BR112020016068A2

BR112020016068A2 - Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima

Info

Publication number: BR112020016068A2
Application number: BR112020016068-7A
Authority: BR
Inventors: Peyman Moslemy; Nathaniel T. Becker; Luke Barnard
Original assignee: Danisco Us Inc.
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2020-12-08
Also published as: EP3749107A1; WO2019156670A1; CN111867388A; MX2020008302A; US20200359656A1

Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos relacionados para termicamente resistente de partículas de matriz de cera para encapsulação de enzima. as partículas são bem adequadas para aplicações de ração animal, particularmente aqueles envolvendo peletização de vapor

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PARTÍ- CULAS DE MATRIZ DE CERA TERMICAMENTE RESISTENTE PA- RA ENCAPSULAÇÃO DE ENZIMA".

CAMPO DA TÉCNICA

[001] As presentes composições e métodos se referem às partí- culas de matriz de cera termicamente resistentes para encapsulação de enzima. As partículas são bem adequadas para aplicações de ali- mentação animal, particularmente aquelas que envolvem peletização a vapor.

ANTECEDENTES

[002] Processos comerciais existentes para produzir grânulos in- cluem compressão, granulação de alto cisalhamento e revestimento de aspersão de leito fluidizado. Compressão de grânulos de enzima é descrita no documento de Patente no U.S. 4.016.040. Em compressão, também conhecida como resfriamento por aspersão ou congelamento por aspersão, um líquido fundido é atomizado e, então, solidificado em partículas. Vários métodos de atomização podem ser usados, que in- cluem atomização de bocal de aspersão, atomização de bocal de cen- trifugação e atomização de disco giratório. (consultar, por exemplo, os documentos de Patente no U.S. 7.261.529 e 7.758.778). Quando a compressão é aplicada em encapsulação de enzima, um pó de enzima seco é mesclado com um ligante hidrofílico fundido, tal como um ten- soativo não iônico e a mistura é atomizada em gotículas com o uso de um bocal de aspersão ou disco em ar resfriado, de modo que se solidi- fique em partículas sólidas dispersíveis em água substancialmente es- féricas ou "comprimidos" que contêm o pó de enzima distribuído. O ligante nesses comprimidos é hidrofílico e solúvel ou dispersível em água, o que permite que a enzima seja liberada em água de lavagem com detergente uma vez que o ligante se dissolve.

[003] A granulação de alto cisalhamento de enzimas adequadas para uso em alimentação animal peletizada é descrita, por exemplo, no documento no WO 92/12645. A enzima é primeiro granulada com vários ligantes e cargas, por exemplo, para produzir um denominado "grânulo T" (descrito no documento de Patente no U.S. 4.106.991). O grânulo T é, então, super-revestido com um agente que compreende uma gordura ou cera de alto ponto de fusão que, tipicamente, também inclui, adicionalmente, uma carga inorgânica, tal como caulim, silicato de magnésio ou carbonato de cálcio. A gordura ou cera de alto ponto de fusão é especificada como um éster de glicerol ou outra substância cerosa com um ponto de fusão entre 30 e 100 °C.

[004] Os grânulos de enzima com múltiplas camadas de revesti- mento protetoras podem ser produzidos com o uso de processos de revestimento, tais como revestimento de aspersão de leito fluidizado. Por exemplo, o documento no U.S. 2006/040394 descreve um proces- so para produzir um grânulo estável para peletização a vapor que in- clui um revestimento hidratante de umidificação e uma barreira de umidificação aplicada em um núcleo enzimático. O revestimento hidra- tante de umidificação pode ser uma camada que inclui sulfato de sódio e a barreira de umidificação pode ser uma camada que inclui álcool polivinílico e talco.

[005] Um processo para proteger grânulos de enzima com reves- timentos espessos é descrito no documento no WO 01/25412. O reves- timento é denominado uma "unidade de invólucro", que é aplicado so- bre uma "unidade de núcleo", de modo que a razão entre o diâmetro do grânulo resultante e o diâmetro da unidade de núcleo seja de pelo menos 1,1. A atividade enzimática é limitada apenas à unidade de nú- cleo; sendo que a unidade de invólucro é especificada como "substan- cialmente livre de enzima", isto é, que contém menos que 5 mg de en- zima/gramas de invólucro. A unidade de invólucro não tem limitações especificadas em sua composição química e pode incluir materiais hi-

drofílicos ou hidrofóbicos, tais como polímeros ou ceras. Quando usa- da para proteger enzimas em peletização a vapor de alimentações, é especificado que as unidades de invólucro devam ter uma composição geral que derreterá sob as condições de peletização, e devem ter uma temperatura de fusão dentro da faixa de 70 a 120 °C.

[006] Embora os processos e formulações descritos nos docu- mentos de Patente citados acima forneçam um determinado grau de proteção às enzimas contra a inativação por alta temperatura e umidi- ficação, tal como aquela encontrada em peletização a vapor ou arma- zenamento em alimentação animal ou detergentes, essas tecnologias sofrem com determinadas desvantagens. Nas aplicações de compres- são anteriores, os ligantes usados na matriz dissolverão ou derreterão nas condições de alta temperatura e umidade, tais como aquelas usa- das em peletização a vapor, ou secagem por aspersão de detergente de roupas, deixando-se a enzima altamente vulnerável à desnaturação por vapor ou água quente. No caso das outras tecnologias citadas, a proteção da enzima exige a adição de revestimentos espessos que são substancialmente livres de enzima. Tais revestimentos podem ser prontamente aplicados em núcleos de enzima maiores, isto é, aqueles com diâmetros medianos maiores que cerca de 300 mícrons, porém, não são aplicados de maneira eficiente em partículas menores

[007] Portanto, é desejável identificar uma tecnologia de granula- ção que possa proteger enzimas contra a alta temperatura e umidifica- ção, forneça liberação ou biodisponibilidade adequada em aplicações de base aquosa, tais como alimentação animal ou detergentes e, ain- da, evitar a necessidade de aplicar um revestimento protetor ou cama- da de barreira. Também há uma necessidade por uma tecnologia de granulação que tem capacidade para produzir partículas com altas concentrações de enzima ativa que sejam menores que 500 mícrons em diâmetro, que forneçam tanto baixo custo quanto distribuição me-

lhorada quando misturadas em produtos finais, tais como alimentação animal ou detergentes.

SUMÁRIO

[008] As presentes composições e métodos se referem às partí- culas de matriz de cera termicamente resistentes para encapsulação de enzima. As partículas de matriz de cera são bem adequadas para aplicações de alimentos e alimentação animal, particularmente aque- las que envolvem peletização a vapor. Os aspectos e modalidades das composições e métodos são descritos nos seguintes parágrafos inde- pendentemente enumerados.

[009] 1. Em um aspecto, uma partícula que compreende particu- lados que contêm uma ou mais enzimas distribuídas em uma matriz de cera de alto ponto de fusão é fornecida.

[0010] 2. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com o parágrafo 1, a matriz de cera compreende uma cera insolúvel em água.

[0011] 3. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, a cera tem um ponto de fusão máximo de pico maior que 100 °C, opcionalmente maior que 110 °C, e ainda opcionalmente maior que 120 °C.

[0012] 4. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, a cera tem um ponto de fusão inici- al de pelo menos 100 °C e um ponto de fusão máximo de pico de pelo menos 110 °C.

[0013] 5. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, a cera tem um ponto de fusão inici- al de pelo menos 110 °C e um ponto de fusão máximo de pico de pelo menos 120 °C.

[0014] 6. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a cera tem uma viscosidade de fu-

são menor que 500 centipoises em temperaturas dentro de 25 °C aci- ma da temperatura de fusão de cera.

[0015] 7. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, a cera tem um peso molecular pon- deral médio menor que 3.000 e um índice de polidispersão menor que

3.

[0016] 8. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 5, o ECR(40,140) é menor que 20%, e preferencialmente menor que 15%.

[0017] 9. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 8, a enzima é pelo menos uma dentre amilase, celulase, fitase, protease ou xilanase.

[0018] 10. Em algumas modalidades, a partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 9, compreende uma carga útil de en- zima ativa maior que 5% em peso/peso, e uma atividade de água me- nor que 0,3.

[0019] 11. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, os particulados de enzima estão na faixa de cerca de 1 a cerca de 250 micrômetros.

[0020] 12. Em algumas modalidades, a partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 10, compreende um teor de água me- nor que 5% em peso/peso, e uma atividade de água menor que 0,4.

[0021] 13. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 12, as partículas estão na faixa de cerca de 100 a cerca de 500 micrômetros.

[0022] 14. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com o parágrafo 13, o tamanho de partículas está na faixa de cerca de 212 a cerca de 425 micrômetros.

[0023] 15. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com o parágrafo 13, o tamanho de partículas está na faixa de cerca de 212 a cerca de 300 micrômetros.

[0024] 16. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 15, os particulados de enzima são produzidos com qualquer um dentre secagem por aspersão, resfria- mento por aspersão, granulação a seco, granulação úmida ou granu- lação de leito fluidizado.

[0025] 17. Em algumas modalidades, a partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 16, compreende um ingrediente de carga selecionado dentre um grupo de substâncias minerais que con- sistem em calcário, mica, argila e óxido de titânio.

[0026] 18. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 17, a cera é selecionada dentre um grupo de ceras de polímero que consistem em cera de polietileno, cera de polietileno oxidado, cera de polipropileno, cera Fischer-Tropsch, cera de sal de ácido carboxílico ou uma mistura dos mesmos.

[0027] 19. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 17, a cera é uma cera de polietileno.

[0028] 20. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 17, a cera é selecionada dentre um grupo de ceras que consiste em estearato de alumínio, estearato de cálcio, estearato de magnésio, behenato de zinco, laurato de zinco, estearato de zinco ou uma mistura dos mesmos.

