JP7218985B2 - バチルス属(Bacillus)におけるタンパク質産生の増加のための改変5’-非翻訳領域(UTR)配列 - Google Patents
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Description
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、2017年9月13日に出願された米国仮特許出願第62/558304号の利益を主張するものである。
「20180823_NB41250WOPCT_SequenceListing_ST25.txt」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、2018年8月23日に作成され、サイズは38KBであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(I):[Pro][mod-5’-UTR][ORF]
を含み;
式中、[Pro]は、バチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能なプロモーター領域核酸配列であり、[mod-5’-UTR]は、改変B.サブチリス(B.subtilis)のaprE 5’非翻訳領域(mod-5’-UTR)核酸配列であり、且つ[ORF]は、目的のタンパク質(POI)をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列であり、[Pro]、[mod-5’-UTR]及び[ORF]核酸配列は、作動可能に連結されている。他の実施形態では、ベクター又はDNA発現コンストラクトは、本開示の単離ポリヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、組換え体バチルス属(Bacillus sp.)細胞は、本開示の単離ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、バチルス属(Bacillus sp.)は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である。
(II):[TIS][mod-5’UTR][tssコドン]
の核酸配列を含み、
式中、[TIS]は、転写開始部位(TIS)であり、[mod-5’-UTR]は、改変B.サブチリス(B.subtilis)5’-UTR核酸配列を含み、且つ[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンである。特定の実施形態では、[mod-5’-UTR]配列は、配列番号2を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに、(a)[TIS]に対して上流(5’)にあり且つ作動可能に連結された核酸プロモーター配列であって、そのプロモーター配列がバチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能である核酸プロモーター配列及び(b)tssコドンに対して下流(3’)にあり且つ作動可能に連結されたORF核酸配列であって、ORF配列がPOIをコードするORF核酸配列を含む。他の実施形態では、ベクター又はDNA発現コンストラクトは、本開示の単離ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、組換え体バチルス属(Bacillus sp.)細胞は、式(II)のポリヌクレオチドを含む。特定の他の実施形態では、バチルス属(Bacillus sp.)細胞は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である。
(III):[5’-HR][TIS][mod-5’-UTR][tssコドン][3’-HR]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを対象とし、
式中、[TIS]は、転写開始部位(TIS)であり、[mod-5’-UTR]は、改変B.サブチリス(B.subtilis)5’-UTR核酸配列を含み、[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、[5’-HR]は、5’-核酸配列相同領域であり、且つ[3’-HR]は、3’-核酸配列相同領域であり、5’-HR及び3’-HRは、それぞれ[TIS]配列のすぐ上流(5’)及び[tssコドン]配列のすぐ下流(3’)のゲノム(染色体)領域(遺伝子座)に対して十分な相同性を含み、相同組換えにより導入されるポリヌクレオチドコンストラクトの改変バチルス属(Bacillus)細胞のゲノムへの組込みをもたらす。特定の実施形態では、ベクター又はDNA発現コンストラクトは、式(III)のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、バチルス属(Bacillus sp.)細胞は、ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、バチルス属(Bacillus sp.)細胞は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である。
(IV):[TIS][5’-UTR-ΔxN][tssコドン]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに関し、
式中、[TIS]は、転写開始部位(TIS)であり、[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、且つ[5’-UTR-ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列であり、mod-5’-UTR核酸配列[5’-UTR-ΔxN]は、WT-5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で「x」ヌクレオチド(「N」)の欠失(-Δ)を含む。
(V):[TIS][5’-UTR+ΔxN][tssコドン]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに関し、
