CN109072213A - 蛋白酶变体及其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了可用于清洁应用和清洁方法以及多种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。一个实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含一种或多种芽孢杆菌属物种枯草杆菌蛋白酶多肽变体；以及一种或多种清洁组合物，其包含一种或多种这类变体。

Description

蛋白酶变体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求于2016年5月5日提交的美国临时专利申请序列号62/332,417的优先权权益，将该临时专利申请通过援引以其全文并入本文。

本文公开了可用于清洁应用和清洁方法以及多种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。一个实施例涉及一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其包含一种或多种芽孢杆菌属物种枯草杆菌蛋白酶多肽变体；以及一种或多种清洁组合物，其包含一种或多种这类变体。

以电子方式提交的序列表的引用

作为ASCII文本文件(名称：NB41119WOPCT_ST25；大小：62KB；创建日期：2016年5月5日)以电子方式与申请一起提交的序列表的内容形成本申请的一部分，并且通过引用以其全文并入本文。

丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(EC编号3.4.21)。丝氨酸蛋白酶包含种类繁多的具有广泛特异性和生物学功能的酶，基于这些酶的结构，这些酶进一步被划分为胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(EC编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶及其同源物是MEROPS分类方案的S8肽酶家族的成员。家族S8的成员在其氨基酸序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体。尽管已经开发了许多可用于清洁应用的变体蛋白酶，但是仍然需要改善的蛋白酶变体。

一个实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在选自12、14、15、26、37、48、53、55、56、78、101、105、120、122、133、143、155、164、165、166、169、175、184、197、198、220、238、243、248、254、255、259、264、268、272、274和275的一个、两个、三个或四个或更多个位置处的氨基酸取代；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。

另一个实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自如下的一个、两个、三个或四个或更多个氨基酸取代：(i)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、G/N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P/S197X、A198X、T220X、L/W238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、H/N268X、R272X、V274X和D175X；(ii)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P197X、A198X、T220X、L238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、N268X、R272X、V274X和D175X；或(ii)X12K、X14D、X15K、X26R、X37A、X48R、X53G/R、X55R、X56K、X78D、X101R、X105K、X120R、X122H、X133R、X143R、X155V、X164N、X165R、X166N、X169D、X175N/P/S、X184S、X197K、X198E、X220R、X238K、X243R、X248Q、X254K、X255N、X259R、X264K、X268K、X272N、X274E和X275S/K；并且其中X是任意氨基酸且该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。

又另一个实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自如下的一个、两个、三个或四个或更多个氨基酸取代：(i)Q12K、T14D、D15K、V26R、R37A、H48R、D53G/R、A55R、N56K、N78D、S101R、S105K、G/N120R、D122H、S133R、I143R、A155V、R164N、G165R、D166N、G169D、D175N/P/S、D184S、P/S197K、A198E、T220R、L/W238K、N243R、E248Q、N254K、D255N、N259R、N264K、H/N268K、R272N、V274E和D275S/K；或(ii)Q12K、T14D、D15K、V26R、R37A、H48R、D53G/R、A55R、N56K、N78D、S101R、S105K、N120R、D122H、S133R、I143R、A155V、R164N、G165R、D166N、G169D、D175N/P/S、D184S、P197K、A198E、T220R、L238K、N243R、E248Q、N254K、D255N、N259R、N264K、N268K、R272N、V274E和D275S/K；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是BspE04637-枯草杆菌蛋白酶。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序1”)。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDL XXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序2”)。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDL NVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:37)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序3”)。在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDLN VXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:38)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序4”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXXHXDLNVXGG XSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:39)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序5”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXNHXDLNVRG GXSVFTXXXXXDPXXDXXGH(SEQID NO:40)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序6”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXNHXDLNVRGG XSVFTXXXXXDPYYDXXGH(SEQ ID NO:41)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序7”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有蛋白酶活性并且/或者是分离的。

一些实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。另外的实施例涉及一种清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或本文所述的一种或多种组合物接触。

图1A-1C提供了BspE04637-T1及其变体与截短形式BspE04637的MUSCLE多序列比对；先前公开的BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶：SWT183_1430046和芽孢杆菌属物种KSM-LD1_BAD02409.1；以及以下枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的序列：解淀粉芽孢杆菌_CAA24990、迟缓芽孢杆菌_P29000、芽孢杆菌属物种SprC_AAC43580和地衣芽孢杆菌_CAJ7073。

图2提供了包括BspE04637及其变体的枯草杆菌蛋白酶的系统发生树。

除非本文另有说明，否则本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体可通过常用于分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域和工业酶使用和开发的常规技术制备和使用。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文提供的任何定义将在说明书的上下文中作为整体进行解释。除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有说明，否则核酸序列从左至右以5’至3’方向书写；并且氨基酸序列从左向右以氨基至羧基方向书写。本文使用的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在此全部明确写出一样。

如本文所使用的，关于数值，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非pH值另有具体定义。

使用以下一种或多种命名法描述本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸取代：位置或一个或多个起始氨基酸:位置:一个或多个取代的氨基酸。对仅一个位置的提及涵盖可以存在于参比枯草杆菌蛋白酶中在该位置处的任何起始氨基酸，以及此类起始氨基酸可以被其取代的任何氨基酸(即，经取代的氨基酸必须排除此类参比枯草杆菌蛋白酶的起始氨基酸)。对起始或经取代的氨基酸的提及可以进一步表示为由斜线(“/”)分开的若干个起始或经取代的氨基酸。例如，D275S/K表示位置275被丝氨酸(S)或赖氨酸(K)取代，并且P/S197K表示位置197处的起始氨基酸脯氨酸(P)或丝氨酸(S)被赖氨酸(K)取代。

术语“蛋白酶”(protease和proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的程序用于测量蛋白水解活性。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较试验来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(Sigma)C-9801)、牛胶原(西格玛公司(Sigma)C-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(Sigma)E-1625)和牛角蛋白(ICN生物医学公司(ICN Biomedical)902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如WO 99/34011和US 6,376,450)。pNA肽基测定(参见例如，Del Mar等人,Anal Biochem[分析生物化学],99:316-320,1979)还可用于确定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物例如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在410nm测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化的蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。

术语“枯草杆菌蛋白酶变体”是指与参比枯草杆菌蛋白酶不同的枯草杆菌蛋白酶，区别为一种或多种天然发生的或人造的氨基酸取代、插入或缺失。在另一个实施例中，参比枯草杆菌蛋白酶可以是天然发生的和/或重组的枯草杆菌蛋白酶。在仍另一个实施例中，该参比枯草杆菌蛋白酶是BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶。在甚至仍另外的实施例中，该参比枯草杆菌蛋白酶是BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶，其包含选自基序1、基序2、基序3、基序4、基序5、基序6和基序7的基序。枯草杆菌蛋白酶的BspE04637-进化枝在2015年10月27日提交的国际专利申请号PCT/US2015/057512中更充分地描述。在又另一个实施例中，该参比枯草杆菌蛋白酶包含与SEQ ID NO:1、28、29或34的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在仍另外一个实施例中，该参比枯草杆菌蛋白酶包含与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在仍另外一个实施例中，该参比枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:1、28、29或34的氨基酸序列。在又甚至仍另外的实施例中，该参比枯草杆菌蛋白酶是SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列。

如本文使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌(B.polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

如本文使用的，术语“突变”是指对参比氨基酸或核酸序列进行的改变。该术语旨在涵盖取代、插入和缺失。

如本文使用的，术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或靶组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、黏粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。典型地，将载体插入靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含有效地连接到合适的前导序列(例如分泌、信号肽序列等)的编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的DNA序列的载体，该载体能够在合适的宿主中实现DNA序列的表达，以及重组多肽链的折叠和易位。

如本文使用的，在将核酸序列引入细胞中的上下文中，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、轭合和转导。转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如DNA)的表达引起的细胞的遗传改变。

“表达盒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸的核酸构建体或载体(例如外源核酸或转基因)。典型地，目的核酸表达目的蛋白。典型地，表达载体或表达盒包含驱动或促进外源核酸表达的启动子核苷酸序列。典型地，表达载体或表达盒还包括其他的允许靶细胞中特定核酸转录的特定核酸元件。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一些表达载体具有在宿主细胞或宿主细胞基因组中整合并表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购的。从掺入表达载体的核酸序列中选择用于表达蛋白质的合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。

如本文使用的，当核酸与另一个核酸序列一起置于功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子有效地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以有效地连接到编码序列。典型地，“有效地连接的”DNA序列是连续的。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果此类位点不存在，则可以按照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文使用的，术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，DNA区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。

如本文使用的，当关于细胞使用时，“重组体”典型地表明细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因取代、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组DNA技术包括用于在体外生产重组DNA并且将该重组DNA转移到其可以被表达或传播的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组”(recombination和recombining)通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。

如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么称该核酸或多核苷酸“编码”该多肽。这样的核酸的反义链也被称为编码该序列。

术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含感兴趣的DNA序列的表达载体而言合适的宿主。

“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(JointCommission on Biochemical Nomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。

“前导序列”或“前导肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前导序列或前导肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表达为前酶。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。典型地，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前导肽序列的蛋白质、多肽或肽的功能形式。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到该蛋白质的氨基或羧基末端的前导序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前导序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。

关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”表示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所使用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。

如本文使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“获自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“来源于芽孢杆菌属的蛋白酶”是指具有由芽孢杆菌属天然生产的蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。

在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用以下描述的或本领域已知的序列比较或分析算法测量的。

“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。可以通过比对序列以直接比较序列信息来确定目标序列共有的氨基酸同一性百分比，例如通过使用例如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL的程序。BLAST算法描述于例如Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410(1990)以及Karlin等人，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。

