KR20080031868A - 약학적 용도를 위한 아밀라제 - Google Patents

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피터 콜린 그레고리
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노보자임스 에이/에스
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Abstract

본 발명은 임의선택적으로는 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된, Bacillus 알파-아밀라제(SEQ ID NO: 1-3)에 관한 아밀라제의 약학적 용도에 관한 것이다. 대표적인 의학적 징후에는 다음과 같은 것이 있다: 소화장애, 췌장 외분비 부족증(PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병 및/또는 제2형 당뇨병의 치료. SEQ ID NO: 1-3의 아밀라제는 Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis 및 Bacillus sp. 유래 아밀라제의 변이체이다. 본 발명의 아밀라제는 개선된 인 비보(in vivo)에서의 효능, 개선된 pH-프로파일, 고특이적 활성, 및/또는 개선된 녹말 파괴 프로파일을 가진다.
아밀라제, 프로테아제, 리파제, 췌장 외분비 부족증

Description

약학적 용도를 위한 아밀라제{AMYLASES FOR PHARMACEUTICAL USE}
본 발명은 임의선택적으로는 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된, 특정 Bacillus 알파-아밀라제(SEQ ID NO: 1-3)에 관한 아밀라제의 약학적 용도에 관한 것이다. 대표적인 의학적 징후에는 다음과 같은 것이 있다: 소화장애, 췌장 외분비 부족증(PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병 및/또는 제2형 당뇨병의 치료.
췌장 외분비 부족증의 치료를 위한 췌장 효소 보충제 형태로 시판중인 몇가지 의약들이 공지되어 있다. 이러한 제품의 활성 성분은 소화 효소인데, 주로 아밀라제, 리파제 및 프로테아제로서, 이들은 정상적으로는 췌장에서 만들어져서 소장의 상부(십이지장)로 분비되는 것들이다. 이러한 의약에 사용되는 효소는 주로 소나 스와인의 췌장에서 유래하는 것들이지만, 미생물 효소를 사용하여 시중에 판매되는 제품도 있고, 이러한 것들로서 예를 들면, Rhizopus oryzae 유래 리파제, Aspergillus oryzae 유래 프로테아제, 및 Aspergillus oryzae 유래 아밀라제를 함유하는 제품 Nortase®가 있다.
US 5614189 (EP 600868)는 췌장 효소 대체 치료에서, 예를 들면, 낭포성 섬유증을 앓고 있는 환자의 치료에서 Humicola lanuginosa 유래 리파제의 용도를 기 술하고 있다. 이러한 리파제는 Humicola lanuginosa DSM 4109에서 유래하는 것이고, SEQ ID NO: 14의 아미노산 1-269의 아미노산 서열을 갖는 것이다.
WO 00/54799는 제1형 및 제2형 당뇨병의 치료시 지방분해, 단백질분해 및 녹말분해 활성을 갖는 생리학적으로 수용가능한 효소 혼합물의 사용을 기술하고 있다.
WO 02/060474는 소화불량의 치료시 Rhizopus delemar 유래 농축된 리파제, Aspergillus melleus 유래 중성 프로테아제, 및 Aspergillus oryzae 유래 아밀라제의 사용을 기술하고 있다.
WO 01/62280는 포유류에서 위장 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 다작용성 교차결합제로 교차결합된 비진균류 리파제 결정, 프로테아제, 및 아밀라제의 사용을 기술하고 있는데, 여기에서 리파제 결정은 약 2.0 내지 9.0 범위의 pH에서 활성인 것을 특징으로 하는 것이다. 바람직한 리파제는 Pseudomonas에서 유래한 것이고, 바람직한 아밀라제는 Bacillus 또는 Aspergillus에서 유래한 것이며, 바람직한 프로테아제는 브로멜라인(bromelain), 파파인(papain), 또는 피신(ficin)이다.
EP 0828509는 췌장 외분비 부족증의 치료에 있어, 임의선택적으로는 특정 산 안정성 리파제 및/또는 프로테아제와 배합하여 특정 산안정성 아밀라제를 사용하는 것을 기술하고 있다. 바람직한 아밀라제는 Aspergillus niger에서 유래한 것이고, 바람직한 리파제는 Rhizopus arrhizus 또는 Rhizopus javanicus에서 유래한 것이다.
WO 99/19467는 Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, 및 Bacillus amyloliquefaciens 유래 알파-아밀라제의 특정 변이체 뿐만 아니라, 이의 각종 산업적 용도에 대해서 기술하고는 있지만, 이의 약학적 용도에 대해서는 기술하고 있지 않다. 이러한 WO 99/19467에서 SEQ ID NO: 3-5로 지칭되는 야생형 Bacillus 알파-아밀라제의 서열은 각각 SEQ ID NO: 10-12로서 본원에 포함되어 있다.
EP 0594235는 발효액으로부터 정제된 아밀라제를 제조하는 방법을 기술한다. 약학적 조성물이 청구범위에 포함되어 있고, 이의 소화보조제로서의 가능성이 다른 잠재적인 용도와 함께 기재되어 있다. 실시예는, 청구범위에 포함된 Bacillus licheniformis 알파-아밀라제에 대한 정제 방법을 설명하고 있다.
WO 2004/078960는 아밀라제의 적어도 하나의 T-세포 에피토프 및 적어도 하나의 에피토프에서 적어도 하나의 변경을 포함하는 변이체 아밀라제를 확인하는 방법을 기술하고 있다. 다양한 잠재적 용도가 언급되어 있고, 여기에는 약학적 용도도 포함된다. Bacillus licheniformis 유래의 아밀라제도 언급되어 있다.
EP 0828509는 췌장 외분비 부족증의 치료시, 임의선택적으로는 특정 산안정성 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된, 특정 산안정성 아밀라제의 용도를 기술하고 있다. 바람직한 아밀라제는 Aspergillus niger 유래의 것이고, 바람직한 리파제는 Rhizopus arrhizus 또는 Rhizopus javanicus 유래의 것이다.
당업계에는 대안적인, 바람직하게는 개선된, 약학적 용도를 위한 효소가 요구되고 있는 실정이다.
발명의 개요
본 발명은 약학적 용도를 위한, 구체적으로는 소화장애, 췌장 외분비 부족증(PEI), 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한, 대안적인, 바람직하게는 개선된 효소를 제공한다. 신규 효소는 프로테아제, 아밀라제, 및 리파제이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 용도를 위한 효소는, 개선된 인 비보(in vivo) 및/또는 인 비트로(in vitro)에서의 효능; 개선된 pH-활성 프로파일; 개선된 특이적 활성; 개선된 파괴 프로파일을 가지고; 담즙염의 존재하에 안정하며; 그리고/또는 감소된 알레르기유발성을 가진다.
본 발명은 의약으로서의 용도를 위한, 임의선택적으로는 리파제, 및/또는 프로테아제와 배합된, (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO:3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 소화장애, PEI, 췌장염(급성 및/또는 만성), 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조시 이러한 아밀라제의 용도에 관한 것인데, 이들은 임의선택적으로는 리파제 및/또는 프로테아제의 사용을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한, 이러한 아밀라제와 함께, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 물질, 임의선택적으로는 리파제 및/또는 프로테아제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 이러한 아밀라제의 치료 유효량을, 임의선택적으로는 리파제 및/또는 프로테아제와 함께 투여함에 의한, 소화장애, PEI, 췌장염(급성 및/또 는 만성), 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486의 아미노산 서열을 갖는 아밀라제( Bacillus stearothermophilus 아밀라제 변이체)의 파괴 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 제시하고 있고;
도 2는 Aspergillus oryzae 유래 아밀라제의 파괴 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 제시하고 있으며;
도 3은 췌장효소의 파괴 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 제시하고 있으며;
도 4는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483의 아미노산 서열을 갖는 아밀라제(Bacillus sp . 아밀라제 변이체)의 파괴 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 제시하고 있으며;
도 5는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 1-481의 아미노산 서열을 갖는 아밀라제(Bacillus licheniformis 아밀라제 변이체)의 파괴 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 제시하고 있다.
효소
본 발명은 의약으로서의 용도를 위한, (i) SEQ ID NO:1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO:2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO:3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제의 약학적 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 소화장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조시 이러한 아밀라제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 아밀라제와 함께, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 물질을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 뿐만 아니라, 이러한 아밀라제의 치료 유효량을 투여하는 것에 의한, 상기 언급한 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
하기에서, 본 발명의 조성물, 방법 및 용도에서의 용도를 위한 아밀라제는 "본 발명의 아밀라제"로 언급하기로 한다.
본 발명의 명세서에서, 아밀라제란 녹말 및 기타 선형 및 분지형 올리고당류 및 다당류의 엔도-가수분해를 촉매하는 효소를 말한다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 아밀라제는 알파 아밀라제 활성을 가지는 것인데, 즉 올리고당류 및 다당류내의 1,4-알파-글루코시딕 결합을 엔도가수분해하는 것을 촉매한다. 알파 아밀라제는 예를 들면, 녹말, 글리코겐 및 관련 다당류 및 올리고당류에 대해 무작위의 방식으로 알파-배열에 있는 환원기를 유리시키는 작용을 한다.
아밀라제의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 알파-아밀라제(분류명이 1,4-알파-D-글루칸 글로카노하이드롤라제)이다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 아밀라제의 EC 3.2.1.-군, 예컨대 EC 3.2.1.1 (알파-아밀라제), EC 3.2.1.2 (베타-아밀라제), EC 3.2.1.3 (글루칸 1,4-알파-글루코시다제, 아밀로글루코시다제, 또는 글루코아밀라제), EC 3.2.1.20 (알파-글루코시다제), EC 3.2.1.60 (글루칸 1,4-알파-말토테트라오하이드롤라제), EC 3.2.1.68 (이소아밀라제), EC 3.2.1.98 (글루칸 1,4-알파-말토헥소시다제), 또는 EC 3.2.1.133 (글루칸 1,4-알파-말토하이드롤라제)에 속한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 아밀라제는 EC 3.2.1.1군으로 분류될 수 있거나, EC 3.2.1.1군으로 분류된다. 효소의 EC 번호는 캘리포니아 샌디에고 소재 아카데믹 프레스출판사의 NC-IUBMB 1992년판 효소 명명법을 참고하여 매겨진 것으로서, 상기 문헌은 각각 Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; 및 Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650의 증보 1-5판을 포함하는 것이다. 명명법은 규칙적으로 증보판이 나오고 업데이트된다: 참조: 예를 들면 월드와이드웹 http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
특정 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 임의의 하나: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 또는 적어도 60%의 동일성의 정도를 갖는다. 또다른 특정 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 임의의 하나: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 또는 적어도 70%의 동일성의 정도를 갖는다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 임의의 하나: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 또는 적어도 80%의 동일성의 정도를 갖는다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 임의의 하나: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 적어도 90%의 동일성의 정도를 갖는다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 임의의 하나: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%의 동일성의 정도를 갖는다.
추가의 특정 구체예에서 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii) 중 임의의 하나의 서열: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483 중 하나 이상의 아미노산의 적어도 하나의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 중요하지 않은 것인데, 달리 말하면 이는 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 상당한 영향을 미치지 않는 보존적인 아미노산 치환 또는 삽입, 바람직하게는 소수의 이러한 치환 또는 삽입; 작은 결실; 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메싸이오닌 잔기의 연장; 작은 링커 펩티드 연장; 또는 전체 전하나 다른 작용기를 변화시킴으로써 정제를 촉진하는 작은 연장, 예컨대 폴리-히스티딘 트랙트, 항원 에피토프, 또는 결합 도메인의 연장을 말하는 것이다. 상기의 문단에서, 용어 "작은"은 독립적으로 25개까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 24, 23, 22, 21까지의, 또는 20까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 또하나의 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 24, 23, 22, 21 또는 20까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11까지의, 또는 10까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2까지의, 또는 1까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다. 다른 구체예에서, 용어 "작은"은 독립적으로 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26까지의, 또는 25까지의 아미노산 잔기를 나타내는 것이다.
보존적 치환의 예는 염기성 아미노산군(아르지닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산군(글루탐산 및 아스파트산), 극성 아미노산군(세린, 트레오닌, 글루타민 및 아스파라진), 소수성 아미노산군(루신, 아이소루신 및 발린 및 알라닌), 방향족 아미노산군(페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신), 및 소형 아미노산군(글리신, 알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 메싸이오닌)내에서 일어난다.
대안적으로, 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산군(아르지닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산군(글루탐산 및 아스파트산), 극성 아미노산군(글루타민 및 아스파라진), 소수성 아미노산군(루신, 아이소루신 및 발린), 방향족 아미노산군(페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신), 및 소형 아미노산군(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메싸이오닌)내에서 일어난다. 일반적으로 특정 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌(H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In , The Proteins, Academic Press, New York)에 설명된다. 가장 흔하게 발생하는 변화는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483 중 임의의 하나와 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 이하의, 또는 11 이하의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483 중 임의의 하나와 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 이하의, 또는 1 이하의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483 중 임의의 하나와 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 이하의, 또는 26 이하의 아미노산이 상이한 아미노산 서열을 갖는다.
또다른 특정 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제 중 임의의 하나의 대립유전자 변이체이거나, 아밀라제 활성을 갖는 이의 단편이다. 또한 본 발명의 아밀라제는 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 갖는 아밀라제 중 임의의 하나의 대립유전자 변이체일 수 있다. 용어 "대립유전자 변이체"는 본원에서 동일한 염색체의 유전자좌를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 대안 형태 중 어떤 것을 나타낸다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 집단 내에 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 변이는 침묵할 수 있거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음) 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변이체는 유전자의 대립유전자 변이체에 의하여 코딩된 폴리펩티드이다. 용어 "단편"은 본원에서 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노 및/또는 카르복실 말단에서, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513; 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483의 아미노 및/또는 카르복실 말단에서 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드로 정의된다. 바람직하게는 작은 수의 아미노산이 결실된 것인데, '작은'의 의미는 상기에 설명한 바와 같다. 더욱 바람직하게는, 단편은 적어도 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 또는 적어도 454 아미노산 잔기를 함유한다. 가장 바람직하게는 단편은 적어도 452, 453 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 또는 적어도 470 아미노산 잔기를 함유한다. 최고로 바람직하게는 단편은 적어도 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 또는 적어도 480 아미노산 잔기를 함유한다.
요약하면, 본 발명의 하나의 구체예는 약학적 용도를 위한 아밀라제에 관한 것인데, 여기에서 a) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고/또는 b) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열의 변이체인데, 여기에서 변이체는 해당 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산이 상이한 것으로, 이 때 (i) 변이체는 해당 아미노산 서열과 대조하여, 하나 이상의 아미노산의 적어도 하나의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하고; 그리고/또는 (ii) 변이체는 해당 아미노산 서열과 대조하여, 적어도 하나의 결실을 포함하고; 그리고/또는 (iii) 변이체는 해당 아미노산 서열과 대조하여, 적어도 하나의 작은 N- 또는 C-말단 서열을 포함하고; 그리고/또는 c) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산을 갖는 아밀라제의 대립유전자 변이체이며; 그리고/또는 d) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산을 갖는 아밀라제의 단편이다.