[0029] 21. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 17, a cera é estearato de zinco.

[0030] 22. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 18 a 21, a partícula compreende uma re- sina de politerpeno, uma resina de colofônia, goma damar ou uma mis- tura das ditas resinas.

[0031] 23. Em algumas modalidades da partícula, de acordo com parágrafo 21, a partícula compreende uma resina de politerpeno, uma resina de colofônia, goma damar ou uma mistura das ditas resinas.

[0032] 24. Em outro aspecto, um método para preparar uma partí- cula que compreende particulados de enzima distribuídos dentro de uma matriz de cera de alto ponto de fusão é fornecido, o qual compre- ende: (a) distribuir um pó de enzima seco em uma cera fundida para fornecer uma suspensão de enzima-cera; (b) atomizar a suspensão de enzima-cera para formar go- tículas discretas; e (c) resfriar, solidificar e coletar as partículas de enzima- cera.

[0033] 25. Em algumas modalidades do método, de acordo com o parágrafo 24, as partículas de enzima-cera resultantes são as partícu- las, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 23.

[0034] 26. Em outro aspecto, um método para melhorar cresci- mento de aves ou porcinos é fornecido, o qual compreende introduzir uma partícula, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 23, na dieta do animal, e medir um melhoramento em crescimento em relação ao animal de controle não tratado com tal partícula.

[0035] Esses e outros aspectos e modalidades das composições e métodos serão evidentes a partir da descrição e desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0036] A Figura 1 mostra um termograma de DSC de ácido esteá- rico comercial que demonstra um ECR(40,140) = 99,69%.

[0037] A Figura 2 mostra um termograma de DSC de cera Fischer- Tropsch comercial, Sasolwax C 105, que demonstra um ECR(40,140) de 45,94%.

[0038] A Figura 3 mostra um termograma de DSC de cera de ho- mopolímero de polietileno comercial, Honeywell A-C® 820A, que de- monstra um ECR(40,140) de 15,26%

[0039] A Figura 4 mostra um termograma de DSC de estearato de zinco comercial, ZINCUM® SP VEG, que demonstra um ECR(40,140) de 9,68%.

[0040] A Figura 5 mostra um termograma de DSC de cera de ho- mopolímero de polietileno comercial, POLYWAX™ 2000, que demons- tra um ECR(40,140) de 6,07%

[0041] A Figura 6 é um diagrama esquemático de uma configura- ção de atomização de disco giratório usada para produção de grânulos de enzima. Valores de carga útil e temperatura de enzima mostrados são exemplificativos.

[0042] A Figura 7 é um gráfico que mostra a variação de cinza de tíbia epifisária medida em um estudo de bioeficiência de fitase de ali- mentação. Os grânulos de fitase de teste foram grânulos de fitase de cera de polietileno microencapsulada P75.1M e P75.4M. Grânulos de produto comercial Danisco AXTRA® PHY serviram como um controle.

[0043] A Figura 8 é um gráfico que mostra a variação de cinza de tíbia inteira medida em um estudo de bioeficiência de fitase de alimen- tação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 7.

[0044] A Figura 9 é um gráfico que mostra a variação de cinza de dedo do pé medida em um estudo de bioeficiência de fitase de alimen- tação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 7.

[0045] A Figura 10 é um gráfico que mostra a variação de cinza de tíbia epifisária medida em um estudo de bioeficiência de fitase de ali- mentação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 7.

[0046] A Figura 11 é um gráfico que mostra a variação de cinza de tíbia inteira medida em um estudo de bioeficiência de fitase de alimen- tação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 7.

[0047] A Figura 12 é um gráfico que mostra a variação de cinza de dedo do pé medida em um estudo de bioeficiência de fitase de alimen- tação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 7.

[0048] A Figura 13 é um gráfico que mostra a variação de cinza de tíbia epifisária medida em um estudo de bioeficiência de fitase de ali- mentação. Os grânulos de fitase de teste foram grânulos de fitase de cera de polietileno microencapsulada P75.1M e P96.5. Grânulos de produto comercial Danisco AXTRA® PHY serviram como um controle.

[0049] A Figura 14 é um gráfico que mostra a variação de cinza de tíbia inteira medida em um estudo de bioeficiência de fitase de alimen- tação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 13.

[0050] A Figura 15 é um gráfico que mostra a variação de cinza de dedo do pé medida em atividade de fitase de alimentação em estudo de bioeficiência com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 13.

[0051] A Figura 16 é um gráfico que mostra a variação de digesti- bilidade do trato total aparente de % de P (% de P de ATTD) medida em um estudo de bioeficiência de fitase de alimentação com o uso dos mesmos grânulos que na Figura 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Introdução - Partículas de matriz de cera termicamente resistentes

[0052] As presentes composições e métodos se referem à prote- ção de uma enzima contra a inativação sob condições de alta tempe- ratura e umidificação, encapsulando-se a enzima dentro de uma partí- cula que compreende uma matriz de cera de alto ponto de fusão. As partículas de matriz de cera termicamente resistentes resultantes (de- nominadas no presente documento "TRWMP") são microgrânulos substancialmente esféricos sem revestimento, que são menores que cerca de 500 mícrons em diâmetro médio, e contêm enzimas ativas em cargas úteis maiores que 5% em p/p. Em algumas modalidades, as enzimas encapsuladas retêm 70% da atividade de enzima original me- diante exposição a uma temperatura de 95 °C por 30 segundos em um típico processo de peletização de alimentação animal, e podem forne-

cer uma biodisponibilidade de enzima aceitável quando incorporadas na alimentação animal. Em algumas modalidades, as partículas forne- cem biodisponibilidade de enzima aceitável em aplicações de alimen- to, alimentação animal e outras aplicações agrícolas. II. Definições e abreviações

[0053] Conforme usado no presente documento, uma "cera" é de- finida como qualquer hidrocarboneto, ácido graxo, álcool graxo, ou sal ou éster dos mesmos, que é insolúvel em água, porém, solúvel em solventes orgânicos não polares. Uma definição compreensiva de cera foi elaborada na Europa pela Deutsche Gesellschaft für Fettwissens- chaft (DGF, Associação Alemã para Ciência de Gorduras). De acordo com essa definição, as ceras (i) têm um ponto de queda ou ponto de fusão acima de 40 °C. (ii) derretem sem decomposição; (iii) têm visco- sidades de fusão que não excedem 10.000 mPa·s a 10 °C acima do ponto de fusão, (iv) exibem dependência de temperatura fortemente negativa em termos de viscosidade e não tendem à fibrosidade acima do ponto de fusão, (v) são lustráveis sob leve pressão e têm uma con- sistência e solubilidade fortemente dependente de temperatura, (vi) são amassáveis ou difíceis de quebrar, engrossam até serem finamen- te cristalino, transparentes até opaco, porém, não são brilhosos, ou altamente viscosos ou líquidos a 20 °C, (vii) derretem entre 50 °C e 90 °C (ceras especiais, conforme usado nas presentes composições e métodos, derretem em temperaturas tão altas quanto 200 °C), e for- mam pastas ou géis e são fracos condutores de calor e eletricidade (isto é, são isolantes térmicos e elétricos).

[0054] Uma cera é considerada "insolúvel em água" se sua solubi- lidade de equilíbrio em água desionizada for menor que 0,1% em p/p. Uma cera que não é insolúvel em água é considerada no presente do- cumento "solúvel em água".

[0055] Uma cera é considerada "de baixo ponto de fusão" se tiver um ponto de fusão máximo de pico abaixo de 100 °C.

[0056] Uma cera é considerada "de alto ponto de fusão" se tiver um ponto de fusão máximo de pico igual ou acima de 100 °C, prefe- rencialmente acima de 110 °C, e mais preferencialmente acima de 120 °C.

[0057] Conforme usado no presente documento, uma "matriz" é uma fase sólida contínua que cerca os sólidos descontinuadamente distribuídos. Uma matriz pode ser não porosa ou porosa. Uma matriz é "porosa" se tiver canais ou poros que compreendem espaço vazio aberto ou material que pode ser pelo menos parcialmente dissolvido ou distribuído mediante contato ou que imerge na água ou uma solu- ção aquosa, de modo a permitir que a água penetre, dissolva e extraia os sólidos distribuídos dentro da matriz.

[0058] Conforme usado, no presente documento, "excipientes" são componentes inativos de um produto que aprimoram as propriedades de produto, por exemplo, manuseio, produção ou estabilidade de ar- mazenamento, sem impactar a atividade ou potência do produto. Em- bora inativos em termos de eficácia, os excipientes fornecem caracte- rísticas benéficas que permitem que a enzima seja entregue na aplica- ção-alvo de maneira eficaz.

[0059] Exemplos de excipientes são "cargas" que são usadas para diluir o componente ativo para ajustar a potência ou reduzir o custo de formulação, "ligantes" que promovem a coesão de componentes de formulação e/ou aumentam a resistência física geral do grânulo, "de- sintegrantes" que expandam mediante contato com a água, que auxili- am a liberação do ativo a partir da formulação, "deslizantes" que pro- movem o atrito entre partículas e fluxo de pó através do equipamento de processo, "lubrificantes" que reduzem o atrito e adesão entre com- ponentes de formulação e equipamento de processo, "conservantes" que evitam ou limitam a perda de atividade de enzima atuando-se co-

mo auxiliares de estabilização (por exemplo, pias de umidificação, de- puradores de radical livre), e "absorventes" que absorvem, preferenci- almente, a umidificação para proteger o componente de enzima do grânulo.

