JP4668426B2 - α−アミラーゼ変異体 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、とりわけ、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの新規変異体、顕著には、変化した特性、特に変異体の適用、特に工業的デンプン処理（例えばデンプン液化又は糖化）に関して有利である（親に対して）変化した開裂パターンを示す変異体に関する。
【０００２】
発明の背景
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１）はデンプン並びに他の直鎖及び分枝鎖１，４−グルコシド結合オリゴ及びポリサッカライドの加水分解を触媒する酵素のグループを構成する。
【０００３】
極めて広範で多数のこの酵素の極めて重要なクラスに関する特許及び科学文献が存在する。いくつかのα−アミラーゼ、例えばＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体が、例えばＷＯ９０／１１３５２，ＷＯ９５／１０６０３，ＷＯ９５／２６３９７，ＷＯ９６／２３８７３，ＷＯ９６／２３８７９及びＷＯ９７／４１２１３から知られている。
【０００４】
α−アミラーゼに関する現在の開示の中で、ＷＯ９６／２３８７４は、ＢＡ２と呼ぶＴｅｒｍａｍｙｌ様のα−アミラーゼについての３次元Ｘ線結晶構造データを供し、それは、その中で配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼの３００ Ｎ末端アミノ酸残基及びその中で配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼのＣ末端のアミノ酸３０１〜４８３からなり、これにより、工業的に重要なＢａｃｉｌｌｕｓ α−アミラーゼに密接に関連する（本文脈において、用語“Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ”の意味に包含され、とりわけ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ及びＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α−アミラーゼを含む）。ＷＯ９６／２３８７４は、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの構造の分析に基づいて、その親に対して変化した特性を示す親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体をデザインするための方法を更に記述する。
【０００５】
ＷＯ９６／２３８７４及びＷＯ９７／４１２１３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、その中の配列番号：４に示す配列のアミノ酸残基Ｖ５４，Ｄ５３，Ｙ５６，Ｑ３３３，Ｇ５７及びＡ５２に変異を含む変化した開裂パターンを有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体を開示する。
【０００６】
発明の簡単な開示
本発明は、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの新規α−デンプン分解変異体、特に、デンプンの工業的処理（デンプン液化、糖化等）に関して有利である（親に対して）変化した開裂パターンを示す変異体に関する。
【０００７】
本発明者らは、驚くことに、変化した特性、特に分枝点の近くで基質を開裂する改良された削減された能力を有し、更に、その中の配列番号：４に示される配列のアミノ酸残基Ｖ５４，Ｄ５３，Ｙ５６，Ｑ３３３，Ｇ５７及びＡ５２に変異を含む変化した開裂パターンを有するＷＯ９６／２３８７４及びＷＯ９７／４１２１３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に開示されるＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体と比較して、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を有する変化した開裂パターンを有する変異体を見い出した。
【０００８】
本発明は、更に、本発明の変異体をコードするＤＮＡ構成物に、本発明の変異体を含む組成物に、本発明の変異体を調製するための方法に、並びに種々の工業プロセス、例えばデンプン液化における、及び洗剤組成物、例えば洗濯、皿洗い及び硬質表面洗浄組成物；エタノール生産、例えば燃料、飲料及び工業用エタノール生産；織物、布帛又は依類のデサイジング等における、単独で又は他のα−デンプン分解酵素と組み合わせての本発明の変異体及び組成物の使用に関する。
【０００９】
命名法
本記載及び請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用的な１文字及び３文字コードを用いる。引用を容易にするため、本発明のα−アミラーゼ変異体は以下の命名法を用いて記述する：
もとのアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸
この命名法によれば、例えば、位置３０でのアラニンのアスパラギンへの置換は、
Ａｌａ３０Ａｓｎ又はＡ３０Ｎ
として示す。同じ位置でのアラニンの欠失は：
Ａｌａ３０* 又はＡ３０*
として示し、更なるアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は：
*３０ａＬｙｓ又は *３０ａＫ
として示す。
【００１０】
アミノ酸残基の連続的ストレッチ、例えばアミノ酸残基３０〜３３の削除は、（３０−３３）* 又はΔ（Ａ３０−Ｎ３３）又はデルタ（Ａ３０−Ｎ３３）として示す。
【００１１】
特定のα−アミラーゼが他のα−アミラーゼと比べて“欠失”を含み、その位置に挿入が行われる場合、これは、位置３６でのアスパラギン酸の挿入について：
*３６ａＡｓｐ又は *３６ａＤ
として示す。
【００１２】
複数の変異は＋の印で分離され、即ち：
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は位置３０及び３４で、アラニン及びグルタミン酸を各々アスパラギン及びセリンで置換する変異を示す。複数の変異は、＋の印と同じ意味で以下の通り分離され得る：
Ａｌａ３０Ａｓｐ／Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ／Ｅ３４Ｓ
１又は複数の別のアミノ酸残基を所定の位置に挿入できる場合、それは
Ａ３０Ｎ，Ｅ又は
Ａ３０Ｎ又はＡ３０Ｅ
として示す。
【００１３】
更に、改変のために適した位置がいずれの特定の改変も示唆されずにここで同定される場合、又はＡ３０Ｘの場合、その位置に存在するアミノ酸残基のかわりにいずれのアミノ酸残基も置換することができると理解される。これにより、例えば、位置３０のアラニンの改変が言及されるが、特定されないか又は“Ｘ”として特定される場合、そのアラニンは、削除されるか、又はいずれかの他のアミノ酸、即ちＲ，Ｎ，Ｄ，Ｃ；Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖのいずれか１つで置換され得ると理解される。
【００１４】
発明の詳細な開示
Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．により生産されるいくつかのα−アミラーゼはアミノ酸レベルで高度に相同性であることが公知である。例えば、（ＴｅｒｍａｍｙｌTMとして市販される）配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼは、配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼと約８９％の相同性、及び配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼと約７９％の相同性であることが見い出されている。更なる相同なα−アミラーゼには、全てがＷＯ９５／２６３９７に詳細に記載される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＣＩＢ１２２８９，ＮＣＩＢ１２５１２，ＮＣＩＢ１２５１３又はＤＳＭ９３７５の株から得られるα−アミラーゼ、並びにTsukamoto et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31に記載される＃７０７α−アミラーゼがある。
【００１５】
なお更なる相同なα−アミラーゼには、ＥＰ０２５２６６６に記載されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＡＴＣＣ２７８１１）により生産されるα−アミラーゼ、並びにＷＯ９１／００３５３及びＷＯ９４／１８３１４に同定されるα−アミラーゼがある。他の商用Ｔｅｒｍａｍｙｌ様Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼはＯｐｔｉｔｈｅｒｍTM及びＴａｋａｔｈｅｒｍTM（Ｓｏｌｖａｙから市販）、ＭａｘａｍｙｌTM（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、ＳｐｅｚｙｍＡＡTM及びＳｐｅｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ ＡＡTM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、及びＫｅｉｓｔａｓｅTM（Ｄａｉｗａから市販）である。
【００１６】
これらのα−アミラーゼ間に見い出される実質的な相同性のため、それらはα−アミラーゼの同じクラス、即ち“Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ”のクラスに属すると考えられる。
【００１７】
従って、本文脈において、用語“Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ”は、アミノ酸レベルでＴｅｒｍａｍｙｌTM、即ち本明細書に配列番号：４で示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼと実質的な相同性を示すα−アミラーゼを示すことを意図する。換言すれば、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、本明細書の配列番号：２，４，６、又は８に示すアミノ酸配列、及びＷＯ９５／２６３９７の配列番号：１もしくは２に又はTsukamoto et al., 1988に示すアミノ酸配列を有するか、又はｉ）前記アミノ酸配列の少くとも１つと少くとも６０％、好ましくは少くとも７０％、より好ましくは少くとも７５％、更により好ましくは少くとも８０％、特に少くとも８５％、特に好ましくは少くとも９０％、更に特により好ましくは少くとも９５％の相同性、より好ましくは少くとも９７％、より好ましくは少くとも９９％の相同性を示し、及び／又はii）前記α−アミラーゼの少くとも１つに対して生ずる抗体と免疫学的な交差反応を示し、及び／又は iii）本願の配列番号：１，３，５及び７並びにＷＯ９５／２６３９７の配列番号：４及び５から各々明らかな先に特定されるα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされるα−アミラーゼである。
【００１８】
特定ｉ）に関連して、“相同性”は、いずれかの慣用的なアルゴリズムの使用により、好ましくは３．０のＧＡＰクリエーションペナルティ及び０．１のＧＡＰエクステンションペナルティである。ＧＡＰペナルティについてのデフォルト値を用いてＧＣＧパッケージバージョン７．３(June 1993）からのＧＡＰプログラムの使用により決定することができる（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, uersion 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, VSA 53711）。
【００１９】
ＴｅｒｍａｍｙｌとＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとの間の構造的アラインメントは、他のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼにおいて等価の／対応する位置を同定するのに用いることができる。その構造アラインメントを得る１つの方法は、ギャップペナルティのデフォルト値、即ち３．０のギャップクリエーションペナルティ及び０．１のギャップエクステンションペナルティを用いて、ＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ Ｕｐプログラムを用いることである。他の構造アラインメント法には、疎水性クラスター分析(Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155）及びリバーススレッディング（Huber, T ; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998)）がある。α−アミラーゼの特性ii）、即ち免疫学的交差反応は、関連するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの少くとも１つのエピトープに対して生じた、又はそれと反応性の抗体を用いてアッセイすることができる。モノクローナル又はポリクローナルであり得る抗体は、例えばHudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publicationsに記載されるように、当業界で知られた方法により生産することができる。免疫学的交差反応は、当業界で知られたアッセイを用いて決定することができ、その例は、例えばHudson et al., 1989 に記載されるような、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ又は放射状免疫拡散アッセイである。これに関して、各々アミノ酸配列、配列番号：２，４，６又は８を有するα−アミラーゼが見い出されている。
【００２０】
先の特性 iii）に従ってＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのキャラクタリゼーションに用いるオリゴヌクレオチドプローブは、好適には、問題のα−アミラーゼの全部又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて調製することができる。
【００２１】
ハイブリダイゼーションをテストするための好適な条件は、５×ＳＳＣにプレソーキングし、そして１時間、約４０℃で、２０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０mMリン酸ナトリウム、pH６．８、及び５０mgの変性超音波処理化ウシ胸腺ＤＮＡ中でプレハイブリダイズし、次に１００mM ＡＴＰを補給した同じ溶液中で１８時間、−４０℃でハイブリダイゼーションを行い、次に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で４０℃で３０分（低ストリンジェンシー）、好ましくは５０℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、更により好ましくは約７５℃（極高ストリンジェンシー）で、フィルターを３回、洗浄することに関する。ハイブリダイゼーション法についてより詳しくは、Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Laboraotry Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 に見い出すことができる。
【００２２】
本文脈において用語“由来（から得られる）”は、問題の生物の株により生産され又は生産され得るα−アミラーゼを示すばかりでなく、このような株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、そのＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物で生産されるα−アミラーゼも示すことを意図する。最後に、その用語は、合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ、問題のα−アミラーゼの同定特性を有するα−アミラーゼを示すことを意図する。その用語は、親α−アミラーゼは、天然のα−アミラーゼの１又は複数のアミノ酸残基の改変（挿入、置換、欠失）の結果である天然のα−アミラーゼの変異体であり得ることを示すことも意図する。
【００２３】
親ハイブリッドα−アミラーゼ
親α−アミラーゼは、ハイブリッドα−アミラーゼ、即ち少くとも２つのα−アミラーゼから得られる部分的アミノ酸配列の組合せを含むα−アミラーゼであり得る。
【００２４】
親ハイブリッドα−アミラーゼは、（先に定義されるように）アミノ酸相同性及び／又は免疫学的交差反応性及び／又はＤＮＡハイブリダイゼーションに基づき、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼファミリーに属すると決定することができるものであり得る。この場合、ハイブリッドα−アミラーゼは、典型的には、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの少くとも一部と微生物（細菌又は真菌）及び／又は哺乳動物源のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ又は非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼから選択される１又は複数の他のα−アミラーゼの１又は複数の部分から構成される。
【００２５】
これにより、親ハイブリッドα−アミラーゼは、少くとも２つのＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼから、又は少くとも１のＴｅｒｍａｍｙｌ様及び少くとも１の非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様細菌α−アミラーゼから、又は少くとも１のＴｅｒｍａｍｙｌ様及び少くとも１の真菌α−アミラーゼから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含み得る。部分的アミノ酸配列をそこから得ることができるＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、例えば、本明細書に言及されるこれらの特定のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのいずれかであり得る。
【００２６】
例えば、親α−アミラーゼは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの株から得られるα−アミラーゼのＣ末端部分及びＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの株から又はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株から得られるα−アミラーゼのＮ末端部分を含み得る。例えば、親α−アミラーゼは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼのＣ末端部分の少なくとも４３０アミノ酸残基を含み得、そして例えば、ａ）配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント、又はｂ）配列番号：８に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼの６８ Ｎ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４１５ Ｃ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントを含み得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、その（成熟タンパク質の）Ｎ末端の３５アミノ酸残基が配列番号：６に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ（ＢＡＮ）の成熟タンパク質のＮ末端３３アミノ酸残基で置換されていることを除いて、配列番号：４に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼと同一のハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。そのハイブリッドは、ＬＥ１７４と呼ぶ（配列番号：４のナンバリングを用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを更に有し得る。
【００２８】
別の好ましい親ハイブリッドα−アミラーゼは配列番号：２に示すＬＥ４２９である。
【００２９】
非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、例えば、真菌α−アミラーゼ、哺乳動物又は植物α−アミラーゼ又は細菌α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼと異なる）であり得る。このようなα−アミラーゼの特定の例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡα−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓα−アミラーゼ、ブタ膵臓α−アミラーゼ及びオオムギα−アミラーゼがある。これらのα−アミラーゼの全は、解明された構造を有し、それらは本明細書で引用されるような典型的なＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの構造と顕著に異なる。
【００３０】
上述の真菌α−アミラーゼ、即ちＡ．ｎｉｇｅｒ及びＡ．ｏｒｙｚａｅから得られるものは、アミノ酸レベルにおいて高度に相同性であり、一般に、α−アミラーゼの同じファミリーに属すると考えられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来の真菌α−アミラーゼは商標ＦｕｎｇｅｍｙｌTMで市販されている。
【００３１】
更に、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの特定の変異体（本発明の変異体）が、特定のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の改変（例えば欠失又は置換）を引用することにより慣用的な様式で、言及される場合、（各々のアミノ酸配列間の最も可能なアミノ酸配列アラインメントから決定して）等価な位置で改変された別のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体がそれにより包含されると理解される。
【００３２】
本発明の変異体の好ましい実施形態は、（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ由来のもの、例えば上述のものの１つ、例えば配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼである。
【００３３】
本発明の変異体の作製
問題の変異体の作製は、その変異体をコードするＤＮＡ配列を含む微生物を、その変異体を生産するために資する条件下で培養することにより行うことができる。次にその変異体は、得られた培養ブロスから回収することができる。これは、以下に更に詳細に記載される。
【００３４】
特性の変化
以下に、本発明の変異体に存在し得る変異、及びそれから生じ得る（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのものに対する）特性の要求される変化の間の関係を議論する。
【００３５】
第１の態様において、本発明は、Ｗ１３，Ｇ４８，Ｔ４９，Ｓ５０，Ｑ５１，Ａ５２，Ｄ５３，Ｖ５４，Ｇ５７，Ｇ１０７，Ｇ１０８，Ａ１１１，Ｓ１６８，Ｍ１９７の群から選択される１又は複数の位置に変異を含む、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体であって、
（ａ）前記変異が、独立して、
（ｉ）前記位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占有するアミノ酸の欠失、又は
（iii)前記位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸での置換
であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、そして
（ｃ）各々の位置が配列番号：４のアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する
変異体に関する。
【００３６】
好ましい実施形態において、上述の本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｖ５４Ｎ，Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ，Ｔ４９Ｌ，Ｔ４９＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ，Ｇ１０７Ａ，Ｑ５１Ｒ，Ｑ５１Ｒ＋Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｎ；又は
Ｔ４９Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｖ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｄ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｙ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｎ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｔ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｖ＋Ｇ１０７Ａ；又は
Ｔ４９Ｖ，Ｔ４９Ｉ，Ｔ４９Ｄ，Ｔ４９Ｎ，Ｔ４９Ｓ，Ｔ４９Ｙ，Ｔ４９Ｆ，Ｔ４９Ｗ，Ｔ４９Ｍ，Ｔ４９Ｅ，Ｔ４９Ｑ，Ｔ４９Ｋ，Ｔ４９Ｒ，Ａ５２Ｔ，Ａ５２Ｌ，Ａ５２Ｉ，Ａ５２Ｖ，Ａ５２Ｍ，Ａ５２Ｆ，Ａ５２Ｙ，Ａ５２Ｗ，Ｖ５４Ｍ，Ｇ１０７Ｖ，Ｇ０７Ｉ，Ｇ１０７Ｌ，Ｇ１０７Ｃ
の少くとも１つに対応する位置での変異を含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｗ１３Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｙ，Ａ；
Ｇ４８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
*４８ａＤ又は *４８ａＹ（即ちＤ又はＹの挿入）；
Ｔ４９Ｘ；
*４９ａＸ（即ちいずれかのアミノ酸残基の挿入）
Ｓ５０Ｘ，特にＤ，Ｙ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｉ；
Ｑ５１Ｒ，Ｋ；
Ａ５２Ｘ，特にＡ５２Ｓ，Ｎ，Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ；
Ｄ５３Ｅ，Ｑ，Ｙ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｌ；
Ｖ５４Ｘ，特にＶ５４Ｉ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｆ，Ｌ；
Ｇ５７Ｓ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｔ；
Ｇ１０７Ｘ，特にＧ１０７Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ，Ｃ；
