BRPI0611932A2 - amilase, uso da mesma, composição farmacêutica, e, método para o tratamento de uma doença - Google Patents

Abstract

AMILASE, USO DA MESMA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, METODO PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENçA O uso farmacêutico das amilases relacionadas às alfa-amilases de Bacilius da SEQ ID NOs: 1 a 3, opcionalmente em combinação com uma lipase e/ou uma protease. Exemplos de indicações médicas são: tratamento dos distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática (PEI), pancreatite, fibrose cística, diabete tipo 1, e/ou diabete tipo II. As amilases das SEQ ID NOs: 1 a 3 são variantes das amilases de Bacilius steatothermophilus, Bacilius licheniformis e Bacilius sp. As amilases da invenção têm uma eficácia melhorada in vivo, um perfil de pH melhorado, uma alta atividade específica, e/ou um perfil de degradação do amido melhorado.

Description

"AMILASE, USO DA MESMA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E,MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA"CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito ao uso farmacêutico dasamilases relacionadas a certas alfa-amilases de Bacillus (SEQ ID NOs: 1 a 3),opcionalmente em combinação com uma lipase e/ou uma protease. Exemplosde indicações médicas são: tratamento dos distúrbios digestivos, insuficiênciaexócrina pancreática (PEI), pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I, e/oudiabete tipo II.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Vários medicamentos comerciais na forma de suplementos deenzimas pancreáticas são conhecidos para o tratamento da insuficiênciaexócrina pancreática.Os ingredientes ativos destes produtos são enzimasdigestivas, principalmente a amilase, a lipase e a protease, as quais sãonormalmente produzidas no pâncreas e excretadas para a parte superior dointestino delgado (o duodeno). As enzimas usadas em tais medicamentosderivam do pâncreas bovino ou suíno, porém existem também produtos nomercado com enzimas microbianas, por exemplo o produto Nortase®, o qualcontém uma lipase de Rhizopus oryzae, uma protease de Aspergillus oryzae, euma amilase de Aspergillus oryzae.

A U.S. 5.614.189 (EP 600868) descreve o uso de, inter alia,uma lipase derivada da Humicola lanuginosa na terapia de substituição daenzima pancreática, por exemplo no tratamento de pacientes que estejamsofrendo de fibrose cística.Esta. lipase é da Humicola lanuginosa DSM4109 etem a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 269 da presente SEQ ID NO:9.

A WO 00/54799 descreve o uso de misturas de enzimasfisiologicamente aceitas tendo atividade lipolítica, proteolítica e amilolítica notratamento do diabete melito tipos I e II.A WO 02/060474 descreve o uso de uma lipase concentradade Rhizopus delemar, uma protease neutra do Aspergillus melieus, e uma amilase do Aspergillus oryzae no tratamento da má digestão.

A WO 01/62280 descreve o uso de um cristal de lipase nãofungica reticulado com um agente multifuncional de reticulação, uma proteasee uma amilase, em que o cristal de lipase é ativo em uma faixa de pH de cercade 2,0 a 9,0, para tratar ou prevenir um distúrbio gastrintestinal em ummamífero. Uma lipase preferida é de Pseudomonas, amilases preferidas sãode Aspergillus e Bacillus, proteases preferidas são a bromelaína, a papaína oua ficina.

A EP 0828509 descreve o uso de certas amilases estáveis emácido, opcionalmente em combinação com certas lipases e/ou proteasesestáveis em ácido, no tratamento da insuficiência exócrina do pâncreas. Umaamilase preferida é do Aspergillus niger, e lipases preferidas são do Rhizopusarrhizus ou Rhizopus javanicus.

A WO 99/19467 descreve certas variantes de alfa-amilasesderivadas de Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis e Bacillusamyloliquefaciens, bem como vários dos seus usos industriais, porém não ouso farmacêutico. As seqüências destas alfa-amilases de Bacillus do tiposelvagem designadas SEQ ID NOs: 3 a 5 na WO 99/19467 são aqui incluídascomo SEQ ID NOs: 10 a 12, respectivamente.

A EP 0594235 descreve um método para preparar amilasepurificada de um caldo de fermentação. Uma composição farmacêutica étambém reivindicada, e um uso potencial como auxiliar digestivo émencionado, junto com outros usos potenciais. Os exemplos ilustram ométodo de purificação reivindicado para uma alfa-amilase de Bacilluslicheniformis.

A WO 2004/078960 apresenta um método para identificar pelomenos um epítopo de célula T de uma amilase e amilases variantescompreendendo pelo menos uma alteração em pelo menos um epítopo.Muitos usos potenciais são enumerados, incluindo o uso farmacêutico. Umaamilase do Bacillus licheniformis é mencionada.

A EP 0828509 descreve o uso de certas amilases estáveis emácido, opcionalmente em combinação com certas lipases e/ou proteasesestáveis em ácido, no tratamento da insuficiência exócrina do pâncreas. Umaamilase preferida é de Aspergillus niger, e lipases preferidas são as deRhizopus arrhizus ou Rhizopus javanieus.

Existe a necessidade na técnica de enzimas alternativas, depreferência melhoradas, para uso farmacêutico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece enzimas alternativas,preferivelmente melhoradas, para uso farmacêutico, em particular para otratamento de distúrbios digestivos, insuficiência exócrina pancreática (PEI),pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II. As novasenzimas são proteases, amilases e lipases. Preferivelmente, as enzimas parauso de acordo com a invenção têm uma eficácia melhorada in vivo e/ou invitro; um perfil de atividade no pH melhorado; uma atividade específicamelhorada; um perfil de degradação melhorado; são ativas na presença de saisbiliares; e/ou têm uma alergenicidade reduzida.

A presente invenção diz respeito a uma amilase de pelo menos50% de identidade aos (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii)aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 daSEQ ID NO: 3; para uso como um medicamento, opcionalmente emcombinação com uma lipase, e/ou uma protease.

A invenção também diz respeito ao uso de tais amilases para afabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios digestivos,PEI, pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II, estes usosopcionalmente ainda compreendendo o uso de uma lipase e/ou uma protease.A invenção além disso diz respeito a uma composiçãofarmacêutica compreendendo tais amilases,junto com pelo menos um materialauxiliar farmaceuticamente aceitável, opcionalmente incluindo uma lipasee/ou uma protease.

A invenção também diz respeito a um método para otratamento de distúrbios digestivos, PEI, pancreatite (aguda e/ou crônica),fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II, mediante a administração deuma quantidade terapeuticamente eficaz de tais amilases, opcionalmente juntocom uma lipase e/ou uma protease.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra um cromatograma representando o perfil dedegradação de uma amilase tendo a seqüência de aminoácidos dosaminoácidos 1 a 486 da SEQ ID NO: 1 (uma variante de amilase de Bacillusstearothermophilus);

A Figura 2 mostra um cromatograma representando o perfil dedegradação de uma amilase de Aspergillus oryzae\

A Figura 3 mostra um cromatograma representando o perfil dedegradação da Pancreatina;

A Figura 4 mostra um cromatograma representando o perfil dedegradação de uma amilase tendo a seqüência de aminoácidos dosaminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3 (uma variante de amilase de Bacillussp.); e

A Figura 5 mostra um cromatograma representando o perfil dedegradação de uma amilase tendo a seqüência de aminoácidos dosaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 (uma variante de amilase de Bacilluslicheniformis).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

ENZIMAS

A presente invenção diz respeito ao uso de amilases tendo pelomenos 50% de identidade aos (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ LD NO: 1, (ii)aminoácidos 1 a 481 da SEQ ED NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 daSEQ ID NO: 3; para uso como um medicamento. A invenção também dizrespeito ao uso de tais amilases para a fabricação de um medicamento para otratamento de distúrbios digestivos, PEI, pancreatite (aguda e/ou crônica),fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II.

A invenção além disso dizrespeito a uma composição farmacêutica compreendendo tais amilases, juntocom pelo menos um material auxiliar farmaceuticamente aceitável. Ainvenção, além disso, diz respeito a um método para o tratamento das doençasmencionadas acima mediante a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de tais amilases.

No que segue, a amilase para uso nas composições, métodos eusos da invenção é referida como a "amilase da invenção".

No presente contexto, uma amilase é uma enzima que catalisaa endo-hidrólise do amido e outros oligo- e polissacarídeos lineares eramificados. Em uma forma de realização particular, a amilase para uso deacordo com a invenção tem uma atividade de alfa-amilase, isto é, catalisa aendo-hidrólise das articulações 1,4-alfa-glicosídicas nos oligossacarídeos epolissacarídeos. As alfa-amilases atuam, por exemplo, sobre o amido, oglicogênio e os polissacarídeos relacionados e oligossacarídeos de umamaneira aleatória, liberando grupos redutores na configuração alfa.

Em uma forma de realização preferida, a amilase da invençãoé uma alfa-amilase (nome sistemático: 1,4-alfa-D-glicano glicanidrolase). Emoutras formas de realização, a amilase da invenção pertence ao grupo deamilases EC 3.2.1, tal como EC 3.2.1.1 (alfa-amilase), EC 3.2.1.2 (beta-amilase), EC 3.2.1.3 (glican 1,4-alfa-glicosidase, amiloglicosidase ouglicoamilase), EC 3.2.1.20 (alfa-glicosidase), EC 3.2.1.60 (glican 1,4-alfa-maltotetraidrolase), EC 3.2.1.68 (isoamilase), EC 3.2.1.98 (glican 1,4-alfa-maltoexosidase) ou EC 3.2.1.133 (glican 1,4-alfa-maltoidrolase). Em umaforma de realização preferida, a amilase para uso de acordo com a invençãopode ser, ou é, classificada como pertencente ao grupo EC 3.2.1.1. Osnúmeros de EC referem-se à Nomenclatura de Enzimas 1992 da NC-IUBMB,Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo os suplementos 1 a 5publicados em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232,1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6;e Eur.J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. A nomenclatura éregularmente suplementada e atualizada; ver, por exemplo, a World WideWeb em http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Em formas de realização particulares, a amilase da invençãotem um grau de identidade a qualquer um dos (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1a 483 da SEQ ID NO: 3, de pelo menos 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,57%, 58%, 59%, ou pelo menos 60%. Em outras formas de realizaçãoparticulares, a amilase da invenção tem um grau de identidade a qualquer umdos (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3, de pelomenos 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, ou pelo menos70%. Nas formas de realização particulares adicionais a amilase da invençãotem um grau de identidade a qualquer um dos (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1a 483 da SEQ ID NO: 3, de pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,77%, 78%, 79% ou pelo menos 80%. Em outras formas de realizaçãoparticulares, a amilase da invenção tem um grau de identidade a qualquer umdentre (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3 de pelomenos 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% ou pelo menos90%. Em ainda outras formas de realização particulares, a amilase dainvenção tem um grau de identidade a qualquer um dos (i) aminoácidos 1 a481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii)aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3, de pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99%.

Em uma outra formas de realização particular, a amilase dainvenção compreende pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção deum ou mais aminoácidos em qualquer uma das seqüências de (i) aminoácidos1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou(iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3. Preferivelmente as mudanças deaminoácidos são de uma natureza secundária, isto é, substituições ouinserções conservativas de aminoácidos que não afetam significativamente aduplicação e/ou a atividade da proteína; pequenas deleções; pequenasextensões de terminal amino ou carboxila, tais como um resíduo de metioninade terminal amino; um pequeno peptídeo ligador; ou uma pequena extensãoque facilite a purificação pela mudança da carga líquida ou outra função, talcomo um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio deligação. No contexto acima, o termo "pequeno" independentemente designaum número de até 25 resíduos de aminoácidos. Nas formas de realizaçãopreferidas, o termo "pequeno" designa até 24, 23, 22, 21 ou até 20 resíduos deaminoácido. Nas formas de realização preferidas adicionais, o termo"pequeno" independentemente designa até 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11ou até 10 resíduos de aminoácidos. Em outras formas de realização preferidas,O termo "pequeno" independentemente designa até 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou até1 resíduo de aminoácido. Em formas de realização alternativas, o termo"pequeno" independentemente designa até 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32,31, 30, 29, 28, 27, 26 ou até 25 resíduos de aminoácido

Exemplos de substituições conservativas acham-se dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidosácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (serina,treonina, glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina,isoleucina, valina e alanina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofanoe tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, prolina, serina, treonina,cisteína e metionina).

Na alternativa, exemplos de substituições conservativasacham-se dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina ehistidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico),aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos(leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina,triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina,treonina e metionina). As substituições que em geral não alteram a atividadeespecífica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em H.Neurath e R. L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, New York. Astrocas mais comumente ocorrentes são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser,Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg,Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Vai, Ala/Glu e Asp/Gly.

Em formas de realização adicionais, a amilase da invenção temuma seqüência de aminoácidos que difere em não mais do que 25, 24, 23, 22,21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 ou não mais do que 11 aminoácidos dequalquer um dentre (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii)aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQID NO: 3; ou difere de qualquer um dentre (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1a 483 da SEQ ID NO: 3 em não mais do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou emnão mais do que 1 aminoácido. Nas formas de realização alternativas, aamilase da invenção tem uma seqüência de aminoácidos que difere em nãomais do que 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 ou não maisdo que 26 aminoácidos de qualquer um dentre (i) aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii)aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3.Em ainda outras formas de realização particulares, a amilaseda invenção é uma variante alélica de qualquer uma das amilases tendo (i)aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ IDNO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3, ou um fragmentodestes que tenha atividade de amilase. A amilase da invenção pode tambémser uma variante alélica de qualquer uma das amilases tendo as seqüências deaminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. Aexpressão variante alélica denota qualquer dentre duas ou mais formasalternativas de um gene que ocupe o mesmo lócus cromossômico. A variaçãoalélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar empolimorfismo dentro das populações. As mutações de genes podem sersilenciosas (sem qualquer mudança no polipeptídeo codificado) ou podemcodificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidos alteradas. Umavariante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por umavariante alélica de um gene. O termo fragmento é aqui definido como umpolipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletados do término amino e/oucarboxila de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3,preferivelmente tendo um ou mais aminoácidos deletados do término aminoe/ou carboxila dos aminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a 513 da SEQID NO: 1; dos aminoácidos 1 a 481 of SEQ ID NO: 2 ou dos aminoácidos 1 a483 da SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, um pequeno número de aminoácidosfoi deletado, pequeno sendo definido como explanado acima. Maispreferivelmente um fragmento contém pelo menos 440, 441, 442, 443, 444,445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453 ou pelo menos 454 resíduos deaminoácidos. O mais preferível é que um fragmento contenha pelo menos452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466,467, 468, 469 ou pelo menos 470 resíduos de aminoácido. Ainda maispreferível, um fragmento contém pelo menos 471, 472, 473, 474, 475, 476,477, 478, 479 ou pelo menos 480 resíduos de aminoácidos.Em resumo, uma forma de realização da presente invenção dizrespeito a uma amilase para uso farmacêutico, em que a) a amilasecompreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindoem (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3 e/ou b) aamilase é uma variante de uma seqüência de aminoácidos selecionado dogrupo consistindo em (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii)aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 daSEQ ID NO: 3, em que a variante difere da seqüência de aminoácidosrespectiva em não mais do que vinte e cinco aminoácidos, e em que: (i) avariante compreende pelo menos uma substituição, deleção e/ou inserção deum ou mais aminoácidos em comparação com a respectiva seqüência deaminoácidos; e/ou (ii) a variante compreende pelo menos uma pequenadeleção em comparação com a respectiva seqüência de aminoácidos; e/ou (iii)a variante compreende pelo menos uma pequena extensão N-terminal ou C-terminal em comparação com a respectiva seqüência de aminoácidos; e/ou c)a amilase é uma variante alélica de uma amilase tendo aminoácidosselecionados do grupo consistindo de (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO:1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483da SEQ ID NO: 3; e/ou d) a amilase é um fragmento de uma amilase tendoaminoácidos selecionados do grupo consistindo em (i) aminoácidos 1 a 481da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii)aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3.

Em particular, a presente invenção diz respeito a uma amilasepara uso farmacêutico, em que a amilase tem uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo consistindo em (i) aminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1 a 486ou 1 a 513 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou(iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3.

Em ainda outras formas de realização particulares da invenção,a amilase é derivada de um microorganismo, por exemplo de um fungo, ou deuma bactéria. Exemplos de bactérias são as cepas de Bacillus, tais como ascepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus halmapalus,Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp., Bacillusstearothermophilus e Bacillus subtilis; preferivelmente das cepas de Bacillusamyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus halmapalus, Bacilluslicheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp. e Bacillusstearothermophilus; os mais preferíveis das cepas de Bacillusstearothermophilus, Bacillus licheniformis oU Bacillus sp. Neste contexto, aexpressão "derivada de" inclui enzimas obteníveis, ou obtidas, de cepas dotipo selvagem; assim como, preferivelmente, as suas variantes tendo pelomenos uma substituição, inserção e/ou deleção de pelo menos um resíduo deaminoácidos. O termo variante também inclui embaralhadores, híbridos,enzimas quiméricas e enzimas de consenso. As variantes podem ter sidoproduzidas por qualquer método conhecido na técnica, tal como a mutagênesedirigida ao sítio, a mutagênese aleatória, os processos de derivação deconsenso (EP 897985), e embaralhadores de genes (WO 95/22625, WO96/00343), etc.