[0060] Conforme usado no presente documento, o termo "biodis- ponibilidade" se refere à disponibilidade das enzimas encapsuladas para um intestino animal quando um produto de alimentação animal que contém as enzimas encapsuladas é ingerido por um animal. Em algumas modalidades, o termo "biodisponibilidade" se refere à dispo- nibilidade de enzimas encapsuladas nos meios de limpeza de sujeira em aplicações de limpeza, tal como lavagem de roupa, limpeza de louças ou de superfície dura.

[0061] As seguintes abreviações são usadas: % em p/p porcentagem em peso AUC área sob curva de fluxo térmico ATTD digestibilidade de trato total aparente avail disponível avg médio AvP fósforo disponível BW peso corporal Ca cálcio cm centímetros CP proteína bruta Cys cisteína d10 diâmetro de 10% de partículas em uma curva de distribui- ção de volume e tamanho acumulativa d50 diâmetro de 50% de partículas em uma curva de distribui- ção de volume e tamanho acumulativa d90 diâmetro de 90% de partículas em uma curva de distribui- ção de volume e tamanho acumulativa dia diâmetro DSC calorimetria de varredura diferencial dT/dt taxa de varredura ECR razão de alteração de entalpia F-T Fischer-Tropsch FTU unidade de fitase de atividade g grama h hora ISO Organização Internacional para Padronização kcal quilocalorias kg quilograma l litro Lys lisina m metro p.f. ponto de fusão m3 metro cúbico Met metionina Mi peso molecular de polímero i min minuto min minutos ml mililitro mol mol mm milímetro Mn peso molecular numérico médio mPa milipascal Mw peso molecular ponderal médio n número NC controle negativo Ni número de mols de polímeros com peso molecular Mi nm nanômetro nPP fosfato de não fitato °C graus Celsius PE polietileno Pin admissão total de fósforo Pfo) excreção fecal total de fósforo Px, Px.x identificadores de formulação interna do requerente rpm revoluções por minuto s segundos std dev desvio padrão T temperatura t tempo Trp triptofano vits/TEs vitaminas e elementos vestigiais peso/peso peso/peso @ em μm micrômetro μmol micromolar III. Ceras adequadas para preparar TRWMP

[0062] Ceras adequadas para uso nas presentes composições e métodos podem ser de ocorrência natural e podem ser derivadas de fontes biológicas não fósseis e incluem, porém, sem limitação: ceras animais, tais como cera de abelha, cera ghedda, cera-laca, cera de inseto chinês, cera de lã; ceras vegetais, tal como cera de carnaúba, cera de candelilha, cera de ouricuri, cera de cana-de-açúcar, cera de retamo e cera de jojoba; ácidos carboxílicos primários lineares de ca- deia longa derivados de gordura animal e vegetal, tal como ácido mi- rístico, ácido palmístico e ácido esteárico; mistura de derivados de áci- do graxo; sais de ácido graxo, tais como estearatos de alumínio, cál- cio, magnésio e zinco, behenato de zinco e laurato de zinco; e ceras de fóssil vegetal, tal como cera montana; ou podem ser derivadas de petróleo, tais como ceras macrocristalinas (ceras de parafina) e ceras microcristalinas (microceras), ou sintéticas, seja como uma pequena molécula, tal como etileno bis-estearamida ou como uma macromolé- cula, isto é, quimicamente polimerizada a partir de subunidades mo- noméricas, tais como ceras Fischer-Tropsch ou ceras de poliolefina que incluem cera de polietileno, cera de polipropileno e seus deriva- dos.

[0063] Exemplos comerciais de ácidos carboxílicos de cadeia lon- ga são derivados de ácido graxo, tais como BAEROLUB® A275 (Baer- locher GmbH), LICOMONT® BS 100 (Clariant Corp.) e ácido carboxí- lico/sal de alcano ramificado, tal como LICOWAX® R 21 (Clariant Corp.).

[0064] Exemplos de estearatos de metal que estão comercialmen- te disponíveis incluem tri/diestrearato de alumínio, tal como ALUGEL® (Baerlocher GmbH), estearato de cálcio, tal como CEASIT® (Baerlo- cher GmbH) e estearato de Ca COAD® 13-LD (Norac, Inc.), estearato de magnésio, tal como MAGNESIUMSTEARAT® (Baerlocher GmbH), estearato de zinco, tal como ZINCUM® SMS Veg, ZINCUM® SP Veg, ZINCUM® TX Veg (Baerlocher GmbH), estearato de Zn COAD® 30 e estearato de Zn COAD® 33 (Norac, Inc.), e estearato de cálcio/zinco correagido NORSTAB® 50 CaZn (Norac, Inc.).

[0065] Exemplos comerciais de behenato de zinco e laurato de zinco incluem, respectivamente, ZINCUM® BE e ZINCLAURAT® Techn. R.G. (Baerlocher GmbH).

[0066] Exemplos comerciais de bis-estearamida de etileno incluem BAEROLUB® L-AK (Baerlocher GmbH), LICOWAX® C e LICOLUB® FA 1 (Clariant Corp.) e Ross Wax 140 (Frank B. Ross Co.).

[0067] Ceras Fischer-Tropsch estão comercialmente disponíveis sob diferentes nomes comerciais que incluem Ceraflour (BYK E.U.A.), SARAWAX® (Shell/Baker Hughes, Inc.), SASOLWAX® (SASOL® Wax

North America Corp.), e VESTOWAX® (Evonik Degussa Corp.).

[0068] Ceras de polietileno são comercializadas sob diversos no- mes comerciais diferentes que incluem BAEROLUB® PA-L (Baerlo- cher GmbH), CERAFLOUR® (BYK, E.U.A.), DEUREX® E (Deurex AG), EXCEREX™ e HI-WAX™ (Mitsui Chemicals, Inc.), EPOLENE® (Westlake Chemical Corp.), HONEYWELL A-C® (Honeywell Internati- onal, Inc.), LICOCENE® PE e LICOWAX® PE (Clariant Corp.), NE- OWAX™ (Yasuhara Chemical Co., Ltd.), Poliwax™ (Baker Hughes, Inc.) e VISCOWAX® (Innospec Leuna GmbH).

[0069] Ceras de polietileno oxidadas estão comercialmente dispo- níveis sob diversos nomes comerciais que incluem DEUREX® EO (Deurex AG), LICOWAX® PED (Clariant Corp.), PETROLITE™ (Baker Hughes, Inc.) e VISCOWAX® (Innospec Leuna GmbH).

[0070] Ceras de polipropileno são comercializadas sob diversos nomes comerciais diferentes que incluem HI-WAX™ (Mitsui Chemi- cals, Inc.) e LICOCENE® PP (Clariant Corp.).

[0071] Em determinadas modalidades, a TRWMP pode incluir uma resina natural, de base biológica ou sintética, que inclui, porém, sem limitação, resinas de colofônia, resinas de politerpeno e goma damar.

[0072] Resinas de colofônia são com base em recursos naturais, por exemplo, toco de pinho renovável. Colofônias de madeira modifi- cada e refinada estão comercialmente disponíveis através da Pinova, Inc., sob diversos nomes comerciais que incluem PENTALYN® FC, PENTALYN® H e HA, PEXALYN®, STAYBELITE®, STAYBELITE® A, STAYBELITE® Ester e Ester A, e FORAL®. Outros produtos comerci- ais oferecidos pela Kraton Corp. (anteriormente Arizona Chemical Co., LLC) incluem aqueles comercializados sob nomes comerciais de SYLVATAC™ RE e SYLVALITE™ RE.

[0073] Resinas de politerpeno são com base em matérias-primas naturais e renováveis, que incluem poli(α-pineno), poli(β-pineno), po-

li(d-limoneno) e misturas dos mesmos. Exemplos comerciais de resi- nas de politerpeno incluem aquelas oferecidas pela Pinova, Inc., sob diversos nomes comerciais que incluem Resina PINOVA®, PIC- COLYTE® A, PICCOLYTE® C, PICCOLYTE® F, e a série PIC- COLYTE® S, e aquelas disponíveis através da Kraton Corp. (anterior- mente Arizona Chemical Co., LLC), sob o nome comercial SYLVA- RES™ TR.

[0074] Goma damar é a exudação seca de árvores cultivadas de Agathis spp., Hopea spp., e/ou Shorea spp. A mesma consiste em uma mistura complexa de resinas triterpenoides ácidas e neutras jun- tamente com material de polissacarídeo. Diversos triterpenos são compostos de baixo peso molecular, tais como damarano, ácido da- marenólico, oleanano, ácido oleanônico, etc., porém, a goma damar também contém uma fração polimérica, composta por policadineno.

[0075] Ceras adequadas incluem aquelas que têm um ponto de fusão máximo de pico, isto é, acima de 100 °C, preferencialmente aci- ma de 110 °C, e mais preferencialmente acima de 120 °C. Diferente- mente de pequenas moléculas o peso molecular de uma cera de polí- mero não é um valor único. Em vez disso, um dado polímero exibe, de modo geral, polidispersão, isto é, uma distribuição de pesos molecula- res, que depende da maneira que o polímero é fabricado. A distribui- ção de peso molecular é normalmente apresentada por um peso mo- lecular médio. Propriedades de polímero, tais como ponto de fusão, são função de distribuição de peso molecular e, assim, dependem do peso molecular médio. O peso molecular numérico médio (Mn) e o pe- so molecular ponderal médio (Mw) são definidos pelas seguintes equa- ções:

em que Ni é o número de mols de polímeros com peso molecular Mi.

[0076] Ceras de polímero adequadas para as presentes composi- ções e métodos devem ter um peso molecular ponderal médio (Mw) entre 1.000 e 5.000 Da (g/mol), preferencialmente entre 1.800 e 4.800 Da, e mais preferencialmente entre 2.000 e 3.000 Da. As ceras de po- límero desta invenção devem ter distribuições de peso molecular es- treitas com índice de polidispersão (Mw/Mn) menor que 3, preferencial- mente menor que 2, mais preferencialmente menor que 1,5, e com máxima preferência menor que 1,2.