如本文所使用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL来确定。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul等，“Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation ofprotein database search programs”[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序],Nucleic Acids Res[核酸研究],第1组；25(17):3389-402(1997))。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，25：3389-3402,1997以及Schaffer等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；打分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；打分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。使用该信息，可以将蛋白质序列分组和/或从中构建系统发生树。可以在例如Vector NTI Advance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining(NJ))法创建引导树(Saitou和Nei,MolBiol Evol[分子生物学与进化],4:406-425,1987)。可以使用针对序列距离的Kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序例如AlignX可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。

了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。两个实体之间最基本的关系是同源性；如果两个分子来源于共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同系物可以分为两类：旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同系物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同系物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。典型地，超家族含有若干个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于MEROPS蛋白酶分类系统，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。

CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实施例(参见Thompson等人，NucleicAcids Res[核酸研究]22:4673-4680,1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝BLOSUM系列；DNA权重矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换权重＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有5个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个相同残基×100)的百分比序列同一性。这样的变体将被与该多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。

当核酸或多核苷酸至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该核酸或多核苷酸是“分离的”。类似地，当多肽、蛋白质或肽至少部分或完全地与其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)分离时，该多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔计，在组合物中分离的种类比其他种类更丰富。例如，分离的种类可以包含存在的所有大分子种类的至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将感兴趣的种类纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)。可以分别使用本领域熟知的许多技术例如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术例如高效液相色谱法(HPLC)或类似方法来纯化物质。

术语“纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于该分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

如本文使用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，该术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。

术语“清洁活性”是指在本公开的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下由丝氨酸蛋白酶多肽或参比枯草杆菌蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶或参比枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种酶敏感性污渍(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白质引起的污渍)的各种测定来确定。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用各种色谱、分光光度计或其他定量方法来评估污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在WO 99/34011和US 6,605,458中描述的那些，以及包括在下面所提供的实例中的那些清洁性测定和方法。

术语本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的“清洁有效量”是指在特定清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，例如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。

术语“清洁辅助材料”是指除了本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体之外在清洁组合物中包含的任何液体、固体或气体物质。在一些实施例中，本公开的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。

清洁组合物和清洁制剂包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于例如液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、棒状、颗粒和/或固体衣物清洁剂或洗涤剂组合物)和精细织物洗涤剂组合物；硬表面清洁组合物和制剂，例如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔顺剂；以及纺织品、衣物增效清洁或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和衣物预去污(pre-spotter)清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelca)或其他单一剂量单位例如预先测量的粉末或液体。

除非另有说明，否则如本文使用的清洁组合物或清洁制剂包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂或单位剂量形式的通用洗涤剂，特别是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢干燥(HDD)洗涤剂类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂，包括高起泡类型的那些；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂、或餐具或桌面器具洗涤剂，包括用于家庭和机构使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是处于“紧密”形式；在一些实施例中，液体组合物是处于“浓缩”形式。

如本文使用的，“织物清洁组合物”包括手洗和机洗衣物洗涤剂组合物，其包括衣物添加剂组合物和适合用于带有污渍的织物(例如衣服、亚麻制品和其他纺织材料)的浸泡和/或预处理的组合物。

如本文使用的，“非织物清洁组合物”包括非纺织品(即非织物)表面清洁组合物，包括但不限于例如手洗或手动或自动餐具洗涤剂组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、接触镜清洁组合物、伤口清创组合物和个人清洁组合物。

如本文使用的，关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中使用的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”。在一些实施例中，本公开的洗涤剂包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。一些实施例涉及清洁组合物或洗涤剂组合物，不包含任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。

如本文使用的，术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的pH和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增亮(即变白)和/或清洁。适合于漂白的化学品的实施例包括但不限于例如ClO₂、H₂O₂、过酸、NO₂等。

如本文使用的，蛋白酶(例如，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)的“洗涤性能”是指与不添加本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体至组合物的洗涤剂相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体对洗涤提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试系统中，其他相关因素，例如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sud concentration)、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。

本文中使用的术语“相关洗涤条件”表示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

如本文使用的，术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。

本文清洁组合物的“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是处于粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为总组合物的约17％至约35％(以重量计)。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以不超过组合物(以重量计)的约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。

本文公开了可用于清洁应用和清洁方法以及多种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。本文公开了一种或多种分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用中，并且可以并入可用于清洁对其有需要的物品或表面的方法中的清洁组合物中。

一个实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在选自12、14、15、26、37、48、53、55、56、78、101、105、120、122、133、143、155、164、165、166、169、175、184、197、198、220、238、243、248、254、255、259、264、268、272、274和275的一个、两个、三个或四个或更多个位置处的氨基酸取代；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。另一个实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在选自12、14、15、26、37、48、53、55、56、78、101、105、120、122、133、143、155、164、165、166、169、175、184、197、198、220、238、243、248、254、255、259、264、268、272、274和275的一个、两个、三个或四个或更多个位置处的氨基酸取代；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号；条件是：(i)在位置120处的氨基酸取代不是G；(ii)在位置197处的氨基酸取代不是S；(iii)在位置238处的氨基酸取代不是W；(iv)在位置268处的氨基酸取代不是H；(v)所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成；和/或(vi)所述变体不由SWT183_1430046的氨基酸序列组成。

另一个实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自如下的一个、两个、三个或四个或更多个氨基酸取代：(i)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、G/N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P/S197X、A198X、T220X、L/W238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、H/N268X、R272X、V274X和D175X；(ii)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P197X、A198X、T220X、L238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、N268X、R272X、V274X和D175X；或(ii)X12K、X14D、X15K、X26R、X37A、X48R、X53G/R、X55R、X56K、X78D、X101R、X105K、X120R、X122H、X133R、X143R、X155V、X164N、X165R、X166N、X169D、X175N/P/S、X184S、X197K、X198E、X220R、X238K、X243R、X248Q、X254K、X255N、X259R、X264K、X268K、X272N、X274E和X275S/K；并且其中X是任意氨基酸且该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。仍另外的实施例提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自如下的一个、两个、三个或四个或更多个氨基酸取代：(i)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、G/N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P/S197X、A198X、T220X、L/W238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、H/N268X、R272X、V274X和D175X；(ii)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P197X、A198X、T220X、L238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、N268X、R272X、V274X和D175X；或(ii)X12K、X14D、X15K、X26R、X37A、X48R、X53G/R、X55R、X56K、X78D、X101R、X105K、X120R、X122H、X133R、X143R、X155V、X164N、X165R、X166N、X169D、X175N/P/S、X184S、X197K、X198E、X220R、X238K、X243R、X248Q、X254K、X255N、X259R、X264K、X268K、X272N、X274E和X275S/K；并且其中X是任意氨基酸且该变体的氨基酸位置通过与SEQID NO:1的氨基酸序列相对应来编号；条件是：(i)在位置120处的氨基酸取代不是G；(ii)在位置197处的氨基酸取代不是S；(iii)在位置238处的氨基酸取代不是W；(iv)在位置268处的氨基酸取代不是H；(v)所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成；和/或(vi)所述变体不由SWT183_1430046的氨基酸序列组成。

又另一个实施例提供枯草杆菌蛋白酶变体，其包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自如下的一个、两个、三个或四个或更多个氨基酸取代：(i)Q12K、T14D、D15K、V26R、R37A、H48R、D53G/R、A55R、N56K、N78D、S101R、S105K、G/N120R、D122H、S133R、I143R、A155V、R164N、G165R、D166N、G169D、D175N/P/S、D184S、P/S197K、A198E、T220R、L/W238K、N243R、E248Q、N254K、D255N、N259R、N264K、H/N268K、R272N、V274E和D275S/K；或(ii)Q12K、T14D、D15K、V26R、R37A、H48R、D53G/R、A55R、N56K、N78D、S101R、S105K、N120R、D122H、S133R、I143R、A155V、R164N、G165R、D166N、G169D、D175N/P/S、D184S、P197K、A198E、T220R、L238K、N243R、E248Q、N254K、D255N、N259R、N264K、N268K、R272N、V274E和D275S/K；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。

仍另一个的实施例涉及包含如下氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，所述氨基酸序列包含九个或更多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：

R37A-D53G-S101R-N120R-I143R-D166N-D184S-P197K-L238K-E248Q-D255N-R272N；

D15K-D53R-N56K-S105K-D122H-D166N-D184S-P197K-E248Q-D255N-V274E；

D15K-A55R-S101R-N120R-I143R-D166N-D184S-P197K-L238K-E248Q-N268K-V274E；

H48R-A55R-S101R-N120R-S133R-R164N-L238K-E248Q-D255N-N268K；Q12K-D15K-R37A-D122H-R164N-G169D-E248Q-N268K-D275S；

D15K-H48R-A55R-S101R-N120R-I143R-G165R-D175N-A198E-N243R-N254K-D275K；

Q12K-V26R-R37A-A55R-N78D-S105K-I143R-A155V-D184S-A198E-N243R-N259R-D275K；

T14D-D53R-S101R-I143R-R164N-D175S-A198E-N243R-D275K；

D15K-D53R-S101R-N120R-I143R-G165R-D175S-N243R-D255N-N264K-D275K；

Q12K-V26R-R37A-H48R-A55R-N78D-S101R-D122H-I143R-D166N-D175P-D184S-Y220R-N243R-D255N-R272N；以及其组合；并且其中该变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶的BspE04637进化枝的特征在于在位置N56之后的2个氨基酸残基插入，其中所述氨基酸位置通过与枯草杆菌蛋白酶BPN'的氨基酸序列相对应来编号。该插入发生在连接形成特征催化三联体的一部分的催化性天冬氨酸(D32)和催化性组氨酸(H66)的残基的跨度中，其中所述氨基酸位置通过与枯草杆菌蛋白酶BspE04637的氨基酸序列相对应来编号。BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶在2015年10月27日提交的PCT国际申请号PCT/US2015/057512中更充分地描述。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXX XXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序1”)。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGI XXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQID NO:36)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序2”)。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXH XDLNVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:37)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序3”)。在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDLN VXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:38)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序4”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXXHXDLNVXGG XSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:39)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序5”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXNHXDLNVRGG XSVFTXXXXXDPXXDXXGH(SEQID NO:40)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序6”)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXNHXDLNVRGG XSVFTXXXXXDPYYDXXGH(SEQ ID NO:41)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸(“基序7”)。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXX HXDLXXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGI XXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXX XXXXDXXGH(SEQ IDNO:37)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在又另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:38)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXX HXDLNVXGGXSVFXXXXXX XXXXDXXGH(SEQ ID NO:39)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXN HXDLNVRGGXSVFTXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:40)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXXDPYYDXXGH(SEQ ID NO:41)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述变体不由BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565、WP_026475840、WP_027963976、WP_012957833或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少70％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述变体不由BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565、WP_026475840、WP_027963976、WP_012957833、WP_035661169、WP_047973355或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述变体不由BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述变体不由BAD02409、WP_026690432、ADC50469、ERN55058、WP_022626565、WP_035661169、WP_047973355或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包含与SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列具有至少80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，条件是所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成。如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对例如，使用程序例如BLAST、MUSCLE、ALIGN、或CLUSTAL来确定。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶，该酶具有枯草杆菌蛋白酶活性或酪蛋白水解活性(例如，二甲基酪蛋白水解活性)。