Exemplos não limitativos das amilases do tipo selvagem dainvenção são aqueles derivados do Bacillus licheniformis, tal como o nome deentrada da Swissprot AMY_BACLI, número de acesso primário P06278;Bacillus amyloliquefaciens, tal como o nome de entrada da Swissprot AMY-BACAM, número de acesso primário P00692; Bacillus megaterium, talcomo o nome de entrada da Swissprot AMY_BACME, número de acessoprimário P20845; Bacillus circulans, tal como o nome de entrada daSwissprot AMY_BACCI, número de acesso primário P08137; Bacillusstearothermophilus, tal como o nome de entrada da Swissprot AMY-BACST,número de acesso primário P06279. Outro exemplo é o do Bacillus subtilis,tal como o nome de entrada da Swissprot AMY_BACSU, número de acessoprimário P00691. Um outro exemplo ainda é a amilase derivada de Bacillushalmapalus, aminoácidos 1 a 485 da SEQ ID NO: 4. Exemplos nãolimitativos de variantes da amilase para uso de acordo com a invenção sãoapresentados nas WO 96/23873, WO 99/19467, patente U.S. na 4.933.279, EP722490 e EP 904360. Nas formas de realização particulares, a amilase dainvenção (i) não é o nome de entrada da Swissprot AMY_BACLI, número deacesso primário P06278; e/ou (ii) não é o nome de entrada da SwissprotAMY BACST, número de acesso primário P06279.

Outros exemplos particulares de amilases da invenção são asamilases contidas nos seguintes produtos comerciais: Clarase, DexLo, GC262 SP, G-Zyme G990, G-Zyme G995, G-Zyme G997, G-Zyme G998,HTAA, Optimax 7525, Purastar OxAm, Purastar ST, Spezyme AA, SpezymeAlfa, Spezyme BBA, Spezyme Delta AA, Spezyme DBA, Spezyme Ethyl,Spezyme Fred (GC521), Spezyme HPA e Ultraphlow (todos da Genencor);Validase BAA, Validase FAA, Validase HT340L, Valley Thin 340L (todosda Valley Research); Avizyme 1500, Dextro 300 L, Kleistase, Maltazyme,Maxamyl, Thermozyme, Thermatex, Starzyme HT 120 L, Starzyme SuperCone. e Ultraphlo.

Exemplos particularmente preferidos de amilases da invençãosão os seguintes: Uma amilase compreendendo os aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 1, tal como as amilases tendo os aminoácidos 1 a 481 da SEQID NO: 1, os aminoácidos 1 a 484 da SEQ ID NO: 1, os aminoácidos 1 a 486da SEQ ID NO: 1, ou os aminoácidos 1 a 513 da SEQ ID NO: 1; uma amilasetendo os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2; e uma amilase tendo osaminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3.

Em ainda outras formas de realização particulares, umaamilase adicional pode ser usada. Exemplos de amilases adicionais são asamilases de mamíferos e as proteases microbianas. Uma amilase demamíferos preferida é o extrato pancreático, por exemplo da suíno ou de boi,tal como a pancreatina. A pancreatina pode ser usada na forma de um produtosem revestimento (bruto), ou na forma de um produto formulado [revestidoentericamente (para proporcionar resistência contra o ácido gástrico) ou nãofuncionalmente revestido (revestido, porém não para proporcionar resistênciacontra o ácido gástrico)]. A pancreatina potencialmente compreende aindaoutros constituintes enzimáticos ativos como a lipase pancreática, a BSSL(Lipase Estimulada pelo Sal Biliar) e/ou a protease pancreática. A amilasemicrobiana pode, por exemplo, originar-se das cepas bacterianas ou fungicas,tais como Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus ou Rhizopus. A amilase pode,em particular, ser derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillusniger, Aspergillus oryzae ou Aspergillus melleus, por exemplo ou dosprodutos Amylase Al® derivados de Aspergillus oryzae, o qual écomercialmente disponível da Amano Pharmaceuticals, Japão, ou AmylaseEC® derivado de Aspergillus melleus, o qual é comercialmente disponível daExtract-Chemie, Alemanha.

A amilase da invenção pode ser usada, com ou sem uma lipasecomo descrito abaixo, em combinação com uma protease. O termo "protease"é aqui definido como uma enzima que hidrolisa ligações peptídicas. Ele incluiqualquer enzima pertencente ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cadauma das suas treze subclasses, estas enzimas estando no que segue referidascomo "pertencentes ao grupo EC 3.4.-.-".

A protease pode ser uma protease de mamífero, ou umaprotease microbiana. Uma protease de mamífero preferida é o extratopancreático, por exemplo de suíno ou de boi, tal como a pancreatina. Apancreatina pode ser usada na forma de um produto não revestido (bruto), ouna forma de um produto formulado (entericamente revestido, ou nãofuncionalmente revestido). A pancreatina potencialmente compreende aindaoutros constituintes enzimáticos ativos como a lipase pancreática, BSSL e/oua amilase pancreática. A protease microbiana pode ser, por exemplo, combase nas cepas bacterianas ou fungicas ou delas derivada. A protease pode,em particular, ser derivada de uma cepa de Aspergillus, tal como Aspergillusoryzae ou Aspergillus melleus, em particular o produto Prozyme 6® (proteasealcalina neutra EC 3.4.21.63), que é comercialmente disponível da AmanoPharmaceuticals, Japão. Exemplos de proteases bacterianas são as proteasesde Bacillus e Nocardiopsis, tais como a protease de Bacillus lieheniformistendo a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5,a protease de Nocardiopsis sp. tendo a seqüência de aminoácidos dosaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6, ou a protease de Nocardiopsisdassonviellei subesp. dassonvillei tendo a seqüência de aminoácidos dosaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7.

A protease dos aminoácidos 1 a 274da SEQ ID NO: 5 pode, por exemplo, ser preparada como descrito no pedidode patente DK ns 2005 00930 intitulado uProteases for Pharmaceutieal Use"e depositado em 24 de junho de 2005 pelas Solvay Pharmaceuticals GmbH eNovozymes A/S. As proteases dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NOs: 6 e7 podem, por exemplo, ser preparadas como descrito nas WO 2001/58276 ouna WO 2004/111224.

Em uma forma de realização preferida, a protease é pelomenos 70% idêntica a qualquer dos (i) aminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO:5, (ii) aminoácidos 1 a 188 de SEQ ID NO: 6, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 188de SEQ ID NO: 7. Nas formas de realização preferidas adicionais de qualquerdos (i), (ii) ou (iii), os graus de identidade são de pelo menos 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelomenos 99%. Nas formas de realização alternativas de qualquer dentre (i), (ii)ou (iii), os graus de identidade são de pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%,53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%,66%, 67%, 68%, ou de pelo menos 69%.

A amilase da invenção pode ser usada com o sem umaprotease como mencionado acima, em combinação com uma lipase. Nopresente contexto, uma lipase significa uma hidrolase de éster carboxílico EC3.1.1-, que inclui atividades tais como a triacilglicerol lipase EC 3.1.1.3, afosfolipase Al 3.1.1.4, a lisofosfolipase EC 3.1.1.5, a galactolipase EC3.1.1.26, a fosfolipase Al 3.1.1.32, a feruloil esterase EC 3.1.1.73. Em umaforma de realização particular, a lipase é uma triacilglicerol lipase EC 3.1.1.3.

A lipase pode ser uma lipase de mamíferos, ou uma lipasemicrobiana. Uma lipase de mamíferos preferida é o extrato pancreático, porexemplo de suíno ou de boi, tal como a pancreatina. A pancreatina pode serusada na forma de um produto sem revestimento (bruto), ou na forma de umproduto formulado (revestido entericamente ou não funcionalmenterevestido). A pancreatina potencialmente compreende ainda outrosconstituintes enzimáticos ativos como a protease pancreática, a BSSL e/ou aamilase pancreática. A lipase microbiana pode, por exemplo, originar-se dascepas bacterianas ou fungicas, tais como Bacillus, Pseudomonas, Aspergillusou Rhizopus. A lipase pode, em particular, ser derivada de uma cepa deRhizopus, tal como Rhizopus javanicus, Rhizopus oryzae ou Rhizopusdelemar, por exemplo o produto Lipase D Amano 2000® (também designadoLipase D2®) o qual acha-se comercialmente disponível da AmanoPharmaceuticals, Japão.

Em outras formas de realização particulares, a lipase é umalipase microbiana recombinantemente produzida, por exemplo derivada deum fungo tal como Humicola ou Rhizomucor, de uma levedura tal como aCandida, ou de uma bactéria tal como a Pseudomonas. Em uma forma derealização preferida, a lipase é derivada de uma cepa de Humieola lanuginosaou Rhizomucor miehei.

A lipase de Humieola lanuginosa (sinônimo Thermomyeeslanuginosus) (SEQ ID NO: 9) é descrita na EP 305216, e variantesparticulares de lipases são descritas, por exemplo, nas WO 92/05249, WO92/19726, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO99/42566, WO 00/32758, WO 00/60063, WO 01/83770, WO 02/055679 eWO 02/066622. Uma variante de lipase preferida é uma lipasecompreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8, taiscomo os seguintes (i) aminoácidos +1 a +269 da SEQ ID NO: 8, (ii)aminoácidos -5 a +269 da SEQ ID NO: 8, (iii) aminoácidos -4 a +269 da SEQID NO: 8; (iv) aminoácidos -3 a +269 da SEQ ID NO: 8; (v) aminoácidos -2 a+269 da SEQ ID NO: 8; (vi) aminoácidos -1 a +269 da SEQ ID NO: 8, (vii)aminoácidos +2 a +269 da SEQ ID NO: l,bem como (viii) qualquer misturade duas ou mais das lipases de (i) a (vii) e suas variantes. Em uma forma derealização particular, a lipase para uso de acordo com a invenção éselecionada das lipases de (i), (ii) e qualquer mistura de (i) e (ii). Misturaspreferidas de (i) e (ii) compreendem pelo menos 5%, preferivelmente pelomenos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou pelo menos95% da lipase (i), os percentuais sendo determinados pela seqüenciação N-terminal com o uso do método de Edman, como descrito no Exemplo 5 dopedido PCT que reivindica prioridade do pedido de patente DK na 200500929. Outras misturas preferidas são: (a) composições compreendendo de 35a 75%, preferível de 40 a 70%, mais preferível de 45 a 65% de lipase (ii); (b)composições compreendendo de 20 a 60%, preferivelmente de 25 a 55%,mais preferível de 30 a 50%, o mais preferível de35 a 47% da lipase (i); (c)composições compreendendo até 30%, preferivelmente até 25%, maispreferível até 20%, o mais preferível até 16% da lipase (vii); e (d) qualquercombinação de (a), (b) e/ou (c), tal como uma composição compreendendo de45 a 65% da lipase (ii), 35 a 47% da lipase (i), e até 16% da lipase (vii).

As lipases das SEQ ID NOs: 8 e 9 podem, por exemplo, serpreparadas com base nos preceitos da Patente U.S. n2 5.869.438 (em que aSEQ ID NO: 1 é uma seqüência de DNA codificando a lipase da SEQ ID NO:9). A lipase da SEQ ID NO: 8 pode, por exemplo, ser preparada pelaexpressão recombinante em uma célula hospedeira adequada de umaseqüência de DNA que seja uma modificação da SEQ ID NO: 1 da PatenteU.S., a modificação refletindo as diferenças de aminoácidos entre as SEQ IDNOs: 8 e 9 presentes. Tais modificações podem ser feitas por mutagênesedirigida ao sítio, como é conhecido na técnica.

Outros exemplos ainda de lipases fungicas são a cutinase daHumicola insolens, que é descrita na EP 785994, e a fosfolipase de Fusariumoxysporum que é descrita na EP 869167. Exemplos de lipases de levedurassão as lipases A e B de Candida antarctica, cuja lipase A é descrita na EP652945, e a lipase B é descrita, por exemplo, por Uppenberg et ai. emStructure, 2 (1994), 293. Um exemplo de uma lipase bacteriana é a lipasederivada de EP 214761.

Em uma forma de realização preferida, a lipase é pelo menos70% idêntica à lipase da SEQ ID NO: 8, ou aos aminoácidos 1 a 269 desta.Nas formas de realização preferidas adicionais, o grau de identidade à SEQID NO: 8, ou aos seus aminoácidos 1 a 269, é de pelo menos 71%, 72%, 73%,74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelomenos 99%. Nas formas de realização alternativas, o grau de identidade àSEQ ID NO: 8, ou aos seus aminoácidos 1 a 269, é de pelo menos cerca de50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%,63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, ou pelo menos 69%.

Em ainda uma outra forma de realização preferida, a lipase,como a lipase pancreática de mamífero, é uma lipase específica da posição 1,3.

Para os fins da presente invenção, as combinações de enzimasparticularmente preferidas são as seguintes: (i) A protease dos aminoácidos 1a 274 da SEQ ID NO: 5 em combinação com uma amilase compreendendo osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1 (tais como os seus aminoácidos 1 a481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a 513); (ii) a protease dos aminoácidos 1 a 274 daSEQ ID NO: 5 em combinação com a amilase da SEQ ID NO: 2; (iii) aprotease dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5 em combinação com aamilase da SEQ ID NO: 3; (iv) a protease dos aminoácidos 1 a 188 da SEQID NO: 6 em combinação com uma amilase compreendendo os aminoácidos1 a 481 da SEQ ID NO: 1 (tais como os seus aminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1a 486 ou 1 a 513); (v) a protease dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6em combinação com a amilase da SEQ ID NO: 2; (vi) a protease dosaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 em combinação com a amilase daSEQ ID NO: 3; (vii) uma lipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2a 269 da SEQ ID NO: 8 em combinação com uma amilase compreendendo osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1 (tais como os seus aminoácidos 1 a481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a 513); (viii) uma lipase compreendendo osaminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8 em combinação com aamilase da SEQ ID NO: 2; (ix) uma lipase compreendendo os aminoácidos 1a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8 em combinação com a amilase da SEQ IDNO: 3; (x) uma protease dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5 emcombinação com uma amilase compreendendo aminoácidos 1 a 481 da SEQID NO: 1 (tais como os seus aminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a513) e uma lipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQID NO: 8; (xi) uma protease dos aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5 emcombinação com a amilase da SEQ ID NO: 2 e uma lipase compreendendo osaminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8; (xii) a protease dosaminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5 em combinação com a amilase daSEQ ID NO: 3 e uma lipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a269 da SEQ ID NO: 8); (xiii) a protease dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ IDNO: 6 em combinação com uma amilase compreendendo os aminoácidos 1 a481 da SEQ ID NO: 1 (tais como os seus aminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1 a486 ou 1 a 513) e uma lipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a269 da SEQ ID NO: 8; (xiv) a protease dos aminoácidos 1 a 188 da SEQ IDNO: 6 a amilase da SEQ ID NO: 2 e uma lipase compreendendo osaminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8; (xv) uma protease dosaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 em combinação com a amilase daSEQ ID NO: 3 e uma lipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a269 da SEQ ID NO: 8; (xvi) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 daSEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilase compreendendoaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1 (tais como os seus aminoácidos 1 a481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a 513); (xvii) uma protease tendo os aminoácidos 1a 188 da SEQ ED NO: 7 em combinação com uma amilase tendo osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2; (xviii) uma protease tendo osaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilasetendo os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; (xix) uma protease tendo osaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilasecompreendendo os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1 (tais como os seusaminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a 513) e uma lipasecompreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8; (xx)uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinaçãocom uma amilase tendo os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e umalipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8; e(xi) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 emcombinação com uma amilase tendo os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO:3 e uma lipase compreendendo os aminoácidos 1 a 269 ou 2 a 269 da SEQ ID NO: 8.

Conseqüentemente, uma forma de realização da presenteinvenção diz respeito a uma amilase em combinação com uma lipase e/ouuma protease de acordo com as reivindicações 4 ou 5, em que a amilase é umaamilase selecionada do grupo consistindo em a) uma amilase compreendendoos aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, b) uma amilase tendo osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e c) uma amilase tendo osaminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; (ii) a lipase compreende osaminoácidos 2 a 269 da SEQ ID NO: 8; (iii) a protease é uma proteaseselecionada do grupo consistindo em a) uma protease tendo os aminoácidos 1a 274 da SEQ ID NO: 5, b) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 daSEQ ID NO: 6, e c) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ IDNO: 7.

