Ｄ－キシロースを、３０％（ｗ／ｖ）のストックから、０．３％（ｗ／ｖ）に加えた。細胞を３７℃（２５０ＲＰＭ）でさらに２．５時間増殖させ、７分間にわたり１７００×ｇでペレット化した。細胞を、使用済み培地を使用して元の培養の４分の１量に再懸濁させた。１００μｌの濃縮細胞を、（ａ）天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）を含むプロテアーゼ発現カセット、又は（ｂ）実施例１に記載の改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）及びｐＲＦ７９３プラスミド（配列番号３４）を含むプロテアーゼ発現カセット約１μｇと混合し、ローリングサークル増幅（Ｓｙｎｇｉｓ）を製造者の使用説明書にしたがって用いて、１８時間増幅した。細胞／ＤＮＡ形質転換混合物を、１０μｇ／ｍＬカナマイシン、１．６％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有し、１．５％（ｗ／ｖ）寒天で固化させたＬ培地（ｍｉｌｌｅｒ）にプレーティングした。３７℃でコロニーを形成させた。
カナマイシン及びスキムミルクを含有するＬ寒天上で増殖し、コロニーに隣接する領域に目に見える透明ゾーンを生成したコロニー（すなわち、タンパク質分解活性を示す）を採取し、１．６％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有する寒天プレート上にストリークした。天然ｒｒｎＩｐ２プロモーターを有するプロテアーゼ発現カセットを含むコロニーを保存し、「ＳＳ０６６」株と命名した。改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーターを有するプロテアーゼ発現カセットを含むコロニーを保存し、「ＳＳ０６５」株と命名した。
実施例３
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における改変プロモーターの制御下でのプロテアーゼ発現
本実施例では、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）又は改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）を有するプロテアーゼ発現カセットを含む２種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（すなわち、ＳＳ０６６株及びＳＳ０６５株）を、小規模条件下でのプロテアーゼ産生について評価した。これらの２種の株を、１．６％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含有するＬ寒天プレート上でストリーク精製し、約２４時間にわたり３７℃で増殖させた。単一のハロー陽性コロニーを２５ｍｌのＬ培地（１％ｗ・ｖ－１トリプトン、０．５％酵母抽出物ｗ・ｖ－１、１％ＮａＣｌｗ・ｖ－１）に接種し、３７℃（２５０ｒｐｍ）で５時間増殖させた。この前培養物を、２５ｍｌのＭＰＳ２培地（１０％ｗ・ｖ－１１０×ＭＯＰＳベースの培地（８．４％ｗ・ｖ－１ＭＯＰＳ、２．９％ｗ・ｖ－１塩化ナトリウム、１．２％ｗ・ｖ－１水酸化カリウム、１％ｗ・ｖ－１硫酸カリウム、１５ｗ・ｖ－１塩化マグネシウム、０．７％ｗ・ｖ－１トリシン）；１０％ｗ・ｖ－１ＭａｌｔｒｉｎＭ１５０、１０％ｗ・ｖ－１微量栄養素；６％ｗ・ｖ－１ソイトン、０．７８％ｗ・ｖ－１リン酸二カリウム、０．３％ｗ・ｖ－１尿素、０．２％リン酸一カリウム、水酸化カリウムでｐＨ７．４）中、０．２（ＯＤ６００単位）に希釈し、３７℃（２５０ＲＰＭ）で増殖させた。１リットル中、４００ｍｇのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ２、及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムの１００×ストック溶液として、微量栄養素を調製した。４０時間の増殖後、全細胞培地中のプロテアーゼ濃度を、ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡアッセイを用いて決定した。
例えば、ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡプロテアーゼアッセイは、全培養培地を規定の条件下で発色性ペプチド基質と共にインキュベートし、発色を測定することを含む。基質はＮ－スクシニル－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｈｅ－ｐ－ニトロアニリド（ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ）である。プロテアーゼによるペプチド基質の加水分解の際に、４－ニトロアニリドが切断され、黄色発色団である４－ニトロアニリンを生じる。したがって、４０５ｎｍでの吸光度を測定し、分析試料中のプロテアーゼレベルに直接相関させる。この一連のアッセイに使用される装置には、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ＭＴＰリーダー（３４０型分子デバイス）が含まれる。より詳細には、このアッセイシステムでは、以下の試薬及び溶液を用いた：（１）Ｎ－スクシニル－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ａｌａ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｈｅ－ｐ－ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ）；（２）希釈緩衝液：１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０緩衝液、ｐＨ８．６；及び（３）トリス緩衝液：１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０緩衝液、ｐＨ８．６。
したがって、１００ｍｇのｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ基質を含有するバイアルを、１ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、１ｍｌのｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡを１００ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液に添加することによって１ｍｇ／ｍＬの作業ストックを調製した。プロテアーゼ試料（全細胞培地）を希釈緩衝液で１０００×希釈した。アッセイは、１０μｌの希釈プロテアーゼ溶液をＭＴＰのウェルに入れ、続いて１ｍｇ／ｍｌの作業用ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ基質溶液１９０μｌを添加することによって行った。溶液を混合し、吸光度をＭＴＰ－リーダーで（λ）４０５ｎｍで読み取った。非プロテアーゼ対照を使用して、バックグラウンド吸光度値を補正した。プロテアーゼ濃度（ｍｇ／Ｌ）を計算するために、精製（バリアント）プロテアーゼの希釈系列を標準（対照試料）として使用し、実験に組み込んだ。相対プロテアーゼ活性を以下の表５に示すが、ＳＳ０６５細胞（改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーターを含む）のＳＳ０６６細胞（天然ｒｒｎＩｐ２プロモーターを含む）に対する（正規化）相対プロテアーゼ発現を示し、プロテアーゼ活性が約２倍に増加したことが示された。