Ｇ１０８Ｘ，特にＧ１０８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
Ａ１１１Ｖ，Ｉ，Ｌ；
Ｓ１６８Ｙ；
Ｍ１９７Ｘ，特にＹ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｔ，Ａ，Ｇ．
の少くとも１つに対応する位置での変異を含む。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｔ４９Ｘ＋Ａ５２Ｘ＋Ｖ５４Ｎ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ＋Ｇ１０７Ａ
に対応する変異を含み、そして更にＧ１０８Ａを含み得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｔ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ．
に対応する少くとも１つの変異を含む。
【００４０】
上述の本発明の変異体の全ては、変化した特性（増加又は減少した特性を意味する）、特に以下の親α−アミラーゼに対する特性：分枝点の近くで基質を開裂する能力の減少、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性、変化した基質結合、変化した熱安定性、変化したpH／活性プロフィール、変化したpH／安定性プロフィール、酸化に対する変化した安定性、変化したＣａ2+依存性の少くとも１つを有する。
【００４１】
安定性
本発明の文脈において、変化した安定性、特に改良された安定性（即ちより高い又は低い）を、特に低いpH（即ちpH４〜６）で行うことに関して重要な（アミノ酸置換及び／又は欠失を含む）変異には、上記“特性の変化”セクションに列記した変異のいずれか及び後述の変異体がある。
【００４２】
（ＢＡＮ、即ち配列番号：６のナンバリングを用いて）次の変異体：Ｑ３６０Ａ，Ｋ；Ｎ１０２Ａ，Ｎ３２６Ａ，Ｌ，Ｎ１９０Ｇ，Ｎ１９０Ｋ；Ｙ２６２Ａ，Ｋ，ＥもpH安定性についてテストした。好ましい親α−アミラーゼは、上述のＢＡＺであり得る。pH安定性は“材料及び方法”セクションに記載されるように決定した。
【００４３】
Ｃａ 2+ 安定性
変化したＣａ2+安定性は、Ｃａ2+枯濁下での酵素の安定性が改良されている、即ちより高い又はより低い安定性を意味する。本発明の文脈において、変化したＣａ2+安定性、特に改良されたＣａ2+安定性、即ちより高い又はより低い安定性を、特に低いpH（即ちpH４〜６）で達成することに関して重要な（アミノ酸置換を含む）変異には、上述の“特性の変化”に列記される変異のいずれかがある。
【００４４】
比活性
本発明の更なる態様において、変化した比活性、特に増加又は減少した比活性を、特に６０〜１００℃、好ましくは７０〜９５℃、特に８０〜９０℃の温度で示す変異体を得ることに関して重要な変異には、上述の“特性の変化”セクションに列記される変異のいずれかがある。ＬＥ１７４及びＬＥ４２９の比活性は、“材料及び方法”セクションに記載されるＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）アッセイを用いて、１６，０００NU／mgと決定された。
【００４５】
開裂パターンの変化
デンプン液化過程において、（慣用的なＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのように）より短い分枝したオリゴサッカライドを形成するα−アミラーゼより、長く分枝したオリゴサッカライドにデンプン分子を分解することができるα−アミラーゼを用いることが要求される。短く分枝したオリゴサッカライド（パノース前駆体）は、液化過程においてα−アミラーゼ処理の前に、又は糖化アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）と同時に、又は糖化アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）を加える前に用いられる。プルラナーゼにより満足いく程、加水分解されない。これにより、パノース前駆体の存在下において、グルコアミラーゼ処理後に存在する産物混合物は、有意な割合の短く分枝したいわゆる限界デキストリン、すなわち、トリサッカライドパンノースを含む。
【００４６】
以前に（米国特許第５，２３４，８２３）、グルコアミラーゼ及びプルラナーゼで糖化する場合、液化過程から生ずる残存α−アミラーゼ活性の存在は、糖化段階の前にα−アミラーゼが不活性化されないなら、グルコースのより低い収率を導き得る。この不活性化は、典型的には、糖化のために６０℃に温度を下げる前に、９５℃で４．７末端のpHに調節することにより行うことができる。
【００４７】
このグルコース収率への負の効果の理由は十分に理解されていないが、液化α−アミラーゼ（例えばＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのＴｅｒｍａｍｙｌ １２０Ｌ）が、アミロペクチン内の分枝点の近くの両方の側での１，４−α−グリコシド結合を加水分解することにより、（プルラナーゼのための乏しい基質である）“限界デキストリン”を形成すると想定される。これらのグルコアミラーゼによるこれらの限界デキストリンの加水分解はトリサッカライドパノースの蓄積を導き、それはグルコアミラーゼによりゆっくりとしか加水分解されない。
【００４８】
この欠点を受けない熱安定性α−アミラーゼの開発は、別個の不活性化ステップが要求されないであろうので、有意な改良であろう。
【００４９】
これにより、本発明の目的は、好適に改変されたデンプン分解特性を有するが、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの熱安定性を保持する変異体α−アミラーゼに到達することである。
【００５０】
従って、本発明は、分枝点近くで基質を開裂する改良された減少した能力を有し、そして更に、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体に関する。
【００５１】
特に関心あるものは、アミロペクチン基質を、その還元端から、その分枝点から１超のグルコース単位、好ましくは分枝点から２又は３超のグルコース単位で、即ち野生型Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの使用により得られるより分枝点から更に離れた距離で開裂する変異体である。
【００５２】
ＷＯ９６／２３８７４に従って、以下の変異の少くとも１つを含む変異体が分枝点の近くでの開裂を防ぐと予想されることがここで言及され得る。
【００５３】
Ｖ５４Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｅ，Ｑ；
Ｄ５３Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｗ；
Ｙ５６Ｗ
Ｑ３３３Ｗ；
Ｇ５７、全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ５２，Ａより長いアミノ酸残基、例えばＡ５２Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｆ，Ｉ分枝点近くで基質を開裂する改良された減少した能力を有し、そして改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を有する本発明による変異体を得ることに関連する特に関心ある変異体は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、配列番号：４中の次の位置：
Ｈ１５６，Ａ１８１，Ｎ１９０，Ａ２０９，Ｑ２６４及びＩ２０１
に突然変異を含む。
【００５４】
用いることができるのは以下に特に言及されるＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼだけではないことが強調されるべきである。他の商用Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼも用いることができる。このようなα−アミラーゼの非排他的リストは次の通りである：ＥＰ０２５２６６６に記載されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＡＴＣＣ２７８１１）により生産されるα−アミラーゼ、並びにＷＯ９１／００３５３及びＷＯ９４／１８３１４に同定されるα−アミラーゼ。他の商用Ｔｅｒｍａｍｙｌ様Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼはＯｐｔｉｔｈｅｒｍTM及びＴａｋａｔｈｅｒｍTM（Ｓｏｌｖａｙから市販）、ＭａｘａｍｙｌTM（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、ＳｐｅｚｙｍＡＡTM酵素デルタＡＡTM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、及びＫｅｉｓｔａｓｅTM（Ｄａｉｗａから市販）である。
【００５５】
全てのＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、好適には、本発明の変異体を調製するための骨格として用いることができる。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは各々配列番号：４及び配列番号：６のハイブリッドアミラーゼである。特に、親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の成熟α−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基を含むハイブリッドα−アミラーゼであり得、それは、好適には、（配列番号：４のナンバリングを用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを更に有し得る。このハイブリッドはＬＥ１７４と呼ばれる。ＬＥ１７４ハイブリッドは、更なる変異Ｉ２０１Ｆと組み合わせて、（ナンバリングについて配列番号：４を用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆを有する親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼを形成することができる。このハイブリッド変異体は配列番号：２に示され、以下の例に用いられ、ＬＥ４２９と呼ばれる。
【００５７】
また、以下の変異の１又は複数を含むＬＥ１７４又はＬＥ４２９（配列番号：２）又は配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼを（変異のナンバリングについて配列番号：４を用いて）骨格として用いることができる：
Ｅ１１９Ｃ；
Ｓ１３０Ｃ；
Ｄ１２４Ｃ；
Ｒ１２７Ｃ；
Ａ５２全ての可能なアミノ酸残基；
Ｓ８５全ての可能なアミノ酸残基；
Ｎ９６全ての可能なアミノ酸残基；
Ｖ１２９全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ２６９全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ３７８全ての可能なアミノ酸残基；
Ｓ１４８全ての可能なアミノ酸残基、特にＳ１４８Ｎ；
Ｅ２１１全ての可能なアミノ酸残基、特にＥ２１１Ｑ；
Ｎ１８８全ての可能なアミノ酸残基、特にＮ１８８Ｓ，Ｎ１８８Ｐ
Ｍ１９７全ての可能なアミノ酸残基、特にＭ１９７Ｔ，Ｍ１９７Ａ，Ｍ１９７Ｇ，Ｍ１９７Ｉ，Ｍ１９７Ｌ，Ｍ１９７Ｙ，Ｍ１９７Ｆ，Ｍ１９７Ｉ；
Ｗ１３８全ての可能なアミノ酸残基、特にＷ１３８Ｙ；
Ｄ２０７全ての可能なアミノ酸残基、特にＤ２０７Ｙ；
Ｈ１３３全ての可能なアミノ酸残基、特にＨ１３３Ｙ；
Ｈ２０５全ての可能なアミノ酸残基、特にＨ２０５Ｈ，Ｈ２０５Ｃ，Ｈ２０５Ｒ；
Ｓ１８７全ての可能なアミノ酸残基、特にＳ１８７Ｄ；
Ａ２１０全ての可能なアミノ酸残基、特にＡ２１０Ｓ，Ａ２１０Ｔ；
Ｈ４０５全ての可能なアミノ酸残基、特にＨ４０５Ｄ；
Ｋ１７６全ての可能なアミノ酸残基、特にＫ１７６Ｒ；
Ｆ２７９全ての可能なアミノ酸残基、特にＦ２７９Ｙ；
Ｑ２９８全ての可能なアミノ酸残基、特にＱ２９８Ｈ；
Ｇ２９９全ての可能なアミノ酸残基、特にＧ２９９Ｒ；
Ｌ３０８全ての可能なアミノ酸残基、特にＬ３０８Ｆ；
Ｔ４１２全ての可能なアミノ酸残基、特にＴ４１２Ａ；
更に、以下の変異の少くとも１つを含む配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼを骨格として用いることができる：
Ｍ１５全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ３３全ての可能なアミノ酸残基；
ＬＥ１７４を変異Ｉ２０１Ｆ（配列番号：４ナンバリング）と組み合わせることにより骨格として（即ち親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）（配列番号：２に示される）ＬＥ４２９を用いる場合、突然変異／変換、特に置換、欠失及び挿入は、本発明に従って、以下の位置の１又は複数で、分枝点近くで基質を開裂する削減された能力を改良するため並びに基質特異性を改良するため及び／又は比活性を改良するために行うことができる：Ｗ１３，Ｇ４８，Ｔ４９，Ｓ５０，Ｑ５１，Ａ５２，Ｄ５３，Ｖ５４，Ｇ５７，Ｇ１０７，Ｇ１０８，Ａ１１１，Ｓ１６８，Ｍ１９７（配列番号：４のナンバリングを用いる）。
【００５８】
ここで、（ａ）変換は、独立して、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）その位置を占めるアミノ酸の欠失、又は
（iii)その位置のアミノ酸の異なるアミノ酸での置換
であり、
（ｂ）その変異体は、α−アミラーゼ活性を有し、そして（ｃ）各々の位置は配列番号：４のアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中に以下の変異に対応する位置に少くとも１の変異を含む：
Ｖ５４Ｎ，Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ，Ｔ４９Ｌ，Ｔ４９＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ，Ｇ１０７Ａ，Ｑ５１Ｒ，Ｑ５１Ｒ＋Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｎ；又は
Ｔ４９Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｖ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｄ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｙ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｎ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｔ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｖ＋Ｇ１０７Ａ；又は
Ｔ４９Ｖ，Ｔ４９Ｉ，Ｔ４９Ｄ，Ｔ４９Ｎ，Ｔ４９Ｓ，Ｔ４９Ｙ，Ｔ４９Ｆ，Ｔ４９Ｗ，Ｔ４９Ｍ，Ｔ４９Ｅ，Ｔ４９Ｑ，Ｔ４９Ｋ，Ｔ４９Ｒ，Ａ５２Ｔ，Ａ５２Ｌ，Ａ５２Ｉ，Ａ５２Ｖ，Ａ５２Ｍ，Ａ５２Ｆ，Ａ５２Ｙ，Ａ５２Ｗ，Ｖ５４Ｍ，Ｇ１０７Ｖ，Ｇ０７Ｉ，Ｇ１０７Ｌ，Ｇ１０７Ｃ．
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列内に次の変異に対応する位置内に少くとも１の変異を含む：
Ｗ１３Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｙ，Ａ；
Ｇ４８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
*４８ａＤ又は *４８ａＹ（即ちＤ又はＹの挿入）；
Ｔ４９Ｘ；
*４９ａＸ（即ちいずれかのアミノ酸残基の挿入）
Ｓ５０Ｘ，特にＤ，Ｙ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｉ；
Ｑ５１Ｒ，Ｋ；
Ａ５２Ｘ，特にＡ５２Ｓ，Ｎ，Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ；
Ｄ５３Ｅ，Ｑ，Ｙ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｌ；
Ｖ５４Ｘ，特にＶ５４Ｉ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｆ，Ｌ；
Ｇ５７Ｓ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｔ；
Ｇ１０７Ｘ，特にＧ１０７Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ，Ｃ；
Ｇ１０８Ｘ，特にＧ１０８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
Ａ１１１Ｖ，Ｉ，Ｌ；
Ｓ１６８Ｙ；
Ｍ１９７Ｘ，特にＹ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｔ，Ａ，Ｇ．
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列内に次の変異に対応する位置に少くとも１の変異を含み：
Ｔ４９Ｘ＋Ａ５２Ｘ＋Ｖ５４Ｎ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ＋Ｇ１０７Ａ
そして更にＧ１０８Ａを含み得る。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中に次の変異に対応する位置に少くとも１の変異を含む：
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｔ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ．
本発明の変異体における一般的な変異
本発明の変異体は先に概説されるものに加えて、１又は複数の改変を含む。これにより、改変されたα−アミラーゼ変異体の部分中に存在する１又は複数のプロリン残基が可能な天然非プロリン残基のいずれであり得る。好ましくはアラニン、グリシン、セリン、トレオニン、バリン又はロイシンである非プロリン残基で置換されることが有利であり得る。
【００６１】
同様に、親α−アミラーゼから改変されているアミノ酸残基中に存在する１又は複数のシステイン残基を、非システイン残基、例えばセリン、アラニン、トレオニン、グリシン、バリン又はロイシンで置換することが好ましい。
【００６２】
更に、本発明の変異体は、唯一の改変として、又は先に概説される改変のいずれかの組合せにおいて、配列番号：４のアミノ酸フラグメント１８５〜２０９に対応するアミノ酸フラグメント中に存在する１又は複数のＡｓｐ及び／又はＧｌｕを各々Ａｓｎ及び／又はＧｌｎで置換するように改変することができる。Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ中で、配列番号：４のアミノ酸フラグメント１８５〜２０９に対応するアミノ酸フラグメント中に存在する１又は複数のＬｙｓ残基の、Ａｒｇでの置換も関心がある。
【００６３】
本発明は、先に概説される改変の２又はそれ超を組み込む変異体も包含する。
【００６４】
更に、本明細書に記載される変異体のいずれかにおいて点変異を導入することが有利であり得る。
【００６５】
α−アミラーゼ変異体を調製するための方法
遺伝子に変異を導入するためのいくつかの方法が当業界で知られている。α−アミラーゼコーディングＤＮＡ配列のクローニングの短い議論の後、α−アミラーゼコーディング配列内の特定、部位に変異を形成するための方法が議論されよう。
【００６６】
α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界で公知の種々の方法を用いて、問題のα−アミラーゼを生産するいずれかの細胞又は微生物から単離することができる。第１に、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、研究すべきα−アミラーゼを生産する生物からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて作製するべきである。次にそのα−アミラーゼのアミノ酸配列が知られているなら、相同な、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成して、問題の生物から調製したゲノムライブラリーからα−アミラーゼコーディングクローンを同定するのに用いることができる。あるいは、既知のα−アミラーゼに相同な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、α−アミラーゼコーディングクローンを同定するためのプローブとして用いることができよう。
【００６７】
α−アミラーゼコーディングクローンを同定するための更に別の方法は、ゲノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、その形質転換された細菌をα−アミラーゼのための基質を含む寒天にプレートし、それによりα−アミラーゼを発現するクローンを同定することに関する。
【００６８】
あるいは、酵素をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的方法、例えばS.L. Beaucage 及びM.H. Caruthers (1981) に記載されるホスホロアミジト法又はMatthes et al. (1984) により記載される方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミジト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして好適なベクターにおいてクローン化された。
【００６９】
最後に、ＤＮＡ配列は、標準的な技術に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のフラグメント（好適なら、全体のＤＮＡ配列の種々の部分に対応するフラグメント）を連結することにより調製される、ゲノム及び合成起源の混合、合成及びｃＤＮＡ起源の混合又はゲノム及びｃＤＮＡ起源の混合のものであり得る。そのＤＮＡ配列は例えばＵＳ４，６８３，２０２又は R.K. Saiki et al. (1988) に記載されるように、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできる。
【００７０】
部位特異的変異誘発
α−アミラーゼコーディングＤＮＡ配列が単離され、変異のための要求される部位が同定されたら、変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、要求される変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。特定の方法において、α−アミラーゼコーディング配列に橋をかけるＤＮＡの一本鎖ギャップがα−アミラーゼ遺伝子を有するベクター内に形成される。次に、要求される変異を有する合成ヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡの相同部分とアニーリングされる。次に残りのギャップがＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）でフィル・インされ、その構成物はＴ４リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例はMorinaga et al (1984) に記載される。ＵＳ４，７６０，０２５は、そのカセットの小さな変換を行うことにより多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、更により多くの多様な変異をＭｏｒｉｎａｇａの方法によりいずれか一回で導入することができる。これは、種々の長さの複数のオリゴヌクレオチドを導入することができるからである。
【００７１】
α−アミラーゼコーディングＤＮＡに変異を導入するための別の方法は、Nelson及びLong (1989) に記載される。それは、ＰＣＲ反応においてプライマーの１つとして化学的に合成されたＤＮＡ鎖を用いることにより導入される要求される変異を含むＰＣＲフラグメントの３ステップ生成に関する。ＰＣＲ生成フラグメントから、その変異を有するＤＮＡフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼでの開裂により単離し、発現プラスミドに挿入されることができる。
【００７２】
ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、好適には、問題の示されるアミノ酸配列に翻訳される遺伝子の少くとも３つの部分において、又は全体の遺伝子内で、局所化又は領域特異的ランダム変異誘発のいずれかとして行われる。
【００７３】
親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のランダム変異誘発は、便利には、当業界で知られたいずれかの方法の使用により行うことができる。
【００７４】
上記に関連して、本発明の更なる態様は、親α−アミラーゼの変異体を生成するための方法であつて、例えばその変異体は分枝点近くでオリゴサッカライド基質を開裂する削減された能力を示し、そして更に、親に対して改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を更に示し、その方法が、
（ａ）親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列をランダム変異誘発にかけ、
（ｂ）宿主細胞内で、ステップ（ａ）で得られた変異したＤＮＡ配列を発現させ、そして
（ｃ）親α−アミラーゼに対して変化した特性（即ち熱安定性）を有するα−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞についてスクリーニングすること
を含む。
【００７５】
上述の本発明の方法のステップ（ａ）は、好ましくは、ドープ化（ｄｏｐｅｄ）プライマーを用いて行われる。例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的又は化学的変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより行うことができる。更に、ランダム変異誘発は、これらの変異誘発剤のいずれかの組合せの使用により行うことができる。変異誘発剤は、例えば、転移、トランスバージョン、反転、スクランブリング；欠失及び／又は挿入を誘導するものであり得る。
【００７６】