[0077] Ceras adequadas para as presentes composições e méto- dos também têm uma razão de alteração de entalpia adequada (ECR) definida como a seguir: ECR(t0, tf) = 100% x AUC(t0,100)/AUC(t0,t) em que t0 e tf são as temperaturas de varredura inicial e final durante calorimetria de varredura diferencial (isto é, um termograma de DSC), e a AUC é a área sob a curva do termograma de DSC.

[0078] Por exemplo, ECR(40,140) é 100% vezes a razão da área sob um termograma de DSC entre 40 °C e 100 °C e a área sob o termo- grama de DSC entre 40 °C e 140 °C: ECR(40, 140) = 100% x AUC(40,100)/AUC(40,140).

[0079] A ECR pode ser usada como uma métrica para comparar diferentes materiais de cera por sua potencial eficácia protetora em um processo de alta temperatura, tal como em peletização de alimentação animal. Mais especificamente, a ECR(40,140) pode ser usada como um indicador da concentração de hidrocarbonetos de baixo ponto de fusão (p.f. < 100 °C) no produto de cera; uma quantidade inferior de hidro- carbonetos de baixo ponto de fusão no produto de cera corresponde a um valor de ECR(40,140) menor. Ceras adequadas para as presentes composições e métodos podem ser caracterizadas como aquelas com uma ECR(40,140) menor que 20%, preferencialmente menor que 15%, e mais preferencialmente menor que 10%.

[0080] Os presentes exemplos ilustram um método para determi- nação de ECR com o uso de ceras Fischer-Tropsch (F-T), ceras de polietileno (PE), estearatos de zinco e ácido esteárico caracterizados com o uso de calorimetria de varredura diferencial (DSC).

[0081] Por conveniência, as propriedades das presentes partículas são resumidas na Tabela 1. Tabela 1. Propriedades das presentes partículas Recurso de partícula Parâmetro preferencial Ponto de fusão máximo de pico >100°C Ponto de fusão inicial de cera ≥100oC Viscosidade de fusão de cera < 500 centipoises em temperatu- ras dentro de 25 °C, acima da temperatura de fusão de cera Peso molecular médio de cera <3,000 Índice de polidispersão de cera <3 ECR(40,140) de cera <20% Carga útil de enzima > 5% em peso/peso Atividade de água <0,4 Teor de água < 5% em peso/peso Faixa de tamanho de particulados 1-500 µm de enzima IV. Enzimas adequadas para encapsulação em TRWMP

[0082] As presentes composições e métodos são aplicáveis a mui- tas enzimas diferentes. Enzimas exemplificativas incluem acil transfe- rases, α-amilases, β-amilases, α-galactosidases, arabinosidases, aril esterases, β-galactosidases, carragenenases, catalases, celobio- hidrolases, celulases, condroitinases, cutinases, endo-β-1, 4- glucanases, endo-beta-mananases, esterases, exomananases, galac- tanases, glucoamilases, hemicelulases, hialuronidases, queratinases, lacases, lactases, ligninases, lipases, lipoxigenases, mananases, oxi- dases, oxidorredutases, pectato liases, pectino acetil estearases, pec-

tinases, pentosanases, per-hidrolases, peroxidases, peroxigenases, fenoloxidases, fosfatases, fosfolipases, fitases, poligalacturonases, proteases, pululanases, redutases, ramnogalacturonases, β- glucanases, tanases, transglutaminases, xilano acetil-estearases, xila- nases, xiloglucanases, xilosidases e combinações dos mesmos.

[0083] Exemplos de fitases incluem, porém, sem limitação, aque- las de Escherichia coli, Buttiauxella sp., Citrobacter braakii, Peniophora lycii e Aspergillus niger. Em algumas modalidades, a protease é uma ou mais dentre QUANTUM®, QUANTUM® BLUE, PHYZYMEXP™, AXTRA® PHY, RONOZYME™ HIPHOS ou NATUPHOS. Fitases são descritas, por exemplo, nos documentos no WO2006038128, US2017143004, US2006141562, US2016362666, US2016289655, US9365840, US8663963 e US2015159149.

[0084] Exemplos de proteases incluem, porém sem limitação, sub- tilisinas, tais como aquelas derivadas de Bacillus (por exemplo, subtili- sina, lentus, amiloliquefaciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168), que incluem variantes tal como des- crito em, por exemplo, nos documentos de Patente no U.S. RE 34.606,

5.955.340, 5.700.676, 6.312.936, e 6.482.628, todas as quais são in- corporadas ao presente documento a título de referência. Proteases adicionais incluem tripsina (por exemplo, de origem suína ou bovina) e a protease Fusarium descrita no documento no WO 89/06270. Em al- gumas modalidades, a protease é uma ou mais dentre MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPE- RASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCEL- LASE™, e PURAFAST™ (DuPont Industrial Biosciences); ALCA- LASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE®, LIQUANASE®, NEUTRASE®, RELASE® e ESPERASE® (Novozymes); variantes BLAP™ e BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Alemanha), e KAP (B.

alkalophilus subtilisin; Kao Corp., Tóquio, Japão). Proteases adicionais são descritas nos documentos no WO95/23221, WO 92/21760, WO 09/149200, WO 09/149144, WO 09/149145, WO 11/072099, WO 10/056640, WO 10/056653, WO 11/140364, WO 12/151534, na Publi- cação de Patente no 2008/0090747, e nos documentos de Patente no U.S. 5.801.039, 5.340.735, 5.500.364, 5.855.625, US RE 34.606,

5.955.340, 5.700.676, 6.312.936 e 6.482.628.

[0085] As proteases incluem metaloproteases neutras que incluem aquelas descritas nos documentos no WO 07/044993 e WO 09/058661. Outras metaloproteases exemplificativas incluem nprE, a forma recombinante de metaloprotease neutra expressa em Bacillus subtilis (consultar, por exemplo, o documento no WO 07/044993), e PMN, a metaloprotease neutra purificada de Bacillus amyloliquefaci- ents.

[0086] Lipases incluem, porém, sem limitação, lipase Humicola lanuginosa (consultar, por exemplo, EP 258 068, e EP 305 216), lipase Rhizomucor miehei (consultar, por exemplo, EP 238 023), Candida li- pase, como lipase C. antarctica (por exemplo, a lipase C. antarctica A ou B; Consulte por exemplo, EP 214 761), Pseudomonas lipases como lipase P. alcaligenes e lipase P. pseudoalcaligenes (consultar, por exemplo, EP 218 272), lipase P. cepacia (consultar, por exemplo, EP 331 376), lipase P. stutzeri (consultar, por exemplo, GB 1,372,034), lipase P. fluorescens, lipase Bacillus (por exemplo, lipase B. subtilis (Dartois et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260); lipase B. stearothermophilus (consultar, por exemplo, JP 64/744992); e lipase B. pumilus (consultar, por exemplo, WO 91/16422)).

[0087] As lipases adicionais incluem lipase Penicillium camembertii (Yamaguchi et al. (1991) Gene 103:61 a 67), lipase Geotricum candi- dum (consultar, Schimada et al. (1989) J. Biochem. 106:383 a 388), e várias lipases Rhizopus como lipase R. delemar (Hass et al. (1991)

Gene 109:117 a 113), uma lipase R. niveus (Kugimiya et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56:716 a 719) e lipase R. oryzae. Lipases adicionais são a cutinase derivada de Pseudomonas mendocina (con- sultar, documento WO 88/09367), e a cutinase derivada de Fusarium solani pisi (documento WO 90/09446). Várias lipases são descritas nos documentos WO 11/111143, WO 10/065455, WO 11/084412, WO 10/107560, WO 11/084417, WO 11/084599, WO 11/150157 e WO 13/033318. Em algumas modalidades, a lipase é um ou mais de M1 LIPASE™, LUMA FAST™, e LIPOMAX™ (DuPont Industrial Bioscien- ces); LIPEX®, LIPOLASE® e LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); e LI- PASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japão).

[0088] As amilases incluem, porém sem limitação, as de origem bacteriana fúngica, ou até mesmo de origem mamífera. Inúmeras ade- quadas são descritas nos documentos W09510603, WO9526397, WO9623874, WO9623873, WO9741213, WO9919467, WO0060060, WO0029560, WO9923211, WO9946399, WO0060058, WO0060059, WO9942567, WO0114532, WO02092797, WO0166712, WO0188107, WO0196537, WO0210355, WO9402597, WO0231124, WO9943793, WO9943794, WO2004113551, WO2005001064, WO2005003311, WO0164852, WO2006063594, WO2006066594, WO2006066596, WO2006012899, WO2008092919, WO2008000825, WO2005018336, WO2005066338, WO2009140504, WO2005019443, WO2010091221, WO2010088447, WO0134784, WO2006012902, WO2006031554, WO2006136161, WO2008101894, WO2010059413, WO2011098531, WO2011080352, WO2011080353, WO2011080354, WO2011082425, WO2011082429, WO2011076123, WO2011087836, WO2011076897, WO94183314, WO9535382, WO9909183, WO9826078, WO9902702, WO9743424, WO9929876, WO9100353, WO9605295, WO9630481, WO9710342, WO2008088493, WO2009149419, WO2009061381, WO2009100102, WO2010104675, WO2010117511, WO2010115021,

WO2013184577, WO9418314, WO2008112459, WO2013063460, WO10115028, WO2009061380, WO2009100102, WO2014099523, WO2015077126A1, WO2013184577, WO2014164777, PCT/US12/70334, PCT/US13/74282, PCT/CN2013/077294, PCT/CN2013/077134, PCT/CN2013/077137, PCT/CN2013/077142, PCT/CN2012/087135, PCT/US12/62209, PCT/CN2013/084808, PCT/CN2013/084809 e PCT/US14/23458. Amilases comercialmente disponíveis incluem, porém sem limitação, uma ou mais de DU- RAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA®, e BAN™ (Novozymes), bem como POWERASE™, RAPIDASE® e MAXAMYL® P, PREFERENZ® S100, PREFERENZ® S110, e PREFERENZ® S1000 (DuPont Industrial Biosciences).