Figure 2022509215000006
実施例４
異種アミラーゼ発現カセットのバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞への導入
本実施例では、（異種）α－アミラーゼ発現カセットを親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入した。より具体的には、以下に示すα－アミラーゼ発現カセットをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入した。ここで、細胞は（ａ）天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）の制御下にある発現カセット、又は（ｂ）改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）の制御下にある発現カセットを含んだ。したがって、本実施例では、キシロース誘導性ｃｏｍＫ発現カセットを有するプラスミド（配列番号４３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を、１２５ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン二塩酸塩を含む、１５ｍｌのＬ培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）中、３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養した物を、２５０ｍｌのバッフル付きフラスコにおいて、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン二塩酸塩を含有する２５ｍｌの新鮮なＬ培地で０．７（ＯＤ６００単位）に希釈した。細胞を３７℃及び２５０ＲＰＭで１時間増殖させた。Ｄ－キシロースを２５％（ｗ／ｖ）ストックから０．１％（ｗ／ｖ）に添加し、細胞を３７℃及び２５０ｒｐｍでさらに４時間増殖させた。細胞を１７００・ｇで７分間ペレット化した。細胞を、使用済み培地を使用して元の培養の４分の１量に再懸濁させた。１００μｌの濃縮細胞を、約１μｇの（ａ）天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター発現コンストラクト（配列番号４４）又は（ｂ）改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター発現コンストラクト（配列番号４５）と混合した。
例えば、各カセットは、（５’から３’方向に）同じ５’ｌｙｓＡ遺伝子座相ホモロジーアーム（配列番号４６）、改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号４７）に作動可能に連結された天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（配列番号３９）又は改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（配列番号４０）を含む。より詳細には、配列番号４７の改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲは、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９４７０号（２０１８年９月０５日出願；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。さらに、改変５’－ＵＴＲを、ｌａｔシグナル配列（配列番号４８）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結し、続いて、３’ｌｙｓＡ遺伝子座ホモロジーアーム（配列番号５１）に連結されたｌａｔターミネーター配列（配列番号５０）に作動可能に連結された（バリアント）サイトファーガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種α－アミラーゼをコードするＤＮＡ配列（配列番号４９）に作動可能に連結した。
形質転換反応物を３７℃、１４００ＲＰＭで９０分間インキュベートした。細胞を１％（ｗ／ｖ）ＫＣｌで２回洗浄し、１％（ｗ／ｖ）不溶性デンプンを含むＴＳＳ寒天（５０ｍＭトリス、３７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ ｐＨ７．４、０．５％（ｗ／ｖ）デキストロース、１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００４％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ３、０．００４％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム）上にプレーティングした。形質転換体を３７℃で回収した。
ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼ（配列番号４４）及びｒｒｎＩｐ２－１＿α－アミラーゼ（配列番号４５）発現カセットのハロー陽性形質転換体を、１％（ｗ／ｖ）不溶性デンプンを含有するＬ寒天上でストリーク精製して、単一コロニーに精製した。精製されたハロー陽性コロニー中の発現カセットの配列を、表６に示すプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ技術を用いて発現カセットを増幅することによって決定した。
Figure 2022509215000007
ＰＣＲ産物を標準的な技術を用いてサンガーシーケンシングし、表７に記載のプライマーを用いて発現カセットの配列を確認した。
Figure 2022509215000008
ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼカセット（配列番号４４）の配列が確認されたカセットを有するコロニーを保存し、「ＢＦ３９９」と命名し、ｒｒｎＩｐ２－１＿α－アミラーゼカセット（配列番号４５）の配列が確認されたカセットを有するコロニーを保存し、「ＢＦ４０１」と命名した。
実施例５
アミラーゼ発現カセットを含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における異種アミラーゼ産生