Outras combinações preferidas das enzimas são as seguintes:(i) Uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1a 274 da SEQ ID NO: 5 em combinação com uma amilase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1; (ii) umaprotease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 274 daSEQ ID NO: 5 em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% deidentidade com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2; (iii) uma proteasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 274 da SEQ IDNO: 5 em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidadecom os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; (iv) uma protease tendo pelomenos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 emcombinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1; (v) uma protease tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 emcombinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2; (vi) uma protease tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 emcombinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; (vii) a lipase tendo pelo menos 50%de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8 em combinaçãocom uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1a 481 da SEQ ID NO: 1; (viii) a lipase tendo pelo menos 50% de identidadecom os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8 em combinação com umaamilase tendo pelo menos 50% de identidade com a SEQ ID NO: 2; (ix) alipase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 daSEQ ID NO: 8 em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% deidentidade com os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; (x) uma proteasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 274 da SEQ IDNO: 5 em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidadecom os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1 e uma lipase tendo pelo menos50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8; (xi) umaprotease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 274 daSEQ ID NO: 5 em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% deidentidade com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e uma lipase tendopelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO:8; (xii) uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5 em combinação com uma amilasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 483 da SEQ IDNO: 3 e uma lipase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos1 a 269 da SEQ ID NO: 8); (xiii) uma protease tendo pelo menos 50% deidentidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 em combinaçãocom uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1a 481 da SEQ ID NO: 1 e uma lipase tendo pelo menos 50% de identidadecom os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8; (xiv) uma protease tendo pelomenos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6 emcombinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e uma lipase tendo pelo menos 50%de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8; (xv) umaprotease tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 188 daSEQ ID NO: 6 em combinação com uma amilase tendo pelo menos 50% deidentidade com os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3 e uma lipase tendopelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO:8; (xvi) uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ IDNO: 1; (xvii) uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ IDNO: 2; (xviii) uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 483 da SEQ IDNO: 3; (xix) uma protease tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinação com uma amilasetendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 481 da SEQ IDNO: 1 e uma lipase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidosIa 269 da SEQ ID NO: 8; (xx) uma protease tendo pelo menos 50% deidentidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 em combinaçãocom uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com os aminoácidos 1a 481 da SEQ ID NO: 2 e uma lipase tendo pelo menos 50% de identidadecom os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8; e (xi) uma protease tendo pelomenos 50% de identidade com os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7 emcombinação com uma amilase tendo pelo menos 50% de identidade com osaminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3 e uma lipase tendo pelo menos 50%de identidade com os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8. Nasmodalidades preferidas de (i) a (xi), cada grau de identidade é,independentemente, pelo menos 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%,58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%,71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, ou pelo menos 99%. Conseqüentemente, uma modalidade dainvenção diz respeito a uma amilase em combinação com uma lipase e/ouuma protease de acordo com as reivindicações 4 ou 5, em que (i) a amilase éuma amilase como definido neste relatório; (ii) a lipase tem pelo menos 70%de identidade com uma lipase tendo os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO:8; (ii) a protease tem pelo menos 70% de identidade com uma proteaseselecionada do grupo consistindo em a) uma protease tendo os aminoácidos 1a 274 da SEQ ID NO: 5, b) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 daSEQ ID NO: 6, e c) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ IDNO: 7.

Geralmente, as enzimas amilase, protease e lipase [daqui pordiante "a(s) enzima(s)"] da invenção podem ser enzimas naturais ou do tiposelvagem obtidas de animais, em particular de mamíferos, por exemploenzimas de seres humanos ou de suínos; de plantas ou de microorganismos,mas também quaisquer de seus mutantes, variantes, fragmentos etc. queapresentem a atividade enzimática desejada, bem como as enzimas sintéticas,tais como as enzimas embaralhadas, híbridas ou quiméricas, e as enzimas deconsenso.

Em uma forma de realização específica, a(s) enzima(s) é(são)variante(s) alergênica(s) fraca(s), que se destina(m) a invocar uma respostaimunológica reduzida quando exposta a animais, incluindo o homem. Aexpressão resposta imunológica deve ser entendida como qualquer reaçãopelo sistema imune de um animal exposto à(s) enzima(s). Um tipo de respostaimunológica é uma resposta alérgica que leve a níveis aumentados de IgE noanimal exposto. As variantes alergênicas fracas podem ser preparadas com ouso de técnicas conhecidas na prática. Por exemplo a(s) enzima(s) pode(m)ser conjugadas com componentes poliméricos protegendo porções ou epítoposda(s) enzima(s) envolvidas em uma resposta imunológica. A conjugação compolímeros pode envolver acoplamento químico in vitro do polímero na(s)enzima(s), por exemplo como descrito nas WO 96/17929, WO 98/30682, WO98/35026 e/ou WO 99/00489. A conjugação pode, além disso oualternativamente a isso, envolver acoplamento in vivo dos polímeros à(s)enzima(s). Tal conjugação pode ser obtida por engenharia genética daseqüência de nucleotídeos que codifica a(s) enzima(s), introduzindoseqüências de consenso codificando sítios de glicosilação adicionais na(s)enzima(s) e expressando a(s) enzima(s) em um hospedeiro capaz de glicosilara(s) enzima(s); ver, por exemplo, a WO 00/26354. Outro meio de provervariantes alergênicas fracas é a engenharia genética da seqüência denucleotídeos codificando a(s) enzima(s) de modo a fazer com que as enzimasse auto-oligomerizem, fazendo com que os monômeros enzimáticos possamproteger os epítopos de outros monômeros enzimáticos e por esse meioreduzindo a antigenicidade dos oligômeros. Tais produtos e sua preparaçãosão descritos, por exemplo, na WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em umareposta imunológica podem ser identificados por vários métodos, tais como ométodo de apresentação de fago descrito nas WO 00/26230 e WO 01/83559,ou a abordagem aleatória descrita na EP 561907. Uma vez um epítopo tenhasido identificado, sua seqüência de aminoácidos pode ser alterada paraproduzir propriedades imunológicas alteradas da(s) enzima(s) mediantetécnicas conhecidas de manipulação de genes, tais como a mutagênesedirigida ao sítio (ver, por exemplo, as WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO00/22103) e/ou a conjugação de um polímero pode ser feita em proximidadesuficiente ao epítopo para o polímero proteger o epítopo.

Nas formas de realização particulares, a(s) enzima(s) é(são) (i)estável(is) em pH 2 a 8, preferivelmente também em pH 3 a 7, mais preferívelem pH 4 a 6; (ii) ativa(s) em pH 4 a 9, preferivelmente 4a 8; (iii) estável(is)contra a degradação pela pepsina e outras proteases digestivas (tais como asproteases pancreáticas, isto é, principalmente, a tripsina e a quimotripsina);e/ou (iv) estável(is) e/ou ativa(s) na presença de sais biliares.

Em uma forma de realização preferida, a amilase da invençãotem uma atividade em pH 7,0 e 37°C de pelo menos 35% em relação àatividade no pH ótimo e 37°C. Mais preferível, a atividade em pH 7,0 e 37°Cé de pelo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou pelo menos 75% da atividade nopH ótimo e 37°C (conforme Tabela 2 do Exemplo 3).

Em outra forma de realização preferida, a amilase da invençãotem uma atividade em pH 7,0 e 37°C e na presença de saia biliares a 5 mM depelo menos 25% em relação à atividade no pH ótimo e a 37°C na ausênciados sais biliares. Mais preferivelmente, a atividade em pH 7,0 e 37°C e napresença de sais biliares a 5 mM é de pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 oupelo menos 65% da atividade no pH ótimo e a 37°C na ausência dos saisbiliares (conforme Tabela 3 do Exemplo 3).

Em ainda outra forma de realização preferida, a atividadeespecífica da amilase da invenção, em pH de 7,0 e a 37°C, é de pelo menos10%, mais preferível de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,ou de pelo menos 70%, em relação à atividade específica da amilase da SEQID NO: 1 em pH de 5,0 e a 37°C (conforme Tabela 4 do Exemplo 3).

Em outra forma de realização preferida, a atividade específicada amilase da invenção, em pH 7,0 e a 37°C, e na presença de sais biliares a 5mM, é de pelo menos 10%, mais preferível de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65 ou de pelo menos 70%, em relação à atividadeespecífica da amilase da SEQ ID NO: 1 em pH 5,0 e a 37°C, e na presença desais biliares a 5 mM (conforme Tabela 5 do Exemplo 3).

As atividades referidas nas formas de realização preferidasacima podem adequadamente ser determinadas com o uso de um ensaio deaçúcar redutor, por exemplo como descrito no Exemplo 3, usando-sepreferivelmente milho ceroso como um substrato. Um procedimentodetalhado é descrito no Exemplo 3.

Em uma outra forma de realização particular, independente, aamilase da invenção tem um perfil de degradação do amido com um ou maisdos seguintes aspectos característicos: (i) DPl é detectado como um produtode degradação; (ii) a quantidade de DP4 é menor do que a quantidade deDEP5; (iii) a quantidade de DP4 é menor do que a quantidade de DP6; e/ou(iv) a quantidade de DP5 e/ou de DP6 é mais elevada do que a quantidade deDPI. O DPl monomérico é preferivelmente glicose, e os produtos DP2 a DP6são dímeros-hexâmeros, respectivamente, de glicose.

O perfil de degradação pode ser determinado com o uso daHPLC como descrito no Exemplo 4, isto é, após ter sido incubado por 24horas em uma temperatura de 60 ou 37°C, em um pH de 6,0 ou 5,5,preferivelmente com o uso de milho ceroso como um substrato, maispreferível na presença de Ca2+.

A expressão "em combinação com" refere-se ao usocombinado, de acordo com a invenção, da protease, lipase e/ou amilase. O usocombinado pode ser simultâneo, de sobreposição ou seqüencial, estes trêstermos sendo geralmente interpretados à luz da prescrição feita pelo médico.

O termo "simultâneo" refere-se a circunstâncias sob as quaisas enzimas ficam ativas ao mesmo tempo, por exemplo quando elas sãoadministradas ao mesmo tempo como um ou mais produtos farmacêuticosseparados, ou se eles forem administrados em uma e a mesma composiçãofarmacêutica.

O termo "seqüencial" refere-se a casos tais em que uma e/ouduas das enzimas estejam atuando primeiro, e a segunda e/ou terceira enzimassubseqüentemente. Uma ação seqüencial pode ser obtida pela administraçãodas enzimas em questão como formulações farmacêuticas separadas emintervalos desejados, ou como uma composição farmacêutica em que asenzimas em questão sejam diferentemente formuladas(compartimentalizadas), por exemplo com vistas a obter-se um diferentetempo de liberação, prover-se uma estabilidade melhorada do produto, ouotimizar-se a dosagem das enzimas.O termo "sobreposição" refere-se aos casos em que osperíodos de atividade das enzimas não sejam nem completamente simultâneosnem completamente seqüenciais, isto é, exista um certo período em que asenzimas sejam ambas, ou todas, ativas.

O termo "uma", por exemplo quando usado no contexto da(s)enzima(s) da invenção, significa pelo menos uma. Em formas de realizaçãoparticulares,"uma" significa "uma ou mais" ou "pelo menos uma" o quenovamente significa uma, duas, três, quatro, cinco etc.

A afinidade entre duas seqüências de aminoácidos é descritapelo parâmetro "identidade".

Para os fins da presente invenção, o alinhamento de duasseqüências de aminoácidos é determinado pelo uso do programa Needle dopacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needleexecuta o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. eWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituiçãousada é BLOSUM62, a penalidade de abertura de descontinuidade é 10, e apenalidade da extensão da abertura é 0,5.

O grau de identidade entre uma seqüência de aminoácidos dapresente invenção ("seqüência da invenção"; por exemplo, aminoácidos 1 a481 da SEQ ID NO: 1) e uma seqüência diferente de aminoácidos ("seqüênciaestranha", por exemplo os aminoácidos 1 a 514 da SEQ ID NO: 12) écalculado como o número de combinações exatas em um alinhamento dasduas seqüências, dividido pelo comprimento da "seqüência da invenção" oupelo comprimento da "seqüência estranha", qualquer que seja a mais curta. Oresultado é expresso em percentual de identidade.

Uma combinação exata ocorre quanto a "seqüência dainvenção" e a "seqüência estranha" tenha resíduos de aminoácido idênticosnas mesmas posições da sobreposição (no exemplo de alinhamento abaixo,isto é representado por "|"). O comprimento de uma seqüência é o número deresíduos de aminoácidos na seqüência (por exemplo, o comprimento da SEQID NO: 1 é 481).

No exemplo alinhamento abaixo, puramente hipotético, asobreposição é a seqüência de aminoácidos "HTWGER-NL" da Seqüência 1;ou a seqüência de aminoácidos "HGWGEDANL" da Seqüência 2. Noexemplo, uma descontinuidade é indicada por um "-".

Exemplo de alinhamento hipotético:Seqüência 1: ACMSHTWGER-NL

Illl Il

Seqüência 2: HGWGEDANL AMNPS

Conseqüentemente, o percentual de identidade da Seqüência 1à Seqüência 2 é 6/12=0,5, correspondente a 50%.

Em uma forma de realização particular, o percentual deidentidade de uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo com, ou aos,aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1 é determinado por i) alinhar as duasseqüências de aminoácidos usando o programa Needle, com a matriz desubstituição BLOSUM62, uma penalidade de abertura de descontinuidade de10, e uma penalidade de extensão da abertura de 0,5; ii) contar o número decombinações exatas no alinhamento; iii) dividir o número de combinaçõesexatas pelo comprimento da mais curta das duas seqüências de aminoácidos, eiv) converter o resultado da divisão de iii) em percentual. O percentual deidentidade a, ou com, outras seqüências da invenção tais como osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, ou 1 a 483 da SEQ ID NO: 3, écalculado de uma maneira análoga.

Na alternativa, o grau de identidade entre duas seqüências deaminoácidos pode ser determinado pelo programa "align", que é umalinhamento de Needleman-Wunsch (isto é, um alinhamento global). Asseqüências são alinhadas pelo programa usando a matriz de classificaçãobásica BLOSUM5Q. A penalidade para o primeiro resíduo de umadescontinuidade é 12, e para outros resíduos de uma descontinuidade aspenalidades são 2. O algoritmo de Needleman-Wunsch é descrito emNeedleman, S. B. e Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48:443-453, e o programa align, em Myers e W. Miller em iiOptimal Alignmentsin Linear Space" CABIOS (aplicações de computador nas biociências) (1988)4: 11 a 17. O "Align" faz parte do pacote FASTA versão v20u6 (ver W. R.Pearson e D. J. Lipman (1988), iiImproved Tools for Biological SequenceAnalysis", PNAS 85: 2444-2448, e W. R. Pearson (1990) iiRapidandSensitiveSequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology183:63-98).

O grau de identidade entre uma amostra, ou teste, seqüência dequal(is)quer da(s) enzima(s) da invenção e uma seqüência especificada, podeser determinado como segue: As duas seqüências são alinhadas com o uso doprograma "align". O número de combinações perfeitas ("N-combinação-perfeita") no alinhamento é determinado (uma combinação perfeita significa omesmo resíduo de aminoácido na mesma posição do alinhamento). Aextensão comum das duas seqüências alinhadas é também determinada, isto é,o número total de aminoácidos no alinhamento (a sobreposição), incluindo asdescontinuidades de fuga e conducentes criadas pelo alinhamento, caso haja("sobreposição-N"). O grau de identidade é calculado como a relação entre"N-combinação-perfeita" e "sobreposição-N" (para a conversão ao percentualde identidade, multiplicar por 100).

Em uma forma de realização alternativa, o grau de identidadeentre a amostra, ou teste, a seqüência e uma seqüência especificada podem serdeterminadas como segue: As seqüências são alinhadas com o uso doprograma "align". O número de combinações perfeitas ("N-combinação-perfeita") no alinhamento é determinado (uma combinação perfeita significa omesmo resíduo de aminoácido na mesma posição do alinhamento). Aextensão da seqüência de amostra (o número de resíduos de aminoácidos) édeterminada ("N-amostra"). O grau de identidade é calculado como a relaçãoentre "N-combinação-perfeita" e "N-amostra" (para a conversão ao percentualde identidade, multiplicar por 100).

Em outra forma de realização alternativa, o grau de identidadeentre a amostra, ou teste, a seqüência e uma seqüência especificada pode serdeterminado como segue: As seqüências são alinhadas com o uso doprograma "align". O número de combinações perfeitas ("N-combinação-perfeita") no alinhamento é determinado (uma combinação perfeita significa omesmo resíduo de aminoácido na mesma posição do alinhamento). Aextensão da seqüência especificada (o número de resíduos de aminoácidos) édeterminado ("N-especificado"). O grau de identidade é calculado como arelação entre "N-combinação-perfeita" e N-especificado" (para a conversão àidentidade percentual, multiplicar por 100).

