JP2023524334A - バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法 - Google Patents

バチルス・リケニフォルミス（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における強化したタンパク質産生のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

【解決手段】本開示は、概して、強化したタンパク質産生能力を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主）を構築及び／又は得るための組成物及び方法に関する。したがって、所定の実施形態は、増加した量の１種以上の関心対象のタンパク質を産生する親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株に由来する遺伝子改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株に関する。【選択図】なし

Description

本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学、工業用タンパク質産生などの分野に関する。したがって、本開示の所定の実施形態は、強化したタンパク質産生表現型を有するバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株を構築するための組成物及び方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／９６１，２３４号の利益を主張するものである。
配列表の参照
「ＮＢ４１６８４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０２１年１月０７日に作成されたものであり、サイズは４２５ＫＢである。
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのグラム陽性菌は、それらの優れた発酵特性と高い収率（例えば、培養物１Ｌ当たり最大２５グラム；Ｖａｎ Ｄｉｊｌ ａｎｄ Ｈｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業用関連タンパク質を生産するための微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、食品、繊維、洗濯、医療機器の洗浄、薬品工業などのために必要なα－アミラーゼ（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）及びプロテアーゼ（Ｂｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の製造用として周知である（Ｗｅｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生成物を全く含まないタンパク質（例えば、内毒素としても公知であるリポ多糖類；ＬＰＳ）を産生するので、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の「安全性適格推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、それらの生成物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「安全食品認定（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）の評価を獲得した（Ｏｌｅｍｐｓｋａ－Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
したがって、微生物宿主細胞内でのタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体など）の産生は、バイオテクノロジー分野において特に関心が高い。同様に、１種以上の関心対象のタンパク質を産生及び分泌させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の最適化は、特に工業バイオテクノロジーの状況においては高度に重要であり、タンパク質が工業的に大量生産される場合は、タンパク質収量の小さな改善が極めて重要な意味を有する。より特別には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、工業的重要性の高いバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）の宿主細胞であるので、したがって、強化／増加したタンパク質発現／産生のためにＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞を改変及び操作する能力は、新規及び改善されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）産生株を構築するために高度に望ましい。したがって、本開示は、増加したタンパク質産生能力を有するＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞）を得て構築するための高度に望ましい、未だ満たされていない必要に関する。
本開示は、概して、強化したタンパク質産生能力を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主）を得るための組成物及び方法に関する。したがって、本開示の所定の実施形態は、増加した量の１種以上の関心対象のタンパク質を産生するそうした改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株を構築するための方法に関する。
したがって、本開示の所定の実施形態は、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞における増加した量の内因性関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を得て、その中に天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含むポリヌクレオチドを導入することによってその親細胞を改変する工程、及び（ｂ）ＰＯＩの産生のために好適な条件下で工程（ａ）の改変細胞を発酵させる工程を含み、ここで改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合の親細胞に比較して、増加した量のＰＯＩを産生する方法に向けられる。本方法の特定の実施形態では、工程（ａ）の導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーターを含む。本方法の他の実施形態では、工程（ａ）の導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦを含む。他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする。所定の好ましい実施形態では、親細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性（野生型）ｐｒｓＡ遺伝子を含むが、ここで導入されたポリヌクレオチドは、それにより配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含むｐｒｓＡタンパク質の第２のコピーをコードする。他の実施形態では、工程（ａ）の導入されたポリヌクレオチドは、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のゲノム内に組み込まれる。本方法の更に他の実施形態では、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、プロテアーゼ又はアミラーゼである。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含む。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。
所定の他の実施形態では、本開示は、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞における増加した量の異種関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に（ｉ）ＰＯＩをコードする発現カセット及び（ｉｉ）天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含むポリヌクレオチドを導入する工程、及び（ｂ）ＰＯＩの産生のために好適な条件下で工程（ａ）の改変細胞を発酵させる工程を含み、ここで改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合の親細胞に比較して、増加した量のＰＯＩを産生する方法に関する。本方法の特定の実施形態では、工程（ａ）（ｉｉ）の導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーターを含む。所定の他の実施形態では、工程（ａ）（ｉｉ）の導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦを含む。本方法の更に他の実施形態では、内因性ｐｒｓＡ遺伝子は、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする。所定の他の実施形態では、工程（ａ）（ｉｉ）の導入されたポリヌクレオチドは、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のゲノム内に組み込まれる。所定の好ましい実施形態では、親細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性（野生型）ｐｒｓＡ遺伝子を含むが、ここで工程（ａ）（ｉｉ）の導入されたポリヌクレオチドは、それにより配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含むｐｒｓＡタンパク質の第２のコピーをコードする。特定の実施形態では、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、プロテアーゼ又はアミラーゼである。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含む。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。所定の好ましい実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。
本開示の他の実施形態は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性ｐｒｓＡ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に向けられる。したがって、所定の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含む導入されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーターを含む。他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦを含む。更に他の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする。所定の他の実施形態では、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチドは、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のゲノム内に組み込まれる。別の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含む。別の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。好ましい実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。所定の他の実施形態では、改変細胞は、異種関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現構築物を含む。他の実施形態では、異種ＰＯＩは、プロテアーゼ又はアミラーゼである。したがって、本開示の所定の実施形態は、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞によって産生した関心対象のタンパク質を得る工程、単離する工程、精製する工程などに向けられる。
したがって、本開示の所定の他の実施形態は、それらが由来する親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較して増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に向けられる。したがって、所定の実施形態では、本開示は、親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較して増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞は、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来し、改変細胞は、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含む導入されたポリヌクレオチドを含み、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含み、改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に親菌株に比較して増加した量のＰＯＩを産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。別の実施形態では、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含む。更に別の実施形態では、天然ｐｒｓＡプロモーターは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む。所定の他の実施形態では、天然ｐｒｓＡ ＯＲＦは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む。別の実施形態では、天然ｐｒｓＡタンパク質は、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む。特定の実施形態では、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、プロテアーゼ又はアミラーゼである。したがって、本開示の所定の他の実施形態は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞によって産生した関心対象のタンパク質を得る工程、単離する工程、精製する工程などに向けられる。
他の実施形態では、本開示は、親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較して増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞は、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来し、改変細胞は、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含む導入されたポリヌクレオチドを含み、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含み、改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に親菌株に比較して増加した量のＰＯＩを産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を更に含む。更に別の実施形態では、天然ｐｒｓＡプロモーターは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む。所定の他の実施形態では、天然ｐｒｓＡ ＯＲＦは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む。別の実施形態では、天然ｐｒｓＡタンパク質は、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む。特定の実施形態では、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、プロテアーゼ又はアミラーゼである。したがって、本開示の所定の他の実施形態は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞によって産生した関心対象のタンパク質を得る工程、単離する工程、精製する工程などに向けられる。
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、天然Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９タンパク質をコードするアミノ酸配列である。
配列番号２は、その核酸配列が、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞内での発現のためにコドン最適化されている配列番号１のＣａｓ９タンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３は、合成Ｎ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、合成Ｃ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）のアミノ酸配列である。
配列番号５は、合成デカ－ヒスチジンタグのアミノ酸配列である。
配列番号６は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥプロモーター配列である。
配列番号７は、合成ターミネーターの核酸配列である。
配列番号８は、フォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号９は、リバースプライマーの核酸配列である。
配列番号１０は、合成ｐＫＢ３２０骨格の核酸配列である。
配列番号１１は、合成ｐＫＢ３２０の核酸配列である。
配列番号１２は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１３は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１４は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１５は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１６は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１７は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１８は、プライマーの核酸配列である。
配列番号１９は、プライマーの核酸配列である。
配列番号２０は、プライマーの核酸配列である。
配列番号２１は、プライマーの核酸配列である。
配列番号２２は、プライマーの核酸配列である。
配列番号２３は、プライマーの核酸配列である。
配列番号２４は、プライマーの核酸配列である。
配列番号２５は、合成ｐＲＦ６９４の核酸配列である。
配列番号２６は、合成ｐＲＦ８０１の核酸配列である。
配列番号２７は、合成ｐＲＦ８０６の核酸配列である。
配列番号２８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）標的部位１（ＴＳ１）の核酸配列である。
配列番号２９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）標的部位２（ＴＳ２）の核酸配列である。
配列番号３０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列である。
配列番号３１は、ヌクレオチド「ＡＧＧ」を含む標的部位１のＰＡＭ配列である。
配列番号３２は、可変標的化（ＶＴ）部位１をコードする核酸配列である。
配列番号３３は、ＣＥＲドメインをコードする合成核酸配列である。
配列番号３４は、部位１を標的化する合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列である。
配列番号３５は、合成ｓｐａｃプロモーターの核酸配列である。
配列番号３６は、合成ｔ０ターミネーターの核酸配列である。
配列番号３７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１の核酸配列である。
配列番号３８は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１のフォワードプライマーの配列である。
配列番号３９は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１のリバースプライマーの配列である。
配列番号４０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２の核酸配列である。
配列番号４１は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２のフォワードプライマーの配列である。
配列番号４２は、合成ｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２のフォワードプライマーの配列である。
配列番号４３は、標的部位１（ＴＳ１）ｇＲＮＡをコードする発現カセットである。
配列番号４４は、合成ｓｅｒＡ１の欠失編集鋳型である。
配列番号４５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列である。
配列番号４６は、ヌクレオチド「ＣＧＧ」を含む標的部位２のＰＡＭ配列である。
配列番号４７は、部位２を標的化する合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列である。
配列番号４８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１のホモロジーアーム１の核酸配列である。
配列番号４９は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム１のフォワードプライマーの配列である。
配列番号５０は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム１のリバースプライマーの配列である。
配列番号５１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１のホモロジーアーム２の核酸配列である。
配列番号５２は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム２のフォワードプライマーの配列である。
配列番号５３は、合成ｒｇｈＲ１ホモロジーアーム２のリバースプライマーの配列である。
配列番号５４は、標的部位２（ＴＳ２）ｇＲＮＡをコードする発現カセットである。