本実施例では、出願人は、実施例４に記載のα－アミラーゼ発現カセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株をアッセイした。したがって、以下の表８に示すように、天然ｒｒｎＩｐ２プロモーター（すなわち、ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼカセット；配列番号４４）及び改変ｒｒｎＩｐ２－１プロモーター（すなわち、ｒｒｎＩｐ２－１＿α－アミラーゼカセット；配列番号４５）のα－アミラーゼ産生について試験して、これらの異なるプロモーターがこのような異種タンパク質産生に及ぼす影響を決定した。
Figure 2022509215000009
株を、１％（ｗ／ｖ）不溶性デンプンを含む１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ寒天で固化させたＬ培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）上にストリークし、３７℃で２４時間増殖させた。単一コロニーを、４つの独立したＴＳＢ（２％（ｗ／ｖ）非動物起源ペプトン、０．２５％（ｗ／ｖ）デキストロース、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｋ２ＨＰＯ４）に接種した。培養物を、３７℃、２５０ｒｐｍ及び８０％湿度で２４時間増殖させた。培養物を４０００ＲＰＭで７分間ペレット化した。１０μｌの清澄化した各培養上清を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）スタンダードを使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法を二連で使用して、全タンパク質産生を測定した。各株の相対アミラーゼ産生を、ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼカセット（配列番号４４）を含む株に対する能力によって決定した。より詳細には、天然（プロモーター）ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼカセット（配列番号４４）又は改変（プロモーター）ｒｒｎＩｐ２＿１＿α－アミラーゼカセット（配列番号４５）を含む株の相対産生を下記の表９に示すが、そのデータは、改変ｒｒｎＩｐ２－１＿α－アミラーゼカセット（配列番号４５）を含む株が天然ｒｒｎＩｐ２＿α－アミラーゼカセット（配列番号４４）を含む株よりも平均３０％多くアミラーゼを産生することを示す。
Figure 2022509215000010
実施例６
異種プルラナーゼ発現カセットのバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞への導入
本実施例では、異種（トランケート型）プルラナーゼ発現カセットをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入した。より具体的には、以下に示すトランケート型プルラナーゼ発現カセットをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に導入し、細胞は、（ａ）天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーター領域（すなわち、ＰａｍｙＬ－１；配列番号６４）の制御下にある発現カセット、（ｂ）改変プロモーター領域ＰａｍｙＬ－２（配列番号６５）の制御下にある発現カセット、（ｃ）改変プロモーター領域ＰａｍｙＬ－３（配列番号６６）の制御下にある発現カセット、又は（ｄ）改変プロモーター領域ＰａｍｙＬ－４（配列番号６７）の制御下にある発現カセットを含んだ。
したがって、本実施例では、キシロース誘導性ｃｏｍＫ発現カセットを有するプラスミド（配列番号４３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を、１２５ｍｌバッフル付きフラスコにおいて、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン二塩酸塩を含む、１５ｍｌのＬ培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）中、３７℃及び２５０ＲＰＭで一晩増殖させた。一晩培養した物を、２５０ｍｌのバッフル付きフラスコにおいて、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン二塩酸塩を含有する２５ｍｌの新鮮なＬ培地で０．７（ＯＤ６００単位）に希釈した。細胞を３７℃及び２５０ＲＰＭで１時間増殖させた。Ｄ－キシロースを２５％（ｗ／ｖ）ストックから０．１％（ｗ／ｖ）に添加し、細胞を３７℃及び２５０ｒｐｍでさらに４時間増殖させた。細胞を１７００・ｇで７分間ペレット化した。細胞を、使用済み培地を使用して元の培養の４分の１量に再懸濁させた。１００μｌの濃縮細胞を、約１μｇのＰａｍｙＬ－１発現カセット（配列番号７８）、ＰａｍｙＬ－２発現カセット（配列番号７９）、ＰａｍｙＬ－３発現カセット（配列番号８０）、又はＰａｍｙＬ－４発現カセット（配列番号８１）と混合した。
例えば、各カセットは、（５’から３’方向に）同じ５’ｌｙｓＡ遺伝子座ホモロジーアーム（配列番号４６）、ｌａｔシグナル配列（配列番号４８）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）プロモーター領域ＰａｍｙＬ－１（配列番号６４）、又は改変プロモーター領域配列ＰａｍｙＬ－２（配列番号６５）、ＰａｍｙＬ－３（配列番号６６）若しくはＰａｍｙＬ－４（配列番号６７）の１つ、続いて、３’ｌｙｓＡ遺伝子座ホモロジーアーム（配列番号５１）に連結されたｌａｔターミネーター配列（配列番号５０）に作動可能に連結されたトランケート型成熟Ｂ．デラミフィカンス（Ｂ．ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼをコードするＤＮＡ配列（配列番号６８）を含む。
形質転換反応物を３７℃、１４００ＲＰＭで９０分間インキュベートした。細胞を１％（ｗ／ｖ）ＫＣｌで２回洗浄し、０．５％（ｗ／ｖ）レマゾールブリリアントブルーで染色したデンプンを含有するＭｉｎｉｍａｌ寒天（５０ｍＭトリス、３７ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ ｐＨ７．４、０．５％（ｗ／ｖ）デキストロース、１ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００４％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ３、０．００４％（ｗ／ｖ）クエン酸三ナトリウム）上にプレーティングした。形質転換体を３７℃で回収した。
ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット（配列番号７８）、ＰａｍｙＬ－２プルラナーゼカセット（配列番号７９）、ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセット（配列番号８０）及びＰａｍｙＬ－４プルラナーゼカセット（配列番号８１）の形質転換体を、ＨＩ寒天上でストリーク精製して、単一コロニーに精製した。精製されたコロニー中の発現カセットの配列を、表１０に示すプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ技術を用いて発現カセットを増幅することによって決定した。
Figure 2022509215000011
ＰＣＲ産物を標準的な技術を用いてサンガーシーケンシングし、表１１に記載のプライマーを用いて発現カセットの配列を確認した。
Figure 2022509215000012
ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット（配列番号７８）、ＰａｍｙＬ－２プルラナーゼカセット（配列番号７９）、ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセット（配列番号８０）及びＰａｍｙＬ－４プルラナーゼ（配列番号８１）発現カセットの配列が確認されたカセットを有するコロニーをストリーク精製し、保存して、それぞれ「ＰａｍｙＬ－Ｐｕｌｌｔｒ．」、「ＬＤＮ４６１」、「ＬＤＮ４６２」及び「ＬＤＮ４６３」と命名した。
実施例７
トランケート型プルラナーゼ発現カセットを含むバチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞における異種トランケート型プルラナーゼ産生
本実施例では、出願人は、実施例６に記載のトランケート型プルラナーゼ発現カセットを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株をアッセイした。したがって、下記の表１２に示すように、ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット（配列番号７８）及びＰａｍｙＬ－２プルラナーゼカセット（配列番号７９）の（切断型）プルラナーゼの産生について試験して、これらの異なるプロモーター及び５’－ＵＴＲがこのような異種プルラナーゼタンパク質産生に及ぼす影響を決定した。
Figure 2022509215000013
同様に、下記の表１３に示すように、ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセット（配列番号８０）及びＰａｍｙＬ－４プルラナーゼカセット（配列番号８１）の（切断型）プルラナーゼの産生について試験して、これらの異なるプロモーター及び５’－ＵＴＲがこのような異種プルラナーゼタンパク質産生に及ぼす影響を決定した。
Figure 2022509215000014
株を、１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ寒天で固化させたＬ培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）上にストリークし、３７℃で２４時間増殖させた。３つのコロニーをＴＳＢ（２％（ｗ／ｖ））に接種し、３７℃、２５０ＲＰＭで一晩増殖させ、１：１０（ｖ／ｖ）で定義されていないＭＯＰＳ緩衝剤をベースとした培地に移し、３７℃、２５０ＲＰＭで６８時間インキュベートした。培養物を採取し、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（プルラナーゼ／限界デキストリナーゼ分析法（ＰｕｌｌＧ６法））法を用いて全タンパク質産生を測定するために直接使用した。
ＬＤＮ４６１株（ＰａｍｙＬ－２プルラナーゼ；配列番号７９）の相対（切断型）プルラナーゼ産生を、ＰａｍｙＬ－Ｐｕｌｌｔｒ株（ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット；配列番号７８）と比較した能力によって決定した。より詳細には、ＰａｍｙＬ－Ｐｕｌｌｔｒ株（ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット；配列番号７８）及びＬＤＮ４６１株（ＰａｍｙＬ－２プルラナーゼカセット；配列番号７９）の相対産生を以下の表１４に示すが、このデータはＬＤＮ４６１株がＰａｍｙＬ－Ｐｕｌｌｔｒ株（ＰａｍｙＬ－１プルラナーゼカセット；配列番号７８）より平均７８％多くプルラナーゼを産生することを示す。
Figure 2022509215000015
同様に、ＬＤＮ４６３株（ＰａｍｙＬ－４プルラナーゼカセット；配列番号８１）の相対（切断型）プルラナーゼ産生を、ＬＤＮ４６２株（ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセット；配列番号８０）と比較した能力によって決定した。これらの株の相対産生を以下の表１５に示すが、このデータは、ＬＤＮ４６３株（ＰａｍｙＬ－４プルラナーゼカセット）がＬＤＮ４６２株（ＰａｍｙＬ－３プルラナーゼカセット；配列番号８０）よりも平均１６％多く（切断型）プルラナーゼを産生することを示す。
Figure 2022509215000016
参考文献
ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４９４７０号
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレット
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Claims (40)

  1. 配列番号３９に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号３９のヌクレオチド位３０のチミン（Ｔ）、配列番号３９のヌクレオチド位８９のチミン（Ｔ）、配列番号３９のヌクレオチド位９０のグアニン（Ｇ）、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のチミン（Ｔ）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含むプロモーター核酸配列。
  2. 配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも２つの変異を含む、請求項１に記載のプロモーター。
  3. 配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも３つの変異を含む、請求項１に記載のプロモーター。
  4. 配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０のＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴを含む少なくとも４つの変異を含む、請求項１に記載のプロモーター。
  5. 前記プロモーターの下流（３’）に位置し、且つ前記プロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項１に記載のプロモーター。
  6. 配列番号４０、配列番号５８又は配列番号５９を含むプロモーター核酸配列。
