BRPI0009362B1 - variante de uma alfa-amilase precursora, e, uso de uma variante de alfa-amilase - Google Patents

Abstract

"variante de uma alfa-amilase semelhante a termamyl precursora, construção de dna, vetor de expressão recombinante, célula, composição, processo para gerar uma variante de uma alfa-amilase semelhante a termamyl precursora, eiuso de uma variante de alfa-amilase. a invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase semelhante a tennamyl precursora, a qual apresenta propriedades alteradas, em particular capacidade reduzida de clivagem de um substrato próximo ao ponto de ramificação, e especificidade do substrato melhorada e/ou atividade específica melhorada em relação à alfa-amilase precursora.

Description

(54) Título: VARIANTE DE UMA ALFA-AMILASE PRECURSORA, E, USO DE UMA VARIANTE DE ALFA-AMILASE (73) Titular: NOVOZYMES A/S, Companhia Dinamarquesa. Endereço: Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, DINAMARCA(DK), Dinamarquesa (72) Inventor: CARSTEN ANDERSEN; CHRISTEL THEA JORGENSEN; HENRIK BISGARD-FRATZEN; ALLAN SVENDSEN; SOREN KJAERULFF.

Código de Controle: 8C9E8ED04AE17DB8 23C79F221E821C80

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

VARIANTE DE UMA ALFA-AMILASE PRECURSORA, E, USO DE UMA VARIANTE DE ALFA-AMILASE

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito, inter alia, a novas variantes de alfa-amilases semelhantes a Termamyl precursora, notavelmente variantes apresentando propriedades alteradas, em particular padrão de clivagem alterado (relativo à precursora), que são vantajosas com respeito a aplicações das variantes, em particular, em processamento industrial de amido (por exemplo liquefação ou sacarificação de amido).

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As alfa-amilases (alfa-1,4-glican-4-flicanoidrolases, EC 3.2.1.1) constituem um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e outros oligo- e polissacarídeos 1,4 glicosídicos lineares e ramificados.

Existe um corpo de patentes e de literatura científica muito extensivo relacionado a esta classe de enzimas industrialmente muito importante. Várias alfa-amilases, tais como as variantes de alfa-amilases semelhantes à Termamyl, são conhecidas, por exemplo, das WO 90/11352. WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 96 96/23874 e WO 97/41213.

Entre as recentes divulgações relativas às alfa-amilases, a WO 96/23874 provê dados estruturais tridimensionais de cristal de raio-X para uma alfa-amilases semelhante a Termamyl, referida como BA2, que consiste dos 300 resíduos de aminoácidos de N-terminal da alfa-amilase de B. amyloliquefaciens compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada aqui em SEQ ID NO: 6, e os aminoácidos de 301 a 483 da extremidade C-terminal

Petição 870180034833, de 27/04/2018, pág. 8/12 & ο ο da alfa-amilase de B. licheniformis compreendendo a seqüência de aminoácido mostrada aqui na SEQ ID NO: 4 (esta última sendo disponível comercialmente sob o nome comercial de Termamyl®), e que é assim intimamente relacionada às alfa-amilases de Bacillus industrialmente importantes (que no presente contexto são abrangidas dentro do significado da expressão “alfa-amilases semelhantes a Termamyl”, e que incluem, inter alia, as alfa-amilases de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens e B. stearothermophilus). A WO 96/23874 ainda descreve a metodologia para designar, com base em uma análise da estrutura de uma alfa-amilase semelhante a Termamyl precursora, variantes da alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora, que apresenta propriedades alteradas em relação à precursora.

A WO 96/23874 e a WO 97/41213 (Novo Nordisk) apresentam variantes de alfa-amilases semelhantes à Termamyl com um padrão de divagem alterado contendo mutações nos resíduos de aminoácidos V54, D53, Y56, Q333, G57 e A52 da seqüência mostrada aqui na SEQ ID NO: 4.

BREVE APRESENTAÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a novas variantes (mutantes) alfa-amilolíticas de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl, em particular variantes apresentando padrão de divagem alterado (em relação à precursora), que são vantajosas em conexão com o processamento industrial de amino (liquefação, escarificação etc., de amido).

Os inventores surpreendentemente encontraram variantes com propriedades alteradas, em particular padrão de divagem alterado, que têm capacidade de divagem de um substrato reduzida melhorada, próxima ao ponto de ramificação, e ainda possuem especificidade do substrato melhorada e/ou atividade específica melhorada, em comparação com as WO 96/23874 e WO 97/41213 (Novo Nordisk), apresentaram variantes de alfa-amilase e ο semelhante a Termamyl com um padrão de divagem alterado contendo mutações nos resíduos de aminoácido V54, D53, Y56, Q333, G57 e A52 da seqüência mostrada aqui na SEQ ID NO: 4.

A invenção ainda diz respeito a construções de DNA codificando variantes da invenção, a composição compreendendo variantes da invenção, a processos para preparar variantes da invenção, e ao uso de variantes e composições da invenção, sozinhas ou em combinação com outras enzimas alfa-amilolíticas, em vários processos industriais, por exemplo em liquefação de amido, e em composições detergentes, tais como composições para lavagem de roupa, lavagem de louça e de limpeza de superfícies duras; produção de etanol, tal como para combustível, bebida e produção industrial de etanol; desencolamento de têxteis, tecidos ou peças de roupa, etc. NOMENCLATURA

Nos presentes relatório descritivo e reivindicações, os códigos de uma letra e de três letras convencionais para os resíduos de aminoácido são usados. Para facilidade de referência, as variantes de alfa-amilase da invenção são descritas pelo uso da seguinte nomenclatura:

Aminoácido(s) original(is): posição(ões): aminoácido(s) substituído(s)

De acordo com esta nomenclatura, por exemplo a substituição asparagina por alanina na posição 30, é apresentada como:

Ala30Asn ou A30N;

uma deleção de alanina na mesma posição é mostrada como:

Ala30* ou A30*;

uma inserção de um resíduo de aminoácido adicional, tal como lisina, é mostrada como:

*30aLys ou *30aK

Uma deleção de uma série consecutiva de resíduos de aminoácido, tais como os resíduos de aminoácido de 30 a 33, é indicada íe como (30-33)* ou Δ(Α30-Ν33) ou delta(A30-N33).

Quando uma alfa-amilase específica contém uma “deleção” em comparação com outras alfa-amilases e uma inserção é feita em uma tal posição, isto é indicado como:

*36aAsp ou *36aD para a inserção de üm ácido aspártico na posição 36. Mutações múltiplas são separadas pelos sinais de Mais, isto é:

Ala30Asp + Glu34Ser ou A30N+E34S representanto mutações nas posições 30 e 34 substituindo asparagina e serina por alanina e ácido glutâmico, respectivamente. Mutações múltiplas podem também ser separadas como segue, isto é, significando o mesmo que o sinal de mais:

Ala30Asp/Glu34Ser ou A30N/E34S

Quando um ou mais resíduos alternativos de aminoácido puderem ser inseridos em uma dada posição, isso é indicado como:

A30N,E ou

A30N ou A30E

Além disso, quando uma posição adequada para modificação é aqui identificada sem qualquer modificação específica sendo sugerida, ou A30X, deve ser entendido que o resíduo de aminoácido presente na posição pode ser substituído por qualquer resíduo de aminoácido. Assim, por exemplo, quando uma modificação de uma alanina na posição 30 é mencionada, mas não especificada, ou especificada como “X”, deve ser entendido que a alanina pode ser deletada ou substituída por qualquer outro aminoácido, isto é, qualquer um de: R, N, D, C, Q, E, G, Η, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

APRESENTAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A alfa-amilase semelhante a Termamyl

É bem conhecido o fato de que várias alfa-amilases produzidas por Bacillus spp. são altamente homólogas no nível do aminoácido. Por exemplo, a alfa-amilase de B. licheniformis compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 (comercialmente disponível como Termamyl®) tem sido observada como sendo cerca de 89% homóloga com a alfa-amilase de B. amyloliquefaciens compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 6, e cerca de 79% homóloga com a alfa-amilase compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8. Outras alfa-amilases homólogas incluem um alfa-amilase derivada de uma cepa dos Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 ou DSM 9375, todas as quais sendo descritas em detalhes na WO 95/26397, e a alfa-amilase #707 descrita por Tsukamoto et aL, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31.

Outras alfa-amilases homólogas ainda incluem a alfa-amilase produzida pela cepa de B. licheniformis descrita na EP 0252666 (ATCC 27811), e as alfa-amilases identificadas nas WO 91/00353 e WO 94/18314. Outras alfa-amilases de B. licheniformis comerciais semelhantes a Termamyl são a Optitherm® e Takatherm® (disponíveis da Solvay), Maxamyl® (disponível da Gistbrocades/Genencor), Spezym AA® e Spezyme Delta AA® (disponíveis da Genencor), e Keistase® (disponível da Daiwa).

Por causa da homologia substancial encontrada entre estas alfa-amilases, elas são consideradas como pertencentes à mesma classe de alfa-amilases, a saber, a classe de “alfa-amilases semelhantes à Termamyl”.

Conseqüentemente, no presente contexto, a expressão “alfaamilase semelhante a Termamyl” destina-se a indicar uma alfa-amilase que, no nível de aminoácido, apresente uma substancial homologia com Termamyl®. isto é, a alfa-amilase de B. licheniformis tendo a seqüência de aminoácidos aqui mostrada na SEQ ID NO: 4. Em outras palavras, uma alfaamilase semelhante a Termamyl é uma alfa-amilase que tem a seqüência de aminoácidos aqui mostrada nas SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, e a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 1 ou 2 da WO 95/26397 ou em Tsukamoto et al., 1988. ou i) que apresente pelo menos 60%, preferível pelo menos 70%, mais preferível pelo menos 75%, mesmo mais preferível pelo menos 80%, especialmente pelo menos 85%, especialmente preferível pelo menos 90%, ainda especialmente mais preferível pelo menos 95%, de hotnologia, mais preferível pelo menos 97%, mais preferível pelo menos 99% com pelo menos uma das ditas sequências de aminoácido, e/ou ii) apresente reativídade cruzada imunológica com um anticorpo surgido contra pelo menos uma das ditas alfa-amilases, e/ou iii) seja codificada por uma sequência de DNA que hibridize às seqüências de DNA codificando as alfaamilases acima especificadas que sejam evidentes das SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 7 do presente pedido, e SEQ ID NOS: 4 e 5 da WO 95/26397, respectivamente.

Com relação à propriedade i), a “homologia” pode ser determinada pelo uso de qualquer algoritmo convencional, preferivelmente pelo uso do programa GAP da versão 7.3 do pacote GCG (Junho de 1993) usando-se valores básicos para os penalidades de GAP, que é um penalidade de criação de GAP de 3.0 e penalidade de extensão de GAP de 0.1 [Manual de Programa do Genetic Computer Group (1991) para o Pacote GCG, versão 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711).

Um alinhamento estrutural entre Termamyl e uma alfa-amilase semelhante a Termamyl pode ser usado para identificar posições eqüivalentes/correspondentes em outras alfa-amilases semelhantes a Termamyl. Um processo de se obter dito alinhamento estrutural é usar o programa Pile Up do pacote GCG usando valores básicos de penalidades de gap, isto é, um penalidade de criação de gap de 3.0 e penalidade de extensão de gap de 0.1. Outros processos de alinhamento estrutural incluem a análise de cluster hidrofóbico [Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp.