式中、[TIS]は、転写開始部位であり、[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、且つ[5’-UTR+ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列であり、mod-5’-UTR核酸配列[5’-UTR+ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で「x」ヌクレオチド(「N」)の付加(+Δ)を含む。
(I):[Pro][mod-5’-UTR][ORF]
の核酸配列を含む導入発現コンストラクトを含む改変バチルス属(Bacillus)細胞を対象とし;
式中、[Pro]は、バチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能なプロモーター領域核酸配列であり、[mod-5’-UTR]は、改変B.サブチリス(B.subtilis)の非翻訳領域(mod-5’-UTR)核酸配列であり、且つ[ORF]は、目的のタンパク質(POI)をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列であり、[Pro]、[mod-5’-UTR]及び[ORF]核酸配列は、作動可能に連結されており、改変バチルス属(Bacillus)(娘)細胞は、同様の条件下で培養されるとき、同じPOIを産生する非改変バチルス属(Bacillus)(親)細胞と比較して増加した量の異種POIを産生する。特定の実施形態では、mod-5’-UTRは、配列番号2を含む。他の実施形態では、細胞は、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である。他の実施形態では、ORF配列は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ(glucan lysase)、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ-ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組合せからなる群から選択されるPOIをコードする。
(VI):[5’-HR][mod-5’-UTR][3’-HR]
の核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを導入する工程であって、
[mod-5’-UTR]が、配列番号2を含み、[5’-HR]が、内在性POIをコードする内在性GOIの内在性野生型5’-UTR(WT-5’-UTR)配列のすぐ上流(5’)のゲノム遺伝子座に対する相同性を含む5’-核酸配列相同領域であり、且つ[3’-HR]が、内在性POIをコードする内在性GOIの内在性WT-5’-UTR配列のすぐ下流(3’)のゲノム遺伝子座に対する相同性を含む3’-核酸配列相同領域であり、5’-HR及び3’-HRが、前記ゲノム遺伝子座に対して十分な相同性を含み、相同組換えにより導入されるmod-5’-UTRポリヌクレオチドコンストラクトの改変バチルス属(Bacillus)細胞のゲノムへの組込みをもたらすことにより、内在性WT-5’-UTRを配列番号2のmod-5’-UTRで置き換える工程、及び(c)内在性POIの産生に好適な培地中で工程(b)の改変バチルス属(Bacillus sp.)細胞を培養する工程を含み、工程(c)の改変細胞が、同様の条件下で培養されるとき、工程(a)の親細胞と比較して増加した量の内在性POIを産生する方法に関する。
配列番号1は、野生型B.サブチリス(B.subtilis)aprE 5’UTRの核酸配列(以下、「WT-5’-UTR」)である。
(I):[Pro][mod-5’-UTR][ORF]
を含む単離ポリヌクレオチドを対象とし、
式中、[Pro]は、バチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能なプロモーター領域核酸配列であり、[mod-5’-UTR]は、改変5’-UTR核酸配列であり、且つ[ORF]は、目的のタンパク質(POI)をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列であり、[Pro]、[5’-UTR]及び[ORF]核酸配列は、作動可能に連結されている。他の実施形態では、本開示は、本開示の単離ポリヌクレオチドを含むベクター及びDNAコンストラクトに関する。
本明細書に記載されるとおりの(親)バチルス属(Bacillus)細胞、改変バチルス属(Bacillus)(娘)細胞、その組成物及びそれを作製及び使用する方法を含むがこれらに限定されない本開示のバチルス属(Bacillus)株及び宿主細胞の観点から、以下の用語及び語句が定義される。
本開示は一般に、増加したタンパク質産生能力などを有するバチルス属(Bacillus)(宿主)細胞(例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場)を作製し且つ構築するための組成物及び方法に関する。したがって、本開示の特定の実施形態は、改変B・サブチリス(B.subtilis)のaprE 5’-非翻訳領域(mod-5’-UTR)核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド、そのベクター、そのDNA(発現)コンストラクト、その改変バチルス属(Bacillus)(娘)細胞、及びそれを作製及び使用する方法に関する。
(I):[Pro][mod-5’-UTR][ORF]
を含む単離ポリヌクレオチドを対象とする。
(II):[TIS][mod-5’UTR][tssコドン]
において提示される核酸配列を含むmod-5’-UTR核酸配列を含み、
式中、[TIS]は、転写開始部位(TIS)であり、[mod-5’-UTR]は、改変B.サブチリス(B.subtilis)のapr5’-UTR核酸配列を含み、且つ[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンである。
(III):[5’-HR][TIS][mod-5’-UTR][tssコドン][3’-HR]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに関し、