구체적으로, 본 발명은 약학적 용도를 위한 아밀라제에 관한 것인데, 여기에서 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 아밀라제는 미생물, 예컨대 진균류 또는 박테리아 유래의 것이다. 박테리아의 예는 Bacillus 균주 유래의 것, 예컨대 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp ., Bacillus stearothermophilus, 및 Bacillus subtilis 균주 유래의 것; 바람직하게는 Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp ., 및 Bacillus stearothermophilus 균주 유래의 것; 가장 바람직하게는 Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, 또는 Bacillus sp 유래의 것이다. 본 명세서에서 용어 "에서 유래한"은 야생형 균주로부터 수득할 수 있거나 수득된 효소를 포함하며; 뿐만 아니라, 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 적어도 하나의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 갖는 이의 변이체도 포함하는 것이다. 용어 변이체는 또한, 셔플런츠, 혼성체, 키메릭 효소 및 컨센서스 효소도 포함하는 것이다. 변이체는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상기의 방법에는 영역지정 돌연변이생성, 랜덤 돌연변이생성, 컨센서스 변이체화 과정(EP 897985), 및 유전자 셔플링(WO 95/22625, WO 96/00343) 등이 있다.
본 발명의 야생형 아밀라제의 비제한적인 예는 Bacillus licheniformis 유래의 것, 예컨대 Swissprot entry name AMY_BACLI, 1차 수탁번호 P06278; Bacillus amyloliquefaciens, 예컨대 Swissprot entry name AMY_BACAM, 1차 수탁번호 P00692; Bacillus megaterium, 예컨대 Swissprot entry name AMY_BACME, 1차 수탁번호 P20845; Bacillus circulans, 예컨대 Swissprot entry name AMY_BACCI, 1차 수탁번호 P08137; Bacillus stearothermophilus, 예컨대 Swissprot entry name AMY_BACST, 1차 수탁번호 P06279가 있다. 다른 예로는 Bacillus subtilis 유래, 예컨대 Swissprot entry name AMY_BACSU, 1차 수탁번호 P00691이 있다. 또다른 예로는 Bacillus halmapalus 유래의 SEQ ID NO: 4의 아미노산 1-485가 있다. 본 발명에 따른 용도의 아밀라제 변이체의 비제한적 예는 WO 96/23873, WO 99/19467, US 특허 제4,933,279호, EP 722490, 및 EP 904360에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 (i) Swissprot entry name AMY_BACLI, 1차 수탁번호 P06278이 아니고; 그리고/또는 (ii) Swissprot entry name AMY_BACST, 1차 수탁번호 P06279가 아니다.
본 발명의 아밀라제의 추가적인 구체예는 하기의 시판되는 제품에 함유된 아밀라제들이다: Clarase, DexLo, GC 262 SP, G-Zyme G990, G-Zyme G995, G-Zyme G997, G-Zyme G998, HTAA, Optimax 7525, Purastar OxAm, Purastar ST, Spezyme AA, Spezyme Alpha, Spezyme BBA, Spezyme Delta AA, Spezyme DBA, Spezyme Ethyl, Spezyme Fred (GC521), Spezyme HPA, 및 Ultraphlow (모두 Genencor 제품); Validase BAA, Validase FAA, Validase HT340L, Valley Thin 340L (모두 Valley Research 제품); Avizyme 1500, Dextro 300 L, Kleistase, Maltazyme, Maxamyl, Thermozyme, Thermatex, Starzyme HT 120 L, Starzyme Super Conc, 및 Ultraphlo.
본 발명의 특히 바람직한 아밀라제의 예는 다음과 같다: SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-484, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-513을 갖는 아밀라제; SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제; 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제.
또다른 특정 구체예에서, 부가적인 아밀라제가 사용될 수 있다. 부가적인 아밀라제의 예는 포유류 아밀라제, 및 미생물 프로테아제이다. 바람직한 포유류 아밀라제는 예를 들면 스와인이나 소의 췌장효소와 같은 췌장추출물이다. 췌장효소는 코팅되지 않은(정제되지 않은) 생성물의 형태로 사용될 수 있거나, 제형된 제품의 형태로((위산에 대한 내성을 제공하기 위해) 장코팅된 형태로) 사용될 수 있거나, 비작용적으로 코팅된(코팅되었지만 위산에 대한 내성을 제공하지는 않는) 형태로 사용될 수 있다. 췌장효소는 잠재적으로 췌장 리파제, BSSL(담즙염 자극 리파제) 및/또는 췌장 프로테아제와 같은 추가의 효소 활성 성분을 포함할 수도 있다. 미생물 아밀라제는 예를 들면 박테리아 또는 진균류 균주로부터, 예를 들면, Bacillus , Pseudomonas, Aspergillus , 또는 Rhizopus로부터 유래할 수 있다. 아밀라제는 특히 Aspergillus 균주, 예를 들면 Aspergillus niger, Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus melleus 유래의 것일 수 있고, 예컨대 Amano Pharmaceuticals, Japan이 시판중인 제품인 Amylase A1TM이거나, Extract-Chemie, Germany이 시판중인 제품인 Aspergillus melleus 유래 Amylase ECTM일 수 있다.
본 발명의 아밀라제는 하기에도 기술하는 바와 같이 리파제와 함께, 또는 리파제 없이, 프로테아제와 배합하여 사용될 수 있다. 용어 "프로테아제"는 본원에서 펩티드 결합을 가수분해하는 효소로서 정의된다. 여기에는 EC 3.4 효소군(이의 13개 하위군 각각을 포함하는 것으로, 이들 효소는 하기에서 "EC 3.4.-.- 군에 속하는" 것으로 언급된다)에 속하는 임의의 효소가 포함된다.
프로테아제는 포유류 프로테아제이거나, 미생물 프로테아제일 수 있다. 바람직한 포유류 프로테아제는 예를 들면 스와인이나 소의 췌장효소와 같은 췌장추출물이다. 췌장효소는 코팅되지 않은(정제되지 않은) 생성물의 형태로 사용될 수 있거나, 제형된 제품의 형태로(장코팅된 형태 또는 비작용적으로 코팅된 형태) 사용될 수 있다. 췌장효소는 잠재적으로 췌장 리파제, BSSL 및/또는 췌장 아밀라제와 같은 추가의 효소 활성 성분을 포함할 수도 있다. 미생물 프로테아제는 예를 들면, 박테리아 또는 진균류 균주에 기초한 것이거나 이로부터 유래한 것일 수 있다. 이 프로테아제는 특히 Aspergillus 균주, 예컨대 Aspergillus oryzae 또는 Aspergillus melleus로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 Amano Pharmaceuticals, Japan에서 시판중인 제품 Prozyme 6TM(중성, 알칼리성 프로테아제 EC 3.4.21.63)이다. 박테리아 프로테아제의 예는 Bacillus 및 Nocardiopsis 유래 프로테아제, 예컨대 SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 아미노산 서열을 갖는 Bacillus licheniformis 프로테아제, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 아미노산 서열을 갖는 Nocardiopsis sp . 프로테아제, 또는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188의 아미노산 서열을 갖는 Nocardiopsis dassonviellei subsp . dassonvillei 프로테아제가 있다. SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제는 예를 들면, 덴마크 특허 출원 번호 2005 00930[발명의 명칭: "Proteases for Pharmaceutical Use", 출원일: 2005년 6월 24일, 출원인: 솔베이 파마슈티컬스 게엠베하 및 노보자임스 에이/에스]에 기술되어 있다. SEQ ID NO: 6-7의 아미노산 1-188의 프로테아제는 예를 들면, WO 2001/58276 또는 WO 2004/111224에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 프로테아제는 (i) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274, (ii) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188 중 하나와 적어도 70% 동일하다. 또다른 (i), (ii) 또는 (iii)의 바람직한 구체예에서 동일성의 정도는 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다. 대안적인 (i), (ii), 또는 (iii)의 구체예에서, 동일성의 정도는 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 적어도 69%이다.
본 발명의 아밀라제는 상기에 언급한 프로테아제와 함께 또는 프로테아제 없이, 리파제와 배합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 리파제는 카르복실 에스테르 하이드롤라제 EC 3.1.1.-을 의미하는 것으로, 예컨대 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파제, EC 3.1.1.4 포스포리파제 A1, EC 3.1.1.5 리소포스포리파제, EC 3.1.1.26 갈락토리파제, EC 3.1.1.32 포스포리파제 A1, EC 3.1.1.73 페루로일 에스터라제 활성을 포함하는 것이다. 하나의 구체예에서, 리파제는 EC 3.1.1.3 트리아실글리세롤 리파제이다.
리파제는 포유류 리파제이거나, 미생물 리파제일 수 있다. 바람직한 포유류 리파제는 예를 들면 스와인이나 소의 췌장효소와 같은 췌장추출물이다. 췌장효소는 코팅되지 않은(정제되지 않은) 생성물의 형태로 사용될 수 있거나, 제형된 제품의 형태로(장코팅된 형태, 또는 비작용적으로 코팅된 형태) 사용될 수 있다. 췌장효소는 잠재적으로 췌장 프로테아제, BSSL, 및/또는 췌장 아밀라제와 같은 추가의 효소 활성 성분을 포함한다. 미생물 리파제는 예를 들면 박테리아 또는 진균류 균주, 예를 들면 Bacillus 또는 Pseudomonas , Aspergillus , 또는 Rhizopus에서 유래할 수 있다. 리파제는 특히 Rhizopus 균주, 예컨대 Rhizopus javanicus , Rhizopus oryzae, 또는 Rhizopus delemar에서 유래할 수 있으며, 예를 들면 Amano Pharmaceuticals, Japan.에서 시판중인 제품인 리파제 D Amano 2000TM(또한 리파제 D2TM 라고도 지칭)일 수 있다.
추가의 구체예에서, 리파제는 재조합으로 제조된 미생물 리파제인데, 예를 들면 Humicola 또는 Rhizomucor와 같은 진균류로부터, Candida와 같은 효모로부터, 또는 Pseudomonas와 같은 박테리아로부터 유래한 것이다. 바람직한 구체예에서, 리파제는 Humicola lanuginosa 또는 Rhizomucor miehei의 균주로부터 유래한다.
Humicola lanuginosa (동의어 Thermomyces lanuginosus) 리파제 (SEQ ID NO: 9)는 EP 305216에 기술되어 있으며, 특히 리파제 변이체는 예를 들면, WO 92/05249, WO 92/19726, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770, WO 02/055679, 및 WO 02/066622에 기술되어 있다. 바람직한 리파제 변이체는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제, 예컨대 하기 (i) 내지 (vii): (i) SEQ ID NO: 8의 아미노산 +1 내지 +269, (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 -5 내지 +269, (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 -4 내지 +269; (iv) SEQ ID NO: 8의 아미노산 -3 내지 +269; (v) SEQ ID NO: 8의 아미노산 -2 내지 +269; (vi) SEQ ID NO: 8의 아미노산 -1 내지 +269, (vii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 +2 내지 +269를 포함하는 리파제 외에도, (i)-(vii)의 리파제 중 둘 이상의 임의의 혼합물 및 이들의 변이체이다. 하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 리파제는 (i), (ii)의 리파제 및 (i)과 (ii)의 임의의 혼합물 중에서 선택된다. 바람직한 (i)과 (ii)의 혼합물은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%의 리파제 (i)을 포함하며, 퍼센트는 덴마크 특허 출원 번호 2005 00929를 우선권으로서 주장하는 PCT 출원의 실시예 5에 기술되어 있는 바와 같이, 에드만 방법을 사용하여 N-말단 서열분석함으로써 결정된 것이다. 다른 바람직한 혼합물은: (a) 35-75%, 바람직하게는 40-70%, 더욱 바람직하게는 45-65%의 리파제 (ii)를 포함하는 조성물; (b) 20-60%, 바람직하게는 25-55%, 더욱 바람직하게는 30-50%, 가장 바람직하게는 35-47%의 리파제 (i)을 포함하는 조성물; (c) 30% 이하, 바람직하게는 25% 이하, 더욱 바람직하게는 20% 이하, 가장 바람직하게는 16% 이하의 리파제 (vii)를 포함하는 조성물; 및 (d) (a), (b), 및/또는 (c)의 임의의 배합물, 예컨대 45-65%의 리파제(ii), 35-47%의 리파제(i), 및 16% 이하의 리파제 (vii)을 포함하는 조성물이 있다.
SEQ ID NO: 8 및 9의 리파제는 예를 들면, 미국 특허 제5,869,438호에 교시된 것을 기초로 제조할 수 있다(상기 특허에서 SEQ ID NO: 1은 SEQ ID NO: 9의 리파제를 코딩하는 DNA 서열이다). SEQ ID NO: 8의 리파제는 예를 들면, 미국 특허의 SEQ ID NO:1의 변형인 DNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 재조합 발현시킴으로써 제조할 수 있는데, 변형은 본원에서의 SEQ ID NO: 8과 9의 아미노산 차이를 반영하는 것이다. 이러한 변형은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 영역지정 돌연변이생성에 의해 제조할 수 있다.
진균류 리파제의 추가적인 예로 EP 785994에 기술된 Humicola insolens 유래 큐티나제, 및 EP 869167에 기술된 Fusarium oxysporum 유래 포스포리파제가 있다. 효모 리파제의 예로는 Candida antarctica 유래 리파제 A 및 B가 있는데, 리파제 A는 EP 652945에 기술된 것이고, 리파제 B는 예를 들면, [Uppenberg et al in Structure, 2 (1994), 293]에 기술된 것이다. 박테리아 리파제의 예로는 Pseudomonas cepacia 유래 리파제가 있는데, 이것은 EP 214761에 기술된 것이다.
바람직한 구체예에서, 리파제는 SEQ ID NO: 8의 리파제와, 또는 이의 아미노산 1-269와 적어도 70% 동일하다. 추가의 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 8에 대한, 또는 이의 아미노산 1-269에 대한 동일성의 정도는 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다. 대안적인 구체예에서, SEQ ID NO: 8에 대한, 또는 이의 아미노산 1-269에 대한 동일성의 정도는 적어도 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 적어도 69%이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 포유류 췌장 리파제와 같은 리파제는 1,3-위치에 특이적인 리파제이다.