Preferivelmente, a sobreposição é de pelo menos 20% daseqüência especificada ["sobreposição-N" como definido acima, dividida pelonúmero dos aminoácidos na seqüência especificada ("N-especificado"), emultiplicada por 100], mais preferível pelo menos 25%, 30%, 35%, 40%,45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou pelo menos95%. Isto significa que pelo menos 20% (preferivelmente de 25 a 95%) dosaminoácidos da seqüência especificada acabam sendo incluídos nasobreposição, quando a seqüência de amostra seja alinhada com a seqüênciaespecificada.

Na alternativa, a sobreposição é pelo menos 20% da seqüênciaespecificada ("sobreposição-N" como definido acima, dividida pela "N-amostra" como definido acima, e multiplicado por 100), mais preferível pelomenos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,85%, 90% ou pelo menos 95%. Isto significa que pelo menos 20%(preferivelmente 25a 95%) dos aminoácidos da seqüência de amostra acabamsendo incluídas na sobreposição, quando alinhadas em relação à seqüênciaespecificada.

A atividade da(s) enzima(s) da invenção pode ser medida como uso de qualquer ensaio adequado. Geralmente, o pH do ensaio e atemperatura do ensaio podem ser adaptados à enzima em questão. Exemplosde valores de pH do ensaio são os pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,80, 90 ou 95°C. Valores preferidos do pH e temperaturas acham-se na faixafisiológica, tais como os valores de pH de 4, 5, 6, 7 ou 8, e as temperaturas de30, 35, 37 ou 40°C.

Ensaios adequados acham-se descritos na parte experimental, enos pedidos de patentes DK ns 2005 00929 e 2005 00930 bem como nospedidos PCT correspondentes.

Outros exemplos são os ensaios da Ph.Eur. quanto à atividadede protease, da lipase e da amilase.

MEDICAMENTO

No presente contexto, o termo "medicamento" significa umcomposto, ou mistura de compostos, que trata, previne e/ou alivia os sintomasda doença, preferivelmente trata e/ou alivia. O medicamento pode serprescrito por um médico, ou pode ser um produto vendido livremente aobalcão.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

O isolamento, a purificação e a concentração da(s) enzima(s)da invenção podem ser realizadas por meios convencionais. Por exemplo, elaspodem ser recuperadas de um caldo de fermentação por procedimentosconvencionais, incluindo, porém sem limitar, a centrifugação, a filtração, aextração, a secagem por pulverização, a evaporação ou a precipitação, e aindapurificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica,incluindo, sem limitar, a cromatografia (por exemplo, troca de íons, afinidade,hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentoseletroforéticos (por exemplo, a focalização isoelétrica preparativa),solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio),SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Jansone Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Por exemplo, o DNA codificando a amilase da invenção (talcomo as SEQ ID NOs: 13 a 16 codificando as SEQ ID NOs: 1 a 4,respectivamente) pode ser recombinantemente expresso em uma célulahospedeira de Bacillus como é conhecido na técnica, e purificado do líquidode fermentação pelas etapas do processo como a centrifugação, aultrafiltração e, se desejável, a germe-filtração. As etapas do processoadicionais, opcionais, incluem várias espécies de cromatografia como, porexemplo, a cromatografia de troca de íons e a cromatografia de interaçãohidrofóbica. Um material de coluna hidrofóbica adequado é a butila ou afenila, e tais colunas acham-se comercialmente disponíveis, por exemplo, daPharmacia. Os pi das amilases de SEQ ID NOs: 1, 2 e 3 são de 5,7, 7,3 e 8,8,respectivamente, e os pesos moleculares de aproximadamente 55 kDa porSDS-PAGE quanto a todas as três amilases.

Em uma forma de realização particular, as preparações sólidasou líquidas concentradas de cada uma da(s) enzima(s) são preparadasseparadamente. Estes concentrados podem também, pelo menos em parte, serseparadamente formulados, como explanado em mais detalhes abaixo.

Em uma outra forma de realização particular, a(s) enzima(s)são incorporadas nas composições farmacêuticas da invenção na forma deconcentrados sólidos. A(s) enzima(s) podem ser colocadas no estado sólidopor vários métodos, como é conhecido na técnica. Por exemplo, o estadosólido pode ser ou cristalino, em que as moléculas enzimáticas são dispostasem uma forma altamente ordenada, ou um precipitado, em que as moléculasenzimáticas são dispostas em uma forma menos ordenada, ou em uma formadesordenada.A cristalização pode, por exemplo, ser realizada em um pHperto do pi da(s) enzima(s)e em baixa condutividade, por exemplo de 10mS/cm ou menos, como descrito na EP 691982.

Vários métodos de precipitação são conhecidos na técnica,incluindo a precipitação com sais, tais como o sulfato de amônio e/ou osulfato de sódio; com solventes orgânicos, tais como o etanol e/ou oisopropanol; ou com polímeros, tais como o PEG (Polietileno Glicol). Naalternativa, a(s) enzima(s) pode(m) ser precipitadas de uma solução pelaremoção do solvente (tipicamente água) por vários métodos conhecidos natécnica, por exemplo a liofilização, a evaporação (por exemplo em pressãoreduzida) e/ou a secagem por pulverização.

Em uma outra forma de realização particular, o concentradosólido da(s) enzima(s) tem um conteúdo de proteína de enzima ativa de pelomenos 50% (p/p) com referência ao conteúdo de proteína total do concentradosólido. Em ainda outras formas de realização particulares, o conteúdo deproteína de enzima ativa, em relação ao conteúdo de proteína total doconcentrado sólido, é de pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou de pelomenos 95% (p/p). O conteúdo de proteína pode ser medido como é conhecidona técnica, por exemplo por varredura de densitômetro, dos géis de SDS-PAGE coloridos de coomassie, por exemplo com o uso de um densitômetrocalibrado GS-800 da BIO-RAD; mediante o uso de um kit comercial, talcomo o Protein Assay ESL, número de ordem 1767003, que écomercialmente disponível da Rocha, ou com base no método descrito noExemplo 8 da WO 01/58276.

Preferivelmente, a proteína da enzima amilase constitui pelomenos 50%, mais preferível pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94,95, 96 ou pelo menos 97% do espectro protéico do concentrado de lipasesólido para uso de acordo com a invenção, conforme medido por varredura dedensitômetro de um gel de SDS-PAGE colorido com coomassie.Uma composição farmacêutica da invenção compreende a(s)enzima(s), preferivelmente na forma de preparações enzimáticasconcentradas, mais preferível concentrações sólidas, juntamente com pelomenos um auxiliar farmaceuticamente aceitável, ou subsidiário, material talcomo (i) pelo menos um portador e/ou excipiente; ou (ii) pelo menos umportador, excipiente, diluente e/ou adjuvante. Exemplos não limitativos deoutros ingredientes opcionais, todos farmaceuticamente aceitáveis, são osdesintegradores, lubrificantes, agentes de tamponamento, agentes umectantes,preservativos, agentes aromatizantes, solventes, agentes solubilizantes,agentes de suspensão, emulsificantes, estabilizadores, propulsores, e veículos.

Geralmente, dependendo, inter alia, da indicação médica emquestão, a composição da invenção pode ser planejada para todos os modosde administração conhecidos na técnica, preferivelmente incluindo aadministração enteral (através do canal alimentar). Assim, a composição podeestar na forma sólida, na semi-sólida, na líquida ou na gasosa, tal como emtabletes, cápsulas, pós, grânulos, microsferas, ungüentos, cremes, espumas,soluções, supositórios, injeções, inalantes, géis, microsferas, loções eaerossóis. O médico saberá selecionar a via de administração mais adequadae, naturalmente, evitar vias de administração potencialmente perigosas ou deoutra forma desvantajosas.

Os métodos e materiais auxiliares seguintes são, portanto,também meramente exemplares e não são, de forma alguma, limitativos.

Para as preparações orais sólidas, a(s) enzima(s) podem serusadas sozinhas ou em combinação com aditivos apropriados para produzirpelotas, micropelotas, tabletes, microtabletes, pós, grânulos ou cápsulas, porexemplo com portadores convencionais, tais como lactose, manitol, amido demilho ou fécula de batata; com excipientes ou aglutinantes, tais como osderivados de celulose, de celulose cristalina ou microcristalina, acácia, amidode milho, ou gelatinas; com desintegradores, tais como o amido de milho, afécula de batata ou a carboximetilcelulose sódica; com lubrificantes, taiscomo a cera de carnaúba, a cera branca, goma laca, sílica coloidal sem água,polietileno glicol (PEGs, também conhecidos pelo termo macrogol) de 1500 a20000, em particular PEG 4000, PEG 6000, PEG 8000, povidona, talco,monoleína ou estearato de magnésio; e, se desejável, com diluentes,adjuvantes, agentes de tamponamento, agentes umectantes, preservativos taiscomo o metilparaidroxibenzoato (E218), agentes colorantes tais como odióxido de titânio (El71) e agentes aromatizantes tais como a sacarose, asacarina, o óleo de laranja, o óleo de limão, e a vanilina. As preparações oraissão exemplos de preparações preferidas para o tratamento da indicaçãomédica de PEI.

A(s) enzima(s) também podem, bem em geral, ser formuladasem preparações orais líquidas, mediante sua dissolução, suspensão ouemulsificação em um solvente aquoso, tal como água, ou em solventes nãoaquosos, tais como óleos vegetais ou outros óleos semelhantes, glicerídeos deácido alifático sintético, ésteres de ácidos alifáticos superiores, propilenoglicol, polietileno glicol tal como o PEG 4000, ou álcoois inferiores tais comoos álcoois Ci-C4 lineares ou ramificados, por exemplo o 2-propanol; e, sedesejável, com materiais subsidiários convencionais ou aditivos tais comosolubilizantes, adjuvantes, diluentes, agentes isotônicos, agentes desuspensão, agentes emulsificadores, estabilizantes e preservativos.

Além disso, a(s) enzima(s) podem geralmente ser produzidasem supositórios para administração retal, mediante a mistura com umavariedade de bases tais como as bases emulsificantes ou as bases solúveis emágua. O supositório pode incluir veículos tais como a manteiga de cacau, ascarboceras e os polietileno glicóis, os quais se fundem na temperatura docorpo, e são também solidificados na temperatura ambiente.

O uso de lipossomas como um veículo de liberação é outrométodo de possível interesse geral. Os lipídeos podem ser qualquercombinação útil de lipídeos formadores dos lipossomas, incluindo os lipídeoscatiônicos ou zuiteriônicos, tais como a fosfatidilcolina. O lipídeoremanescente normalmente será de lipídeos neutros ou ácidos, tais como ocolesterol, a fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e outros. Para preparar oslipossomas, o procedimento descrito por Kato et ai. (1991) J. Biol. Chem.266: 3361 pode ser usado.

As formas de dosagem unitária para administração oral ouretal, tais como xaropes, elixires, pós e suspensões, podem ser fornecidas, emque cada unidade de dosagem, por exemplo a quantidade de uma colher dechá, a quantidade de uma colher de sopa, cápsula, tablete ou supositório,contenha uma quantidade predeterminada da(s) enzima(s). De formasemelhante, as formas de dosagem unitária para injeção ou administraçãointravenosa, podem compreender a(s) enzima(s) em uma composição comouma solução em água estéril, solução salina normal, ou outro portadorfarmaceuticamente aceitável.

A expressão "forma de dosagem unitária", como aqui usada,refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitáriaspara indivíduos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidadepredeterminada de enzima(s) em um montante suficiente para produzir oefeito desejado.

Em uma forma de realização particular, a composiçãofarmacêutica da invenção é para administração entérica, preferivelmente oral.

Em outras formas de realização particulares, a composição oralé (i) uma composição líquida contendo cristais da(s) enzima(s); (ii) umasuspensão líquida de sedimentos de enzima(s) (altamente) purificada(s); (iii)um gel contendo a(s) enzima(s) na forma sólida ou solubilizada; (iv) umasuspensão líquida de enzima(s) imobilizada(s) ou de enzimas adsorvidas naspartículas e outros; ou (v) uma composição sólida na forma de pó, pelotas,grânulos ou microsferas contendo a(s) enzima(s), se desejável na forma detabletes, cápsulas, ou coisa parecida, que sejam opcionalmente revestidas, porexemplo com um revestimento estável em ácido.

Em outra modalidade particular da composição, a(s) enzima(s)é(são) compartimentalizadas, isto é, separadas umas das outras, por exemplopor meio de revestimentos separados.

Em ainda uma outra modalidade particular da composição, aprotease é separada dos outros componentes enzimáticos da composição, taiscomo a lipase e/ou a amilase.

A dosagem da(s) enzima(s) variarão amplamente, dependendoda(s) enzima(s) específica(s) a ser(em) administrada(s), da freqüência deadministração, da maneira de administração, da severidade dos sintomas, e dasuscetibilidade do paciente aos efeitos colaterais, etc. Algumas das enzimasespecíficas podem ser mais potentes do que outras.

Exemplos de preparações orais sólidas da(s) enzima(s) dainvenção compreendem: (i) uma amilase de pelo menos 50% de identidadeaos (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; (ii) umaprotease tendo pelo menos 70% de identidade com uma protease selecionadado grupo consistindo de a) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 274 daSEQ ID NO: 5, b) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ IDNO: 6, e c) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7;e/ou (iii) uma lipase tendo pelo menos 70% de identidade a uma lipase tendoos aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8; em que, preferivelmente, asdosagens clínicas diárias previstas das enzimas de (i), (ii) e (iii) são comosegue (todas em mg de proteína enzimática por kg de peso corporal): para aamilase de (i): 0,001 a 250, 0,005 a 100, 0,01 a 50, ou 0,05 a 10 mg/kg depeso corporal; para uma protease de (ii): 0,005 a 500, 0,01 a 250, 0,05 a 100,ou 0,1 a 50 mg/kg de peso corporal; para a lipase de (iii): 0,01 a 1000, 0,05 a500, 0,1 a 250, ou 0,5 a 100 mg/kg de peso corporal.Um exemplo preferido de preparações orais sólidas da(s)enzima(s) da invenção compreende: (i) uma amilase compreendendo osaminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 1, (ii) uma protease compreendendo osaminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5, e/ou (iii) uma lipase compreendendoos aminoácidos 2 a 269 da SEQ ID NO: 8.

Exemplos de dosagens clínicas diárias previstas das enzimasde (i), (ii) e (iii) são como a seguir (todas em miligramas de proteína porquilograma de peso corporal: Para a amilase de (i): 0,01 a 50, 0,05 a 10, ou0,1 a 5 mg/kg de peso corporal; para a protease de (ii): 0,05 a 100, 0,1 a 50,ou 0,5 a 25 mg/kg de peso corporal; para a lipase de (iii): 0,1 a 250, 0,5 a 100,ou 1 a 50 mg/kg de peso corporal.

As ligações de amida (peptídeo), bem como os términos aminoe carbóxi, podem ser modificados para maior estabilidade na administraçãooral. Por exemplo, o término carbóxi pode ser amidado.

Modalidades particulares das composições farmacêuticas dainvenção, adequadas para o tratamento de distúrbios digestivos, PEI,pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabete tipo II, podem serpreparadas pela incorporação da(s) enzima(s) da invenção nas pelotas. Aspelotas podem geralmente compreender de 10 a 90% (p/p, em relação ao pesoseco das pelotas resultantes) de um polímero orgânico fisiologicamenteaceitável, de 10 a 90% (p/p, em relação ao peso seco das pelotas resultantes)de celulose ou de um derivado de celulose, e de 80 a 20% (p/p em relação aopeso seco das pelotas resultantes) da(s) enzima(s), a quantidade total dopolímero orgânico, celulose ou derivado de celulose, e enzima(s) perfazendoaté 100% em cada caso.

O polímero orgânico fisiologicamente aceitável pode serselecionado do grupo consistindo de polietileno glicol 1500, polietileno glicol2000, polietileno glicol 3000, polietileno glicol 4000, polietileno glicol 6000,polietileno glicol 8000, polietileno glicol 10000, polietileno glicol 20000,hidroxipropil metilcelulose, polioxietileno, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, e misturas dos referidos polímeros orgânicos. O polietilenoglicol 4000 é o preferido como polímero orgânico fisiologicamente aceitável.

A celulose ou um derivado de celulose podem, por exemplo,ser selecionados de celulose, acetato de celulose, éster de ácido graxo decelulose, nitratos de celulose, éter de celulose, carboximetilcelulose,.etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, metilcelulose,metiletilcelulose e metilidroxipropilcelulose. A celulose, em particular acelulose microcristalina, é preferida como celulose ou derivado de celulose.