如上文所述，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有酶活性(例如，蛋白酶活性)并且因此可用于清洁应用中，该清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。以下描述了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的示例性清洁组合物。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的酶活性(例如，蛋白酶活性)可以容易地使用本领域普通技术人员熟知的程序来确定。下面提供的实施例描述用于评估酶的活性和清洁性能的方法。可以容易地使用本领域中熟知的程序和/或通过使用在实施例中列出的程序来确定本发明的多肽酶在除去污渍(例如，蛋白质污渍例如血液/奶/墨汁、色素/奶/墨汁或蛋黄)、清洁硬表面或清洁衣物、餐具或一种或多种桌面器具物品方面的性能。

在一些实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有一种或多种改善的性质，其中改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能和改善的洗涤剂热稳定性。在其他实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有一种或多种改善的性质，其中改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能和改善的洗涤剂中的热稳定性，其中参比枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列。在一个实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体在更长的洗涤期内更稳定。在另一个实施例中，与参比枯草杆菌蛋白酶相比，本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体通过短的和冷的或长的和热的洗涤循环更稳定。在仍还另外的实施例中，所述一种或多种改善的性质是(i)改善的蛋白酶活性，其中所述变体针对N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；(ii)改善的清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM和/或调入色素的蛋黄样本清洁PI>1；和/或(iii)改善的热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1。在甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的蛋白酶活性，其中所述变体在N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物上具有PI>1。在甚至仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM和/或调入色素的蛋黄样本清洁PI>1。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的蛋白酶活性，其中所述变体在N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物上具有PI>1，并且所述PI根据实例1的蛋白酶活性测定进行测量。在另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM和/或调入色素的蛋黄样本清洁PI>1，并且所述PI根据实例1的洗涤剂测定中的清洁性能进行测量。在甚至另外的实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1，并且所述PI根据实例1的洗涤剂测定中的热稳定性进行测量。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在清洁组合物中表现出清洁性能。清洁组合物通常包括对酶的稳定性和性能有害的成分，这些成分使清洁组合物成为酶例如丝氨酸蛋白酶保留功能的恶劣环境。因此，将酶置于清洁组合物中并且期望发挥酶功能(例如丝氨酸蛋白酶活性，例如通过清洁性能表现的)是重要的。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，ADW洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁蛋黄污渍。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在衣物洗涤剂组合物中表现出清洁性能。在一些实施例中，在衣物洗涤剂组合物中的清洁性能包括清洁血液/奶/墨汁污渍。在每种清洁组合物中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在具有或不具有漂白组分情况下表现出清洁性能。

可以使本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体经历多种改变，例如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括此类改变基本上不改变该变体的酶活性的情况。类似地，本发明的核酸也可以经历多种变化，例如在一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸的一个或多个取代，这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变异、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失、序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入、和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个截短的切割。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的许多这样的变化基本上可能不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本文描述的核酸序列进行修饰以便包括一个或多个密码子，这种或这些密码子在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供了最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。

本文描述的是一种或多种分离的、非天然存在的或重组的多核苷酸，其包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列。本文所述的一种或多种核酸序列可用于本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重组生产(例如表达)中，典型地通过表达包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或其片段的序列的质粒表达载体。一个实施例提供了编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述变体是具有蛋白水解活性的成熟形式。在一些实施例中，重组表达具有同源前导肽序列的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在其他实施例中，重组表达具有异源前导肽序列(例如GG36前导肽序列)的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。

本文所述的一种或多种核酸序列可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本文所述的一种或多种多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术、例如固相合成技术来生产。在此类技术中，典型地合成高至50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进本文所述的一种或多种多核苷酸的合成，包括但不限于使用以下方法的化学合成：经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人，Tetrahedron Letters[四面体快报]22：1859-69(1981))，或Matthes等人描述的方法，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：801-805(1984)，如典型地在自动合成方法中所实践的。本文所述的一种或多种多核苷酸也可以通过使用自动DNA合成仪产生。可以从多种商业来源订购定制的核酸(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland CertifiedReagent Company)、大美国基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA 2.0)。用于合成核酸和相关原理的其他技术描述于例如，Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53：323(1984)；和Itakura等人，Science[科学]198：1056(1984))。

用于修饰核酸的重组DNA技术是本领域熟知的，例如比如限制性内切酶消化、连接、逆转录和cDNA产生、以及聚合酶链式反应(例如PCR)。本文所述的一种或多种多核苷酸还可以通过使用一个或多个寡核苷酸探针来筛选cDNA文库而获得，所述探针可以与编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸杂交或对其进行PCR扩增。用于筛选和分离cDNA克隆和PCR扩增程序的方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本文所述的一种或多种多核苷酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。适合于产生编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经修饰的本文所述的多核苷酸的多种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化、以及各种其他重组方法。

另一个实施例涉及一种或多种载体，其包含一种或多种本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体(例如，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸)；表达载体或表达盒，该表达载体或表达盒包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的、基本上纯的、或重组的DNA构建体，该构建体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的或重组的细胞，该细胞包含本文所述的一种或多种多核苷酸序列；以及组合物，该组合物包含一种或多种这样的载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物。

一些实施例涉及一种或多种重组细胞，该重组细胞包含本文所述的一种或多种载体(例如表达载体或DNA构建体)，该载体包含本文所述的一种或多种核酸或多核苷酸序列。一些这样的重组细胞使用这样的至少一种载体转化或转染，尽管其他方法在本领域中是可获得且已知的。这样的细胞典型地称为宿主细胞。一些这样的细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞。其它实施例是涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种载体是表达载体或表达盒，其包含有效地连接到有效的基因表达所需的一种或多种另外的核酸区段上(例如，有效地连接到本文所述的一种或多种多核苷酸序列的启动子)的本文所述的一种或多种多核苷酸序列。载体可以包括转录终止子和/或选择基因，例如能够通过在含有抗微生物剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的抗生素抗性基因。

表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在可替代实施例中，含有两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus[针对芽孢杆菌的分子生物学方法]，约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)(1990))；枯草芽孢杆菌的适合的复制质粒包括第92页列出的那些)。(还参见，Perego，Integrational Vectors for Genetic Manipulations inBacillus subtilis[在枯草芽孢杆菌中用于遗传操作的整合载体]，Sonenshein等人[编辑]；Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学]，American Society for Microbiology[美国微生物学会]，华盛顿(1993)，第615-624页；和p2JM103BBI)。

为了在细胞中表达和生产目的蛋白(例如，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)，包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的一种或多种拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的一种或多种表达载体在适合于变体表达的条件下被转化到细胞中。在一些实施例中，将编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列(以及包含在载体中的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中；然而在其他实施例中，包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的质粒载体在该细胞内保持为自主的染色体外元件。一些实施例明提供染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的进入的核苷酸序列。本文描述的载体可用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于能够将编码变体的多核苷酸整合到宿主染色体中并且任选地在宿主染色体中扩增的整合载体上。整合位点的实例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的转录通过如下启动子来实现，该启动子是所选参比枯草杆菌蛋白酶的野生型启动子。在一些其他实施例中，启动子与参比枯草杆菌蛋白酶是异源的，但是在宿主细胞中发挥功能。用于细菌宿主细胞的示例性的启动子的实例包括但不限于amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在革兰氏阳性细菌中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属的物种(Bacillusspp.)、链霉菌属的物种(Streptomyces spp.)、埃希氏菌属的物种(Escherichia spp.)、曲霉属的物种(Aspergillus spp.)、木霉属的物种(Trichoderma spp.)、假单胞菌属的物种(Pseudomonas spp.)、棒状杆菌属的物种(Corynebacterium spp.)、酵母属的物种(Saccharomyces spp.)和毕赤酵母属的物种(Pichia spp.)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体由芽孢杆菌属宿主细胞产生。可用于本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的生产的芽孢杆菌属宿主细胞的实施例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞被用于生产丝氨酸蛋白酶多肽。US 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的各种芽孢杆菌属宿主菌株，但是可以使用其他合适的菌株。

可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics[遗传学]73：215-228(1973)；还参见US 4,450,235；US 4,302,544；以及EP 0134048)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人，Gene[基因]19：81-87(1982)；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，165：796-804(1986)；和Wang等人，Gene[基因]69：39-47(1988))。

在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是包含以下基因中的至少一个的突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中，突变是在degU基因中，并且在一些实施例中，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]172：824-834(1990)；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]253：562-567(1997))。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主在scoC4(参见例如Caldwell等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]183：7329-7340(2001))；spoIIE(参见例如Arigoni等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]31:1407-1415(1999))；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，Perego等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]5:173-185(1991))中包含突变或缺失。实际上，预期引起与oppA基因中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本文所述的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经改变的芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已经包含上述基因中的一个或多个中的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US2005/0202535)。