본 발명의 목적을 위해서 특히 바람직한 효소의 배합은 다음과 같다: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513)와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제; (ii) SEQ ID NO: 2의 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제; (iii) SEQ ID NO: 3의 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제; (iv) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513)와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 프로테아제; (v) SEQ ID NO: 2의 아미라제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 프로테아제; (vi) SEQ ID NO: 3의 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 프로테아제; (vii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513)와 배합된, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (viii) SEQ ID NO: 2의 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (ix) SEQ ID NO: 3의 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제; (x) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513) 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제; (xi) SEQ ID NO: 2의 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269 또는 2-269의 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제; (xii) SEQ ID NO: 3의 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제; (xiii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513) 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 프로테아제; (xiv) SEQ ID NO: 2의 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 프로테아제; (xv) SEQ ID NO: 3의 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188의 프로테아제; (xvi) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486 또는 1-513)와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제; (xvii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제; (xviii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제; (xix) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제(예컨대 이의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513) 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제; (xx) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269, 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제; 및 (xi) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269 또는 2-269를 포함하는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제.
그러므로, 본 발명의 일 구체예는 청구항 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된 아밀라제에 관한 것으로서, 여기에서 아밀라제는 a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제, b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및 c) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성되는 군 중에서 선택되는 아밀라제이고, (ii) 리파제는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 2-269를 포함하며; (iii) 프로테아제는 a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제, 및 c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제인 것을 특징으로 한다.
다른 바람직한 효소의 배합은 다음과 같다: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (iv) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (v) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (vi) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (vii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (viii) SEQ ID NO: 2와 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (ix) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제; (x) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xi) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274와 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xiii) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xiv) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xv) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xvi) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xvii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xviii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xix) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; (xx) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제; 및 (xi) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269와 적어도 50% 동일성을 갖는 리파제와 배합된, SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188과 적어도 50% 동일성을 갖는 프로테아제. (i)-(xi)의 바람직한 구체예에서 각각의 동일성의 정도는 독립적으로, 적어도 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%이다.
이에 따라, 본 발명의 하나의 구체예는 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된 아밀라제에 관한 것이고, 여기에서 (i) 아밀라제는 본원에서 정의된 아밀라제이고; (ii) 리파제는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269를 갖는 리파제와 적어도 70% 동일성을 갖는 것이며; (ii) 프로테아제는 a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 188을 갖는 프로테아제, 및 c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 한다.
일반적으로, 프로테아제, 리파제 및 아밀라제 효소(이후부터는 "효소"로 통칭)는 동물, 구체적으로는 포유류, 예를 들면 사람 또는 스와인 효소로부터 수득한 것, 식물로부터 수득한 것, 또는 미생물로부터 수득한 자연 또는 야생형 효소일 수 있지만, 희망하는 효소 활성을 보이는 상기 야생형 효소의 임의의 돌연변이, 변이체, 단편 등일 수 있을 뿐만 아니라, 셔플, 혼성화, 또는 키메릭 효소 및 컨센서스 효소와 같은 합성 효소일 수도 있다.
보다 구체적인 구체예에서, 효소는 사람을 포함한 동물에 노출된 경우 감소된 면역 반응을 불러일으키도록 고안된 저-알레르기유발성 변이체이다. 용어 "면역 반응"이란 효소에 노출된 동물의 면역계에 의한 임의의 반응으로서 이해되어야 한다. 면역 반응의 한 유형으로는 노출된 동물에서 증가된 수준의 IgE를 유도하는 알레르기 반응이 있다. 저-알레르기유발성 변이체는 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 면역 반응에 관여하는 효소의 일부 또는 에피토프를 감추는 중합체 잔기와 효소를 컨쥬게이팅할 수 있다. 중합체와의 컨쥬게이팅은 효소와 중합체의 인 비트로 화학적 커플링을 포함할 수 있는데, 이것은 예컨대 WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, 및/또는 WO 99/00489에 기술된 바와 같다. 컨쥬게이팅은 추가로 또는 대안적으로, 효소와 중합체와의 인 비보 커플링을 포함할 수 있다. 이러한 컨쥬게이팅은 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 유전자 조작하고, 효소내에 부가적인 당화 자리를 코딩하는 컨센서스 서열을 삽입한 뒤, 효소를 당화할 수 있는 숙주에서 효소를 발현시키는 것을 통해 달성할 수 있다. 참조: 예를 들면 WO 00/26354. 다른 저-알레르기유발성 변이체를 제조하는 방법은 효소가 스스로 올리고머화할 수 있도록 유발하게, 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 유전자 조작하는 것인데, 이렇게 하면, 효소 단량체가 다른 효소 단량체의 에피토프를 덮을 수 있어서, 결국은, 올리고머의 항원성을 낮추게 되는 효과가 발생한다. 이러한 생성물 및 이의 제조방법은 예를 들면 WO 96/16177에 기술되어 있다. 면역 반응에 관여하는 에피토프는 WO 00/26230 및 WO 01/83559에 기술되어 있는 파지 디스플레이 방법, 또는 EP 561907에 기술된 랜덤 어프로치 방법과 같은 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 일단 에피토프를 확인한 후에는, 이의 아미노산 서열을 영역지정 돌연변이생성(예를 들면, WO 00/26230, WO 00/26354 및/또는 WO 00/22103 참조)과 같은 공지된 유전자 조작 기술에 의해 효소의 면역학적 성질을 변경시키도록 변화를 가할 수 있고 그리고/또는 중합체와 컨쥬게이팅시키면 에피토프를 감추기 위하여 중합체로 하여금 에피토프에 대해 충분한 근접성을 부여할 수 있다.
구체적인 예에서, 효소는 (i) pH 2-8에서, 바람직하게는 pH 3-7에서, 더욱 바람직하게는 pH 4-6에서 안정하고; (ii) pH 4-9에서, 바람직하게는 4-8에서 활성이며; (iii) 펩신 및 다른 소화 프로테아제(예컨대 췌장 프로테아제, 즉 주로 트립신 및 키모트립신)에 의한 파괴에 대해 안정하며; 및/또는 (iv) 담즙 염의 존재하에서 안정하고/안정하거나 활성이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 최적 pH 및 37℃에서의 활성에 비해 적어도 35%의 pH 7.0 및 37℃에서의 활성을 가진다. 더욱 바람직하게는, pH 7.0 및 37℃에서의 활성은 최적 pH 및 37℃에서의 활성의 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 적어도 75%이다(실시예 3의 표 2 참조).
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 pH 7.0 및 37℃에서 5mM 담즙 염의 존재하에, 최적 pH 및 37℃에서 담즙염의 부재하에서의 활성의 적어도 25%의 활성을 가진다. 더욱 바람직하게는, pH 7.0 및 37℃에서 5 mM 담즙 염의 존재하에 활성은, 최적 pH 및 37℃에서 담즙염의 부재하에서의 활성의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 적어도 65%이다(실시예 3의 표 3 참조).
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 아밀라제의 pH 7.0 및 37℃에서의 특이적 활성은, pH 5.0 및 37℃에서의 SEQ ID NO: 1의 아밀라제의 특이적 활성에 비해 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 적어도 70%이다(실시예 3의 표 4 참조).
또다른 바람직한 구체예에서, pH 7.0 및 37℃에서 5 mM 담즙 염의 존재하에 본 발명의 아밀라제의 특이적 활성은, pH 5.0 및 37℃에서 5 mM 담즙 염의 존재하에 SEQ ID NO: 1의 아밀라제의 특이적 활성에 비해 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 적어도 75%이다(실시예 3의 표 5 참조).
상기의 바람직한 구체예에서 언급된 활성은 예를 들면 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 바람직하게는 왁시 옥수수를 기질로서 사용하는 환원당 분석방법을 사용하여 적당하게 측정할 수 있다. 상세한 절차는 실시예 3에 기술되어 있다.
추가의 독립적인 특정한 구체예에서, 본 발명의 아밀라제는 하기의 특징 중 하나 이상을 가지는 녹말 파괴 프로파일을 가진다: (i) DP1은 파괴 산물로서 검출되고; (ii) DP4 양은 DP5의 양보다 적으며; (iii) DP4 양은 DP6 양보다 적으며; 그리고/또는 (iv) CP5 및/또는 DP6의 양은 DP1의 양보다 더 많다. 단량체 DP1은 바람직하게는 글루코스이고, DP2-DP6 산물은 각각 글루코스의 이량체-육량체이다.
파괴 프로파일은 실시예 4에 기술된 바와 같은 HPLC를 사용하여 측정할 수 있는데, 즉 바람직하게는 기질로서 왁시 옥수수를 사용하고, 더욱 바람직하게는 Ca2+의 존재하에, pH 6.0 또는 5.5에서, 60℃ 또는 37℃의 온도에서, 24시간 인큐베이션 한 후 측정할 수 있다.
용어 "배합된"은 프로테아제, 리파제 및/또는 아밀라제의 본 발명에 따른 배합 사용을 언급하는 것이다. 배합 사용은 동시에, 겹쳐서, 또는 순차적일 수 있는데, 상기 세가지 용어는 의사가 처방한 처방전에 따라 일반적으로 이해되는 것과 같은 용어이다.
용어 "동시에"는 효소들이 동시에 활성인 조건 하에 있는 것을 말하는데, 예를 들면 동시에 하나 이상의 별개의 약학적 제품으로서 투여되는 것을 말하거나, 또는 이들 성분이 하나의 동일한 약학적 조성물로 투여되는 것을 말한다.
용어 "순차적"은 하나 및/또는 두개의 효소가 먼저 작용한 다음, 두번째 및/또는 세번째 효소가 순차적으로 작용하는 경우를 말한다. 순차적인 작용은 예를 들면, 상이한 방출 시간을 수득하고, 개선된 제품 안정도를 제공하거나, 효소 용량을 최적화하기 위한 측면에서, 미지의 효소를 별개의 약학적 제형물로서 원하는 간격을 두고 투여함으로써, 또는 미지의 효소가 상이하게 제형되는(구획화되는) 하나의 약학적 조성물로서 투여함으로써 수득할 수 있다.
용어 "겹쳐서"는 효소 활동 기간이 완전히 동일한 것도 아니고 완전히 순차적인 것도 아닌, 즉 효소 중 두가지가, 또는 효소 모두가 활성인 특정한 기간이 존재하는 경우를 말한다.
단수의 표현은, 예를 들면 본 발명의 효소가 명세서에 사용될 때 적어도 하나를 의미한다. 구체예에서, "하나의"라는 표현은 "하나 이상의", 또는 "적어도 하나"를 의미하며, 이는 또다시 1, 2, 3, 4, 5 등을 의미한다.
두 아미노산 서열 간의 연관성은 매개변수 "동일성"으로 설명된다.
본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 정렬은 EMBOSS 패키지 (http://emboss.org) 버전 2.8.0의 니들 프로그램을 사용하여 결정된다. 니들 프로그램은 문헌(Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453)에 설명된 글로벌 정렬 알고리즘을 실행한다. 사용된 치환 매트릭스는 BLOSUM62이고, 갭 오프닝 벌점은 10이며, 갭 연장 벌점은 0.5이다.
본 발명의 아미노산 서열("발명 서열"; 예를 들면 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481)과 다른 아미노산 서열("외래 서열"; 예를 들면 SEQ ID NO: 12의 아미노산 1-514) 간의 동일성의 정도는 두 서열의 정렬에서 정확하게 일치된 것의 수를 가장 짧은 것이 어떤 것이든지 "발명 서열"의 길이 또는 "외래 서열"의 길이로 나누어 계산한다. 결과는 동일성 퍼센트로 표현된다.
정확한 일치는 "발명 서열"과 "외래 서열"이 오버랩의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 가질 때 발생한다(하기 정렬 예에서 이것은 "｜"로 나타낸다). 서열의 길이는 서열의 아미노산 잔기의 수이다(예를 들면, SEQ ID NO: 1의 길이는 481이다).
순수한 이론적인 하기 정렬 예에서, 오버랩은 서열 1의 아미노산 서열 "HTWGER-NL"; 또는 서열 2의 아미노산 서열 "HGWGEDANL"이다. 예에서, 갭은 "-"로 표시된다.
이론적인 정렬 예는 다음과 같다:
Figure 112007091276680-PCT00001
따라서, 서열 1 및 서열 2의 동일성 %는 6/12=0.5로서, 50%에 해당한다.
하나의 구체예에서, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 갖는, 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열의 동일성 %는 i) BLOSUM62 치환 매트릭스, 10의 갭 오프닝 벌점, 및 0.5의 갭 연장 벌점을 사용한 니들 프로그램을 사용하여, 두 아미노산 서열을 정렬하고; ii) 정렬에서 정확히 일치하는 것의 수를 센 다음; iii) 정확히 일치하는 것의 수를 두 아미노산 서열 중 짧은 것의 길이로 나눈 다음; iv) iii)의 몫을 %로 전환하는 단계에 의해 결정한다. SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 같은 본 발명의 다른 서열에 대한, 또는 다른 서열과의 동일성 %도 동일한 방식으로 계산한다.
대안적으로 두 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 Needleman-Wunsch alignment(즉, 글로벌 정렬)인, 프로그램 "align"에 의해 결정할 수 있다. 디폴트 기록 매트릭스 BLOSUM50를 사용하여 프로그램에 의해 서열을 정렬한다. 처음 나타난 갭의 잔기에 대한 벌점은 12이고, 그 다음에 나타난 갭의 잔기에 대한 벌점은 2이다. Needleman-Wunsch 알고리즘은 [Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453]에 기재되어 있고, 정렬 프로그램은 [Myers and W. Miller in "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17]에 기재되어 있다. "Align"은 FASTA package version v20u6의 일부이다(참조: W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, 및 W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98).
본 발명의 임의의 효소의 샘플, 또는 시험, 서열과, 특정한 서열 간의 동일성의 정도는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 서열을 "align" 프로그램을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전히 일치하는 것의 수("N-완전한 일치")를 결정한다(완전한 일치란 정렬의 동일한 위치에 동일한 아미노산 잔기가 있는 것을 의미한다). 두 정렬된 서열 중 일치하는 길이를 결정하는데, 즉, 존재하는 경우 정렬에 의해 발생된 트레일링 및 리딩 갭을 포함한 정렬내 총 아미노산 수("N-오버랩")도 결정한다. 동일성의 정도는 "N-완전한 일치" 및 "N-오버랩" 간의 비율로서 계산된다(동일성 %로 전환하기 위해서, 100을 곱한다).
본 발명의 임의의 효소의 샘플, 또는 시험, 서열과, 특정한 서열 간의 동일성의 정도는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 서열을 "align" 프로그램을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전히 일치하는 것의 수("N-완전한 일치")를 결정한다(완전한 일치란 정렬의 동일한 위치에 동일한 아미노산 잔기가 있는 것을 의미한다). 샘플 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)를 결정한다("N-샘플"). 동일성의 정도는 "N-완전한 일치" 및 "N-샘플" 간의 비율로서 계산된다(동일성 %로 전환하기 위해서, 100을 곱한다).
또다른 대안적인 구체예에서 본 발명의 임의의 효소의 샘플, 또는 시험, 서열과, 특정한 서열 간의 동일성의 정도는 다음과 같이 결정할 수 있다: 두 서열을 "align" 프로그램을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전히 일치하는 것의 수("N-완전한 일치")를 결정한다(완전한 일치란 정렬의 동일한 위치에 동일한 아미노산 잔기가 있는 것을 의미한다). 특정 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)를 결정한다("N-특정서열"). 동일성의 정도는 "N-완전한 일치" 및 "N-특정서열" 간의 비율로서 계산된다(동일성 %로 전환하기 위해서, 100을 곱한다).