本目的のために適した物理的又は化学的変異誘発剤の例には、紫外（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログがある。このような剤を用いる場合、変異誘発は、典型的には、変異誘発すべき親酵素をコードするＤＮＡ配列を選択された変異誘発剤の存在下で、変異誘発がおこるのに適した条件下でインキュベートし、そして要求される特性を有する変異されたＤＮＡについて選択することにより行われる。変異誘発をオリゴヌクレオチドの使用により行う場合、そのオリゴヌクレオチドは、変化されるべき位置でオリゴヌクレオチドの合成の間、３つの非親ヌクレオチドでドープ化又はスパイクされ得る。ドーピング又はスパイキングは、不要なアミノ酸についてのコドンが避けられるように行うことができる。ドープ化又はスパイク化オリゴヌクレオチドは、いずれかの公開されている技術により、例えばＰＣＲ、ＬＣＲ又は好適ならいずれかのＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、α−アミラーゼ酵素をコードするＤＮＡに組み込むことができる。好ましくは、ドーピングは、各々の位置での野生型及び変異のパーセンテージが予め規定される“コンスタントランダムドーピング”を用いて行われる。更に、ドーピングは、特定のヌクレオチドの導入についての選択、及びこれにより１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入についての選択に対して行うことができる。ドーピングは、例えば各々の位置への９０％の野生型及び１０％の変異の導入を許容するように行うことができる。ドーピングスキームの選択における更なる考慮事項は遺伝子及びタンパク質構造連続に基づく。ドーピングスキームは、とりわけ終止コドンの導入が避けられるのを確実にするＤＯＰＥプログラムを用いることにより行うことができる。ＰＣＲ生成変異誘発を用いる場合、化学的に処理され又は非処理の親α−アミラーゼをコードする遺伝子がヌクレオチドの誤った組み込みを増加させる条件下でＰＣＲにかけられる（Deshler 1992 ; Levng et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15)。大腸菌のミューテーター株（Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191)，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ又はいずれかの他の微生物を、α−アミラーゼをコードするＤＮＡのランダム変異誘発のために、例えば親グリコシラーゼを含むプラスミドをそのミューテーター株に形質転換し、そのミューテーター株をプラスミドと共に増殖させ、そしてそのミューテーター株から変換したプラスミドを単離することにより用いることができる。変異したプラスミドは、次に、発現生物に形質転換することができる。変異誘発すべきＤＮＡ配列は、慣用的には、親α−アミラーゼを発現する生物から調製したゲノム又はｃＤＮＡライブラリーに存在し得る。あるいは、ＤＮＡ配列は、好適なベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在し得、それは、更に、変異誘発剤と共にインキュベートされるか、又はそれに露出され得る。変異誘発すべきＤＮＡは、前記細胞のゲノム内に組み込むことにより、又は細胞内に保持されたベクター上に存在することにより宿主細胞中に存在してもよい。最後に、変異誘発すべきＤＮＡは、単離された形態であり得る。ランダム変異誘発にかけるべきＤＮＡ配列は、好ましくは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである。特定の場合、発現ステップｂ）又はスクリーニングステップｃ）を行う前にその変異したＤＮＡ配列を増幅するのが便利である。このような方法は当業界で知られた方法に従って行うことができ、好ましい方法は、親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ生成増幅である。変異誘発剤とのインキュベーション又はそれへの露出の次に、変異されたＤＮＡは、発現がおこるのを許容する条件下でＤＮＡ配列を有する好適な宿主細胞を培養することにより発現される。この目的のために用いる宿主細胞は、任意にベクター上に存在する、変異されたＤＮＡ配列で形質転換されているもの、又は変異誘発処理の間に親酵素をコードするＤＮＡ配列を有するものであり得る。好適な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ；及びグラム陰性細菌、例えば大腸菌である。その変異されたＤＮＡ配列は、その変異誘発されたＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を更に含み得る。
【００７７】
局所化ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、有利には、問題の親α−アミラーゼの一部に局在化され得る。これは、例えば酵素の特定の領域がその酵素の所定の特性のために特に重要であると同定されている場合に有利であり得、改変した場合に改良された特性を有する変異体を生ずることが予想される。このような領域は、通常、親酵素の３次構造が解明されて、酵素の機能に関連している場合に同定することができる。
【００７８】
局在化又は領域特異的ランダム変異誘発は、便利には、上述のＰＣＲ生成変異誘発技術又は当業界で知られているいずれかの他の好適な技術の使用により行われる。あるいは、改変すべきＤＮＡ配列の部分をコードするＤＮＡ配列は、例えば好適なベクターへの挿入により単離することができる。その部分は、次に、先に議論した変異誘発法のいずれかの使用により変異誘発にかけられ得る。
【００７９】
α−アミラーゼ変異体を供する別の方法
本発明の変異体を供するための別の方法には、例えばＷＯ９５／２２６２５（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．）及びＷＯ９６／００３４３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）に記載される方法を含む、当業界で知られた遺伝子シャッフリング法がある。
【００８０】
α−アミラーゼ変異体の発現
本発明によれば、上述の方法により、又は当業界で知られたいずれかの別の方法により生産された変異体をコードするＤＮＡ配列は、酵素形態で、典型的にはプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意にレプレッカー遺伝子又は種々のアクティベーター遺伝子をコードする調節配列を含む発現ベクターを用いて発現させることができる。
【００８１】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順にかけることができるいずれかのベクターであってもよく、ベクターの選択は、しばしば、導入すべき宿主細胞に依存するであろう。これにより、ベクターは、自己複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクターであってその複製が染色体複製と独立しているもの、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外要素、ミニクロソーム又は人工染色体であり得る。あるいはベクターは、宿主細胞に導入した時に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。
【００８２】
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は好適なプロモーター配列に作用可能に連結されるべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示し、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得られ得るいずれのＤＮＡ配列であってもよい。本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を、特に細菌細胞内で駆動するための好適なプロモーターの例は、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガロース遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼのプロモーター（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。真菌宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラチックプロティナーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。
【００８３】
本発明の発現ベクターは、好適な転写ターミネーター、及び真核生物において、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結したポリアデニル化配列も含み得る。ターミネーション及びポリアデニル化配列は、好適には、プロモーターと同じソースから得ることができる。
【００８４】
ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞内で複製するのを可能にするＤＮＡ配列を更に含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製の起点である。
【００８５】
ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞内の欠損を補う遺伝子、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性を与えるもの、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロランフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるものも含み得る。更に、ベクターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ選択マーカー、例えばａｍｄｓ，ａｒｇＢ，ｎｉａＤ及びｓＣ、ヒグロマイシン耐性を生じてマーカーを含み得るか、又は選択は、例えばＷＯ９１／１７２４３に記載されるように、同時形質転換により行うことができる。
【００８６】
細胞内発現は、特定の場合、例えば宿主細胞として特定の細菌を用いる場合に有利であり得るが、発現は細胞外であることが一般に好ましい。一般に、本明細書に言及される。Ｂａｃｉｌｌｕｓ α−アミラーゼは発現されたプロテアーゼの培養培地への分泌を許容するプレ領域を含む。必要に応じて、このプレ領域は、異なるプレ領域又はシグナル配列により置換され得、便利には、各々のプレ領域をコードするＤＮＡ配列の置換により行うことができる。
【００８７】
α−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素各々をコードするＤＮＡ構成物を連結するため及びそれらを複製のために必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために用いる手順は、当業者に公知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989）。
【００８８】
上述の本発明のＤＮＡ構成物又は発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、有利には、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生産において宿主細胞として用いられる。その細胞は、便利には、（１又は複数のコピーにおける）ＤＮＡ構成物を宿主染色体に組み込むことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構成物で形質転換することができる。この組み込みは、一般に、ＤＮＡ配列が細胞内でより安定に維持されるので有利であると考えられる。ＤＮＡ構成物の宿主染色体への組み込みは、例えば相同的又は非相同的組換えにより、慣用的な方法に従って行うことができる。あるいは、その細胞は、異なる型の宿主細胞と組み合わせて、上述の通り発現ベクターで形質転換することができる。
【００８９】
本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳動物又は昆虫の細胞であり得るが、好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は真菌（イーストを含む）細胞である。
【００９０】
好適な細菌の例は、グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、又はグラム陰性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により又はそれ自体知られた様式でコンピテント細胞を用いることにより行うことができる。
【００９１】
イースト生物は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。糸状菌は、有利には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに属し得る。真菌細胞は、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、次のそれ自体知られた様式での細胞壁の再生に関する方法により形質転換することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞の形質転換のための好適な手順はＥＰ ２３８ ０２３に記載される。
【００９２】
なお更なる態様において、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体を生産する方法であって、上述の宿主細胞を、変異体の生産に資する条件下で培養し、そして細胞及び／又は培養培地からその変異体を回収することを含む。
【００９３】
細胞を培養するために用いる培地は、問題の宿主細胞を増殖させ、そして本発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るために適したいずれの慣用的な培地であってもよい。好適な培地は、商用的供給元から利用でき、又は公開されている方法（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載）に従って調製することができる。
【００９４】
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は、便利には、遠心又はろ過により培地から細胞を分離し、そして塩、例えば硫酸アンモニウムを利用して培地のタンパク質成分を沈殿させ、そして次に、クロマトグラフィー手順、例えばイオン交換、アフィニティークロマトグラフィー等を用いることを含む公知の手順により培養培地から回収することができる。
【００９５】
工業的適用
本発明のα−アミラーゼ変異体は、種々の工業的適用を許容する価値ある特性を有する。特に、本発明の酵素変異体は、洗浄、皿洗い及び硬質表面洗浄洗剤組成物中の成分として適用できる。多数の変異体が、デンプンからの甘味料及びエタノール、例えば燃料、飲料又は工業エタノールの生産に、及び／又は織物デサイジングのために特に役立つ。デンプン液化及び／又は糖化過程を含む、慣用的なデンプン変換過程のための条件は例えばＵＳ３，９１２，５９０及びＥＰ特許公報第２５２ ７３０及び６３ ９０９に記載される。
【００９６】
デンプンからの甘味料の生産
デンプンのフルクトースシロップへの変換のための“伝統的な”方法は、通常、３つの連続的酵素過程、即ち液化過程、次の糖化過程、及び異性化過程からなる。液化過程の間、デンプンは、５．５〜６．２のpH値で９５°〜１６０℃の温度で、約２時間、α−アミラーゼ（例えばＴｅｒｍａｍｙｌTM）によりデキストリンに分解される。これらの条件下での至適酵素安定性を確実にするために、１mMのカルシウムを加える（４０ppm 遊離カルシウムイオン）。
【００９７】
液化過程の後、デキストリンはグルコアミラーゼ（例えばＡＭＧTM）及び脱分枝酵素、例えばイソアミラーゼ又はプルラナーゼ（例えばＰｒｏｍｏｚｙｍｅTN）の添加によりデキストロースに変換される。このステップの前に、pHは４．５未満の値に下げ、高温（９５℃超）に維持し、液化α−アミラーゼ活性を変性させる。温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分枝酵素を加える。糖化過程を２４〜７２時間、進行させる。
【００９８】
糖化過程の後、pHを６〜８の範囲、好ましいpH７．５の値に増加させ、カルシウムをイオン交換により除去する。次にデキストロースシロップを例えば固定化グルコースイソメラーゼ（例えばＳｗｅｅｔｚｙｍｅTM）を用いて高フルクトースシロップに変換する。
【００９９】
この過程の少くとも１の酵素的改良が考えられる：液化α−アミラーゼのカルシウム依存性の削減。遊離カルシウムの添加は、α−アミラーゼの適度に高い安定性を確実にするために要求されるが、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強力に阻害し、更なるユニット作業を用いて遊離カルシウムのレベルを３〜５ppm に下げる程度まで除去する必要がある。このような作業を避けることができ、液化過程を遊離カルシウムイオンの添加なしに行うことができるなら、費用が節約できるであろう。
【０１００】
これを達成するためには、低濃度の遊離カルシウム（＜４０ppm ）で安定でかつ高度に活性であるより低いカルシウム依存性のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼが要求される。Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは４．５〜６．５の範囲、好ましくは４．５〜５．５の範囲のpHでpH至適性を有するべきである。
【０１０１】
本発明は、（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）配列番号：８に示す配列を有するＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼ由来の本発明の１又は複数の変異体及び配列番号：４に示す配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの混合物を含む組成物にも関する。
【０１０２】
更に、本発明は、（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）配列番号：８に示す配列を有するＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼ由来の本発明による１又は複数の変異体並びに配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼの一部及び配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの一部を含むハイブリッドα−アミラーゼの混合物を含む組成物にも関する。後者のハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基を含む。後者のハイブリッドα−アミラーゼは、好適には、（配列番号：４のナンバリングを用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを含み得る。好ましくは、後者のハイブリッドα−アミラーゼは、好適には、（配列番号：４＋ナンバリングを用いて）Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆを含む。以下の例において、（配列番号：２に示す）ＬＥ４２９と呼ぶ最後に言及した親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、本発明の変異体を調製するために用いられる。その変異体は、本発明の組成物中に用いることができる。
【０１０３】
本発明のα−アミラーゼ変異体又は本発明の組成物は、本発明の一態様において、デンプン液化のため、洗剤組成物、例えば洗濯、皿洗い組成物及び硬質表面洗浄、エタノール生産、例えば燃料、飲料及び工業用エタノール生産、織物、布帛及び依類のデサイジングに用いることができる。
【０１０４】
材料及び方法
酵素：
ＬＥ１７４：ハイブリッドα−アミラーゼ変異体：
ＬＥ１７４は、（成熟タンパク質の）Ｎ末端３５アミノ酸残基がＢＡＮ（成熟タンパク質）、即ち次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ（配列番号：４）を更に有する配列番号：６に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼのＮ末端３３残基により置換されていることを除き、Ｔｅｒｍａｍｙｌ配列、即ち配列番号：４に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼと同一であるハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。
【０１０５】
ＬＥ４２９：ハイブリッドα−アミラーゼ変異体：
ＬＥ４２９は、（成熟タンパク質の）Ｎ末端３５アミノ酸残基がＢＡＮ（成熟タンパク質）、即ち次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆ（配列番号：４）を更に有する配列番号：６に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼのＮ末端３３残基により置換されていることを除き、Ｔｅｒｍａｍｙｌ配列、即ち配列番号：４に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼと同一であるハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。ＬＥ４２９は配列番号：２に示し、ＳＯＥ−ＰＣＲ（Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16 : 7351）により作製した。
【０１０６】
ＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅTMＥ：グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓの選択された株から得ることができるプルラナーゼ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから市販）の平衡化混合物。
【０１０７】
α−アミラーゼ変異体の発酵及び精製
関連する発現プラスミドを有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を−８０℃ストックから１０マイクロｇ／mLカナマイシンを伴うＬＢ−寒天プレート上にストリーキングし、３７℃で一晩、増殖させる。そのコロニーを、５００mL振とうフラスコ中の１０マイクロｇ／mLカナマイシンを補給した１００mL ＢＰＸ培地に移す。ＢＰＸ培地の組成は次の通りである：
ポテトデンプン １００ｇ／Ｌ
オオムギ粉 ５０ｇ／Ｌ
ＢＡＮ５０００ ＳＫＢ ０．１ｇ／Ｌ
ナトリウムカゼイネート １０ｇ／Ｌ
ダイズミール ２０ｇ／Ｌ
Ｎａ2ＨＰＯ4，１２Ｈ2Ｏ ９ｇ／Ｌ
ＰｌｕｒｏｎｉｃTM ０．１ｇ／Ｌ
その培養物を３７℃で２７０rpm で５日間、振とうする。
【０１０８】
細胞及び細胞デブリスを２０〜２５分の４５００rpm での遠心により発酵ブロスから除去する。その後、上清をろ過して完全に透明な溶液を得る。そのろ液を濃縮し、ＵＦ−フィルター（１００００カットオフ膜）で洗い、その緩衝液を２０mMアセテートpH５．５に変える。そのＵＦ−ろ液をＳ−セファロースＦ．Ｆ．に適用し、溶出を同じ緩衝液中０．２Ｍ ＮａＣｌでのステップ溶出により行う。その溶出液を１０mM Ｔｒｉｓ，pH９．０に対して透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．に適用し、６カラム容量にわたり０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出する。（Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイにより測定した）活性を含む画分をプールし、pHを７．５に調節し、残っている色を５分、０．５％ｗ／vol の活性石灰での処理により除去した。
【０１０９】
活性測定−（ＫＮＵ）
１キロα−アミラーゼ単位（１ＫＮＵ）は、次の条件：
基質 可溶性デンプン
溶媒中のカルシウム含有量 ０．００４３Ｍ
反応時間 ７〜２０分
温度 ３７℃
pH ５．６
に基づきα−アミラーゼの測定のためのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋの標準的方法において１時間当りに５．２６ｇのデンプン（Merck, Amylum Solubile, Erg. B6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である。
【０１１０】
Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋの分析法（ＡＦ９）の詳細な記載は要求により利用できる。
【０１１１】
α−アミラーゼ活性についてのアッセイ
α−アミラーゼ活性は、基質としてＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）錠剤を用いる方法により測定される。Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃにより供されるＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）Ａｍｙｌａｓｔ Ｔｅｓｔ）は、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と混合され、錠剤化された架橋化不溶性青色デンプンポリマーを含む。
【０１１２】
各々の一回の測定のために、１つの錠剤を５mLの５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（５０mM酢酸、５０mMリン酸、５０mMホウ酸、０．１mM ＣａＣｌ2 ，pHをＮａＯＨで問題の値に調節）を含むチューブに懸濁する。そのテストは問題の温度で水浴中で行う。テストすべきα−アミラーゼは、５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液ＸmLに希釈する。このα−アミラーゼ溶液１mLを５mLの５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に加える。デンプンをα−アミラーゼにより加水分解して可溶性の青色フラグメントを供する。６２０nmで分光光度測定で測定される得られる青色溶液の吸光度はα−アミラーゼ活性の関数である。
【０１１３】
１０分又は１５分のインキュベーション（テスト時間）の後の測定された６２０nmの吸光度は６２０nmで０．２〜２．０吸光度単位の範囲であることが重要である。この吸光度範囲において、活性と吸光度との間の直線性がある（Ｌｕｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則）。それゆえ、酵素の希釈はこの基準に適合するよう調節しなければならない。特定の条件のセット（温度、pH、反応時間、緩衝条件）下で、所定のα−アミラーゼ１mgは特定量の基質を加水分解するであろうし、青色が形成されるであろう。色の強度は６２０nmで測定される。その測定された吸光度は所定の条件のセットの下で問題のα−アミラーゼの比活性（活性／純粋なα−アミラーゼタンパク質のmg）に直接、比例する。
【０１１４】
比活性の測定
比活性は活性／mg酵素としてＰｈａｄｅｂａｓアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定される。
【０１１５】
pH 活性プロフィール（ pH 安定性）の測定
変異体を２０mM ＴＲＩＳ pH７．５、０．１mM、ＣａＣｌ2 中に保存し、３０℃、５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、０．１mM ＣａＣｌ2 でテストする。pH活性は、上述のＰｈａｄｅｂａｓアッセイを用いて、pH４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，７．０，８．０，９．５，９．５，１０、及び１０．５で測定する。
【０１１６】
ＡＧＵ活性の及びＡＧＵ／mgとしての測定
１Ｎｏｖｏ Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｕｎｉｔ（ＡＧＵ）は３７℃、pH４．３で１分当りに１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義する。分析法（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）の詳細な記載は要求によりＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから利用できる。
【０１１７】