As pelotas resultantes podem ser revestidas com umrevestimento entérico adequado, outros revestimentos não funcionais, oupodem ser usadas diretamente sem tal revestimento. Além disso, as pelotasresultantes podem ser colocadas em cápsulas como as cápsulas de gelatinadura ou as cápsulas livres de gelatina de um tamanho adequado para a terapiade um distúrbio ou doença conforme descrito em maiores detalhes acima. Emuma forma de realização da invenção, as pelotas produzidas de diferentestipos de enzima, em particular de lipase, protease e/ou amilase, podem sercolocadas nas referidas cápsulas. Embora enchendo-se as cápsulas com osdiferentes tipos de enzimas, a dosagem de um tipo único de enzima (a saber,lipase, protease ou amilase) pode ser adaptada às necessidades específicas deum certo grupo de indicação ou de um certo subgrupo de pacientes mediante aadição de uma quantidade especificada de qualquer dentre a lipase, a proteasee/ou a amilase às cápsulas, isto é, podem ser produzidas cápsulas que variemem suas relações específicas de lipase:protease:amilase.

Composições farmacêuticas preferidas da lipase da invençãosão descritas na WO 2005/092370, em particular nas formulaçõescompreendendo os excipientes preferidos nela mencionados. Em uma formade realização particularmente preferida, a composição farmacêuticacompreende uma mistura macrogolglicerídica de mono-, di- e tri-acilglicerídeos e polietileno glicol (PEG)5 mono- e di-ésteres de ácidoscarboxílicos C6-C22 alifáticos, e também possivelmente pequenas proporçõesde glicerol e polietileno glicol livre.

O polietileno glicol (PEG) contido nas misturasmacrogolglicerídicas é preferivelmente PEG que tenha em média 6 a nomáximo 40 unidades de óxido de etileno por molécula ou um peso molecularentre 200 e 2000.

Um outro aspecto da invenção leva em conta a composiçãofarmacêutica da(s) enzima(s) da invenção para compreender um sistemaconsistindo de tensoativo, co-tensoativo e fase lipofílica, o sistema tendo umvalor de HLB (Equilíbrio Hidrofílico-Lipofílico) maior ou igual a 10 e umponto de fusão maior ou igual a 20°C. Em uma forma de realização preferida,o sistema tem um valor de HLB de 10 a 16, preferivelmente de 12 a 15, e temum ponto de fusão entre 30 e 600°C, preferivelmente entre 40 e 500°C. Emparticular, o sistema caracterizado pelo valor de HLB e pelo ponto de fusão éuma mistura de mono-, di- e triacilglicerídeos e mono- e diésteres depolietileno glicol (PEG) com ácidos carboxílicos alifáticos com 8 a 20.preferivelmente 8 a 18, átomos de carbono, por meio do que o polietilenoglicol preferivelmente tem cerca de 6 a cerca de 32 unidades de óxido deetileno por molécula, e o sistema opcionalmente contém glicerina livre e/oupolietileno glicol livre. O valor de HLB de um tal sistema é preferivelmenteregulado pelo comprimento de cadeia do PEG. O ponto de fusão de um talsistema é regulado pelo comprimento da cadeia dos ácidos graxos, pelocomprimento da cadeia do PEG e pelo grau de saturação das cadeias de ácidograxo, e, conseqüentemente, pelo óleo de partida para a preparação da misturamacrogolglicerídica.

"Ácidos carboxílicos C8-Ci8 alifáticos" designa misturas emque o ácido caprílico (C8), o ácido cáprico (Ci0), o ácido láurico (Ci2), o ácidomirístico (Ci4), o ácido palmítico (Cj6) e o ácido esteárico (Ci8) estejamcontidos em uma proporção significativa e variável, se estes ácidos estiveremsaturados, e os ácidos carboxílicos Cg-Ci8 insaturados correspondentes. Asproporções destes ácidos graxos podem variar de acordo com os óleos departida.

Uma tal mistura de mono-, di- e triacilglicerídeos e mono- ediésteres de polietileno glicol (PEG) com ácidos carboxílicos alifáticos com 8a 18 átomos de carbono, pode, por exemplo,ser obtida por uma reação entreum polietileno glicol com um peso molecular entre 200 e 1500, e um óleo departida, o óleo de partida consistindo em uma mistura de triglicerídeos comácidos graxos que sejam selecionados do grupo contendo ácido caprílico,ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico,ácido oléico e ácido linolênico, individualmente ou como uma mistura.Opcionalmente, o produto de uma tal reação pode também conter pequenasproporções de glicerina e de polietileno glicol livre.

Tais misturas acham-se comercialmente disponíveis, porexemplo, sob o nome comercial de Gelucire®. Uma forma de realizaçãovantajosa da invenção mostra que os produtos conhecidos sob o nomecomercial de Gelucire®, em particular o "Gelucire® 50/13" e/ou o "Gelucire®44/14", representam misturas adequadas para uso nas preparaçõesfarmacêuticas de acordo com a invenção.

O "Gelucire® 50/13 é uma mistura com mono-, di- etriacilglicerídeos e mono- e diésteres de polietileno glicol, com ácidopalmítico (Ci6) e ácido esteárico (Ci8) em 40% a 50% e 48% a 58%,respectivamente, compondo a proporção principal dos ácidos graxos ligados.A proporção do ácido caprílico (C8) e ácido cáprico (Ci0) é menor do que 3%em cada caso, e a proporção de ácido láurico (Cj2) e ácido mirístico (Ci4), emcada caso, é menor do que 5%.

O "Gelucire® 44/14 é uma mistura com mono-, di- etriacilglicerídeos e mono- e diésteres de polietileno glicol, as proporçõesrespectivas de ácido palmítico (Cj6) sendo de 4 a 25%, de ácido esteárico(Cj8) em 5% a 35%, de ácido caprílico (C8) de menos do que 15%, de ácidocáprico (Ci0) de menos do que 12%, de ácido láurico (Ci2) de 30 a 50% e deácido mirístico (Cu) de 5 a 25%. O Gelucire® 44/14 pode, por exemplo, serpreparado por uma reação de alcoólise/esterificação com o uso de óleo desemente de palma e polietileno glicol 1500.

Uma forma de realização preferida da presente invenção levaem conta uma composição farmacêutica da(s) enzima(s) da invenção, quecompreende um sistema contendo uma mistura de mono-, di- e triacil-glicerídeos com polietileno glicol mono- e diésteres de ácidos carboxílicosC8-Ci8 alifáticos e também, possivelmente, pequenas proporções de glicerinae polietileno glicol livre, o sistema tendo um ponto de fusão entre 40°C e55°C e um valor de HLB na faixa entre 12 e 15. Mais preferível, o sistematem um ponto de fusão entre 44°C e 50°C e um valor de HLB na faixa de 13al4. Alternativamente, o sistema tem um ponto de fusão ao redor de 44°C eum valor de HLB de 14, ou o sistema tem um ponto de fusão ao redor de5 0°C e um valor de HLB de 13.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

A amilase da invenção, opcionalmente em combinação comuma lipase e/ou uma protease [a(s) enzima(s) da invenção], é útil notratamento terapêutico e/ou profilático de várias doenças ou distúrbios emanimais. O termo "animal" inclui todos os animais e, em particular, os sereshumanos. Exemplos de animais são os não ruminantes e os ruminantes, taiscomo o carneiro, a cabra e gado, por exemplo o gado de corte, e a vaca. Emuma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Osanimais não ruminantes incluem os animais monogástricos, por exemplo osporcos (incluindo, porém sem limitar, os leitões, os porcos emdesenvolvimento, e porcas); ave doméstica tal como peru, pato e galinha(incluindo, porém sem limitar, os frangos, poedeiras); bezerros jovens,animais de estimação tais como gato e cão; e peixe (incluindo, porém semlimitar, o salmão, a truta, tilápia, peixe-gato e carpas); e crustáceos (incluindo,porém sem limitar, camarões e pitus). Em uma forma de realização particular,o animal é um mamífero, mais em particular um ser humano.

Por exemplo, a(s) enzima(s) é/são útil(eis) no tratamento dosdistúrbios digestivos como a má digestão ou a dispepsia, que sãofreqüentemente causadas por uma produção e/ou secreção deficientes no tratogastrintestinal de enzimas digestivas normalmente secretadas, inter alia, doestômago e do pâncreas.

Além disso, a(s) enzima(s) é(são) particularmente útil(eis) notratamento da PEI. A PEI pode ser verificada com o uso, inter alia, do teste deBorgstrõm (JOP. J. Pancreas (Online) 2002; 3(5): 116-125), e pode sercausada por doenças e condições tais como o câncer pancreático, a cirurgiapancreática e/ou gástrica, por exemplo a ressecção total ou parcial dopâncreas, a gastrectomia, a pós-cirurgia de bypass gastrintestinal (porexemplo, a gastroenterostomia de Billroth II); a pancreatite crônica; aSíndrome de Shwachman Diamond; a obstrução dutal do pâncreas ou docanal colédoco (por exemplo do neoplasma); e/ou a fibrose cística (umadoença herdada, em que um muco espesso bloqueia os dutos do pâncreas).A(s) enzima(s) pode(m) também ser útil(eis) no tratamento da pancreatiteaguda.

O efeito da(s) enzima(s) sobre os distúrbios digestivos podeser medido como descrito de uma maneira geral na EP 0600868, na qual oExemplo 2 descreve um teste de digestibilidade in vitro para medir o teste deestabilidade da lipase sob condições gástricas, e o Exemplo 3 descreve umteste de digestibilidade in vitro quanto à atividade da lipase na presença dossais biliares. Testes correspondentes podem ser estabelecidos quanto àprotease e à amilase. Igualmente a WO 02/060474 apresenta testes adequados,por exemplo (1) um teste in vitro para medir a digestão lipídica em umaalimentação de teste de suínos, e (2) uma prova in vivo com suíno insuficientequanto ao pâncreas, no qual a digestibilidade da gordura, da proteína e doamido é medida.

Em uma forma de realização particular, o efeito da amilase dainvenção é medido com o uso do teste de triagem in vivo quanto à eficácia daamilase do Exemplo 2.

Como outro exemplo, a(s) enzima(s) é(são) útil(eis) notratamento do diabete melito tipo I e/ou tipo II, em particular para tratamentoadjuvante em uma terapia do diabete dos distúrbios digestivos que usualmenteacompanham esta doença, com vistas a reduzir as complicações posteriores.

O efeito sobre o diabete melito da(s) enzima(s) pode serdeterminado por um ou mais dos métodos descritos na WO 00/54799, porexemplo pelo controle do nível de hemoglobina glicosilada, do nível deglicose do sangue, dos ataques hipoglicêmicos, do estado das vitaminassolúveis em gordura, como as vitaminas A, D e E, da dosagem diáriarequerida de insulina, do índice de peso corporal, e dos períodoshiperglicêmicos.

A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitadano escopo pelas formas de realização específicas apresentadas neste relatóriodescritivo, tendo em vista que estas formas de realização são fornecidas comoilustrações dos vários aspectos da invenção. Pretende-se que quaisquer formasde realização equivalentes se situem dentro do escopo desta invenção. Defato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui apresentadas edescritas, se tornarão evidentes àqueles habilitados na técnica, a partir dadescrição supracitada. Pretende-se também que tais modificações se situemdentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, o presenterelatório descritivo, incluindo as definições, procederão ao controle.

Várias referências são citadas neste relatório, cujas descriçõesficam incorporadas como referência em suas totalidades.EXEMPLOS

Exemplo 1: Ensaios de enzimas

A atividade da amilase, da protease e da lipase pode serdeterminada com o uso dos ensaios da FIP (Fédération InternationalePharmaceutique), 1 unidade da FIP = 1 unidade da Ph.Eur. (FarmacopéiaEuropéia). Estes ensaios são descritos em: Fédération InternationalePharmaceutique, Scientific Section: International Commission for thestandardisation of pharmaceutical enzymes, a) iiPharmaceutical Enzymes,"Editores: R. Ruyssen e A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Bélgica (1978),b) Farmacopéia Européia. Ver também Deemester et ai. em Lauwers, A.,Scharpé, S. (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Mareei Dekker,1997, pp. 343-385. Os padrões enzimáticos podem ser procurados daInternational Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards,Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent.

Ensaio da FIP da amilase

A atividade amilolítica da pancreatina foi analisada de acordocom o método publicado na Farmacopéia Européia 5.1 em relação ao padrãoda pancreatina fornecido pela FIP. Para a determinação da atividadeamilolítica das amilases para uso de acordo com a invenção, o ensaio quanto àatividade amilolítica das amilases microbianas descrito pela FIP foimodificado. Em princípio, o amido é hidrolisado pela amilase em pH 5,8 e emtemperatura constante (37,0 ± 0,1 °C) na presença de cloreto de sódio e cloretode cálcio. Os grupos redutores resultantes da hidrólise reagem com o iodo nasolução alcalina e o excesso de iodo é titulado com tiossulfato. Uma unidadede amilase é definida como a quantidade de enzima que, sob as condições e osubstrato definidos, hidrolisa 1 micromol de ligação glicosídica por minuto.

Reagentes

Solução do substrato: O substrato é amido solúvel (porexemplo, Merck, n° 101252). O conteúdo de água de cada batelada de amidosolúvel é determinado após a abertura do recipiente. A uma quantidade deamido solúvel equivalente a 10,0 g do substrato seco, adicionar 50 ml de águapura (filtração/troca de íons) e misturar. Adicionar esta suspensão, enquantoem agitação contínua, a 800 ml de água pura em ebulição. Lavar o recipientepor várias vezes com quantidades sucessivas, cada uma de 10 ml, de águapura e adicionar a água de lavagem à solução de amido quente. Aquecer atéebulição sob agitação contínua. Esfriar até temperatura ambiente e diluir até1000 ml com água pura.

Solução tampão (acetato), pH 5,8 (0,2 mol/litro): Dissolver 12g de ácido acético, 1 g de cloreto de sódio e 544 mg de cloreto de cálcio emcerca de 800 ml de água. Ajustar o pH a 5,8 com uma solução de hidróxido desódio (cerca de 10 N). Diluir até 1000 ml.

Ácido acético, CH3COOH, p.a.

Cloreto de sódio, NaCl, p.a.

Hidróxido de sódio 0,25 N

Acido clorídrico 1 N

Solução de iodo 0,1 N [por exemplo, Titrisol (Merck 9910),diluído com água pura]

Solução de tiossulfato de sódio 0,1 N

Acido sulfürico (p.a.) 20%: a 4 partes em volume de águaadicionar 1 parte em volume de ácido sulfürico a 96% cuidadosamente.

Padrão FIP de referência da amilase füngica (Batelada n° 2;55310 FlP-U/g, Condição de 25°C sem cloreto de cálcio).

Suspensão de controle da qualidade (padrão de referência daAmilase Fúngica): Dissolver uma quantidade exatamente pesada do padrão dereferência de modo que a solução dê um volume de titulação de tiossulfato,que se situe entre 2 e 4 ml (por exemplo, pesar cerca de 12 a 15 mg do padrãode amilase füngica e dissolver em 100 ml de solução tampão. A suspensão docontrole de qualidade é usada apenas para monitoração dia a dia do sistema deteste.

Suspensão de teste: Dissolver uma quantidade exatamentepesada da amostra de teste de modo que a solução dê um volume de titulaçãode tiossulfato, que se situe entre 2 e 4 ml.

PROCEDIMENTO

Amostra de teste: Para cada determinação, preparar umasolução de reação contendo 25,0 ml de solução de substrato e 10,0 ml desolução tampão de acetato 0,2 M em um frasco de Erlenmeyer de 300 ml.Tampá-lo com uma rolha de borracha e colocá-lo em um banho de água emuma temperatura constante (37,0 ± 0,1 °C). Tão logo a mistura de substratotenha alcançado uma temperatura constante, iniciar a reação pela adição de2,0 ml da suspensão de teste. Sacudir brevemente e incubar por exatamente 10minutos a 37°C. Interromper a reação imediatamente pela adição de 4 ml deácido clorídrico. Enquanto agitando, adicionar 10 ml de solução de iodo a 0,1N, 25 ml de hidróxido de sódio a 0,25 N e, para lavar as paredes, 20 ml deágua pura. Deixar a mistura repousar em completa escuridão por 15 minutos.Adicionar 4 ml de ácido sulfürico e titular a solução com solução detiossulfato de sódio com o uso de uma microbureta. Calcular a média de duasdeterminações.

Amostra de controle da qualidade: Determinar a atividade dasuspensão de controle da qualidade como descrito quanto à amostra de testeem duplicata. Usar 2,0 ml da suspensão de referência.

Valores em branco: Preparar valores em branco do teste e dassuspensões de referência. Repetir o procedimento como descrito acima, masadicionar os 4 ml do ácido clorídrico 1 N antes da adição da solução de teste ede referência.