149-155] e encadeamento reverso (Huber, T.; Torda, A. E., PROTEIN SCIENCE, Vol. 7, n^a 1, pp. 142-149 (1998). A propriedade ii) da alfaamilase, isto é, a reatividade cruzada imunológica, pode ser ensaiada usandose um anticorpo surgido contra, ou reativo com, pelo menos um epítopo da alfa-amilase relevante semelhante a Termamyl. O anticorpo, que pode ou ser monoclonal ou policlonal, pode ser produzido por processos conhecidos na técnica, por exemplo como descrito por Hudson et al., Practical Immunology, Terceira edição (1989), Blackwell Scientific Publications. A reatividade cruzada imunológica pode ser determinada usando-se ensaios conhecidos na técnica, exemplos dos quais são a Mancha do Oeste ou o ensaio de imunodifusão radial, por exemplo conforme descrito por Hudson et al., 1989. A este respeito, a reatividade cruzada imunológica entre as alfa-amilases tendo as sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 2, 4, 6 ou 8, respectivamente, foi observada.

A sonda de oligonucleotídeo usada na caracterização da alfaamilase semelhante à Termamyl de acordo com a propriedade iii) acima pode adequadamente ser preparada na base do nocleotídeo completo ou parcial ou sequência de aminoácidos da alfa-amilase em questão.

Condições adequadas para testar a hibridização envolve o préembebimento em 5xSSC e pré-híbridizaçao por 1 hora a -40°C em uma solução de formamida a 20%, 5x solução de Denhardt, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8 e 50 mg de DNA de timo de bezerro sonicado desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução suplementada com ATP 100 mM por 18 horas a ~40°C, seguido por lavagem por três vezes do filtro em 2xSSC, SDS a 0,2% a 40°C por 30 minutos (baixa estringência), preferível a 50°C (média estringência), mais preferivelmente a 65°C (alta estringência), ainda mais preferível a ~75°C (muito alta estringência). Mais detalhes sobre o processo de hibridização podem ser encontrados em Sambrook et al., Molecular_Cloning: A Laboratory Manual, 2^â Edição, Cold Spring Harbor,

1989.

No presente contexto, “derivado de” pretende não apenas indicar uma alfa-amilase produzida ou produtível por uma cepa do organismo em questão, mas também uma alfa-amilase codificada por uma sequência de DNA isolada de tal cepa e produzida em um organismo hospedeiro mutado com dita sequência de DNA. Finalmente, o termo intenta indicar uma alfaamilase que é codificada por uma sequência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA, e que tenha as características de identificação da alfa-amilase em questão. O termo também intenta indicar que a alfa-amilase precursora pode ser uma variante de uma alfa-amilase de ocorrência natural, isto é, uma variante que seja o resultado de uma modificação (inserção, substituição, deleção) de um ou mais resíduos de aminoácidos da alfa-amilase de ocorrência natural.

Alfa-amilases híbridas precursoras

A alfa-amilase precursora pode ser uma alfa-amilase híbrida, isto é, uma alfa-amilase que compreenda uma combinação de sequências de aminoácidos parciais derivadas de pelo menos duas alfa-amilases.

A alfa-amilase híbrida precursora pode ser uma que, na base da homologia de aminoácidos e/ou reatividade cruzada imunológica e/ou hibridização de DNA (como definido acima), pode ser determinada como pertencendo à família da alfa-amilase semelhante à Termamyl. Neste caso, a alfa-amilase híbrida é tipicamente composta de pelo menos uma parte de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl e parte(s) de uma ou mais outras alfaamilases selecionadas das alfa-amilases semelhantes à Termamyl ou alfaamilases não semelhantes à Termamyl de origem microbiana (bacteriana ou fungica) e/ou de mamíferos.

Assim, a alfa-amilase híbrida precursora pode compreender uma combinação de seqüências de aminoácidos parciais derivando-se de pelo menos duas alfa-amilases bacterianas semelhantes à Termamyl, ou de pelo menos uma semelhante à Termamyl e pelo menos uma não semelhante à Termamyl, ou de pelo menos uma alfa-amilase fungica semelhante à Termamyl e pelo menos uma não semelhante à Termamyl. A alfa-amilase semelhante à Termamyl, da qual uma sequência parcial de aminoácidos deriva, pode, por exemplo, ser qualquer uma daquelas alfa-amilases semelhantes à Termamyl específicas aqui referidas.

Por exemplo, a alfa-amilase precursora pode compreender uma parte C-terminal de uma alfa-amilase derivada de uma cepa de B. licheniformis, e uma parte N-terminal de uma alfa-amilase derivada de uma cepa de B. amyloliquefaciens ou de uma cepa de B. stearothermophilus. Por exemplo, a alfa-amilase precursora pode compreender pelo menos 430 resíduos de aminoácidos da parte C-terminal da alfa-amilase de B. licheniformis, e pode, por exemplo, compreender a) um segmento de aminoácido correspondente aos 37 resíduos de aminoácido N-terminal da alfa-amilase de B. amyloliquefaciens tendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 6 e um segmento de aminoácido correspondente aos 445 resíduos de aminoácido C-terminal da alfa-amilase de B. licheniformis tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, ou b) um segmento de aminoácido correspondente aos resíduos de aminoácido N-terminal da alfa-amilase de B. stearothermophilus tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 e um segmento de aminoácido correspondente aos 415 resíduos de aminoácido C-terminal da alfa-amilase de B. licheniformis tendo a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade preferida, a alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora é uma alfa-amilase semelhante à Termamyl híbrida idêntica à alfa-amilase de Bacillus licheniformis mostrada na SEQ ID NO: 4, exceto que os 35 resíduos de aminoácido N-terminal (da proteína madura) são substituídos pelos 33 resíduos de aminoácido N-terminal da proteína madura da alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (BAN) mostrados na SEQ ID NO: 6. Dito híbrido pode ainda ter as seguintes mutações: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando a numeração na SEQ ID NO: 4) referida como LEI74.

Outra alfa-amilase híbrida precursora preferida é a LE429 mostrada na SEQ ID NO: 2.

A alfa-amilase não semelhante a Termamyl pode, por exemplo, ser uma alfa-amilase fungica, uma alfa-amilase de mamíferos ou de um vegetal, ou uma alfa-amilase bacteriana (diferente de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl). Exemplos específicos de tais alfa-amilases incluem a alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, a alfa-amilase ácida de A. niger, a alfa-amilase de Bacillus subtilis, a alfa-amilase pancreática porcina e uma alfa-amilase da cevada. Todas estas alfa-amilases têm estruturas elucidadas, que são marcadamente diferentes da estrutura de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl típica, conforme aqui referido.

As alfa-amilases fungicas mencionadas acima, isto é, derivadas de A. niger e de A oryzae, são altamente homólogas no nível de aminoácido e geralmente consideradas pertencerem à mesma família de alfaamilases. A alfa-amilase fungica derivada de Aspergillus oryzae é comercialmente disponível sob a denominação comercial de Fungamyl®.

Além do mais, quando uma variante particular de uma alfaamilase semelhante à Termamyl (variante da invenção) é referida - de uma forma convencional - por referência à modificação (por exemplo, deleção ou substituição) de resíduos de aminoácidos específicos na sequência de aminoácidos de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl, deve ser entendido que variantes de outra alfa-amilase semelhante à Termamyl modificada na(s) posição(ões) eqüivalente(s) (determinadas do alinhamento da sequência de aminoácidos melhor possível entre as sequências de aminoácidos respectivas) são desse modo abrangidas.

b t*

00*00* 0 0 0 0 0 9 * o 9 9 & 9 0909

Uma modalidade preferida de uma variante da invenção é uma derivada de uma alfa-amilase de B. licheniformis (como alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora), por exemplo uma daquelas referidas acima, tais como a alfa-amilase de B. licheniformis tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQID NO: 4.

Construção de variantes da invenção

A construção da variante de interesse pode ser realizada pela cultura de um microorganismo compreendendo uma sequência de DNA codificando a variante sob condições que sejam conducentes para produzir a variante. A variante pode então subseqüentemente ser recuperada do caldo de cultura resultante. Isto é descrito em detalhes mais abaixo.

Propriedades alteradas

O seguinte examina o relacionamento entre mutações que possam estar presentes em variantes da invenção, e alterações desejáveis nas propriedades (em relação àquelas de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora), que possam daí resultar.

No primeiro aspecto, a invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora, compreendendo uma alteração em uma ou mais posições selecionadas do grupo de: W13, G48, T49, S50, Q51, A52, D53, V54, G57, G107, G108, Al 11, S168, M197, em que (a) a(s) alteração(ões) são independentemente (i) uma inserção de um aminoácido a jusante do aminoácido que ocupa a posição, (ii) uma deleçao do aminoácido que ocupa a posição, ou (iii) uma substituição do aminoácido que ocupa a posição com um aminoácido diferente, (b) a variante tem atividade de alfa-amilase e (c) cada posição corresponde a uma posição da seqüência de aminoácidos da alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade preferida, as variantes supra da invenção compreendem uma mutação em uma posição correspondente a pelo menos uma das seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4:

V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A,

A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R,

Q51R+A52S, A52N; ou

T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A,

T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A,

T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A,

T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; ou

T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E, T49Q, T49K, T49R, A52T, A52L, A52I, A52V, A52M, A52F, A52Y, A52W, V54M, G107V, G107I, G107L, G107C.

Em uma modalidade preferida, uma variante da invenção compreende pelo menos uma mutação em uma posição correspondente às seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4: W13F, L, I, V, Y, A;

G48A, V, S, T, I, L;

*48aD ou *48aY (isto é, inserção de D ou Y);

T49X;

*49aX (isto é, inserção de qualquer resíduo de aminoácido possível)

S50X, em particular D, Y, L, T, V, I;

Q51R, K;

A52X, em particular A52S, N, T, F, L, I, V;

D53E, Q, Y, I, N, S, T, V, L;

V54X, em particular V54I, N, W, Y, F, L;

G57S, A, V, L, I, F, Y, T;

o da invenção

G107X, em particular G107A, V, S, T, I, L, C;

G108X, em particular G108A, V, S, T, I, L;

All IV, I, L;

S168Y;

M197X, em particular Y, F, L, I, T, A, G.

Em uma modalidade preferida, uma variante compreende as seguintes mutações correspondentes às seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4: T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A, e pode ainda compreender G108A.

Em uma modalidade preferida, uma variante da invenção compreende pelo menos uma mutação correspondente às seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4:

T49L+G107A;

T49I+G107A;

T49L+G107A+V54I;

T49I+G107A+V54I;

A52S+V54N+T49L+G107A;

A52S+V54I+T49L+G107A;

A52S+T49L+G107A;

A52T+T49L+G107A;

A52S+V54N+T49I+G107A;

A52S+V54I+T49I+G107 A;

A52S+T49I+G107A;

T49L+G108A;

T49I+G108A;

T49L+G108A+V54I;

T49I+G108A+V54I.

Todas as variantes acima mencionadas da invenção têm propriedades alteradas (significando propriedades aumentadas ou reduzidas),

Ó * ' O (?

em particular pelo menos uma das seguintes propriedades em relação à alfaamilase precursora: capacidade reduzida para clivar um substrato perto do ponto de ramificação, especificidade do substrato alterada, estabilidade térmica alterada, pH/perfil de atividade alterados, pH/perfil de estabilidade alterados, estabilidade alterada em relação à dependência de oxidação e de Ca² alterada.