式中、[TIS]は、転写開始部位(TIS)であり、[mod-5’-UTR]は、改変B.サブチリス(B.subtilis)のaprE 5’-UTR核酸配列を含み、[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、[5’-HR]は、5’-核酸配列相同領域であり、且つ[3’-HR]は、3’-核酸配列相同領域であり、5’-HR及び3’-HRは、それぞれ[TIS]配列のすぐ上流(5’)及び[tssコドン]配列のすぐ下流(3’)のゲノム(染色体)領域(遺伝子座)に対して十分な相同性を含み、相同組換えにより導入されるポリヌクレオチドコンストラクトの改変バチルス属(Bacillus)細胞のゲノムへの組込みをもたらす。
(IV):[TIS][5’-UTR-ΔxN][tssコドン]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに関し、
式中、[TIS]は、転写開始部位(TIS)であり、[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、且つ[5’-UTR-ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列であり、mod-5’-UTR核酸配列[5’-UTR-ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で「x」ヌクレオチド(「N」)の欠失(-Δ)を含む。例えば、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で1個のヌクレオチド欠失を含むmod-5’-UTR核酸配列は、「[5’-UTR-Δ1N]」として表すことができ、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で2個のヌクレオチド欠失を含むmod-5’-UTR核酸配列は、「[5’-UTR-Δ2N]」などとして表すことができる。
(V):[TIS][5’-UTR+ΔxN][tssコドン]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドに関し、
式中、[TIS]は、転写開始部位であり、[tssコドン]は、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、且つ[5’-UTR+ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列であり、mod-5’-UTR核酸配列[5’-UTR+ΔxN]は、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で「x」ヌクレオチド(「N」)の付加(+Δ)を含む。例えば、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTRの遠位(3’)末端で1個のヌクレオチド付加を含むmod-5’-UTR核酸配列は、「[5’-UTR+Δ1N]」として表すことができ、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で2個のヌクレオチド付加を含むmod-5’-UTR核酸配列は、「[5’-UTR+Δ2N]」などとして表すことができる。
上記のとおり、本開示の特定の実施形態は、親バチルス属(Bacillus)細胞に由来する(組換え)遺伝子改変バチルス属(Bacillus)細胞に関する。特定の実施形態では、本開示のバチルス属(Bacillus)細胞は、1つ以上の目的のタンパク質の増加した発現/産生のために遺伝子改変される。特定の実施形態では、本開示のバチルス属(Bacillus)細胞は、本開示のmod-5’-UTRを含むDNAコンストラクトから目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を発現するために遺伝子改変される。さらに他の実施形態では、親バチルス属(Bacillus)細胞は、1つ以上の(内在性)染色体遺伝子を不活性化するために遺伝子改変され、且つ/又は不活性な1つ以上の(内在性)染色体遺伝子を回復させるために改変される。
特定の実施形態では、本開示は、非改変(親)細胞と比較して(すなわち、相対的、相対して)改変バチルス属(Bacillus)細胞のタンパク質生産性を増加させるための方法及び組成物を提供する。したがって、特定の実施形態では、本開示は、改変バチルス属(Bacillus)細胞を発酵させる/培養する工程を含む目的のタンパク質(POI)を産生する方法を提供し、ここで改変細胞は、POIを培養培地中に分泌するか又はPOIを細胞内に保持する。本開示の改変及び非改変バチルス属(Bacillus)細胞を発酵させるために、当該技術分野でよく知られる発酵方法が適用され得る。
本開示の目的のタンパク質(POI)は、任意の内在性又は異種タンパク質であってもよく、そのようなPOIの変異体であってもよい。タンパク質は、1つ以上のジスルフィド架橋を含有し得るか、又はその機能的形態が単量体又は多量体であるタンパク質であり、すなわち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一(相同)又は同一でない(異種)サブユニットから構成され、ここで、POI又はその変異体POIは、好ましくは目的の特性を有するものである。
「Qp=gP/gDCW・hr」
(式中、「gP」は、タンク中において産生されるタンパク質のグラムであり;「gDCW」は、タンク中の乾燥細胞重量(DCW)のグラムであり、「hr」は、接種時点からの発酵時間であり、これは、産生時間、並びに増殖時間を含む)。
-1A UTR発現コンストラクトの構築及びアミラーゼ産生の試験
バチルス属(Bacillus)細胞における目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現に対する改変5’非翻訳領域(5’-UTR)の効果は、野生型B.サブチリス(B.subtilis)のaprE5’UTR(配列番号1)又は改変5’UTR(配列番号2)のいずれかの発現カセットを作製することによって試験された(例えば、図1を参照のこと)。より具体的には、本実施例は、様々な(改変)5’UTRコンストラクトの評価のためのバチルス属(Bacillus)株/宿主細胞の作製、並びにそのような改変5’UTRコンストラクトが上流(5’)プロモーター及び目的のタンパク質をコードする下流(3’)オープンリーディングフレームに作動可能に連結されているときの目的のタンパク質の産生に対するそれらの影響/作用を記載する。