[0089] Celulases incluem, porém sem limitação, aquelas que tem benefícios no cuidado da cor (consulte por exemplo, EP 0 495 257). Exemplos incluem celulases Humicola insolens (consultar, por exem- plo, o documento de Patente no U.S. 4.435.307) e celulases comerci- almente disponíveis, tais como CELLUZYME®, CAREZYME® (No- vozymes), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation), e Primafast® GOLD (DuPont). Em algumas modalidades, as celulases são incorporadas como porções ou fragmentos de celulases de tipo selvagem ou varian- tes, maduras, em que uma porção do terminal N é excluída (consultar, por exemplo, o documento de Patente no 5.874.276). Celulases ade- quadas adicionais incluem aquelas encontradas no documento WO2005054475, WO2005056787, Patente no U.S. 7.449.318 e Paten- te no 7.833.773.

[0090] Mananases são descritas na Patente no U.S. 6.566.114,

6.602.842, 5.476, e 775, 6.440.991 e Pedido de Patente no U.S. 61/739267, todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência. Disponíveis comercialmente incluem, porém sem limitação, MANNASTAR®, PURABRITE™ e MANNAWAY®.

[0091] Em algumas modalidades, peroxidases são usadas em combinação com peróxido de hidrogênio ou uma fonte do mesmo (por exemplo, um percarbonato, perborato ou persulfato) nas composições dos presentes ensinamentos. Em algumas modalidades alternativas, oxidases são usadas em combinação com oxigênio. Ambos os tipos de enzimas são usados para "branqueamento da solução" (isto é, para impedir transferência de um corante têxtil de um pano tingido para ou- tro pano quando os panos são lavados juntos em um licor de lava- gem), preferencialmente junto com um agente melhorador (consultar, por exemplo, documentos WO 94/12621 e WO 95/01426). Peroxida- ses/oxidases adequadas incluem, porém, sem limitação, aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fúngica. Mutantes química ou genetica- mente modificados são incluídos em algumas modalidades.

[0092] Per-hidrolases incluem a enzima a partir de Mycobacterium smegmatis. Essa enzima, suas propriedades enzimáticas, sua estrutu- ra e inúmeras variantes e homólogos da mesma, são descritos em de- talhes nas Publicações de Pedido de Patente Internacionais WO 05/056782A e WO 08/063400A, e Publicações de Patente no US2008145353 e US2007167344, as quais são incorporadas a título de referência.

[0093] Em algumas modalidades, a per-hidrolase Mycobacterium smegmatis, ou homólogo, inclui a substituição S54V.

[0094] Outras per-hidrolases adequadas incluem membros da fa- mília de estearase de família de carboidratos 7 (família CE-7) descritos em, por exemplo, documentos WO2007/070609 e Publicações de Pe- dido de Patente no U.S. 2008/0176299, 2008/176783 e 2009/0005590. Os membros da família CE-7 incluem cefalosporina C desacetilases (CAHs; EC 3.1.1.41) e acetil xilano esterases (AXEs; E.C. 3.1.1.72). Os membros da família de esterase CE-7 compartilham um motivo de assinatura conservado (Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593 a 606 (2003)).

[0095] Outras enzimas de per-hidrolase incluem aquelas de Si- norhizobium meliloti, Mesorhizobium loti, Moraxella bovis, Agrobacte- rium tumefaciens, ou Prosthecobacter dejongeii (WO2005056782), Pseudomonas mendocina (documento de Patente no U.S. 5.389.536), ou Pseudomonas putida (documento de Patente no U.S. 5.030.240 e

5.108.457). V. Preparação de TRWMP

[0096] O processo de encapsulação exige primeiro fornecer a en- zima em uma forma substancialmente seca como um pó. Por exemplo, a enzima pode ser seca por aspersão a partir de uma solução aquosa ou suspensão, ou isolada como um precipitado através da adição de sais, solventes orgânicos ou polímeros na solução de enzima. Se o precipitado de pó resultante contém água, o mesmo deve ser adicio- nalmente seco, de modo a reduzir o teor de água ou atividade de água. O teor de água residual de pó de enzima, que inclui água livre e ligada, deve ser menor que 6%, preferencialmente menor que 5%, e mais preferencialmente menor que 4%. A atividade de água (Aw) do dito pó de enzima deve ser menor que 0,3, preferencialmente menor que 0,2 e mais preferencialmente menor que 0,1.

[0097] O pó de enzima seco por aspersão ou precipitado pode ser adicionalmente processado através de granulação seca ou úmida, tal como aglomeração, compactação ou mesclagem com outros materiais secos, que incluem excipientes inativos de não enzima. Em algumas modalidades, a solução de enzima pode compreender uma mistura de concentrado de enzima e, opcionalmente, excipientes adicionados. A mistura pode ser adicionalmente processada ou granulada através de processos, tais como aglomeração de aspersão, granulação de asper- são, granulação de baixo ou alto cisalhamento, granulação em tambor e semelhantes.

[0098] A enzima seca, sozinha ou adicionalmente misturada, pro- cessada ou granulada, conforme descrito acima, é, então, encapsulada em uma matriz de cera porosa, que é descrita em detalhes no presente documento, juntamente com cargas solúveis em água ou insolúveis em água opcionais, formadores de poro, tampões, estabilizadores, agentes de inchaço, desintegrantes ou outros excipientes. Conforme descrito, a cera na matriz deve ser insolúvel em água, preferencialmente ter um ponto de fusão inicial de pelo menos 110 °C e um ponto de fusão má- ximo de pico de pelo menos 120 °C, e preferencialmente, ter uma baixa viscosidade de fusão, isto é, menor que cerca de 500 centipoises em temperaturas dentro de 25 °C acima de seu ponto de fusão.

[0099] Cargas na matriz de cera podem incluir sais inorgânicos, tais como sulfato de sódio ou carbonato de cálcio, ácidos orgânicos ou sais dos mesmos, argilas, minerais, tais como aluminossilicatos, terra diatomácea, talco, pigmentos, tais como dióxido de titânio, mono ou dissacarídeos, tais como frutose, galactose e glicose ou lactose, mal- tose, sacarose e trealose, álcoois de açúcar, tais como sorbitol ou gli- cerol, ciclodextrinas, e polissacarídeos, tais como amido e maltodextri- na, ou pó ou gomas de celulose, tais como goma xantana ou alginato de sódio.

[00100] Em algumas modalidades, a matriz de cera inclui cargas solúveis em água ou insolúveis em água opcionais, formadores de po- ro, tampões, estabilizadores, agentes de inchaço, desintegrantes, adi- tivos de intensificação de degradação ou outros excipientes. Os ditos aditivos de intensificação de degradação podem promover a degrada- ção de cera através de diferentes trajetórias que incluem fotodegrada- ção, termodegradação, oxo-biodegradação, biodegradação por meio de formação de biofilme ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de tecnologia de aditivo de oxo-biodegradação são ADDIFLEX® (Add-

X Biotech AB, Höganäs, Suécia), D2W® (Symphony Environmental E.U.A., Jacksonville, FL, E.U.A.), e TDPA®, Aditivos Plásticos Total- mente Degradáveis (EPI Environmental Technologies Inc., Vancouver, BC, Canadá). Um exemplo de tecnologia de aditivo de biodegradação com base na formação de biofilme é MASTERBATCH PELLETS™ (ECM Biofilms Inc., Painesville, OH, E.U.A.).

[00101] Para encapsular a enzima na matriz de cera, a cera deve primeiro ser aquecida até ser fundida. O pó de enzima é distribuído, juntamente com quaisquer outros excipientes, dentro da cera fundida. A enzima pode ser adicionada antes, após ou simultaneamente com quaisquer excipientes. A distribuição de sólido-líquido pode ser condu- zida em lotes ou em lote alimentado em um vaso de tanque agitado, ou continuamente em um misturador em linha. Uma vez que a enzima é adequadamente distribuída para formar uma suspensão na cera fun- dida, a suspensão de cera é atomizada em partículas. Por exemplo, uma corrente da suspensão fundida pode ser extrudada ou bombeada em um atomizador de disco giratório. A formação de partícula de mi- crocápsula através de atomização de disco giratório é descrita, por exemplo, nos documentos de Patente no U.S. 3.015.128, 4.256.677 e

6.001.387. Alternativamente, as microcápsulas de cera podem ser formadas através de outros métodos de atomização, tal como extrusão centrífuga (consultar, por exemplo, o documento de Patente no U.S.

4.386.895), atomização de bocal vibratório (consultar, por exemplo, o documento no WO2012/098239) ou corte a jato (consultar, por exem- plo, o documento no DE 4.424.998 e o documento de Patente no U.S.

6.467.699), seguido pelo resfriamento para solidificar as partículas e coletar as partículas solidificadas.

[00102] Em atomização de disco giratório, o tamanho de partícula médio e a distribuição de tamanho de partícula das partículas finais podem ser controlados ajustando-se a velocidade giratória do disco de atomização, em consideração ao diâmetro de disco, à taxa de fluxo da suspensão e à viscosidade e tensão de superfície da suspensão fun- dida. Para um dado aparelho de disco, o tamanho de partícula é redu- zido aumentando-se a velocidade giratória do disco, reduzindo-se a taxa de alimentação da suspensão fundida, e/ou reduzindo-se a visco- sidade e tensão de superfície da suspensão fundida.