Estabilidade

No contexto da presente invenção, as mutações (incluindo substituições e/ou deleções de aminoácido) de importância com respeito a se obter estabilidade alterada, em particular estabilidade melhorada (isto é, maior ou menor), especialmente em pH baixo (isto é, pH de 4 a 6), incluem qualquer das mutações listadas na seção de “propriedades alteradas”, acima, e as variantes mencionadas logo abaixo.

As seguintes variantes: Q360A, K; NI02A, N326A, L, N190G, N190K; Y262A, K, E (usando a numeração BAN, isto é, SEQ ID NO: 6), foram também testadas quanto à estabilidade de pH. Uma alfaamilase precursora preferida pode ser a BA2 descrita acima. A estabilidade de pH foi determinada como descrito na seção de “Materiais & Processos”. Estabilidade do CÀ²⁺

A estabilidade do Ca²⁺ alterada significa que a estabilidade da enzima sob depleção de Ca²⁺ tenha sido melhorada, isto é, estabilidade superior ou inferior. No contexto da presente invenção, mutações (incluindo as substituições de aminoácido) de importância com respeito a obter-se estabilidade de Ca²⁺ alterada, em particular estabilidade de Ca²⁺ melhorada, isto é, estabilidade superior ou inferior, especialmente em pH baixo (isto é, pH de 4 a 6), incluem qualquer das mutações listadas na seção acima de “propriedades alteradas”.

Atividade específica

Em um outro aspecto da presente invenção, mutações importantes com respeito a obter-se variantes que apresentem atividade específica alterada, em particular atividade específica aumentada ou reduzida, especialmente em temperaturas de 60 a 100°C, preferivelmente de 70 a 95 °C, especialmente de 80 a 90°C, incluem qualquer uma das mutações listadas na seção de “propriedades alteradas” acima.

A atividade específica de LEI 74 e LE429 foi determinada em 16.000 NU/mg, usando o ensaio Phadebas® descrito na seção de “Materiais e Processos”.

Padrão de clivagem alterado

No processo de liquefação de amido é desejável usar uma alfaamilase que seja capaz de degradar as moléculas do amido em oligossacarídeos longos e ramificados, ao invés de uma alfa-amilase que dê origem à formação de oligossacarídeos mais curtos e ramificados (como as alfa-amilases semelhantes à Termamyl convencionais). Os oligossacarídeos curtos e ramificados (precursores de panose) não são hidrolisados satisfatoriamente pelas pululanases, que são usadas após o tratamento da alfaamilase no processo de liquefação, ou simultaneamente com uma amiloglicosidase de sacarificação (glicoamilase), ou antes da adição de uma amiloglicosidase de sacarificação (glicoamilase). Assim sendo, na presença de precursores de panose, a mistura do produto presente após o tratamento de glicoamilase, contém uma proporção significativa da assim chamada dextrina limite curta e ramificada, isto é, a panose de trissacarídeos. A presença de panose reduz a produção de sacarificação significativamente e é, assim, indesejável.

Foi relatado anteriormente (Patente U.S. 5.234.823) que, quando da sacarificação com glicoamilase e pululanase, a presença de atividade de alfa-amilase residual originada do processo de liquefação, pode conduzir a produções menores de glicose, se a alfa-amilase não for inativada antes do estágio de sacarificação. Esta inativação pode ser tipicamente : M U Μ J . j Γ:::: 31 realizada mediante ajuste do pH a menos do que 4,7 a 95°C, antes de reduzir a temperatura a 60°C para a sacarifícação.

A razão para este efeito negativo sobre a produção de glicose não é completamente entendida, mas supõe-se que a alfa-amilase de 5 liquefação (por exemplo Termamyl 120 L de B. licheniformis) gere “dextrinas limites” (que são substratos fracos para a pululanase), mediante hidrólise das articulações de 1,4-alfa-flicosídica perto e em ambos os lados dos pontos de ramificação na amilopectina. A hidrólise destas dextrinas limites por glicoamilase conduz a uma construção da panose de 10 trissacarídeos, que é apenas lentamente hidrolisada por glicoamilase.

O desenvolvimento de uma alfa-amilase termoestável, que não sofra desta desvantagem, deve ser um melhoramento significativo, já que nenhuma etapa de inativação separada deve ser necessária.

Assim, o objetivo da presente invenção é chegar a uma alfa15 amilase mutante tendo características de degradação de amido apropriadamente modificadas, mas retendo a termoestabilidade da alfaamilase semelhante à Termamyl precursora.

Conseqüentemente, a invenção diz respeito a uma variante de uma alfa-amilase semelhante à Termamyl, que tenha uma capacidade 20 reduzida melhorada para clivar um substrato perto do ponto de ramificação, e ainda tenha especificidade do substrato melhorada e/ou atividade específica melhorada.

De particular interesse é uma variante que clive um substrato de amilopectina, da extremidade de redução, mais do que uma unidade de 25 glicose do ponto de ramificação, preferivelmente mais do que duas ou três unidades de glicose do ponto de ramificação, isto é, um uma distância mais extensa do ponto de ramificação do que aquela obtida pelo uso de uma alfaamilase de B. licheniformis do tipo selvagem.

Pode ser aqui mencionado que, de acordo com a WO

96/23874, espera-se que as variantes compreendendo pelo menos uma das seguintes mutações para impedir a divagem perto do ponto de ramificação: V54L, I, F, Y, W, R, K, Η, E, Q;

D53L, I, F, Y, W;

Y56W;

Q333W;

G57, todos os resíduos possíveis de aminoácido;

A52, resíduos de aminoácidos maiores do que A, por exemplo A52W, Y, L, F, L

Mutações de particular interesse em relação à obtenção de variantes de acordo com a invenção, tendo uma capacidade reduzida melhorada para clivar um substrato perto do ponto de ramificação, e ainda tendo especificidade de substrato melhorada e/ou atividade específica melhorada, incluem as mutações nas seguintes posições na alfa-amilase de B. licheniformis, SEQ ID NO: 4:

H156, Al 81, NI90, A209, Q264 e 1201.

Deve ser enfatizado que não apenas a alfa-amilase semelhante à Termamyl mencionada especificamente abaixo pode ser usada. Também outras alfa-amilase semelhante à Termamyl comerciais podem ser usadas. Uma lista não exaustiva de tais alfa-amilases é a seguinte:

Alfa-amilases produzidas pela cepa de B. licheniformis descritas na EP 0252666 (ATCC 27811), e as alfa-amilases identificadas nas WO 91/00353 e WO 54/18314. Outras alfa-amilases de B. licheniformis semelhantes à Termamyl comerciais são as Optitherm® e Takatherm® (disponíveis da Solvay), Maxamyl® (disponível da Gistbrocades/Genencor), Spezym AA® e Spezyme Delta AA® (disponíveis da Genencor), e Keistase® (disponível da Daiwa).

Todas as alfa-amilases semelhantes à Termamyl podem ser adequadamente usadas como a espinha dorsal para preparar variantes da invenção.

Em uma modalidade preferida da invenção, a alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora é uma alfa-amilase híbrida das SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6. Especificamente, a alfa-amilase semelhante à Termamyl híbrida precursora pode ser uma alfa-amilase híbrida que compreenda os 445 resíduos de aminoácido C-terminal da alfa-amilase de B. licheniformis mostrados na SEQ ID NO: 4, e os 37 resíduos de aminoácido N-terminal da alfa-amilase madura derivada de B. amyloliquefaciens mostrados na SEQ ID NO: 6, que podem adequadamente ainda ter as seguintes mutações: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando a numeração na SEQ ID NO: 4). Este híbrido é referido como LEI74. O híbrido LEI74 pode ser combinado com uma outra mutação 1201F para formar uma alfa-amilase semelhante à Termamyl híbrida precursora tendo as seguintes mutações H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (usando a SEQ ID NO: 4 para a numeração). Esta variante híbrida é mostrada na SEQ ID NO: 2 e é usada nos exemplos abaixo, e é referida como LE429.

Igualmente, LE174 ou LE429 (SEQ ID NO: 2) ou a alfaamilase de B. licheniformis mostrada na SEQ ID NO: 4 compreendendo uma ou mais das seguintes mutações, podem ser usadas como a espinha dorsal (usando a SEQ ID NO: 4 para a numeração das mutações):

E119C;

S130C;

D124C;

R127C;

A52 todos possíveis resíduos de aminoácido;

S85 todos possíveis resíduos de aminoácido;

N96 todos possíveis resíduos de aminoácido;

VI29 todos possíveis resíduos de aminoácido;

A269 todos possíveis resíduos de aminoácido;

ο ô

Α378 todos possíveis resíduos de aminoácido;

S148 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular S148N; E211 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular E211Q;

NI 88 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular N188S, N188P;

M197 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular M197T, M197A, M197G, M197I, M197L, M197Y, M197F, M197I;

W138 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular W138Y; D207 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular D207Y; H133 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular H133Y;

H205 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular H205H, H205C, H205R;

SI87 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular S187D;

A210 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular A210S, A210T;

H405 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular H405D; Kl76 todos possíveis resíduos de aminoácido, em particular K176R; F279 todos os possíveis resíduos de aminoácido, em particular F279Y;

Q298 todos os possíveis resíduos de aminoácido, em particular Q298H; G299 todos os possíveis resíduos de aminoácido, em particular G299R;

L3O8 todos os possíveis resíduos de aminoácido, em particular L308F; T412 todos os possíveis resíduos de aminoácido, em particular T412A.

Além disso, a alfa-amilase de B, licheniformis mostrada na

SEQ ID NO: 4, compreendendo pelo menos uma das seguintes mutações, pode ser usada como espinha dorsal:

Ml5 todas possíveis resíduos de aminoácido;

A33 todas possíveis resíduos de aminoácido.

Quando do uso de LE429 (mostrada na SEQ ID NO: 2) como a espinha dorsal (isto é, como a alfa-amilase semelhante à Termamyl

precursora) pela combinação de LEI74 com a mutação 1201F (numeração da SEQ ID NO: 4), as mutações/alterações, em particular substituições, deleções e inserções, podem, de acordo com a invenção, ser feitas em uma ou mais das seguintes posições, para melhorar a capacidade reduzida para clivar um substrato perto do ponto de ramificação, e para melhorar a especificidade do substrato e/ou atividade específica melhorada: W13, G48, T49, S50, Q51, A52, D53, V54, G57, G107, G108, Al 11, S168, M197 (usando a numeração da SEQ ID NO: 4), em que (a) a(s) alteração(ões) são independentemente (i) uma inserção de um aminoácido a jusante do aminoácido que ocupa a posição, (ii) uma deleção do aminoácido que ocupa a posição, ou (iii) uma substituição do aminoácido que ocupa a posição com um aminoácido diferente, (b) a variante tem atividade de alfa-amilase e (c) cada posição corresponde a uma posição da sequência de aminoácidos da alfa-amilase semelhante à Termamyl precursora tendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4.