配列番号５５は、合成ｒｇｈＲ１の欠失編集鋳型である。
配列番号５６は、Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）変異タンパク質をコードするアミノ酸配列である。
配列番号５７は、合成Ｙ１５５Ｈのフォワードプライマー配列である。
配列番号５８は、合成Ｙ１５５Ｈのリバースプライマー配列である。
配列番号５９は、合成ｐＲＦ８２７の核酸配列である。
配列番号６０は、配列番号５６の変異Ｃａｓ９（Ｙ１５５Ｈ）タンパク質をコードする発現カセットである。
配列番号６１は、合成ｐＲＦ８５６の核酸配列である。
配列番号６２は、合成ｐＲＦ８６２の核酸配列である。
配列番号６３は、合成Ｙ１５５Ｈの断片の配列である。
配列番号６４は、合成Ｙ１５５Ｈの断片のフォワードプライマー配列である。
配列番号６５は、合成Ｙ１５５Ｈの断片のリバースプライマー配列である。
配列番号６６は、合成ｐＲＦ６９４の断片の配列である。
配列番号６７は、合成ｐＲＦ６９４の断片のフォワードプライマー配列である。
配列番号６８は、合成ｐＲＦ６９４の断片のリバースプライマー配列である。
配列番号６９は、合成ｐＲＦ８６９の核酸配列である。
配列番号７０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列である。
配列番号７１は、合成ｒｇｈＲ２ｓｔｏｐの断片である。
配列番号７２は、合成ｒｇｈＲ２ｓｔｏｐの編集鋳型である。
配列番号７３は、ｒｇｈＲ２ ｇＲＮＡをコードする発現カセットである。
配列番号７４は、合成断片のフォワードプライマーである。
配列番号７５は、合成断片のリバースプライマーである。
配列番号７６は、合成ｐＲＦ８６２の骨格のフォワードプライマーである。
配列番号７７は、合成ｐＲＦ８６２の骨格のリバースプライマーである。
配列番号７８は、合成ｐＲＦ８７９の核酸配列である。
配列番号７９は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐＲＦ８７９の標的部位及びＰＡＭの核酸配列である。
配列番号８０は、合成ｐＲＦ８７９の編集鋳型の配列である。
配列番号８１は、合成ｐＲＦ９４６の核酸配列である。
配列番号８２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐＲ９４６の標的部位及びＰＡＭの核酸配列である。
配列番号８３は、合成ｐＲ９４６の編集鋳型の配列である。
配列番号８４は、合成ｐＺＭ２２１の核酸配列である。
配列番号８５は、ｐＺＭ２２１の標的部位及びＰＡＭの核酸配列である。
配列番号８６は、合成ｐＺＭ２２１の編集鋳型の配列である。
配列番号８７は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＬｙｓＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列である。
配列番号８８は、合成ｐＢｌ．ｃｏｍＫの核酸配列である。
配列番号８９は、合成スペクチノマイシンマーカーの核酸配列である。
配列番号９０は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＲの核酸配列である。
配列番号９１は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡｐの核酸配列である。
配列番号９２は、合成ｃｏｍＫの核酸配列である。
配列番号９３は、合成ｃａｔ＿ｐｒｓＡの核酸配列である。
配列番号９４は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｃａｔ上流の核酸配列である。
配列番号９５は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｃａｔプロモーターの核酸配列である。
配列番号９６はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｃａｔＨの核酸配列である。
配列番号９７は、合成二重ターミネーターの核酸配列である。
配列番号９８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｃａｔＨターミネーターの核酸配列である。
配列番号９９は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｐｏＶＧターミネーターの核酸配列である。
配列番号１００は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡプロモーターの核酸配列である。
配列番号１０１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列である。
配列番号１０２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬターミネーターの核酸配列である。
配列番号１０３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｃａｔ下流の核酸配列である。
配列番号１０４は、合成フォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号１０５は、合成リバースプライマーの核酸配列である。
配列番号１０６は、合成ｐｒｓＡ（第２のコピー）の検証の核酸配列である。
配列番号１０７は、合成プライマー配列である。
配列番号１０８は、合成プライマー配列である。
配列番号１０９は、合成プライマー配列である。
配列番号１１０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）が欠失したｃａｔＨＰ及びｃａｔＨをコードする核酸配列である。
配列番号１１１は、ｃａｔ ｃａｔＨ欠失における合成ｐｒｓＡ（第２のコピー）発現カセットである。
配列番号１１２は、合成ｃａｔＨ（第２のコピー）の欠失検証ＰＣＲ産物である。
配列番号１１３は、合成フォワードプライマー配列である。
配列番号１１４は、合成リバースプライマー配列である。
配列番号１１５は、合成ｄｌｔＡ－２の検証ＰＣＲ産物である。
配列番号１１６は、合成ｄｌｔＡ－２の親検証ＰＣＲ産物である。
配列番号１１７は、合成フォワードプライマー配列である。
配列番号１１８は、合成リバースプライマー配列である。
配列番号１１９は、合成ｒｇｈＲ２の欠失検証ＰＣＲ産物である。
配列番号１２０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の親ｒｇｈＲ２の欠失検証ＰＣＲ産物である。
配列番号１２１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の親ｒｇｈＲ２遺伝子座である。
配列番号１２２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の親ｄｌｔＡ遺伝子座である。
配列番号１２３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の親ｃａｔ遺伝子座である。
配列番号１２４は、合成ｃａｔ ２×ｐｒｓＡ遺伝子座である。
配列番号１２５は、合成ｄｌｔＡ－２遺伝子座である。
配列番号１２６は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアミラーゼ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１２７は、合成ｓｅｒＡ１－アミラーゼ１のカセットである。
配列番号１２８は、合成ｐ３プロモーター配列である。
配列番号１２９は、合成改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列である。
配列番号１３０は、ａｍｙＬシグナル配列をコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の核酸配列である。
配列番号１３１は、配列番号１２６のアミラーゼ１タンパク質をコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の核酸配列である。
配列番号１３２は、合成ｌｙｓＡアミラーゼ１のカセットである。
配列番号１３３は、合成ｌｙｓＡ親遺伝子座の核酸配列である。
配列番号１３４は、ｌｙｓＡをコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の核酸配列である。
配列番号１３５は、合成ｐ２プロモーター配列である。
配列番号１３６は、アミラーゼ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１３７は、合成ｓｅｒＡ１－アミラーゼ２のカセットである。
配列番号１３８は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｍＩプロモーター配列である。
配列番号１３９は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ配列である。
配列番号１４０は、配列番号１３６のアミラーゼ２タンパク質をコードする合成核酸配列である。
配列番号１４１は、合成ａｍｙＬ又はｌｙｓＡアミラーゼ２のカセットである。
配列番号１４２は、合成ａｍｙＬの親遺伝子座である。
配列番号１４３は、アミラーゼ３タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１４４は、合成ｓｅｒＡ１アミラーゼ３のカセットである。
配列番号１４５は、配列番号１４３のアミラーゼ３タンパク質をコードする合成核酸配列である。
配列番号１４６は、合成ＬｙｓＡアミラーゼ３のカセットである。
配列番号１４７は、アミラーゼ４タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１４８は、合成ｓｅｒＡ１アミラーゼ４のカセットである。
配列番号１４９は、配列番号１４７のアミラーゼ４タンパク質をコードする合成核酸配列である。
配列番号１５０は、合成ｌｙｓＡアミラーゼ４のカセットである。
配列番号１５１は、アミラーゼ５タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１５２は、合成ｓｅｒＡ１アミラーゼ５のカセットである。
配列番号１５３は、配列番号１５１のアミラーゼ５タンパク質をコードする合成核酸配列である。
配列番号１５４は、合成ｌｙｓＡアミラーゼ５のカセットである。
配列番号１５５は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１５６は、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１５７は、変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号１５８は、配列番号１５７の変異ＲｇｈＲ２タンパク質をコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の変異ｒｇｈＲ２遺伝子の核酸配列である。
本開示は、概して、強化したタンパク質産生能力を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（例えば、タンパク質産生宿主）を得るための組成物及び方法に関する。本開示の所定の実施形態は、親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に由来する遺伝子改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に関する。したがって、本開示の所定の他の実施形態は、増加した量の１種以上の関心対象のタンパク質を産生する、そのような改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株を構築するための方法に向けられる。
例えば、本開示の所定の実施形態は、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞における増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）その中に天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含むポリヌクレオチドを導入することによって、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を改変する工程、及び（ｂ）ＰＯＩの産生のために好適な条件下で改変細胞を発酵させる工程を含み、ここで改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合の親細胞に比較して、増加した量のＰＯＩを産生する方法に向けられる。所定の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び／又は配列番号１２１と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を更に含む。所定の実施形態では、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、酵素である。所定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼ又はアミラーゼである。
本開示の他の実施形態は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性ｐｒｓＡ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞／株に向けられる。したがって、所定の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含む導入されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び／又は配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む。
したがって、本開示の所定の実施形態は、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞によって産生した関心対象のタンパク質を得る工程、単離する工程、精製する工程などに向けられる。
Ｉ．定義
本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞及び本明細書に記載したそれらの方法を考慮して、以下の用語及び句を定義する。本明細書で定義されていない用語には、当該技術分野で通常使用されている意味が与えられるべきである。
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の組成物及び方法を実施又は試験するためにも使用できるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。本明細書で引用した刊行物及び特許は全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特許請求の範囲が任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにも更に留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又は「否定的な」限定又はその条件の使用のための先行文として機能することを意図している。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
本明細書で使用する「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者には公知である「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種が含まれ、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、それらに限定されない。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属は、再分類されている種、例えば、以下に限定されないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されている「Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むことが意図されている。
本明細書で使用するように、「親細胞」は、「未改変細胞」（例えば、未改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）親細胞）を指す。
本明細書で使用するように、「改変細胞」又は「娘細胞」は、互換的に使用され得、改変細胞が由来する「親細胞」中に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組み換えＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を指す。
所定の実施形態では、「未改変」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（親）細胞は、特に、「改変」Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞と比較した場合、又はそれに対して、「対照細胞」と呼ぶことができる。
本明細書で使用するように、「未改変」（親）細胞における関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）の発現及び／又は産生が、「改変」（娘）細胞における同一ＰＯＩの発現及び／又は産生と比較される場合、「改変」及び「未改変」細胞は、同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等の同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。
本明細書で使用するように、「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。したがって、本開示の所定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
本明細書で使用するように、本開示の「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡプロモーター」は、配列番号１００と約９５％の配列同一性を含む。所定の実施形態では、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡプロモーターは、配列番号１００と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。
本明細書で使用するように、「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、配列番号１０１と約９０％以上の配列同一性を含む。所定の実施形態では、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡ ＯＲＦは、配列番号１０１と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｒｓＡ遺伝子は、Ｋｏｎｔｉｎｅｎ ａｎｄ Ｓａｒｖａｓ（１９９３）及び国際公開第１９９４／０１９４７１号パンフレットに記載されており、これらの刊行物は、ｐｒｓＡ遺伝子がタンパク質分泌（即ち、細胞分泌機構の成分をコードする）に包含されることを示唆しており、ここでｐｒｓＡ遺伝子産物は、膜関連リポタンパク質である。
本明細書で使用するように、「天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡタンパク質」は、配列番号１５５と約９０％以上の配列同一性を含み、ペプチジル－プロピルのシス－トランスイソメラーゼ活性（ＥＣ５．２．１．８）を含む。所定の実施形態では、天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡタンパク質は、配列番号１５５と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。
本明細書で使用するように、「親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性（野生型）ｐｒｓＡ遺伝子を含み」、及びしたがって、配列番号１５５と約９０％配列同一性を含むｐｒｓＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドが本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に導入されると、導入されたポリヌクレオチドは、本明細書では第２のｐｒｓＡコピーと呼ぶことができる。例えば、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含むｐｒｓＡタンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチドを含む本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、本明細書では、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする第１（１ｓｔ）の内因性（野生型）ｐｒｓＡ遺伝子及びｐｒｓＡタンパク質をコードする第２の導入されたポリヌクレオチドを含む、２つのコピーｐｒｓＡ（改変）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を指すことができる。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ｄｌｔオペロンは、それぞれＤｌｔＡ、ＤｌｔＢ、ＤｌｔＣ、ＤｌｔＤ及びＤｌｔＥと称されるタンパク質をコードする５つのＯＲＦ（ｄｌｔＡ、ｄｌｔＢ、ｄｌｔＣ、ｄｌｔＤ及びｄｌｔＥ）を含む（Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．，２００５）。例えば、Ｍａｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）によって記載されたように、ＤｌｔＡタンパク質は、Ｄ－アラニン：細胞壁のリポタイコ酸内へのＤ－Ａｌａの組み込みに関係するＤ－アラニル担体タンパク質リガーゼである。
本明細書で使用するように、「ｄｌｔＡ遺伝子」は、配列番号１２２と約９０％の配列同一性を含む。所定の実施形態では、ｄｌｔＡ遺伝子は、配列番号１５５と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｇｈＲ遺伝子は、ｒａｐＧ、ｒａｐＨ（Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）及びｒａｐＤ（Ｏｇｕｒａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｔａ，２００７）のリプレッサーとして当該技術分野において記載されている、ＲｇｈＲと称される転写調節タンパク質をコードする。対照的に、国際公開２０１８／１５６７０５号パンフレットに近年記載されたように、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、ＲｇｈＲ１及びＲｇｈＲ２と称されるＲｇｈＲ転写調節タンパク質の２つのホモログをコードする。下記に記載するように、本開示の所定の実施形態は、改変（例えば、欠失又は破壊した）ｒｇｈｒ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。