바람직하게는, 오버랩(상기 정의된 바와 같은 "N-오버랩"으로서, 상기 정의된 바와 같이 특정 서열의 아미노산 수("N-특정서열")로 나누고, 100을 곱한 것)은 특정 서열의 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%이다. 이것은 샘플 서열을 특정 서열에 대해 정렬했을 때, 특정 서열의 아미노산의 적어도 20% (바람직하게는 25-95%)가 오버랩에 포함된 채로 끝남을 의미한다.
또는 달리, 오버랩은 특정 서열의 적어도 20%(상기 정의된 바와 같은 "N-오버랩"으로서, 상기 정의된 바와 같이 "N-샘플"로 나누고, 100을 곱한 것), 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%이다. 이것은 특정 서열에 대해 정렬했을 때, 샘플 서열의 아미노산의 적어도 20% (바람직하게는 25-95%)가 오버랩에 포함된 채로 끝남을 의미한다.
본 발명의 효소의 활성은 적당한 임의의 분석방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일반적으로는, 미지의 효소에 맞추어, pH-분석방법 및 온도-분석방법이 사용될수 있다. pH값 분석의 예는 pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12가 있다. 온도 분석의 예에는 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 또는 95℃가 있다. 바람직한 pH값 및 온도는 생체내 범위인데, 예컨대 4, 5, 6, 7, 또는 8의 pH값 및, 30, 35, 37, 또는 40℃의 온도가 그것이다.
적당한 분석방법은 실시예 부분과, 덴마크 특허 출원번호 2005 00929 및 2005 00930 뿐만 아니라, 이에 해당하는 PCT-출원에도 기술되어 있다.
다른 예로는 프로테아제, 리파제 및 아밀라제 활성에 대한 방법으로 Ph.Eur. 분석방법이 있다.
의약
본 발명의 명세서에서, 용어 "의약"은 질병의 징후를 치료, 예방 및/또는 완화시키는, 바람직하게는 질병의 징후를 치료 및/또는 완화시키는 화합물, 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 의약은 전문의약품일 수도 있고, 일반의약품일 수도 있는 것이다.
약학적 조성물
본 발명의 효소의 분리, 정제 및 농축은 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 원심분리, 여과, 추출, 방사건조, 증발, 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상의 절차에 의해 발효액으로부터 효소를 회수할 수 있고, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크로마토포커싱, 및 크기 배제 크로마토그래피), 전기영동 절차(예를 들면, 예비 등전 포커싱(preparative isoelectric focusing)), 용해도차(예를 들면, 황산 암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출을 포함하나 이에 제한되지 않는 공지된 각종 절차에 의해 효소를 추가로 정제할 수 있다(참조: 예를 들면, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).
예를 들면, 본 발명의 아밀라제를 코딩하는 DNA(예컨대 각각 SEQ ID NO: 1-4를 코딩하는 SEQ ID NO:13-16과 같은)는 당업계에 공지된 방법과 같이 Bacillus 숙주에서 재조합 발현시킬 수 있고, 원심분리, 여과, 한외여과 및 필요한 경우 무균여과 과정의 단계에 의해 발효액으로부터 정제될 수 있다. 추가의 임의선택적인 단계에는 예를 들면, 이온교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같은 각종 크로마토그래피 방법이 포함된다. 적당한 소수성 컬럼 물질은 부틸 또는 페닐이고, 이러한 컬럼은 예를 들면, Pharmacia사로부터 구입할 수 있는 것이다. SEQ ID NO:1, 2 및 3의 아밀라제의 pI는 각각 5.7, 7.3, 및 8.8이며, 세가지 아밀라제를 모두 SDS-PAGE한 결과 분자량은 대략 55 kDa이다.
하나의 구체예에서, 각 효소의 농축된 고체 또는 액체 제조물은 따로 제조된다. 이러한 농축물은 또한 적어도 일부는 하기에서 자세히 설명하는 바와 같이 따로 제형될 수 있다.
또다른 구체예에서, 효소는 고체 농축물의 형태로 본 발명의 약학적 조성물에 혼입된다. 효소는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은 각종 방법에 의해 고체 상태로 될 수 있다. 예를 들어, 고체 상태는 결정질, 즉 효소 분자가 매우 규칙적인 형태로 배열되어 있는 형태이거나, 침전물, 즉 효소 분자가 결정질 보다는 덜 규칙적인 상태로 배열되거나, 또는 불규칙적으로 배열된 형태일 수 있다.
결정화는 예를 들면, 효소의 pI 근처의 pH와, 저전도율에서, 예를 들면, EP 691982에도 기술되어 있는 바와 같이 10 mS/cm 또는 그 미만에서 수행할 수 있다.
염, 예컨대 황산 암모늄, 및/또는 황산 나트륨; 유기 용매, 예컨대 에탄올, 및/또는 이소프로판올; 또는 중합체, 예컨대 PEG(폴리에틸렌글리콜)로 침전시키는 것을 포함하는 각종 침전법이 당업계에 공지되어 있다. 또는 달리, 효소는 당업계에 공지된 각종 방법, 예를 들면, 동결건조, 증발(예를 들면 감압하에서의 증발), 및/또는 방사건조에 의해 용매(전형적으로는 물)를 제거함으로써, 용액으로부터 침전시킬 수도 있다.
또다른 구체예에서, 효소 중의 고체 농축물은 고체 농축물 중 총 단백질 함량을 기준으로 적어도 50%(w/w)의 활성 효소 단백질 함량을 가진다. 또다른 구체예에서, 고체 농축물의 총 단백질 함량을 기준으로 활성 효소 단백질 함량은 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 적어도 95% (w/w)이다. 단백질 함량은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 측정할 수 있는데, 예를 들자면 BIO-RAD사의 GS-800 교정농도계를 사용하여 코마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 농도계로 스캐닝함으로써; 그리고 Roche사가 시판하고 있는 상업적 키트인, 예컨대 Protein Assay ESL, order no. 1767003을 사용함으로써; 또는 WO 01/58276의 실시예 8에 기술된 바와 같은 방법을 기초로 하여 측정할 수 있다.
바람직하게는, 아밀라제 효소 단백질은, 코마시-염색된 SDS-PAGE 겔을 농도계로 스캐닝하여 측정한 결과, 본 발명에 따른 용도를 위한, 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 또는 적어도 97%의 고체 리파제 농축물의 단백질 스펙트럼으로 구성된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 효소, 바람직하게는 농축된 효소 제조물 형태, 더욱 바람직하게는 고체 농축물 형태의 효소를, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 또는 보조 물질, 예컨대 (i) 적어도 하나의 담체 및/또는 부형제; 또는 (ii) 적어도 하나의 담체, 부형제, 희석제, 및/또는 보조제와 함께 포함한다. 임의선택적인 다른 성분의 비제한 적인 예로는, 모두 약학적으로 수용가능한 것으로, 붕해제, 윤활제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향료, 용매, 용해제, 현탁제, 유화제, 안정제, 추진제, 및 베히클이 있다.
일반적으로, 문제되는 의학적 징후에 따라서, 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 모든 투여 방식에 알맞게 디자인될 수 있는데, 바람직하게는 장내 투여(소화관을 통해)하는 것을 포함한다. 그러므로 조성물은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예를 들면 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 크림, 거품, 용액, 좌약, 주사, 흡입, 겔, 미소구체, 로션, 및 에어로졸일 수 있다. 의료업계 종사자라면 가장 적당한 투여 경로를 선택해야 할 것을 잘 알 것이고, 잠재적으로 위험하거나 달리 유리하지 않은 투여 경로는 피할 수 있을 것이다.
그러므로 하기의 방법 및 부가 물질은 또한 주로 예시적인 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키고자 하는 것은 아니다.
고체 경구용 제조물에 대해서, 효소는 단독으로, 또는 펠렛, 마이크로펠렛, 정제, 미세정제, 분말, 과립 또는 캡슐을 만들기 위한 적당한 첨가제와 함께 사용될 수 있으며, 적당한 첨가제의 예를 들면 통상의 담체, 예컨대, 락토스, 만니톨, 옥수수 전분, 또는 감자 전분; 부형제 또는 결합제, 예컨대 결정질, 또는 미세결정질 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 카르노바 왁스, 화이트 왁스, 쉘락, 무수 콜로이드 실리카, 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 또한 마크로골이라고도 알려져 있음) 1500 내지 20000, 특히 PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, 포비돈, 탈크, 모노레인, 또는 마그네슘 스테아레이트; 그리고 원하는 경우, 희석제, 보조제, 완충제, 습윤제, 메틸파라하이드록시벤조에이트(E218)과 같은 보존제, 티타늄 다이옥사이드(E171)와 같은 착색제, 및 자당, 사카린, 오렌지 오일, 레몬 오일, 및 바닐린와 같은 향료가 있다. 경구용 제조물은 PEI의 의학적 징후를 치료하기 위한 바람직한 제조물의 예이다.
효소는 꽤 일반적으로는, 물과 같은 수성 용매에, 또는 식물유 또는 기타 유사한 오일, 합성 지방산 글리세리드, 고지방산의 에스테르, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 4000, 또는 저급 알콜, 예컨대 선형 또는 측쇄형 C1-C4 알콜, 예컨대 2-프로판올과 같은 비수성 용매에, 원하는 경우 통상의 보조물질 또는 첨가물, 예컨대 용해제, 보조제, 희석제, 등장화제, 현탁제, 유화제, 안정제, 및 보존제와 함께 용해, 현탁, 또는 유화함으로써, 액체 경구용 제조물로 제형될 수 있다.
또한, 효소는 일반적으로는 유화 염기 또는 수용성 염기와 같은 다양한 염기와 혼합하여 좌약으로 만들 수 있다. 좌약은 체온에서는 녹지만 실온에서는 응고되는 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 베히클을 포함할 수 있다.
전달 비히클로서 리포솜을 사용하는 것은 관심대상의 한 방법이다. 지질은 포스파티딜콜린과 같은 양이온 또는 쌍성이온 지질을 포함한 공지된 리포솜 형성 지질의 어떤 유용한 조합일 수 있다. 나머지 지질은 보통 콜레스테롤, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 글리세롤 등과 같이 중성 또는 산성 지질일 것이다. 리포솜을 제조하기 위하여, Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3361에 설명된 과정이 사용될 수 있다.
각 투여 단위, 예를 들면 티스푼, 테이블스푼의 정제 또는 좌약이 효소의 사전결정된 양을 함유한 시럽, 엑릭시르, 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투여 형태가 제공될 수 있다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 투여 형태는 멸균수, 보통의 식염수, 또는 다른 약학적으로 허용되는 담체 중의 용액과 같은 조성물에 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단위 투여 형태"는 사람 및 동물 피험체에 대하여 단일 투여로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하는데, 각 단위는 희망하는 효과를 만들기에 충분한 양으로 계산된, 본 발명의 화합물의 사전결정된 양을 함유한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 장내 투여를 위한 것이고, 바람직하게는 경구 투여를 위한 것이다.
추가의 구체예에서, 경구용 조성물은 (i) 효소의 결정을 함유하는 액체 조성물; (ii) (고도로) 정제된 효소의 침전물의 액체 현탁액; (iii) 고체 또는 용해된 형태의 효소를 함유하는 겔; (iv) 입자 등에 고정된 또는 흡착된 효소의 액체 현탁액; 또는 (v) 효소 함유 분말, 펠렛, 과립, 또는 미소구체 형태, 원하는 경우 정제, 캡슐 등의 형태의 고체 조성물로서, 임의 선택적으로는 예를 들면 산안정성 코팅된 것이다.
조성물의 또다른 구체예에서, 효소는 구획화되어 있는데, 즉 예를 들면, 분리 코팅에 의해 서로 분리되어 있다.
조성물의 또다른 구체예에서, 프로테아제는 조성물의 다른 효소 성분, 예컨대 리파제, 및/또는 아밀라제와는 분리되어 있다.
효소의 용량은 투여되어야 할 구체적인 효소, 투여 빈도, 투여 방식, 증상의 심한 정도, 및 피험체의 부작용에 대한 감수성 등에 따라 다양하다. 특정 효소 중 일부는 다른 것보다 더 효능이 있을 수 있다.
대표적인 본 발명의 고체 경구용 효소 제조물의 예는 하기 (i) 내지 (iii):
(i)(i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제; (ii) a) SEQ ID NO:5의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제, b) SEQ ID NO:6의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제 및 c) SEQ ID NO:7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 갖는 프로테아제 및/또는 (iii) SEQ ID NO:8의 아미노산 1-269를 갖는 리파제와 적어도 70% 동일성을 갖는 리파제로서; 이 경우 바람직하게는 (i), (ii), 및 (iii)의 효소의 예상되는 1일 임상적 용량은 (모두 체중 kg 당 효소 단백질 mg 단위), (i)의 아밀라제에 대해서는: 0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 또는 0.05-10 mg/kg 체중; (ii)의 프로테아제에 대해서는: 0.005-500, 0.01-250, 0.05-100, 또는 0.1-50 mg/kg 체중; (iii)의 리파제에 대해서는: 0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250, 또는 0.5-100 mg/kg 체중이다.
바람직한 본 발명의 고체 경구용 효소 제조물의 예는 하기를 포함한다: (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제, (ii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274를 포함하는 프로테아제, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 2-269를 포함하는 리파제.
(i), (ii), 및 (iii)의 효소의 예상되는 1일 임상적 용량의 예는 (모두 체중 kg 당 효소 단백질 mg 단위), (i)의 아밀라제에 대해서는: 0.01-50, 0.05-10, 또는 0.1-5 mg/kg 체중; (ii)의 프로테아제에 대해서는: 0.05-100, 0.1-50, 또는 0.5-25 mg/kg 체중; (iii)의 리파제에 대해서는: 0.1-250, 0.5-100, 또는 1-50 mg/kg 체중이다.
아미드 (펩티드) 결합, 아미노 및 카르복시 말단은 경구용 투여에 대해 더욱 큰 안정성을 가지도록 하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들면, 카르복시 말단은 아미드화될 수 있다.
소화장애, PEI, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위해 적당한, 본 발명의 약학적 조성물의 구체예는, 본 발명의 효소를 펠렛내에 혼입함으로서 제조할 수 있다. 펠렛은 일반적으로는 10-90%(w/w, 생성된 펠렛의 건조 중량에 대비한 것)의 생리학적으로 수용가능한 유기 중합체, 10-90% (w/w, 생성된 펠렛의 건조 중량에 대비한 것)의 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체, 및 80-20% (w/w, 생성된 펠렛의 건조 중량에 대비한 것)의 효소를 포함할 수 있는데, 이때 유기 중합체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 및 효소의 총량은 모든 경우 합해서 100%가 된다.