使用本领域已知的任何合适的方法用编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸序列转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将这样的质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物例如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。

将本文所述的一种或多种核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的示例性方法描述于，例如，Ferrari等人，“Genetics[遗传学]”，在Hardwood等人(编辑)，Bacillus[芽孢杆菌属]，Plenum Publishing Corp.[普莱南出版公司](1989)，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，157:718-726(1984)；Hoch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，93:1925-1937(1967)；Mann等人，Current Microbiol.[现代微生物学]，13:131-135(1986)；Holubova，Folia Microbiol.[微生物学大观]，30:97(1985)；Chang等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]，168:11-115(1979)；Vorobjeva等人，FEMSMicrobiol.Lett.[FEMS微生物学快报]，7:261-263(1980)；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物学]，51:634(1986)；Fisher等人，Arch.Microbiol.[微生物学档案]139:213-217(1981)；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]130:203(1984))。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本文。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记拯救转化等方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，Contente等人，Plasmid[质粒]2：555-571(1979)；Haima等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]，223:185-191(1990)；Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，154:1077-1087(1983)；和Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，169:1205-1211(1987))。在该方法中，进入的供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。

除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本文所述的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不插入宿主基因组中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA和脂质体。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不插入质粒。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择标记(参见Stahl等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]158：411-418(1984)；以及Palmeros等人，Gene[基因]247：255-264(2000))。

在一些实施例中，将本发明的转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的特定培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。一些实施例提供了包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或本文所述的一种或多种核酸序列的培养物(例如细胞培养物)。

在一些实施例中，将用编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许该变体表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从该培养物中回收所得的变体。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的变体，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分和层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。

在一些实施例中，由重组宿主细胞生产的变体被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进该变体的纯化。包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进变体纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，Kroll等人，DNA Cell Biol.[DNA细胞生物学]12：441-53(1993))。此类纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，Protein Expr.Purif.[蛋白质表达与纯化]3：263-281[1992])；允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域。在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列例如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣迭戈市英杰公司(Invitrogen)的序列)还可用于促进纯化。

可以使用多种方法来确定宿主细胞中成熟蛋白酶(例如，本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体)的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，Maddox等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]158：1211(1983))。

一些其他实施例提供了用于制备或产生本文所述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的方法。成熟的枯草杆菌蛋白酶变体不包括信号肽或前导肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。其他实施例提供了生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，该方法包括在有利于生产该变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸。一些这样的方法进一步包括从培养物中回收变体。

另外的实施例提供了生产本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，该方法包括：(a)将包含编码该变体的核酸的重组表达载体引入细胞群体(例如细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞)中；并且(b)在有助于生产由表达载体编码的变体的条件下在培养基中培养细胞。一些这样的方法进一步包括：(c)从细胞或从培养基中分离变体。

除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参考该组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购的来源中的杂质，例如残留溶剂或副产品。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另外指明，所有百分比和比率均按重量计算。除非另外指明，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本文描述的组合物包括清洁组合物，例如洗涤剂组合物。在例示的洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表示酶水平并且除非另外说明，按总组合物的重量计表示洗涤剂成分。

在一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用中，例如比如但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)。另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，该组合物是清洁组合物。在其他实施例中，该组合物是洗涤剂组合物。在又其他实施例中，该组合物选自衣物洗涤剂组合物、自动餐具洗涤(ADW)组合物、手洗(手动)餐具洗涤剂组合物、硬表面清洁组合物、眼镜清洁组合物、和个人护理清洁组合物。在仍其他的实施例中，该组合物是衣物洗涤剂组合物、和ADW组合物、或手洗(手动)餐具洗涤剂组合物。甚至仍另外的实施例涉及织物清洁组合物，而其他实施例涉及非织物清洁组合物。在一些实施例中，该清洁组合物不含硼酸盐。在一些实施例中，该清洁组合物不含磷酸盐。在一些实施例中，该组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种赋形剂；辅助材料；和/或另外的酶。

在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物是处于选自凝胶、片剂、粉末、颗粒、固体、液体、单位剂量及其组合的形式。在一些实施例中，本文所述的清洁组合物是处于单位剂量形式。在其他实施例中，该单位剂量形式选自丸剂、片剂、胶囊、囊形片、小药囊、小袋、多隔室小袋和预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，单位剂量形式被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式描述于例如EP 2100949；WO 02102955；US4765916；US4972017；和WO04/111178。在一些实施例中，该单位剂量形式是包含在水溶性膜或小袋中的片剂或粉末。

示例性衣物洗涤剂组合物包括但不限于例如液体和粉末衣物洗涤剂组合物。示例性硬表面清洁组合物包括但不限于例如用于清洁非餐具物品、非桌面器具物品、桌子、桌面、家具物品、墙壁、地板和天花板的硬表面的组合物。示例性硬表面清洁组合物描述于，例如，USPN6610642、6376450和6376450。示例性个人护理组合物包括但不限于用于清洁假牙、牙齿、头发、接触镜和皮肤的组合物。这种口腔护理组合物的示例性组分包括在例如US6376450中描述的那些。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体对于清洁需要蛋白质污渍去除的表面有用或有效。

在一些实施例中，掺入辅助材料例如以便辅助或增强清洁性能(用于处理待清洁的基材)，或者以便改变清洁组合物的美观性(例如用香料、色素、染料等的情况)。一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述辅助材料选自：漂白催化剂、另外的酶、酶稳定系统、螯合剂、光亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填充剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂、抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素、和pH控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、黏土污垢去除/抗再沉积剂、结构增弹剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、色素及其组合。示例性辅助材料和使用水平的合适实例可以在USPN 5576282；6306812；6326348；6610642；6605458；5705464；5710115；5698504；5695679；5686014和5646101中找到。在一种或多种清洁辅助材料与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体不相容的实施例中，使用将辅助材料和一种或多种变体保持分离(即彼此不接触)的方法，直到两种组分的组合合适为止。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂、物理分离等)。

一些实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁添加剂产品。在一些实施例中，该添加剂被包封于剂型中用于添加至清洁过程中。在一些实施例中，添加剂被包封在用于添加至清洁过程中的剂型中，在该清洁过程中使用过氧化物来源并且增加的漂白效果是希望的。

用于颗粒组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐；滑石；和黏土。用于液体组合物的示例性填料或载体包括但不限于，例如水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二元醇(例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇)。在一些实施例中，组合物包含从约5％至约90％的此类填料或载体。在此类组合物中可包含酸性填料以降低清洁方法或应用中所得溶液的pH。

在一个实施例中，本文描述的一种或多种清洁组合物包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体是单独的或与一种或多种另外的酶组合的。通常，清洁组合物包含一种或多种蛋白酶的至少约0.0001至约20wt％、从约0.0001至约10wt％、从约0.0001至约1wt％、从约0.001至约1wt％、或从约0.01至约0.1wt％。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含从约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约2mg、约0.01至约1mg、约0.5至约10mg、约0.5至约5mg、约0.5至约4mg、约0.5至约4mg、约0.5至约3mg、约0.5至约2mg、约0.5至约1mg、约0.1至约10mg、约0.1至约5mg、约0.1至约4mg、约0.1至约3mg、约0.1至约2mg、约0.1至约2mg、约0.1至约1mg、或约0.1至约0.5mg的一种或多种蛋白酶/克组合物。

典型地配制本文的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5的pH。液体产品制剂典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的pH。颗粒洗衣产品典型地被配制成具有从约9至约11的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有碱性pH，例如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的pH。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有中性pH，例如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的pH。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃下以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性pH条件，使用常规pH计进行测量。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。

在一些实施方案中，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包封以在储存期间保护其免于组合物中的其他组分和/或在清洁期间控制变体的可用性。在一些实施例中，包封增强了变体和/或另外的酶的性能。在一些实施例中，该包封材料典型地包封本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体的至少一部分。典型地，包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(Tg)。示例性包封材料包括但不限于：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些实施例中，包封材料是淀粉(参见例如EP0922499、US4,977,252、US 5,354,559、和US 5,935,826)。在一些实施例中，包封材料是由塑料(例如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球。示例性商业微球包括但不限于(阿克苏诺贝尔化学国际公司(Akzo NobelChemicals International,B.V.))；PM6545、PM6550、PM7220、PM7228和(Sphere One公司)；和 和(波特工业有限责任公司(Potters Industries LLC))。

存在各种洗涤条件，包括本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体所暴露的不同的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。低洗涤剂浓度系统涉及含有少于约800ppm洗涤剂组分的洗涤水。中等洗涤剂浓缩系统涉及含有约800ppm至约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤水。高洗涤剂浓度系统涉及含有大于约2000ppm洗涤剂组分的洗涤水。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约40℃、从约20℃至约30℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合、或10℃至40℃的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。

不同的地理位置具有不同的水硬度。硬度是水中钙(Ca²⁺)和镁(Mg²⁺)的量的量度。通常按照颗粒/加仑(gpg)混合的Ca²⁺/Mg²⁺来描述水硬度。在美国，大部分水都是硬水，但是硬度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(将ppm转化为颗粒/美国加仑是将ppm除以17.1)的硬度矿物。

水	颗粒/加仑	百万分率
			软	小于1.0	小于17
略硬	1.0至3.5	17至60
			中等硬	3.5至7.0	60至120
硬	7.0至10.5	120至180
			非常硬	大于10.5	大于180

其他实施例涉及一种或多种清洁组合物，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.999％至约90.0％的一种或多种辅助材料。在另一个实施例中，该清洁组合物包含按组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％的一种或多种辅助材料。