Em uma modalidade preferida, uma variante da invenção compreende pelo menos uma mutação em uma posição correspondente às seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4:

V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49+G107A,

A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R,

Q51R+A52S, A52N; ou

T49F+G107A, T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A,

T49S+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A,

T49L+A52T+G107A, T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A,

T49L+A52I+G107A, T49L+A52V+G107A; ou

T49V, T49I, T49D, T49N, T49S, T49Y, T49F, T49W, T49M, T49E,

T49Q, Τ49Κ, T49R, Α52Τ, A52L, Α52Ι, A52V, Α52Μ, A52F, Α52Υ, A52W, V54M, G107V, G107I, G107L, G107C.

Em uma modalidade preferida, uma variante da invenção compreende pelo menos uma mutação em uma posição correspondente às 5 seguintes mutações na seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4: W13F, L, I, V, Y, A;

G48A, V, S, T, I, L;

*48aD ou *48aY (isto é, inserção de D ou Y);

T49X;

*49aX (isto é, inserção de qualquer resíduo de aminoácido)

S50X, em particular D, Y, L, T, V, I;

Q51R, K;

A52X, em particular A52S, N, T, F, L, I, V;

D53E, Q, Y, I, N, S, T, V, L;

V54X, em particular V54I, N, W, Y, F, L;

G57S, A, V, L, I, F, Y, T;

G107X, em particular G107A, V, S, T, I, L, C;

G108X, em particular G108A, V, S, T, I, L;

A111V, I, L;

S168Y;

M197X, em particular Y, F, L, I, T, A, G.

Em uma modalidade preferida, uma variante da invenção compreende pelo menos uma mutação em uma posição correspondente às seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4: 25 T49X+A52X+V54N/I/L/Y/F/W+G107A, e pode ainda compreender

G108A.

Em uma modalidade preferida, uma variante da invenção compreende pelo menos uma mutação em uma posição correspondente às seguintes mutações na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4:

Ο ¢,

Ay

T49L+G107A;

T49I+G107A;

T49L+G107A+V54I;

T49I+G107A+V54I;

A52S+V54N+T49L+G107Α;

A52S+V54I+T49L+G107A;

A52S+T49L+G107A;

A52T+T49L+G107A;

A52S+V54N+T49I+G107 A;

A52S+V54I+T49I+G107A;

A52S+T49I+G107A;

T49L+G108A;

T49I+G108A;

T49L+G108A+V54I; T49I+G108A+V54I.

Mutações gerais nas variantes da invenção

Pode ser preferível que uma variante da invenção compreenda uma ou mais modificações, além daquelas delineadas acima. Assim, pode ser vantajoso que um ou mais resíduos de prolina presentes na parte da variante de alfa-amilase que é modificada sejam substituídos por um resíduo não de prolina que possa ser qualquer um dos resíduos possíveis de não prolina de ocorrência natural, e que, preferivelmente, seja uma alanina, glicina, serina, treonina, valina ou leucina.

Analogamente, pode ser preferível que um ou mais resíduos de cisteína presentes entre os resíduos de aminoácidos com que a alfa-amilase precursora é modificada sejam substituídos por um resíduo de cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina ou leucina.

Além disso, uma variante da invenção pode - ou como a única modificação ou em combinação com qualquer uma das modificações delineadas acima - ser modificada de modo que uma ou mais Asp e/ou Glu presentes em um fragmento de aminoácido correspondente aos fragmentos de aminoácidos de 185 a 209 da SEQ ID NO: 4 sejam substituídas por uma Asn e/ou Gin, respectivamente. Igualmente de interesse é a substituição, na alfaamilase semelhante à Termamyl, de um ou mais dos resíduos de Lys presentes em um fragmento de aminoácido correspondente aos fragmentos de aminoácido de 185 a 209 da SEQ ID NO: 4, por um Arg.

Será entendido que a presente invenção engloba variantes que incorporam duas ou mais das modificações acima delineadas.

Além do mais, pode ser vantajoso introduzir mutações de ponta em qualquer uma das variantes aqui descritas.

Processos para preparar variantes de alfa-amilases

Vários processos para introduzir mutações nos genes são conhecidos na técnica. Após um breve exame da clonagem de seqüências de DNA codificando alfa-amilases, os processos para gerar mutações em sítios específicos dentro da sequência codificadora de alfa-amilases serão examinados.

Clonagem de uma seqüência de DNA codificando uma alfa-amilase

A seqüência de DNA codificando uma alfa-amilase precursora pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo que produza a alfaamilase em questão, usando vários processos bem conhecidos na técnica. Primeiro, uma biblioteca de DNA genômico e/ou de cDNA deve ser construída usando-se DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a alfa-amilase a ser estudada. Depois, se a seqüência de aminoácido da alfa-amilase for conhecida, sondas de oligonucleotídeos homólogos rotulados podem ser sintetizadas e usadas para identificar os clones codificadores da alfa-amilase a partir de uma biblioteca genômica preparada do organismo em questão. Altemativamente, uma sonda de oligonucleotídeo rotulada contendo seqüências homólogas a um gene » θ'- c conhecido de alfa-amilase, podería ser usada como uma sonda para identificar os clones codificadores da alfa-amilase, usando condições de hibridização e de lavagem de estringência inferior.

Ainda outro processo para identificar os clones codificadores da alfa-amilase deve envolver a inserção de fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, a transformação de bactérias alfa-amilase negativas com a biblioteca de DNA genômico resultante, e depois plaqueando as bactérias sobre ágar contendo um substrato para a alfa-amilase, dessa forma permitindo que os clones expressando a alfaamilase sejam identificados.

Altemativamente, a seqüência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por processos padrão estabelecidos, por exemplo, o processo de fosforoamidita descrito por S. L. Beaucage e Μ. H. Caruthers (1981) ou o processo descrito por Matthes et al. (1984), No processo de fosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sintetizador de DNA automático, purificados, recozidos, ligados e clonados em vetores apropriados.

Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origem mista genômica e sintética, de origem mista sintética e de cDNA, ou de origem mista genômica e de cDNA, preparada por fragmentos de ligação de origem sintética, genômica ou de cDNA (como seja apropriado, os fragmentos correspondentes a várias partes da seqüência de DNA inteira), de acordo com técnicas padrão. A seqüência de DNA pode também ser preparada por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando-se iniciadores específicos, por exemplo conforme descrito na U.S. 4.683.202 ou em R. K. Saiki et al. (1988). MUTAGÊNESE LOCO-DIRIGIDA

Uma vez uma seqüência de DNA codificadora da alfa-amilase tenha sido isolada, e sítios desejáveis para mutação identificados, as mutações podem ser introduzidas usando-se oligonucleotídeos sintéticos.

Estes oligonucleotídeos contêm seqüências de nucleotídeos flanqueando os sítios de mutação desejados; os nucleotídeos mutantes são inseridos durante a síntese dos oligonucleotídeos. Em um processo específico, um intervalo de filamento único de DNA, ligando a seqüência codificadora da alfa-amilase, é criado em um vetor conduzindo o gene de alfa-amilase. Então o nucleotídeo sintético, transportando a mutação desejada, e recozido em uma porção homóloga do DNA de filamento único. O intervalo remanescente é então enchido com uma DNA polimerase I (fragmento de Klenow) e a construção é ligada usando-se ligase T4. Um exemplo específico deste processo é descrito em Morinaga et al. (1984). A U.S. 4.760.025 apresenta a introdução de oligonucleotídeos codificando mutações múltiplas pela realização de alterações secundárias do cassete. No entanto, uma variedade mesmo maior de mutações pode ser introduzida a qualquer tempo pelo processo de Morinaga, porque uma multiplicidade de oligonucleotídeos, de vários comprimentos, pode ser introduzida.

Outro processo para introduzir mutações em seqüências de DNA codificando a alfa-amilase é descrito em Nelson e Long (1989). Ele envolve a geração de 3 etapas de um fragmento de PCR contendo a mutação desejada introduzida pelo uso de um filamento de DNA quimicamente sintetizado como um dos iniciadores nas reações de PCR. Do fragmento gerado por PCR, um fragmento de DNA conduzindo a mutação pode ser isolado por divagem com endonucleases de restrição e reinserido em um plasmídeo de expressão.

MUTAGÊNESE ALEATÓRIA

A mutagênese aleatória é adequadamente realizada ou como mutagênese aleatória localizada ou específica da região, em pelo menos três partes do gene transladando-se para a seqüência de aminoácidos em questão apresentada, ou dentro do gene completo.

A mutagênese aleatória de uma seqüência de DNA : $

codificando uma alfa-amilase precursora pode ser convenientemente realizada pelo uso de qualquer processo conhecido na técnica.

Em relação ao acima, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um processo para gerar uma variante de uma alfa-amilase precursora, por exemplo em que a variante apresente uma capacidade reduzida de clivar um substrato de oligo-sacarídeo perto do ponto de ramificação, e ainda apresenta especificidade melhorada do substrato e/ou atividade específica melhorada relativa à precursora, o processo:

(a) submetendo uma seqüência de DNA codificando a alfa-amilase precursora a mutagênese aleatória, (b) expressando a seqüência de DNA mutada obtida na etapa (a) em uma célula hospedeira, e (c) triando as células hospedeira que expressem uma variante de alfaamilase que tenha uma propriedade alterada (isto é, estabilidade térmica) em relação à alfa-amilase precursora.

A etapa (a) do processo da invenção acima é preferivelmente realizada usando-se iniciadores dopados. Por exemplo, a mutagênese aleatória pode ser realizada pelo uso de um agente de mutagenização física ou química adequado, mediante o uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo-se a seqüência de DNA a mutagênese gerada por PCR. Além do mais, a mutagênese aleatória pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes de mutagenização. O agente de mutagenização pode, por exemplo, ser um que induza a transições, transversões, inversões, misturas, deleções e/ou inserções.

Exemplos de um agente de mutagenização física ou química adequado para a presente finalidade incluem a irradiação ultravioleta (UV), a hidroxilamina, a N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), a hidroxilamina O-metílica, o ácido nitroso, o sulfonato de etil-metano (EMS), o bissulfito de sódio, o ácido fórmico e os análogos de nucleotídeos. Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada poro incubação da seqüência de DNA que codifica a enzima precursora a ser mutagenizada na presença do agente de mutagenização de escolha, sob condições adequadas para a mutagênese a ter lugar, e selecionando-se quanto ao DNA mutado tendo as propriedades desejadas. Quando a mutagênese é realizada pelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou bloqueado com os três nucleotídeos não precursores durante a síntese do oligonucleotídeo nas posições, as quais devessem ser trocadas. A dopagem ou bloqueio pode ser feito de modo que os códons para os aminoácidos indesejáveis sejam evitados. O oligonucleotídeo dopado ou bloqueado pode ser incorporado no DNA codificando a enzima alfa-amilase por qualquer técnica publicada, usando-se, por exemplo, PCR, LCR ou qualquer DNA polimerase e ligase como julgado apropriado. Preferivelmente a dopagem é realizada usando-se “dopagem aleatória constante”, em que o percentual de tipo selvagem e mutação em cada posição seja pré-definida. Além disso, a dopagem pode ser dirigida a uma preferência pela introdução de certos nucleotídeos, e dessa forma uma preferência pela introdução de um ou mais resíduos específicos de aminoácidos. A dopagem pode ser feita, por exemplo, de modo a permitir a introdução de 90% do tipo selvagem e 10% de mutações em cada posição. Uma consideração adicional na escolha de um esquema de dopagem se baseia na genética, bem como em constrangimentos estrutural de proteínas. O esquema de dopagem pode ser feito usando-se o programa DOPE, que, inter alia, garante que a introdução de códons de parada é evitada. Quando a mutagênese gerada por PCR é usada, ou um gene quimicamente tratado ou não tratado codificando uma alfa-amilase precursora é submetido a PCR sob condições que aumentam a má incorporação de nucleotídeos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, pp. 11a 15). Uma cepa mutadora de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), 5. cereviseae ou qualquer outro organismo microbiano,