Calcular a atividade da amilase em Unidades por grama daamostra de teste com o uso da seguinte equação:

(% ~ nUB .000 solução de teste [ml] _ unidades de amilase2 ml χ amostra pesada [mg] [g] amostra de testeIiu: consumo de tiossulfato de sódio O5I N [ml] usado natitulação da suspensão de teste;

nuB: consumo de tiossulfato de sódio 0,1 N [ml] usado natitulação em branco da suspensão de teste;

A atividade medida da monitoração da amostra (amostra dereferência fungica) é de 97500 U/g, com uma Faixa de Médias de ± 3 χ SD,em particular com uma Faixa de ± 6000 U/g.

AMILASE

Alternativamente, o seguinte ensaio de amilase pode ser usado:Substrato: Tabletes Phadebas (Pharmacia Diagnostics;reticulado, insolúvel, polímero de amido colorido de azul, o qual é misturadocom albumina de soro bovino e uma substância tampão, e produzido emtabletes).

Temperatura do Ensaio: 37°CpH do Ensaio: 4,3 (ou 7,0, se desejável)

Tempo de reação: 20 minutos

Após a suspensão em água, o amido é hidrolisado pela alfa-amilase, dando fragmentos azuis solúveis. A absorbância da solução azulresultante, medida em 620 nm, é uma função da atividade de alfa-amilase.Uma Unidade de alfa-Amilase Fúngica (1 FAU) é a quantidade de enzima quedecompõe 5,26 g de amido (Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batelada9947275) por hora nas condições padrão do ensaio. Uma descrição do ensaiomais detalhada, APTSMYQI-3207, acha-se disponível, mediante solicitação,da Novozymes A/S, ICrogshoejvej 36, DK-2880Bagsvaerd, Dinamarca.LIPASE

Substrato: para-Nitro-Fenil (pNP) ValeratopH do ensaio: 7,7Temperatura do Ensaio: 40°CTempo de reação: 25 minutosO produto digerido com cor amarela tem uma absorbânciacaracterística em 405 nm. Sua quantidade é determinada porespectrofotometria. Uma unidade de lipase é a quantidade da enzima quelibera 1 micromol de ácido butírico titulável por minuto sob as dadascondições do ensaio. Uma descrição mais detalhada do ensaio, AF95/6-GB,acha-se disponível mediante solicitação da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36,DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.

PROTEASE

Substrato: Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388).

Tampão do ensaio: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM (Sigma H-3375). CHES 100 mM (Sigma C-2885), CABS 100 mM (Sigma C-5580),CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, 0,01% de Triton® X-100 ajustado a pH 9,0 comHCl ou NaOH.

Temperatura do ensaio: 25°C.

Amostra de protease diluída de 300 μΐ foi misturada com 1,5ml do tampão de ensaio e a reação de atividade foi iniciada pela adição de 1,5ml de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DMSO e aindadiluídos 45x com 0,01% de Triton® X-100) e, após mistura, o aumento emA405 foi monitorado por um espectrofotômetro como uma medição daatividade da protease. As amostras de protease foram diluídas antes damedição da atividade de modo a garantir que todas as medições de atividadecaíssem dentro da parte linear da curva de resposta de dose para o ensaio.

Exemplo 2: Teste de triagem in vivo quanto à eficácia da amilase

As amilases de Bacillus purificadas dos aminoácidos 1 a 486da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e aminoácidos 1 a483 da SEQ ID NO: 3 foram testadas em porquinhos Gõttingen (Ellegaard),junto com uma amilase fungica purificada derivada de Aspergillus oryzae,sendo abaixo de 50% idênticas a qualquer um das SEQ ID NOs: 1 a 3. AInsuficiência Exócrina Pancreática (PEI) foi induzida nos porquinhosmediante a ligação do canal pancreático, e eles foram também ajustados comuma cânula reentrante íleocecal, tudo sob anestesia de halotano e em um pesode cerca de 25 kg, como descrito em Tabeling et al., J. 1999, Studies onnutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigsand the effects of enzyme substitution, J.Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82:251-263 (daqui por diante referidos como uTabeling 1999"); e em Gregory etal., J. 1999. Growthg and digestion in pancreatic duct ligatedpigs, Effect ofenzyme supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing Animais"(SG Pierzynowski & R. Zabielski, eds.), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp381-393 (daqui por diante referido como "Gregory et al. 1999"). Um períodode pelo menos 4 semanas foi deixado para recuperação da cirurgia, antes queos estudos fossem iniciados. Antes do início do estudo, o estado da PEI decada porco foi confirmado através do teste da quimotripsina das fezes(comercialmente disponível da Immundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Alemanha, com o n° do catálogo K 6990).

Durante os estudos, os porcos foram alojados em gaiolas demetabolismo modificado em um ciclo de luz-escuro de 12:12 h e Dermitiu-selivre acesso à água e foram alimentados com duas refeições/dia. A refeição deteste, contendo 15,4% de proteína, 69% de amido e 2,1% de gordura, tinha aseguinte composição em g/100 g de matéria seca: Refeição de carne de avesdomésticas 7,1; refeição de peixe 2,45; caseína 4,1; farinha de trigo 20,65;arroz com casca 9,8; fécula de batata 7,7; amido de milho 39,8; celulose empó 3,0; vitaminas 5,3 (conforme as exigências nutricionais). Os porcos foramalimentados com 250 g desta refeição de teste misturada com 1 litro de água,0,625 g de Cr2O3 e em que diferentes quantidades de amilases (0,7500,18750, 90000 FIP U de amilase/refeição, ver Exemplo 1) foram misturadasimediatamente antes da alimentação.

O quimo ileal coletado por um total de 6 horas após o primeiroaparecimento do marcador de refeições no íleo (quimo verde), foi congeladoem -20°C imediatamente após a coleta, para evitar qualquer fermentaçãobacteriana das amostras. Pelo menos uma lavagem diária foi permitida entreas determinações separadas.

As amostras congeladas foram secadas por congelamento,moídas e analisadas quanto à matéria seca (DM) e o amido. A DM foiestimada em peso após a secagem por congelamento seguido por 8 horas deincubação em 103°C; o amido foi analisado polarimetricamente após ahidrólise ácida, e o açúcar foi estimado gravimetricamente. O Cr2C>3 foioxidado até cromar e o conteúdo de cromo foi calculado através de extinçãoem 365 nm (espectrofotômetro), como descrito por Petry e Rapp em Zeitungfur Tierphysiologie (1970), vol. 27, pp. 181-189.

Digestibilidade: O cálculo da digestibilidade aparente doamido pré-cecal foi feito de acordo com a fórmula, em que o Cr2Os e o amidoforam expressos como g/100 g de matéria seca:

<formula>formula see original document page 52</formula>

Os resultados da digestibilidade aparente do amido sãoapresentados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

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Os valores são médias ± Desvio Padrão

Dos resultados da Tabela 1, é evidente que as amilases dainvenção se desempenham muito melhor do que a amilase de Aspergillusoryzae conhecida e melhor do que as preparações de pancreatina conhecidas.As amilases da invenção produziram um melhoramento intenso e dependenteda dose sobre a digestibilidade do amido, já apresentando um melhoramentoaltamente eficiente na menor dosagem testada.

Exemplo 3: Perfis do ph da amilase, com e seu sais biliares

Para uso no tratamento da PEI e de doenças relacionadas, épreferível quanto às enzimas de substituição pancreática terem uma altaatividade ao redor de pH 6 a 7 (condições típicas do intestino delgadosuperior). Esta experiência serve para determinar os perfis de pH de quatroalfa-amilases, três amilases bacterianas da invenção e uma amilase fungica deAspergillus oryzae da técnica anterior, com e sem a adição de sais biliares.

Materiais e métodos

Enzimas

As amilases usadas para este estudo foram as amilasespurificadas de Bacillus dos aminoácidos 1 a 486 da SEQ ID NO: 1 ("SEQ 1"),aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 ("SEQ 2") e aminoácidos 1 a 483 daSEQ ID NO: 3 ("SEQ 3"), e, para comparação, uma amilase fungicapurificada derivada de Aspergillus oryzae ("A. oryzae"), a amilase do produtocomercial de amilase Fungamyl®, que é disponível da Novozymes A/S,Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.

Perfil do pH - ensaio do açúcar redutor

Tampão de enzimas: 50 mM de acetato, 50 mM de imidazol,50 mM de ácido malônico, 1 mM de CaCl2, 0,01% de Triton X-100. Ajustaraté pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 ou 7,0 com HCl/NaOH.

Tampão de substratos: 1,5 mg/ml de amilopectina (milhoceroso, por exemplo o Milho ceroso 04201 da Cerestar, batelada WM5671),50 mM de acetato, 50 mM de imidazol, 50 mM de ácido malônico, 1 mM deCaCl2. Ajustar ao pH desejado (como acima) com HCl/NaOH. Incubar por 5minutos a 100°C. O tampão de substratos foi produzido com ou sem saisbiliares a 5 mM [isto é, taurocolato de sódio BRP, lote 2, da FarmacopéiaEuropéia (Ph.Eur) ou da FIP5 também comercialmente disponível, porexemplo, da LGC promochem, 500 g/mol).

A atividade de amilase foi detectada pelo ensaio do açúcarredutor. Resumidamente, 50 μΐ de enzima (diluída em tampão de enzima demodo a situar-se dentro da faixa linear do ensaio) foram misturados com 100μl de tampão de substrato em PCR-MTP (Thermo-Fast® 96, ABgene, cat. n°AB-0600). Os MTP's foram incubados a 37°C por 15 minutos, em seguida aoque 75 μΐ de solução de parada (100 mM de hidrazida de ácido p-hidróxi-benzóico, 180 mM de tartarato de K-Na, 2% de NaOH) foram adicionados, eas placas foram incubadas em 95°C por 10 minutos. Depois, 150 μΐ de cadareservatório foram transferidos para MTP de 96 reservatórios, e a absorbânciaem 410 nm foi monitorada como uma medida da atividade da amilase.

Resultados

Os resultados (média das determinações em duplicata) sãoapresentados nas Tabelas 2 a 4, abaixo.

A Tabela 2 apresenta a atividade de cada enzima no pHindicado na ausência de sais biliares. Para cada enzima, a atividade máximafoi estabelecida em 100%.

A Tabela 3 apresenta o mesmo da Tabela 2, mas na presençade 5 mM de sais biliares.

A Tabela 4 apresenta a atividade de cada enzima por mg deproteína de enzima no pH indicado na ausência dos sais biliares, em relação àatividade enzimática máxima medida nesta experiência, a qual era a atividadeda enzima da SEQ 1 em pH 5,0 (100%). A atividade de cada enzima foiconseqüentemente normalizada em relação a esta atividade. A quantidade deproteína enzimática para cada enzima foi determinada com base na atividadeespecífica.

A Tabela 5 apresenta o mesmo da Tabela 4, mas na presençade 5 mM de sais biliares. Aqui, a atividade da enzima de SEQ 1 em pH 5,0 napresença de 5 mM de sais biliares é o valor de referência (100%).

Tabela 2: atividade relativa sem sais biliares

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Tabela 3: Atividade relativa com sais biliares

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*Uma medição descartada por ser claramente incorreta.

Tabela 4: Atividades absolutas normalizadas relativas à SEQ. 1 sem saisbiliares

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Tabela 5: Atividades absolutas normalizadas relativas à SEQ. 1 com saisbiliares

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Estes resultados mostram que, embora os sais biliares pareçamreduzir levemente a atividade da amilase, a atividade na presença de 5 mM desais biliares é ainda satisfatória. Os resultados mostram também que os saisbiliares não levam a um deslocamento do o pH ótimo.

Os resultados além disso mostram que cada uma das amilasesde Bacillus da invenção têm, todas, mais do que 50% de atividade relativa empH 7, o que não é o caso quanto à amilase fungica comparativa.

Finalmente, as Tabelas 4 e 5 demonstram que, pelo menos sobestas condições, a amilase tendo os aminoácidos 1 a 486 da SEQ ID NO: 1tem uma atividade significativamente mais elevada por mg de enzima, do quetodas as outras amilases testadas.

Exemplo 4: Perfil de degradação das amilases

O perfil de degradação (impressão digital qualitativa DPl-10)das cinco alfa-amilases foi determinado pela degradação do amido de milhoceroso seguida pela análise em HPLC.

Materiais e Métodos

As enzimas foram as amilases purificadas de Bacillus dosaminoácidos 1 a 486 da SEQ ID NO: 1 ("SEQ 1"), aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 2 ("SEQ 2") e aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3 ("SEQ3"), e, para comparação, uma amilase fungica purificada derivada deAspergillus oryzae ("A. oryzae"), a amilase do produto comercial de amilaseFungamyl®, que é disponível da Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880Bagsvaerd, Dinamarca. A pancreatina foi da Solvay Pharmaceuticals.

Como substrato, uma pasta de 50 mg/ml de amido de milhoceroso (por exemplo, milho ceroso 04201 da Cerestar, Batelada: WM5671)foi produzida em 50 mM de tampão de acetato de Na, pH 6,0, 40 ppm deCa2+.

As enzimas purificadas foram dosadas em uma concentraçãode 0,0073 mg de proteína enzimática por grama de substância seca da misturade reação. A quantidade de proteína da enzima amilase foi calculada combase nos valores de A2so e nas seqüências de aminoácidos (composições deaminoácidos) com o uso dos princípio delineados em S. C. Gill e Ρ. H. vonHippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989). Após a dosagem daenzima, a reação foi incubada a 60°C. Alíquotas foram removidas após 24horas e diluídas a 1:1 em água desmineralizada e duas gotas de HCl 1 Mforam adicionadas. As enzimas foram inativadas por ebulição por 15 minutos.As amostras foram filtradas através de um filtro de 0,2 μιη antes da aplicaçãona HPLC ajustada com duas colunas Aminex HPX 42A (Biorad) conectadasem série e usando-se água como eluente.

100 mg de pancreatina foram dissolvidos em 10 ml de tampãode acetato de Na 50 mM, pH 5,5, 20 μΐ desta solução foram adicionados a 1ml de pasta de substrato (50 mg/ml de amido de milho ceroso em acetato deNa 50 mM, pH 5,5) e incubados a 37°C por 24 horas, e depois inativados efiltrados como descrito acima antes da aplicação na HPLC.

Em uma experiência separada (não mostrada), a amilase da"SEQ 1" foi também testada a 37°C, o que deu origem ao mesmo perfil dedegradação como a 60°C.

Resultados

Os cromatogramas resultantes após24 horas de incubação sãoapresentados nas Figuras 1 a 5 juntamente com as indicações de modo que ocomposto seja representado pelo pico no cromatograma. A bem da clareza,estas indicações foram introduzidas na Figura 1 apenas, mas elas se aplicammutatis mutandis a cada uma das outras figuras também. A designação de DPsignifica o Grau de Polimerização. Assim, DPl designa o monômero, DP2, odímero, DP3, o trímero, DP4, o tetrâmero, DP5, o pentâmero, DP6, ohexâmero, e assim por diante.

Parece das figuras que a alfa-amilase fungica ("A. oryzae")gera DP2, DP3 e DP4 como os principais produtos de degradação, enquantodeixa uma grande fração não hidrolisada (grande pico no tempo de retençãode 10 minutos). O DPl não foi detectado como um produto de degradação.

As alfa-amilases bacterianas, por outro lado ("SEQ 1", "SEQ2", "SEQ 3"), em geral, produzem DPI, DP2, DP3, e qualquer dentre DP5 ouDP6, como produtos principais, deixando apenas uma pequena parte dosubstrato não hidrolisado. Geralmente, uma baixa quantidade de DP4 pareceser produzida.

No que diz respeito à Pancreatina, ela parece comportar-secomo uma mistura das amilases fungicas e bacterianas descritas acima, isto é,gerando produtos de baixo DP (DPI, DP2 e DP3), quase nada de DP4, DP5 eDP6, e apenas deixando um pequeno pico de substrato não hidrolisado.

Exemplo 5: Composições farmacêuticas de amilase

(A) Pelotas de alta resistência

Um concentrado líquido foi preparado como descrito na DK2005 00931 (um ultrafiltrado em filtração de germe) da amilase tendo osaminoácidos 1 a 486 da SEQ ID NO: 1. O concentrado líquido foi secado porpulverização. O conteúdo medido da proteína de amilase do pó de amilasesecado por pulverização, foi de 37%. 1125 g do pó de amilase secado porpulverização foram pré-misturados secos junto com celulose microcristalina(450 g) e polietileno glicol 4000 (Macrogol® 4000; 675 g) em um misturadorcomercialmente disponível. Álcool isopropílico a 100% (460 g) foiadicionado e a massa úmida resultante continuou a ser completamentemisturada na temperatura ambiente. A massa homogeneizada foi entãoextrusada em uma extrusora comercialmente disponível que foi ajustada comuma matriz de perfurar tendo um diâmetro de furo de 0,8 mm para formarpelotas cilíndricas. A temperatura das contas não excedeu os 50°C enquantoem extrusão. O extrusado produzido foi arredondado em pelotas esféricascom um esferonizador comercialmente disponível mediante a adição daquantidade necessária de álcool isopropílico a 100% (75,5 g). As pelotasforam secadas em uma temperatura de suprimento de aproximadamente 40°Cem um secador a vácuo comercialmente disponível (da Voetsch). Atemperatura do produto não excedeu os 450C. As pelotas secas foram entãoseparadas com o uso de uma máquina de peneira mecânica com telas de 0,7 e1,4 mm. As frações da peneira de > 0,7 mm e < 1,4 mm foram coletadas epuderam ser carregadas em porções de 200 mg de pelotas cada em cápsulasde tamanho 2. A concentração de amilase das pelotas secas resultantes foi deaproximadamente 18,5% (p/p).