在其他实施例中，本文所述的组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的酶。该一种或多种另外的酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-β-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、和木糖苷酶、或其任何组合和混合物。一些实施例涉及包含常规酶(如淀粉酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶)的酶的组合(即“混合物”)，所述酶的组合与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和/或一种或多种另外的蛋白酶结合。

在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的蛋白酶。在一个实施例中，另外的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施例中，另外的蛋白酶是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。适合的另外的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。在一些实施例中，另外的蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他实施例中，另外的蛋白酶是化学或遗传修饰的突变体。在另一个实施例中，另外的蛋白酶是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。示例性碱性蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。示例性另外的蛋白酶包括但不限于描述于以下中的那些：WO95/23221、WO92/21760、WO2008010925、WO20100566356、WO2011072099、WO201113022、WO2011140364、WO2012151534、WO2015038792、WO2015089441、WO2015089447、WO2015143360、WO2016001449、WO2016001450、WO2016061438、WO2016069544,WO2016069548、WO2016069552、WO2016069557、WO2016069563、WO2016069569、WO2016087617、WO2016087619、WO2016145428、WO2016174234、WO2016183509、WO2016202835、WO2016205755、US 2008/0090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE 34,606、US 5,955,340、US 5,700,676、US 6,312,936、US 6,482,628、Us8530219、美国临时申请号62/331282、62/343618、62/351649、62/437171、62/437174和62/437509、以及PCT申请号PCT/CN2017/076749，以及描述于以下文献中的金属蛋白酶：WO 2007/044993、WO 2009/058303、WO 2009/058661、WO2014/071410、WO 2014/194032、WO 2014/194034、WO 2014/194054和WO 2014/194117。示例性另外的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和在WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、 OXP、PREFERENZ^TM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZ^TM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZ^TM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFAST(美国丹尼斯科公司)；ULTRA、16L、ULTRA、 PRIMASE、DURAZYM、 PROGRESS和(诺维信公司)；BLAP^TM和BLAP^TM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGY^TM PRO104L(BASF)、和KAP(嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶(花王公司)。

另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种脂肪酶的组合物。在一些实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于例如细菌或真菌来源的那些，例如像绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)脂肪酶(参见例如EP258068、和EP 305216)、疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)脂肪酶(参见例如WO2014/059360和WO2015/010009)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(参见例如EP238023)、假丝酵母属脂肪酶例如南极洲假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶A或B)(参见例如EP 214761)、假单胞菌属脂肪酶例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，EP218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(参见例如，EP331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(参见例如，GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，JP 64/744992)、和短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，WO 91/16422))。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见Yamaguchi等人，Gene[基因]103:61-67(1991))；白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见Schimada等人，J.Biochem.[生物化学杂志],106:383-388(1989))；以及各种根霉属脂肪酶例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(参见Hass等人，Gene[基因]109:117-113(1991))；雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等人，Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719(1992))和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。其他脂解酶如角质酶也可用于本文所述的一种或多种组合物中，包括但不限于例如衍生自门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)和/或豌豆根腐镰孢菌(Fusarium solani pisi)(参见WO 90/09446)。示例性商业脂肪酶包括但不限于M1LIPASE、LUMA FAST和LIPOMAX(杰能科公司)；和ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE P(天野药业有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd))。

仍另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种淀粉酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包含在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的淀粉酶，例如比如如下描述的淀粉酶：GB 1,296,839、WO91/00353、WO94/02597、WO94/183314、WO95/10603、WO95/26397、WO95/35382、WO 96/05295、WO96/23873、WO96/23874、WO96/30481、WO97/10342、WO97/41213、WO97/43424、WO 98/13481、WO98/26078、WO99/02702、WO99/09183、WO99/19467、WO99/23211、WO99/29876、WO99/42567、WO99/43793、WO99/43794、WO99/46399、WO00/29560、WO00/60058、WO00/60059、WO00/60060、WO01/14532、WO01/34784、WO01/64852、WO01/66712、WO01/88107、WO01/96537、WO02/092797、WO02/10355、WO02/31124、WO2004055178、WO2004113551、WO2005001064、WO2005003311、WO2005018336、WO2005019443、WO2005066338、WO2006002643、WO2006012899、WO2006012902、WO2006031554、WO2006063594、WO2006066594、WO2006066596、WO2006136161、WO2008000825、WO2008088493、WO2008092919、WO2008101894、WO2008112459、WO2009061380、WO2009061381、WO2009100102、WO2009140504、WO2009149419、WO2010059413、WO2010088447、WO2010091221、WO2010104675、WO2010115021、WO2010115028、WO2010117511、WO2011076123、WO2011076897、WO2011080352、WO2011080353、WO2011080354、WO2011082425、WO2011082429、WO2011087836、WO2011098531、WO2013063460、WO2013184577、WO2014099523、WO2014164777、和WO2015077126。示例性商业淀粉酶包括但不限于AMPLIFYBAN ULTRA、PLUS、ULTRA和(诺维信公司)；EFFECTENZ^TMS 1000、PREFERENZ^TM S 100、PREFERENZ^TM S 110、EXCELLENZ^TM S 2000、和P(美国丹尼斯科公司)。

仍又另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种纤维素酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。任何合适的纤维素酶可以用于本文所述的组合物中。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌或真菌起源的那些纤维素酶，例如像描述于WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307；EP 0495257；和美国临时申请号62/296,678和62/435340。示例性商业纤维素酶包括但不限于，PREMIUM、和(诺维信公司)；100、200/220和2000(美国丹尼斯科公司)；以及KAC-500(B)(花王公司)。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分被缺失(参见例如US 5,874,276)。

甚至仍另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种甘露聚糖酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％或约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。示例性甘露聚糖酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性甘露聚糖酶包括但不限于：细菌或真菌来源的那些，例如像WO2016007929；USPN6566114、6602842、和6440991；以及国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所述的。示例性商业甘露聚糖酶包括但不限于(诺维信公司)和EFFECTENZ^TM M 1000、M 100、和PURABRITE(美国丹尼斯科公司)。

又甚至仍另外的实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种过氧化物酶和/或氧化酶的组合物。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的过氧化物酶或氧化酶。过氧化物酶可以与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用，并且氧化酶可以与氧气组合使用。将单独的或与增效剂组合的过氧化物酶和氧化酶用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)(参见例如WO 94/12621和WO 95/01426)。示例性过氧化物酶和/或氧化酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。

另一个实施例涉及包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种过水解酶的组合物，例如比如描述于WO 2005056782、WO 2007106293、WO 2008063400、WO2008106214和WO 2008106215中的过水解酶。

在又另一个实施例中，本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体以及在本文所述的一种或多种组合物中包含的一种或多种另外的酶可以各自独立地变动至约10％，其中该清洁组合物的余量为一种或多种辅助材料。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物可用作洗涤剂添加剂，其中所述添加剂为固体或液体形式。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400g/升至约1200g/升，而在其他实施例中，其范围为在20℃下测量的500g/升至约950g/升的组合物。

一些实施例涉及衣物洗涤剂组合物，其包含一种或多种本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自如下的辅助材料：表面活性剂、助洗剂化合物、聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮剂、抗再沉积剂、腐蚀抑制剂及其组合的。在一些实施例中，该洗衣组合物还含有柔顺剂。

另外的实施例涉及手动餐具洗涤组合物，其包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自如下的辅助材料：表面活性剂、有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。

其它实施例涉及本文所述的一种或多种组合物，其中所述组合物是用于有色织物洗涤的压缩颗粒状织物清洁组合物或通过洗涤容量提供软化，或者是重垢液体(HDL)织物清洁组合物。示例性织物清洁组合物和/或制备方法描述于USPN 6,610,642和6,376,450中。其他示例性清洁组合物描述于例如USPN 6,605,458；6294514；5,929,022；5,879,584；5,691,297；5,565,145；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303；4,968,451；4,597,898；4,561,998；4,550,862；4,537,706；4,515,707；和4,515,705。

在一些实施例中，该清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，例如甘氨酸-N,N-二乙酸或具有通式MOOC-CHR-N(CH₂COOM)₂(其中R是C_1-12烷基并且M是碱金属)的衍生物。在一些实施例中，氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、羧基甲基菊粉及其盐及其衍生物、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺基甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺基乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺基甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺基乙基)谷氨酸(SEGL)、IDS(亚氨基二乙酸)及其盐及其衍生物例如N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺基甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、以及碱金属盐及其衍生物。在一些实施例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400μ至约1200μ，并且体积密度为至少550g/L。在一些实施例中，酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。

在一些实施例中，酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有高至15个碳，特别是高至10个碳，例如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，该酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。也已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。

另外的实施例涉及清洁组合物，其包含一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中该表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在可替代的实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又另外的实施例中，该水平为从约5％至约40％，以清洁组合物的重量计。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在一个实施例中，该组合物包含按组合物重量计从约1％、从约0.1％至约80％、从约3％至约60％、从约5％至约40％、从约10％至约50％的助洗剂。示例性助洗剂包括但不限于多磷酸盐的碱金属盐、铵盐和烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；多元羧酸盐化合物；醚羟基多羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的铵盐和取代的铵盐，例如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；多羧酸盐，例如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸；及其可溶性盐。在一些此类组合物中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，例如柠檬酸盐和多磷酸盐，例如三聚磷酸钠、三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾。示例性助洗剂描述于，例如EP 2100949。在一些实施例中，助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂是非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，助洗剂包括磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。示例性磷酸盐助洗剂包括但不限于单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(STPP)。另外，组合物可以包含碳酸盐和/或柠檬酸盐。其他适合的非磷酸盐助洗剂包括多元羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。适合的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在某些情况下被不超过两个碳原子分离。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种螯合剂。在一个实施例中，该组合物包含以组合物重量计从约0.1％至约15％或约3％至约10％的螯合剂。示例性螯合剂包括但不限于例如铜、铁、锰及其混合物。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种沉积助剂。示例性沉积助剂包括但不限于例如聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；去污聚合物，例如比如聚对苯二甲酸；黏土，例如比如高岭石、蒙脱石、硅镁土、伊利石、膨润土和多水高岭土；以及它们的混合物。