Hi podem ser usados para a mutagênese aleatória do DNA codificando a alfaamilase mediante, por exemplo, transformação de um plasmídeo contendo a glicosilase precursora na cepa mutadora, cultivando a cepa mutadora com o plasmídeo e isolando o plasmídeo mutado da cepa mutadora. O plasmídeo 5 mutado pode ser subsequentemente mutado no organismo de expressão. A seqüência de DNA a ser mutagenizada pode estar convenientemente presente em uma biblioteca genômica ou cDNA preparada de um organismo expressando a alfa-amilase precursora. Altemativamente, a seqüência de DNA pode estar presente em um vetor adequado, tal como um plasmídeo ou 10 um bacteriófago, que, como tal, possa ser incubado com o agente mutagenizante ou de outra forma a ele exposto. O DNA a ser mutagenizado também pode estar presente em uma célula hospedeira ou sendo integrado no genoma da dita célula ou estando presente em um vetor abrigado na célula. Finalmente, o DNA a ser mutagenizado pode estar na forma isolada. Será 15 entendido que a seqüência de DNA a ser submetida a mutagênese aleatória é preferivelmente um cDNA ou uma seqüência de DNA genômico. Em alguns casos, pode ser conveniente ampliar a seqüência de DNA mutada antes de realizar a etapa b) de expressão ou a etapa c) de triagem. Tal ampliação pode ser realizada de acordo com processos conhecidos na técnica, o processo 20 presentemente preferido sendo a ampliação gerada por PCR usando-se iniciadores de oligonucleotídeos preparados à base da seqüência de DNA ou de aminoácidos da enzima precursora. Subseqüente à incubação com o agente mutagenizante, ou exposição a ele, o DNA mutado é expresso pelo cultivo de uma célula hospedeira adequada conduzindo a seqüência de DNA sob 25 condições que permitam que a expressão ocorra. A célula hospedeira usada para este fim pode ser uma que tenha sido mutada com a seqüência de DNA mutada, opcionalmente presente em um vetor, ou uma que tenha sido transportada pela seqüência de DNA codificando a enzima precursora durante o tratamento de mutagênese. Exemplos de células hospedeiras adequadas são os seguintes: bactérias Gram-positivas, tais como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus; e bactérias Gram-negativas, tais como E. coli. A seqüência de DNA mutada pode ainda compreender uma seqüência de DNA codificando funções que permitam a expressão da seqüência de DNA mutada.

MUTAGÊNESE ALEATÓRIA LOCALIZADA

A mutagênese aleatória pode ser vantajosamente localizada em uma parte da alfa-amilase precursora em questão. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso quando certas regiões da enzima tenham sido identificadas como sendo de particular importância para uma dada propriedade da enzima, e quando se espera que modificações resultem em uma variante tendo 15 propriedades melhoradas. Tais regiões podem normalmente ser identificadas quando a estrutura terciária da enzima precursora tiver sido elucidada e relacionada à função da enzima.

A mutagênese aleatória localizada ou específica da região é convenientemente realizada pelo uso de técnicas de mutagênese gerada por 20 PCR conforme descrito acima, ou outra técnica adequada conhecida na técnica. Altemativamente, a seqüência de DNA codificando a parte da seqüência de DNA a ser modificada, pode ser isolada, por exemplo, pela inserção em um vetor adequado, e dita parte pode ser subseqüentemente submetida a mutagênese mediante o uso de qualquer um dos processos de 25 mutagênese examinados acima.

PROCESSOS ALTERNATIVOS DE PROVER VARIANTES DA ALFAAMILASE

Processos alternativos para prover variantes da invenção incluem o processo de mistura dos genes conhecido na técnica, incluindo os

processos descritos, por exemplo, na WO 95/22625 (da Affymax Technologies N.V.) e na WO 96/00343 (da Novo Nordisk A/S).

EXPRESSÃO DE VARIANTES DA ALFA-AMILASE

De acordo com a invenção, uma seqüência de DNA codificando a variante produzida pelos processos descritos acima, ou por quaisquer processos alternativos conhecidos na técnica, pode ser expressa, na forma enzimática, usando-se um vetor de expressão que tipicamente inclua as seqüências de controle que codifiquem um promotor, operador, sítio de ligação ribossômica, sinal de iniciação da translação e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores.

O vetor de expressão recombinante conduzindo a seqüência de DNA codificando uma variante da alfa-amilase da invenção pode ser qualquer vetor que possa convenientemente ser submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor dependerá, com freqüência, da célula hospedeira em que ele deva ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é, um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, cuja replicação seja independente da replicação cromossômica, por exemplo um plasmídeo, um bacteriófago ou um elemento extracromossômico, um minocromossoma ou um cromossoma artificial. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, seja integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) em que ele tenha sido integrado.

No vetor, a seqüência de DNA deve ser operavelmente conectada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que apresente atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteínas ou homólogos ou heterólogos à célula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcrição da seqüência de DNA codificando uma variante da alfa-amilase da invenção, especialmente em um hospedeiro φ

bacteriano, são o promotor do óperon lac de E. coli, os promotores dagk do gene da Streptomyces coelicolor agarase, os promotores do gene da algaamilase de Bacillus licheniformis (amyL), os promotores do gene de amilase (amyM) maltogênico de Bacillus stearothermophilus, os promotores da alfaamilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQf os promotores doso genes xylA e XylB de Bacillus subtilis, etc. Para a transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene codificando a amilase TAKA de A. oryzae, a proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, a alfa-amilase neutra de A. niger, a alfa-amilase estável em ácido de A. niger, a glicoamilase de A. niger, a lipase de Rhizomucor miehei, a protease alcalina de A. oryzae, a triose fosfato isomerase de A. oryzae ou a acetamidase de A. nidulans.

O vetor de expressão da invenção pode também compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariotas, sequências de poliadenilação operavelmente conectadas à seqüência de DNA codificando a variante da alfa-amilase da invenção. As seqüências de terminação e de poliadenilação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes do promotor.

O vetor pode ainda compreender uma seqüência de DNA que permita que o vetor replique na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBl 10, pE194, pAMBl e pIJ702.

O vetor pode também compreender um marcador selecionável, por exemplo um gene cujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um que confira resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, à canamicina, ao cloramfenicol ou à tetraciclina. Além disso, o vetor pode compreender marcadores de seleção de Aspergillus, tais como amdS, argB, niaD e sC, um marcador dando origem à resistência à higromicina, ou a

seleção pode ser realizada por co-transformação, por exemplo como descrito na WO 91/17243.

Embora a expressão intracelular possa ser vantajosa em alguns pontos de vista, por exemplo, quando do uso de certas bactérias como células hospedeiras, é preferível geralmente que a expressão seja extracelular. Em geral, as alfa-amilases de Bacillus aqui mencionadas compreendem uma préregião que permita a secreção da protease expressa no meio de cultura. Se desejável, esta pré-região pode ser substituída por uma pré-região diferente ou seqüência de sinal, convenientemente realizada poro substituição das seqüências de DNA codificando as respectivas pré-regiões.

Os procedimentos usados para ligar a construção de DNA da invenção codificando uma variante de alfa-amilase, o promotor, o terminador e outros elementos, respectivamente, e para inseri-los em vetores adequados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos das pessoas versadas na técnica (conforme, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning'. A Laboratory Manual, 2~ Edição, Cold Spring Harbor, 1989).

A célula da invenção, compreendendo ou uma construção de DNA ou um vetor de expressão da invenção conforme definido acima, é vantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinante de uma variante de alfa-amilase da invenção. A célula pode ser mutada com a construção de DNA da invenção codificando a variante, convenientemente por integração da construção de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é em geral considerada ser uma vantagem à medida em que a seqüência de DNA seja mais provável de ser estavelmente mantida na célula. A integração das construções de DNA no cromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com processos convencionais, por exemplo por recombinação homóloga ou heteróloga. Altemativamente, a célula pode ser mutada com um vetor de expressão

4« conforme descrito acima em conexão com os diferentes tipos de células hospedeiras.

A célula da invenção pode ser uma célula de um organismo superior, tal como um mamífero ou um inseto, mas é preferivelmente uma 5 célula microbiana, por exemplo, uma célula bacteriana ou fungica (incluindo a levedura).

Exemplos de bactérias adequadas são as bactérias Grampositivas, tais como Bacillus subtilis, BaciUus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus 10 amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces Hvidans ou Streptomyces murinus, ou bactérias Gram-negativas, tais como E. coli. A transformação das bactérias pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplastos ou pelo uso de células competentes de uma 15 maneira por si conhecida.

O organismo de levedura pode favoravelmente ser selecionado de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, por exemplo Saccharomyces cerevisiae. O fungo fílamentoso pode vantajosamente pertencer a uma espécie de Aspergillus, por exemplo Aspergillus oryzae ou 20 Aspergillus niger. As células fungicas podem ser mutadas por um processo que envolva a formação de protoplastos e a transformação dos protoplastos seguida por regeneração da parede celular de uma maneira por si conhecida. Um procedimento adequado para transformação de células hospedeiras de Aspergillus é descrito na EP 238 023.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um processo de produzir uma variante de alfa-amilase da invenção, processo este que compreende cultivar uma célula hospedeira como descrito acima, sob condições conducentes à produção da variante, e recuperar a variante das células e/ou do meio de cultura.

O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio conveniente adequado para cultivar a célula hospedeira em questão e obter expressão da variante da alfa-amilase da invenção. Meios adequados achamse disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, como descrito nos catálogos da American Type Culture Colection).

A variante da alfa-amilase secretada das células hospedeiras pode convenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separar as células do meio mediante centrifugação ou filtração, e precipitar os componente proteináceos do meio mediante um sal, tal como sulfato de amônio, seguido pelo uso de procedimentos cromatográficos tais como a cromatografia de troca de íons, a cromatografia por afinidade, ou coisa parecida.

APLICAÇÕES INDUSTRIAIS

As variantes da alfa-amilase desta invenção possuem propriedades valiosas que possibilitam uma variedade de aplicações industriais. Em particular, as variantes da enzima da invenção são aplicáveis como um componente em lavagens, composições detergentes de lavagem de louça e de limpeza de superfícies duras. Numerosas variantes são particularmente úteis na produção de adoçantes e etanol, por exemplo combustível, bebida ou etanol industrial, de amido, e/ou para desencolamento têxtil. Condições para processos convencionais de conversão de amido, incluindo a liquefação do amido, e/ou processos de sacarifícação, são descritos, por exemplo, na U.S. 3.912.590 e nas publicações de patentes EP 252 730 e 63 909.

PRODUÇÃO DE ADOÇANTES DE AMIDO

Um processo “tradicional” para conversão de amido em xaropes de frutose normalmente consiste de três processos enzimáticos consecutivos, a saber, um processo de liquefação, seguido por um processo de sacarificação e um processo de isomerização*. Durànfè ô° processo? ° de liquefação, o amido é desintegrado em dextrinas por uma alfa-amilase (por exemplo, Termanyl®), em valores de pH entre 5,5 e 6,2, e em temperaturas de 95 a 160°C, por um período de aproximadamente 2 horas. De modo a garantir estabilidade enzimática ótima sob estas condições, 1 mM de cálcio é adicionado (40 ppm de íons de cálcio livre).