[00103] De modo a produzir micropartículas bem formadas menores é preferencial usar uma suspensão fundida com uma baixa viscosida- de de fusão. Por exemplo, para produzir micropartículas menores que 500 mícrons, é desejável usar uma cera com uma viscosidade de fu- são menor que 500 centipoises em temperaturas dentro de 25 °C, acima da temperatura de fusão de cera. VI. Propriedades de TRWMP

[00104] As TRWMP resultantes são microgrânulos substancialmen- te esféricos sem revestimento, que são menores que cerca de 500 mí- crons em diâmetro médio, e contêm enzimas ativas em cargas úteis maiores que 5% em p/p. As propriedades particulares da matriz de ce- ra são descritas em detalhes no presente documento.

[00105] Em algumas modalidades, as enzimas encapsuladas retêm pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, e mais prefe- rencialmente pelo menos 90%, ou mais da atividade de enzima original mediante exposição a uma temperatura de 95 °C por 30 segundos em um típico processo de peletização de alimentação animal. A retenção de atividade é facilmente medida comparando-se a atividade de enzi- mas que estiveram na produção de grânulo com a quantidade de ativi- dade na TRWMP final. Esses e outros aspectos e modalidades das presentes composições e métodos serão evidentes para o versado na técnica em vista da presente descrição. Os exemplos a seguir desti- nam-se a ilustrar adicionalmente, porém, sem limitação, as composi- ções e os métodos.

EXEMPLOS Exemplo 1. Análise térmica de ceras poliméricas e não poliméri- cas

[00106] Análise térmica de ceras Fischer-Tropsch comerciais, ceras de polietileno, estearatos de zinco e ácido esteárico foi conduzida através de calorimetria de varredura diferencial (DSC) em um analisa- dor térmico TA Instruments DSC Q2000 em atmosfera de nitrogênio.

[00107] Amostras de ceras F-T e PE foram aquecidas de 20 °C a 180 °C em uma taxa de aquecimento de 10 °C min-1 e resfriadas até 20 °C na mesma taxa na primeira varredura. As mesmas foram, então, aquecidas até 180 °C em uma taxa de aquecimento de 2 °C min-1 e resfriadas até 20 °C na mesma taxa na segunda varredura. Amostras de estearatos de zinco e ácido esteárico foram aquecidas de 20 °C a 160 °C em uma taxa de aquecimento de 10 °C min-1 e resfriadas até 20 °C na mesma taxa na primeira varredura. As mesmas foram, então, aquecidas até 160 °C em uma taxa de aquecimento de 5 °C min-1 e resfriadas até 20 °C na mesma taxa na segunda varredura. Proprieda- des térmicas, tais como ponto inicial de fusão, pico máximo e a área sob curva de fluxo térmico (W/g contra °C) foram determinadas a partir do ciclo de aquecimento da segunda varredura. A área sob a curva de fluxo térmico (AUC) é proporcional à alteração de entalpia total da amostra para o processo de aquecimento entre as temperaturas inicial e final da varredura DSC. A variação de alteração de entalpia com o tempo (t), temperatura (T) ou taxa de varredura (dT/dt) depende do grau de uniformidade de massa molecular das ceras.

[00108] Termogramas de DSC que incluem o ponto inicial de fusão, pico máximo e razão de alteração de entalpia entre 40 °C e 140 °C (ECR(40,140)) são mostrados nas Figuras 1 a 5. Ceras adequadas para as presentes composições e métodos são aquelas com uma ECR(40,140) menor que 20%, preferencialmente menor que 15%, e mais preferencialmente menor que 10%. As ceras preferenciais têm um ponto inicial de fusão e ponto de pico máximo respectivamente acima de 100 °C e 120 °C. Exemplo 2. Preparação de pó de enzima com secagem por asper- são

[00109] Esse Exemplo fornece uma descrição geral dos materiais e métodos usados para a produção de pó de enzima com processo de secagem por aspersão. O pó de enzima seco por aspersão foi produ- zido através de secagem por aspersão de uma solução de enzima (ou concentrado) em um secador de aspersão Niro P-6.3 (GEA Process Engineering A/S, Søborg, Dinamarca) equipado com um atomizador giratório configurado em um modo de contracorrente. A solução de en- zima (ou concentrado) foi alimentada no secador de aspersão com o uso de uma bomba peristáltica Watson-Marlon, modelo 505U (Watson- Marlow Pumps Group, Wilmington, MA, E.U.A.) e subsequentemente atomizada através de atomizador giratório de alta velocidade. O atomi- zador giratório foi colocado no distribuidor de ar do teto e operado com a roda de atomizador com palhetas (12 cm de diâmetro) que gira a

14.000 rpm. O secador de aspersão foi termicamente equilibrado com água desmineralizada de resfriação a cerca de 10 a 15 °C antes da aspersão. Típicas condições de processo são resumidas na Tabela 2. O pó de enzima seco por aspersão foi coletado no fim de cada execu- ção e armazenado em bolsas plásticas duplas vedadas em temperatu- ra ambiente. Tabela 2. Típicas condições de processo de secagem por aspersão para produção de pó de enzima Concentrado de Temperatura 5-15oC enzima Tempo de Agitação 10-30 min Taxa de Alimentação 10-30 kg/h Ar de processo Temperatura de Entrada 160-200oC Temperatura de Saída 75-110oC

Taxa de Fluxo 500-600 m3/h

[00110] A distribuição de tamanho de partícula de pó de enzima foi analisada através do método de difração de laser. Os tamanhos de partícula característicos de d10, d50 (mediano) e d90, que correspon- dem, respectivamente, a 10%, 50% e 90% pontos na curva de distri- buição de volume e tamanho acumulativa, estiveram dentro de uma faixa estreita. Para amostras de pó de fitase listadas nos seguintes Exemplos 4 a 7, d10 esteve na faixa de 11 a 14 um, d50 esteve na faixa de 25 a 39 µm, e d90 esteve na faixa de 53 a 105 µm. Exemplo 3. Produção de grânulos de enzima com atomização de disco giratório de fusão a quente

[00111] Grânulos de enzima a serem descritos nos seguintes Exemplos foram produzidos com o uso de um atomizador de disco gi- ratório em uma configuração laboratorial, conforme ilustrado na Figura

6. Uma substância de cera (carreador fundível) foi primeiro aquecida para fundir em um recipiente de vidro. A cera fundida foi adicionalmen- te aquecida e mantida em 15 a 30 °C acima do ponto de fusão. Ingre- dientes inativos e, então, pó de enzima seco por aspersão ativo, pro- duzidos conforme descrito no Exemplo 2, foram distribuídos na cera fundida enquanto eram agitados manualmente. Ingredientes inativos foram selecionados dentre cargas, ligantes, estabilizadores, desinte- grantes, tensoativos, agentes de osmolaridade, agentes modificadores de pH e misturas dos mesmos. Uma lista de excipientes inativos exemplificativos, seu fabricante/fornecedor e ponto de fusão usado nas composições exemplificadas, é fornecida na Tabela 3.

Tabela 3. Lista de excipientes inativos exemplificativos Material Fabrican- p.f. ini- p.f. má- ECR(40,1 Viscosi- te/Fornecedor cial (°C) ximo de 40) dade de pico (°C) fusão (cP) Carbonato de Imerys Perfor- - - - - cálcio, MI- mance Mine- CROWHITE® rals 30 Codex Carbonato de Great Lakes - - - - cálcio GLC- Calcium 1012 PICCOLYTE® Pinova - 127 - - C125 PICCOLYTE® Pinova - 133 - - A135 Plus Estearato de Alfa Aesar - 153 - - cálcio Estearato de Sigma-Aldrich - 250 - - sódio Ácido esteárico Sigma-Aldrich 69,6 73,1 99,69% - Cera microcris- Frank B. Ross - 95 - - talina 863 Sasolwax C105 Sasol Wax 88,0 101,1 45,94% 13 @ North America 135oC Honeywell A- Honeywell 120,0 124,3 15,26% 86 @ C® 820A 140oC ZINCUM® SMS Baerlocher 120,2 123,1 13,17% - Veg, Estearato de Zinco ZINCUM® SP Baerlocher 120,2 123,5 9,68% - VEG Prills, es- tearato de zin- co POLYWAX™ Baker Hughes 120,6 124,7 6,07% 51 @ 2000 149oC

[00112] As distribuições de fusão foram homogeneizadas com o uso de um homogeneizador de alto cisalhamento para garantir que uma distribuição livre de caroço consistente fosse atingida. As distri- buições de fusão foram, então, distribuídas manualmente, ou com o uso de uma bomba peristáltica, em uma taxa estável, em um disco de aço inoxidável giratório aquecido (10 cm de diâmetro) para atomiza- ção. O disco foi instalado a cerca de 4,6 metros acima do chão e ope- rado a cerca de 1.500 a 6.500 rpm com o uso de uma bomba de pres- são hidráulica. Gotículas de fusão finas formadas pela atomização fo- ram solidificadas em partículas em temperatura ambiente. As partícu- las foram coletadas manualmente e mantidas em recipientes plásticos vedados em temperatura ambiente.

[00113] O tempo de processamento de fusão geral foi menor que 2,5 a 5 min, incluindo a mistura dos materiais e alimentação do disco giratório. A atomização de formulações de fusão ocorreu em uma câ- mara confinada de cerca de 80 metros cúbicos em condições de am- biente normal. Exemplo 4. Produção de grânulos de fitase compostos de pó de enzima seco por aspersão e cera de baixo ponto de fusão como material matricial com atomização de disco giratório de fusão a quente

[00114] O seguinte é um exemplo comparativo de formulações de enzima produzidas a partir do uso de carreadores de baixo ponto de fusão que não satisfazem as exigências de estabilidade de peletiza- ção, conforme descrito no Exemplo 10.