活性は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１２４０３６，Ｓｔａｎｄａｒｄ：ＡＭＧ−ｓｔａｎｄａｒｄ，ｂａｔｃｈ ７−１１９５，１９５ＡＧＵ／mLからのＧｌｕｃｏｓｅ ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄキットを用いて、後に改変する方法（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）によりＡＧＵ／mLとして測定する。
【０１１８】
３７５μＬ基質（５０mM酢酸ナトリウム、pH４．３中１％マルトース）を５分、３７℃でインキュベートする。酢酸ナトリウムに希釈した２５μＬの酵素を加える。その反応を、１００μＬの０．２５Ｍ ＮａＯＨを加えることにより１０分後に停止させる。２０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、２００μＬのＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ溶液を加える。室温で３０分の後、吸光度を６５０nmで測定し、活性をＡＭＧ−標準からＡＧＵ／mLで計算する。
【０１１９】
次にＡＧＵ／mgの比活性を、タンパク質濃度（mg／mL）で割った活性（ＡＧＵ／mL）から計算する。
【０１２０】
実施例
実施例１
本発明によるＴｅｒｍａｍｙｌ変異体の作製
Ｔｅｒｍａｍｙｌ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ配列番号：４）を、ｐＤＮ１５２８と呼ぶプラスミドからＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で発現させる。このプラスミドはＴｅｒｍａｍｙｌをコードする完全な遺伝子、ａｍｙＬを含み、その発現はそれ自身のプロモーターにより駆動される。更に、そのプラスミドはプラスミドｐＵＢ１１０からの複製の起点、ｏｒｉ及びクロランフェニコールに対する耐性を与えるプラスミドｐＣ１９４からのｃａｔ遺伝子を含む。ｐＤＮ１５２８はＷＯ９６／２３８７４のＦｉｇ．９に示される。配列番号：３のコーディング領域の主要部分を含む特定の変異誘発ベクターを調製した。ｐＪｅＥＮ１と呼ぶこのベクターの重要な特徴は、ｐＵＣプラスミド由来の複製の起点、クロランフェニコールに対する耐性を与えるｃａｔ遺伝子、及びｂｌａ遺伝子のフレームシフト含有型を含む。この野生型は、通常、アンピシリンに対する耐性を与える（ａｍｐR ）。この変異型はａｍｐS 表現型を生ずる。そのプラスミドｐＪｅＥＮ１をＷＯ９６／２３８７４のＦｉｇ．１０に示し、複製の大腸菌の起点、ｏｒｉ，ｂｌａ，ｃａｔ，Ｔｅｒｍａｍｙｌアミラーゼ遺伝子の５′−トランケート型、及び選択された制限部位をプラスミド上に示す。
【０１２１】
突然変異を、Deng及びNickoloff により概説される制限酵素消化による選択を用いるかわりに、組み込まれた“選択プライマー”（プライマー＃６６１６；以下を参照）を、修復されたｂｌａ遺伝子を伴うプラスミドを有する形質転換された大腸菌細胞のａｍｐR 表現型に基づき選択したことを除いて、Deng及びNickoff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81-88) により記載される方法によりａｍｙＬに導入する。変異誘発のために用いる化学物質及び酵素は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００５０９）からのＣｈｅｍｅｌｅｏｎＯ変異誘発キットから得た。
【０１２２】
変異体プラスミド中のＤＮＡ配列の確認の後、要求される変化を含むトランケートされた遺伝子をＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＤＮ１５２８にサブクローン化し、変異体酵素を発現させるためにプロテアーゼ−及びアシラーゼ涸渇化Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＨＡ２７３に形質転換する。
【０１２３】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｗは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG（配列番号：９）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ５２Ｗ＋Ｖ５４Ｗは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG（配列番号：１０）
プライマー＃６６１６（５′から３′を左から右に記載；Ｐは５′ホスフェートを示す）：
P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C（配列番号：１１）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｅは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG（配列番号：１２）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｍは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG（配列番号：１３）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｉは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG（配列番号：１４）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｙ２９０Ｅ及びＹ２９０Ｋは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C（配列番号：１５）
ＹはＣ及びＴの等量混合物を示す。位置２９０のグルタミン又はリシンをコードするコドンの存在はＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１２４】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｎ１９０Ｆは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C（配列番号：１６）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｎ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｆは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC（配列番号：１７）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１４０Ｋ＋Ｈ１４２Ｄは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG（配列番号：１８)
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１５６Ｙは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG（配列番号：１９）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ１８１Ｔは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC（配列番号：２０）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ２０９Ｖは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC（配列番号：２１）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｑ２６４Ｓは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC（配列番号：２２）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｓ１８７Ｄは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC（配列番号：２３）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体ＤＥＬＴＡ（Ｋ３７０−Ｇ３７１−Ｄ３７２）（即ち、アミノ酸番号：３７０、３７１及び３７２を削除）は以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC（配列番号：２４）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体ＤＥＬＴＡ（Ｄ３７２−Ｓ３７３−Ｑ３７４）は以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C（配列番号：２５）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ１８１Ｔ及びＡ２０９Ｖを、Ａ１８１Ｔ含有ｐＤＮ１５２８様プラスミド（即ちＡ１８１Ｔ変化を生ずるａｍｙＬ内に変異を含むｐＰＮ１５２８）及びＡ２０９Ｖ含有ｐＤＮ１５２８様プラスミド（即ちＡ２０９Ｖ変化を生ずるａｍｙＬ内に変異を含むｐＤＮ１５２８）を、ｐＤＮ１５２８様プラスミドを２回切断する制限酵素ＣｌａＩで消化して、１１１６bpのフラグメント及び３８５０bpのベクター部分（即ち複製のプラスミド起点を含むもの）を作ることによりＡ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖに組み合わせた。Ａ２０９Ｖ変異を含むフラグメント及びＡ１８１Ｔ変異を含むベクター部分を、アガロースゲルでの分離の後に、（ＱＩＡＧＥＮから購入した）ＱＩＡｑｕｉｃｋにゲル抽出キットにより精製した。そのフラグメント及びベクターを連結し、上述のプロテアーゼ及びアミラーゼ涸渇化Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株に形質転換した。ａｍｙ＋からのプラスミド（デンプン含有寒天プレート上の透明をゾーン）及びクロランフェニコール耐性形質転換体を、プラスミド上の両方の変異の存在について分析した。
【０１２５】
先と同様に、Ｈ１５６Ｙ及びＡ２０９Ｖを制限エンドヌクレアーゼＡｃｃ６５Ｉ及びＥｃｏＲＩを利用して組み合わせてＨ１５６Ｙ＋Ａ２０９Ｖを供した。
【０１２６】
Ｈ１５６Ｙ＋Ａ２０９Ｖ及びＡ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖを、制限エンドヌクレアーゼＡｃｃ６５Ｉ及びＨｉｎｄIII の使用によりＨ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖに組み合わせた。
【０１２７】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖの成熟部分の３５Ｎ末端残基を、以下の通りＳＯＥ−ＰＣＲアプローチ（Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16：7351）により、（本文脈でＢＡＮと呼ぶ）Ｂａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼ（配列番号：４）の３３ Ｎ末端残基により置換した：
プライマー１９３６４（配列５′−３′）：CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG（配列番号：２６）
プライマー１９３６２：CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG（配列番号：２７）
プライマー１９３６３：CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC （配列番号：２８）
プライマー１Ｃ：CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC（配列番号：２９）
標準的ＰＣＲ、ポリメラーゼ鎖反応を製造元の説明書及び温度サイクル：９４℃で５分、（９４℃で３０秒、５０℃で４５秒、７２℃で１分）の２５サイクル、７２℃で１０分に従ってＰｗｏ熱安定性ポリメラーゼを用いて行った。
【０１２８】
約１３０bpのフラグメントを、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントに基づきプライマー１９３６４及び１９３６２でＰＣＲ１と呼ぶ最初のＰＣＲにおいて増幅した。
【０１２９】
約４００bpのフラグメントをテンプレートｐＤＮ１５２８に基づきプライマー１９３６３及び１ＣでのＰＣＲ２と呼ぶ別のＰＣＲにおいて増幅した。
【０１３０】
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２をアガロースゲルから精製し、プライマー１９３６４及び１Ｃと共に、ＰＣＲ３におけるテンプレートとして用い、約５２０bpのフラグメントを作った。これにより、このフラグメントは３５番目のアミノ酸からのＴｅｒｍａｍｙｌをコードするＤＮＡの一部に融合されたＢＡＮからのＮ末端をコードするＤＮＡの一部を含む。
【０１３１】
その５２０bpフラグメントを（Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖを含むｐＤＮ１５２８様プラスミドに、上述のように、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ及びＳａｃ IIでの消化、連結及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の形質転換によりサブクローン化した。制限部位ＰｓｔＩ及びＳａｃIIの間のＤＮＡ配列をａｍｙ＋及びクロランフェニコール耐性形質転換からの抽出されたプラスミドにおいてＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３２】
ＢＡＮ及びＨ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖからの正確なＮ末端を含む最終的な構成物をＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖと呼んだ。
【０１３３】
Ｎ１９０ＦをＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖと組み合わせて、ｐＪｅＥＮ１中のａｍｙＬの配列をＴｅｒｍａｍｙｌ変異体ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９ＶをコードするＤＮＡ配列により置換したことを除いて上述の通り変異誘発を行うことにより、ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖを供した。
【０１３４】
Ｑ２６４ＳをＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖと組み合わせて、ｐＪｅＥＮ中のａｍｙＬの配列をＴｅｒｍａｍｙｌ変異体ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９ＶをコードするＤＮＡ配列により置換したことを除いて上述の通り変異誘発を行うことにより、ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを供した。
【０１３５】
ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ及びＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖを組み合わせて、制限エンドヌクレアーゼＢｓａＨＩ（ＢｓａＨＩ部位をＡ２０９変異近くに導入した）及びＰｓｔＩを利用して、ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓにした。
【０１３６】
Ｉ２０１ＦをＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓと組み合わせて、上述の通り変異誘発を行うことによりＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆ（配列番号：２）を供した。変異誘発プライマーＡＭ１００を用い、Ｉ２０１Ｆ置換を導入し、そして同時にＣｌａＩ制限部位を除去して、変異体の容易なピン・ポインティングを容易にした。
【０１３７】
プライマーＡＭ１００：
5' GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3'（配列番号：３０）
実施例２
本発明による変化した開裂パターンを有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体の作製
配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基を含み、更に次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆを含む熱安定性Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼの変異体（この変異体の作製は実施例１に記載し、そのアミノ酸配列は配列番号：２に示す）は分枝点近くで基質を開裂する削減された能力を有する。
【０１３８】
そのα−アミラーゼ変異体の分枝点近くで基質を開裂する削減された能力を更に改良する試みにおいて、定方向突然変異誘発を、Sarkar及びSommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407 ）に記載されるようにＭｅｇａ−プライマー法を用いて行った：
ＬＥ３１３：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｖ５４Ｎの作製
遺伝子特異的プライマー２７２７４及び変異誘発プライマーＡＭ１１５を用いてＰＣＲにより（配列番号：４からのアミラーゼをコードする遺伝子中にＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを有する）ｐＤＮ１５２８様プラスミドから約４４０bpＤＮＡフラグメントを増幅した。
【０１３９】
その４４０bpフラグメントをアガロースゲルから精製し、同じテンプレートで行った第２のＰＣＲにおいてプライマー１１３７１１と一緒にＭｅｇａ−プライマーとして用いる。
【０１４０】
得られた約６３０bpフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＡｃｃ６５Ｉで消化し、得られた約３７０bpＤＮＡフラグメントを精製し、同じ酵素で消化したｐＤＮ１５２８様プラスミドに連結した。コンピテントＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＡ２７３（アミラーゼ及びプロテアーゼが低い）細胞を、その連結体で形質転換し、クロランフェニコール耐性形質転換体をＤＮＡ配列決定によりチェックしてプラスミド上の正確な変異の存在を確認した。
【０１４１】
プライマー２７２７４：
5' CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3'（配列番号：３１）
プライマー１Ｂ：
5' CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3'（配列番号：３２）
プライマーＡＭ１１５：
5' GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3'（配列番号：３３）
ＬＥ３１４の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓは変異誘発プライマーＡＭ１１６を用いることを除いて同様に行う。
【０１４２】
ＡＭ１１６：
5' GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3'（配列番号：３４）
ＬＥ３１５の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎは、変異誘発プライマーＡＭ１１７を用いることを除いて同様に行う。
【０１４３】
ＡＭ１１７：
5' GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3'（配列番号：３５）
ＬＥ３１６の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｔ４９Ｌは変異誘発プライマーＡＭ１１８を用いることを除いて同様に行う。
【０１４４】
ＡＭ１１８：
5' GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3'（配列番号：３６）
ＬＥ３１７の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａは、変異誘発プライマーＡＭ１１８及び変異誘発プライマーＡＭ１１９を同時に用いることを除いて同様に行う。
【０１４５】
ＡＭ１１９：
5' CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3'（配列番号：３７）
ＬＥ３１８の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａは、変異誘発プライマーＡＭ１２０及び変異誘発プライマーＡＭ１１９を同時に用いることを除いて同様に行う。
【０１４６】
ＡＭ１２０：
5' GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3'（配列番号：３８）
ＬＥ３１９の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌは変異誘発プライマーＡＭ１２０を用いることを除いて同様に行う。
【０１４７】
ＬＥ３２０の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｇ１０７Ａは変異誘発プライマーＡＭ１１９を用いることを除いて同様に行う。
【０１４８】
ＬＥ３２２の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｑ５１Ｒ＋Ａ５２Ｓは変異誘発プライマーＡＭ１２１を用いることを除いて同様に行う。
【０１４９】
ＡＭ１２１：
5' GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3'（配列番号：３９）
ＬＥ３２３の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｎは変異誘発プライマーＡＭ１２２を用いることを除いて同様に行う。
【０１５０】
ＡＭ１２２：
5' GAACGAGCCAAAACGACGTGGGCTACGG 3'（配列番号：４０）
実施例３
ＬＥ４２９変異体のテスト（糖化）
標準反応条件は次の通りであった：
基質濃度 ３０％ｗ／ｗ
温度 ６０℃
開始pH（６０℃） ５．５
酵素投与量
グハコアミラーゼ ０．１８ＡＧＵ／ｇ ＤＳ
プルラナーゼ ０．０６ＰＵＮ／ｇ ＤＳ
α−アミラーゼ １０μｇ酵素／ｇ ＤＳ
ＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅTMＥを用いてグルコアミラーゼ及びプルラナーゼ活性を供した。
【０１５１】
糖化のための基質は、脱イオン水中に一般的なコーンデンプンを溶かし、その乾燥基質を約３０％ｗ／ｗに調節することにより調製した。そのpHは（６０℃で測定して）５．５に調節し、１０ｇの乾燥重量に相当する基質のアリコートをブルーキャップガラスフラスコに移した。
【０１５２】
次にそのフラスコを６０℃で平衡化した振とう水溶に入れ、酵素を加えた。そのpHを必要に応じて５．５に再調節した。そのサンプルを４８時間の糖化の後にとり；そのpHを約３．０に調節し、次に１５分、煮沸水浴中で加熱して、酵素を不活性化した。冷却した後、サンプルをロータリーミキサー上で３０分、約０．１ｇの混合床イオン交換樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ５０１×８（Ｄ））で処理して塩及び可溶性Ｎを除去した。ろ過の後、炭水化物組成をＨＰＬＣにより測定した。以下の結果を得た：
変異体についての親α−アミラーゼはＬＥ４２９である。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
コントロールと比べて、液化の間の本発明の活性をα−アミラーゼ変異体の存在はパノースレベル（ＤＰ３）を減少させる。
【０１５５】
特に、ＬＥ４２９のＴ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ変異体及びＬＥ４２９のＡ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ変異体各々はパノースレベル（ＤＰ３）を劇的に減少させる。これらのα−アミラーゼ変異体をデンプン液化のために用いる場合、糖化の開始前に酵素を不活性化することは必要ないであろう。
【０１５６】
実施例４
ＬＥ４２９変異体の液化及び糖化
実施例３の実験を同じ条件下でいくつかの他のＬＥ４２９変異体についてくり返した。
【０１５７】
結果を以下に示す：
【０１５８】
【表２】
【０１５９】
実施例５
実施例３の実験を、液化を９５℃、pH６．０で行い、糖化を６０℃、pH４．５、４０ppm 、ＣａＣｌ2 で行い、次に不活性化したことを除いていくつかのＬＥ４２９変異体についてくり返した。以下に示す変異体はＬＥ４２９変異体である。見い出された結果は以下の通りである：
【０１６０】
【表３】
【０１６１】
【表４】
【配列表】
発明の分野
本発明は、とりわけ、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの新規変異体、顕著には、変化した特性、特に変異体の適用、特に工業的デンプン処理（例えばデンプン液化又は糖化）に関して有利である（親に対して）変化した開裂パターンを示す変異体に関する。
【０００２】
発明の背景
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．１）はデンプン並びに他の直鎖及び分枝鎖１，４−グルコシド結合オリゴ及びポリサッカライドの加水分解を触媒する酵素のグループを構成する。
【０００３】
極めて広範で多数のこの酵素の極めて重要なクラスに関する特許及び科学文献が存在する。いくつかのα−アミラーゼ、例えばＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体が、例えばＷＯ９０／１１３５２，ＷＯ９５／１０６０３，ＷＯ９５／２６３９７，ＷＯ９６／２３８７３，ＷＯ９６／２３８７９及びＷＯ９７／４１２１３から知られている。
【０００４】
α−アミラーゼに関する現在の開示の中で、ＷＯ９６／２３８７４は、ＢＡ２と呼ぶＴｅｒｍａｍｙｌ様のα−アミラーゼについての３次元Ｘ線結晶構造データを供し、それは、その中で配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼの３００ Ｎ末端アミノ酸残基及びその中で配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼのＣ末端のアミノ酸３０１〜４８３からなり、これにより、工業的に重要なＢａｃｉｌｌｕｓ α−アミラーゼに密接に関連する（本文脈において、用語“Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ”の意味に包含され、とりわけ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ及びＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α−アミラーゼを含む）。ＷＯ９６／２３８７４は、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの構造の分析に基づいて、その親に対して変化した特性を示す親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体をデザインするための方法を更に記述する。
【０００５】