생리학적으로 수용가능한 유기 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 1500, 폴리에틸렌 글리콜 2000, 폴리에틸렌 글리콜 3000, 폴리에틸렌 글리콜 4000, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 폴리에틸렌 글리콜 8000, 폴리에틸렌 글리콜 10000, 폴리에틸렌 글리콜 20000, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌의 공중합체 및 상기 유기 중합체의 혼합물로 구성되는 군 중에서 선택될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 4000이 생리학적으로 수용가능한 유기 중합체로서 바람직하다.
셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체는 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 지방산 에스테르, 셀룰로스 니트레이트, 셀룰로스 에테르, 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 메틸 에틸셀룰로스 및 메틸하이드록시프로필 셀룰로스 중에서 선택될 수 있다. 셀룰로스, 특히 미세결정질 셀룰로스가 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체로서 바람직하다.
생성된 펠렛은 적당한 장내 코팅, 다른 비작용성 코팅으로 코팅될 수 있거나, 이러한 코팅 없이 곧바로 사용될 수도 있다. 또한, 생성된 펠렛은 경질 젤라틴 캡슐과 같은 캡슐에 채워질 수 있거나, 상기에 자세히 언급한 질환이나 질병의 치료에 적합한 크기의 무젤라틴 캡슐에 채워질 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 상이한 효소 유형으로부터, 구체적으로는 리파제, 프로테아제 및/또는 아밀라제로부터 제조된 펠렛은 상기의 캡슐에 채워질 수 있다. 캡슐을 상이한 효소 유형으로 채울 것이지만, 각 효소 유형의 용량(즉, 리파제, 프로테아제, 또는 아밀라제)은 특정한 군이 필요로 하는 특정 요구에 따라, 또는 특정한 환자의 하위군에 따라, 리파제, 프로테아제 및/또는 아밀라제 중 임의의 특정한 양을 캡슐에 첨가함으로써 변형시킬 수 있는데, 즉 캡슐은 리파제: 프로테아제: 아밀라제의 특정 비율을 다양화하여 제조될 수 있다.
본 발명의 리파제의 바람직한 약학적 조성물은 WO 2005/092370에 기술되어 있는데, 특히 바람직한 경과를 포함하는 제형물이 기술되어 있다. 더욱 구체적인 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 모노-, 디- 및 트리- 아실글리세리드 및 지방산 C6-C22 카르복실산의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모노- 및 디-에스테르의 마이크로골글리세리드 혼합물을 포함하며, 또한 가능하게는 작은 비율의 글리세롤 및 유리 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
마크로골글리세리드 혼합물에 함유된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 바람직하게는 분자당 평균 6 내지 최대 40 에틸렌 옥사이드 단위체와, 200 내지 2000 사이의 분자량을 갖는 PEG이다.
본 발명의 추가의 측면은 표면활성제, 공동-표면활성제 및 친지질성 상으로 구성되는 시스템을 포함하기 위한, 본 발명의 효소의 약학적 조성물을 제공하는데, 이 시스템은 10 이상의 HLB값(친수성-친지질성 균형)을 갖고, 30℃ 이상의 융점을 갖는 시스템이다. 바람직한 구체예에서, 시스템은 10 내지 16, 바람직하게는 12 내지 15의 HLB 값을 가지며, 30 내지 600℃, 바람직하게는 40 내지 500℃의 융점을 가진다. 구체적으로는, HLB값 및 융점에 의해 특징지워지는 시스템은 8 내지 20개, 바람직하게는 8 내지 18개 탄소 원자를 갖는 지방산 카르복실산과, 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 모노- 및 디에스테르의 혼합물인데, 여기에서, 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게는 분자당 약 6 내지 32개의 에틸렌 옥사이드 단위체를 가지고, 시스템은 임의선택적으로는 유리 글리세린 및/또는 유리 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다. 이러한 시스템의 HLB값은 바람직하게는 PEG의 사슬 길이를 통해 조절한다. 이러한 시스템의 융점은 지방산의 사슬 길이, PEG의 사슬 길이, 지방산 사슬의 포화도 정도를 통해, 즉 결과적으로 마크로골글리세리드 혼합물의 제조를 위한 출발 오일을 통해 조절한다.
"지방산 C8-C18 카르복실산"은 카프릴산(C8), 카프르산(C10), 라우르산(C12), 미리스트산(C14), 팔미트산(C16) 및 스테아르산(C18)이 상당량, 다양한 비율로 함유된 혼합물을 말하는 것이고, 이러한 산이 포화된 경우에는 해당하는 불포화 C8-C18 카르복실산을 말하는 것이다. 이러한 지방산의 비율은 출발 오일에 따라 다양할 수 있다.
이러한 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 모노- 및 디에스테르와, 8 내지 18 탄소 원자를 갖는 지방족 카르복실산의 혼합물은 예를 들면, 200 내지 1500 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 출발 오일과 반응시킴으로써 수득할 수 있으며, 출발 오일은 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀렌산 각각, 또는 이의 혼합물을 함유하는 군 중에서 선택되는 지방산을 갖는 트리글리세리드 혼합물로 구성된다. 임의선택적으로는 이러한 반응 산물은 작은 비율의 글리세린 및 유리 폴리에틸렌 글리콜을 함유할 수도 있다.
이러한 혼합물은 예를 들면 Gelucire® 라는 상표명으로 시판중이다. 본 발명중 하나의 유리한 구체예에서는, 상표명 Gelucire®로 알려진 제품 중에서도 특히 "Gelucire® 50/13" 및/또는 "Gelucire® 44/14"가 본 발명에 따른 약학적 제조물에 사용하기에 적합한 대표적인 혼합물이다.
Gelucire® 50/13은 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르와 40 내지 50%, 및 48% 내지 58%의 팔미트산(C16) 및스테아르산(C18)을 포함하고, 각각은 결합한 지방산의 주요 비율을 구성한다. 카프릴산(C8) 및 카프르산(C10)의 비율은 각 경우에 3% 미만이고, 라우르산(C12) 및 미리스트산(C14)의 비율은 각 경우에 5% 미만이다.
Gelucire® 44/14는 모노-, 디- 및 트리아실글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르의 혼합물인데, 팔미트산(C16)의 비율은 4 내지 25%, 스테아르산(C18)의 비율은 5 내지 35%, 카프릴산(C8)의 비율은 15% 미만, 카프르산(C10)의 비율은 12% 미만, 라우르산(C12)의 비율은 30 내지 50%, 및 미리스트산(C14)의 비율은 5 내지 25%이다. Gelucire® 44/14는 예를 들면, 팜 커널 오일 및 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 알콜분해/에스테르화 반응을 통해 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는 모노-, 디- 및 트리아실-글리세리드 및 지방족 C8-C18 카르복실산의 폴리에틸렌 글리콜 모노- 및 디에스테르, 및 가능하게는 작은 비율의 글리세린 및 유리 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물을 함유하는 시스템을 포함하는 본 발명의 효소의 약학적 조성물을 제공하는데, 여기에서 시스템은 40 내지 55℃의 융점을 가지고, 12 내지 15 사이 범위의 HLB값을 가지는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 시스템은 44 내지 50℃의 융점을 가지고, 13-14 범위의 HLB값을 가진다. 또는 달리, 시스템은 약 44℃의 융점을 가지고, 14의 HLB값을 가지거나, 또는 시스템은 약 50℃의 융점을 가지고 13의 HLB값을 가진다.
치료 방법
본 발명의 아밀라제, 임의선택적으로는 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된 아밀라제(본 발명의 효소)는 동물의 각종 질병이나 질환의 치료적, 및/또는 예방적 치료에서 유용하다. 용어 "동물"은 모든 동물을 포함하는 것이고, 특히 인류를 포함하는 것이다. 동물의 예로는 비반추동물, 및 반추동물, 에컨대 양, 염소 및 소, 예를 들어 축우, 및 암소가 있다. 하나의 구체예에서, 동물은 비반추동물이다. 비반추동물에는 단위(mono-gastric) 동물, 예를 들어 돼지(한정하는 것은 아니지만, 새끼돼지, 성장한 돼지 및 암퇘지 포함); 가금류, 에컨대 칠면조, 오리 및 닭(한정하는 것은 아니지만, 브로일러용 닭, 알낳는 닭 포함); 어린 송아지; 고양이 및 개와 같은 애완 동물; 및 물고기(한정하는 것은 아니지만 연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어 포함); 및 갑각류(한정하는 것은 아니지만 새우 및 참새우 포함)가 있다. 하나의 구체예에서 동물은 포유류이고, 더욱 구체적으로는 인간이다.
예를 들어, 효소는, 일반적으로는 위나 췌장으로부터 보통 분비되는 소화 효소의 생성 결핍 및/또는 위장관으로의 분비에 의해 종종 유발되는 소화불량이나 소화불량증과 같은 소화장애의 치료에 유용하다.
또한, 효소는 특히 PEI의 치료에 유용하다. PEI는 Borgstrom 테스트(JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5):116-125)를 사용하여 평가할 수 있는데, 이는 췌장암, 췌장 및/또는 위장 수술, 예를 들면, 췌장 전체 또는 일부 절제술, 위절제술, 후 위장우회술(예를 들면 Billroth II 위장절제술); 만성 췌장염; Shwachman Diamond 증후군; 췌장 또는 공통 담즙선의 폐색증(예를 들면, 종양으로부터의); 및/또는 낭포성 섬유증(두꺼운 근육이 췌장의 관을 막는 선천성 질병)과 같은 질병이나 증상에 의해 유발될 수 있다. 효소는 또한 급성 췌장염의 치료에도 유용할 수 있다.
소화장애에 대한 효소의 효과는 일반적으로는 EP　0600868에 기재된 바와 같이 측정할 수 있는데, 즉 이의 실시예 2는 위장내 조건하에 리파제 안정성을 측정하기 위한 인 비트로 소화능력 시험을 개시하고 있고, 이의 실시예 3은 담즙염의 존재하에 리파제 활성을 측정하기 위한 인 비트로 소화능력 시험을 개시하고 있다. 프로테아제 및 아밀라제에 대해서도 해당 시험을 구상할 수 있다. 또한 WO 02/060474는 예를 들면, (1) 스와인 시험용 사료내 지질 소화를 측정하기 위한 인 비트로 시험을, (2) 지방, 단백질 및 녹말의 소화능력을 측정하는 췌장 이상이 있는 스와인에 대한 인 비보 시험 등의 적당한 시험들을 개시하고 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 아밀라제의 효과는 완전한 실시예 2의 아밀라제 효과에 대한 인 비보 스크리닝 테스트를 사용하여 측정할 수 있다.
다른 예로서, 효소는 제1형 및/또는 제2형 당뇨병의 치료, 특히 후기 복합증을 감소시키기 위한 측면에서, 이러한 질병에 보통 수반되는 소화장애의 당뇨병 치료에 있어 보조 치료를 위해 유용하다.
효소의 당뇨병에 대한 효과는 WO 00/54799에 기술된 하나 이상의 방법을 사용하여 결정할 수 있는데, 예를 들면, 당화 헤모글로빈의 수치, 혈액내 글루코스 수치, 저혈당 쇼크, 비타민 A, D 및 E와 같은 지용성 비타민의 수준, 하루에 요구되는 인슐린 양, 체중, 및 고혈당의 기간 등을 조절함으로써 가능하다.
본원에 개시하고 청구한 것은 본원에 기재된 특정한 구체예로 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아닌데, 왜냐하면 이러한 구체예들은 본 발명의 여러 측면들을 상세히 설명하고자 하는 것이기 때문이다. 임의의 동등한 구체예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 하고자 한다. 결국, 본원에 제시되고 설명된 것 뿐 아니라, 본 발명의 변형도 당업자라면 전술한 범위내에 속함을 명백히 알 것이다. 이러한 변형 또한 첨부되는 청구의 범위의 범위내에 속하는 것으로 의도하고자 한다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 개시를 참고해야 할 것이다.
본원에 언급된 각종 참고문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 인용되는 것이다.
실시예 1: 효소 분석방법
아밀라제, 프로테아제 및 리파제 활성은 FIP 분석방법(Federation Internationale Pharmaceutique)을 사용하여 측정할 수 있다. 1 FIP-유닛 = 1 Ph.Eur.-유닛 (European Pharmacopoeia). 분석방법은 예를 들면, Federation Internationale Pharma-ceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes. a) "Pharmaceutical enzymes", Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia에 기술되어 있다. 참조: Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385. 효소 표준은 하기로부터 획득할 수 있다: International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent.
아밀라제 FIP 분석방법
췌장효소의 녹말분해 활성은 FIP에 의해 제공되는 췌장효소 표준에 대해 European Pharmacopoeia 5.1에 공개된 방법에 따라 분석하였다. 본 발명에 따른 용도를 위한 아밀라제의 녹말분해 활성을 측정하기 위해, FIP에 의해 기술된 미생물 아밀라제의 녹말분해 활성에 대한 분석방법을 변형시켰다. 기본적으로 녹말은 pH 5.8 및 일정한 온도(37 +/- 0.1℃)에서 염화나트륨 및 염화칼슘의 존재하에 아밀라제에 의해 가수분해된다. 가수분해에서 유래한 환원기는 알칼리성 용액에서 요오드와 반응하고 과량의 요오드는 티오설페이트로 적정한다. 아밀라제 한 유닛은 정해 진 조건 및 기질 하에서 1분당 1 마이크로몰의 글리코시딕 결합을 가수분해하는 효소의 양으로 정의된다.
시약
기질 용액: 기질은 가용성 녹말(예를 들면, Merck, No. 101252)이다. 가용성 녹말의 각 배치의 수분 함량은 용기를 개봉하자 마자 측정한다. 건조한 기질 10.0 g과 동등한 가용성 녹말의 양에 50 mL의 순수한(여과/이온교환)물을 첨가하고 혼합한다. 계속 저어주면서 이 현탁액에 끓고있는 순수한 물 800 mL를 첨가한다. 각각 10 mL씩의 물로 용기를 여러번 헹구고 뜨거운 녹말 용액에 세척수를 첨가한다. 계속 저어주면서 끓을 때까지 가열한다. 실온까지 냉각시키고 100 mL의 순수한 물로 희석시킨다.
완충액(아세테이트) 용액 pH 5.8(0.2 몰/L): 12 g의 아세트산, 1 g의 염화나트륨 및 544 mg의 염화칼슘을 약 800 mL의 물에 용해시킨다. 수산화나트륨 용액( 약 10 N)을 사용하여 pH를 5.8로 조정한다. 1000 mL까지 희석시킨다.
아세트산, CH3COOH, p.a.
염화나트륨, NaCl, p.a.
염화칼슘 x 2 H2O, p.a.