本明細書で使用するように、本明細書に記載した遺伝子改変のために好適な「Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子」は、配列番号１５６と約９０％の配列同一性（例えば、配列番号１５６と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性）を含む天然ＲｈｇＲ２タンパク質をコードする野生型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号１２１）であり得る、又は配列番号１５７と約９０％の配列同一性（例えば、配列番号１５７と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性）を含む変異ｒｇｈＲ２タンパク質をコードする変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号１５８）であり得る。例えば、配列番号１５７に示したように、変異ＲｈｇＲ２タンパク質は、配列番号１５７のアミノ酸残基３６～４１で「Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ」の６アミノ酸残基反復を含むが、その６アミノ酸反復は、天然ＲｇｈＲ２タンパク質（即ち、配列番号１５６のアミノ酸残基１～１３４）中には存在しない。
したがって、所定の他の実施形態では、ｒｇｈＲ２遺伝子、又はそのオープンリーディングフレームは、天然ｒｇｈＲ２遺伝子と約９０％の配列同一性（例えば、配列番号１２１と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性）を含み；又は変異ｒｇｈＲ２遺伝子と約９０％の配列同一性（例えば、配列番号１５８と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性）を含む。
本明細書で使用するように、「ＢＦ１４０」又は「ＢＦ１４０（ΔｓｅｒＡ＿ΔｌｙｓＡ）」と称される親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、ｓｅｒＡ遺伝子の欠失（ΔｓｅｒＡ）及びｌｙｓＡ遺伝子の欠失（ΔｌｙｓＡ）を含む。
本明細書で使用するように、「ＢＦ５６１」又は「ＢＦ５６１（第２のコピーｐｒｓＡ）」と称される改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、親株ＢＦ１４０に由来したが、ここで改変ＢＦ５６１株は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする野生型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡ遺伝子の導入された第２のコピーを含む。
本明細書で使用するように、「ＢＦ５９８」又は「ＢＦ５９８（ΔｄｌｔＡ＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）」と称される改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、ＢＦ５６１株に由来したが、ここで改変ＢＦ５９８は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｄｌｔＡ遺伝子の欠失を更に含む。
本明細書で使用するように、「ＢＦ６０２」又は「ＢＦ６０２（ΔｒｇｈＲ２＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）」と称される改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、ＢＦ５６１株に由来したが、ここで改変ＢＦ６０２は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子の欠失を更に含む。
本明細書で使用するように、「ＢＦ６１３」又は「ＢＦ６１３（ΔｒｇｈＲ２＿ΔｄｌｔＡ＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）」と称される改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、ＢＦ５９８（ΔｄｌｔＡ＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）株に由来したが、ここで改変ＢＦ６１３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子の欠失を更に含む。
本明細書で使用するように、「アミラーゼ１」は、当該技術分野において一般にＡｍｙＬと呼ばれる天然Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のα－アミラーゼであり、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用するように、「アミラーゼ２」は、概して国際公開第２０１８／１８４００４号パンフレット（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載された配列番号１３６を含む変異バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のα－アミラーゼである。
本明細書で使用するように、「アミラーゼ３」は、概して国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレット；同第２０１２／１６４８００号パンフレット及び同第２０１４／１６４８３４号パンフレット（それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載された配列番号１４３を含む変異サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）のα－アミラーゼである。
本明細書で使用するように、「アミラーゼ４」は、概して国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレット；同第２０１２／１６４８００号パンフレット及び同第２０１４／１６４８３４号パンフレット（それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載された配列番号１４７を含む変異サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）のα－アミラーゼである。
本明細書で使用するように、「アミラーゼ５」は、概して国際公開第２００８／１５３８０５号パンフレット及び米国特許出願第２０１４／００５７３２４号明細書（それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載された配列番号１５１を含む変異バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の７０７アルカリ性α－アミラーゼである。
本明細書で使用するように、「Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ」と称される本明細書の変異Ｃａｓ９タンパク質は、国際公開第２０１９／１１８４６３号パンフレット（参照により本明細書に全体として組み込まれる）に記載されている。
本明細書で使用する用語「改変」及び「遺伝子改変」は、互換的に使用され、以下：（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節／制御エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子の破壊、（ｃ）遺伝子の変換、（ｄ）遺伝子の欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的変異誘発、及び／又は（ｇ）本明細書に開示される任意の１つ以上の遺伝子のランダム変異誘発を含む。
本明細書で使用するように、例えば「改変宿主細胞が（未改変）親宿主細胞に比較して増加した量の１種以上の関心対象のタンパク質を発現／産生する」などの語句において使用する場合の「増加した量」は、特に、改変宿主細胞内で発現／産生した任意の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）の「増加した量」を指すが、この「増加した量」は常に同一ＰＯＩを発現／産生する（未改変）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関し、ここで改変及び未改変細胞は、同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵させられる。例えば、増加した量のＰＯＩは、本開示の改変バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞において発現した内因性バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のＰＯＩであっても異種ＰＯＩであってもよい。
本明細書で使用するように、タンパク質産生を「増加させる」又は「増加した」タンパク質産生は、増加した量の産生したタンパク質（例えば、関心対象のタンパク質）を意味する。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地中へ分泌（又は、輸送）されてもよい。所定の実施形態では、関心対象のタンパク質は、培養培地中へ産生（分泌）される。増加したタンパク質産生は、例えば、親宿主細胞と比較して、より高い最大レベルのタンパク質若しくは酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性など）として、又は産生される総細胞外タンパク質として検出され得る。
本明細書で使用する用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。したがって、用語「発現」には、以下に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などのポリペプチドの産生に関与する任意の工程が含まれる。
本明細書で使用するように、「核酸」は、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれを表していても、二本鎖であっても一本鎖であってもよいヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片若しくは部分並びにゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、複数のヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
本明細書に記載したポリヌクレオチド（又は核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」が含まれることは理解されている。
したがって、用語「遺伝子」は、タンパク質のコーディング配列の全部又は一部を含む、アミノ酸の特定配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）並びにコーディング配列を含み得る。
本明細書で使用する用語「コーディング配列」は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コーディング配列の境界は、通常、ＡＴＧ開始コドンで開始する、概してオープンリーディングフレーム（以下では「ＯＲＦ」）によって決定される。コーディング配列としては、典型的には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組み換えヌクレオチド配列が挙げられる。
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよい、又は天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよい、又は合成核酸セグメントを含んでいてさえよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で遺伝子の発現を最も多く引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。更に、殆どの場合に調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることは確認されている。
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、そのコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、分泌リーダー（即ち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合は、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコーディング配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、及び分泌リーダーの場合には、隣接し、且つリーディング期にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
本明細書で使用するように、「関心対象のタンパク質のコーディング配列の遺伝子に連結した関心対象の遺伝子の発現を制御する機能的プロモーター配列（又はそれらのオープンリーディングフレーム）」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるコーディング配列の転写及び翻訳を制御するプロモーター配列を指す。例えば、所定の実施形態では、本開示は、５’プロモーター（又は、５’プロモーター領域若しくはタンデム５’プロモーターなど）を含むポリヌクレオチドであって、そのプロモーター領域がタンパク質をコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結しているポリヌクレオチドに向けられる。
本明細書で使用するように、「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、コーディング配列内又はコーディング配列の下流（３’非コーディング配列）に位置しており、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を含み得る。
本明細書で使用する、「細菌細胞内に導入する工程」又は「Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを導入する工程」等の語句に使用される用語「導入する工程」は、例えば、プロトプラスト融合法、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）法、形質導入法、トランスフェクション法、共役法等を含むがそれらに限定されない、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための当該技術分野で公知の方法を含む（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
本明細書で使用するように、「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組み換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、典型的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ又は遺伝子）を細胞に挿入することによって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（即ち、形質転換対象の細胞には天然に存在しない配列）であってもよい。したがって、一般的に「形質転換」は、ＤＮＡが、染色体組み込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外因性ＤＮＡを宿主細胞に導入することを指す。
本明細書で使用するように、「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」、及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡを指す。形質転換ＤＮＡは、配列を宿主細胞又は生物に導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは、入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、ホモロジーボックスに隣接された入来配列を更に含む。更に別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。
本明細書で使用するように、「遺伝子の破壊」又は「遺伝子破壊」は、互換的に使用され、宿主細胞が機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生することを実質的に妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。したがって、本明細書で使用するように、遺伝子破壊には、フレームシフト突然変異、未成熟終止コドン（即ち、機能的タンパク質が作製されないような）、タンパク質の内部欠失の活性を排除若しくは低減させる置換（機能的タンパク質が作製されないような）、コーディング配列を破壊する挿入、転写のために必要とされる天然プロモーターとオープンリーディングフレームなどの間の作動可能な連結を除去する突然変異が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用するように、「入来配列」は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の関心対象のタンパク質をコードする。一部の実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（即ち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。一部の実施形態では、入来配列は、１種以上の関心対象のタンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。いくつかの実施形態では、非機能的配列は、遺伝子の機能を破壊するために遺伝子に挿入され得る。別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。更に別の実施形態では、入来配列は、２つのホモロジーボックスを含む。
本明細書で使用するように、「ホモロジーボックス」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、ホモロジーボックスは、本発明に従って、欠失した、破壊した、不活化した、ダウンレギュレートしたなどの遺伝子又は遺伝子の一部の直接隣接するコーディング領域と約８０～１００％の配列同一性、約９０～１００％の配列同一性又は約９５～１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる場所を指示し、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、ホモロジーボックスには、約１塩基対（ｂｐ）～２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、ホモロジーボックスは、約１ｂｐ～１０．０ｋｂ；１ｂｐ～５．０ｋｂ；１ｂｐ～２．５ｋｂ；１ｂｐ～１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ～２．５ｋｂを含む。ホモロジーボックスはまた、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。一部の実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端は、ホモロジーボックスに隣接されるが、ここでホモロジーボックスは、遺伝子のコーディング領域に直接隣接する核酸配列を含む。
本明細書で使用する用語「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、宿主細胞中で発現可能であり、選択可能マーカーの発現が発現した遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与するヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用する用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現できる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が関心対象の入来ＤＮＡを取り込めたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。典型的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外因性配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
「存在する選択可能マーカー」は、形質転換対象の微生物の染色体上に所在するマーカーである。存在する選択可能マーカーは、形質転換ＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者にはよく知られている。上記で示したように、マーカーは、抗微生物耐性マーカー（例えば、ａｍｐＲ、ｐｈｌｅｏＲ、ｓｐｅｃＲ、ｋａｎＲ、ｅｒｙＲ、ｔｅｔＲ、ｃｍｐＲ及びｎｅｏＲ（例えば、Ｇｕｅｒｏｔ－Ｆｌｅｕｒｙ，１９９５；Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；及びＴｒｉｅｕ－Ｃｕｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照）であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、並びにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において、並びに染色体に組み込まれたカセット及び統合的プラスミドの染色体増幅を包含する実施形態において、特に有用である（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ ａｎｄ Ｇａｌｉｚｚｉ，１９８５；Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒｉ，１９８４を参照）。本発明にしたがって有用な他のマーカーとしては、セリン、リシン、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、及びβ－ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で定義するように、宿主細胞の「ゲノム」、細菌（宿主）細胞の「ゲノム」、又はバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（宿主）細胞の「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。
本明細書で使用する用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、典型的には細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を頻繁に運ぶ、及び通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外エレメントを指す。そのような要素は、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構造に接合又は再結合されている任意の起源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよい。