ＷＯ９６／２３８７４及びＷＯ９７／４１２１３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、その中の配列番号：４に示す配列のアミノ酸残基Ｖ５４，Ｄ５３，Ｙ５６，Ｑ３３３，Ｇ５７及びＡ５２に変異を含む変化した開裂パターンを有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体を開示する。
【０００６】
発明の簡単な開示
本発明は、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの新規α−デンプン分解変異体、特に、デンプンの工業的処理（デンプン液化、糖化等）に関して有利である（親に対して）変化した開裂パターンを示す変異体に関する。
【０００７】
本発明者らは、驚くことに、変化した特性、特に分枝点の近くで基質を開裂する改良された削減された能力を有し、更に、その中の配列番号：４に示される配列のアミノ酸残基Ｖ５４，Ｄ５３，Ｙ５６，Ｑ３３３，Ｇ５７及びＡ５２に変異を含む変化した開裂パターンを有するＷＯ９６／２３８７４及びＷＯ９７／４１２１３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）に開示されるＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体と比較して、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を有する変化した開裂パターンを有する変異体を見い出した。
【０００８】
本発明は、更に、本発明の変異体をコードするＤＮＡ構成物に、本発明の変異体を含む組成物に、本発明の変異体を調製するための方法に、並びに種々の工業プロセス、例えばデンプン液化における、及び洗剤組成物、例えば洗濯、皿洗い及び硬質表面洗浄組成物；エタノール生産、例えば燃料、飲料及び工業用エタノール生産；織物、布帛又は依類のデサイジング等における、単独で又は他のα−デンプン分解酵素と組み合わせての本発明の変異体及び組成物の使用に関する。
【０００９】
命名法
本記載及び請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用的な１文字及び３文字コードを用いる。引用を容易にするため、本発明のα−アミラーゼ変異体は以下の命名法を用いて記述する：
もとのアミノ酸：位置：置換されるアミノ酸
この命名法によれば、例えば、位置３０でのアラニンのアスパラギンへの置換は、
Ａｌａ３０Ａｓｎ又はＡ３０Ｎ
として示す。同じ位置でのアラニンの欠失は：
Ａｌａ３０* 又はＡ３０*
として示し、更なるアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は：
*３０ａＬｙｓ又は *３０ａＫ
として示す。
【００１０】
アミノ酸残基の連続的ストレッチ、例えばアミノ酸残基３０〜３３の削除は、（３０−３３）* 又はΔ（Ａ３０−Ｎ３３）又はデルタ（Ａ３０−Ｎ３３）として示す。
【００１１】
特定のα−アミラーゼが他のα−アミラーゼと比べて“欠失”を含み、その位置に挿入が行われる場合、これは、位置３６でのアスパラギン酸の挿入について：
*３６ａＡｓｐ又は *３６ａＤ
として示す。
【００１２】
複数の変異は＋の印で分離され、即ち：
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は位置３０及び３４で、アラニン及びグルタミン酸を各々アスパラギン及びセリンで置換する変異を示す。複数の変異は、＋の印と同じ意味で以下の通り分離され得る：
Ａｌａ３０Ａｓｐ／Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ又はＡ３０Ｎ／Ｅ３４Ｓ
１又は複数の別のアミノ酸残基を所定の位置に挿入できる場合、それは
Ａ３０Ｎ，Ｅ又は
Ａ３０Ｎ又はＡ３０Ｅ
として示す。
【００１３】
更に、改変のために適した位置がいずれの特定の改変も示唆されずにここで同定される場合、又はＡ３０Ｘの場合、その位置に存在するアミノ酸残基のかわりにいずれのアミノ酸残基も置換することができると理解される。これにより、例えば、位置３０のアラニンの改変が言及されるが、特定されないか又は“Ｘ”として特定される場合、そのアラニンは、削除されるか、又はいずれかの他のアミノ酸、即ちＲ，Ｎ，Ｄ，Ｃ；Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖのいずれか１つで置換され得ると理解される。
【００１４】
発明の詳細な開示
Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．により生産されるいくつかのα−アミラーゼはアミノ酸レベルで高度に相同性であることが公知である。例えば、（ＴｅｒｍａｍｙｌTMとして市販される）配列番号：４に示すアミノ酸配列を含むＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼは、配列番号：６に示すアミノ酸配列を含むＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼと約８９％の相同性、及び配列番号：８に示すアミノ酸配列を含むＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼと約７９％の相同性であることが見い出されている。更なる相同なα−アミラーゼには、全てがＷＯ９５／２６３９７に詳細に記載される、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＣＩＢ１２２８９，ＮＣＩＢ１２５１２，ＮＣＩＢ１２５１３又はＤＳＭ９３７５の株から得られるα−アミラーゼ、並びにTsukamoto et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31に記載される＃７０７α−アミラーゼがある。
【００１５】
なお更なる相同なα−アミラーゼには、ＥＰ０２５２６６６に記載されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＡＴＣＣ２７８１１）により生産されるα−アミラーゼ、並びにＷＯ９１／００３５３及びＷＯ９４／１８３１４に同定されるα−アミラーゼがある。他の商用Ｔｅｒｍａｍｙｌ様Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼはＯｐｔｉｔｈｅｒｍTM及びＴａｋａｔｈｅｒｍTM（Ｓｏｌｖａｙから市販）、ＭａｘａｍｙｌTM（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、ＳｐｅｚｙｍＡＡTM及びＳｐｅｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ ＡＡTM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、及びＫｅｉｓｔａｓｅTM（Ｄａｉｗａから市販）である。
【００１６】
これらのα−アミラーゼ間に見い出される実質的な相同性のため、それらはα−アミラーゼの同じクラス、即ち“Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ”のクラスに属すると考えられる。
【００１７】
従って、本文脈において、用語“Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ”は、アミノ酸レベルでＴｅｒｍａｍｙｌTM、即ち本明細書に配列番号：４で示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼと実質的な相同性を示すα−アミラーゼを示すことを意図する。換言すれば、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、本明細書の配列番号：２，４，６、又は８に示すアミノ酸配列、及びＷＯ９５／２６３９７の配列番号：１もしくは２に又はTsukamoto et al., 1988に示すアミノ酸配列を有するか、又はｉ）前記アミノ酸配列の少くとも１つと少くとも６０％、好ましくは少くとも７０％、より好ましくは少くとも７５％、更により好ましくは少くとも８０％、特に少くとも８５％、特に好ましくは少くとも９０％、更に特により好ましくは少くとも９５％の相同性、より好ましくは少くとも９７％、より好ましくは少くとも９９％の相同性を示し、及び／又はii）前記α−アミラーゼの少くとも１つに対して生ずる抗体と免疫学的な交差反応を示し、及び／又は iii）本願の配列番号：１，３，５及び７並びにＷＯ９５／２６３９７の配列番号：４及び５から各々明らかな先に特定されるα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされるα−アミラーゼである。
【００１８】
特定ｉ）に関連して、“相同性”は、いずれかの慣用的なアルゴリズムの使用により、好ましくは３．０のＧＡＰクリエーションペナルティ及び０．１のＧＡＰエクステンションペナルティである。ＧＡＰペナルティについてのデフォルト値を用いてＧＣＧパッケージバージョン７．３(June 1993）からのＧＡＰプログラムの使用により決定することができる（Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, uersion 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, VSA 53711）。
【００１９】
ＴｅｒｍａｍｙｌとＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとの間の構造的アラインメントは、他のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼにおいて等価の／対応する位置を同定するのに用いることができる。その構造アラインメントを得る１つの方法は、ギャップペナルティのデフォルト値、即ち３．０のギャップクリエーションペナルティ及び０．１のギャップエクステンションペナルティを用いて、ＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ Ｕｐプログラムを用いることである。他の構造アラインメント法には、疎水性クラスター分析(Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155）及びリバーススレッディング（Huber, T ; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 pp. 142-149 (1998)）がある。α−アミラーゼの特性ii）、即ち免疫学的交差反応は、関連するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの少くとも１つのエピトープに対して生じた、又はそれと反応性の抗体を用いてアッセイすることができる。モノクローナル又はポリクローナルであり得る抗体は、例えばHudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publicationsに記載されるように、当業界で知られた方法により生産することができる。免疫学的交差反応は、当業界で知られたアッセイを用いて決定することができ、その例は、例えばHudson et al., 1989 に記載されるような、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ又は放射状免疫拡散アッセイである。これに関して、各々アミノ酸配列、配列番号：２，４，６又は８を有するα−アミラーゼが見い出されている。
【００２０】
先の特性 iii）に従ってＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのキャラクタリゼーションに用いるオリゴヌクレオチドプローブは、好適には、問題のα−アミラーゼの全部又は部分的ヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて調製することができる。
【００２１】
ハイブリダイゼーションをテストするための好適な条件は、５×ＳＳＣにプレソーキングし、そして１時間、約４０℃で、２０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０mMリン酸ナトリウム、pH６．８、及び５０mgの変性超音波処理化ウシ胸腺ＤＮＡ中でプレハイブリダイズし、次に１００mM ＡＴＰを補給した同じ溶液中で１８時間、−４０℃でハイブリダイゼーションを行い、次に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で４０℃で３０分（低ストリンジェンシー）、好ましくは５０℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは６５℃（高ストリンジェンシー）、更により好ましくは約７５℃（極高ストリンジェンシー）で、フィルターを３回、洗浄することに関する。ハイブリダイゼーション法についてより詳しくは、Sambrook et al. (Molecular Cloning : A Laboraotry Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 に見い出すことができる。
【００２２】
本文脈において用語“由来（から得られる）”は、問題の生物の株により生産され又は生産され得るα−アミラーゼを示すばかりでなく、このような株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、そのＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物で生産されるα−アミラーゼも示すことを意図する。最後に、その用語は、合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ、問題のα−アミラーゼの同定特性を有するα−アミラーゼを示すことを意図する。その用語は、親α−アミラーゼは、天然のα−アミラーゼの１又は複数のアミノ酸残基の改変（挿入、置換、欠失）の結果である天然のα−アミラーゼの変異体であり得ることを示すことも意図する。
【００２３】
親ハイブリッドα−アミラーゼ
親α−アミラーゼは、ハイブリッドα−アミラーゼ、即ち少くとも２つのα−アミラーゼから得られる部分的アミノ酸配列の組合せを含むα−アミラーゼであり得る。
【００２４】
親ハイブリッドα−アミラーゼは、（先に定義されるように）アミノ酸相同性及び／又は免疫学的交差反応性及び／又はＤＮＡハイブリダイゼーションに基づき、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼファミリーに属すると決定することができるものであり得る。この場合、ハイブリッドα−アミラーゼは、典型的には、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの少くとも一部と微生物（細菌又は真菌）及び／又は哺乳動物源のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ又は非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼから選択される１又は複数の他のα−アミラーゼの１又は複数の部分から構成される。
【００２５】
これにより、親ハイブリッドα−アミラーゼは、少くとも２つのＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼから、又は少くとも１のＴｅｒｍａｍｙｌ様及び少くとも１の非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様細菌α−アミラーゼから、又は少くとも１のＴｅｒｍａｍｙｌ様及び少くとも１の真菌α−アミラーゼから得られる部分アミノ酸配列の組合せを含み得る。部分的アミノ酸配列をそこから得ることができるＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、例えば、本明細書に言及されるこれらの特定のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのいずれかであり得る。
【００２６】
例えば、親α−アミラーゼは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの株から得られるα−アミラーゼのＣ末端部分及びＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓの株から又はＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株から得られるα−アミラーゼのＮ末端部分を含み得る。例えば、親α−アミラーゼは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼのＣ末端部分の少なくとも４３０アミノ酸残基を含み得、そして例えば、ａ）配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント、又はｂ）配列番号：８に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼの６８ Ｎ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント及び配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４１５ Ｃ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントを含み得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、その（成熟タンパク質の）Ｎ末端の３５アミノ酸残基が配列番号：６に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ（ＢＡＮ）の成熟タンパク質のＮ末端３３アミノ酸残基で置換されていることを除いて、配列番号：４に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼと同一のハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。そのハイブリッドは、ＬＥ１７４と呼ぶ（配列番号：４のナンバリングを用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを更に有し得る。
【００２８】
別の好ましい親ハイブリッドα−アミラーゼは配列番号：２に示すＬＥ４２９である。
【００２９】
非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、例えば、真菌α−アミラーゼ、哺乳動物又は植物α−アミラーゼ又は細菌α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼと異なる）であり得る。このようなα−アミラーゼの特定の例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡα−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓα−アミラーゼ、ブタ膵臓α−アミラーゼ及びオオムギα−アミラーゼがある。これらのα−アミラーゼの全は、解明された構造を有し、それらは本明細書で引用されるような典型的なＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの構造と顕著に異なる。
【００３０】
上述の真菌α−アミラーゼ、即ちＡ．ｎｉｇｅｒ及びＡ．ｏｒｙｚａｅから得られるものは、アミノ酸レベルにおいて高度に相同性であり、一般に、α−アミラーゼの同じファミリーに属すると考えられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来の真菌α−アミラーゼは商標ＦｕｎｇｅｍｙｌTMで市販されている。
【００３１】
更に、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの特定の変異体（本発明の変異体）が、特定のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基の改変（例えば欠失又は置換）を引用することにより慣用的な様式で、言及される場合、（各々のアミノ酸配列間の最も可能なアミノ酸配列アラインメントから決定して）等価な位置で改変された別のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体がそれにより包含されると理解される。
【００３２】
本発明の変異体の好ましい実施形態は、（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ由来のもの、例えば上述のものの１つ、例えば配列番号：４に示すアミノ酸配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼである。
【００３３】
本発明の変異体の作製
問題の変異体の作製は、その変異体をコードするＤＮＡ配列を含む微生物を、その変異体を生産するために資する条件下で培養することにより行うことができる。次にその変異体は、得られた培養ブロスから回収することができる。これは、以下に更に詳細に記載される。
【００３４】
特性の変化
以下に、本発明の変異体に存在し得る変異、及びそれから生じ得る（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのものに対する）特性の要求される変化の間の関係を議論する。
【００３５】
第１の態様において、本発明は、Ｗ１３，Ｇ４８，Ｔ４９，Ｓ５０，Ｑ５１，Ａ５２，Ｄ５３，Ｖ５４，Ｇ５７，Ｇ１０７，Ｇ１０８，Ａ１１１，Ｓ１６８，Ｍ１９７の群から選択される１又は複数の位置に変異を含む、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体であって、
（ａ）前記変異が、独立して、
（ｉ）前記位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を占有するアミノ酸の欠失、又は
（iii)前記位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸での置換
であり、
（ｂ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、そして
（ｃ）各々の位置が配列番号：４のアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する
変異体に関する。
【００３６】
好ましい実施形態において、上述の本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｖ５４Ｎ，Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ，Ｔ４９Ｌ，Ｔ４９＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ，Ｇ１０７Ａ，Ｑ５１Ｒ，Ｑ５１Ｒ＋Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｎ；又は
Ｔ４９Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｖ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｄ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｙ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｎ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｔ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｖ＋Ｇ１０７Ａ；又は
Ｔ４９Ｖ，Ｔ４９Ｉ，Ｔ４９Ｄ，Ｔ４９Ｎ，Ｔ４９Ｓ，Ｔ４９Ｙ，Ｔ４９Ｆ，Ｔ４９Ｗ，Ｔ４９Ｍ，Ｔ４９Ｅ，Ｔ４９Ｑ，Ｔ４９Ｋ，Ｔ４９Ｒ，Ａ５２Ｔ，Ａ５２Ｌ，Ａ５２Ｉ，Ａ５２Ｖ，Ａ５２Ｍ，Ａ５２Ｆ，Ａ５２Ｙ，Ａ５２Ｗ，Ｖ５４Ｍ，Ｇ１０７Ｖ，Ｇ０７Ｉ，Ｇ１０７Ｌ，Ｇ１０７Ｃ
の少くとも１つに対応する位置での変異を含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｗ１３Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｙ，Ａ；
Ｇ４８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
*４８ａＤ又は *４８ａＹ（即ちＤ又はＹの挿入）；
Ｔ４９Ｘ；
*４９ａＸ（即ちいずれかのアミノ酸残基の挿入）
Ｓ５０Ｘ，特にＤ，Ｙ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｉ；
Ｑ５１Ｒ，Ｋ；
Ａ５２Ｘ，特にＡ５２Ｓ，Ｎ，Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ；
Ｄ５３Ｅ，Ｑ，Ｙ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｌ；
Ｖ５４Ｘ，特にＶ５４Ｉ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｆ，Ｌ；
Ｇ５７Ｓ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｔ；
Ｇ１０７Ｘ，特にＧ１０７Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ，Ｃ；
Ｇ１０８Ｘ，特にＧ１０８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
Ａ１１１Ｖ，Ｉ，Ｌ；
Ｓ１６８Ｙ；
Ｍ１９７Ｘ，特にＹ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｔ，Ａ，Ｇ．
の少くとも１つに対応する位置での変異を含む。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｔ４９Ｘ＋Ａ５２Ｘ＋Ｖ５４Ｎ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ＋Ｇ１０７Ａ
に対応する変異を含み、そして更にＧ１０８Ａを含み得る。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中で、次の変異：
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｔ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ．
に対応する少くとも１つの変異を含む。
【００４０】
上述の本発明の変異体の全ては、変化した特性（増加又は減少した特性を意味する）、特に以下の親α−アミラーゼに対する特性：分枝点の近くで基質を開裂する能力の減少、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性、変化した基質結合、変化した熱安定性、変化したpH／活性プロフィール、変化したpH／安定性プロフィール、酸化に対する変化した安定性、変化したＣａ2+依存性の少くとも１つを有する。
【００４１】
安定性
本発明の文脈において、変化した安定性、特に改良された安定性（即ちより高い又は低い）を、特に低いpH（即ちpH４〜６）で行うことに関して重要な（アミノ酸置換及び／又は欠失を含む）変異には、上記“特性の変化”セクションに列記した変異のいずれか及び後述の変異体がある。
【００４２】
（ＢＡＮ、即ち配列番号：６のナンバリングを用いて）次の変異体：Ｑ３６０Ａ，Ｋ；Ｎ１０２Ａ，Ｎ３２６Ａ，Ｌ，Ｎ１９０Ｇ，Ｎ１９０Ｋ；Ｙ２６２Ａ，Ｋ，ＥもpH安定性についてテストした。好ましい親α−アミラーゼは、上述のＢＡＺであり得る。pH安定性は“材料及び方法”セクションに記載されるように決定した。
【００４３】
Ｃａ 2+ 安定性