[00115] As formulações de grânulo de fitase foram produzidas com o método de atomização de disco giratório descrito no Exemplo 3. As composições de fusão a quente foram preparadas adicionando-se pó de fitase seco por aspersão, preparado conforme descrito no Exemplo 1, e carbonato de cálcio na cera fundida. O tempo de processamento foi de aproximadamente 5 min incluindo a mistura dos materiais e dis-

tribuição da preparação de fusão no disco giratório. Gotículas de fusão finas formadas pela atomização foram rapidamente solidificadas em partículas em temperatura ambiente. As partículas foram coletadas e armazenadas em recipientes plásticos vedados. A composição de for- mulações de grânulo de fitase é fornecida na Tabela 4. Composições de fusão que contêm estearato de cálcio e estearato de sódio foram preparadas em 90 a 110 °C na medida em que os sais de estearato eram solúveis no ácido esteárico fundido. Tabela 4. Composição (% em p/p) de fitase e grânulos de cera de bai- xo ponto de fusão produzida com atomização de disco giratório de fu- são a quente Ingrediente P2 P4 P44 P46 P54 Pó de fitase 10% 10% 10% 10% 10% Carbonato de cálcio, MI- 10% 40% - - 40% CROWHITE® 30 Codex Ácido esteárico 80% 50% 60% 60% - Estearato de sódio - - 30% 10% - Estearato de cálcio - - - 20% - Cera microcristalina 863 - - - - 50% Total 100% 100% 100% 100% 100% Tamanho de lote 500 g 500 g 250 g 250 g 250 g Exemplo 5. Produção de grânulos de fitase compostos de pó de enzima seco por aspersão e cera de alto ponto de fusão como ma- terial matricial com atomização de disco giratório de fusão a quente

[00116] O seguinte é um exemplo de formulações de enzima com carreador de alto ponto de fusão que, dependendo de seus valores de ECR, satisfazem a exigência de estabilidade de peletização, conforme descrito no Exemplo 11.

[00117] As formulações de grânulo de fitase foram produzidas com o método de atomização de disco giratório descrito no Exemplo 3. As composições de fusão a quente foram preparadas adicionando-se pó de fitase seco por aspersão, preparado conforme descrito no Exemplo 1, e carbonato de cálcio na cera fundida a cerca de 152 °C. O tempo de processamento foi menor que 2,5 min incluindo a mistura dos mate- riais e distribuição da preparação de fusão no disco giratório. Gotículas de fusão finas formadas pela atomização foram rapidamente solidifica- das em partículas em temperatura ambiente. As partículas foram cole- tadas e armazenadas em recipientes plásticos vedados. A composição de formulações de grânulo de fitase é fornecida na Tabela 5. Tabela 5. Composição (% em p/p) de fitase e grânulos de cera de alto ponto de fusão produzida com atomização de disco giratório de fusão a quente Ingrediente P40.4 P58.1 P96.1 97.6 P97.2 Pó de fitase 10% 10% 20% 20% 20% Carbonato de cálcio GLC- - - 10% 10% 20% 1012 Sasolwax C105 90% - - - - Honeywell A-C® 820A - 90% - - - POLYWAX™ 2000 - - 70% 70% 60% Total 100% 100% 100% 100% 100% Tamanho de lote 180 g 500 g 400 g 500 g 400 g Exemplo 6. Produção de grânulos de fitase compostos de pó de enzima seco por aspersão e (baixo ponto de fusão) ácido esteári- co e (alto ponto de fusão) estearato de zinco como materiais ma- triciais com atomização de disco giratório de fusão a quente

[00118] O seguinte é um exemplo comparativo de formulações de enzima, conforme descrito no Exemplo 5 do Pedido de Patente Inter- nacional no WO03056934A2 (atribuído a Cargill), intitulado, "encapsu- lation by coating with a mixture of lipids and hydrophobic, high melting point compounds", que demonstra que essas formulações anteriores não satisfazem a presente estabilidade de peletização.

[00119] As formulações de grânulo de fitase foram produzidas com o método de atomização de disco giratório descrito no Exemplo 3. Áci- do esteárico (p.f. 73 °C) e estearato de zinco ZINCUM® SMS Veg (p.f. 121 °C) foram usados como materiais matriciais. Composições de fu- são a quente foram preparadas adicionando-se o pó de fitase seco por aspersão na preparação de cera fundida a cerca de 152 °C, em que a razão de ácido esteárico/estearato de zinco foi de 9:1 em base de pe- so por peso. A preparação de fusão foi transferida de maneira manual e estável como uma única corrente no disco giratório. O tempo de pro- cessamento foi de aproximadamente 1,3 min incluindo a mistura dos materiais e alimentação no disco giratório. Gotículas de fusão finas formadas pela atomização foram rapidamente solidificadas em partícu- las em temperatura ambiente. As partículas foram coletadas e arma- zenadas em recipientes plásticos vedados. A composição de formula- ções de grânulo de fitase é fornecida na Tabela 6. Tabela 6. Composição (% em p/p) de grânulos de fitase produzida com atomização de disco giratório de fusão a quente Ingrediente P166.4 Ácido esteárico 72% ZINCUM® SMS Veg 8% Fitase, pó seco por aspersão 20% Tamanho de lote 400 g Exemplo 7. Produção de grânulos de fitase compostos de pó de enzima seco por aspersão e estearato de zinco e resina de poli- terpeno como materiais matriciais de alto ponto de fusão com atomização de disco giratório de fusão a quente

[00120] As formulações de grânulo de fitase foram produzidas com o método de atomização de disco giratório descrito no Exemplo 3. Es- tearato de zinco ZINCUM® SP VEG (p.f. 121 °C), PICCOLYTE® C125 °C (ponto de suavização 125 ), e PICCOLYTE® A135 Plus (ponto de suavização 135 °C) foram usados como materiais matriciais. Composi-

ções de fusão a quente foram preparadas adicionando-se o pó de fi- tase seco por aspersão na preparação de cera fundida a cerca de 152 °C. A preparação de fusão foi transferida de maneira manual e estável como uma única corrente no disco giratório. O tempo de processamen- to foi de aproximadamente 1 a 1,5 min incluindo a mistura dos materi- ais e alimentação no disco giratório. Gotículas de fusão finas formadas pela atomização foram rapidamente solidificadas em partículas em temperatura ambiente. As partículas foram coletadas e armazenadas em recipientes plásticos vedados. A composição de formulações de grânulo de fitase é fornecida na Tabela 7. Tabela 7. Composição (% em p/p) de grânulos de fitase produzida com atomização de disco giratório de fusão a quente Ingrediente P166.1 P170.2 P171.3 ZINCUM® SP VEG 60% 48% 48% PICCOLYTE® C125 - 12% - PICCOLYTE® A135 Plus - - 12% Carbonato de cálcio 20% 20% 20% Fitase, pó seco por aspersão 20% 20% 20% Tamanho de lote 400 g 400 g 400 g Exemplo 8. Procedimentos para condicionamento de vapor de alimentação animal que contém grânulos de enzima

[00121] A estabilidade térmica de grânulos de enzima foi avaliada em uma usina de moagem de alimentação em miniatura com uma ca- pacidade de peletização nominal de 300 kg/h. O condicionamento foi realizado sob diferentes temperaturas controladas, por exemplo, 90 e 95 °C. Produção da mistura de alimentação, técnica de mistura, tempo de descanso, capacidade e tempo de resfriamento foram idênticos em todas as formulações. Apenas a adição de enzimas e a adição de va- por no misturador de cascata para alcançar a temperatura de condici- onamento desejada variaram.

[00122] O moinho de alimentação consistiu em um misturador hori-

zontal com uma capacidade de volume de 700 l e uma capacidade de mistura de 80 a 300 kg, execução a uma velocidade de 48 rpm; uma rosca dosadora do tipo Skjold TR com velocidade ajustável (usado pa- ra esvaziar o misturador e para dosar a alimentação); um misturador de cascata do tipo KAHL, 130 cm x 30 cm – comprimento x diâmetro, com 37 paletas ajustáveis que operam a uma velocidade de 155 rpm (tempo de permanência no misturador de cascata foi de aproximada- mente 30 segundos estimados com base em uma taxa de produção de 300 kg/h); uma tubulação de coleta montada em um lado do mistura- dor de cascata com uma descarga de água e 3 válvulas de vapor das quais o vapor foi adicionado na alimentação; e uma caldeira de alta pressão do tipo Dan Stroker com uma capacidade máxima de 400 kg de vapor/h.

[00123] O vapor foi adicionado na alimentação com uma válvula de expansão que controla a adição de vapor no misturador de cascata. As três válvulas na tubulação de coleta foram usadas para ajuste fino da temperatura desejada na alimentação. A temperatura da alimentação aumentou em 14 °C por 1% de vapor adicionado. A temperatura da refeição foi gravada com um termômetro digital do tipo Testo 925 com um sensor Pt 100. O sensor foi colocado próximo à boca do misturador de cascata. O termômetro foi calibrado com um termômetro de mercú- rio aprovado do tipo Goldbrand/39 Q9732-818.

[00124] A peletizadora usada foi uma Simon Heesen do tipo Labor Monoroll com um motor de 7,5 kW. O diâmetro interno da matriz foi de 173 mm com um molde de 3 mm x 35 mm (diâmetro de furo x compri- mento de canal). A altura e o diâmetro da prensa foram de 50 mm e 140 mm, respectivamente. As amostras foram resfriadas em uma caixa de resfriamento dividida com o fundo perfurado através do qual a ali- mentação de farinha foi resfriada por um ventilador com uma capaci- dade de 1.500 m3 ar/h.