本明細書で使用する用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用され、且つ多くの細菌及び幾つかの真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構築物を指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるようになり、いくつかの実施形態では、プラスミドは、親細胞内に存在し、娘細胞内では失われている。
本明細書で使用する「形質転換カセット」は、遺伝子（又は、そのＯＲＦ）を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。
本明細書で使用する用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子又はＤＮＡセグメントを細胞内に運ぶことができる任意の核酸を指す。したがって、この用語は、様々な宿主細胞間を輸送するために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソームである」（即ち、自律的に複製するか、又は宿主生物の染色体に組み込むことができる）、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。
「発現ベクター」は、細胞内に異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者には知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
本明細書で使用する用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組み換えにより、又は合成的に生成される核酸構築物（即ち、これらは、上述したベクター若しくはベクターエレメントである）を指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片内に組み込むことができる。通常、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も含まれる。所定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。
本明細書で使用するように、「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入する際に使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクターへの挿入などのように、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。例えば、所定の実施形態では、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞は、その中に１つ以上の「ターゲティングベクター」を導入することによって改変（例えば、形質転換）される。
本明細書で使用する用語「関心対象のタンパク質」若しくは「ＰＯＩ」は、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）宿主細胞中で発現するのが望ましく、ＰＯＩは、増加した（即ち、「未改変」（親）細胞に比較して）レベルで発現する関心対象のポリペプチドを指す。したがって、本明細書で使用するように、ＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質などであってよい。所定の実施形態では、本開示の改変細胞は、親細胞に比較して増加した量の関心対象の異種タンパク質若しくは関心対象の内在性タンパク質を産生する。特定の実施形態では、本開示の改変細胞によって産生した増加した量の関心対象のタンパク質は、親細胞と比較して、少なくとも０．５％の増加、少なくとも１．０％の増加、少なくとも５．０％の増加又は５．０％超の増加である。
同様に、本明細書で規定した「関心対象の遺伝子」若しくは「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子若しくはＯＲＦ）を指す。「関心対象のタンパク質」をコードする「関心対象の遺伝子」は、天然型遺伝子、突然変異遺伝子又は合成遺伝子であってよい。
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含んでいてもよく、また、非アミノ酸によって分断されていてもよい。ポリポチペプチドという用語はまた、自然に、或いは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化成分との結合などの任意の他の操作若しくは改変によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
所定の実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせ）などの商業的に関連する工業用の関心対象のタンパク質をコードする。
本明細書で使用するように、「変異」ポリペプチドは、一般的には組み換えＤＮＡ技術による、１個以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失による親（若しくは参照）ポリペプチドに由来するポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドとは異なる可能性があり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義され得る。
好ましくは、変異ポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用するように、「変異」ポリヌクレオチドは、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、この「変異ポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと特定の程度の配列相同性／同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（又は、その相補体）とハイブリダイズする。好ましくは、変異ヌクレオチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。
本明細書で使用するように、「突然変異」は、核酸配列内の任意の変化又は変更を指す。点突然変異、欠失突然変異、サイレント突然変異、フレームシフト突然変異、スプライシング突然変異などを含む数種のタイプの突然変異が存在する。突然変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株を通しての継代によって）行われ得る。
本明細書で使用するように、ポリペプチド若しくはその配列に関連して、用語「置換」は、１つのアミノ酸とまた別のアミノ酸との取り換え（即ち、置換）を意味する。
本明細書で規定した「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。
本明細書で規定した「異種」遺伝子、「非内在性」遺伝子又は「外来」遺伝子は、通常は宿主生物中では見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子（若しくはＯＲＦ）を指す。本明細書で使用する用語「外来」遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。
本明細書で定義するように、「異種制御配列」は、天然では関心対象の遺伝子の発現を調節（制御）するために機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、その中にそれらが存在する細胞又はゲノムの一部に対して内因性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられている。「異種」核酸構築物は、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同一又は異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。
本明細書で使用する用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟タンパク質又はタンパク質の前駆体形の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、一般的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外因性であってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
用語「由来する」には、用語「～から生じた」、「～から得られた」、「～から入手可能な」及び「～から作製された」が含まれ、一般には、１つの特定の材料若しくは組成物が別の材料若しくは組成物にその起源が見出されるか、又は他の特定の材料若しくは組成物を参照して記載できる特徴を有することを示す。
本明細書で使用する用語「相同性」は、相同ポリヌクレオチド又は相同ポリペプチドに関する。２つ以上のポリヌクレオチド又は２つ以上のポリペプチドが相同である場合、これは、それらの相同のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有することを意味している。２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列が、本明細書で定義するように相同であるほどの十分に高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で知られるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）を使用して２つの配列をアラインさせることにより好適に調べることができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）。ＤＮＡ配列比較のために以下の：ＧＡＰ作製ペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）５．０及びＧＡＰ伸長ペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．３の設定でＧＡＰを使用する。
本明細書で使用する用語「同一性パーセント（％）」は、配列アラインメントプログラムを使用してアラインさせた場合の、ポリペプチドをコードする核酸配列間又はポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸又はアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。
本明細書で使用するように、「比生産性」は、所定の期間にわたって、細胞１個当たり、単位時間当たりに産生するタンパク質の総量を指す。
本明細書で定義する用語「精製（された）」、「単離（された）」又は「濃縮（された）」は、生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、それが本来結合している、天然型の一部若しくは全部の構成要素から分離することによって、その天然状態から改変されることを指す。そのような単離若しくは精製は、最終組成物中の望ましくない全細胞、細胞残屑、不純物、外来タンパク質又は酵素を除くための、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈澱若しくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、又は勾配による分離などの当該技術分野で知られる分離技術によって実施することができる。精製又は単離した生体分子組成物には、その後更に、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨ調節化合物又は他の酵素若しくは化学物質を添加することができる。
本明細書で使用する用語「ＣｏｍＫポリペプチド」は、ｃｏｍＫ遺伝子の産物；コンピテンスの発達の前の最終自己調節制御スイッチとして作用する転写因子として定義され；ＤＮＡ結合及び取り込み並びに組み換えに関与する後期コンピテンス遺伝子の発現の活性化に関与する（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｚｕｂｅｒ，１９９８，Ｈａｍｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。典型的なＣｏｍＫ核酸は、配列番号９２に示されている。
本明細書で使用するように、「組み換え」は、異種核酸配列の導入によって改変されている、又は細胞がそのように改変された細胞に由来する細胞又はベクターへの言及が含まれる。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内の同一形態においては見出されない遺伝子を発現する、又はヒトが意図的に介入した結果として、さもなければ異常に発現する、過少発現する、若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え」、「組み換える（こと）」又は「組み換え」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の集合体であり、ここで集合体は、キメラ遺伝子を発生させる。
本明細書で使用するように、「フランキング配列」は、考察対象の配列の上流又は下流にある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣの遺伝子配列にフランキングされている）。所定の実施形態では、入来配列は、両側でホモロジーボックスにフランキングされている。また別の実施形態においては、入来配列及びホモロジーボックスは、両側でスタッファー配列によってフランキングされている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各ホモロジーボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体内の配列と相同である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体のどこに新規な構築物が組み込まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指示する。他の実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、不活化染色体セグメントの一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は、一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
ＩＩ．強化したタンパク質産生表現型を含む改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞
概して以下の実施例のセクションにおいて記載したように、本出願人は、一連の宿主改変を構築し、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株内に導入した。より特別には、以下の実施例に示したように（例えば、表１８を参照されたい）、この実施例において使用した親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、ｓｅｒＡ１遺伝子（配列番号３０）及びｌｙｓＡ遺伝子（配列番号８７）の欠失を含み、ＢＦ１４０（ΔｓｅｒＡ＿ΔｌｙｓＡ）と名称が付けられた。本出願人は、引き続いて、（１）天然ｐｒｓＡタンパク質（ＢＦ５６１と称する；第２のコピーｐｒｓＡ）をコードする野生型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡ遺伝子の第２のコピーの導入、（２）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｄｌｔＡ遺伝子の欠失（ＢＦ５９８と称する；ΔｄｌｔＡ＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）、（３）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子の欠失（ＢＦ６０２と称するｇｈＲ２＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）及び（４）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ２遺伝子及びｄｌｔＡ遺伝子の結合した欠失（ＢＦ６１３と称する；ΔｒｇｈＲ２＿ΔｄｌｔＡ＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）を含む所定の遺伝子改変を親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株（ＢＦ１４０）内に導入した。
上記の改変菌株の構築後、一連のα－アミラーゼ発現カセットを改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株（ＢＦ５６１、ＢＦ５９８、ＢＦ６０２及びＢＦ６１３）及び親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株（ＢＦ１４０）内に導入した。より特別には、下記の実施例４に提示したように、５つの異なるα－アミラーゼ発現カセット（即ち、「アミラーゼ１」、「アミラーゼ２」「アミラーゼ３」、「アミラーゼ４」及び「アミラーゼ５」）中の２つのコピーをＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株内に導入した。
更に以下の実施例５に記載したように、アミラーゼ１～５についての２つのコピーの発現カセットを含有する親（ＢＦ１４０）及び改変（ＢＦ５６１、ＢＦ５９８、ＢＦ６０２及びＢＦ６１３）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株をアミラーゼの産生についてアッセイした（例えば、表１９を参照されたい）。例えば、多様な群のα－アミラーゼから試験した全５種のアミラーゼは、未改変親宿主ＢＦ１４０に比較して、欠失ｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）対立遺伝子（配列番号１２５）、欠失ｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子（配列番号８０）を含む天然ＢＦ６１３の改変したバックグラウンド（ΔｒｇｈＲ２＿ΔｄｌｔＡ＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）におけるα－アミラーゼの産生における改善及びｐｒｓＡプロモーター（配列番号１２４）によって制御された第２のコピーの挿入を示している。アミラーゼ２及びアミラーゼ３について、欠失ｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子（配列番号８０）及び天然ｐｒｓＡプロモーター（配列番号１２４）によって制御される天然ｐｒｓＡ遺伝子の第２のコピーを含むＢＦ６０２の改変したバックグラウンド（ΔｒｇｈＲ２＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）におけるα－アミラーゼ産生における改善は、ＢＦ６１３改変宿主において見られる生産性の改善とほぼ同等に良好である。この観察所見は、いくつかのアミラーゼについて、生産性の改善には、これらの２つの対立遺伝子（即ち、ΔｒｇｈＲ２＿２ｎｄ ｃｏｐｙ ｐｒｓＡ）の存在だけを必要とし、及びΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子の存在は、この改善にとって有害ではないことを示唆している。
ＩＩＩ．分子生物学
上で概して説明したように、本開示の所定の実施形態は、親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞に関する。より特別には、本開示の所定の実施形態は、増加したタンパク質産生能力、増加した二次代謝産物産生能力などのそのような改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を生成及び構築するための、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞、及びその方法に関する。
所定の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする遺伝子若しくはＯＲＦの導入された第２のコピーを含む。他の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、欠失ｄｌｔＡ遺伝子を含む。所定の他の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質及び欠失ｄｌｔＡ遺伝子をコードする遺伝子若しくはＯＲＦの導入された第２のコピーを含む。他の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、欠失ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。所定の他の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質及び欠失ｒｇｈＲ２遺伝子をコードする遺伝子若しくはＯＲＦの導入された第２のコピーを含む。他の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、欠失ｄｌｔＡ遺伝子及び欠失ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。所定の他の実施形態では、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質、欠失ｄｌｔＡ遺伝子及び欠失ｒｇｈＲ２遺伝子をコードする遺伝子若しくはＯＲＦの導入された第２のコピーを含む。
したがって、本開示の所定の実施形態は、本開示の親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の遺伝子を改変（変更）して、その改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、及びより特別には（非改変）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、増加した量の関心対象の内因性及び／又は異種タンパク質を産生する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を生成するための組成物及び方法を提供する。
したがって、本開示の所定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を遺伝子改変する方法であって、その改変が、（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子の破壊、（ｃ）遺伝子の変換、（ｄ）遺伝子の欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）部位特異的変異誘発、及び／或いは（ｇ）ランダム変異誘発を含む方法に向けられる。