AACGAGTTGGAACGGCTTGC;フォワード(配列番号18)、
GGCAACACCTACTCCAGCTT;フォワード(配列番号19)、
GATCACTCCGACATCATCGG;フォワード(配列番号20)。
目的のタンパク質の産生に対する改変5’UTRの効果の評価
本実施例では、実施例1における上記の改変B.リケニフォルミス(B.licheniformis)娘細胞(すなわち、娘細胞BF134;配列番号4を含む、及び娘細胞BF117、配列番号5を含む)を、標準的な発酵条件下で84時間増殖させた。より具体的には、B.リケニフォルミス(B.licheniformis)娘細胞であるBF134及びBF117の相対的なアミラーゼ産生を、標準的な方法を用いて測定したが、その結果が表1において下に記載される。
国際公開第1989/06279号パンフレット
国際公開第1999/20726号パンフレット
国際公開第1999/20769号パンフレット
国際公開第1999/20770号パンフレット
国際公開第2002/14490号パンフレット
国際公開第2003/083125号パンフレット
国際公開第2003/089604号パンフレット
国際公開第2014/164777号パンフレット
米国特許第4,914,031号明細書
米国特許第4,980,288号明細書
米国特許第5,208,158号明細書
米国特許第5,310,675号明細書
米国特許第5,336,611号明細書
米国特許第5,399,283号明細書
米国特許第5,441,882号明細書
米国特許第5,482,849号明細書
米国特許第5,631,217号明細書
米国特許第5,665,587号明細書
米国特許第5,700,676号明細書
米国特許第5,741,694号明細書
米国特許第5,858,757号明細書
米国特許第5,880,080号明細書
米国特許第6,197,567号明細書
米国特許第6,218,165号明細書
米国特許出願公開第2014/0329309号明細書
米国再発行特許第34,606号明細書
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Claims (34)
- 野生型バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のaprE 5’-非翻訳領域(WT-5’-UTR)核酸配列(配列番号1)に由来する改変バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のaprE 5’-非翻訳領域(mod-5’-UTR)核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記mod-5’-UTRが配列番号2を含む、単離ポリヌクレオチド。
- 前記mod-5’-UTRがさらに、前記mod-5’-UTRに対して5’且つ作動可能に連結された上流(5’)プロモーター領域核酸配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mod-5’-UTRがさらに、目的のタンパク質をコードする下流(3’)オープンリーディングフレーム(ORF)核酸配列を含み、前記ORF配列が、前記mod-5’-UTRに対して3’にあり且つ作動可能に連結されている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 5’から3’方向において式(I):
(I):[Pro][mod-5’-UTR][ORF]
を含み;
式中、[Pro]が、バチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能なプロモーター領域核酸配列であり、[mod-5’-UTR]が、改変B.サブチリス(B.subtilis)のaprE 5’非翻訳領域(mod-5’-UTR)核酸配列であり、且つ[ORF]が、目的のタンパク質(POI)をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列であり、前記[Pro]、[mod-5’-UTR]及び[ORF]核酸配列が、作動可能に連結されている、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むDNA発現コンストラクト。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドを含むバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 前記細胞が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である、請求項7に記載のバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR(WT-5’-UTR)配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR(mod-5’-UTR)核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、単離された改変ポリヌクレオチドが、5’から3’方向において作動可能な組合せにおける式(II):
(II):[TIS][mod-5’-UTR][tssコドン]
の前記核酸配列を含み、
式中、[TIS]が、転写開始部位(TIS)であり、[mod-5’-UTR]が、改変B.サブチリス(B.subtilis)5’-UTR核酸配列を含み、且つ[tssコドン]が、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、
前記[mod-5’-UTR]配列が配列番号2を含む、単離ポリヌクレオチド。 - (a)前記[TIS]に対して上流(5’)にあり且つ作動可能に連結された核酸プロモーター配列であって、そのプロモーター配列がバチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能である核酸プロモーター配列及び