Após o processo de liquefação, as dextrinas são convertidas em dextrose mediante a adição de uma glicoamilase (por exemplo, AMG®) e uma enzima desramifícadora, tal como uma isoamilase ou uma pululanase (por exemplo, Promozyme®). Antes desta etapa, o pH é reduzido a um valor abaixo de 4,5, mantendo-se a temperatura alta (acima de 95°C), e a atividade da alfa-amilase de liquefação é desnaturada. A temperatura é reduzida a 60°C, e glicoamilase e enzima desramifícadora são adicionadas. O processo de sacarificação prossegue por 24 a 72 horas.

Após o processo de sacarificação, o pH é aumentado a um valor na faixa de 6 a 8, preferivelmente 7,5, e o cálcio é removido por troca de íons. O xarope de dextrose é então convertido em xarope de alta frutose usando-se, por exemplo, uma glicoseisomerase imobilizada (tal como Sweetzyme®).

Pelo menos um melhoramento enzimático deste processo pode ser considerado: redução da dependência de cálcio da alfa-amilase liquefaciente. A adição do cálcio livre é necessária para garantir estabilidade adequadamente elevada da alfa-amilase, mas o cálcio livre inibe intensamente a atividade da glicoisomerase e necessita ser removido, por meio de uma operação unitária dispendiosa, em uma extensão que reduza o nível de cálcio livre a menos do que 3 a 5 ppm. A economia de custos pode ser obtida se uma tal operação puder ser evitada e o processo de liquefação puder ser realizado sem a adição de íons de cálcio livre.

Para obter isso, uma alfa-amilase semelhante a Termamyl menos dependente de cálcio, que seja estável e âltafnehte⁰ ad vã'em baixas concentrações de cálcio livre (< 40 ppm), é necessária. Uma tal alfa-amilase semelhante a Termamyl deve ter um ótimo de pH em uma faixa de pH de 4,5 a 6,5, preferivelmente na faixa de 4,5 a 5,5.

A invenção também diz respeito a uma composição que compreende uma mistura de uma ou mais variantes da invenção, derivadas da alfa-amilase de B. stearothermophilus (como a alfa-amilase semelhante a Termamyl precursora) tendo a seqüências apresentada em SEQ ID NO: 8, e uma alfa-amilase semelhante a Termamyl derivada da alfa-amilase de B. licheniformis tendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 4.

Além disso, a invenção também diz respeito a uma composição que compreende uma mistura de uma ou mais variantes de acordo com a invenção, derivada da alfa-amilase de B. stearothermophilus (como a alfa-amilase semelhante a Termamyl precursora) tendo a seqüências apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma alfa-amilase híbrida compreendendo uma parte da alfa-amilase de B. amyloliquefaciens apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma parte da alfa-amilase de B. licheniformis apresentada na SEQ ID NO: 4. Esta alfa-amilase semelhante a Termamyl híbrida última mencionada compreende 445 resíduos de aminoácido C-terminais da alfa-amilase de B. licheniformis apresentada na SEQ ID NO: 4 e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens apresentada na SEQ ID NO: 6. Dita alfa-amilase híbrida por último mencionada pode estavelmente conter as seguintes mutações:

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando-se a numeração na SEQ ID NO: 4). Preferivelmente, a dita alfa-amilase híbrida por último mencionada pode adequadamente compreender as seguintes mutações H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (usando a numeração na SEQ ID NO: 4). Nos exemplos abaixo, dita alfa-amilase semelhante a Termamyl híbrida precursora por último mencionada, referida como LE429 i°o ΐ ’ .°. - ··* ^{00 0} í° i nJoiÕ^{000 0} ’ ⁰ * (apresentada na SEQ ID NO: 2), é usada para prepàraf vàriàútês dà invenção, variantes essas que podem ser usadas nas composições da invenção.

Uma variante de alfa-amilase da invenção ou uma composição da invenção podem, em um aspecto da invenção, ser usadas para liquefação 5 de amido, em composição detergente, tal como composições para lavagem de roupa suja, de lavagem de louça e limpeza de superfícies duras, produção de etanol, tal como combustível, bebidas e produção industrial de etanol, desencolamento de têxteis, tecidos e roupas.

MATERIAIS E PROCESSOS

ENZIMAS:

LEI 74: variante de alfa-amilase híbrida:

A LEI74 é uma alfa-amilase semelhante a Termamyl híbrida, sendo idêntica à seqüência de Termamyl, isto é, a alfa-amilase de Bacillus licheniformis apresentada na SEQ ID NO: 4, exceto que os 35 resíduos de 15 aminoácido N-terminais (da proteína madura) foram substituídos pelos 33 resíduos N-terminais de BAN (proteína madura), isto é, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens apresentada na SEQ ID NO: 6, que ainda tem as seguintes mutações: H156Y+A181 T+Nl 90F+A209V+Q264S (SEQ

ID NO: 4).

LE429: variante de alfa-amilase híbrida

LE429 é uma alfa-amilase semelhante a Termamyl híbrida que é idêntica à seqüência de Termamyl, isto é, a alfa-amilase de Bacillus licheniformis apresentada na SEQ ID NO: 4, exceto que os 35 resíduos de aminoácido N-terminais (da proteína madura) foi substituído pelos 33 25 resíduos N-terminais de BAN (proteína madura), isto é, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens apresentada na SEQ ID NO: 6, que ainda tem as seguintes mutações: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F (SEQ ID NO: 4). LE429 é apresentada como SEQ ID NO: 2 e foi construída por SOE-PCR (Higuchi et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 7351).

>5.ò

Dextrozyme® E: uma mistura baíanéeada⁰ de gíicóáiniluse (AMG) e pululanase obtenível de cepas selecionadas de Aspergillus niger e Bacillus deramificans (disponíveis da Novo Nordisk A/S).

FERMENTAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE VARIANTES DE ALFAAMILASE

Uma cepa de B. subtilis abrigando o plasmídeo de expressão relevante é aplicada sobre uma placa de LB-ágar com 10 micrograma/ml de canamicina do estoque a -80°C, e cultivada durante a noite a 37°C.

As colônias foram transferidas para 100 ml de meio de BPX suplementado com 10 micrograma/ml de canamicida em um frascos de agitação de 500 ml.

Composição do meio de BPX:

Fécula de batata	100 g/litro
Farinha de cevada	50 g/litro
BAN 5000 SKB	0,1 g/litro
Caseinato de sódio	10 g/litro
Farinha de feijão-soja Na2HPO4, 12 H2O Pluronic®	20 g/litro 9 g/litro 0,1 g/litro

A cultura foi agitada a 37°C a 270 rpm por 5 dias.

As células e os detritos celulares foram removidos do caldo de fermentação mediante centrifugação a 4500 rpm em 20 a 25 minutos. Mais tarde, o sobrenadante foi filtrado para se obter uma solução completamente límpida.

O filtrado é concentrado e lavado em um filtro UF (membrana de corte 10000) e o tampão é mudado para 20 mM de acetato pH 5,5. O filtrado UF é aplicado em uma S-sefarose F.F. e a eluição é realizada pela elução da etapa com 0,2 M de NaCl no mesmo tampão. O eluato é submetido à diálise contra 10 mM de Tris, pH 9,0 e aplicado em uma a Q-sefarose F.F. e >54 • õ * >' 7 t _w “ - “ » ' r* . * ’ ’ ? ^J ' . ¹ ·* ^L eluído com um gradiente linear de 0 a 0,3 M de NaCl sobre Os volumes’da coluna 6. As frações que contêm a atividade (medida pelo teste de Phadebas) são reunidas, o pH foi ajustado ao pH 7,5 e a cor remanescente foi removida pelo tratamento com 0,5 % de P/vol. de carvão ativo em 5 minutos.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE - (KNU)

Uma Unidade de alfa-amilase de um quilograma (1 KNU) é a quantidade de enzima que quebra 5,26 g de amido (Merck, Amylum Solubile, Erg. B 6, Lote 9947275) por hora no processo padrão da Novo Nordisk para a determinação da alfa-amilase com base na seguinte condição:

Substrato amido solúvel

Teor de cálcio no solvente	0,0043 M
Tempo de Reação Temperatura pH	7 a 20 minutos 37° C 5,6

A descrição detalhada do processo analítico da Novo Nordisk (AF 9) está disponível no pedido.

TESTE DA ATIVIDADE DA ALFA-AMILASE

A atividade da Alfa-Amilase é determinada por um processo que utiliza os tabletes de Phadebas como substrato. Os tabletes de Phadebas (Phadebas® Amilase Test, fornecido pela Pharmacia Diagnostic) contêm um polímero de amido de cor azul insolúvel reticulado que foi misturado com a albumina de soro bovino e uma substância de tampão e mutado em tablete.

Para cada medição simples, um tablete é colocado em suspensão em um tubo contendo 5 ml de 50 mM do tampão de BrittonRobinson (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0,1 mM de CaC12, pH ajustado ao valor de interesse com NaOH). O teste é realizado em um banho de água na temperatura de interesse. A alfa-amilase a ser testada é diluída em x ml de 50 mM do tampão de Britton-Robinson. 1 ml desta solução de alfa-amilase é adicionada aos 5 'ΊΊ ml de 50 mM de tampão de Britton-Robinson. O amidó 'éTiidrdliskàò :pela alfa-amilase que dá fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azul resultante, medida espectrofotometricamente a 620 nm, é uma função da atividade da alfa-amilase.

É importante que a absorbância medida a 620 nm após 10 ou 15 minutos de incubação (tempo de teste) está na faixa de 0,2 a 2,0 unidades de absorbância a 620 nm. Nesta faixa de absorbância existe uma linearidade entre a atividade e a absorbância (lei de Lambert-Beer), A diluição da enzima, portanto, deve ser ajustada para ajustar este critério. Sob um ajuste especificado de condições (temperatura, pH, tempo de reação, condições do tampão) 1 mg de uma dada alfa-amilase hidrolisará uma certa quantidade de substrato e uma cor azul será produzida. A intensidade da cor é medida a 620 nm. A absorbância medida é diretamente proporcional à atividade específica (atividade/mg de proteína de alfa-amilase pura) da alfa-amilase em questão sob os dados ajustes de condições.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA

A atividade específica é determinada usando-se o teste de Phadebas (Pharmacia) como a atividade/mg de enzima.

MEDIÇÃO DO PERFIL DE ATIVIDADE DO pH (estabilidade do pH)

A variante é armazenada em 20 mM de TRIS, pH 7,5, 0,1 mM, CaC12 e testada a 30° C, 50 mM de Britton-Robinson, 0,1 mM de CaC12. A atividade do pH é medida no pH 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 7,0,

8,0, 9,5, 9,5, 10 e 10,5, usando-se o teste de Phadebas descrito acima.

DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE AGU e As AGU/mg

Uma Unidade de Amiloglicosidase da Novo (AGU) é definida como a quantidade de enzima, que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto a 37° C e pH 4,3. Uma descrição detalhada do processo analítico (AEL-SM-0131) está disponível no pedido da Novo Nordisk.