所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、当該技術分野において周知である方法、例えば、挿入、破壊、置換又は欠失を使用して、上記に規定した遺伝子の発現を減少させる、又は排除することによって構築される。改変又は不活化対象の遺伝子の部分は、例えば、コーディング領域、又はコーディング領域を発現させるために必要とされる調節エレメントであってよい。
そのような調節配列又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（即ち、核酸配列の発現に十分に影響を及ぼす部分）であり得る。改変のための他の制御配列としては、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子などが挙げられるがこれらに限定されない。
所定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、本開示の上記の遺伝子の少なくとも１つの発現を排除若しくは減少させるための遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が減少した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子にフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するように構築されているプラスミドを用い、相同組み換えによって遂行され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で樹立されることを可能にする許容温度で第２の選択可能マーカーと会合しているｐＥ１９４などの感温性プラスミドでバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入され得る。細胞はその後、相同フランキング領域の１つで染色体内に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択するために非許容温度へシフトされる。プラスミドを組み込むための選択は、第２の選択可能マーカーの選択によって実施される。組み込み後、第２の相同フランキング領域での組み換え事象は、選択せずに細胞を数世代に渡り許容温度へシフトさせることによって刺激される。細胞をプレーティングして単一コロニーを得、このコロニーを両方の選択可能マーカーの消失について試験する（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３を参照）。したがって、当業者は、完全又は部分的欠失に好適な遺伝子のコーディング配列及び／又は遺伝子の非コーディング配列中のヌクレオチド領域を容易に同定し得る。
他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、それらの転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入するか、置換するか、又は除去することによって構築される。例えば、ヌクレオチドは、終止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトを生じさせるように挿入又は除去することができる。そのような改変は、当該技術分野で知られる方法にしたがって、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発によって行われ得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９、及びＳａｒｋａｒ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。したがって、所定の実施形態では、本開示の遺伝子は、完全又は部分的欠失によって不活化される。
別の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列は、インビトロで変異させられて欠陥のある核酸配列を生成し、これは、その後親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換されて欠陥のある遺伝子を生成する。相同組み換えによって、欠陥のある核酸配列は、内在性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片はまた、欠陥のある遺伝子を含む形質転換体の選択に使用することができるマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合して、非複製又は温度感受性プラスミドに導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミドを複製させない条件下でのマーカー選択によって達成される。遺伝子置換をもたらす第２の組み換え事象の選択は、選択可能マーカーの欠損及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調べることによって達成される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。或いは、欠陥のある核酸配列は、以下に記載されるとおり、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換、又は欠失を含有し得る。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より詳細には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減（ダウンレギュレート）又は排除することができ、それは細胞中で転写され得、細胞中で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、したがって、翻訳されるタンパク質の量は低減又は排除される。このようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられ、これらの全てが当業者によく知られている。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集によって作製／構築される。例えば、関心対象のタンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆ１又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）に結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって編集又は破壊（又は欠失又はダウンレギュレート）されてもよく、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失させるために提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ（この目的のためには、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）をコードする遺伝子、又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これによりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、関心対象の遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。例えば、関心対象の遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するためには、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’側である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせによって、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。
特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’側は、編集鋳型を生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’側に融合させることができ、その鋳型は、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の機構によって使用される。
Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることによる、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、これらの断片は、編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマーを使用して配列決定される。
更に他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、化学的変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照されたい）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むがそれらに限定されない当該技術分野においてよく知られる方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的突然変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に突然変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が低減若しくは排除されている突然変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。特異的であってもランダムであってもよい突然変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成突然変異誘発（ＰＣＲ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）にかけることによって実施され得る。更に、この突然変異誘発は、これらの突然変異誘発法の任意の組み合わせの使用により実施され得る。
本発明のために好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、突然変異誘発は、典型的には、好適な条件下で最適な変異誘発剤の存在下で突然変異誘発対象の親細胞をインキュベートする工程、及び遺伝子の減少した発現を示す、又は発現を示さない突然変異細胞を選択する工程によって実施される。
所定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、内因性遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、内在性遺伝子の破壊を含む。所定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド破壊カセットは、マーカー遺伝子を含む。
他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ダウンレギュレートされた内因性遺伝子を含む。例えば、所定の実施形態では、上記に規定した１つ以上の遺伝子をダウンレギュレートする工程は、その遺伝子の上流若しくは下流の調節要素を欠失又は破壊する工程を含む。
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をバイパスするためにＰＣＲ融合を使用するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡ構築物の作製を開示する。
国際公開第２００２／１４４９０号パンフレットは、（１）組み込みプラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コーディング配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム変異誘発、（３）相同組み換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することにより形質転換効率を増大させること、（５）二重交差組み込みを最適化すること、（６）部位特異的変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法を開示する。
当業者は、細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．））中にポリヌクレオチド配列を導入するために好適な方法を十分に承知している（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６７；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，１９８５；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８１及びＭｃＤｏｎａｌｄ，１９８４を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入並びにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法は公知であり、本開示での使用に適している。形質転換法は、特に、本開示のＤＮＡ構築物を宿主細胞内に導入するために好ましい。
一般に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、直接的に形質転換させられる（即ち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡ構築物を増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために中間細胞が使用されない）。ＤＮＡ構築物の宿主細胞内への導入には、プラスミド又はベクター内へ挿入することなく、ＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当該技術分野において知られるそれらの物理的及び化学的方法が含まれる。このような方法としては、以下に限定されないが、塩化カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、裸のＤＮＡ法、リポソーム法などが挙げられる。追加の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換される。さらなる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において知られる方法によって改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から欠失、又は実質的に切除される（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。いくつかの実施形態では、宿主染色体由来のベクターの分解は、染色体内のフランキング領域を残すが、一方、固有の染色体領域を除去する。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子の発現において使用するためのプロモーター及びプロモーター配列、それらのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はそれらの変異配列は、一般に当業者に知られている。本開示の本開示のプロモーター配列は、一般に、それらがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞など）内で機能的であるように選択される。所定の典型的なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター配列を、表６に示す。同様に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子発現を駆動するために有用なプロモーターとしては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｔａｒｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、変異ａｐｒＥプロモーター（国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）、又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくは他の関連バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の任意の他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。所定の他の実施形態では、プロモーターは、米国特許出願公開第２０１４／０３２９３０９号明細書に開示されたリボソームタンパク質プロモーター又はリボソームＲＮＡプロモーター（例えば、ｒｒｎＩプロモーター）である。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において広範囲の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製する方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。
ＩＶ．関心対象のタンパク質を産生するためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の培養
他の実施形態では、本開示は、非改変（親）細胞と比較して（即ち、それに対して）、改変細菌細胞のタンパク質生産性を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、改変細菌細胞を発酵させる／培養する工程を含む関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）の産生方法であって、改変細胞が、ＰＯＩを培養培地中に分泌する方法に向けられる。本開示の改変及び未改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を発酵させるためには、当該技術分野でよく知られた発酵方法を適用することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で培養される。古典的なバッチ発酵は、閉鎖系であり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない。発酵の開始時に、培地には所望の生物が接種される。この方法では、この系にいかなる成分も添加することなく醗酵が許容される。典型的には、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子の制御が頻繁に行われる。バッチ系の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止される時点まで絶えず変化する。一般的なバッチ培養では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少又は停止する静止期に進み得る。処理されなければ、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。一般的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行に伴い基質が徐々に加えられる。フェドバッチ系は、異化生成物の抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系では、実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、知られている。
連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持するが、ここで細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメーターは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の当該技術分野においてはよく知られている。
したがって、所定の実施形態では、形質転換（改変）宿主細胞によって産生されたＰＯＩは、従来の手順、例えば、宿主細胞を培地から遠心分離若しくは濾過によって分離する、又は必要であれば、細胞を破壊し、上清を細胞破砕物及び細胞片から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。典型的には、清浄化後、上清又は濾液のタンパク質成分は、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって沈澱させられる。次いで、沈澱したタンパク質を可溶化させ、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などの様々なクロマトグラフィー法により精製してもよい。
Ｖ．改変（宿主）細胞により産生される関心対象のタンパク質
本開示の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内因性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩの変異体であってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質であり、即ち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、好ましくは関心対象の特性を備えるタンパク質である。
例えば、以下の実施例に記載したように、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、増加した量の関心対象の内因性及び／又は異種タンパク質を産生する。したがって、所定の実施形態では、本開示の改変細胞は、内因性ＰＯＩ、異種ＰＯＩ、又はそのようなＰＯＩの１つ以上の組み合わせを発現する。例えば、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、増加した量の内因性ＰＯＩを産生する。他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、増加した量の異種ＰＯＩを産生する。
したがって、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（対照）細胞と比較して増加した量のＰＯＩを産生し、そのＰＯＩの増加量は、少なくとも約０．０１％の増加、少なくとも約０．１０％の増加、少なくとも約０．５０％の増加、少なくとも約１．０％の増加、少なくとも約２．０％の増加、少なくとも約３．０％の増加、少なくとも約４．０％の増加、少なくとも約５．０％の増加、又は５．０％を超える増加である。所定の実施形態では、ＰＯＩの増加量は、酵素活性を試験することによって、及び／又はその比生産性（Ｑｐ）を試験／定量することによって決定される。同様に、当業者は、１種以上の関心対象のタンパク質の発現又は産生を検出、試験、測定するなどのために、当該技術分野で知られる他の定型の方法及び技術を利用し得る。