在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种抗再沉积剂或非离子表面活性剂(其可以防止污垢的再沉积)(参见，例如，EP 2100949)。例如，在ADW组合物中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(特别是用于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止污垢的再沉积。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂、环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。示例性聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯咪唑及其混合物。在一个实施例中，该组合物包含以组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种硅酸盐。示例性包括但不限于硅酸钠，例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐。在一些实施例中，硅酸盐以按该组合物的重量计从约1％至约20％或约5％至约15％的水平存在。

在一些仍另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种分散剂。示例性水溶性有机材料包括但不限于例如均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。

在一些另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种酶稳定剂。在一些实施例中，酶稳定剂是钙和/或镁离子的水溶性来源。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐。在一些实施例中，本文使用的酶通过存在于为这些酶提供以下这样的离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)以及氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于一些实施例中。示例性寡糖和多糖(例如糊精)描述于例如WO 07/145964中。在一些实施例中，还可使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛。在一些实施例中，组合物包含至少一种选自钙和锌的离子。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种漂白剂、漂白活化剂、和/或漂白催化剂。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。示例性无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体，没有另外的保护，但是在一些其他实施例中，该盐被包被。漂白活化剂通常为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。示例性漂白活化剂包括在过水解条件下给出具有从约1至约10个碳原子或从约2至约4个碳原子的脂肪族过氧羧酸的化合物、和/或任选地取代的过氧苯甲酸。示例性的漂白活化剂描述于例如EP 2100949中。示例性漂白催化剂包括但不限于锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的示例性漂白催化剂描述于例如US 4,246,612；US 5,227,084；US 4,810,410；WO 99/06521；和EP 2100949。

在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，金属漂白催化剂包含一种催化体系，该催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如US 4,430,243)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物用锰化合物来催化。此类化合物和使用水平描述于例如US 5,576,282中。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于并包含于本文所述的一种或多种组合物中。各种钴漂白催化剂描述于例如USPN 5,597,936和5,595,967中。

在一些另外的实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为实际问题而并非通过限制，在一些实施例中，对本文所述的组合物和清洁方法进行调节以提供至少一亿分之一数量级的，在洗涤液中约0.005ppm至约25ppm、约0.05ppm至约10ppm、或约0.1ppm至约5ppm的活性MRL。示例性MRL包括但不限于形成交联桥接的特殊超刚性配体，例如比如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环(6.6.2)十六烷。示例性金属MRL描述于例如WO 2000/32601和US 6,225,464中。

在另一个实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含一种或多种金属护理剂。在一些实施例中，组合物包含按该组合物的重量计从约0.1％至约5％的金属护理剂。示例性金属护理剂包括例如铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)。其他示例性金属护理剂描述于例如EP2100949、WO 94/26860和WO 94/26859中。在一些组合物中，金属护理剂是锌盐。

在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度液体(HDL)组合物。HDL液体衣物洗涤剂可以包含清洁表面活性剂(10％-40％)，该清洁表面活性剂包含：阴离子清洁表面活性剂，其选自以下组：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物；以及任选地非离子表面活性剂，其选自以下组：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C₈-C₁₈烷基乙氧基化醇和/或C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物，任选地其中阴离子清洁表面活性剂(亲水指数(HIc)为从6.0至9)与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。

该组合物可以任选地包含由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，该两亲烷氧基化油脂清洁聚合物选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内)和/或典型地包含含有选自下组的单体的亲水主链的无规接枝聚合物：不饱和的C₁-C₆羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(例如甘油)及其混合物；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自下组：C₄-C₂₅烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C₂-C₆单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C₁-C₆烷基酯及其混合物。

该组合物可以包含另外的聚合物，例如去污聚合物，该去污聚合物包含例如阴离子封端的聚酯，例如SRP1；处于无规或嵌段构型的、含有至少一种单体单元的聚合物，该单体单元选自糖类、二羧酸、多元醇及其组合；处于无规或嵌段构型的、基于对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物及其共聚物，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6；Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325；Marloquest SL；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括例如羧酸盐聚合物，例如包含至少一种选自以下的单体的聚合物：丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或具有在500至100,000Da范围的分子量的聚乙二醇)；纤维素聚合物(包括例如烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧基烷基纤维素；烷基羧基烷基纤维素，其实施例包括羧基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧基甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合羧酸酯(例如，像马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

该组合物可以进一步包含饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C₁₂-C₂₄脂肪酸(0wt％至10wt％)；处于无规或嵌段构型的沉积助剂(包括例如多糖、纤维素聚合物、聚二烯丙基二甲基卤化铵(DADMAC))、以及DADMAC与乙烯基吡咯烷酮的共聚物、丙烯酰胺、咪唑、卤化咪唑啉及其混合物；阳离子瓜尔胶；阳离子纤维素，例如阳离子羟基乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺；以及它们的混合物。

该组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)；二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)；羟基乙烷二膦酸(HEDP)；乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)；甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；二乙撑三胺五乙酸(DTPA)；丙二胺四乙酸(PDTA)；2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)；或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)；谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)；次氮基三乙酸(NTA)；4,5-二羟基间苯二磺酸；柠檬酸及其任何盐；N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)及其衍生物。

组合物可以包含酶稳定剂(其实例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸)。

该组合物可以进一步包含硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％)，选自下组：甘油二酸酯、甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物。

适合的清洁表面活性剂还包括阳离子清洁型表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。

在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度粉末(HDD)组合物。该HDD粉末衣物洗涤剂可以包括清洁表面活性剂，其包括阴离子清洁表面活性剂(选自直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子清洁表面活性剂(选自直链或支链或无规链、取代或未取代的C₈-C₁₈烷基乙氧基化物和/或C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子清洁表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性清洁表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂，例如沸石助洗剂，其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)；磷酸盐助洗剂，例如在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠；在小于15wt％范围内的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐；硅酸盐(在0wt％至小于10wt％范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠)或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(在0wt％至小于10wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(光漂白剂，例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水漂白活化剂(例如，十二烷酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、和壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐(nitrile quats)、及其混合物)；过氧化氢；过氧化氢源(无机过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预成型的亲水和/或疏水性过酸(选自过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚胺酸和盐、过氧单硫酸和盐及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂，例如亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)、含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(例如锌或铝)和螯合剂(例如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、及其水溶性盐))。

组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增亮剂(例如C.I.荧光增亮剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

在一些实施例中，清洁组合物是包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的ADW洗涤剂组合物。该ADW洗涤剂组合物可以包含两种或更多种非离子表面活性剂选自：乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇和胺氧化物表面活性剂，它们以0至10％(以重量计)的量存在；在5％-60％范围内的助洗剂，该助洗剂包括：磷酸盐助洗剂(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚磷酸盐)，三聚磷酸钠-STPP或无磷酸盐助洗剂(基于氨基酸的化合物，例如MGDA(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物、GLDA(谷氨酸-N,N-二乙酸)及其盐和衍生物、IDS(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、和B-丙氨酸二乙酸(B-ADA)及其盐)，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5％至50％(以重量计)的范围内；磺化/羧化聚合物(为产品提供尺寸稳定性)，其在约0.1％至约50％(以重量计)的范围内；在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内的干燥助剂(选自聚酯，特别是任选地与有助于缩聚作用的具有3至6个官能团(特别是酸、醇或酯官能团)的另外的单体一起的阴离子聚酯，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其反应性环状碳酸酯和尿素型的前体化合物)；在约1％至约20％(以重量计)的范围内的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过氧水合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂-有机过酸前体，其在约0.1％至约10％(以重量计)的范围内；漂白催化剂(选自锰三氮杂环壬烷及相关络合物、Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在约0.1％至5％(以重量计)的范围内的金属护理剂(选自苯并三氮唑、金属盐和络合物、和硅酸盐)；每克ADW洗涤剂组合物的在约0.01mg至5.0mg范围内的活性酶的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、过水解酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。

在一些实施例中，组合物包含至少一种选自钙和锌的离子；至少一种稳定剂；从约0.001％至约1.0重量％的所述变体；至少一种漂白剂；至少一种辅助成分；和/或一种或多种选自下组的另外的酶或酶衍生物：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-β-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、及其组合。

更多实施例涉及使用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，US 6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的本文所述变体接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。

可以在纺织品的编织期间或之后、在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在纺织品的编织期间，使线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，常常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织期间或之后应用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以除去上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用该变体来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为清洁剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，织物可被裁剪和缝制成服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。丝氨酸蛋白酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服装(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整加工方法。

本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从动物中去除蛋白质及其随后的降解或处置，例如羽毛、皮肤、毛发和兽皮。在一些情况下，与在滚烫的水或去毛工艺中的传统浸泡相比，将动物尸体浸泡在包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的溶液中可以起到保护皮肤免受损伤的作用。在一个实施例中，羽毛可以在适合于消化或引发羽毛退化的条件下用本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体进行喷雾。在一些实施例中，该变体可以与氧化剂组合使用。

在一些实施例中，可以通过本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来辅助与未加工的羽毛相关的油或脂肪的去除。在一些实施例中，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在用于清洁羽毛的组合物中使用，并且用来对纤维进行消毒和部分脱水。在又其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于从羽毛中回收蛋白质。在一些其他实施例中，在具有或没有约0.5％(v/v)的表面活性剂的情况下，将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与95％乙醇或其他极性有机溶剂组合应用于洗涤溶液中。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与合适的羽毛加工和蛋白水解方法(例如在PCT/EP2013/065362、PCT/EP2013/065363和PCT/EP2013/065364中公开的那些组合使用。在一些实施例中，回收的蛋白质随后可以用于动物或鱼类饲料中。