  7. 前記プロモーターの下流（３’）に位置し、且つ前記プロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はＯＲＦを含む、請求項６に記載のプロモーター。
  8. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６０とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、配列番号３９の等価なヌクレオチド位３０、８９、９０又は９１に対して、３０、８９、９０又は９１から選択されるヌクレオチド位に少なくとも１つの変異を含む、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
  9. 配列番号４０を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 配列番号５８を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  11. 配列番号５９を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記プロモーターの下流（３’）に位置し、且つ前記プロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記ＰＯＩは酵素である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記酵素はヒドロラーゼである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 請求項１又は請求項６に記載のプロモーターを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞。
  16. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞。
  17. 請求項１に記載のプロモーター、請求項６に記載のプロモーター又は請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
  18. 請求項１７に記載の発現カセットを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞。
  19. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号６０とハイブリダイズする変異プロモーター核酸配列を含む変異体Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞であって、前記変異体プロモーター配列は、配列番号３９の等価なヌクレオチド位３０、８９、９０又は９１に対して、３０、８９、９０又は９１から選択されるヌクレオチド位に少なくとも１つの変異を含む変異体Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞。
  20. （３’）下流５’－ＵＴＲ配列に作動可能に連結された（５’）上流プロモーター配列を含むプロモーター領域核酸配列であって、前記プロモーター配列は、配列番号８２に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８２のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８２のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含むプロモーター領域核酸配列。
  21. 前記５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８４の天然ａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列、又はそのバリアントａｍｙＬ ５’－ＵＴＲ配列である、請求項２０に記載のプロモーター領域核酸配列。
  22. 前記５’－ＵＴＲ配列は、配列番号８５の天然ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列、又はそのバリアントａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列である、請求項２０に記載のプロモーター領域核酸配列。
  23. 配列番号６５を含むプロモーター領域核酸配列。
  24. 配列番号６７を含むプロモーター領域核酸配列。
  25. 前記プロモーター領域の（３’）下流に位置し、且つ前記プロモーター領域に作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項２０、２３又は２４に記載のプロモーター領域。
  26. 配列番号８２のヌクレオチド配列を含む天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーターに由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙＬプロモーターであって、配列番号８２に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８２のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８２のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を含む改変プロモーター。
  27. 前記プロモーターの（３’）下流に位置し、且つ前記プロモーターに作動可能に連結された目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、請求項２６に記載のプロモーター。
  28. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６５又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
  29. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号６７又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
  30. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号８３又はその相補配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
  31. 請求項２０、２３又は２４に記載のプロモーター領域を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞。
  32. 配列番号８３の改変プロモーターを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞。
  33. 請求項２０、２３又は２４に記載のプロモーター領域を含む発現カセット。
  34. 請求項２６に記載のプロモーターを含む発現カセット。