所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、（非改変）親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、ＰＯＩの増加した比生産性（Ｑｐ）を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）の検出は、タンパク質の産生を評価するために好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中に産生されるタンパク質のグラムであり、「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラムであり、「ｈｒ」は、接種時点からの発酵時間（時間）であり、これは、産生時間及び増殖時間を含む）を使用して決定することができる）によって決定できる。
したがって、所定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、未改変（親）細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリザーゼ（ｇｌｕｃａｎ ｌｙｓａｓｅｓ）、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
したがって、所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、酵素番号（ＥＣ）のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５若しくはＥＣ６から選択される酵素である。
例えば、所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ－乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１－脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ－リポキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。
所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｓｕｃｒａｓｅ））、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α－グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４－α－グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２－β－オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２－α－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］－アデニリル－Ｌ－チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール－エステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸加水分解酵素）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３－フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル－フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ－１，６－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド－１，６－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α－１，６－グルカン－６－グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα－１，２－グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ－アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α－グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ－β－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド－１，６－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β－アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β－フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４－β－キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド－１，３－β－Ｄ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α－Ｌ－ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α－Ｌ－フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α－Ｎ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド－１，３－α－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４－α－ガクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１－β－Ｄ－フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド－１，６－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２－（１，３）－α－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ－フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ－ポリ－α－ガラクツロニシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ－カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド－１，４－β－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４－β－セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル－グリコプロテインエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド－１，５－α－Ｌ－アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル－ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル－ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコールペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ－アシル－脂肪族－Ｌ－アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質－Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド－Ｎ（４）－（Ｎ－アセチル－β－グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ－アシル－Ｄ－アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．－（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。
所定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１－エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）－α－Ｄ－グルカン１－α－Ｄ－グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。
更に他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４－クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ－アミノ酸α－リガーゼ）９から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。
したがって、所定の実施形態では、工業用プロテアーゼを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、特に好ましい発現宿主を提供する。同様に、所定の他の実施形態では、工業用アミラーゼを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、特に好ましい発現宿主を提供する。
例えば、典型的にはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）によって分泌されるプロテアーゼには、２つの一般型、即ち、中性（又は「金属プロテアーゼ」）及びアルカリ性（又は「セリン」）プロテアーゼがある。例えば、バチルス・サブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）タンパク質（酵素）は、本開示において使用するための典型的なセリンプロテアーゼである。多種多様なバチルス・サブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７及びサブチリシン３０９が同定及びシーケンシングされている（例えば、国際公開第１９８９／０６２７９号パンフレット；及びＳｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。本開示のいくつかの実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、変異（ｍｕｔａｎｔ）（即ち、変異（ｖａｒｉａｎｔ））プロテアーゼを産生する。数多くの参考文献、例えば、国際公開第１９９９／２０７７０号パンフレット；同第１９９９／２０７２６号パンフレット；同第１９９９／２０７６９号パンフレット；同第１９８９／０６２７９号パンフレット；米国再発行特許第３４，６０６号明細書；米国特許第４，９１４，０３１号明細書；同第４，９８０，２８８号明細書；同第５，２０８，１５８号明細書；同第５，３１０，６７５号明細書；同第５，３３６，６１１号明細書；同第５，３９９，２８３号明細書；同第５，４４１，８８２号明細書；同第５，４８２，８４９号明細書；同第５，６３１，２１７号明細書；同第５，６６５，５８７号明細書；同第５，７００，６７６号明細書；同第５，７４１，６９４号明細書；同第５，８５８，７５７号明細書；同第５，８８０，０８０号明細書；同第６，１９７，５６７号明細書及び同第６，２１８，１６５号明細書が、変異プロテアーゼの例を提供している。したがって、所定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、プロテアーゼをコードする発現構築物を含む。
所定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、アミラーゼをコードする発現構築物を含む。広範囲のアミラーゼ酵素及びそれらの変異体は、当業者には公知である。例えば、国際公開第２００６／０３７４８４号パンフレット及び同第２００６／０３７４８３号パンフレットは、溶媒安定性が改善された変異α－アミラーゼを記載しており、同第１９９４／１８３１４号パンフレットは、酸化的に安定なα－アミラーゼ変異体を開示しており、同第１９９９／１９４６７号パンフレット、同第２０００／２９５６０号パンフレット及び同第２０００／６００５９号パンフレットは、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α－アミラーゼ変異体を開示しており、同第２００８／１１２４５９号パンフレットは、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７番に由来するα－アミラーゼ変異体を開示しており、同第１９９９／４３７９４号パンフレットは、マルトジェニックα－アミラーゼ変異体を開示しており、同第１９９０／１１３５２号パンフレットは、超耐熱性α－アミラーゼ変異体を開示しており、同第２００６／０８９１０７号パンフレットは、粒状デンプン加水分解活性を有するα－アミラーゼ変異体を開示している。
他の実施形態では、本開示の改変細胞内で発現及び産生されるＰＯＩ又は変異ＰＯＩは、ペプチド、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ Ｅ７など）、それらの変異体、それらの断片などである。他のタイプの関心対象のタンパク質（若しくは変異体）は、食品又は作物に栄養価を提供することのできるタンパク質であり得る。非限定的な例としては、抗栄養因子の形成を阻害できる植物タンパク質及びより望ましいアミノ酸組成（例えば、非トランスジェニック植物より高いリシン含量）を有する植物タンパク質が挙げられる。
細胞内及び細胞外で発現したタンパク質の活性を検出及び測定するためには、当業者には公知の様々な方法がある。特に、プロテアーゼについては、２８０ｎｍでの吸光度として測定される、又はフォリン法を使用して比色定量により測定されるカゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがある（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。他のアッセイには、発色性基質の可溶化が包含される（例えば、Ｗａｒｄ，１９８３を参照）。他の典型的なアッセイとしては、スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－パラ－ニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者に知られる多数の追加の文献が、好適な方法を提供する（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４及びＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照されたい）。
国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットは、本明細書に記載したアミラーゼ活性のために有用なＣｅｒａｌｐｈａ α－アミラーゼ活性アッセイを開示している。
宿主細胞中の関心対象のタンパク質の分泌レベルを決定し、発現したタンパク質を検出するための手段には、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体いずれかを用いるイムノアッセイの使用が挙げられる。その例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
ＶＩ．典型的な実施形態
本開示の非限定的実施形態としては、以下が含まれるがそれらに限定されない。
１．改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞における増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）その中に天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含むポリヌクレオチドを導入することによって、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を改変する工程、及び（ｂ）ＰＯＩの産生のために好適な条件下で改変細胞を発酵させる工程を含み、ここで改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合の親細胞に比較して、増加した量のＰＯＩを産生する方法。
２．改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞における増加した量の異種関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって、（ａ）その中に（ｉ）ＰＯＩをコードする発現カセット及び（ｉｉ）天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを導入することによって、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を改変する工程、及び（ｂ）ＰＯＩの産生のために好適な条件下で工程（ａ）の改変細胞を発酵させる工程を含み、ここで改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合の親細胞に比較して、増加した量のＰＯＩを産生する方法。
３．導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーター配列を含む、実施形態１又は実施形態２の方法。
４．導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦを含む、実施形態１又は実施形態２の方法。
５．親細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性ｐｒｓＡ遺伝子を含む、実施形態１又は実施形態２の方法。
６．内因性ｐｒｓＡ遺伝子は、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする、実施形態５の方法。
７．導入されたポリヌクレオチドは、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のゲノム内に組み込まれる、実施形態１又は実施形態２の方法。
８．改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を更に含む、実施形態１又は実施形態２の方法。
９．改変細胞は、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を更に含む、実施形態１又は実施形態２の方法。
１０．改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む、実施形態１又は実施形態２の方法。
１１．ＰＯＩは、酵素である、実施形態１又は実施形態２の方法。
１２．酵素は、プロテアーゼ又はアミラーゼである、実施形態１１の方法。
１３．親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーター配列を含む導入されたポリヌクレオチドを含む、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
１４．天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性ｐｒｓＡ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーター配列を含む導入されたポリヌクレオチドを含む、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
１５．導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーターを含む、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
１６．導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦを含む、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
１７．導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
１８．導入されたポリヌクレオチドは、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のゲノム内に組み込まれる、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
１９．配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含む、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
２０．配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
２１．配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
２２．異種関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現カセットを含む、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
２３．ＰＯＩは、酵素である、実施形態２２の改変細胞。
２４．親細胞は、内因性ＰＯＩを発現する、実施形態１３又は実施形態１４の改変細胞。
２５．実施形態２２又は実施形態２４の改変細胞によって産生した関心対象のタンパク質。
２６．親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較して増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞は、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来し、改変細胞は、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーター配列を含む導入されたポリヌクレオチドを含み、配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含み、改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に親菌株に比較して増加した量のＰＯＩを産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
２７．配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含む、実施形態２６の改変細胞。
２８．親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に比較して増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、改変細胞は、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来し、改変細胞は、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含む導入されたポリヌクレオチドを含み、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子を含み、改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に親菌株に比較して増加した量のＰＯＩを産生する、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
２９．配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を更に含む、実施形態２８の改変細胞。