変化したＣａ2+安定性は、Ｃａ2+枯濁下での酵素の安定性が改良されている、即ちより高い又はより低い安定性を意味する。本発明の文脈において、変化したＣａ2+安定性、特に改良されたＣａ2+安定性、即ちより高い又はより低い安定性を、特に低いpH（即ちpH４〜６）で達成することに関して重要な（アミノ酸置換を含む）変異には、上述の“特性の変化”に列記される変異のいずれかがある。
【００４４】
比活性
本発明の更なる態様において、変化した比活性、特に増加又は減少した比活性を、特に６０〜１００℃、好ましくは７０〜９５℃、特に８０〜９０℃の温度で示す変異体を得ることに関して重要な変異には、上述の“特性の変化”セクションに列記される変異のいずれかがある。ＬＥ１７４及びＬＥ４２９の比活性は、“材料及び方法”セクションに記載されるＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）アッセイを用いて、１６，０００NU／mgと決定された。
【００４５】
開裂パターンの変化
デンプン液化過程において、（慣用的なＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのように）より短い分枝したオリゴサッカライドを形成するα−アミラーゼより、長く分枝したオリゴサッカライドにデンプン分子を分解することができるα−アミラーゼを用いることが要求される。短く分枝したオリゴサッカライド（パノース前駆体）は、液化過程においてα−アミラーゼ処理の前に、又は糖化アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）と同時に、又は糖化アミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）を加える前に用いられる。プルラナーゼにより満足いく程、加水分解されない。これにより、パノース前駆体の存在下において、グルコアミラーゼ処理後に存在する産物混合物は、有意な割合の短く分枝したいわゆる限界デキストリン、すなわち、トリサッカライドパンノースを含む。
【００４６】
以前に（米国特許第５，２３４，８２３）、グルコアミラーゼ及びプルラナーゼで糖化する場合、液化過程から生ずる残存α−アミラーゼ活性の存在は、糖化段階の前にα−アミラーゼが不活性化されないなら、グルコースのより低い収率を導き得る。この不活性化は、典型的には、糖化のために６０℃に温度を下げる前に、９５℃で４．７末端のpHに調節することにより行うことができる。
【００４７】
このグルコース収率への負の効果の理由は十分に理解されていないが、液化α−アミラーゼ（例えばＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのＴｅｒｍａｍｙｌ １２０Ｌ）が、アミロペクチン内の分枝点の近くの両方の側での１，４−α−グリコシド結合を加水分解することにより、（プルラナーゼのための乏しい基質である）“限界デキストリン”を形成すると想定される。これらのグルコアミラーゼによるこれらの限界デキストリンの加水分解はトリサッカライドパノースの蓄積を導き、それはグルコアミラーゼによりゆっくりとしか加水分解されない。
【００４８】
この欠点を受けない熱安定性α−アミラーゼの開発は、別個の不活性化ステップが要求されないであろうので、有意な改良であろう。
【００４９】
これにより、本発明の目的は、好適に改変されたデンプン分解特性を有するが、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの熱安定性を保持する変異体α−アミラーゼに到達することである。
【００５０】
従って、本発明は、分枝点近くで基質を開裂する改良された減少した能力を有し、そして更に、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体に関する。
【００５１】
特に関心あるものは、アミロペクチン基質を、その還元端から、その分枝点から１超のグルコース単位、好ましくは分枝点から２又は３超のグルコース単位で、即ち野生型Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの使用により得られるより分枝点から更に離れた距離で開裂する変異体である。
【００５２】
ＷＯ９６／２３８７４に従って、以下の変異の少くとも１つを含む変異体が分枝点の近くでの開裂を防ぐと予想されることがここで言及され得る。
【００５３】
Ｖ５４Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，Ｒ，Ｋ，Ｈ，Ｅ，Ｑ；
Ｄ５３Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｗ；
Ｙ５６Ｗ
Ｑ３３３Ｗ；
Ｇ５７、全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ５２，Ａより長いアミノ酸残基、例えばＡ５２Ｗ，Ｙ，Ｌ，Ｆ，Ｉ分枝点近くで基質を開裂する改良された減少した能力を有し、そして改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を有する本発明による変異体を得ることに関連する特に関心ある変異体は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、配列番号：４中の次の位置：
Ｈ１５６，Ａ１８１，Ｎ１９０，Ａ２０９，Ｑ２６４及びＩ２０１
に突然変異を含む。
【００５４】
用いることができるのは以下に特に言及されるＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼだけではないことが強調されるべきである。他の商用Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼも用いることができる。このようなα−アミラーゼの非排他的リストは次の通りである：ＥＰ０２５２６６６に記載されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株（ＡＴＣＣ２７８１１）により生産されるα−アミラーゼ、並びにＷＯ９１／００３５３及びＷＯ９４／１８３１４に同定されるα−アミラーゼ。他の商用Ｔｅｒｍａｍｙｌ様Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼはＯｐｔｉｔｈｅｒｍTM及びＴａｋａｔｈｅｒｍTM（Ｓｏｌｖａｙから市販）、ＭａｘａｍｙｌTM（Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、ＳｐｅｚｙｍＡＡTM酵素デルタＡＡTM（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから市販）、及びＫｅｉｓｔａｓｅTM（Ｄａｉｗａから市販）である。
【００５５】
全てのＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、好適には、本発明の変異体を調製するための骨格として用いることができる。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは各々配列番号：４及び配列番号：６のハイブリッドアミラーゼである。特に、親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の成熟α−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基を含むハイブリッドα−アミラーゼであり得、それは、好適には、（配列番号：４のナンバリングを用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを更に有し得る。このハイブリッドはＬＥ１７４と呼ばれる。ＬＥ１７４ハイブリッドは、更なる変異Ｉ２０１Ｆと組み合わせて、（ナンバリングについて配列番号：４を用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆを有する親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼを形成することができる。このハイブリッド変異体は配列番号：２に示され、以下の例に用いられ、ＬＥ４２９と呼ばれる。
【００５７】
また、以下の変異の１又は複数を含むＬＥ１７４又はＬＥ４２９（配列番号：２）又は配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼを（変異のナンバリングについて配列番号：４を用いて）骨格として用いることができる：
Ｅ１１９Ｃ；
Ｓ１３０Ｃ；
Ｄ１２４Ｃ；
Ｒ１２７Ｃ；
Ａ５２全ての可能なアミノ酸残基；
Ｓ８５全ての可能なアミノ酸残基；
Ｎ９６全ての可能なアミノ酸残基；
Ｖ１２９全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ２６９全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ３７８全ての可能なアミノ酸残基；
Ｓ１４８全ての可能なアミノ酸残基、特にＳ１４８Ｎ；
Ｅ２１１全ての可能なアミノ酸残基、特にＥ２１１Ｑ；
Ｎ１８８全ての可能なアミノ酸残基、特にＮ１８８Ｓ，Ｎ１８８Ｐ
Ｍ１９７全ての可能なアミノ酸残基、特にＭ１９７Ｔ，Ｍ１９７Ａ，Ｍ１９７Ｇ，Ｍ１９７Ｉ，Ｍ１９７Ｌ，Ｍ１９７Ｙ，Ｍ１９７Ｆ，Ｍ１９７Ｉ；
Ｗ１３８全ての可能なアミノ酸残基、特にＷ１３８Ｙ；
Ｄ２０７全ての可能なアミノ酸残基、特にＤ２０７Ｙ；
Ｈ１３３全ての可能なアミノ酸残基、特にＨ１３３Ｙ；
Ｈ２０５全ての可能なアミノ酸残基、特にＨ２０５Ｈ，Ｈ２０５Ｃ，Ｈ２０５Ｒ；
Ｓ１８７全ての可能なアミノ酸残基、特にＳ１８７Ｄ；
Ａ２１０全ての可能なアミノ酸残基、特にＡ２１０Ｓ，Ａ２１０Ｔ；
Ｈ４０５全ての可能なアミノ酸残基、特にＨ４０５Ｄ；
Ｋ１７６全ての可能なアミノ酸残基、特にＫ１７６Ｒ；
Ｆ２７９全ての可能なアミノ酸残基、特にＦ２７９Ｙ；
Ｑ２９８全ての可能なアミノ酸残基、特にＱ２９８Ｈ；
Ｇ２９９全ての可能なアミノ酸残基、特にＧ２９９Ｒ；
Ｌ３０８全ての可能なアミノ酸残基、特にＬ３０８Ｆ；
Ｔ４１２全ての可能なアミノ酸残基、特にＴ４１２Ａ；
更に、以下の変異の少くとも１つを含む配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼを骨格として用いることができる：
Ｍ１５全ての可能なアミノ酸残基；
Ａ３３全ての可能なアミノ酸残基；
ＬＥ１７４を変異Ｉ２０１Ｆ（配列番号：４ナンバリング）と組み合わせることにより骨格として（即ち親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）（配列番号：２に示される）ＬＥ４２９を用いる場合、突然変異／変換、特に置換、欠失及び挿入は、本発明に従って、以下の位置の１又は複数で、分枝点近くで基質を開裂する削減された能力を改良するため並びに基質特異性を改良するため及び／又は比活性を改良するために行うことができる：Ｗ１３，Ｇ４８，Ｔ４９，Ｓ５０，Ｑ５１，Ａ５２，Ｄ５３，Ｖ５４，Ｇ５７，Ｇ１０７，Ｇ１０８，Ａ１１１，Ｓ１６８，Ｍ１９７（配列番号：４のナンバリングを用いる）。
【００５８】
ここで、（ａ）変換は、独立して、
（ｉ）その位置を占めるアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）その位置を占めるアミノ酸の欠失、又は
（iii)その位置のアミノ酸の異なるアミノ酸での置換
であり、
（ｂ）その変異体は、α−アミラーゼ活性を有し、そして（ｃ）各々の位置は配列番号：４のアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中に以下の変異に対応する位置に少くとも１の変異を含む：
Ｖ５４Ｎ，Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ，Ｔ４９Ｌ，Ｔ４９＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ，Ｇ１０７Ａ，Ｑ５１Ｒ，Ｑ５１Ｒ＋Ａ５２Ｓ，Ａ５２Ｎ；又は
Ｔ４９Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｖ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｄ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｙ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｎ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｔ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｖ＋Ｇ１０７Ａ；又は
Ｔ４９Ｖ，Ｔ４９Ｉ，Ｔ４９Ｄ，Ｔ４９Ｎ，Ｔ４９Ｓ，Ｔ４９Ｙ，Ｔ４９Ｆ，Ｔ４９Ｗ，Ｔ４９Ｍ，Ｔ４９Ｅ，Ｔ４９Ｑ，Ｔ４９Ｋ，Ｔ４９Ｒ，Ａ５２Ｔ，Ａ５２Ｌ，Ａ５２Ｉ，Ａ５２Ｖ，Ａ５２Ｍ，Ａ５２Ｆ，Ａ５２Ｙ，Ａ５２Ｗ，Ｖ５４Ｍ，Ｇ１０７Ｖ，Ｇ０７Ｉ，Ｇ１０７Ｌ，Ｇ１０７Ｃ．
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列内に次の変異に対応する位置内に少くとも１の変異を含む：
Ｗ１３Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ，Ｙ，Ａ；
Ｇ４８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
*４８ａＤ又は *４８ａＹ（即ちＤ又はＹの挿入）；
Ｔ４９Ｘ；
*４９ａＸ（即ちいずれかのアミノ酸残基の挿入）
Ｓ５０Ｘ，特にＤ，Ｙ，Ｌ，Ｔ，Ｖ，Ｉ；
Ｑ５１Ｒ，Ｋ；
Ａ５２Ｘ，特にＡ５２Ｓ，Ｎ，Ｔ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｖ；
Ｄ５３Ｅ，Ｑ，Ｙ，Ｉ，Ｎ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｌ；
Ｖ５４Ｘ，特にＶ５４Ｉ，Ｎ，Ｗ，Ｙ，Ｆ，Ｌ；
Ｇ５７Ｓ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｆ，Ｙ，Ｔ；
Ｇ１０７Ｘ，特にＧ１０７Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ，Ｃ；
Ｇ１０８Ｘ，特にＧ１０８Ａ，Ｖ，Ｓ，Ｔ，Ｉ，Ｌ；
Ａ１１１Ｖ，Ｉ，Ｌ；
Ｓ１６８Ｙ；
Ｍ１９７Ｘ，特にＹ，Ｆ，Ｌ，Ｉ，Ｔ，Ａ，Ｇ．
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列内に次の変異に対応する位置に少くとも１の変異を含み：
Ｔ４９Ｘ＋Ａ５２Ｘ＋Ｖ５４Ｎ／Ｉ／Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ＋Ｇ１０７Ａ
そして更にＧ１０８Ａを含み得る。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明の変異体は、配列番号：４に示すアミノ酸配列中に次の変異に対応する位置に少くとも１の変異を含む：
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｔ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｉ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ａ５２Ｓ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ；
Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ；
Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０８Ａ＋Ｖ５４Ｉ．
本発明の変異体における一般的な変異
本発明の変異体は先に概説されるものに加えて、１又は複数の改変を含む。これにより、改変されたα−アミラーゼ変異体の部分中に存在する１又は複数のプロリン残基が可能な天然非プロリン残基のいずれであり得る。好ましくはアラニン、グリシン、セリン、トレオニン、バリン又はロイシンである非プロリン残基で置換されることが有利であり得る。
【００６１】
同様に、親α−アミラーゼから改変されているアミノ酸残基中に存在する１又は複数のシステイン残基を、非システイン残基、例えばセリン、アラニン、トレオニン、グリシン、バリン又はロイシンで置換することが好ましい。
【００６２】
更に、本発明の変異体は、唯一の改変として、又は先に概説される改変のいずれかの組合せにおいて、配列番号：４のアミノ酸フラグメント１８５〜２０９に対応するアミノ酸フラグメント中に存在する１又は複数のＡｓｐ及び／又はＧｌｕを各々Ａｓｎ及び／又はＧｌｎで置換するように改変することができる。Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ中で、配列番号：４のアミノ酸フラグメント１８５〜２０９に対応するアミノ酸フラグメント中に存在する１又は複数のＬｙｓ残基の、Ａｒｇでの置換も関心がある。
【００６３】
本発明は、先に概説される改変の２又はそれ超を組み込む変異体も包含する。
【００６４】
更に、本明細書に記載される変異体のいずれかにおいて点変異を導入することが有利であり得る。
【００６５】
α−アミラーゼ変異体を調製するための方法
遺伝子に変異を導入するためのいくつかの方法が当業界で知られている。α−アミラーゼコーディングＤＮＡ配列のクローニングの短い議論の後、α−アミラーゼコーディング配列内の特定、部位に変異を形成するための方法が議論されよう。
【００６６】
α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、当業界で公知の種々の方法を用いて、問題のα−アミラーゼを生産するいずれかの細胞又は微生物から単離することができる。第１に、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーは、研究すべきα−アミラーゼを生産する生物からの染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて作製するべきである。次にそのα−アミラーゼのアミノ酸配列が知られているなら、相同な、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成して、問題の生物から調製したゲノムライブラリーからα−アミラーゼコーディングクローンを同定するのに用いることができる。あるいは、既知のα−アミラーゼに相同な配列を含む標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いて、α−アミラーゼコーディングクローンを同定するためのプローブとして用いることができよう。
【００６７】
α−アミラーゼコーディングクローンを同定するための更に別の方法は、ゲノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えばプラスミドに挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリーでα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換し、そして次に、その形質転換された細菌をα−アミラーゼのための基質を含む寒天にプレートし、それによりα−アミラーゼを発現するクローンを同定することに関する。
【００６８】
あるいは、酵素をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的方法、例えばS.L. Beaucage 及びM.H. Caruthers (1981) に記載されるホスホロアミジト法又はMatthes et al. (1984) により記載される方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミジト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そして好適なベクターにおいてクローン化された。
【００６９】
最後に、ＤＮＡ配列は、標準的な技術に従って、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のフラグメント（好適なら、全体のＤＮＡ配列の種々の部分に対応するフラグメント）を連結することにより調製される、ゲノム及び合成起源の混合、合成及びｃＤＮＡ起源の混合又はゲノム及びｃＤＮＡ起源の混合のものであり得る。そのＤＮＡ配列は例えばＵＳ４，６８３，２０２又は R.K. Saiki et al. (1988) に記載されるように、特定のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により調製することもできる。
【００７０】
部位特異的変異誘発
α−アミラーゼコーディングＤＮＡ配列が単離され、変異のための要求される部位が同定されたら、変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、要求される変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含み；変異体ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の間に挿入される。特定の方法において、α−アミラーゼコーディング配列に橋をかけるＤＮＡの一本鎖ギャップがα−アミラーゼ遺伝子を有するベクター内に形成される。次に、要求される変異を有する合成ヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡの相同部分とアニーリングされる。次に残りのギャップがＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）でフィル・インされ、その構成物はＴ４リガーゼを用いて連結される。この方法の特定の例はMorinaga et al (1984) に記載される。ＵＳ４，７６０，０２５は、そのカセットの小さな変換を行うことにより多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示する。しかしながら、更により多くの多様な変異をＭｏｒｉｎａｇａの方法によりいずれか一回で導入することができる。これは、種々の長さの複数のオリゴヌクレオチドを導入することができるからである。
【００７１】
α−アミラーゼコーディングＤＮＡに変異を導入するための別の方法は、Nelson及びLong (1989) に記載される。それは、ＰＣＲ反応においてプライマーの１つとして化学的に合成されたＤＮＡ鎖を用いることにより導入される要求される変異を含むＰＣＲフラグメントの３ステップ生成に関する。ＰＣＲ生成フラグメントから、その変異を有するＤＮＡフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼでの開裂により単離し、発現プラスミドに挿入されることができる。
【００７２】
ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、好適には、問題の示されるアミノ酸配列に翻訳される遺伝子の少くとも３つの部分において、又は全体の遺伝子内で、局所化又は領域特異的ランダム変異誘発のいずれかとして行われる。
【００７３】
親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のランダム変異誘発は、便利には、当業界で知られたいずれかの方法の使用により行うことができる。
【００７４】
上記に関連して、本発明の更なる態様は、親α−アミラーゼの変異体を生成するための方法であつて、例えばその変異体は分枝点近くでオリゴサッカライド基質を開裂する削減された能力を示し、そして更に、親に対して改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を更に示し、その方法が、
（ａ）親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列をランダム変異誘発にかけ、
（ｂ）宿主細胞内で、ステップ（ａ）で得られた変異したＤＮＡ配列を発現させ、そして
（ｃ）親α−アミラーゼに対して変化した特性（即ち熱安定性）を有するα−アミラーゼ変異体を発現する宿主細胞についてスクリーニングすること
を含む。
【００７５】
上述の本発明の方法のステップ（ａ）は、好ましくは、ドープ化（ｄｏｐｅｄ）プライマーを用いて行われる。例えば、ランダム変異誘発は、好適な物理的又は化学的変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより行うことができる。更に、ランダム変異誘発は、これらの変異誘発剤のいずれかの組合せの使用により行うことができる。変異誘発剤は、例えば、転移、トランスバージョン、反転、スクランブリング；欠失及び／又は挿入を誘導するものであり得る。
【００７６】
本目的のために適した物理的又は化学的変異誘発剤の例には、紫外（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、重亜硫酸ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチドアナログがある。このような剤を用いる場合、変異誘発は、典型的には、変異誘発すべき親酵素をコードするＤＮＡ配列を選択された変異誘発剤の存在下で、変異誘発がおこるのに適した条件下でインキュベートし、そして要求される特性を有する変異されたＤＮＡについて選択することにより行われる。変異誘発をオリゴヌクレオチドの使用により行う場合、そのオリゴヌクレオチドは、変化されるべき位置でオリゴヌクレオチドの合成の間、３つの非親ヌクレオチドでドープ化又はスパイクされ得る。ドーピング又はスパイキングは、不要なアミノ酸についてのコドンが避けられるように行うことができる。ドープ化又はスパイク化オリゴヌクレオチドは、いずれかの公開されている技術により、例えばＰＣＲ、ＬＣＲ又は好適ならいずれかのＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いて、α−アミラーゼ酵素をコードするＤＮＡに組み込むことができる。好ましくは、ドーピングは、各々の位置での野生型及び変異のパーセンテージが予め規定される“コンスタントランダムドーピング”を用いて行われる。更に、ドーピングは、特定のヌクレオチドの導入についての選択、及びこれにより１又は複数の特定のアミノ酸残基の導入についての選択に対して行うことができる。ドーピングは、例えば各々の位置への９０％の野生型及び１０％の変異の導入を許容するように行うことができる。ドーピングスキームの選択における更なる考慮事項は遺伝子及びタンパク質構造連続に基づく。ドーピングスキームは、とりわけ終止コドンの導入が避けられるのを確実にするＤＯＰＥプログラムを用いることにより行うことができる。ＰＣＲ生成変異誘発を用いる場合、化学的に処理され又は非処理の親α−アミラーゼをコードする遺伝子がヌクレオチドの誤った組み込みを増加させる条件下でＰＣＲにかけられる（Deshler 1992 ; Levng et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11-15)。大腸菌のミューテーター株（Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191)，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ又はいずれかの他の微生物を、α−アミラーゼをコードするＤＮＡのランダム変異誘発のために、例えば親グリコシラーゼを含むプラスミドをそのミューテーター株に形質転換し、そのミューテーター株をプラスミドと共に増殖させ、そしてそのミューテーター株から変換したプラスミドを単離することにより用いることができる。変異したプラスミドは、次に、発現生物に形質転換することができる。変異誘発すべきＤＮＡ配列は、慣用的には、親α−アミラーゼを発現する生物から調製したゲノム又はｃＤＮＡライブラリーに存在し得る。あるいは、ＤＮＡ配列は、好適なベクター、例えばプラスミド又はバクテリオファージ上に存在し得、それは、更に、変異誘発剤と共にインキュベートされるか、又はそれに露出され得る。変異誘発すべきＤＮＡは、前記細胞のゲノム内に組み込むことにより、又は細胞内に保持されたベクター上に存在することにより宿主細胞中に存在してもよい。最後に、変異誘発すべきＤＮＡは、単離された形態であり得る。ランダム変異誘発にかけるべきＤＮＡ配列は、好ましくは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである。特定の場合、発現ステップｂ）又はスクリーニングステップｃ）を行う前にその変異したＤＮＡ配列を増幅するのが便利である。このような方法は当業界で知られた方法に従って行うことができ、好ましい方法は、親酵素のＤＮＡ又はアミノ酸配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ生成増幅である。変異誘発剤とのインキュベーション又はそれへの露出の次に、変異されたＤＮＡは、発現がおこるのを許容する条件下でＤＮＡ配列を有する好適な宿主細胞を培養することにより発現される。この目的のために用いる宿主細胞は、任意にベクター上に存在する、変異されたＤＮＡ配列で形質転換されているもの、又は変異誘発処理の間に親酵素をコードするＤＮＡ配列を有するものであり得る。好適な宿主細胞の例は、次のものである：グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ；及びグラム陰性細菌、例えば大腸菌である。その変異されたＤＮＡ配列は、その変異誘発されたＤＮＡ配列の発現を許容する機能をコードするＤＮＡ配列を更に含み得る。