(B) Pelotas de menor resistênciaSemelhante ao exemplo (A) acima fornecido, as pelotas comum conteúdo menor de amilase foram produzidas com o uso de 562,5 g domesmo pó de amilase secado por pulverização, celulose microcristalina (1125g), polietileno glicol 4000 (562,5 g), álcool isopropílico para umedecer (700g) e álcool isopropílico para boleamento (41,6 g). A concentração de amilasedas pelotas secas resultantes foi aproximadamente de 9,3% (p/p).

As pelotas resultantes dos exemplos (A) e (B) foram testadasquanto à atividade amilolítica pela aplicação de um método da FEPmodificado para amilases microbianas. Em princípio, o amido é hidrolisadopela amilase em pH 5,8 e em uma temperatura constante (37,0 ± 0,1 °C) napresença de cloreto de sódio e cloreto de cálcio. Os grupos redutoresresultantes da hidrólise reagem com iodo em solução alcalina e o excesso deiodo foi titulado com tiossulfato. Uma unidade de amilase é definida como aquantidade de enzima, que, sob as condições e substrato definidos, hidrolisa 1micromol de ligação glicosídica por minuto. A atividade amilolítica naspelotas foi observada ser de aproximadamente 96% em relação à atividadeamilolítica no material de amilase pulverulento de partida para cada um dosExemplos (A) e (B).

As pelotas resultantes dos Exemplos (A) e (B) foram entãotestadas quanto à desintegração de acordo com a Farmacopéia Européia 2.9.1.(Seção de "Desintegração de tabletes e cápsulas") (solução de teste: água -500 ml, 37°C). A desintegração das pelotas do Exemplo (A) foi completadadentro de 15 minutos. A desintegração das pelotas do Exemplo (B) foicompletada dentro de 9 minutos.

Exemplo 6: Composições farmacêuticas de amilase e protease

As pelotas de alta resistência contendo amilase e proteaseforam preparadas como segue:

Um concentrado líquido filtrado em germe da protease dosaminoácidos 1 a 274 de SEQ ID NO: 5 foi preparado como descrito noExemplo 1 do pedido de patente DK n° 2005 00930 e secado porpulverização. A amilase secada por pulverização na forma de pó (398,5 g)preparada como descrito no Exemplo 5, foi pré-misturada seca com o pó deprotease secado por pulverização (746,5 g, tendo um conteúdo de proteína deprotease medido de 58,5%), celulose microcristalina (458g) e polietilenoglicol 4000 (Macrogol® 4000; 687 g) em um misturador comercialmentedisponível. Álcool isopropílico a 100% (460 g) foi adicionado e a massaúmida resultante continuou a ser completamente misturada na temperaturaambiente. A massa homogeneizada foi então extrusada em uma extrusoracomercialmente disponível que foi ajustada com uma matriz de perfurar tendoum diâmetro de furo de 0,8 mm para formar pelotas cilíndricas. A temperaturadas contas não excedeu os 50°C enquanto em extrusão. O extrusadoproduzido foi arredondado em pelotas esféricas com um esferonizadorcomercialmente disponível mediante a adição da quantidade necessária deálcool isopropílico a 100% (58 g). As pelotas foram secadas com o uso deuma temperatura de suprimento de aproximadamente 40°C em um secador devácuo comercialmente disponível (da Voetsch). A temperatura do produto nãoexcedeu os 450C. As pelotas secas foram então separadas mediante o uso deuma máquina de peneira mecânica com telas de 0,7 e 1,4 mm. As frações dapeneira > 0,7 mm e < 1,4 mm foram coletadas e puderam ser carregadas emporções de 200 mg cada em cápsulas de tamanho 2.

As pelotas disso resultantes foram testadas quanto àsatividades proteolíticas e amilolíticas de acordo com os métodos delineadosacima. Nenhuma perda na atividade proteolítica ou na amilolítica foiobservada nas pelotas em cada caso em relação ao material pulverulento departida de protease ou amilase, respectivamente.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Novozymes A/S

Solvay Pharmaceuticals GmbH<120> Amylases para uso farmacêutico<130> 10795.204-W0<160> 16

<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 513<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus<220>

<221> VARIANTE<222> (1)..(513)

<4 00> 1 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu1 5 10 15 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn 20 25 30 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 35 40 45 Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 50 55 60 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr65 70 75 80Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 85 90 95 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly 100 105 110 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 130 135 140 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His145 150 155 160Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 165 170 175 Lys Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu Phe Gly 180 185 190 Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His Pro Glu 195 200 205 Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn Thr Thr 210 215 220 Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser225 230 235 240Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly Lys Pro 245 250 255 Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys Leu His 260 265 270 Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asp Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp Ala Pro 275 280 285 Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala Phe Asp 290 295 300 Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro Thr Leu305 310 315 320Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln Ala Leu 325 330 335 Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile 340 345 350 Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr 355 360 365Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile Asp Pro 370 375 380 Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr385 390 395 400Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Gly Thr Glu 405 410 415 Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val Phe Tyr 435 440 445 Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser Asp Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Val Pro465 470 475 480Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr Arg Pro 485 490 495 Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val Ala Trp 500 505 510 Pro <210> 2 <211> 4 í η <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> VARIANTE <222> (1).. (481) <400> 2 Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp1 5 10 15 Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp 20 25 30 Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser 35 40 45 Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 50 55 60 Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu65 70 75 80Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr 85 90 95 Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp 100 105 110 Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser 115 120 125 Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg 130 135 140 Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly145 150 155 160Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn Tyr Asp 180 185 190 Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val Ala 195 200 205 Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp 210 215 220 Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg225 230 235 240Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr 245 250 255 Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu 260 265 270 Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr275 280 285 Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys 290 295 300 Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr305 310 315 320Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr 325 330 335 Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg 340 345 350 Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys 355 360 365 Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro 370 375 380 Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr385 390 395 400Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser 405 410 415 Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly 420 425 430 Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His 435 440 445 Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly 450 455 460 Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln465 470 475 480Arg <210> 3 <211> 483 <212> PRT <213> Bacillus sp. <220> <221> VARIANTE <222> (1).. (483) <400> 3 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Lys Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu 180 185 190 Phe Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His 195 200 205 Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn 210 215 220Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys225 230 235 240Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala Thr Gly 245 250 255Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala 260 265 270 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp 275 280 285 Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly Gly Asn 290 295 300 Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro305 310 315 320Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Glu Glu 325 330 335Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala 340 345 350 Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp 355 360 365 Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser Lys Ile 370 375 380 Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg Gln Asn385 390 395 400Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn 405 410 415Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Ala 420 425 430 Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly Gln Val 435 440 445 Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Lys Ala Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala 450 455 460 Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp465 470 475 480Val Asn Lys

<210> 4<211> 485<212> PRT

<213> Bacillus halmapalus<220>

<221> mat_peptideo<222> (1) .. (485)<400> 4

His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp 20 Gly Asn His Trp Asn 25 Arg Leu Arg Asp Asp 30 Ala SerAsn Leu Arg 35 Asn Arg Gly Ile Thr 40 Ala Ile Trp Ile Pro 45 Pro Ala TrpLys Gly 50 Thr Ser Gln Asn Asp 55 Val Gly Tyr Gly Ala 60 Tyr Asp Leu TyrAsp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Ser Gln Leu 85 Glu Ser Ala Ile His 90 Ala Leu Lys Asn Asn 95 GlyVal Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu 130 Ile Ser Gly Asp Tyr 135 Thr Ile Glu Ala Trp 140 Thr Lys Phe AspPhe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys305 310 315 320His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr385 390 395 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser4 65 470 475 480Ile Trp Val Lys Arg 485 <210> 5 <211> 274 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <220> <221> mat peptideo <222> (1).. (274) <400> 5 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15 Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly 50 55 60 Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp 100 105 110Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val 115 120Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln 130 135 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala145 150

Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala 165 Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn 180 Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro 195 200Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu 210 215 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu225 230 Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg 245 Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys 260 Ala Gln <210> 6 <211> 188 <212> PRT <213> Nocardiopsis sp. <220> <221> mat peptídeo <222> (1).. (188) <400> 6 Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala1 5 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala 20 Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly 35 40Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val 50 55 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr65 70 Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val 85 Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly 100 Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser 115 120Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val 130 135 Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln145 150 Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly 165 Pro Met Val Asn iQn Ser Trp Gly Val

180

<210> 7<211> 188<212> PRT

<213> Nocardiopsis dassonvillei<220>

<221> mat_peptideo<222> (1) .. (188)<400> 7

Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala

Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala 125 Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg 140 Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn 155 160Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val 170 175 Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly185 190 Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr 205 Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 220 Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 235 240Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 250 255 Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala265 270 Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser 10 15 Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr25 30 Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly 45 Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 60 Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr 75 80Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile 90 95 Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly105 110 Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val 125 Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 140 Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly 155 160Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr 170 175 Arg Leu Arg Thr

185

subsp. dassonvillei

Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser1 5 10 15 Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr 20 25 30 Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly 35 40 45 Thr Gly Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr65 70 75 80Asn Ser Gly Gly Tyr Gln Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala 85 90 95 Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly 100 105 110 Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val 115 120 125 Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly 130 135 140 Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly145 150 155 160Ser Gly Asn Cys Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr 165 170 175 Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly Val Arg Ile Arg Thr 180 185 <210> 8 <211> 274 <212> PRT <213> Humicola lanuginosa <220> <221> VARIANTE <222> (1).. (274) <220> <221> mat peptideo <222> (6).. (274) <400> 8 Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn-5 -1 1 5 10 Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp 15 20 25 Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu 30 35 40 Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly 45 50 55 Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu60 65 70 75Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly 80 85 90 Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys 95 100 105 Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr 110 115 120 Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg 125 130 135 Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala140 145 150 155Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr 160 165 170 Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val 175 180 185 Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val 190 195 200 Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu 205 210 215 Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile220 225 230 235

Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn

240 245 250

Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr255 260 265

Cys Leu

<210> 9<211> 269<212> PRT

<213> Humicola lanuginosa<220>

<221> mat_peptídeo<222> (1)..(269)<400> 9

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr15 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu260 265

<210> 10<211> 483<212> PRT

<213> Bacillus licheniformis<220>

<221> mat_peptídeo<222> (1)..(483)<4 00> 10

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro15 10 15

Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

20 25 30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala 50 55 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg65 70 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu 85 90Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys 100 105 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro 115 120 Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp 130 135 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys145 150 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys 165 170Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val 180 185 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp 195 200 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp 210 215 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys225 230 Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu 245 250Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp 260 265 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser 275 280 His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln 290 295 Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser305 310 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln 325 330Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu 340 345 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe 355 360 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro 370 375 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr385 390 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly 405 410Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala 420 425 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg 435 440 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu 450 455 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly465 470 Val Gln Arg

<210> 11<211> 480<212> PRT

<213> Bacillus amyloliquefaciens<220>

<221> mat_peptideo<222> (1)..(480)

Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 60 Thr Lys Tyr Gly Thr Lys75 80His Ser Arg Asp Ile Asn 95 Gly Gly Ala Asp Ala Thr 110 Ala Asp Arg Asn Arg Val 125 Thr His Phe His Phe Pro 140 Trp His Trp Tyr His Phe155 160Leu Asn Arg Ile Tyr Lys 175 Ser Asn Glu Asn Gly Asn 190 Tyr Asp His Pro Asp Val 205 Tyr Ala Asn Glu Leu Gln 220 His Ile Lys Phe Ser Phe235 240Lys Thr Gly Lys Glu Met 255 Leu Gly Ala Leu Glu Asn 270 Val Phe Asp Val Pro Leu 285 Gly Gly Gly Tyr Asp Met 300 Lys His Pro Leu Lys Ser315 320Pro Gly Gln Ser Leu Glu 335 Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 350 Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 365 Ala Leu Lys His Lys Ile 380 Ala Tyr Gly Ala Gln His395 400Trp Thr Arg Glu Gly Asp 415 Leu Ile Thr Asp Gly Pro 430 Gln Asn Ala Gly Glu Thr 445 Pro Val Val Ile Asn Ser 460 Gly Ser Val Ser Ile Tyr475 480<400> 11

Val Asn Gly Thr1

Gly Gln His Trp20

Ile Gly Ile Thr35

Gln Ser Asp Asn50

Phe Gln Gln Lys65

Leu Gln Asp Ala

Gly Asp Val Val100

Val Thr Ala Val115

Glu Glu Tyr Gln130

Gly Asn Thr Tyr145

Ala Asp Trp Asp

Gly Glu Gly Lys180

Tyr Asp Tyr Leu195

Val Ala Glu Thr210

Leu Asp Gly Phe225

Leu Arg Asp Trp

Phe Thr Val Ala260

Tyr Leu Asn Lys275

His Phe Asn Leu290

Arg Arg Leu Leu305

Val Thr Phe Val

Ser Thr Val Gln340

Thr Arg Glu Ser355

Thr Lys Gly Thr370

Glu Pro Ile Leu385

Asp Tyr Ile Asp

Ser Ser Ala Ala420

Gly Gly Ser Lys435

Trp Tyr Asp Ile450

Asp Gly Trp Gly465<210> 12<211> 514

10

Leu Met Gln Tyr Phe Glu5 10Lys Arg Leu Gln Asn Asp 25 Ala Val Trp Ile & η Pro ProGly Tyr Gly fè U Pro Tyr Asp 55 Gly Thr Val Arg Thr Lys 70 Ile Gly Ser Leu His Ser85 90Leu Asn His Lys Ala Gly 105 Glu Val Asn Pro Ala Asn 120 Ile Lys Ala Trp Thr Asp 135 Ser Asp Phe Lys Trp His 150 Glu Ser Arg Lys Ile Ser165 170Ala Trp Asp Trp Glu Val 185 Met Tyr Ala Asp Val Asp 200 Lys Lys Trp Gly Ile Trp 215 Arg Ile Asp Ala Ala Lys 230 Val Gln Ala Val Arg Gln245 250Glu Tyr Trp Gln Asn Asn 265 Thr Ser Phe Asn Gln Ser 280 Gln Ala Ala Ser Ser Gln 295 Asp Gly Thr Val Val Ser 310 Glu Asn His Asp Thr Gln325 330Thr Trp Phe Lys Pro Leu 345 Gly Tyr Pro Gln Val Phe 360 Ser Pro Lys Glu Ile Pro 375 Lys Ala Arg Lys Glu Tyr 390 His Pro Asp Val Ile Gly405 410Lys Ser Gly Leu Ala Ala 425 Arg Met Tyr Ala Gly Leu 440 Thr Gly Asn Arg Ser Asp 455 Glu Phe His Val Asn Asp 470

Trp Tyr Thr Pro Asn Asp 15 Ala Glu His Leu Ser Asp 30 Ala Tyr Lys Gly Leu Ser 45 Leu Tyr Asp Leu Gly Glu 60 Tyr Gly Thr Lys Ser Glu75 80Arg Asn Val Gln Val Tyr 95 Ala Asp Ala Thr Glu Asp 110 Arg Asn Gln Glu Thr Ser 125 Phe Arg Phe Pro Gly Arg 140 Trp Tyr His Phe Asp Gly155 160Arg Ile Phe Lys Phe Arg 175 Ser Ser Glu Asn Gly Asn 190 Tyr Asp His Pro Asp Val 205 Tyr Ala Asn Glu Leu Ser 220 His Ile Lys Phe Ser Phe235 240Ala Thr Gly Lys Glu Met 255 Ala Gly Lys Leu Glu Asn 270 Val Phe Asp Val Pro Leu 285 Gly Gly Gly Tyr Asp Met 300 Arg His Pro Glu Lys Ala315 320Pro Gly Gln Ser Leu Glu 335 Ala Tyr Ala Phe Ile Leu 350 Tyr Gly Asp Met Tyr Gly 365 Ser Leu Lys Asp Asn Ile 380 Ala Tyr Gly Pro Gln His395 400Trp Thr Arg Glu Gly Asp 415 Leu Ile Thr Asp Gly Pro 430 Lys Asn Ala Gly Glu Thr 445 Thr Val Lys Ile Gly Ser 460 Gly Ser Val Ser Ile Tyr475 480<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophi<220>

<221> mat_peptídeo<222> (1) .. (514)