３０．天然ｐｒｓＡプロモーターは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む、実施形態２６又は実施形態２８の改変細胞。
３１．天然ｐｒｓＡ ＯＲＦは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、実施形態２６又は実施形態２８の改変細胞。
３２．天然ｐｒｓＡタンパク質は、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む、実施形態２６又は実施形態２８の改変細胞。
３３．ＰＯＩは、酵素である、実施形態２６又は実施形態２８の改変細胞。
３４．酵素は、プロテアーゼ又はアミラーゼである、実施形態３３の改変細胞。
３５．実施形態２６又は実施形態２８の改変細胞によって産生した、関心対象のタンパク質。
［実施例］
本発明の特定の態様は、以下の実施例に照らして更に理解することができるが、それらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。
ＲＧＨＲ２経路遺伝子を標的化するＣＡＳ９ベクターの構築
Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（配列番号１）由来のＣａｓ９タンパク質は、Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ、「ＡＰＫＫＫＲＫＶ」；配列番号３）、Ｃ末端ＮＬＳ（「ＫＫＫＫＬＫ」；配列番号４）及びデカ－ヒスチジンタグ（「ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ」；配列番号５）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーター（配列番号６）及びターミネーター配列（配列番号７）を加えてバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（配列番号２）に対してコドン最適化し、製造業者の使用説明書に従って、下記の表１に示したフォワード（配列番号８）プライマー及びリバース（配列番号９）プライマー対を用いてＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して増幅させた。
Figure 2023524334000001
 プラスミドｐＫＢ３２０（配列番号１１）の骨格（配列番号１０）は、製造業者の取扱説明書に従って、下記の表２に示したフォワード（配列番号１２）及びリバース（配列番号１３）プライマー対を用いるＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して増幅させた。
Figure 2023524334000002
 ＰＣＲ産物は、Ｚｙｍｏ ｃｌｅａｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ５カラムを製造業者の使用説明書に従って使用して精製した。続いて、ＰＣＲ産物は、等モル比にある２つの断片を混合してＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いる延長したオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＰＯＥ－ＰＣＲ）を用いて組み立てた。以下のＰＯＥ－ＰＣＲ反応サイクルを実行した：９８℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で４分１５秒間を３０サイクル。５μｌのＰＯＥ－ＰＣＲ（ＤＮＡ）を、製造業者の使用説明書に従ってＴｏｐ１０ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有し、１．５％寒天で固化させた溶原（Ｌ）培地（Ｍｉｌｌｅｒ処方；１重量／体積％のトリプトン、０．５重量／体積％酵母抽出物、１重量／体積％のＮａＣｌ）で選択した。コロニーを３７℃で１８時間増殖させた。コロニーを採取し、Ｑｉａｐｒｅｐ ＤＮＡミニプレップキットを製造業者の使用説明書に従って使用してプラスミドＤＮＡを調製し、５５μｌのｄｄＨ２Ｏ中に溶出させた。このプラスミドＤＮＡについてサンガーシーケンシングを行い、以下の表３に示すシーケンシングプライマーを使用して、正しい組み立てを検証した。
Figure 2023524334000003
正確に組み立てられたプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２５）を使用して、下記に記載するように標的部位１（ＴＳ１；配列番号２８）及び標的部位２（ＴＳ２；配列番号２９）でＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノムを編集するためのプラスミドｐＲＦ８０１（配列番号２６）及びｐＲＦ８０６（配列番号２７）を構築した。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム（配列番号３０）は、リバース方向に固有の標的部位（ＴＳ）である標的部位１（ＴＳ１；配列番号２８）を含有する。標的部位は、リバース方向にあるプロト－スペーサー隣接モチーフ（配列番号３１）に隣接する。標的部位は、可変標的化（ＶＴ）ドメイン（配列番号３２）をコードするＤＮＡに変換され得る。
ＶＴドメイン（配列番号３２）をコードするＤＮＡ配列は、細菌細胞のＲＮＡポリメラーゼによって転写されると、標的部位１を標的化する機能的ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号３４）を産生するように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ；配列番号３３）をコードするＤＮＡ配列に機能的に融合される。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、プロモーターが、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号３３）の（５’）に位置し、ターミネーターが、ｇＲＮＡ（配列番号３３）をコードするＤＮＡの下流（３’）に位置するように、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞において作動可能なプロモーター（例えば、ｓｐａｃプロモーター；配列番号３５）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ファージラムダのｔ０ターミネーター配列；配列番号３６）に作動可能に連結された。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ開裂に応答してｓｅｒＡ１遺伝子を欠失させるための編集鋳型は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する２本のホモロジーアームの増幅によって作製した。第１の断片は、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム（配列番号３７）の直ぐ上流の５００ｂｐに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ並びに下記の表４に列挙したフォワード（配列番号３８）プライマー及びリバース（配列番号３９）プライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは、第１の断片の３’末端上の第２の断片の５’末端と相同である１８ｂｐ及び第１の断片の５’末端のｐＲＦ６９４と相同である２０ｂｐを組み込んでいる。
Figure 2023524334000004
第２の断片は、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム（配列番号４０）の３’末端の直ぐ下流の５００ｂｐに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ並びに下記の表５に列挙したフォワード（配列番号４１）プライマー及びリバース（配列番号４２）プライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは、第２の断片の５’末端上の第１の断片の３’末端と相同である２８ｂｐ及び第２の断片の３’末端上のｐＲＦ６９４と相同である２１ｂｐを組み込んでいる。
Figure 2023524334000005
標的部位１のｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）、第１（配列番号３７）及び第２（配列番号４０）ホモロジーアームをコードするＤＮＡは、ｐＲＦ８０１（配列番号２６）、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号２）を含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のシャトルプラスミド、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム内の標的部位１を標的化するｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）並びに第１（配列番号３７）及び第２（配列番号４０）ホモロジーアームから構成される編集鋳型（配列番号４４）を生成する標準分子生物学技術を用いてｐＲＦ６９４（配列番号２５）内に組み立てた。プラスミドは、表３に示したオリゴを用いるサンガーシーケンシングによって検証した。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム（配列番号４５）は、リバース鎖上の固有の標的部位である標的部位２（ＴＳ２；配列番号２９）を含有する。この標的部位は、リバース鎖上にあるプロト－スペーサー隣接モチーフ（配列番号４６）に隣接する。標的部位（配列番号２９）をコードするＤＮＡ配列は、細菌細胞のＲＮＡポリメラーゼによって転写されると、標的部位２を標的化する機能的ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号４７）を産生するように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ；配列番号３３）をコードするＤＮＡ配列に機能的に融合される。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、プロモーターが、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号４７）の５’に位置し、ターミネーターがｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号４７）の３’に位置するように、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞において作動可能なプロモーター（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｓｐａｃプロモーター；配列番号３５）及びバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ラムダファージのｔ０ターミネーター配列；配列番号３６）に作動可能に連結された。
Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ開裂に応答してｒｇｈＲ１遺伝子を改変するための編集鋳型は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に由来する２本のホモロジーアームの増幅によって作製した。第１の断片は、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム（配列番号４８）の直ぐ上流の５００ｂｐに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従って、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ並びに下記の表６に列挙したプライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは、第１の断片の３’末端上の第２の断片の５’末端と相同である２３ｂｐ及び第１の断片の５’末端のｐＲＦ６９４と相同である２０ｂｐを組み込んでいる。
Figure 2023524334000006
第２の断片は、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム（配列番号５１）の３’末端の直ぐ下流の５００ｂｐに一致する。この断片は、製造業者の使用説明書に従って、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ並びに下記の表７に列挙したプライマーを用いて増幅させた。これらのプライマーは、第２の断片の５’末端上の第１の断片の３’末端と相同である２０ｂｐ及び第２の断片の３’末端上のｐＲＦ６９４と相同である２１ｂｐを組み込んでいる。
Figure 2023524334000007
標的部位２のｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５４）、第１（配列番号４８）及び第２（配列番号５１）ホモロジーアームをコードするＤＮＡは、ｐＲＦ８０６（配列番号２７）、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号２）を含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のシャトルプラスミド、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム内の標的部位２を標的化するｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５４）並びに第１（配列番号４８）及び第２（配列番号５１）ホモロジーアームから構成される編集鋳型（配列番号５５）を生成する標準分子生物学技術を用いて、ｐＲＦ６９４（配列番号２５）内に組み立てた。プラスミドは、表３に示したオリゴを用いるサンガーシーケンシングによって検証した。
ＣＡＳ９ Ｙ１５５Ｈ変異体及び関連標的化プラスミドの構築
本実施例では、Ｓ．ピオゲネ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）スＣａｓ９（配列番号５６）のＹ１５５Ｈ変異体をｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）及びｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）において構築した。ｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）若しくはｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）内にＹ１５５Ｈ変異体を導入するために、部位特異的突然変異誘発は、製造業者の取り扱い説明書に従って、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キット並びに鋳型ＤＮＡとしてｐＲＦ８０１（配列番号２６）若しくはｐＲＦ８０６（配列番号２７）を用いて、下記の表８に示したオリゴを使用して実施した。
Figure 2023524334000008
結果として生じた反応産物であるｐＲＦ８２７（配列番号５９）は、（Ｃａｓ９）Ｙ１５５Ｈ変異発現カセット（配列番号６０）、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム内のｇＲＮＡ標的化標的部位１をコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）、並びに第１（配列番号３７）及び第２（配列番号４０）ホモロジーアームから構成される編集鋳型（配列番号４４）；又は（Ｃａｓ９）Ｙ１５５Ｈ変異発現カセット（配列番号６０）、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム内の標的部位２を標的化するｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５４）並びに第１（配列番号４８）及び第２（配列番号５１）ホモロジーアームから構成される編集鋳型（配列番号５５）を含むｐＲＦ８５６（配列番号６１）を含んでいた。これらのプラスミドＤＮＡについては、上記の表３に示すシーケンシングプライマーを使用して、正確な組み立てを検証するためにサンガーシーケンシングを行った。
プラスミドｐＲＦ８６２の構築
プラスミドｐＲＦ８６２（配列番号６２）は、表９に示したプライマーを使用して増幅させたｐＲＦ８２７（配列番号５９）からＹ１５５Ｈ置換を含有するＣａｓ９オープンリーディングフレームの断片（配列番号６３）を移動させることによって構築した。
Figure 2023524334000009
第２の断片（配列番号６６）は、それが上記のｐＲＦ８２７断片（配列番号６３）上に含有される断片を除く全プラスミドを含有するように、ｐＲＦ６９４（配列番号２５）から増幅させた。この断片は、組み立てのためにｐＲＦ８２７断片（配列番号６０）の５’及び３’末端とホモロジーを共有しており、下記の表１０に記載したプライマーを用いて増幅させた。
Figure 2023524334000010
２つの断片は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを製造業者の取り扱い説明書に従って使用して組み立て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞内に形質転換させた。プラスミド配列は、表３に示したサンガー法によって検証した。配列が検証された単離物をプラスミドｐＲＦ８６２（配列番号６２）として保存した。
ｒｇｈＲ２ ＯＲＦ（配列番号７０）を標的化し、３個のイン－フレーム終止コドンを挿入するプラスミドであるｐＲＦ８６９（配列番号６９）は、２つの部分を使用して構築した。ｒｇｈＲ２ ＯＲＦ（配列番号７０）を改変するための編集鋳型（配列番号７２）及びｒｇｈＲ２ ＯＲＦ（配列番号７０）を標的化するｇＲＮＡ発現カセット（配列番号７３）を含む第１部分（配列番号７１）は、ＩＤＴによって合成し、下記の表１１に示したプライマーセットを用いた組み立てのために増幅させた。
Figure 2023524334000011
合成断片は、表１２に示したプライマーを使用してｐＲＦ８６２を増幅させることによって、ｐＲＦ８６２（配列番号６２）内に挿入した。
Figure 2023524334000012
これら２つの部分は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを製造業者の取り扱い説明書に従って使用して組み立て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換させた。プラスミド配列は、表３に示したサンガー法によって検証した。配列が検証された単離物をプラスミドｐＲＦ８６９（配列番号６９）として保存した。
数個の追加のＣａｓ９プラスミドは、上記の実施例１及び２に記載したように組み立てた。それらのプラスミドは、標的部位配列及び編集鋳型作用と一緒に、下記の表１３に列挙した。
Figure 2023524334000013
全プラスミドについて、ローリング－サークル増幅（ＲＣＡ）を使用してプラスミドを増幅させ、ＴｒｕＰｒｉｍｅ ＲＣＡキット（Ｓｙｇｎｉｓ）を用いる形質転換のために好適な基質に作製した。
改変宿主菌株の構築
本実施例では、一連の宿主改変を親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株内に導入した。親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株は、ｓｅｒＡ１遺伝子（配列番号３０）及びｌｙｓＡ遺伝子（配列番号８７）の欠失を含有しており、ＢＦ１４０と称されている。
スペクチノマイシンマーカー（配列番号８９）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＣｏｍＫタンパク質（配列番号９２）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＸｙｌＲリプレッサー（配列番号９０）及びｘｙｌＡプロモーター（配列番号９１）をコードするＤＮＡを含有するｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号８８）（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｚｕｂｅｒ，１９９８，Ｈａｍｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を含有する１バージョンのＢＦ１４０は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡ遺伝子の第２のコピーを組み込むためのｃａｔＨ遺伝子座（配列番号９３）を標的化する線状ＰＣＲ産物を用いて形質転換させた。この構築物は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｓｐｏＶＧターミネーター（配列番号９９）に作動可能に連結したｃａｔＨターミネーター（配列番号９８）から構成される二重ターミネーター（配列番号９７）に作動可能に連結したＣａｔＨタンパク質（配列番号９６）をコードするＤＮＡであるｃａｔＨプロモーター（配列番号９５）に作動可能に連結したｃａｔＨ遺伝子座（配列番号９４）への上流ホモロジーアームを含有している。
この構築物は、次にｃａｔＨ遺伝子座（配列番号１０３）に対する下流ホモロジーアームに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ遺伝子からのターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したｐｒｓＡコーディング配列（配列番号１０１）に作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｐｒｓＡプロモーター（配列番号１００）を含有する。手短には、ＢＦ１４０／ｐＢｌ．ｃｏｍＫコンピテント細胞を生成した。ＢＦ１４０／ｐＢｌ．ｃｏｍＫ株は、１００ｐｐｍのスペクチノマイシンを含有する３７℃のＬブロス内で２５０ＲＰＭでの振とうにより一晩増殖させた。培養物は、翌日に１００ｐｐｍのスペクチノマイシンを含有する新鮮Ｌブロス内で０．７のＯＤ６００に希釈した。この新規培養物を１時間に渡り３７℃、２５０ＲＰＭで振とうしながら増殖させた。Ｄ－キシロースを０．１重量／体積％へ添加した。培養物は、３７℃及び２５０ＲＰＭで振とうしながら更に４時間に渡り増殖させた。細胞を７分間に渡り１７００ｇで採取した。細胞は、１０体積／体積％のＤＭＳＯを含有する１／４体積の消費済み培養培地中に再懸濁させた。１００μｌの細胞を１０μＬのｃａｔＨ：：［ｃａｔＨ ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡ］組み込み断片（配列番号９４）と混合した。細胞／ＤＮＡ混合物を１時間半に渡り１４００ＲＰＭ、３７℃でインキュベートした。この混合物を次に、１０ｐｐｍのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天プレート上でプレーティングした。接種したプレートを４８時間に渡り３７℃でインキュベートした。
１０ｐｐｍのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上で形成されたコロニーは、表１４に列挙したプライマー及び標準のＰＣＲ技術を使用して、ｃａｔＨ遺伝子座の改変を確証するためにコロニーＰＣＲを使用してスクリーニングした。