0.25 N 염화나트륨
1 N 염산
0.1 N 요오드 용액 (예를 들면 Titrisol (Merck 9910), 순수한 물에 희석시 킨 것)
0.1 N 나트륨 티오설페이트 용액
황산 (p.a.) 20 %: 4 용적부의 물에 1 용적부의 황산 96%를 조심스럽게 첨가한다.
진균류 아밀라제 기준 표준 FIP(Batch No. 2; 55310 FIP-U/g, 염화칼슘 없이 25℃).
정량(Quality) 대조군 현탁액(진균류 아밀라제 기준 표준): 티오설페이트의 적정(titration) 용적을 산출하도록, 즉 2 내지 4 mL를 산출하도록 정확히 중량을 잰 기준 표준을 용해시켰다(예를 들면, 진균류 아밀라제 표준 약 12-15 mg을 재서 100 ml 완충액에 용해시킨다). 정량 대조군 현탁액은 시험 시스템의 매일 모니터링에만 사용하였다.
시험용 현탁액: 티오설페이트의 적정 용적을 산출하도록, 즉 2 내지 4 mL를 산출하도록 정확히 중량을 잰 시험용 샘플을 용해시켰다.
절차
시험용 샘플: 각각의 측정을 위해서, 25.0 mL의 기질 용액 및 10.0 mL의 0.2 M 아세테이트 완충액을 함유하는 반응 용액을 300 mL Erlenmeyer 플라스크에 만들었다. 고무 마개로 막고 일정한 온도(37.0 +/- 0.1℃)에 있는 수조에 이를 배치하였다. 기질 혼합물이 일정 온도에 이르자마자, 시험용 현탁액 2.0 mL를 첨가함으로써 반응을 시작시켰다. 간단히 교반하고 정확히 10분 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. 4 mL의 염산을 즉시 첨가하여 반응을 중지시켰다. 10 mL의 0.1 N 요오드 용 액을 교반하며 첨가하면서, 25 mL의 0.25 N 수산화나트륨과 벽을 세정하기 위한 순수한 물 20 mL를 첨가하였다. 혼합물을 완전한 암소에 15분간 방치하였다. 황산 4mL를 첨가하고 마이크로뷰렛을 사용하여 나트륨 티오설페이트로 용액을 적정하였다. 2회 측정한 값의 평균을 계산하였다.
정량 대조군 샘플: 시험용 샘플에 대해 기술한 바와 같이 정량 대조군 현탁액의 활성을 2회 측정하였다. 참조 현탁액 2.0 mL를 사용하였다.
블랭크(blank) 값: 시험용 및 기준 현탁액의 블랭크 값을 만들었다. 상기와 같이 실시하되, 단 시험 용액 및 참조 용액을 첨가하기 전에 1 N 염산 4 mL를 첨가하는 것을 달리하여 상기의 절차를 반복하였다.
하기의 방정식을 사용하여 시험용 샘플 g당 유니트의 아밀라제 활성을 계산하였다:
Figure 112007091276680-PCT00002
nU: 시험용 현탁액의 적정에 사용되는 0.1 N 나트륨 티오설페이트의 소모량[mL]
nUB: 시험용 현탁액의 블랭크 적정에 사용되는 0.1 N 나트륨 티오설페이트의 소모량[mL]
모니터링 샘플(진균류 참조 샘플)의 측정된 활성은 97500 U/g이고, 평균 범위 +/- 3 x 표준편차, 구체적으로는 +/- 6000 U/g 범위이다.
아밀라제
대안적으로는, 하기의 아밀라제 분석방법이 사용될 수도 있다:
기질: Phadebas 정제(Pharmacia Diagnostics; 교차결합된, 불용성의, 청색 녹말 중합체, 이것은 소 혈청 알부민 및 완충액 기질과 혼합한 다음에, 정제로 제조한 것이다)
분석 온도: 37℃
분석 pH: 4.3 (또는 원하는 경우 7.0)
반응 시간: 20 분
물에 현탁시킨 다음에 녹말을 알파-아밀라제로 가수분해하면, 용해성의 청색 단편이 생긴다. 생성된 청색 용액의 620 nm에서 측정한 흡광도는 알파-아밀라제 활성의 함수가 된다. 1 진균류 알파-아밀라제 유닛(1 FAU)은 표준 분석 조건 하에 시간당 5.26 g 녹말(Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275)을 파괴하는 효소의 양이다. 더욱 상세한 분석 설명서 APTSMYQI-3207는 요청시 덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스에서 구할 수 있다.
리파제
기질: 파라-니트로-페닐 (pNP) 발레레이트
분석 pH: 7.7
분석 온도: 40℃
반응 시간: 25분
황색의 소화 산물은 405 nM에서 특징적인 흡광도를 가졌다. 그 양을 분광계 로 측정하였다. 1 리파제 유닛은 소정의 분석 조건 하에서 1분당 1 마이크로몰의 적정가능한 부티르산을 방출하는 효소의 양을 말한다. 더욱 상세한 분석방법 설명서 AF95/6-GB은 요청시 덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스로부터 구할 수 있다.
프로테아제
기질: Suc-AAPF-pNA (Sigma®S-7388).
분석 완충액: 100mM 숙신산, 100mM HEPES (Sigma H-3375), 100mM CHES (Sigma C-2885), 100mM CABS (Sigma C-5580), 1mM CaCl2, 150mM KCl, HCl 또는 NaOH로 pH 9.0으로 조정된 0.01% Triton®X-100.
분석 온도: 25℃
300 ㎕의 희석된 프로테아제 샘플을 1.5 ml의 분석 완충액과 혼합하고, 1.5ml pNA 기질 (1.0ml DMSO에 용해시킨 50mg이고, 0.01% Triton®X-100을 사용하여 45배 추가로 희석시킨 것)을 첨가함으로써 활성 반응을 시작시켰고, 혼합 후에, 프로테아제 활성의 측정값으로서 분광기에 의해 A405 의 증가를 모니터링하였다. 모든 활성 측정값이 분석방법에 대한 용량-반응 곡선의 직선 부분에 포함되도록 하기 위하여, 활성 측정을 하기에 앞서 프로테아제 샘플을 희석시켰다.
실시예 2: 아밀라제 효능에 대한 인 비보 스크리닝 시험
SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486, SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483의 정제된 Bacillus 아밀라제를, SEQ ID NO: 1-3 중 임의의 하나와 50% 이하 동일한 Aspergillus oryzae 유래 정제된 진균류 아밀라제와 함께, 암컷 Gottinggen 미니피그(Ellegaard)에서 시험하였다. [Tabeling et al., J.1999, Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution, J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263(이하, "Tabeling 1999"라 함); 및 Gregory et al., J. 1999. Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (SG Pierzynowski & R. Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393(이하, "Gregory et al., J. 1999라 함)]에 기술된 바와 같이, 췌장관을 연결함으로써 미니피그에 췌장 외분비 부족증(PEI)을 유발시키고, 이들을 ileo-caecal re-entrant 캐뉼라에 장치한 다음, 할로탄 전신마취하였고, 체중은 약 25 kg이었다. 연구를 시작하기 전에, 적어도 4주간은 수술에서 회복되도록 하였다. 연구를 시작하기에 앞서, 도구 키모트립신 시험(Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany에서 판매하는 것으로서 카탈로그 번호 K 6990)을 통해 각 피그의 PEI 상태를 확인하였다.
연구 동안에, 피그들은 12:12 시간으로 밤낮 주기가 반복되는 펜스 안에서 물을 자유롭게 공급하고 하루 두끼의 급식을 하며 키웠다. 15.4% 단백질, 69% 녹말, 및 2.1% 지방을 함유하는 시험용 식사는 g/100 g 건조 물질 단위의 하기 조성을 가지는 것이었다: 가금류고기 가루 7.1; 물고기가루 2.45; 카세인 4.1; 밀가루 20.65; 껍질을 벗긴 쌀 9.8; 감자 녹말 7.7; 옥수수 녹말 39.8; 셀룰로스 분말 3.0; 비타민 5.3(영양요구표에 따른 것). 피그에는 1 리터의 물, 0.625 g Cr2O3과 혼합한 250 g의 시험용 식사를 공급하였으며, 여기에는 아밀라제의 상이한 양(0, 7500, 18750, 90000 FIP U 아밀라제/식사 (실시예1 참조))을 공급하기 직전에 혼합하였다.
회장내에 식사 마커가 처음 등장(녹색 유미즙)한 지 총 6시간 후에 회장 유미즙을 모으고, 모은 직후 -20℃에서 얼려서 샘플이 박테리아에 의해 발효되는 것을 피하도록 했다. 각각의 결정 사이에는 적어도 하루의 세척 기간을 두었다.
냉동된 샘플을 동결건조시키고, 분쇄하고, 건조 물질(DM) 및 녹말에 대해 분석하였다. DM은 동결건조시킨 후 중량을 잰 다음 103℃에서 8시간 인큐베이션함으로써 측정하였다; 녹말은 산 가수분해 후 분석하였으며 당은 중량을 재어 추정하였다. Cr2O3는 크롬산염으로 산화되고, 크롬 함량은 [Petry and Rapp in Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189]에 기술되어 있는 바와 같이, 365 nm에서 흡광도를 측정하는 것에 의해 결정할 수 있다.
소화능력:
외견상의, 사전계산한 녹말의 소화능력은 하기 식에 따라 계산한 것이었고, 여기에서 Cr2O3 및 녹말은 g/100 g 건조 물질로서 표현하였다:
외견상의 소화능력 (%)
= 100 - [ 급식 중의 Cr 2 O 3 %. 샘플 중의 녹말 % .100]
[ 샘플 중의 Cr2O3 % . 급식 중의 녹말 % ]
외견상의 녹말 소화능력의 결과는 하기 표 1에 제시한다.
효소 보충제 0 효소 7500 FIP U 18750 FIP U 90000 FIP U
보충제 없음 44.9 +/- 7.6
췌장효소 64.1 +/- 15.2 76.7 +/- 13.2 97.2 +/- 2.2
SEQ ID NO: 1의 아밀라제 87.2 +/- 4.3 95.4 +/- 1.6 96.4 +/- 3.0
SEQ ID NO: 3의 아밀라제 89.0 +/- 6.8 92.5 +/- 3.8 96.8 +/- 2.6
SEQ ID NO: 2의 아밀라제 93.9 +/- 8.4 93.4 +/- 6.8 96.7 +/- 2.6
Aspergillus oryzae amylase 49.0 +/- 16.2 52.6 +/- 7.5 59.9 +/- 12.5
모든 값은 평균 ± SD이다
표 1의 결과로부터, 공지된 Aspergillus oryzae 아밀라제 및 공지된 췌장효소 제조물보다 훨씬 더 본 발명의 아밀라제의 경과가 좋음이 명백하다. 본 발명의 아밀라제는 녹말 소화능력에 대해 강하고 용량 의존적인 개선을 불러일으켰으며, 이미 가장 낮은 시험된 용량에서 매우 효과적인 개선을 보인 바 있다.
실시예 3: 담즙 염의 존재 또는 부재하에서 아밀라제 pH 프로파일
PEI 및 관련 질병의 치료에서의 용도를 위해서는 췌장효소 대체 효소가 약 pH 6-7(전형적인 소장 상부의 조건)에서 고활성을 가지는 것이 바람직하다. 이 실험은 4가지 알파-아밀라제, 즉 3가지의 본 발명의 박테리아 아밀라제 및 기존의 진균류 Aspergillus oryzae 아밀라제의, 첨가된 담즙염의 존재 또는 부재하에서의, pH 프로파일을 결정하는 역할을 한다.
재료 및 방법
효소
본 연구에 사용하기 위한 아밀라제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486("SEQ 1"), SEQ ID NO: 2 의 아미노산 1-481("SEQ 2"), 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483("SEQ 3")의 정제된 Bacillus 아밀라제와, 대조를 위한 Aspergillus oryzae 유래 정제된 진균류 아밀라제("A. oryzae")인 시판되는 FungamylTM 아밀라제 제품인 아밀라제였다(덴마크 디케이-2880 박스에바르드 크록쇼이베이 36 소재, 노보자임스 에이/에스 제품).
pH -프로파일-환원당 분석방법
효소 완충액: 50 mM 아세테이트, 50 mM 이미다졸, 50 mM 말론산, 1 mM CaCl2, 0.01% Triton X-100. HCl/NaOH로 pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 또는 7.0으로 조정.
기질 완충액:
1.5 mg/ml 아밀로펙틴 (왁시 옥수수, 예를 들면 Cerestar사의 Waxy corn 04201, batch WM5671), 50 mM 아세테이트, 50 mM 이미다졸, 50 mM 말론산, 1 mM CaCl2. HCl/NaOH로 희망하는 pH(상기와 같음)로 조정하였다. 100℃에서 5분간 인큐베이팅한다. 기질 완충액을 5 mM 담즙염의 존재하에 또는 부존재하에 만들었다(즉, Ph.Eur 또는 FIP에서 시판되는 Sodium taurocholate BRP, lot 2,, 또한 예를 들면 LGC promochem, 500g/mol에서 시판되는 제품).
아밀라제 활성은 환원 당 분석방법에 의해 검출하였다. 간단히 말하면, 50 ㎕ 효소(분석의 직선 범위내에 떨어지도록 효소 완충액으로 희석한 것)를 PCR-MTP(Thermo-Fast®96, ABgene, cat. no. AB-0600)에서 100 ㎕ 기질 완충액과 혼합하였다. MTP를 37℃에서 15분간 인큐베이팅한 후에, 75㎕ 중단 용액(100 mM p-하이드록시-벤조산 히드라자이드, 180 mM K-Na-타르트레이트, 2% NaOH)을 첨가한 다음, 플레이트를 95℃에서 10분간 인큐베이팅하였다. 그 다음에 각 웰 중 150 ㎕를 96-웰-MTP에 옮기고, 410 nm에서의 흡광도를 아밀라제 활성의 측정치로서 모니터링하였다.
결과
결과(2회 측정한 것의 평균)를 하기의 표 2-4에 제시한다.
표 2는 담즙 염의 부재하에 지정된 pH에서 각 효소의 활성을 제시한 것이다. 각 효소에 대해서 최대의 활성은 100%로 맞추었다.
표 3은 표 2와 동일하지만, 다만 5mM 담즙 염의 존재만이 다른 것을 제시한다.
표 4는 이 실험에서 측정된 최대 효소 활성인, pH 5.0에서 SEQ 1 효소의 활성(100%)에 비교한, 담즙 염의 부재하에 지정된 pH에서 효소 단백질 mg당 각 효소의 활성을 제시한 것이다. 이에 따라 각 효소의 활성은 이 활성에 비교하여 정규화되었다. 각 효소에 대한 효소 단백질의 양은 특이적 활성을 기준으로 측정하였다.
표 5는 표 4와 동일하지만, 5 mM 담즙 염의 존재만이 다른 것을 제시한다. 여기에서 5 mM 담즙 염의 존재하에 pH 5.0에서 SEQ 1 효소의 활성은 기준값(100%)에 대한 상대값이다.