* ο ο Ο ύ » Ο » Μ 0 : : : ί::::::: / :» ⁶ ;

£· ο» coo»

A atividade é determinada como AGU/ml °pòr uiri-pMcfesso modificado após (AEL-SM-0131) usar o conjunto Glucose GOD-Perid da

Boehringer Mannheim, 124036. Padrão: Padrão de AMG, lote 7-1195, 195

AGU/ml.

375 microlitros de substrato (1 % de maltose em 50 mM de acetato de sódio, pH 4,3) são incubados 5 minutos a 37° C. 25 microlitros de enzima diluída em acetato de sódio são adicionados. A reação é interrompida após 10 minutos pela adição de 100 microlitros de 0,25 M de NaOH. 20 microlitros são transferidos a uma placa microtituladora de 96 reservatórios e 200 microlitros de solução GOD-Perid são adicionados. Depois de 30 minuto em temperatura ambiente, a absorbância é medida a 650 nm e a atividade calculada em AGU/ml do padrão de AMG.

A atividade específica em AGU/mg é então calculada a partir da atividade (AGU/ml) dividida com a concentração de proteína (mg/ml). EXEMPLOS

EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DAS VARIANTES DE TERMAMYL DE ACORDO COM A INVENÇÃO

A Termamyl (alfa-amilase de B. licheniformis SEQ ID NO: 4) é expressa no B. subtilis de um plasmídeo denominado pDN1528. Este plasmídeo contém o gene completo que codifica a Termamyl, amyL, cuja expressão está direcionada por seu próprio promotor. Ainda, o plasmídeo contém a origem da replicação, ori, do plasmídeo pUBllO e o gene cat do plasmídeo pC194 que confere resistência com respeito ao cloranfenicol. O pDN1528 é mostrado na Figura 9 da WO 96/23874. Um vetor da mutagênese específico que contém a parte principal da região codificadora da SEQ ID NO: 3 foi preparado. As características importantes deste vetor, denominado pJeENl, incluem uma origem de replicação derivada dos plasmídeos de pUC, o gene cat que confere resistência com respeito ao cloranfenicol e uma versão '5/

J ο*οΰο°°° ° * contendo mudança de estrutura do gene bla, o tipo natural 'qúè/normalmáate, confere resistência com respeito a ampicilina (fenótipo ampR). Esta versão submetida a mutação resulta em um fenótipo ampS. O plasmídeo pJeENl é mostrado na Figura 10 da WO 96/23874, e origem de E. coli de replicação, ori, bla, cat, a versão 5’-truncada do gene de Termamyl amilase e os locais de restrição selecionados são indicados no plasmídeo.

As mutações são introduzidas no amyL pelo processo descrito por Deng e Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81 a 88) exceto que os plasmídeos com o “iniciador de seleção” (iniciador #6616; ver abaixo) incorporado são selecionadas com base no fenótipo ampS das células de E. coli mutadas que abrigam um plasmídeo com um gene bla reparado, em vez de utilizar a seleção pela digestão da enzima de restrição descrita por Deng and Nickoloff. Os produtos químicos e as enzimas usadas para a mutagênese foram obtidas do conjunto de mutagênese ChameleonÔ da Stratagene (número de catálogo 200509). Após a verificação da seqüência de DNA em plasmídeos variantes, o gene truncado, contendo a alteração desejada, é subclonado em pDN1528 como um fragmento de PstI-EcoRI e mutado na cepa de Bacillus subtilis esgotada em protease e amilase SHA273 (descrita na WO92/11357 e na W095/10603) a fim de expressar a enzima variante.

A variante de Termamyl V54W foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3\ da esquerda para a direita)

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG (SEQ ID NO: 9)

A variante de Termamyl A52W + V54W foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG (SEQ IDNO: 10)

Iniciador #6616 (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita;

61S

P denota a 5’ fosfato): ·’ ^: °°° ’·’

P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C (SEQ ID NO: 11)

A variante de Termamyl V54E foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3\ da esquerda para a direita)

PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG (SEQ ID NO: 12)

A variante de Termamyl V54M foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’a 3\ da esquerda para a direita):

PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG (SEQ ID NO:

13)

A variante de Termamyl V54I foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG (SEQ ID NO:

14)

As variantes de Termamyl Y29DE e Y290K foram construídas pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C (SEQ IDNO: 15)

Y representa uma mistura igual de C e de T A presença de códon que codifica o Glutamato ou a Lisina na posição 290 foi verificada pelo sequenciamento do DNA.

A variante de Termamyl N190F foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita)

PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C (SEQ ID NO: 16)

A variante de Termamyl N188P + N190F foi construída pelo «_ο ^: : ί : χ s : s ^: _β· °° uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ à3°f da° e^quêídaspara a direita):

PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC (SEQ ID NO: 17)

A variante de Termamyl H140K + H142D foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG (SEQ ID NO: 18)

A variante de Termamyl H156Y foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG (SEQ ID NO: 19)

A variante de Termamyl A181T foi construída pelo uso do 10 seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita)

PCT TCC CAA T,CC CAA GTC TTC CCT TGA AAC (SEQ ID NO: 20)

A variante de Termamyl A209V foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC (SEQ ID NO: 21)

A variante de Termamyl Q264S foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita):

PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC (SEQ ID NO: 22)

A variante de Termamyl S187D foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5” a 3 ’/°dâ° esquerda “para a direita):

PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC (SEQ ID NO: 23)

A variante de Termamyl DELTA (K370-G371-D372) (isto é anulada dos resíduos de aminoácido N°. 370, 371 e 372) foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita) PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC (SEQ ID NO: 24)

A variante de Termamyl DELTA(D372-5373-Q374) foi construída pelo uso do seguinte iniciador de mutagênese (escrito de 5’ a 3’, da esquerda para a direita)

PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C (SEQ ID NO: 25)

As variantes de Termamyl A181T e A209V foram combinadas para A181T + A209V pela digestão de A181T contendo o plasmídeo semelhante ao pDN1528 (isto é pDN1528 contendo dentro do amyL, a mutação resultante na alteração de A181T) e o plasmídeo semelhante ao pDN1528 contendo A209V (isto é pDN1528 contendo dentro do amyL, a mutação resultante da alteração de A209V) com a enzima de restrição Ciai que corta o plasmídeo semelhante ao pDN1528 duas vezes resultando em um fragmento de 1116 pares de base e a parte do vetor (isto é, contém a origem de plasmídeo de replicação) de 3850 pares de base. O fragmento contendo a mutação de A209V e a parte do vetor contendo a mutação de A161T foram purificados pelo conjunto de extração de gel QIAquick (comprado da QIAGEN) após a separação em um gel de agarose. O fragmento e os vetores foram ligados e mutados na cepa de Bacillus subtilis esgotada de protease e de amilase referida acima. O plasmídeo do amy+ (zonas de clareamento nas placas de ágar contendo amido) e os transformantes resistentes ao cloranfenicol foram analisados quanto a presença de ambas as mutações no plasmídeo. · . ^e ? ·/ ..

De uma maneira similar, como descrito acima, ο H156Y e o A209V foram combinados utilizando-se endonucleases de restrição Acc65I e EcoRI, que dão H156Y + A209V.

Ο H156Y + A209V e ο A181T + A209V foram combinados em H156Y + A181T + A209V pelo uso das endonucleases de restrição Acc65I e HindlII.

Os 35 resíduos do terminal N da parte madura da variante de Termamyl H156Y + A181T + A209V foram substituídos pelos 33 resíduos de terminal N da alfa-amilase de B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 4) (que no presente contexto é denominado BAN) por um processo SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351) como segue:

Iniciador 19364 (seqüência 5’ a 3’) : CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG (SEQ ID NO: 26)

Iniciador 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG (SEQ ID NO: 27)

Iniciador 19363 : CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC (SEQ ID NO: 28)

Iniciador 1C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC (SEQ ID NO: 29)

Uma PCR padrão, reação em cadeia da polimerase, foi realizada usando-se a polimerase termoestável Pwo da Boehringer Mannheim de acordo com as instruções do fabricante e o ciclo de temperatura: 5 minutos a 94° C, 25 ciclos de (94° C por 30 segundos, 50° C por 45 segundos, 72° C por 1 minuto), 72° C por 10 minutos.

Um fragmento de aproximadamente 130 pares de base foi amplificado em um primeira PCR indicada PCR1 com os iniciadores 19364 e 19362 em um fragmento de DNA contendo gene que codifica a alfa-amilase de B. amyloliquefaciens.

Um fragmento de aproximadamente 400 pares de base foi ” ’ í - * f a _σ amplificado em outra PCR indicada PCR2 com inicíactóres 19963 ^-10 no pDN1528 padrão.

A PCR1 e a PCR2 foram purificados a partir de um gel de agarose e usados como padrões na PCR3 com iniciadores 19364 e 1C, que resultou em um fragmento de aproximadamente 520 pares de base. Desta maneira, o fragmento contém uma parte do DNA que codifica o término N do BAN fundido a uma parte do DNA que codifica a Termamyl do 35° aminoácido.

O fragmento de 520 pares de base foi subclonado em um plasmídeo similar ao pDN1528 (contendo o gene que codifica a variante de Termamyl H156Y + A181T + A209V) pela digestão com as endo-nucleases de restrição PstI e SacII, ligação e transformação da cepa B. subtilis como previamente descrito. A seqüência de DNA entre os locais PstI e SacII foi verificada pelo sequenciamento do DNA nos plasmídeos extraídos dos transformantes resistentes de amy+ e de cloranfenicol.

A construção final contendo o término N correto de BAN e de H156Y + A181T + A209V foi indicado BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V.

O N190F foi combinado com BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V dando BAN(l-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V realizando-se a mutagênese como descrito acima, exceto que a seqüência de amyL em pJeENl foi substituído pela seqüência de DNA que codifica a variante de Termamyl BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V.

O Q264S foi combinado com o BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V que dá o BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V + Q264S realizando-se a mutagênese como descrito acima, exceto que a seqüência de amyL em pJeEN foi substituída pela seqüência de DNA que codifica a variante de Termamyl BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V

O BAN(l-35) + H156Y + A181T + A209V + Q264S e O

ΒΑΝ(1-35) + Η156Υ + Α181Τ + N190F + A209V foram combinados em BAN(l-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S que utiliza as endonucleases de restrição BsaHI (o local de BsaHI foi introduzido próximo à mutação de A209V) e PstI.

O I201F foi combinado com BAN(l-35) + H156Y + A181T +

N190F + A209V + Q264S que dá o BAN(l-35) + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + 1201F (SEQ ID NO: 2) realizando-se a mutagênese como descrito acima. O iniciador de mutagênese AM 100 foi usado, introduziu a substituição de 1201F e removeu simultaneamente um local de restrição de Cia I, que facilita o ponto de fixação fácil de mutantes.

Iniciador AM 100:

5’GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC 3’ (SEQ ID NO: 30) EXEMPLO 2

CONSTRUÇÃO DE VARIANTES DE ALFA-AMILASE SEMELHANTE À TERMAMYL COM UM PADRÃO DE CLIVAGEM ALTERADO DE ACORDO COM A INVENÇÃO

A variante da alfa-amilase de B. licheniformis termoestável que compreende os resíduos de amino ácido de terminal C da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada na SEQ ID NO: 4 e os 37 resíduos de aminoácido de terminal N da alfa-amilase derivada do B. amyloliquefaciens mostrado na SEQ ID NO: 6 e ainda que compreende as seguintes mutações:

H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + I201F (a construção desta variante é descrita no Exemplo 1 e a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2) tem uma capacidade reduzida de clivar um substrato próximo ao ponto de ramificação.