在仍另一个实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用作动物饲料组合物、动物饲料添加剂和/或宠物食品的组分，其包含本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。其他的实施例涉及制备这样的动物饲料组合物、动物饲料添加剂组合物和/或宠物食品的方法，该方法包括将本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体与一种或多种动物饲料成分和/或动物饲料添加剂成分和/或宠物食品成分进行混合。

术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体实施例中，该动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于：猪(pig和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、小鸡、肉仔鸡、蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类，例如虾和对虾。在另外的实施例中，动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”和“喂养料”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers Dried Grain Solubles)(DDGS)(特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获自以下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获自植物和动物来源的油和脂肪；以及e)矿物质和维生素。

本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于纸浆(例如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。

在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，该纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。

实例1

测定

性能指数

酶的性能指数(PI)比较了在相同蛋白质浓度下，变体(测量值)与亲本酶(理论值或测量值)的性能。可以使用从亲本酶标准曲线的Langmuir拟合提取的参数计算亲本酶的理论浓度。PI大于1(PI>1)表明与亲本或基准蛋白酶(针对每个分析的数据集定义的)相比，变体的性能得到改善，而PI为1(PI＝1)鉴定为变体与其亲本具有相同的性能，PI小于1(PI<1)鉴定为变体的性能不如其亲本。

蛋白质测定分析

用安捷伦U-HPLC系统进行从培养上清液中获得的BspE04637-T1亲本蛋白酶(SEQID NO:1)和BspE04637变体的蛋白质浓度测定。产生使用纯化的BspE04637-T1蛋白的校准曲线(0-500ppm)并用于产生标准曲线。将澄清的培养物上清液的等分试样在稀释缓冲液(Tris 25mM，pH 7.4，5mM CaCl₂)中稀释10倍，然后以1:1的比例与含有乙腈的缓冲液(22.5mM Tris，pH 7.4，4.5mM CaCl₂，9％乙腈)混合。将这些样品在45μm滤板上过滤，并将滤液通过自动进样器加载到反相柱(Zorbax 300SB-C3柱)上。使用缓冲液A(0.1％三氟乙酸)和缓冲液B(0.07％乙腈)的线性洗脱梯度。在1mL/min的流速下，运行时间为4分钟，运行后柱子平衡为1分钟。在220nm处测量吸光度，并使用ChemStation软件(安捷伦科技公司)对峰进行积分。基于纯化的BspE04637-T1亲本酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。

蛋白酶活性测定

通过测量N-suc-AAPF-pNA、二甲基酪蛋白(DMC)的水解来测试BspE04637-T1亲本蛋白酶(SEQ ID NO:1)和其变体的蛋白酶活性。

对于AAPF测定，使用的试剂溶液是：100mM Tris pH 8.6，10mM CalCl₂，0.005％-80(Tris/Ca缓冲液)和在DMSO中的160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA原液)(西格玛：S-7388)。为了制备工作溶液，将1mL suc-AAPF-pNA原液添加到100mL Tris/Ca缓冲液中并混合。将酶样品添加到含有1mg/mL suc-AAPF-pNA工作溶液的微量滴定板(MTP)中，并且使用SpectraMax板读数器以动力学方式在室温下经3分钟内在405nm下测量活性。将蛋白酶活性表达为mOD/min。

对于DMC测定，所使用的试剂溶液是：在100mM碳酸钠(pH 9.5)中的2.5％二甲基酪蛋白(DMC，西格玛)、在试剂A中的0.075％TNBSA(2,4,6-三硝基苯磺酸，赛默科技公司(Thermo Scientific))。试剂A：在15mL 4N NaOH中的45.4g Na₂B₄O₇.10H₂O(默克公司(Merck))，在MQ水中达到1000mL的终体积，稀释溶液：10mM NaCl、0.1mM CaCl₂、0.005％Tween-80和0.02％叠氮化钠。加入2.5uL 20ppm蛋白酶上清液后，用47.5uL DMC底物填充MTP。然后添加50μL在试剂A中的TNBSA，同时缓慢混合。使用SpectraMax酶标仪以动力学方式在室温下经5min在405nm下测量活性。如上针对AAPF测定所述，活性以mOD/min表示。

评估洗涤剂组合物

在具有表1.1和1.2中列出的组合物的定制液体洗涤剂制剂(“测试HDL1和测试HDL2”)中测试蛋白酶的清洁性能和/或稳定性。对于HDL洗涤剂，测试HDL1和测试HDL2被认为是无硼的，因为当测试元素硼含量时，它们含有≤5mg/Kg的硼。

洗涤剂清洁性能

在各种微样品上测试变体相对于BspE04637-T1亲本蛋白酶的清洁性能：BMI(棉布上的血液/奶/墨水，EMPA-116)、调入色素的蛋黄(通过加热熟化的，CFT CS-38)和POM(色素/油/奶，CFT-C10)。预先冲穿(以放入MTP)的、经冲洗的和填充的含样品的板(康宁(Corning)3641)由荷兰符拉尔丁根(Vlaardingen)的测试材料BV中心(Center forTestmaterials BV)制备。如表1.3所述给予洗涤剂，并在添加酶之前将其添加至MTP中。

将酶的等分试样添加到洗涤剂填充的MTP中，以达到洗涤中200uL的最终体积和1.25ppm的最终酶浓度。衣物清洁测定在25℃下进行。当使用测试HDL1测试CS-10和CS-38染色时，测定进行25分钟。当在测试HDL1中测试EMPA-116或在测试HDL2中测试CS-10和CS-38时，测定进行超过50分钟。当在测试HDL2中测试EMPA-116时，测定进行超过65分钟。在这些孵育之后，将130μL每种上清液的等分试样转移至新鲜的MTP，并使用SpectraMax读板仪测量EMPA-116样品在600nm处的吸光度，并且在405nm处测量CFT CS-38和CFT CS-10样品的吸光度。通过从每个样品值中减去空白(不添加酶)的值来获得吸光度结果。通过将给定变体的吸光度值除以相同浓度的测试的BspE04637-T1亲本蛋白酶的吸光度值来获得每中测定条件下的清洁PI。

洗涤剂中的热稳定性测定

通过在升高的温度下孵育之后测量残余活性，在应激条件下使用稀释在去离子水中的10％测试HDL1洗涤剂(以下称为“应激源”)测试变体的稳定性。设置升高的温度以获得应激的样品的约30％的残留活性(相比于无应激(基线)的样品)。

对于无应激条件，将稀释的酶样品在10％测试HDL1洗涤剂(在去离子水中稀释)中混合，并在通过上述DMC测定稀释后立即测量基线蛋白酶活性(无升高的温度应力)。对于应激条件，将这些在应激物中稀释的酶样品在96孔板中在72℃下使用热循环仪孵育5分钟。然后冷却平板并通过DMC方法测量所得的应激蛋白酶活性。通过确定有应激的与基线蛋白酶的活性的比例，并将其乘以100来计算每个样品的百分比残留活性(％)。

实例2

BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶的产生

通过本领域已知的分子生物学技术进行DNA操作以产生BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶。BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白酶在2015年10月27日提交的PCT国际申请号PCT/US2015/057512中更充分地描述。天然存在的BspE04637野生型蛋白酶的预测和观察序列在PCT国际申请号PCT/US2015/057512中列出。合成一系列人工DNA序列(通过整合DNA科技公司(DNA Technologies,Inc.))以产生编码截短形式的BspE04637-T1(SEQ ID NO:1)的BspE04637蛋白酶序列的基因。使用本领域已知的分子生物学技术将多个氨基酸修饰引入该序列，其由天然存在的序列的C-末端截短组成，产生278个氨基酸(SEQ ID NO:1)的成熟蛋白质。

含有以下成分的DNA片段：构建了BPN'终止子、来自金黄色葡萄球菌(CAT)的氯霉素抗性标记、枯草芽孢杆菌aprE启动子、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列和天然BspE04637蛋白酶前导肽。使用Gibson技术组装目的基因库(编码各种BspE04637-T1变体)和上述DNA片段以形成靶向枯草芽孢杆菌aprE基因座的整合盒。这些表达盒由以下组成：枯草芽孢杆菌aprE启动子(SEQ ID NO:2)、枯草芽孢杆菌aprE信号肽序列(核苷酸序列为SEQ ID NO:3，氨基酸序列为SEQ ID NO:4)、天然BspE04637蛋白酶前导肽(核苷酸序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6)、编码BspE04637-T1亲本(SEQ ID NO:1)或其变体的成熟蛋白酶序列的区域、和解淀粉芽孢杆菌终止子(SEQ ID NO:7)。BspE04637-T1变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:8-17所示，且BspE04637-T1变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:18-27所示。

用上述Gibson组装反应的反应产物转化合适的枯草芽孢杆菌菌株，并且将转化的细胞接种于Luria琼脂+5ppm含氯霉素的脱脂奶上。将来自琼脂平板的单个菌落挑取到96孔MTP的各个孔中，每个孔含中含有150微升Luria肉汤+5ppm氯霉素。培养物在37℃和250RPM下生长过夜。将75微升50％甘油(稀释于水中)添加到每个孔中，并将MTP在-80℃下长期储存。

为了产生重组蛋白酶，在37℃和250RPM下将携带每个目的基因的枯草芽孢杆菌在加富性半组合培养基中培养2天。将培养物进行离心和过滤，并将澄清的上清液用于下述筛选测定。

实例3

评估BspE04637-进化枝蛋白酶变体的清洁和稳定性

在如下微型样品上测试BspE04637-进化枝蛋白酶变体(列于表4)相对于BspE04637-T1亲本蛋白酶的清洁性能：BMI(EMPA-116)、调入色素的蛋黄(通过加热熟化的，CFT CS-38)和POM(色素/油/奶，CFT-C10)。