<4 00> 12 Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met1 5 Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr 20 Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala 35 40Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly 50 55 Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly65 70 Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile 85 Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe 100 Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu 115 120Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile 130 135 Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser145 150 Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu 165 Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala 180 Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met 195 200Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys 210 215 Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg225 230 Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu 245 Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu 260 Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr 275 280Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr 290 295 Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr305 310 Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp 325 Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro 340 Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly 355 360Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn 370 375 Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg385 390 Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile 405 Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu 420 Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val 435 440Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg

Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu 10 15 Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn25 30 Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys 45 Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp 60 Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr 75 80Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met 90 95 Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly105 110 Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln 125 Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe 140 Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His 155 160Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr 170 175 Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu185 190 Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His 205 Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn 220 Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys 235 240Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly 250 255 Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys265 270 Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp 285 Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr 300 Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro 315 320Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln 330 335 Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala345 350 Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp 365 Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile 380 Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His 395 400Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val 410 415 Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro425 430 Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val 445 Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser450

455

460

Gly Gly Ser Val Ser Val Trp

Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn

465

470

475

480

Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr485

Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg

Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val510

Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr

490

495

500

505

Ala Trp

<210> 13<211> 1620<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> VARIANTE de DNA de Bacillus stearothermophilus<220>

<221> misc_aspecto<222> (1)..(1620)

<223> DNA codificando SEQ ID NO: 1<4 00> 13

atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60

ttgctgcctc attctgcagc cgcggcaccg tttaacggca ccatgatgca gtattttgaa 120tggtacttgc cggatgatgg cacgttatgg accaaagtgg ccaatgaagc caacaactta 180tccagccttg gcatcaccgc tctttggctg ccgcccgctt acaaaggaac aagccgcagc 240gacgtagggt acggagtata cgacttgtat gacctcggcg aattcaatca aaaagggacc 300gtccgcacaa aatacggaac aaaagctcaa tatcttcaag ccattcaagc cgcccacgcc 360gctggaatgc aagtgtacgc cgatgtcgtg ttcgaccata aaggcggcgc tgacggcacg 420gaatgggtgg acgccgtcga agtcaatccg tccgaccgca accaagaaat ctcgggcacc 480tatcaaatcc aagcatggac gaaatttgat tttcccgggc ggggcaacac ctactccagc 540tttaagtggc gctggtacca ttttgacggc gttgattggg acgaaagccg aaaattgagc 600cgcatttaca aattccgtgg caaggcttgg gattgggaag tagacacgga attcggaaac 660tatgactact taatgtatgc cgaccttgat atggatcatc ccgaagtcgt gaccgagctg 720aaaaactggg ggaaatggta tgtcaacaca acgaacattg atgggttccg gcttgatgcc 780gtcaagcata ttaagttcag tttttttcct gattggttgt cgtatgtgcg ttctcagact 840ggcaagccgc tatttaccgt cggggaatat tggagctatg acatcaacaa gttgcacaat 900tacattacga aaacagacgg aacgatgtct ttgtttgatg ccccgttaca caacaaattt 960tataccgctt ccaaatcagg gggcgcattt gatatgcgca cgttaatgac caatactctc 1020atgaaagatc aaccgacatt ggccgtcacc ttcgttgata atcatgacac cgaacccggc 1080caagcgctgc aatcatgggt cgacccatgg ttcaaaccgt tggcttacgc ctttattcta 1140actcggcagg aaggataccc gtgcgtcttt tatggtgact attatggcat tccacaatat 1200aacattcctt cgctgaaaag caaaatcgat ccgctcctca tcgcgcgcag ggattatgct 1260tacggaacgc aacatgatta tcttgatcac tccgacatca tcgggtggac aagggaaggg 1320ggcactgaaa aaccaggatc cggactggcc gcactgatca ccgatgggcc gggaggaagc 1380aaatggatgt acgttggcaa acaacacgct ggaaaagtgt tctatgacct taccggcaac 1440cggagtgaca ccgtcaccat caacagtgat ggatgggggg aattcaaagt caatggcggt 1500tcggtttcgg tttgggttcc tagaaaaacg accgtttcta ccatcgctcg gccgatcaca 1560acccgaccgt ggactggtga attcgtccgt tggaccgaac cacggttggt ggcatggcct 1620<210> 14<211> 1461<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> VARIANTE de DNA de Bacillus licheniformis<220>

<221> misc_aspecto<222> (1) .. (1461)

<223> DNA codificando SEQ ID NO: 2<4 00> 14

atgcctgcag cagcagccgt aaatggcacg ctgatgcagt attttgaatg gtatacgccg 60

aacgacggcc agcattggaa acgattgcag aatgatgcgg aacatttatc ggatatcggt 120attactgccg tctggattcc cccggcatat aagggaacga gccaagcgga tgtgggctac 180ggtgcttacg acctttatga tttaggggag tttcatcaaa aagggacggt tcggacaaag 240tacggcacaa aaggagagct gcaatctgcg atcaaaagtc ttcattcccg cgacattaac 300gtttacgggg atgtggtcatgcggttgaag tcgatcccgcgcctggacac attttcattttggtaccatt ttgacggaactttcaaggga agacttgggaatgtatgccg acatcgattaacttggtatg ccaatgaactaaattttctt ttttgcgggatttacggtag ctgagtactgacaaatttta atcattcagtacacagggag gcggctatgaccgttgaaat cggttacatttcgactgtcc aaacatggttggataccctc aggttttctaattcctgcct tgaaacacaaggagcacagc atgattatttagctcggttg caaattcaggcgaatgtatg tcggccggcatcggagccgg ttgtcatcaagtttcaattt atgttcaaag a<210> 15<211> 1449<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> VARIANTE de DNA de Bacillus sp.<220>

<221> misc_aspecto

<222> (1)..(1449)

<223> DNA encoding SEQ ID NO: 3

<400> 15

caaccacaaatgaccgcaactccggggcgccgattgggacttgggaagtttgaccatcctgcaattggacttgggttaatgtcgaatgacgtttgacgtgtatgaggaaatgtcgataactaagccgcttcggggatatgaattgaaccgcgaccaccattttggcggcaaaacgccggtttcggaaggc

ggcggcgctgcgcgtaatttggcagcacatgagtcccgaatccaatgaatgacgtcgtagggtttccgtccatgtcagggttgggcgcgcccgcttcattttgctgaacgcatgatacacgcttacgctttacgggacgaatcttaaaaggacattgtcgttaataacaggagacatggctggggagagt

atgcgaccgacaggagaacaacagcgatttagctgaaccgtcggcaactacagaaattaattgatgctgtaaaaaacgggtggaaaactaatcagttccagtacggtcgtagccggggcattattctcacaaggagactccgagaaaacagctggacaagacggacccggatgacattacttcacgtaaa

agatgtaacccctaattaaataagtggtatcatctataagtgattatttggagatggggccaaacacattgaaggaaatgtttgaacaaatgctgcatcgttccaagcatatcgcttgagaagggaatctccagcgcgaagtatgcgtacggaaggcgactggggcaaagcggaaaccgtcggcgggtcg

caccataatg gtacgaacggggaaaccatt ggaatagattgcggtttgga ttcctcctgctatgatctgt atgatttaggacgcgcaatc agttacaagcggcgatgttg taatgaatcagaagtaaacc cgaataatagacaaagtttg actttccaggcactttgatg gagtagattgcgcggtaaag ggtgggattgtatgcagata ttgacatggatggtatacga atacattaggtacagcttta ctcgtgattggcggttgcgg aattttggaaaactggaacc attcagtcttagcggaggga attatgatatatgcatgctg ttacatttgttttgttgaag aatggttcaatacccttctg tattttatggaaatcgaaaa ttgacccgatgactacttag accatcataaaactccggtt tagctactatgggcgtaata aagctggtcaacgattaatg ctgatggatggtaaacaaa<210> 16<211> 1768<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> VARIANTE de DNA<220>

cacaatgatgaaggtctgatatggaagggtagaattcaattgcggttaactaaagggggaaaatcaagaaacgaggtaatggatcagtcaggaagtcgattcacccagagccttgatggtgattaatcataaatgatttatgatgttccggaggcaaatatgataatcataccattagcgagattattattctagaagcgtatcatcggtcatgtccgatagtttggaccgggtaatttt

cagtactttggcaagtaaccgcctctcaaacaaaaaggaagccttgaaaagcagacgctagtgtccggtgactcattcaacgtaagctgaacagaattcggtagtgaatgtttagaataggttagaagtgggtgctattgctgcactatatttaatggtagattcgcaactatgctttgaggcattccaacgtcaaaagttggacacgtgggggcaggaggatatcactgtctgtaaatg

aatggtatcttaaaagataaatgatgtgggccattcgtacgtaatggaatccgaaatggtaatatacaatacttcaaatgacaatcgaatgtaactatgaagctaagaaaatgcagtaaacaactggcaaaaaactatttacctctataacagtcgtgcactgaagaagccattaacacgcgcatggtgtatgcatatggaagggaatacgaaataagtggaaataaagcgaggatcagt

accaaatgacagggatctcagtatggtgctaaaatatggatcaagtgtattaaagcagtctgaggcttgggagatggtatttataaattcttacctaâtgttggggtgttacatataaaaaaatatgtttaaacaaaacatgcttcaaaaaaagcatccatttagagtcttgaacaaggcaccagcgatgaagacaaaatagcacaccccgatgtttgttcggtactgttttctatttgg

360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401461

60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401449

de Bacillus halmapalus<221> misc_aspecto

<223> DNA codificando SEQ ID NO: 4<400> 16

gtgaggaaac gaaaaaatat gctattaagt atgtttatag tatttattat gatgctttct 60

tttgtgccag tttcaggtgg agaggtagaa gcacatcata atgggacaaa tgggacgatg 120

atgcaatact ttgaatggca cttgcctaat gatgggaatc actggaatag attaagagat 180

gatgctagta atctaagaaa tagaggtata accgctattt ggattccgcc tgcctggaaa 240

gggacttcgc aaaatgatgt ggggtatgga gcctatgatc tttatgattt aggggaattt 300

aatcaaaagg ggacggttcg tactaagtat gggacacgta gtcaattgga gtctgccatc 360

catgctttaa agaataatgg cgttcaagtt tatggggatg tagtgatgaa ccataaagga 420

ggagctgatg ctacagaaaa cgttcttgct gtcgaggtga atccaaataa ccggaatcaa 480

gaaatatctg gggactacac aattgaggct tggactaagt ttgattttcc agggaggggt 540

aatacatact cagactttaa atggcgttgg tatcatttcg atggtgtaga ttgggatcaa 600

tcacgacaat tccaaaatcg tatctacaaa ttccgaggtg atggtaaggc atgggattgg 660

gaagtagatt cggaaaatgg aaattatgat tatttaatgt atgcagatgt agatatggat 720

catccggagg tagtaaatga gcttagaaga tggggagaat ggtatacaaa tacattaaat 780

cttgatggat ttaggatcga tgcggtgaag catattaaat atagctttac acgtgattgg 840

ttgacccatg taagaaacgc aacgggaaaa gaaatgtttg ctgttgctga attttggaaa 900

aatgatttag gtgccttgga gaactattta aataaaacaa actggaatca ttctgtcttt 960

gatgtccccc ttcattataa tctttataac gcgtcaaata gtggaggcaa ctatgacatg 1020

gcaaaacttc ttaatggaac ggttgttcaa aagcatccaa tgcatgccgt aacttttgtg 1080

gataatcacg attctcaacc tggggaatca ttagaatcat ttgtacaaga atggtttaag 1140

ccacttgctt atgcgcttat tttaacaaga gaacaaggct atccctctgt cttctatggt 1200

gactactatg gaattccaac acatagtgtc ccagcaatga aagccaagat tgatccaatc 1260

ttagaggcgc gtcaaaattt tgcatatgga acacaacatg attattttga ccatcataat 1320

ataatcggat ggacacgtga aggaaatacc acgcatccca attcaggact tgcgactatc 1380

atgtcggatg ggccaggggg agagaaatgg atgtacgtag ggcaaaataa agcaggtcaa 1440

gtttggcatg acataactgg aaataaacca ggaacagtta cgatcaatgc agatggatgg 1500

gctaattttt cagtaaatgg aggatctgtt tccatttggg tgaaacgata atggaaaaaa 1560

gaaaaggcta aatggtcttt tctttttttc taggaggtgt tgtaaatgga gtttattcaa 1620

ttactaagtg ccgagctaaa agatcagtcg tatctttttt taaaattaga agcatttgtt 1680

tccgtattag atatagaggg tcatgaaaaa tgtgttatgc aatatcaaat ggggcagcag 1740

ttctttacag tgagcggcaa tgaaattg 1768

Claims (19)

1. Amilase, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos-50% de identidade a (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: I5 (ii)aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483 daSEQ ID NO: 3; para uso como um medicamento.

2. Amilase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que:a) a amilase compreende uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo consistindo em (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO:-1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1 a 483da SEQ ID NO: 3 e/oub) a amilase é uma variante de uma seqüência de aminoácidosselecionados do grupo consistindo em (i) aminoácidos 1 a 481 da SEQ IDNO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2, e/ou (iii) aminoácidos 1 a-483 da SEQ ID NO: 3, em que a variante difere da seqüência de aminoácidosrespectiva por não mais do que vinte e cinco aminoácidos, e em que:(i) a variante compreende pelo menos uma substituição,deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos em comparação com arespectiva seqüência de aminoácidos; e/ou(ii) a variante compreende pelo menos uma pequena deleçãoem comparação com a respectiva seqüência de aminoácidos; e/ou(iii) a variante compreende pelo menos uma pequenaextensão N-terminal ou C-terminal em comparação com a respectivaseqüência de aminoácidos; e/ouc) a amilase é uma variante alélica de uma amilase tendoaminoácidos selecionados do grupo consistindo de (i) aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii)aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3; e/oud) a amilase é um fragmento de uma amilase tendoaminoácidos selecionados do grupo consistindo em (i) aminoácidos 1 a 481da SEQ ID NO: 1, (ii) aminoácidos 1 a 481 da SEQ ID NO: 2 e/ou (iii)aminoácidos 1 a 483 da SEQ ID NO: 3.

3. Amilase de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelofato de que tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo nos (i) aminoácidos 1 a 481, 1 a 484, 1 a 486 ou 1 a 513 da SEQID NO: 1; (ii) aminoácidos 1 a 481 of SEQ ID NO: 2 e/ou (iii) aminoácidos 1a 483 da SEQ ID NO: 3.

4. Amilase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, em combinação com uma lipase ou uma protease, caracterizada pelo fato deser para uso como um medicamento.

5. Amilase de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, em combinação com uma lipase e uma protease, caracterizada pelo fato deser para uso como um medicamento.

6. Amilase em combinação com uma lipase e/ou uma proteasede acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que:(i) a lipase tem pelo menos 70% de identidade com umalipase tendo os aminoácidos 1 a 269 da SEQ ID NO: 8;(ii) a protease tem pelo menos 70% de identidade com umaprotease selecionada do grupo consistindo ema) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5,b) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6, ec) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7.

7. Amilase em combinação com uma lipase e/ou uma proteasede acordo com as reivindicações 4 ou 5, a amilase caracterizada pelo fato deque(i)é uma amilase selecionada do grupo consistindo ema) uma amilase compreendendo os aminoácidos 1 a 481 daSEQ ID NO: 1,b) uma amilase tendo os aminoácidos 1 a 48Ida SEQ ID NO: 2,ec) uma amilase tendo os aminoácidos 1 a 483 da SEQ ED NO: 3;(ii) a lipase compreende os aminoácidos 2 a 269 da SEQ ID NO: 8;(iü)a protease é uma protease selecionada do grupoconsistindo ema) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 274 da SEQ ID NO: 5,b) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 6, ec) uma protease tendo os aminoácidos 1 a 188 da SEQ ID NO: 7.

8. Uso de uma amilase como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de distúrbios digestivos, insuficiênciaexócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística, diabete tipo I e/ou diabetetipo II.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que ainda compreende o uso de uma lipase ou de uma protease.

10. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que ainda compreende o uso de uma lipase e uma protease.

11. Uso de acordo com as reivindicações 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que a lipase e/ou protease são como definidas nasreivindicações 6 ou 7.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma amilase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, juntamente com pelo menos um material auxiliar farmaceuticamenteaceitável.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma lipase ou uma protease.

14. Composição de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que ainda compreende uma lipase e uma protease.

15. Composição de acordo com as reivindicações 13 ou 14,caracterizada pelo fato de que a lipase e/ou a protease são como definidas nasreivindicações 6 ou 7.

16. Método para o tratamento de uma doença sendo distúrbiosdigestivos, insuficiência exócrina pancreática, pancreatite, fibrose cística,diabete tipo I e/ou diabete tipo II, o método caracterizado pelo fato de ser pelaadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma amilasecomo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que ainda compreende administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma lipase ou uma protease.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que ainda compreende administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma lipase e uma protease.

19. Método de acordo com as reivindicações 17 ou 18,caracterizado pelo fato de que a lipase e/ou a protease são de acordo com asreivindicações 6 ou 7.