담즙염의 부재하에 상대적 활성
효소 / pH 2 3 4 5 6 7
A. oryzae 0.0 0.0 77.4 93.4 100.0 25.6
SEQ 2 0.4 0.2 7.8 51.8 100.0 76.1
SEQ 3 0.3 0.8 2.8 22.2 79.7 100.0
SEQ 1 0.1 1.8 29.4 100.0 86.0 71.1
담즙염의 존재하에 상대적 활성
효소 / pH 2 3 4 5 6 7
A. oryzae 0.0 0.0 53.5 71.8 68.6 16.1
SEQ 2 0.1 0.0 0.5 37.5 85.8 66.1
SEQ 3 0.0 0.0 0.8 2.5 61.4 78.1
SEQ 1 0.0 0.0 10.4* 76.0 68.6 59.7
*하나의 측정값은 명백한 오류여서 취하지 않았다.
담즙염의 부재하에 SEQ 1에 대해 정규화된 절대적 활성
효소 / pH 2 3 4 5 6 7
A. oryzae 0.0 0.0 10.9 13.2 14.1 3.6
SEQ 2 0.1 0.1 2.1 14.0 27.1 20.6
SEQ 3 0.1 0.4 1.4 10.7 38.3 48.0
SEQ 1 0.1 1.8 29.4 100.0 86.0 71.1
담즙염의 존재하에 SEQ 1에 대해 정규화된 절대적 활성
효소 / pH 2 3 4 5 6 7
A. oryzae 0.0 0.0 9.9 13.3 12.7 3.0
SEQ 2 0.0 0.0 0.2 13.4 30.6 23.6
SEQ 3 0.0 0.0 0.5 1.6 38.8 49.3
SEQ 1 0.0 0.0 13.7 100.0 90.2 78.6
이러한 결과들은 담즙염은 아밀라제 활성을 약간 감소시키지만, 5mM 담즙 염의 존재하에 활성은 여전히 만족스러운 정도라는 것을 제시한다. 이러한 결과들은 또한 담즙 염은 최적 pH로 이동하는 것을 유도하지 않는다는 것을 제시한다.
결과들은 또한, 본 발명의 Bacillus 아밀라제 각각이 pH 7에서 50% 이상의 상대적 활성을 가지지만, 이것은 대조군인 진균류 아밀라제의 경우에는 그러하지 아니하다는 것을 제시한다.
마지막으로 표 4 및 5는, 적어도 이러한 조건하에서는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486을 갖는 아밀라제는 시험된 다른 모든 아밀라제보다 효소 mg당 상당히 높은 활성을 가진다는 것을 증명한다.
실시예 4: 아밀라제 파괴 프로파일
5가지 알파-아밀라제의 파괴 프로파일(DP1-10 정량적 핑거프린트)을 왁시 옥수수 녹말의 파괴 및 이에 이은 HPLC상의 분석에 의해 측정하였다.
재료 및 방법
SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486("SEQ 1"), SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481("SEQ 2") 및 SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483("SEQ 3")의 정제된 Bacillus 아밀라제, 및 대조를 위한, Aspergillus oryzae 유래 정제된 진균류 아밀라제("A. oryzae")로서, 후자는 시판되는 FungamylTM 아밀라제 제품이고, 덴마크 디케이-2880 박스바에르드 크록쇼이베이 36 소재 노보자임 에이/에스로부터 구입가능한 것이었다. 췌장효소는 솔베이 파마슈티컬 제품이었다.
기질로서, 50 mg/mL 왁시 옥수수 녹말(예를 들면 Cerestar사의 Waxy corn 04201, 배치:WM5671)의 슬러리를 50 mM Na-아세테이트 완충액 pH 6.0, 40 ppm Ca2 +에서 만들었다.
정제된 효소를 반응 혼합물 중 건조 물질 g당 효소 단백질 0.0073 mg의 농도로 투여하였다. 아밀라제 효소 단백질의 양은 [S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989)]에 개괄설명된 바와 같이, A280 값 및 아미노산 서열(아미노산 조성)을 근거로 하여 계산하였다. 효소를 투여한 다음에, 반응을 60℃에서 인큐베이팅하였다. 분취액을 24시간 후에 취하고, 탈염수로 1:1 희석한 다음에, 1 M HCl을 두방울 첨가하였다. 효소를 15분 후에 끓여서 비활성화시켰다. 샘플을 용리액으로서 물을 사용하는, 연속하여 연결된 두개의 Aminex HPX 42A (Biorad) 컬럼이 장치된 HPLC에 적용하기 전에 0.2 ㎛ 필터에 여과시켰다.
100 mg의 췌장효소를 10 mL의 50 mM Na-아세테이트 완충액 pH 5.5에 용해시켰다. 20 ㎕의 이 용액을 1 mL 기질 슬러리(50 mM Na-아세테이트 pH 5.5 중의 50 mg/mL 왁시 옥수수 녹말)에 첨가하고, 24시간 동안 37℃에서 인큐베이팅한 다음, 비활성화시키고, HPLC에 적용하기 전에 상기 설명한 바와 같이 여과하였다.
별개의 실험(제시하지는 않음)에서, "SEQ 1" 아밀라제는 37℃에서 시험되었고, 이 때 60℃에서와 동일한 파괴 프로파일을 일으켰다.
결과
인큐베이션한 24시간 후의 생성된 크로마토그램을 도 1-5에 제시하였으며, 이 때 화합물은 크로마토그램에서의 피크로 표시하였다. 명확히 하기 위하여, 이 표시는 도 1에만 삽입하였지만, 이들은 다른 도면에서도 필요한 변경을 가하여 적용될 수 있는 것이다. DP는 중합화 정도를 나타낸다. 그러므로, DP1은 단량체, DP2는 이량체, DP3은 삼량체, DP4는 사량체, DP5는 오량체, DP6는 육량체 등을 나타낸다.
도면에서, 진균류 알파-아밀라제("A. oryzae")는 주요 파괴 산물로서 DP2, DP3 및 DP4를 만들지만, 큰 비가수분해된 분획을 남긴다(10분의 정체 시간에서 큰 피크). DP1은 파괴 산물로서 검출되지 않았다.
반면 박테리아 알파-아밀라제("SEQ 1", "SEQ 2", "SEQ 3")는 일반적으로 주요 산물로서 DP1, DP2, DP3 및 DP5 또는 DP6 중 하나를 생성시키고, 소량의 비가수분해된 기질을 남겼다. 일반적으로 소량의 DP4가 생성되는 것으로 보인다.
췌장효소가 관여하는 한, 상기의 진균류 및 박테리아 아밀라제의 혼합물과 같이 행동할 것으로 보이는데, 즉 소량의 DP 생성물((DP1, DP2 및 DP3)을 만들고, DP4, DP5 및 DP6는 거의 생성시키지 않으며, 오로지 소량의 비가수분해된 기질 피크만을 만드는 것이 그것이다.
실시예 5: 약학적 아밀라제 조성물
(A) 고강도 펠렛
SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-486의 아미노산을 갖는 아밀라제의 무균여과된 농축액을 DK 2005 00931에 기술된 바와 같이 제조하였다. 액체 농축물을 방사건조시켰다. 방사건조된 아밀라제 분말의 정제된 아밀라제 단백질 함량은 37%였다. 1125 g의 방사건조된 아밀라제 분말을 미세결정질 셀룰로스(450 g) 및 폴리에틸렌 글리콜 4000((MacrogolTM4000; 675 g)과 함께 시판중인 믹서기내에서 건식으로 미리혼합하였다. 이소프로필 알콜(460 g; 100%)을 첨가한 다음에, 생성된 축축한 덩어리를 실온에서 완전히 혼합될 때까지 계속 혼합하였다. 균질화된 덩어리를 이어서 시판되는 압출기에서 압출하는데, 이 압출기는 0.8 mm의 구멍 직경을 가지는 천공 다이를 가진 것으로 원통 모양의 펠렛을 형성하는 것이다. 압출되는 동안의 비드 온도는 50℃를 넘지 않게 하였다. 생성된 압출물을 시판되는 스페로나이저(spheronizer)를 사용하여 필요한 양만큼의 이소프로필 알콜 100%(54.5 g)을 첨가함으로써 구형 펠렛으로 둥글게 만들었다. 펠렛은 시판되는 진공 건조기(Voetsch사의 것)에서 대략 40℃의 생성 온도에서 건조시켰다. 생성 온도는 45℃를 넘지 않게 하였다. 이어서 건조된 펠렛을 0.7 내지 1.4 mm 스크린을 사용하여 기계적 체를 사용하여 분리하였다. ≥0.7 mm 및 ≤1.4 mm 스크린의 체에 걸러내린 것을 모으고 크기 2의 캡슐에 각 펠렛 200 mg 중 일부를 채웠다. 생성된 건조 펠렛의 아밀라제 농도는 대략 18.5%(w/w)였다.
(B) 저강도 펠렛
상기 (A)에 제공된 실시예와 유사하게, 저함량의 아밀라제를 갖는 펠렛을, 562.5 g의 방사건조된 아밀라제 분말, 미세결정질 셀룰로스 (1125 g), 폴리에틸렌 글리콜 4000(562.5 g), 습윤을 위한 이소프로필 알콜(700 g) 및 동그랗게 만들기 위한 이소프로필 알콜(41.6 g)을 사용하여 제조하였다. 생성된 건조 펠렛의 아밀라제 농도는 대략 9.3%(w/w)였다.
실시예 (A) 및 (B)로부터의 생성된 펠렛을, 미생물 아밀라제에 맞게 변형된 FIP 방법을 적용함으로써 녹말분해 활성에 대해 시험하였다. 기본적으로 녹말은 pH 5.8 및 일정한 온도(37 +/- 0.1℃)에서 염화나트륨 및 염화칼슘의 존재하에 가수분해된다. 가수분해에서 생성된 환원기는 알칼리성 용액 중에서 요오드와 반응하고 과량의 요오드는 티오설페이트로 적정한다. 아밀라제 1 유닛은 소정의 조건 및 기질 하에 분당 1 마이크로몰의 글루코시딕 결합을 가수분해하는 효소의 양으로서 정의된다. 펠렛의 녹말분해 활성은 실시예(A) 및 (B) 각각에 대한 출발 분말 아밀라제 물질의 녹말분해 활성에 비해 대략 96%인 것으로 밝혀졌다.
이어서 실시예 (A) 및 (B)로부터 생성된 펠렛을 Pharm. Eur. 2.9.1. (Section "Disintegration of tablets and capsules")에 따라 붕해에 대해 시험하였다(시험 용액: 물 - 500 mL, 37 ℃). 실시예 (A)로부터의 펠렛의 붕해는 15분 안에 완성되었다. 실시예 (B)로부터의 펠렛의 붕해는 9분 안에 완성되었다.
실시예 6: 아밀라제 및 프로테아제의 약학적 조성물
아밀라제 및 프로테아제를 함유하는 고강도 펠렛을 하기와 같이 제조하였다: SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274의 프로테아제의 무균여과된 농축액을 DK 2005 00930의 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 방사건조시켰다. 실시예 5에서 기술된 바와 같이 제조된 분말 형태의 방사건조된 아밀라제(398.5 g)를, 방사건조된 프로테아제 분말(746.5 g; 측정된 단백질 함량 58.5%)과, 미세결정질 셀룰로스(458 g) 및 폴리에틸렌 글리콜 4000(MacrogolTM 4000; 687 g)과 함께 시판중인 믹서기내에서 혼합하였다. 이소프로필 알콜 100%(460 g)을 첨가하고, 생성된 축축한 덩어리를 실온에서 계속 교반하였다. 균질화된 덩어리를 이어서 시판되는 압출기에서 압출하는데, 이 압출기는 0.8 mm의 구멍 직경을 가지는 천공 다이를 가진 것으로 원통 모양의 펠렛을 형성하는 것이다. 압출되는 동안의 비드 온도는 50℃를 넘지 않게 하였다. 생성된 압출물을 시판되는 스페로나이저(spheronizer)를 사용하여 필요한 양만큼의 이소프로필 알콜 100%(58 g)을 첨가함으로써 구형 펠렛으로 둥글게 만들었다. 펠렛은 시판되는 진공 건조기(Voetsch사의 것)에서 대략 40℃의 공급 온도에서 건조시켰다. 생성 온도는 45℃를 넘지 않게 하였다. 이어서 건조된 펠렛을 0.7 내지 1.4 mm 스크린을 사용하여 기계적 체를 사용하여 분리하였다. ≥0.7 mm 및 ≤1.4 mm 스크린의 체에 걸러내린 것을 모으고 크기 2의 캡슐에 각 펠렛 200 mg 중 일부를 채웠다.