表5显示当将各种BspE04637-进化枝蛋白酶变体的清洁与测试HDL1和测试HDL2洗涤剂中的BspE04637-T1亲本蛋白酶进行比较时获得的结果。

表6显示了与BspE04637-T1亲本蛋白酶相比，10％测试HDL1中各种BspE04637蛋白酶变体的稳定性，如在上文实例1中描述的稳定性测定中所测量的。

实例4

BspE04637-T1与其变体的序列比对

BspE04637-T1亲本蛋白酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列与其蛋白酶变体的比对：BSPE-01299(SEQ ID NO:18)、BSPE-01314(SEQ ID NO:19)、BSPE-01329(SEQ ID NO:20)、BSPE-01346(SEQ ID NO:21)、BSPE-01420(SEQ ID NO:22)、BSPE-01443(SEQ ID NO:23)、BSPE-01483(SEQ ID NO:24)、BSPE-01560(SEQ ID NO:25)、BSPE-01579(SEQ ID NO:26)和BSPE-01581(SEQ ID NO:27)具有天然截短形式的BspE04637(SEQ ID NO:34)(其在PCT国际申请号PCT/US2015/057512中进一步描述)；以前公开的BspE04637-进化枝枯草杆菌蛋白：SWT183_1430046(SEQ ID NO:28)和芽孢杆菌属物种KSM-LD1_BAD02409.1(SEQ ID NO:29)；和以下枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的序列：解淀粉芽孢杆菌_CAA24990(SEQ ID NO:30)、迟缓芽孢杆菌_P29000(SEQ ID NO:31)、芽孢杆菌属物种SprC_AAC43580(SEQ ID NO:32)、和地衣芽孢杆菌_CAJ70731(SEQ ID NO:33)示于图1中。在BspE04637-进化枝蛋白酶的基序周围绘制了框。使用来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(RobertC.Edgar,MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and highthroughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)的MUSCLE程序使用默认参数来比对这些序列。

使用Geneious树构建程序构建了图1中枯草杆菌蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的系统发生树，并且在图2中列出。

Claims (26)

1.一种枯草杆菌蛋白酶变体，所述枯草杆菌蛋白酶变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在选自12、14、15、26、37、48、53、55、56、78、101、105、120、122、133、143、155、164、165、166、169、175、184、197、198、220、238、243、248、254、255、259、264、268、272、274和275的一个、两个、三个或四个或更多个位置处的氨基酸取代；并且

其中所述变体的氨基酸位置通过与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相对应来编号。

2.如权利要求1所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个、两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：

(i)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、G/N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P/S197X、A198X、T220X、L/W238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、H/N268X、R272X、V274X和D175X；

(ii)Q12X、T14X、D15X、V26X、R37X、H48X、D53X、A55X、N56X、N78X、S101X、S105X、N120X、D122X、S133X、I143X、A155X、R164X、G165X、D166X、G169X、D175X、D184X、P197X、A198X、T220X、L238X、N243X、R248X、N254X、D255X、N259X、N264X、N268X、R272X、V274X和D175X；或

(ii)X12K、X14D、X15K、X26R、X37A、X48R、X53G/R、X55R、X56K、X78D、X101R、X105K、X120R、X122H、X133R、X143R、X155V、X164N、X165R、X166N、X169D、X175N/P/S、X184S、X197K、X198E、X220R、X238K、X243R、X248Q、X254K、X255N、X259R、X264K、X268K、X272N、X274E和X275S/K；并且

其中X是任何氨基酸。

3.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，条件是：

(i)在位置120处的氨基酸取代不是G；

(ii)在位置197处的氨基酸取代不是S；

(iii)在位置238处的氨基酸取代不是W；

(iv)在位置268处的氨基酸取代不是H；

(v)所述变体不由BAD02409或JP2003325186-0001的氨基酸序列组成；和/或

(vi)所述变体不由SWT183_1430046的氨基酸序列组成。

4.如权利要求1或2所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含一个、两个、三个或四个或更多个选自以下的氨基酸取代：

(i)Q12K、T14D、D15K、V26R、R37A、H48R、D53G/R、A55R、N56K、N78D、S101R、S105K、G/N120R、D122H、S133R、I143R、A155V、R164N、G165R、D166N、G169D、D175N/P/S、D184S、P/S197K、A198E、T220R、L/W238K、N243R、E248Q、N254K、D255N、N259R、N264K、H/N268K、R272N、V274E和D275S/K；或

(ii)Q12K、T14D、D15K、V26R、R37A、H48R、D53G/R、A55R、N56K、N78D、S101R、S105K、N120R、D122H、S133R、I143R、A155V、R164N、G165R、D166N、G169D、D175N/P/S、D184S、P197K、A198E、T220R、L238K、N243R、E248Q、N254K、D255N、N259R、N264K、N268K、R272N、V274E和D275S/K。

5.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列包含九个或更多个选自以下的氨基酸取代：

R37A-D53G-S101R-N120R-I143R-D166N-D184S-P197K-L238K-E248Q-D255N-R272N；

D15K-D53R-N56K-S105K-D122H-D166N-D184S-P197K-E248Q-D255N-V274E；

D15K-A55R-S101R-N120R-I143R-D166N-D184S-P197K-L238K-E248Q-N268K-V274E；

H48R-A55R-S101R-N120R-S133R-R164N-L238K-E248Q-D255N-N268K；Q12K-D15K-R37A-D122H-R164N-G169D-E248Q-N268K-D275S；

D15K-H48R-A55R-S101R-N120R-I143R-G165R-D175N-A198E-N243R-N254K-D275K；

Q12K-V26R-R37A-A55R-N78D-S105K-I143R-A155V-D184S-A198E-N243R-N259R-D275K；

T14D-D53R-S101R-I143R-R164N-D175S-A198E-N243R-D275K；

D15K-D53R-S101R-N120R-I143R-G165R-D175S-N243R-D255N-N264K-D275K；

Q12K-V26R-R37A-H48R-A55R-N78D-S101R-D122H-I143R-D166N-D175P-D184S-Y220R-N243R-D255N-R272N；及其组合。

6.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体还包含一种或多种选自以下的基序：

i.DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:31)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

ii.DTGIXXXHXDLXXXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:32)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

iii.DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:33)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

iv.DTGIXXXHXDLNVXGGXSVFXXXXXXDPXXDXXGH(SEQ ID NO:34)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

v.DTGIDXXHXDLNVXGGXS VFXXXXXXXXXXDXXGH(SEQ ID NO:35)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；

vi.DTGIDXNHXDL NVRGGXSVFTXXXXX DPXXDXXGH(SEQ ID NO:36)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸，末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸；以及

vii.DTGIDXNHXDLNVRGGXSVFTXXXXX DPYYDXXGH(SEQ ID NO:37)基序，其中初始D是活性位点天冬氨酸且末端H是活性位点组氨酸，并且X是任何氨基酸。

7.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体来自参比枯草杆菌蛋白酶，所述参比枯草杆菌蛋白酶包含与SEQ ID NO:1、28、29或34的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

8.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体还包含与SEQID NO:1或34的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体具有蛋白酶活性并且/或者是分离的。

10.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体与参比枯草杆菌蛋白酶相比，具有一种或多种改善的性质，其中所述改善的性质选自改善的蛋白酶活性、改善的洗涤剂清洁性能和改善的洗涤剂热稳定性。

11.如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述参比枯草杆菌蛋白酶包含SEQ ID NO:1或34的氨基酸序列。

12.如权利要求10或11所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述改善的性质是

(i)改善的蛋白酶活性，其中所述变体对于N-suc-AAPF-pNA或二甲基酪蛋白底物具有PI>1；

(ii)改善的清洁性能，其中所述变体具有BMI、POM和/或调入色素的蛋黄样本清洁PI>1；和/或

(iii)改善的热稳定性，其中所述变体具有稳定性PI>1。

13.如权利要求12所述的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述

(i)蛋白酶活性根据实例1所述的蛋白酶活性测定进行测量；

(ii)洗涤剂清洁性能根据实例1所述的洗涤剂测定中的清洁性能进行测量；和/或

(iii)洗涤剂热稳定性根据实例1所述的洗涤剂测定中的热稳定性进行测量。

14.一种组合物，所述组合物包含一种或多种如前述权利要求中任一项所述的枯草杆菌蛋白酶变体。

15.如权利要求14所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述洗涤剂组合物选自下组：衣物洗涤剂、织物软化洗涤剂、餐具洗涤剂和硬表面清洁洗涤剂。

17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种选自钙和锌的离子；至少一种稳定剂；从约0.001％至约1.0重量％的所述变体；至少一种漂白剂；至少一种辅助成分；和/或一种或多种选自下组的另外的酶或酶衍生物：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-β-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、金属蛋白酶、及其组合。

18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含磷酸盐或不含磷酸盐和/或包含硼酸盐或不含硼酸盐。

19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物是颗粒、粉末、固体、棒状、液体、片剂、凝胶、糊剂或单位剂量组合物。

20.一种清洁方法，所述清洁方法包括使需要清洁的表面或物品与如权利要求1-13中任一项所述的变体或如权利要求14-19中任一项所述的组合物接触；并且所述方法任选地进一步包括在使所述表面或物品与所述变体或组合物接触之后漂洗所述表面或物品的步骤。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述物品是餐具或织物。

22.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1-13中任一项所述的变体的核酸序列，其中所述多核苷酸是任选地分离的。

23.一种表达载体或表达盒，所述表达载体或表达盒包含如权利要求22所述的多核苷酸。

24.如权利要求23所述的表达载体或表达盒，其中所述核酸序列有效地连接到启动子。

25.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求23所述的载体或盒或如权利要求22所述的多核苷酸。

26.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-13中任一项所述的变体，其中所述组合物是动物饲料组合物、接触镜清洁组合物、伤口清洁组合物、或纺织品加工组合物、皮革加工组合物或羽毛加工组合物。