【００７７】
局所化ランダム変異誘発
ランダム変異誘発は、有利には、問題の親α−アミラーゼの一部に局在化され得る。これは、例えば酵素の特定の領域がその酵素の所定の特性のために特に重要であると同定されている場合に有利であり得、改変した場合に改良された特性を有する変異体を生ずることが予想される。このような領域は、通常、親酵素の３次構造が解明されて、酵素の機能に関連している場合に同定することができる。
【００７８】
局在化又は領域特異的ランダム変異誘発は、便利には、上述のＰＣＲ生成変異誘発技術又は当業界で知られているいずれかの他の好適な技術の使用により行われる。あるいは、改変すべきＤＮＡ配列の部分をコードするＤＮＡ配列は、例えば好適なベクターへの挿入により単離することができる。その部分は、次に、先に議論した変異誘発法のいずれかの使用により変異誘発にかけられ得る。
【００７９】
α−アミラーゼ変異体を供する別の方法
本発明の変異体を供するための別の方法には、例えばＷＯ９５／２２６２５（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．）及びＷＯ９６／００３４３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）に記載される方法を含む、当業界で知られた遺伝子シャッフリング法がある。
【００８０】
α−アミラーゼ変異体の発現
本発明によれば、上述の方法により、又は当業界で知られたいずれかの別の方法により生産された変異体をコードするＤＮＡ配列は、酵素形態で、典型的にはプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意にレプレッカー遺伝子又は種々のアクティベーター遺伝子をコードする調節配列を含む発現ベクターを用いて発現させることができる。
【００８１】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換え発現ベクターは、便利には組換えＤＮＡ手順にかけることができるいずれかのベクターであってもよく、ベクターの選択は、しばしば、導入すべき宿主細胞に依存するであろう。これにより、ベクターは、自己複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクターであってその複製が染色体複製と独立しているもの、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外要素、ミニクロソーム又は人工染色体であり得る。あるいはベクターは、宿主細胞に導入した時に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されるものであり得る。
【００８２】
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は好適なプロモーター配列に作用可能に連結されるべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示し、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得られ得るいずれのＤＮＡ配列であってもよい。本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を、特に細菌細胞内で駆動するための好適なプロモーターの例は、大腸菌のｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガロース遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼのプロモーター（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター等である。真菌宿主における転写のために、有用なプロモーターの例は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラチックプロティナーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼ又はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。
【００８３】
本発明の発現ベクターは、好適な転写ターミネーター、及び真核生物において、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に作用可能に連結したポリアデニル化配列も含み得る。ターミネーション及びポリアデニル化配列は、好適には、プロモーターと同じソースから得ることができる。
【００８４】
ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞内で複製するのを可能にするＤＮＡ配列を更に含み得る。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＵＢ１１０，ｐＥ１９４，ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製の起点である。
【００８５】
ベクターは、選択マーカー、例えばその産物が宿主細胞内の欠損を補う遺伝子、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性を与えるもの、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロランフェニコール又はテトラサイクリン耐性を与えるものも含み得る。更に、ベクターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ選択マーカー、例えばａｍｄｓ，ａｒｇＢ，ｎｉａＤ及びｓＣ、ヒグロマイシン耐性を生じてマーカーを含み得るか、又は選択は、例えばＷＯ９１／１７２４３に記載されるように、同時形質転換により行うことができる。
【００８６】
細胞内発現は、特定の場合、例えば宿主細胞として特定の細菌を用いる場合に有利であり得るが、発現は細胞外であることが一般に好ましい。一般に、本明細書に言及される。Ｂａｃｉｌｌｕｓ α−アミラーゼは発現されたプロテアーゼの培養培地への分泌を許容するプレ領域を含む。必要に応じて、このプレ領域は、異なるプレ領域又はシグナル配列により置換され得、便利には、各々のプレ領域をコードするＤＮＡ配列の置換により行うことができる。
【００８７】
α−アミラーゼ変異体、プロモーター、ターミネーター及び他の要素各々をコードするＤＮＡ構成物を連結するため及びそれらを複製のために必要な情報を含む好適なベクターに挿入するために用いる手順は、当業者に公知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989）。
【００８８】
上述の本発明のＤＮＡ構成物又は発現ベクターのいずれかを含む本発明の細胞は、有利には、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え生産において宿主細胞として用いられる。その細胞は、便利には、（１又は複数のコピーにおける）ＤＮＡ構成物を宿主染色体に組み込むことにより、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構成物で形質転換することができる。この組み込みは、一般に、ＤＮＡ配列が細胞内でより安定に維持されるので有利であると考えられる。ＤＮＡ構成物の宿主染色体への組み込みは、例えば相同的又は非相同的組換えにより、慣用的な方法に従って行うことができる。あるいは、その細胞は、異なる型の宿主細胞と組み合わせて、上述の通り発現ベクターで形質転換することができる。
【００８９】
本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳動物又は昆虫の細胞であり得るが、好ましくは微生物細胞、例えば細菌又は真菌（イーストを含む）細胞である。
【００９０】
好適な細菌の例は、グラム陽性細菌、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓもしくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、又はグラム陰性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト形質転換により又はそれ自体知られた様式でコンピテント細胞を用いることにより行うことができる。
【００９１】
イースト生物は、好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから選択することができる。糸状菌は、有利には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒに属し得る。真菌細胞は、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、次のそれ自体知られた様式での細胞壁の再生に関する方法により形質転換することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主細胞の形質転換のための好適な手順はＥＰ ２３８ ０２３に記載される。
【００９２】
なお更なる態様において、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体を生産する方法であって、上述の宿主細胞を、変異体の生産に資する条件下で培養し、そして細胞及び／又は培養培地からその変異体を回収することを含む。
【００９３】
細胞を培養するために用いる培地は、問題の宿主細胞を増殖させ、そして本発明のα−アミラーゼ変異体の発現を得るために適したいずれの慣用的な培地であってもよい。好適な培地は、商用的供給元から利用でき、又は公開されている方法（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載）に従って調製することができる。
【００９４】
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は、便利には、遠心又はろ過により培地から細胞を分離し、そして塩、例えば硫酸アンモニウムを利用して培地のタンパク質成分を沈殿させ、そして次に、クロマトグラフィー手順、例えばイオン交換、アフィニティークロマトグラフィー等を用いることを含む公知の手順により培養培地から回収することができる。
【００９５】
工業的適用
本発明のα−アミラーゼ変異体は、種々の工業的適用を許容する価値ある特性を有する。特に、本発明の酵素変異体は、洗浄、皿洗い及び硬質表面洗浄洗剤組成物中の成分として適用できる。多数の変異体が、デンプンからの甘味料及びエタノール、例えば燃料、飲料又は工業エタノールの生産に、及び／又は織物デサイジングのために特に役立つ。デンプン液化及び／又は糖化過程を含む、慣用的なデンプン変換過程のための条件は例えばＵＳ３，９１２，５９０及びＥＰ特許公報第２５２ ７３０及び６３ ９０９に記載される。
【００９６】
デンプンからの甘味料の生産
デンプンのフルクトースシロップへの変換のための“伝統的な”方法は、通常、３つの連続的酵素過程、即ち液化過程、次の糖化過程、及び異性化過程からなる。液化過程の間、デンプンは、５．５〜６．２のpH値で９５°〜１６０℃の温度で、約２時間、α−アミラーゼ（例えばＴｅｒｍａｍｙｌTM）によりデキストリンに分解される。これらの条件下での至適酵素安定性を確実にするために、１mMのカルシウムを加える（４０ppm 遊離カルシウムイオン）。
【００９７】
液化過程の後、デキストリンはグルコアミラーゼ（例えばＡＭＧTM）及び脱分枝酵素、例えばイソアミラーゼ又はプルラナーゼ（例えばＰｒｏｍｏｚｙｍｅTN）の添加によりデキストロースに変換される。このステップの前に、pHは４．５未満の値に下げ、高温（９５℃超）に維持し、液化α−アミラーゼ活性を変性させる。温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼ及び脱分枝酵素を加える。糖化過程を２４〜７２時間、進行させる。
【００９８】
糖化過程の後、pHを６〜８の範囲、好ましいpH７．５の値に増加させ、カルシウムをイオン交換により除去する。次にデキストロースシロップを例えば固定化グルコースイソメラーゼ（例えばＳｗｅｅｔｚｙｍｅTM）を用いて高フルクトースシロップに変換する。
【００９９】
この過程の少くとも１の酵素的改良が考えられる：液化α−アミラーゼのカルシウム依存性の削減。遊離カルシウムの添加は、α−アミラーゼの適度に高い安定性を確実にするために要求されるが、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強力に阻害し、更なるユニット作業を用いて遊離カルシウムのレベルを３〜５ppm に下げる程度まで除去する必要がある。このような作業を避けることができ、液化過程を遊離カルシウムイオンの添加なしに行うことができるなら、費用が節約できるであろう。
【０１００】
これを達成するためには、低濃度の遊離カルシウム（＜４０ppm ）で安定でかつ高度に活性であるより低いカルシウム依存性のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼが要求される。Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは４．５〜６．５の範囲、好ましくは４．５〜５．５の範囲のpHでpH至適性を有するべきである。
【０１０１】
本発明は、（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）配列番号：８に示す配列を有するＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼ由来の本発明の１又は複数の変異体及び配列番号：４に示す配列を有するＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの混合物を含む組成物にも関する。
【０１０２】
更に、本発明は、（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼとして）配列番号：８に示す配列を有するＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓα−アミラーゼ由来の本発明による１又は複数の変異体並びに配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼの一部及び配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの一部を含むハイブリッドα−アミラーゼの混合物を含む組成物にも関する。後者のハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基を含む。後者のハイブリッドα−アミラーゼは、好適には、（配列番号：４のナンバリングを用いて）次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを含み得る。好ましくは、後者のハイブリッドα−アミラーゼは、好適には、（配列番号：４＋ナンバリングを用いて）Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆを含む。以下の例において、（配列番号：２に示す）ＬＥ４２９と呼ぶ最後に言及した親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、本発明の変異体を調製するために用いられる。その変異体は、本発明の組成物中に用いることができる。
【０１０３】
本発明のα−アミラーゼ変異体又は本発明の組成物は、本発明の一態様において、デンプン液化のため、洗剤組成物、例えば洗濯、皿洗い組成物及び硬質表面洗浄、エタノール生産、例えば燃料、飲料及び工業用エタノール生産、織物、布帛及び依類のデサイジングに用いることができる。
【０１０４】
材料及び方法
酵素：
ＬＥ１７４：ハイブリッドα−アミラーゼ変異体：
ＬＥ１７４は、（成熟タンパク質の）Ｎ末端３５アミノ酸残基がＢＡＮ（成熟タンパク質）、即ち次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ（配列番号：４）を更に有する配列番号：６に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼのＮ末端３３残基により置換されていることを除き、Ｔｅｒｍａｍｙｌ配列、即ち配列番号：４に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼと同一であるハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。
【０１０５】
ＬＥ４２９：ハイブリッドα−アミラーゼ変異体：
ＬＥ４２９は、（成熟タンパク質の）Ｎ末端３５アミノ酸残基がＢＡＮ（成熟タンパク質）、即ち次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆ（配列番号：４）を更に有する配列番号：６に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼのＮ末端３３残基により置換されていることを除き、Ｔｅｒｍａｍｙｌ配列、即ち配列番号：４に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼと同一であるハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。ＬＥ４２９は配列番号：２に示し、ＳＯＥ−ＰＣＲ（Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16 : 7351）により作製した。
【０１０６】
ＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅTMＥ：グルコアミラーゼ（ＡＭＧ）並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓの選択された株から得ることができるプルラナーゼ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから市販）の平衡化混合物。
【０１０７】
α−アミラーゼ変異体の発酵及び精製
関連する発現プラスミドを有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株を−８０℃ストックから１０マイクロｇ／mLカナマイシンを伴うＬＢ−寒天プレート上にストリーキングし、３７℃で一晩、増殖させる。そのコロニーを、５００mL振とうフラスコ中の１０マイクロｇ／mLカナマイシンを補給した１００mL ＢＰＸ培地に移す。ＢＰＸ培地の組成は次の通りである：
ポテトデンプン １００ｇ／Ｌ
オオムギ粉 ５０ｇ／Ｌ
ＢＡＮ５０００ ＳＫＢ ０．１ｇ／Ｌ
ナトリウムカゼイネート １０ｇ／Ｌ
ダイズミール ２０ｇ／Ｌ
Ｎａ2ＨＰＯ4，１２Ｈ2Ｏ ９ｇ／Ｌ
ＰｌｕｒｏｎｉｃTM ０．１ｇ／Ｌ
その培養物を３７℃で２７０rpm で５日間、振とうする。
【０１０８】
細胞及び細胞デブリスを２０〜２５分の４５００rpm での遠心により発酵ブロスから除去する。その後、上清をろ過して完全に透明な溶液を得る。そのろ液を濃縮し、ＵＦ−フィルター（１００００カットオフ膜）で洗い、その緩衝液を２０mMアセテートpH５．５に変える。そのＵＦ−ろ液をＳ−セファロースＦ．Ｆ．に適用し、溶出を同じ緩衝液中０．２Ｍ ＮａＣｌでのステップ溶出により行う。その溶出液を１０mM Ｔｒｉｓ，pH９．０に対して透析し、Ｑ−セファロースＦ．Ｆ．に適用し、６カラム容量にわたり０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの直線勾配で溶出する。（Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイにより測定した）活性を含む画分をプールし、pHを７．５に調節し、残っている色を５分、０．５％ｗ／vol の活性石灰での処理により除去した。
【０１０９】
活性測定−（ＫＮＵ）
１キロα−アミラーゼ単位（１ＫＮＵ）は、次の条件：
基質 可溶性デンプン
溶媒中のカルシウム含有量 ０．００４３Ｍ
反応時間 ７〜２０分
温度 ３７℃
pH ５．６
に基づきα−アミラーゼの測定のためのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋの標準的方法において１時間当りに５．２６ｇのデンプン（Merck, Amylum Solubile, Erg. B6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である。
【０１１０】
Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋの分析法（ＡＦ９）の詳細な記載は要求により利用できる。
【０１１１】
α−アミラーゼ活性についてのアッセイ
α−アミラーゼ活性は、基質としてＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）錠剤を用いる方法により測定される。Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃにより供されるＰｈａｄｅｂａｓ（登録商標）Ａｍｙｌａｓｔ Ｔｅｓｔ）は、ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と混合され、錠剤化された架橋化不溶性青色デンプンポリマーを含む。
【０１１２】
各々の一回の測定のために、１つの錠剤を５mLの５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液（５０mM酢酸、５０mMリン酸、５０mMホウ酸、０．１mM ＣａＣｌ2 ，pHをＮａＯＨで問題の値に調節）を含むチューブに懸濁する。そのテストは問題の温度で水浴中で行う。テストすべきα−アミラーゼは、５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液ＸmLに希釈する。このα−アミラーゼ溶液１mLを５mLの５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に加える。デンプンをα−アミラーゼにより加水分解して可溶性の青色フラグメントを供する。６２０nmで分光光度測定で測定される得られる青色溶液の吸光度はα−アミラーゼ活性の関数である。
【０１１３】
１０分又は１５分のインキュベーション（テスト時間）の後の測定された６２０nmの吸光度は６２０nmで０．２〜２．０吸光度単位の範囲であることが重要である。この吸光度範囲において、活性と吸光度との間の直線性がある（Ｌｕｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒの法則）。それゆえ、酵素の希釈はこの基準に適合するよう調節しなければならない。特定の条件のセット（温度、pH、反応時間、緩衝条件）下で、所定のα−アミラーゼ１mgは特定量の基質を加水分解するであろうし、青色が形成されるであろう。色の強度は６２０nmで測定される。その測定された吸光度は所定の条件のセットの下で問題のα−アミラーゼの比活性（活性／純粋なα−アミラーゼタンパク質のmg）に直接、比例する。
【０１１４】
比活性の測定
比活性は活性／mg酵素としてＰｈａｄｅｂａｓアッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定される。
【０１１５】
pH 活性プロフィール（ pH 安定性）の測定
変異体を２０mM ＴＲＩＳ pH７．５、０．１mM、ＣａＣｌ2 中に保存し、３０℃、５０mM Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、０．１mM ＣａＣｌ2 でテストする。pH活性は、上述のＰｈａｄｅｂａｓアッセイを用いて、pH４．０，４．５，５．０，５．５，６．０，７．０，８．０，９．５，９．５，１０、及び１０．５で測定する。
【０１１６】
ＡＧＵ活性の及びＡＧＵ／mgとしての測定
１Ｎｏｖｏ Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ Ｕｎｉｔ（ＡＧＵ）は３７℃、pH４．３で１分当りに１マイクロモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義する。分析法（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）の詳細な記載は要求によりＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから利用できる。
【０１１７】
活性は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１２４０３６，Ｓｔａｎｄａｒｄ：ＡＭＧ−ｓｔａｎｄａｒｄ，ｂａｔｃｈ ７−１１９５，１９５ＡＧＵ／mLからのＧｌｕｃｏｓｅ ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄキットを用いて、後に改変する方法（ＡＥＬ−ＳＭ−０１３１）によりＡＧＵ／mLとして測定する。
【０１１８】
３７５μＬ基質（５０mM酢酸ナトリウム、pH４．３中１％マルトース）を５分、３７℃でインキュベートする。酢酸ナトリウムに希釈した２５μＬの酵素を加える。その反応を、１００μＬの０．２５Ｍ ＮａＯＨを加えることにより１０分後に停止させる。２０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、２００μＬのＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ溶液を加える。室温で３０分の後、吸光度を６５０nmで測定し、活性をＡＭＧ−標準からＡＧＵ／mLで計算する。
【０１１９】
次にＡＧＵ／mgの比活性を、タンパク質濃度（mg／mL）で割った活性（ＡＧＵ／mL）から計算する。
【０１２０】
実施例
実施例１
本発明によるＴｅｒｍａｍｙｌ変異体の作製
Ｔｅｒｍａｍｙｌ（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ配列番号：４）を、ｐＤＮ１５２８と呼ぶプラスミドからＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中で発現させる。このプラスミドはＴｅｒｍａｍｙｌをコードする完全な遺伝子、ａｍｙＬを含み、その発現はそれ自身のプロモーターにより駆動される。更に、そのプラスミドはプラスミドｐＵＢ１１０からの複製の起点、ｏｒｉ及びクロランフェニコールに対する耐性を与えるプラスミドｐＣ１９４からのｃａｔ遺伝子を含む。ｐＤＮ１５２８はＷＯ９６／２３８７４のＦｉｇ．９に示される。配列番号：３のコーディング領域の主要部分を含む特定の変異誘発ベクターを調製した。ｐＪｅＥＮ１と呼ぶこのベクターの重要な特徴は、ｐＵＣプラスミド由来の複製の起点、クロランフェニコールに対する耐性を与えるｃａｔ遺伝子、及びｂｌａ遺伝子のフレームシフト含有型を含む。この野生型は、通常、アンピシリンに対する耐性を与える（ａｍｐR ）。この変異型はａｍｐS 表現型を生ずる。そのプラスミドｐＪｅＥＮ１をＷＯ９６／２３８７４のＦｉｇ．１０に示し、複製の大腸菌の起点、ｏｒｉ，ｂｌａ，ｃａｔ，Ｔｅｒｍａｍｙｌアミラーゼ遺伝子の５′−トランケート型、及び選択された制限部位をプラスミド上に示す。