  35. 改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強方法であって、
    （ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、前記カセットは、ＰＯＩをコードする遺伝子又はＯＲＦの上流（５’）に位置し、且つそれに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、前記プロモーターは、配列番号３９に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号３９のヌクレオチド位３０のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位８９のＴ、配列番号３９のヌクレオチド位９０におけるＧ、及び配列番号３９のヌクレオチド位９１のＴからなる群から選択される少なくとも１つの改変を含む工程と、
    （ｂ）前記導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の改変細胞を前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、
    前記工程（ｃ）の改変細胞は、同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦの上流（５’）に位置し、且つそれに作動可能に連結されたプロモーター配列を含むポリヌクレオチド発現カセットを含み、前記プロモーターは配列番号３９を含む、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、前記ＰＯＩをより多く産生する方法。
  36. 改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強方法であって、
    （ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、前記カセットは、配列番号６５に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を有する上流プロモーター領域を含み、前記上流プロモーター領域は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている工程と、
    （ｂ）前記導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の改変細胞を前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、
    前記工程（ｃ）の改変細胞は、配列番号６５に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にアデニン（Ａ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にチミン（Ｔ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にグアニン（Ｇ）を有する上流プロモーター領域を含む導入されたポリヌクレオチド発現カセットを含み、前記上流プロモーター領域は、同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、前記ＰＯＩをより多く産生する方法。
  37. 改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強方法であって、
    （ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、前記カセットは、配列番号６７に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を有する上流プロモーター領域を含み、前記上流プロモーター領域は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている工程と、
    （ｂ）前記導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の改変細胞を前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、
    前記工程（ｃ）の改変細胞は、配列番号６７に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号６５のヌクレオチド位７２にアデニン（Ａ）、配列番号６５のヌクレオチド位７３にチミン（Ｔ）、及び配列番号６５のヌクレオチド位７４にグアニン（Ｇ）を有する上流プロモーター領域を含む導入されたポリヌクレオチド発現カセットを含み、前記上流プロモーター領域は、同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、前記ＰＯＩをより多く産生する方法。
  38. 改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞におけるタンパク質産生増強方法であって、
    （ａ）ポリヌクレオチド発現カセットを親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に導入する工程であって、前記カセットは、配列番号８３に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８３のヌクレオチド位７２にチミン（Ｔ）、配列番号８３のヌクレオチド位７３にグアニン（Ｇ）、及び配列番号８３のヌクレオチド位７４にチミン（Ｔ）を有する上流プロモーターを含み、前記上流プロモーターは、目的のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている工程と、
    （ｂ）前記導入された発現カセットを含む工程（ａ）からの改変細胞を単離する工程と、
    （ｃ）前記工程（ｂ）の改変細胞を前記ＰＯＩの産生に好適な条件下で発酵させる工程とを含み、
    前記工程（ｃ）の改変細胞は、配列番号８３に対し少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８３のヌクレオチド位７２にアデニン（Ａ）、配列番号８３のヌクレオチド位７３にチミン（Ｔ）、及び配列番号８３のヌクレオチド位７４にグアニン（Ｇ）を有する上流プロモーターを含む導入されたポリヌクレオチド発現カセットを含み、前記上流プロモーターは、同じＰＯＩをコードする同じ遺伝子又はＯＲＦに作動可能に連結されている、等価なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞と比較して、前記ＰＯＩをより多く産生する方法。
  39. 前記ＰＯＩは酵素である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記酵素はヒドロラーゼである、請求項３９に記載の方法。
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