(b)前記tssコドンに対して下流(3’)にあり且つ作動可能に連結されたORF核酸配列であって、前記ORF配列がPOIをコードするORF核酸配列をさらに含む、請求項9に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むDNA発現コンストラクト。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを含むバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 前記細胞が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である、請求項13に記載のバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 5’から3’方向及び作動可能な組合せにおける式(III)
(III):[5’-HR][TIS][mod-5’-UTR][tssコドン][3’-HR]
の核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、
式中、[TIS]が、転写開始部位(TIS)であり、[mod-5’-UTR]が、改変B.サブチリス(B.subtilis)5’-UTR核酸配列を含み、[tssコドン]が、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、[5’-HR]が、5’-核酸配列相同領域であり、且つ[3’-HR]が、3’-核酸配列相同領域であり、前記5’-HR及び3’-HRが、それぞれ前記[TIS]配列のすぐ上流(5’)及び前記[tssコドン]配列のすぐ下流(3’)のゲノム(染色体)領域(遺伝子座)に対して十分な相同性を含み、相同組換えにより導入されるポリヌクレオチドコンストラクトの改変バチルス属(Bacillus)細胞のゲノムへの組込みをもたらし、
前記[mod-5’-UTR]配列が配列番号2を含む、単離ポリヌクレオチド。 - 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含むDNA発現コンストラクト。
- 請求項15に記載のポリヌクレオチドを含むバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 前記細胞が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である、請求項18に記載のバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 前記ORF配列が、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ(glucan lysase)、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ-ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組合せからなる群から選択されるPOIをコードする、請求項3または4に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ORF配列が、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ(glucan lysase)、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ-ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組合せからなる群から選択されるPOIをコードする、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
- 野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR(WT-5’-UTR)配列に由来する改変5’-UTR(mod-5’-UTR)核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記単離ポリヌクレオチドが、5’から3’方向及び作動可能な組合せにおける式(IV):
(IV):[TIS][5’-UTR-ΔxN][tssコドン]
の前記核酸配列を含み、
式中、[TIS]が、転写開始部位(TIS)であり、[tssコドン]が、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、且つ[5’-UTR-ΔxN]が、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列であり、前記mod-5’-UTR核酸配列[5’-UTR-ΔxN]が、前記WT-5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で「x」ヌクレオチド(「N」)の欠失(-Δ)を含み、
前記mod-5’-UTRが配列番号2を含む、単離ポリヌクレオチド。 - 野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR(WT-5’-UTR)配列に由来する改変5’-UTR(mod-5’-UTR)核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記単離ポリヌクレオチドが、5’から3’方向及び作動可能な組合せにおける式(V):
(V):[TIS][5’-UTR+ΔxN][tssコドン]
の前記核酸配列を含み、
式中、[TIS]が、転写開始部位であり、[tssコドン]が、3ヌクレオチドの翻訳開始部位(tss)コドンであり、且つ[5’-UTR+ΔxN]が、野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列に由来する改変バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列であり、前記mod-5’-UTR核酸配列[5’-UTR+ΔxN]が、前記野生型バチルス属(Bacillus sp.)5’-UTR核酸配列の遠位(3’)末端で「x」ヌクレオチド(「N」)の付加(+Δ)を含み、
前記mod-5’-UTRが配列番号2を含む、単離ポリヌクレオチド。 - 請求項22又は23に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項22又は23に記載のポリヌクレオチドを含むDNA発現コンストラクト。