Figure 2023524334000014
２６７６ｂｐの断片（配列番号１０６）であるこのＰＣＲ産物は、サンガー法及び表１５に列挙したプライマーを用いてシーケンシングした。
Figure 2023524334000015
正確なｃａｔＨ：：［ｃａｔＨ ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡ］組み込み（配列番号９３）を備える単離物は、菌株ＢＦ５４７として貯蔵した。
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号８８）を含有するＢＦ５４７のバージョンは、上述したようにコンピテントに作製した。１００μｌのコンピテント細胞を５μｌのｐＲＦ９４６（配列番号８１）のＲＣＡと混合し、１時間半に渡り、１４００ＲＰＭ、３７℃でインキュベートした。混合物は、プラスミド形質転換のために選択するために２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でプレーティングした。プレートは、４８時間に渡り３７℃でインキュベートした。
２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天上で形成されたコロニーは、その間に、標準ＰＣＲ技術及び上記の表１４に列挙したプライマーを用いてｃａｔＨ：：［ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡ］カセット（配列番号１１１）を保持しながら、ｃａｔＨプロモーターの３’末端をコードするＤＮＡ及びＣａｔＨタンパク質（配列番号１１０）をコードするＤＮＡの欠失を確証するためにコロニーＰＣＲについてスクリーニングした。
ｃａｔＨ：：［ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡ］カセット（配列番号１１１）を含有する正確なコロニーは、ｃａｔＨ：：［ｃａｔＨ ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡ］カセット（配列番号９３、長さが２６７６ｂｐのＰＣＲ産物を産生した）（配列番号１０６）を含有する親コロニーとは反対に、１９９０ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号１１２）を産生した。差は、標準のゲル電気泳動法技術を使用して、視覚的に評価した。正確なサイズのＰＣＲ産物を備える単離物は、上記の表１５に示したプライマー１９１５（配列番号１０７）及びプライマー１９１６（配列番号１０８）を用いてシーケンシングした。
ｃａｔＨ：：［ｐｒｓＡｐ－ｐｒｓＡ］カセット（配列番号１１１）を含有し、クロラムフェニコール（１０ｐｐｍ）に対して表現型的に感受性であった、配列を検証した分離物は、ＢＦ５６１として貯蔵した。
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号８８）を含有するＢＦ５６１のバージョンは、上述したようにコンピテントに作製した。１００μｌのコンピテント細胞を５μｌのｐＺＭ２２１（配列番号８４）又はｐＲＦ８７９（配列番号７８）のＲＣＡと混合し、１時間半に渡り、１４００ＲＰＭ、３７℃でインキュベートした。混合物は、プラスミドを用いて形質転換した細胞を選択するために、２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でプレーティングした。
２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でコロニーを形成したｐＺＭ２２１（配列番号８４）を用いて形質転換させた細胞については、コロニーを標準ＰＣＲ技術及び表１６に示したプライマーを用いて、７００ｂｐのｄｌｔＡコーディング配列の欠失であるΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子（配列番号８６）についてスクリーニングした。
Figure 2023524334000016
ΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子を備えるコロニーは、表１６に示したプライマーを用いて２０６７ｂｐ（配列番号１１５）のＰＣＲ産物を産生するが、他方インタクトのｄｌｔＡ遺伝子を含有する親細胞は、２７６７ｂｐ（配列番号１１６）のＰＣＲ産物を産生する。これは、標準の電気泳動法技術を用いて分化させることができよう。７００ｂｐのｄｌｔＡ（配列番号８６）の内部欠失を含有するコロニーは、ＢＦ５９８として貯蔵した。
２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でコロニーを形成したｐＲＦ８７９（配列番号７８）を用いて形質転換させた細胞については、コロニーを標準ＰＣＲ技術及び表１７に示したプライマーを用いて、最初の９ｂｐ及び最後の９ｂｐを除いてｒｇｈＲ２コーディング配列の欠失であるΔｒｇｈＲ２対立遺伝子（配列番号８０）についてスクリーニングした。
Figure 2023524334000017
ΔｒｇｈＲ２対立遺伝子（配列番号８０）を備えるコロニーは、表１７に示したプライマーを用いて１５２３ｂｐ（配列番号１１９）のＰＣＲ産物を産生するが、他方インタクトのｒｇｈＲ２遺伝子を含有する親細胞は、１９２２ｂｐ（配列番号１２０）のＰＣＲ産物を産生する。これらの２つの産物間の差は、標準の電気泳動法技術を用いて識別することができる。ｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号８４）の欠失を含有するコロニーは、ＢＦ６０２として貯蔵した。
ｐＢｌ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号８８）を含有するＢＦ５９８のバージョンは、上述したようにコンピテントに作製した。１００μｌのコンピテント細胞を５μｌのｐＲＦ８７９（配列番号７８）のＲＣＡと混合し、１時間半に渡り、１４００ＲＰＭ、３７℃でインキュベートした。混合物は、プラスミドを用いて形質転換した細胞を選択するために、２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でプレーティングした。
２０ｐｐｍのカナマイシンを含有するＬ寒天プレート上でコロニーを形成したｐＲＦ８７９（配列番号７８）を用いて形質転換させた細胞については、コロニーを標準ＰＣＲ技術及び上記の表１７に示したプライマーを用いて、最初の９ｂｐ及び最後の９ｂｐを除いて、ｒｇｈＲ２コーディング配列の欠失であるΔｒｇｈＲ２対立遺伝子（配列番号８０）についてスクリーニングした。
ΔｒｇｈＲ２対立遺伝子（配列番号８０）を備えるコロニーは、表１７に示したプライマーを用いて１５２３ｂｐ（配列番号１１９）のＰＣＲ産物を産生するが、他方インタクトのｒｇｈＲ２遺伝子を含有する親細胞は、１９２２ｂｐ（配列番号１２０）のＰＣＲ産物を産生する。これらの２つの産物間の差は、標準の電気泳動法技術を用いて識別することができる。ｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号８０）の欠失を含有するコロニーは、ＢＦ６１３として貯蔵した。下記の表１８は、本実施例における３つの改変遺伝子座についての配列番号と共に、本実施例において作り出された改変宿主菌株を示している。
Figure 2023524334000018
改変宿主菌株中のアミラーゼ発現菌株の構築
本実施例では、一連のアミラーゼ及びアミラーゼ変異体発現カセットを上記の実施例２の表１８に列挙した菌株系統内に導入した。
アミラーゼ１
アミラーゼ１（配列番号１２６）は、一般にＡｍｙＬと呼ばれる、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の天然αアミラーゼである。アミラーゼ１の第１のカセット（配列番号１２７）は、ｓｅｒＡ１遺伝子座（配列番号４４）内に組み込まれ、ｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号３０）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ１（配列番号１３１）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１２９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ３プロモーター（配列番号１２８）を含有する。ｌｙｓＡ遺伝子座（配列番号１３３）内に組み込まれたアミラーゼ１の第２のカセット（配列番号１３２）は、ＬｙｓＡ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ、及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ１（配列番号１３１）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１２９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ２プロモーター（配列番号１３５）を含有する。
アミラーゼ２
アミラーゼ２（配列番号１３６）は、概して国際公開第２０１８／１８４００４号パンフレット（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載された変異バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のα－アミラーゼである。アミラーゼ２の第１のカセット（配列番号１３７）は、ｓｅｒＡ１遺伝子座（配列番号４４）内に組み込まれ、ｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号３０）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ２（配列番号１４０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｒｒｎＩプロモーター（配列番号１３８）を含有する。ｌｙｓＡ遺伝子座（配列番号１３３）又はａｍｙＬ遺伝子座（配列番号１４２）内に組み込まれたアミラーゼ２の第２のカセット（配列番号１４１）は、ＬｙｓＡ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ、及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ２（配列番号１４０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ３プロモーター（配列番号１２８）を含有する。
アミラーゼ３
アミラーゼ３（配列番号１４３）は、変異サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）のα－アミラーゼ（例えば、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレット；同第２０１２／１６４８００号パンフレット及び同第２０１４／１６４８３号パンフレットを参照されたい）である。アミラーゼ３の第１のカセット（配列番号１４４）は、ｓｅｒＡ１遺伝子座（配列番号４４）内に組み込まれ、ｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号３０）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ３（配列番号１４５）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１２９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ３プロモーター（配列番号１２８）を含有する。ｌｙｓＡ遺伝子座（配列番号１３３）内に組み込まれたアミラーゼ３の第２のカセット（配列番号１４６）は、ＬｙｓＡ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ、及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ３（配列番号１４５）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１２９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ２プロモーター（配列番号１３５）を含有する。
アミラーゼ４
アミラーゼ４（配列番号１４７）は、変異サイトファガ種（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ｓｐ．）のα－アミラーゼ（例えば、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレット；同第２０１２／１６４８００号パンフレット及び同第２０１４／１６４８３号パンフレットを参照されたい）である。アミラーゼ４の第１のカセット（配列番号１４８）は、ｓｅｒＡ１遺伝子座（配列番号４４）内に組み込まれ、ｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号３０）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１２９）に作動可能に連結したアミラーゼ４（配列番号１４９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ３プロモーター（配列番号１２８）を含有する。ｌｙｓＡ遺伝子座（配列番号１３３）内に組み込まれたアミラーゼ４の第２のカセット（配列番号１５０）は、ＬｙｓＡ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ、及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ４（配列番号１４９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＡｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ２プロモーター（配列番号１３５）を含有する。
アミラーゼ５
アミラーゼ５（配列番号１５１）は、変異バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）７０７のα－アミラーゼである（例えば、国際公開第２００８／１５３８０５号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１４／００５７３２４号明細書を参照されたい）。アミラーゼ５の第１のカセット（配列番号１５２）は、ｓｅｒＡ１遺伝子座（配列番号４４）内に組み込まれ、ｓｅｒＡ１ ＯＲＦ（配列番号３０）及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ５（配列番号１５３）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ３プロモーター（配列番号１２８）を含有する。ｌｙｓＡ遺伝子座（配列番号１３３）内に組み込まれたアミラーゼ５の第２のカセット（配列番号１５４）は、ＬｙｓＡ（配列番号１３４）をコードするＤＮＡ、及びＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬ転写ターミネーター（配列番号１０２）に作動可能に連結したアミラーゼ５（配列番号１５３）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のａｍｙＬシグナル配列（配列番号１３０）をコードするＤＮＡに作動可能に連結したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のａｐｒＥ ５’ＵＴＲ（配列番号１３９）をコードするＤＮＡに作動可能に連結した合成ｐ２プロモーター（配列番号１３５）を含有する。
全てのアミラーゼ発現カセットは、国際公開第２０１９／０４０４１２号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された方法を用いて、改変宿主菌株内に形質転換された。
改変宿主のバックグラウンドがアミラーゼ産生に及ぼす作用
本実施例では、アミラーゼ１～５（実施例４）についての発現カセットの２つのコピーを含有する改変宿主菌株（即ち、表１９；ＢＦ１４０、ＢＦ５６１、ＢＦ５９８、ＢＦ６０２及びＢＦ６１３）を標準の小規模又は研究室規模の発酵条件を用いるα－アミラーゼの産生についてアッセイした（各々が参照により本明細書に組み込まれた、国際公開第２０１８／１５６７０５号パンフレット及び同第２０１９／０５５２６１号パンフレットを参照されたい）。α－アミラーゼの産生は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）又はセラルファ（Ｃｅｒａｌｐｈａ）アッセイの方法を用いて定量した。アミラーゼの産生における相対的改善は、下記の表１９に提示した同一のα－アミラーゼ発現カセットを含む未改変宿主と匹敵する。
Figure 2023524334000019
したがって、多様な群のα－アミラーゼから試験した全５種のアミラーゼは、未改変親宿主ＢＦ１４０に比較して、欠失ｄｌｔＡ－２（ΔｄｌｔＡ－２）対立遺伝子（配列番号１２５）、欠失ｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子（配列番号８０）を含む天然ＢＦ６１３の改変したバックグラウンドにおけるα－アミラーゼの産生における改善及びｐｒｓＡプロモーター（配列番号１２４）によって制御された天然ｐｒｓＡ遺伝子の第２のコピーの挿入を示している。
アミラーゼ２及びアミラーゼ３については、欠失ｒｇｈＲ２（ΔｒｇｈＲ２）対立遺伝子（配列番号８０）及び天然ｐｒｓＡプロモーター（配列番号１２４）によって制御された天然ｐｒｓＡ遺伝子の第２のコピーを含むＢＦ６０２の改変したバックグラウンドにおけるα－アミラーゼ産生における改善は、ＢＦ６１３改変宿主において見られる改善とほぼ同等に良好であり、これはいくつかのアミラーゼについての改善にはこれら２種の対立遺伝子の存在だけが必要であるだけではなく、ΔｄｌｔＡ－２対立遺伝子の存在がこの改善にとって有害ではないことを示唆している。
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Claims (16)

  1. 改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって：（ａ）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含むポリヌクレオチドを導入することによって、ＰＯＩを発現する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を改変する工程、及び
    （ｂ）前記改変細胞を前記ＰＯＩの前記産生に好適な条件下で発酵させる工程
    を含み、前記改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に前記親細胞に比較して、増加した量の前記ＰＯＩを産生する方法。
  2. 改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内で増加した量の関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するための方法であって：（ａ）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞内に、（ｉ）ＰＯＩをコードする発現カセット、及び（ｉｉ）天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含むポリヌクレオチドを導入する工程、及び
    （ｂ）工程（ａ）の前記改変細胞を前記ＰＯＩの前記産生に好適な条件下で発酵させる工程
    を含み、前記改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に前記親細胞に比較して、増加した量の前記ＰＯＩを産生する方法。
  3. 前記導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーター配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 前記導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦ配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  5. 前記親細胞は、天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする内因性ｐｒｓＡ遺伝子を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  6. 前記導入されたポリヌクレオチドは、前記改変細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  7. 前記改変細胞は、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び／又は配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  8. 前記ＰＯＩは、酵素である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  9. 親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変ミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であって、天然ｐｒｓＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結した天然ｐｒｓＡプロモーターを含む導入されたポリヌクレオチドを含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞。
  10. 前記導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１００と少なくとも９５％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡプロモーターを含む、請求項９に記載の改変細胞。
  11. 前記導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１０１と少なくとも９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡ ＯＲＦを含む、請求項９に記載の改変細胞。
  12. 前記導入されたポリヌクレオチドは、配列番号１５５と約９０％の配列同一性を含む天然ｐｒｓＡタンパク質をコードする、請求項９に記載の改変細胞。
  13. 配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｄｌｔＡ遺伝子及び／又は配列番号１２１又は配列番号１５８と少なくとも９０％の配列同一性を含む欠失又は破壊したｒｇｈＲ２遺伝子を含む、請求項９に記載の改変細胞。
  14. 異種関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入された発現構築物を含む、請求項９に記載の改変細胞。
  15. 前記ＰＯＩは、酵素である、請求項１４に記載の改変細胞。
  16. 請求項１４に記載の前記改変細胞によって産生した、関心対象のタンパク質。
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