【０１２１】
突然変異を、Deng及びNickoloff により概説される制限酵素消化による選択を用いるかわりに、組み込まれた“選択プライマー”（プライマー＃６６１６；以下を参照）を、修復されたｂｌａ遺伝子を伴うプラスミドを有する形質転換された大腸菌細胞のａｍｐR 表現型に基づき選択したことを除いて、Deng及びNickoff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81-88) により記載される方法によりａｍｙＬに導入する。変異誘発のために用いる化学物質及び酵素は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００５０９）からのＣｈｅｍｅｌｅｏｎＯ変異誘発キットから得た。
【０１２２】
変異体プラスミド中のＤＮＡ配列の確認の後、要求される変化を含むトランケートされた遺伝子をＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＤＮ１５２８にサブクローン化し、変異体酵素を発現させるためにプロテアーゼ−及びアシラーゼ涸渇化Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＳＨＡ２７３に形質転換する。
【０１２３】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｗは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG（配列番号：９）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ５２Ｗ＋Ｖ５４Ｗは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG（配列番号：１０）
プライマー＃６６１６（５′から３′を左から右に記載；Ｐは５′ホスフェートを示す）：
P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C（配列番号：１１）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｅは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG（配列番号：１２）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｍは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG（配列番号：１３）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｖ５４Ｉは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG（配列番号：１４）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｙ２９０Ｅ及びＹ２９０Ｋは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C（配列番号：１５）
ＹはＣ及びＴの等量混合物を示す。位置２９０のグルタミン又はリシンをコードするコドンの存在はＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１２４】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｎ１９０Ｆは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C（配列番号：１６）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｎ１８８Ｐ＋Ｎ１９０Ｆは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC（配列番号：１７）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１４０Ｋ＋Ｈ１４２Ｄは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG（配列番号：１８)
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１５６Ｙは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG（配列番号：１９）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ１８１Ｔは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC（配列番号：２０）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ２０９Ｖは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC（配列番号：２１）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｑ２６４Ｓは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC（配列番号：２２）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｓ１８７Ｄは以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC（配列番号：２３）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体ＤＥＬＴＡ（Ｋ３７０−Ｇ３７１−Ｄ３７２）（即ち、アミノ酸番号：３７０、３７１及び３７２を削除）は以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC（配列番号：２４）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体ＤＥＬＴＡ（Ｄ３７２−Ｓ３７３−Ｑ３７４）は以下の変異誘発プライマーを用いることにより作製した（５′から３′を左から右に記載）：
PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C（配列番号：２５）
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ａ１８１Ｔ及びＡ２０９Ｖを、Ａ１８１Ｔ含有ｐＤＮ１５２８様プラスミド（即ちＡ１８１Ｔ変化を生ずるａｍｙＬ内に変異を含むｐＰＮ１５２８）及びＡ２０９Ｖ含有ｐＤＮ１５２８様プラスミド（即ちＡ２０９Ｖ変化を生ずるａｍｙＬ内に変異を含むｐＤＮ１５２８）を、ｐＤＮ１５２８様プラスミドを２回切断する制限酵素ＣｌａＩで消化して、１１１６bpのフラグメント及び３８５０bpのベクター部分（即ち複製のプラスミド起点を含むもの）を作ることによりＡ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖに組み合わせた。Ａ２０９Ｖ変異を含むフラグメント及びＡ１８１Ｔ変異を含むベクター部分を、アガロースゲルでの分離の後に、（ＱＩＡＧＥＮから購入した）ＱＩＡｑｕｉｃｋにゲル抽出キットにより精製した。そのフラグメント及びベクターを連結し、上述のプロテアーゼ及びアミラーゼ涸渇化Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ株に形質転換した。ａｍｙ＋からのプラスミド（デンプン含有寒天プレート上の透明をゾーン）及びクロランフェニコール耐性形質転換体を、プラスミド上の両方の変異の存在について分析した。
【０１２５】
先と同様に、Ｈ１５６Ｙ及びＡ２０９Ｖを制限エンドヌクレアーゼＡｃｃ６５Ｉ及びＥｃｏＲＩを利用して組み合わせてＨ１５６Ｙ＋Ａ２０９Ｖを供した。
【０１２６】
Ｈ１５６Ｙ＋Ａ２０９Ｖ及びＡ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖを、制限エンドヌクレアーゼＡｃｃ６５Ｉ及びＨｉｎｄIII の使用によりＨ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖに組み合わせた。
【０１２７】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖの成熟部分の３５Ｎ末端残基を、以下の通りＳＯＥ−ＰＣＲアプローチ（Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16：7351）により、（本文脈でＢＡＮと呼ぶ）Ｂａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼ（配列番号：４）の３３ Ｎ末端残基により置換した：
プライマー１９３６４（配列５′−３′）：CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG（配列番号：２６）
プライマー１９３６２：CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG（配列番号：２７）
プライマー１９３６３：CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC （配列番号：２８）
プライマー１Ｃ：CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC（配列番号：２９）
標準的ＰＣＲ、ポリメラーゼ鎖反応を製造元の説明書及び温度サイクル：９４℃で５分、（９４℃で３０秒、５０℃で４５秒、７２℃で１分）の２５サイクル、７２℃で１０分に従ってＰｗｏ熱安定性ポリメラーゼを用いて行った。
【０１２８】
約１３０bpのフラグメントを、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−アミラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡフラグメントに基づきプライマー１９３６４及び１９３６２でＰＣＲ１と呼ぶ最初のＰＣＲにおいて増幅した。
【０１２９】
約４００bpのフラグメントをテンプレートｐＤＮ１５２８に基づきプライマー１９３６３及び１ＣでのＰＣＲ２と呼ぶ別のＰＣＲにおいて増幅した。
【０１３０】
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２をアガロースゲルから精製し、プライマー１９３６４及び１Ｃと共に、ＰＣＲ３におけるテンプレートとして用い、約５２０bpのフラグメントを作った。これにより、このフラグメントは３５番目のアミノ酸からのＴｅｒｍａｍｙｌをコードするＤＮＡの一部に融合されたＢＡＮからのＮ末端をコードするＤＮＡの一部を含む。
【０１３１】
その５２０bpフラグメントを（Ｔｅｒｍａｍｙｌ変異体Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖを含むｐＤＮ１５２８様プラスミドに、上述のように、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ及びＳａｃ IIでの消化、連結及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株の形質転換によりサブクローン化した。制限部位ＰｓｔＩ及びＳａｃIIの間のＤＮＡ配列をａｍｙ＋及びクロランフェニコール耐性形質転換からの抽出されたプラスミドにおいてＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１３２】
ＢＡＮ及びＨ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖからの正確なＮ末端を含む最終的な構成物をＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖと呼んだ。
【０１３３】
Ｎ１９０ＦをＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖと組み合わせて、ｐＪｅＥＮ１中のａｍｙＬの配列をＴｅｒｍａｍｙｌ変異体ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９ＶをコードするＤＮＡ配列により置換したことを除いて上述の通り変異誘発を行うことにより、ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖを供した。
【０１３４】
Ｑ２６４ＳをＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖと組み合わせて、ｐＪｅＥＮ中のａｍｙＬの配列をＴｅｒｍａｍｙｌ変異体ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９ＶをコードするＤＮＡ配列により置換したことを除いて上述の通り変異誘発を行うことにより、ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを供した。
【０１３５】
ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ及びＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖを組み合わせて、制限エンドヌクレアーゼＢｓａＨＩ（ＢｓａＨＩ部位をＡ２０９変異近くに導入した）及びＰｓｔＩを利用して、ＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓにした。
【０１３６】
Ｉ２０１ＦをＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓと組み合わせて、上述の通り変異誘発を行うことによりＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆ（配列番号：２）を供した。変異誘発プライマーＡＭ１００を用い、Ｉ２０１Ｆ置換を導入し、そして同時にＣｌａＩ制限部位を除去して、変異体の容易なピン・ポインティングを容易にした。
【０１３７】
プライマーＡＭ１００：
5' GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3'（配列番号：３０）
実施例２
本発明による変化した開裂パターンを有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ変異体の作製
配列番号：４に示すＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来のα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基を含み、更に次の変異：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｉ２０１Ｆを含む熱安定性Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼの変異体（この変異体の作製は実施例１に記載し、そのアミノ酸配列は配列番号：２に示す）は分枝点近くで基質を開裂する削減された能力を有する。
【０１３８】
そのα−アミラーゼ変異体の分枝点近くで基質を開裂する削減された能力を更に改良する試みにおいて、定方向突然変異誘発を、Sarkar及びSommer, 1990 (BioTechniques 8 : 404-407 ）に記載されるようにＭｅｇａ−プライマー法を用いて行った：
ＬＥ３１３：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｖ５４Ｎの作製
遺伝子特異的プライマー２７２７４及び変異誘発プライマーＡＭ１１５を用いてＰＣＲにより（配列番号：４からのアミラーゼをコードする遺伝子中にＢＡＮ（１−３５）＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓを有する）ｐＤＮ１５２８様プラスミドから約４４０bpＤＮＡフラグメントを増幅した。
【０１３９】
その４４０bpフラグメントをアガロースゲルから精製し、同じテンプレートで行った第２のＰＣＲにおいてプライマー１１３７１１と一緒にＭｅｇａ−プライマーとして用いる。
【０１４０】
得られた約６３０bpフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＡｃｃ６５Ｉで消化し、得られた約３７０bpＤＮＡフラグメントを精製し、同じ酵素で消化したｐＤＮ１５２８様プラスミドに連結した。コンピテントＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＳＨＡ２７３（アミラーゼ及びプロテアーゼが低い）細胞を、その連結体で形質転換し、クロランフェニコール耐性形質転換体をＤＮＡ配列決定によりチェックしてプラスミド上の正確な変異の存在を確認した。
【０１４１】
プライマー２７２７４：
5' CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3'（配列番号：３１）
プライマー１Ｂ：
5' CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3'（配列番号：３２）
プライマーＡＭ１１５：
5' GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3'（配列番号：３３）
ＬＥ３１４の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓは変異誘発プライマーＡＭ１１６を用いることを除いて同様に行う。
【０１４２】
ＡＭ１１６：
5' GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3'（配列番号：３４）
ＬＥ３１５の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎは、変異誘発プライマーＡＭ１１７を用いることを除いて同様に行う。
【０１４３】
ＡＭ１１７：
5' GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3'（配列番号：３５）
ＬＥ３１６の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｔ４９Ｌは変異誘発プライマーＡＭ１１８を用いることを除いて同様に行う。
【０１４４】
ＡＭ１１８：
5' GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3'（配列番号：３６）
ＬＥ３１７の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａは、変異誘発プライマーＡＭ１１８及び変異誘発プライマーＡＭ１１９を同時に用いることを除いて同様に行う。
【０１４５】
ＡＭ１１９：
5' CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3'（配列番号：３７）
ＬＥ３１８の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａは、変異誘発プライマーＡＭ１２０及び変異誘発プライマーＡＭ１１９を同時に用いることを除いて同様に行う。
【０１４６】
ＡＭ１２０：
5' GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3'（配列番号：３８）
ＬＥ３１９の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌは変異誘発プライマーＡＭ１２０を用いることを除いて同様に行う。
【０１４７】
ＬＥ３２０の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｇ１０７Ａは変異誘発プライマーＡＭ１１９を用いることを除いて同様に行う。
【０１４８】
ＬＥ３２２の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ｑ５１Ｒ＋Ａ５２Ｓは変異誘発プライマーＡＭ１２１を用いることを除いて同様に行う。
【０１４９】
ＡＭ１２１：
5' GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3'（配列番号：３９）
ＬＥ３２３の作製：ＢＡＮ／Ｔｅｒｍａｍｙｌハイブリッド＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ＋Ａ５２Ｎは変異誘発プライマーＡＭ１２２を用いることを除いて同様に行う。
【０１５０】
ＡＭ１２２：
5' GAACGAGCCAAAACGACGTGGGCTACGG 3'（配列番号：４０）
実施例３
ＬＥ４２９変異体のテスト（糖化）
標準反応条件は次の通りであった：
基質濃度 ３０％ｗ／ｗ
温度 ６０℃
開始pH（６０℃） ５．５
酵素投与量
グハコアミラーゼ ０．１８ＡＧＵ／ｇ ＤＳ
プルラナーゼ ０．０６ＰＵＮ／ｇ ＤＳ
α−アミラーゼ １０μｇ酵素／ｇ ＤＳ
ＤｅｘｔｒｏｚｙｍｅTMＥを用いてグルコアミラーゼ及びプルラナーゼ活性を供した。
【０１５１】
糖化のための基質は、脱イオン水中に一般的なコーンデンプンを溶かし、その乾燥基質を約３０％ｗ／ｗに調節することにより調製した。そのpHは（６０℃で測定して）５．５に調節し、１０ｇの乾燥重量に相当する基質のアリコートをブルーキャップガラスフラスコに移した。
【０１５２】
次にそのフラスコを６０℃で平衡化した振とう水溶に入れ、酵素を加えた。そのpHを必要に応じて５．５に再調節した。そのサンプルを４８時間の糖化の後にとり；そのpHを約３．０に調節し、次に１５分、煮沸水浴中で加熱して、酵素を不活性化した。冷却した後、サンプルをロータリーミキサー上で３０分、約０．１ｇの混合床イオン交換樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ５０１×８（Ｄ））で処理して塩及び可溶性Ｎを除去した。ろ過の後、炭水化物組成をＨＰＬＣにより測定した。以下の結果を得た：
変異体についての親α−アミラーゼはＬＥ４２９である。
【０１５３】
【表１】
コントロールと比べて、液化の間の本発明の活性をα−アミラーゼ変異体の存在はパノースレベル（ＤＰ３）を減少させる。
【０１５５】
特に、ＬＥ４２９のＴ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ変異体及びＬＥ４２９のＡ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ変異体各々はパノースレベル（ＤＰ３）を劇的に減少させる。これらのα−アミラーゼ変異体をデンプン液化のために用いる場合、糖化の開始前に酵素を不活性化することは必要ないであろう。
【０１５６】
実施例４
ＬＥ４２９変異体の液化及び糖化
実施例３の実験を同じ条件下でいくつかの他のＬＥ４２９変異体についてくり返した。
【０１５７】
結果を以下に示す：
【０１５８】
【表２】
実施例５
実施例３の実験を、液化を９５℃、pH６．０で行い、糖化を６０℃、pH４．５、４０ppm 、ＣａＣｌ2 で行い、次に不活性化したことを除いていくつかのＬＥ４２９変異体についてくり返した。以下に示す変異体はＬＥ４２９変異体である。見い出された結果は以下の通りである：
【０１６０】
【表３】
【表４】
Claims (12)
- Ａ５２Ｓ＋Ｖ５４Ｎ＋Ｔ４９Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｖ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｙ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｎ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｓ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｔ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｆ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｌ＋Ｇ１０７Ａ，Ｔ４９Ｌ＋Ａ５２Ｉ＋Ｇ１０７Ａ及びＴ４９Ｌ＋Ａ５２Ｖ＋Ｇ１０７Ａからなる群から選択される変異を含む、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼの変異体であって、
（ａ）前記変異体がα−アミラーゼ活性を有し、そして
（ｂ）各々の変異が配列番号：４のアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼのアミノ酸配列の変異に対応する
変異体。 - 親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼが、バチルス（Bacillus）属由来である、請求項１に記載の変異体。
- 親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼが、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）由来である、請求項２に記載の変異体。
- 前記変異体が、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼと比べて、分枝点に近いオリゴサッカライド基質を開裂する能力が低い請求項１〜３のいずれかに記載の変異体。
- 親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼに対して、改良された基質特異性及び／又は改良された比活性を更に示す請求項１〜４のいずれかに記載の変異体。
- 親Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼが配列番号：４及び配列番号：６のハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼである請求項１〜５のいずれかに記載の変異体。
- 前記親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）様α−アミラーゼが、配列番号：４に示すＢ．リケニホルミス（B. licheniformis）α−アミラーゼの４４５ Ｃ−末端アミノ酸残基及び配列番号：６に示すＢ．アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）由来のα−アミラーゼの３７ Ｎ−末端アミノ酸残基を含むハイブリッドα−アミラーゼである請求項６に記載の変異体。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物。
- 請求項８に記載のＤＮＡ構成物を有する組換え発現ベクター。
- 請求項８に記載のＤＮＡ構成物又は請求項９に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 細菌、真菌、グラム陽性細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レントゥス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウトゥス（Bacillus lautus）又はバチルス・ツリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）の中から選定される微生物である請求項１０に記載の細胞。
- デンプン液化；洗剤組成物；洗濯、皿洗い及び硬質表面洗浄組成物；エタノール生産；燃料、飲用及び工業用エタノール生産；織物、布帛又は衣類のデサイジングのための、請求項１〜７のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
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