- 請求項22又は23に記載のポリヌクレオチドを含むバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 前記細胞が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である、請求項26に記載のバチルス属(Bacillus sp.)細胞。
- 異種の目的のタンパク質(POI)の産生に好適な培地中で培養されるときに増加した量の異種のPOIを産生する改変バチルス属(Bacillus sp.)(娘)細胞であって、前記改変バチルス属(Bacillus)細胞が、5’から3’方向及び作動可能な組合せにおいて式(I)
(I):[Pro][mod-5’-UTR][ORF]
の核酸配列を含む導入発現コンストラクトを含み;
式中、[Pro]が、バチルス属(Bacillus sp.)細胞において作動可能なプロモーター領域核酸配列であり、[mod-5’-UTR]が、改変B.サブチリス(B.subtilis)の非翻訳領域(mod-5’-UTR)核酸配列であり、且つ[ORF]が、目的のタンパク質(POI)をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列であり、前記[Pro]、[mod-5’-UTR]及び[ORF]核酸配列が、作動可能に連結されており、前記改変バチルス属(Bacillus)(娘)細胞が、同様の条件下で培養されるとき、同じPOIを産生する非改変B.リケニフォルミス(B.licheniformis)(親)細胞と比較して増加した量の前記異種POIを産生し、
前記mod-5’-UTRが配列番号2を含む、改変バチルス属(Bacillus sp.)(娘)細胞。 - 前記細胞が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である、請求項28に記載のバチルス属(Bacillus)細胞。
- 前記ORF配列が、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ(glucan lysase)、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ-ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組合せからなる群から選択されるPOIをコードする、請求項28に記載のバチルス属(Bacillus)細胞。
- 改変バチルス属(Bacillus)細胞中で増加した量の異種の目的のタンパク質(POI)を産生するための方法であって:
(a)5’から3’の方向及び作動可能な組合せにおいて[Pro]が、バチルス属(Bacillus sp.)細胞中で作動可能なプロモーター領域核酸配列であり、[mod-5’-UTR]が、配列番号2のmod-5’-UTR核酸配列であり、且つ[ORF]が、目的のタンパク質(POI)をコードするオープンリーディングフレーム核酸配列である核酸配列[Pro][mod-5’-UTR][ORF]を含む発現コンストラクトを親バチルス属(Bacillus sp.)細胞に導入する工程、及び
(b)異種POIの産生に好適な培地中で工程(a)の前記改変バチルス属(Bacillus)細胞を培養する工程を含み、
前記改変バチルス属(Bacillus)(娘)細胞が、工程(b)の同じ培地中において培養されたバチルス属(Bacillus)対照細胞と比較して増加した量のPOIを産生し、前記バチルス属(Bacillus)対照細胞が、5’から3’の方向及び作動可能な組合せにおいて[Pro]及び[ORF]核酸配列が、工程(a)における前記[Pro]及び[ORF]配列と同一であり、且つ[WT-5’-UTR]が、配列番号1を含む核酸配列[Pro][WT-5’-UTR][ORF]を含む導入発現コンストラクトを含む、方法。 - 前記細胞が、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)細胞である、請求項31に記載のバチルス属(Bacillus)細胞。
- 前記ORF配列が、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ(glucan lysase)、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ-ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組合せからなる群から選択されるPOIをコードする、請求項31に記載のバチルス属(Bacillus)細胞。
- 改変バチルス属(Bacillus)細胞中で増加した量の内在性の目的のタンパク質(POI)を産生するための方法であって:
(a)内在性POIを産生する親バチルス属(Bacillus)細胞を入手する工程、
(b)工程(a)の前記細胞中に、5’から3’の方向及び作動可能な組合せにおいて式(VI)
(VI):[5’-HR][mod-5’-UTR][3’-HR]
の核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクトを導入する工程であって、
[mod-5’-UTR]が、配列番号2を含み、[5’-HR]が、前記内在性POIをコードする内在性GOIの内在性野生型5’-UTR(WT-5’-UTR)配列のすぐ上流(5’)のゲノム遺伝子座に対する相同性を含む5’-核酸配列相同領域であり、且つ[3’-HR]が、前記内在性POIをコードする内在性GOIの内在性WT-5’-UTR配列のすぐ下流(3’)のゲノム遺伝子座に対する相同性を含む3’-核酸配列相同領域であり、前記5’-HR及び3’-HRが、前記ゲノム遺伝子座に対して十分な相同性を含み、相同組換えにより導入されるmod-5’-UTRポリヌクレオチドコンストラクトの前記改変バチルス属(Bacillus)細胞のゲノムへの組込みをもたらすことにより、内在性WT-5’-UTRを配列番号2の前記mod-5’-UTRで置き換える工程、及び
(c)前記内在性POIの産生に好適な培地中で工程(b)の前記改変バチルス属(Bacillus sp.)細胞を培養する工程を含み、
工程(c)の改変細胞が、同様の条件下で培養されるとき、工程(a)の親細胞と比較して増加した量の前記内在性POIを産生する、方法。
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