Em uma tentativa de ainda melhorar a capacidade reduzida de clivar um substrato próximo ao ponto de ramificação do dito local da variante de alfa-amilase, a mutagênese direcionada foi realizada usando-se o processo Mega-primer como descrito por Sarkar e Sommer, 1990 (BioTechniques 8:

404 a 407):

Construção de LE313: BAN/Termamyl híbrida + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + V54N:

O iniciador específico de gene 27274 e o iniciador mutagênico AM115 são usados para amplificar por PCR um fragmento de DNA de aproximadamente 440 pares de base DNA de um plasmídeo semelhante ao pDN1528 (que abrigam as mutações BAN(135) + H156Y + A181T + N190F + 1201F + A209V + Q264S no gene que codifica a amilase da SEQ ID NO: 4).

O fragmento de 440 pares de base é putrificado a partir de um gel de agarose e usado como um Mega-Iniciador junto com o Iniciador 113711 em um segunda PCR realizado no mesmo padrão.

O fragmento de aproximadamente 630 pares de base resultante é digerido com as enzimas de restrição EcoR V e Acc65 I e o fragmento de DNA de aproximadamente 370 pares de base resultante é purificado e ligado com o plasmídeo semelhante ao pDN1528 digerido com as mesmas enzimas. As células de Bacillus subtilis SHA273 competentes (amilase e protease baixa) são mutadas com a ligação e os transformantes de Cloranfenicol resistentes são checados pelo sequenciamento do DNA para verificar a presença das mutações corretas o plasmídeo.

Iniciador 27274:

5’ CATAGTTGCCGAATTCATTGGAAACTTCCC 3’ (SEQ ID NO: 31) Iniciador 1B:

5’ CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC 3’ (SEQ ID NO: 32)

Iniciador AM115:

5’ GCCAAGCGGATAACGGCTACGGTGC 3’ (SEQ ID N0: 33)

A construção de LE314: BAN/Termamyl híbrida +H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52S é realizada de uma maneira similar, exceto que iniciador mutagênico AM116 é usado.

ΑΜ116:

5’ GAACGAGCCAATCGGACGTGGGCTACGG 3’ (SEQ ID NO: 34)

A construção de LE315: BAN/Termamyl híbrida +H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+A52S+V54N é realizada de uma maneira similar, exceto que o iniciador mutagênico AM117 é usado.

AM117:

5’ GGAACGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGTGC 3’ (SEQ ID NO: 35)

A construção de LE316: BAN/Termamyl híbrida +H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+T49L é realizada de uma maneira similar, exceto que o iniciador mutagênico AM118 é usado.

AM118:

5’ GCATATAAGGGACTGAGCCAAGCGG 3’ (SEQ ID NO: 36)

A construção de LE317: BAN/Termamyl híbrida +H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+T49L+G107A é realizada de uma maneira similar, exceto que o iniciador mutagênico AM118 e o iniciador 10 mutagênico AM 119 são usados simultaneamente.

AM119:

5’ CAACCACAAAGCCGGCGCTGATGCG 3’ (SEQ ID NO: 37)

A construção de LE318: BAN/Termamyl híbrida + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + A52S + V54N + T49L + G107A é realizada de uma maneira similar, exceto que o iniciador mutagênico AM 120 e o iniciador mutagênico AM119 são usados simultaneamente.

AM120:

5’ GCATATAAGGGACTGAGCCAATCGGATAACGGCTACGGT-GC 3’ (SEQ ID NO: 38)

A construção de LE 319: BAN/Termamyl híbrida + H156Y +

A181T + N190F + A209V + Q264S + A52S + V54N + T49L é realizada de uma maneira similar, exceto que iniciador mutagênico AM 120 é usado.

A construção de LE320: BAN/Termamyl híbrida + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + G107A é realizada de uma maneira similar, exceto que iniciador mutagênico AM119 é usado.

A construção de LE322: BAN/Termamyl híbrida + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + Q51R + A52S é realizada de uma maneira similar, exceto que iniciador mutagênico AM 121 é usado.

AM121:

5’ GAACGAGCCGATCGGACGTGGGCTACGG 3’ (SEQ ID NO:39)

A construção de LE323: BAN/Termamyl híbrida + H156Y + A181T + N190F + A209V + Q264S + A52N é realizada de uma maneira similar, exceto que iniciador mutagênico AM 122 é usado.

AM 122:

5’ GAACGAGCCAAAACGACGTGGGCTACGG 3’ (SEQ ID NO: 40)

EXEMPLO 3

TESTE DAS VARIANTES DE LE 429 (SACARIFICAÇÃO)

As condições de reação padrão foram:

Concentração de substrato Temperatura pH inicial (a 60° C) Dosagem de Enzima Glicoamilase	30% p/p 60° C 5,5 0,18AGU/gDS ·'
Pululanase	0,06 PUN/g DS 9 1
Alfa-amilase	10 micro g de enzima/g DS

A DextrozymeTM E foi usada para fornecer as atividades de glicoamilase e pululanase.

Os substratos para a sacarificação foram preparados pela dissolução do amido de milho comum em água desionizada e pelo ajuste da substância seca a aproximadamente 30 % p/p. O pH foi ajustado a 5,5 (medido a 60° C) e as alíquotas do substrato correspondente a 10 g de peso

6'Υ seco foram transferidos aos frascos de vidro de tampa azul.

Os frascos foram então colocados em um banho de água de agitação equilibrado a 60° C e as enzimas adicionadas. O pH foi reajustado a

5,5 quando necessário. As amostras foram absorvidas após 48 horas de 5 sacarificação; o pH foi ajustado a cerca de 3,0 e depois aquecidas em um banho de água em ebulição por 15 minutos para inativar as enzimas. Após o esfriamento, as amostras foram tratadas com aproximadamente 0,1 g de resina trocadora de íon de leito misto (BIO-RAD 501 X8 (D)) por 30 minutos em um misturador rotativo os sais e o N solúvel. Após a filtração, a 10 composição de carboidrato foi determinada pelo HPLC. Os seguintes resultados foram obtidos:

A alfa-amilase parente para as variantes é a LE429.

Variantes de alfa-amilase adicionadas	DPi	dp2	dp3	SPEC. ACT. (NU/mg)
V54N	96,1	1,75	1,18	8200
A52S	95,9	1,80	1,11	18800
A52S+ V54N	96,3	1,84	1,08	10000
T49L	96,3	1,77	UL	12300
T49L+G107A^	96,4	1,87	/VA	13600
A52S+ V54NÍT49L+G107A,'	80,5	2,55	í 0,43	10000
A52S+ V54N+T49L '	95,8	1,76	\Q,84X	8400
G107A	94,4	1,89	1,04	19600
Q51R+A52S	95,9	1,77	1,27	16500
A52N	95,5	1,89	1,56	17600
LE174 (CONTROLE)	95,9/95,8	1,87/1,83	1,17/1,35	16000

Comparado com o controle, a presença de uma variante de alfa-amilase ativa da invenção durante a liquefação resulta em níveis de 15 panose diminuídos (DP3).

Especialmente a variante T49L+G107A de LE429 e a variante A52S+V54N+T49L de LE429, respectivamente, resulta de um nível de panose drasticamente diminuído (DP3). Se estas variantes de alfa-amilase são usadas para a liquefação do amido, não será necessário inativar a enzima 20 antes do começo da sacarificação.

EXEMPLO 4

LIQUEFACÃO E SACARIFICACÃO DAS VARIANTES DE LE429

O experimento no Exemplo 3 foi repetido para várias outras variantes de LE429 sob as mesmas condições.

O resultado é mostrado abaixo:

5	Variante/perfil do açúcar	DP1	DP2	DP3	DP4+
	T49V + G107A	95,9 %	1,72%	1,27%	1,11 %
	T49Y + G107A	95,3 %	1,73%	1,29%	1,65 %
	T49N + G107A	95,7 %	1,64%	1,51 %	1,18%
	T49L +A52S + G107A	95,7 %	1,73 %	0,95%	1,67%
10	T49L + A52T + G107A	95,8 %	1,66%	1,03%	1,48 %
	T49L + A52F + G107A	95,7 %	1,69%	1,16%	1,42%
	T49L + A52L + G107A	95,5 %	1,70%	1,40%	1,38%
	T49L + A52I +G107A	95,9 %	1,72%	1,31 %	1,07%
	T49L + A52V + G107A	94,7 %	1,69%	1,16%	2,44 %
15	T49L + A52V + G107A + Al 1IV	94,5 %	1,75%	< 0,72	2,99 %
	LE429	94,9 %	1,71 %	1,85 %	1,51 %

EXEMPLO 5

Os experimentos no Exemplo 3 foram repetidos por diversas variantes de LE429, exceto que a liquefação foi realizada a 95° C, pH 6,0 e a < 20 sacarificação a 60° C, pH 4,5, 40 ppm de CaC12, seguido pela inativação. A variante referida abaixo é a variante LE429. Os resultados observados são como segue:

Variante/perfil do açúcar	DP4+	DP3	DP2	DP1
T49F	1,15	0,92	1,83	96,12
T49D + G107A	0,84	1,03	1,82	96,3
T491+G107A z	0,97	<0,64)	1,84	96,55
T49L + G107A	0,96	0,81	1,82	96,42
T49L + A52S + G107A	1,37	/0,75''	1,88	96,01
T49L + A52T + G107A	0,87	0,81	1,8	96,52

Ó3

T49L + A52F + G107A	0,98	0,83	1,87	96,31
T49V + G107A	0,65	0,8	2,13	96,43
T49Y + G107A	0,83	0,94	1,89	96,35
LE429	1,16	1,21	1,77	95,87

REFERENCIAS CITADAS

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Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Variante de uma alfa-amilase precursora que tem a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 2, caracterizada pelo fato de que a variante compreende uma das seguintes mutações na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4:

   V54N, A52S, A52S+V54N, T49L, T49L+G107A,

   A52S+V54N+T49L+G107A, A52S+V54N+T49L, G107A, Q51R+A52S, A52N; ou T49V+G107A, T49D+G107A, T49Y+G107A, T49N+G107A, T49I+G107A, T49L+A52S+G107A, T49L+A52T+G107A,

   T49L+A52F+G107A, T49L+A52L+G107A, T49L+A52I+G107A,

   T49L+A52V+G107A; ou T49F, em que tais variantes diferem da enzima parental de SEQ ID NO: 2 apenas pelos conjuntos de mutações aqui descritos.
2. 2. Variante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem uma capacidade reduzida de clivar um substrato de oligossacarídeo perto do ponto de ramificação, em comparação com a alfaamilase precursora.
3. 3. Variante de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que ainda apresenta especificidade do substrato melhorada e/ou atividade específica melhorada em relação à alfa-amilase precursora.
4. 4. Uso de uma variante de alfa-amilase como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para liquefação de amido; em composição detergente, tal como composições para lavagem de roupa suja, lavagem de louça e limpeza de superfícies duras; na produção de etanol, tal como combustível, bebidas e produção industrial de etanol; no desencolamento de têxteis, tecidos ou roupas.

   Petição 870180062300, de 19/07/2018, pág. 6/6