상기에 개괄설명한 바와 같은 방법에 따른 단백질분해 활성 및 녹말분해 활성에 대해서 생성된 펠렛을 시험하였다. 출발 분말 프로테아제 또는 아밀라제 물질에 대비하여, 각 경우에 단백질분해 활성 또는 녹말분해 활성에 대해서 손실은 각각 발견되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S Solvay Pharmaceuticals GmbH <120> Amylases for pharmaceutical use <130> 10795.204-WO <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 513 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <220> <221> VARIANT <222> (1)..(513) <400> 1 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 145 150 155 160 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser 225 230 235 240 Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu 305 310 315 320 Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365 Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro 465 470 475 480 Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro <210> 2 <211> 481 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> VARIANT <222> (1)..(481) <400> 2 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu 65 70 75 80 Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly 145 150 155 160 Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg 225 230 235 240 Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr 275 280 285 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr 305 310 315 320 Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg 340 345 350 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 355 360 365 Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr 385 390 395 400 Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 405 410 415 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln 465 470 475 480 Arg <210> 3 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus sp. <220> <221> VARIANT <222> (1)..(483) <400> 3 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220 Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255 Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro 305 310 315 320 Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335 Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn 385 390 395 400 Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415 Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp 465 470 475 480 Val Asn Lys <210> 4 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus halmapalus <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(485) <400> 4 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Lys Arg 485 <210> 5 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(274) <400> 5 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110 Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala 115 120 125 Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 130 135 140 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 145 150 155 160 Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 165 170 175 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly 180 185 190 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205 Pro 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Glu Gly Val 405 410 415 Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro 420 425 430 Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val 435 440 445 Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp 465 470 475 480 Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr 485 490 495 Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val 500 505 510 Ala Trp <210> 13 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant of DNA from Bacillus stearothermophilus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1620) <223> DNA encoding SEQ ID NO: 1 <400> 13 atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60 ttgctgcctc attctgcagc cgcggcaccg tttaacggca ccatgatgca gtattttgaa 120 tggtacttgc cggatgatgg cacgttatgg accaaagtgg ccaatgaagc caacaactta 180 tccagccttg gcatcaccgc tctttggctg ccgcccgctt acaaaggaac aagccgcagc 240 gacgtagggt acggagtata cgacttgtat gacctcggcg aattcaatca aaaagggacc 300 gtccgcacaa aatacggaac aaaagctcaa tatcttcaag ccattcaagc cgcccacgcc 360 gctggaatgc aagtgtacgc cgatgtcgtg ttcgaccata aaggcggcgc tgacggcacg 420 gaatgggtgg acgccgtcga agtcaatccg tccgaccgca accaagaaat ctcgggcacc 480 tatcaaatcc aagcatggac gaaatttgat tttcccgggc ggggcaacac ctactccagc 540 tttaagtggc gctggtacca ttttgacggc gttgattggg acgaaagccg aaaattgagc 600 cgcatttaca aattccgtgg caaggcttgg gattgggaag tagacacgga attcggaaac 660 tatgactact taatgtatgc cgaccttgat atggatcatc ccgaagtcgt gaccgagctg 720 aaaaactggg ggaaatggta tgtcaacaca acgaacattg atgggttccg gcttgatgcc 780 gtcaagcata ttaagttcag tttttttcct gattggttgt cgtatgtgcg ttctcagact 840 ggcaagccgc tatttaccgt cggggaatat tggagctatg acatcaacaa gttgcacaat 900 tacattacga aaacagacgg aacgatgtct ttgtttgatg ccccgttaca caacaaattt 960 tataccgctt ccaaatcagg gggcgcattt gatatgcgca cgttaatgac caatactctc 1020 atgaaagatc aaccgacatt ggccgtcacc ttcgttgata atcatgacac cgaacccggc 1080 caagcgctgc aatcatgggt cgacccatgg ttcaaaccgt tggcttacgc ctttattcta 1140 actcggcagg aaggataccc gtgcgtcttt tatggtgact attatggcat tccacaatat 1200 aacattcctt cgctgaaaag caaaatcgat ccgctcctca tcgcgcgcag ggattatgct 1260 tacggaacgc aacatgatta tcttgatcac tccgacatca tcgggtggac aagggaaggg 1320 ggcactgaaa aaccaggatc cggactggcc gcactgatca ccgatgggcc gggaggaagc 1380 aaatggatgt acgttggcaa acaacacgct ggaaaagtgt tctatgacct taccggcaac 1440 cggagtgaca ccgtcaccat caacagtgat ggatgggggg aattcaaagt caatggcggt 1500 tcggtttcgg tttgggttcc tagaaaaacg accgtttcta ccatcgctcg gccgatcaca 1560 acccgaccgt ggactggtga attcgtccgt tggaccgaac cacggttggt ggcatggcct 1620 <210> 14 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant of DNA from Bacillus licheniformis <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1461) <223> DNA encoding SEQ ID NO: 2 <400> 14 atgcctgcag cagcagccgt aaatggcacg ctgatgcagt attttgaatg gtatacgccg 60 aacgacggcc agcattggaa acgattgcag aatgatgcgg aacatttatc ggatatcggt 120 attactgccg tctggattcc cccggcatat aagggaacga gccaagcgga tgtgggctac 180 ggtgcttacg acctttatga tttaggggag tttcatcaaa aagggacggt tcggacaaag 240 tacggcacaa aaggagagct gcaatctgcg atcaaaagtc ttcattcccg cgacattaac 300 gtttacgggg atgtggtcat caaccacaaa ggcggcgctg atgcgaccga agatgtaacc 360 gcggttgaag tcgatcccgc tgaccgcaac cgcgtaattt caggagaaca cctaattaaa 420 gcctggacac attttcattt tccggggcgc ggcagcacat acagcgattt taagtggtat 480 tggtaccatt ttgacggaac cgattgggac gagtcccgaa agctgaaccg catctataag 540 tttcaaggga agacttggga ttgggaagtt tccaatgaat tcggcaacta tgattatttg 600 atgtatgccg acatcgatta tgaccatcct gacgtcgtag cagaaattaa gagatggggc 660 acttggtatg ccaatgaact gcaattggac ggtttccgtc ttgatgctgt caaacacatt 720 aaattttctt ttttgcggga ttgggttaat catgtcaggg aaaaaacggg gaaggaaatg 780 tttacggtag ctgagtactg gtcgaatgac ttgggcgcgc tggaaaacta tttgaacaaa 840 acaaatttta atcattcagt gtttgacgtg ccgcttcatt atcagttcca tgctgcatcg 900 acacagggag gcggctatga tatgaggaaa ttgctgaacg gtacggtcgt ttccaagcat 960 ccgttgaaat cggttacatt tgtcgataac catgatacac agccggggca atcgcttgag 1020 tcgactgtcc aaacatggtt taagccgctt gcttacgctt ttattctcac aagggaatct 1080 ggataccctc aggttttcta cggggatatg tacgggacga aaggagactc ccagcgcgaa 1140 attcctgcct tgaaacacaa aattgaaccg atcttaaaag cgagaaaaca gtatgcgtac 1200 ggagcacagc atgattattt cgaccaccat gacattgtcg gctggacaag ggaaggcgac 1260 agctcggttg caaattcagg tttggcggca ttaataacag acggacccgg tggggcaaag 1320 cgaatgtatg tcggccggca aaacgccggt gagacatggc atgacattac cggaaaccgt 1380 tcggagccgg ttgtcatcaa ttcggaaggc tggggagagt ttcacgtaaa cggcgggtcg 1440 gtttcaattt atgttcaaag a 1461 <210> 15 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant of DNA from Bacillus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1449) <223> DNA encoding SEQ ID NO: 3 <400> 15 caccataatg gtacgaacgg cacaatgatg cagtactttg aatggtatct accaaatgac 60 ggaaaccatt ggaatagatt aaggtctgat gcaagtaacc taaaagataa agggatctca 120 gcggtttgga ttcctcctgc atggaagggt gcctctcaaa atgatgtggg gtatggtgct 180 tatgatctgt atgatttagg agaattcaat caaaaaggaa ccattcgtac aaaatatgga 240 acgcgcaatc agttacaagc tgcggttaac gccttgaaaa gtaatggaat tcaagtgtat 300 ggcgatgttg taatgaatca taaaggggga gcagacgcta ccgaaatggt taaagcagtc 360 gaagtaaacc cgaataatag aaatcaagaa gtgtccggtg aatatacaat tgaggcttgg 420 acaaagtttg actttccagg acgaggtaat actcattcaa acttcaaatg gagatggtat 480 cactttgatg gagtagattg ggatcagtca cgtaagctga acaatcgaat ttataaattc 540 cgcggtaaag ggtgggattg ggaagtcgat acagaattcg gtaactatga ttacctaatg 600 tatgcagata ttgacatgga tcacccagag gtagtgaatg agctaagaaa ttggggtgtt 660 tggtatacga atacattagg ccttgatggt tttagaatag atgcagtaaa acatataaaa 720 tacagcttta ctcgtgattg gattaatcat gttagaagtg caactggcaa aaatatgttt 780 gcggttgcgg aattttggaa aaatgattta ggtgctattg aaaactattt aaacaaaaca 840 aactggaacc attcagtctt tgatgttccg ctgcactata acctctataa tgcttcaaaa 900 agcggaggga attatgatat gaggcaaata tttaatggta cagtcgtgca aaagcatcca 960 atgcatgctg ttacatttgt tgataatcat gattcgcaac ctgaagaagc tttagagtct 1020 tttgttgaag aatggttcaa accattagcg tatgctttga cattaacacg tgaacaaggc 1080 tacccttctg tattttatgg agattattat ggcattccaa cgcatggtgt accagcgatg 1140 aaatcgaaaa ttgacccgat tctagaagcg cgtcaaaagt atgcatatgg aagacaaaat 1200 gactacttag accatcataa tatcatcggt tggacacgtg aagggaatac agcacacccc 1260 aactccggtt tagctactat catgtccgat ggggcaggag gaaataagtg gatgtttgtt 1320 gggcgtaata aagctggtca agtttggacc gatatcactg gaaataaagc cggtactgtt 1380 acgattaatg ctgatggatg gggtaatttt tctgtaaatg gaggatcagt ttctatttgg 1440 gtaaacaaa 1449 <210> 16 <211> 1768 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Variant of DNA from Bacillus halmapalus <220> <221> misc_feature <223> DNA encoding SEQ ID NO: 4 <400> 16 gtgaggaaac gaaaaaatat gctattaagt atgtttatag tatttattat gatgctttct 60 tttgtgccag tttcaggtgg agaggtagaa gcacatcata atgggacaaa tgggacgatg 120 atgcaatact ttgaatggca cttgcctaat gatgggaatc actggaatag attaagagat 180 gatgctagta atctaagaaa tagaggtata accgctattt ggattccgcc tgcctggaaa 240 gggacttcgc aaaatgatgt ggggtatgga gcctatgatc tttatgattt aggggaattt 300 aatcaaaagg ggacggttcg tactaagtat gggacacgta gtcaattgga gtctgccatc 360 catgctttaa agaataatgg cgttcaagtt tatggggatg tagtgatgaa ccataaagga 420 ggagctgatg ctacagaaaa cgttcttgct gtcgaggtga atccaaataa ccggaatcaa 480 gaaatatctg gggactacac aattgaggct tggactaagt ttgattttcc agggaggggt 540 aatacatact cagactttaa atggcgttgg tatcatttcg atggtgtaga ttgggatcaa 600 tcacgacaat tccaaaatcg tatctacaaa ttccgaggtg atggtaaggc atgggattgg 660 gaagtagatt cggaaaatgg aaattatgat tatttaatgt atgcagatgt agatatggat 720 catccggagg tagtaaatga gcttagaaga tggggagaat ggtatacaaa tacattaaat 780 cttgatggat ttaggatcga tgcggtgaag catattaaat atagctttac acgtgattgg 840 ttgacccatg taagaaacgc aacgggaaaa gaaatgtttg ctgttgctga attttggaaa 900 aatgatttag gtgccttgga gaactattta aataaaacaa actggaatca ttctgtcttt 960 gatgtccccc ttcattataa tctttataac gcgtcaaata gtggaggcaa ctatgacatg 1020 gcaaaacttc ttaatggaac ggttgttcaa aagcatccaa tgcatgccgt aacttttgtg 1080 gataatcacg attctcaacc tggggaatca ttagaatcat ttgtacaaga atggtttaag 1140 ccacttgctt atgcgcttat tttaacaaga gaacaaggct atccctctgt cttctatggt 1200 gactactatg gaattccaac acatagtgtc ccagcaatga aagccaagat tgatccaatc 1260 ttagaggcgc gtcaaaattt tgcatatgga acacaacatg attattttga ccatcataat 1320 ataatcggat ggacacgtga aggaaatacc acgcatccca attcaggact tgcgactatc 1380 atgtcggatg ggccaggggg agagaaatgg atgtacgtag ggcaaaataa agcaggtcaa 1440 gtttggcatg acataactgg aaataaacca ggaacagtta cgatcaatgc agatggatgg 1500 gctaattttt cagtaaatgg aggatctgtt tccatttggg tgaaacgata atggaaaaaa 1560 gaaaaggcta aatggtcttt tctttttttc taggaggtgt tgtaaatgga gtttattcaa 1620 ttactaagtg ccgagctaaa agatcagtcg tatctttttt taaaattaga agcatttgtt 1680 tccgtattag atatagaggg tcatgaaaaa tgtgttatgc aatatcaaat ggggcagcag 1740 ttctttacag tgagcggcaa tgaaattg 1768

Claims (19)

  1. 의약으로서의 용도를 위한, (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483과 적어도 50% 동일성을 갖는 아밀라제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    a) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고/또는
    b) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열의 변이체인데, 여기에서 변이체는 해당 아미노산 서열과 25개 이하의 아미노산이 상이한 것으로, 이 때
    (i) 변이체는 해당 아미노산 서열과 대조하여, 하나 이상의 아미노산의 적어도 하나의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하고; 그리고/또는
    (ii) 변이체는 해당 아미노산 서열과 대조하여, 적어도 하나의 결실을 포함하고; 그리고/또는
    (iii) 변이체는 해당 아미노산 서열과 대조하여, 적어도 하나의 작은 N- 또는 C-말단 서열을 포함하고; 그리고/또는
    c) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산을 갖는 아밀라제의 대립유전자 변이체이며; 그리고/또는
    d) 아밀라제는 하기 (i) 내지 (iii): (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산을 갖는 아밀라제의 단편인 것을 특징으로 하는 아밀라제.
  3. 제 2 항에 있어서, 아밀라제는 (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481, 1-484, 1-486, 또는 1-513, (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481, 및/또는 (iii) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483으로 구성되는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 아밀라제.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한, 리파제 또는 프로테아제와 배합된 아밀라제.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한, 리파제 및 프로테아제와 배합된 아밀라제.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된 아밀라제로서,
    (i) 리파제는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-269를 갖는 리파제와 적어도 70% 동일성을 가지고,
    (iii) 프로테아제는
    a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제,
    b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제, 및
    c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제와 적어도 70% 동일성을 가지는 것을 특징으로 하는 아밀라제.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 따른 리파제 및/또는 프로테아제와 배합된 아밀라제로서,
    (i) 아밀라제는
    a) SEQ ID NO: 1의 아미노산 1-481을 포함하는 아밀라제,
    b) SEQ ID NO: 2의 아미노산 1-481을 갖는 아밀라제, 및
    c) SEQ ID NO: 3의 아미노산 1-483을 갖는 아밀라제로 구성되는 군 중에서 선택되는 아밀라제이고;
    (ii) 리파제는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 2-269를 포함하며;
    (iii) 프로테아제는
    a) SEQ ID NO: 5의 아미노산 1-274를 갖는 프로테아제,
    b) SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제, 및
    c) SEQ ID NO: 7의 아미노산 1-188을 갖는 프로테아제로 구성되는 군 중에서 선택되는 프로테아제인 것을 특징으로 하는 아밀라제.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 아밀라제의, 소화장애, 췌장 외분비 부족증, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 용도.
  9. 제 8 항에 있어서, 리파제 또는 프로테아제를 사용하는 것을 추가로 포함하는 용도.
  10. 제 8 항에 있어서, 리파제 및 프로테아제를 사용하는 것을 추가로 포함하는 용도.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 리파제 및/또는 프로테아제는 제 6 항 또는 제 7 항에서 정의된 바와 같은 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 아밀라제와, 적어도 하나의 약학적으로 수용가능한 부가 물질을 함께 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 리파제 또는 프로테아제를 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서, 리파제 및 프로테아제를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 리파제 및/또는 프로테아제는 제 6 항 또는 제 7 항에서 정의된 바와 같은 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 아밀라제의 치료 유효량을 투여함에 의한, 소화장애, 췌장 외분비 부족증, 췌장염, 낭포성 섬유증, 제1형 당뇨병, 및/또는 제2형 당뇨병의 치료 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 리파제 또는 프로테아제 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 리파제 및 프로테아제 치료 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 리파제 및/또는 프로테아제는 제 6 항 또는 제 7 항에서 정의된 바와 같은 것을 특징으로 하는 방법.
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