[00125] A formulação de mistura de alimentação correspondeu a uma dieta de milho padrão regular, conforme mostrado na Tabela 17. Uma quantidade suficiente da mistura de alimentação foi preparada em cada ensaio. Essa mistura básica foi produzida em um lote em uma instalação de mistura e moinho, e armazenada em um recipiente antes de cada ensaio. Uma ‘pré-mistura' de alimentação foi preparada mesclando-se uma dada quantidade de grânulos de enzima com 10 kg da mistura de alimentação em um misturador compulsório de 70 l que opera a 45 rpm por 10 min. A pré-mistura foi, então, adicionada a cer- ca de 110 kg da mistura de alimentação no misturador horizontal do moinho de alimentação e misturada por 10 minutos para produzir a ‘alimentação de ensaio' ou ‘mosto'. No caso de fitase, quantidade ade- quada de grânulos de fitase foram adicionados na pré-mistura para render uma atividade de enzima-alvo de 5.000 FTU/kg de alimentação de ensaio. Uma amostra de ‘pré-vapor' foi coletada a partir da alimen- tação de ensaio antes de peletizar e armazenada em um recipiente identificado em temperatura de meio ambiente normal até a análise para atividade de enzima.

[00126] Um produto de grânulo de fitase de referência (serviu como controle) com atividade de fitase conhecida foi adicionado a 5.000 FTU/kg de alimentação de ensaio em todos os ensaios de peletização como controle. Tabela 8. Composição de dieta de milho padrão em ensaios de peleti- zação Ingrediente Percentual em Peso Milho 61,10% Farinha de soja 48 31,43% Óleo de soja 4,00% Sal 0,40% DL-metionina 0,20% Calcário 1,16%

Ingrediente Percentual em Peso Fosfato dicálcico 1,46% Pré-mistura de vitaminas/minerais 0,25% Total 100,00%

[00127] A alimentação de ensaio foi peletizada na peletizadora Si- mon Heesen com o molde. A capacidade foi definida em 300 kg/h e foi ajustada para a rosca dosadora. A alimentação foi aquecida até as temperaturas de saída-alvo (ou descarga) de 90 e 95 °C por vapor no misturador de cascata. A quantidade de vapor foi regulada através da válvula de redução de pressão e da tubulação. A amostra ‘pós-vapor' foi coletada como subamostras de aproximadamente 0,5 kg que foram imediatamente removidas 10 a 15 segundos após os péletes terem deixado a peletizadora e colocados em uma caixa de resfriamento. Pa- ra cada nível de temperatura, a primeira subamostra foi obtida quando a operação foi estabelecida após 8 a 10 min de peletização. Subamos- tras foram coletadas durante um período de 1 a 1,5 min, que corres- ponde a 5 a 7,5 kg de alimentação peletizada. Todas as amostras fo- ram aeradas e resfriadas em temperatura de meio ambiente por 15 minutos, que garantiu a remoção de calor excedente dos péletes. A amostra de pós-vapor foi armazenada em um recipiente identificado em temperatura de meio ambiente normal até a análise para atividade de enzima.

[00128] Antes da produção da mistura de farinha na instalação de mistura e moinho, o moinho de alimentação foi limpo dos restantes de alimentação e o misturador foi limpo a vácuo. O moinho de alimenta- ção em miniatura foi limpo antes e após cada ensaio. Misturador e equipamento de dosagem foram limpos a vácuo, e o misturador de cascata era autoesvaziante. O pequeno misturador para pré-mistura e a caixa de resfriamento foram limpos vigorosamente após cada en- saio. Exemplo 9. Análise de atividade de fitase de amostras de alimen-

tação

[00129] Um método interno de análise foi desenvolvido de modo a analisar precisamente a atividade de T. reesei fitase em alimentos animais e em pré-misturas que contêm grânulos de fitase quando mis- turadas na alimentação. O método é muito similar ao método padrão harmonizado IS0 30024:2009 (isto é, ISO 30024: Animal feeding stuffs – Determination of Phytase Activity, 2009) e segue o mesmo princípio, isto é, a fitase é incubada com fitato de sódio, que resulta na liberação de fosfato inorgânico. O fosfato inorgânico cria um complexo de cor amarela quando reagido com o reagente de molibdato-vanadato. A densidade óptica do complexo amarelo é medida em um comprimento de onda de 415 nm. O grau de formação de cor pode estar diretamen- te relacionado à atividade de enzima. Quantificação de atividade é fei- ta através de um método absoluto que usa uma curva de calibragem padrão de fosfato.

[00130] Esse método foi desenvolvido de acordo com os princípios apresentados em ISO 9001 (isto é, ISO 9001: 2008 Quality Manage- ment Systems) e Boa Práticas de Laboratório e foi escrito em confor- midade com as regras dadas em ISO 78-2:1999 (isto é, ISO 78-2: Chemistry – Layouts for standards – Part 2: Methods of Chemical Analysis, 1999).

[00131] Uma unidade de atividade de fitase (FTU) foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ortofosfato inorgânico de um substrato de fitato de sódio por minuto em pH 5,5 e 37 °C. Amos- tras de alimentação moídas com a atividade de fitase conhecida (5.000 FTU/kg) foram usadas como um controle. Exemplo 10. Estabilidade térmica de fitase granulada para condi- cionamento de vapor de alimentação animal que contém grânulos de fitase produzidos a partir de cera de baixo ponto de fusão co- mo material matricial

[00132] O seguinte é um exemplo comparativo que ilustra que as formulações de enzima com carreadores de baixo ponto de fusão des- critos no Exemplo 4 não satisfazem as presentes exigências de estabi- lidade de peletização.

[00133] Os grânulos de fitase do Exemplo 4 foram avaliados em ensaios de peletização de alimentação animal em conformidade com os procedimentos descritos nos Exemplos 8 e 9. A faixa de tamanho de partícula de formulações de teste é mostrada na Tabela 9. Tabela 9. Distribuição de tamanho de partícula (% em p/p) de formula- ções de grânulo de fitase avaliada em ensaio de peletização Formulação Faixa de Tamanho de Partícula P2 212-300 µm P4 212-300 µm P44 212-300 µm P46 212-300 µm P54 212-300 µm

[00134] A atividade de enzima de formulações de grânulo de fitase medida no mosto de alimentação antes e a atividade residual relativa após o processamento com vapor são mostradas na Tabela 10. Todas as formulações de fitase produzidas com a cera de baixo ponto de fu- são como material matricial perderam pelo menos 85% de sua ativida- de de enzima inicial no processo de peletização a vapor (n = 2, avg ± std dev). Tabela 10. Atividade de enzima de grânulos de fitase produzidos com atomização de disco giratório de fusão a quente Formulação Atividade inicial Atividade resi- Atividade resi- (FTU/g) dual relativa (%) dual relativa (%) 90oC 95oC P2 30160 ± 1450 8,1% ± 1,8% 4,8% ± 1,7% P4 32084 ± 1040 6,8% ± 1,0% 5,2% ± 0,5% P44 20234 ± 558 14,8% ± 2,4% 5,1% ± 2,9% P46 19608 ± 1038 7,7% ± 0,8% 6,5% ± 1,0%

Formulação Atividade inicial Atividade resi- Atividade resi- (FTU/g) dual relativa (%) dual relativa (%) P54 12990 ± 1810 8,4% ± 2,2% 7,8% ± 2,1% Exemplo 11. Estabilidade térmica de fitase granulada para condi- cionamento de vapor de alimentação animal que contém grânulos de fitase produzidos a partir de cera de alto ponto de fusão como material matricial

[00135] O seguinte é um exemplo que ilustra as formulações de en- zima com os carreadores de alto ponto de fusão descritos no Exemplo 5, que satisfazem as presentes exigências de estabilidade de peletiza- ção. Os grânulos de fitase do Exemplo 5 foram avaliados em ensaios de peletização de alimentação animal em conformidade com os proce- dimentos descritos nos Exemplos 9 e 10. A faixa de tamanho de partí- cula de formulações de teste é mostrada na Tabela 11. Tabela 11. Faixa de tamanho de partícula (% em peso/peso) de formu- lações de grânulo de fitase avaliadas no ensaio de peletização Formulação Faixa de Tamanho de Partícula P40.4 212-425 µm P58.1 212-300 µm P96.1 212-300 µm P97.6 212-300 µm P97.2 212-300 µm

[00136] A atividade de enzima de formulações de grânulo de fitase medida no mosto de alimentação antes e a atividade residual relativa após o processamento com vapor são mostradas na Tabela 12. Todas as formulações de fitase produzidas com a cera de alto ponto de fusão como material matricial mantiveram pelo menos 50% de sua atividade de enzima inicial no processo de peletização a vapor. As composições preferenciais, produzidas a partir de uma cera de alto ponto de fusão com uma ECR(40,140) de 6,1%, mantiveram pelo menos 85% de sua ati- vidade inicial após peletização a 95 °C (n = 2, avg ± std dev).

Tabela 12. Atividade de enzima de grânulos de fitase produzidos com atomização de disco giratório de fusão a quente Formulação Atividade inicial Atividade resi- Atividade resi- (FTU/g) dual relativa (%) dual relativa (%) 90oC 95oC P40.4 10979 ± 98 54,7% ± 5,2% 51,3% ± 9,4% P58.1 17800 ± 148 74,4% ± 1,1% 68,8% ± 5,4% P96.1 29852 ± 2176 89,5% ± 8,4% 86,1% ± 6,6% P97.6 21604 ± 704 102,4% ± 16,8% 84,9% ± 3,6% P97.2 31744 ± 4032 96,4% ± 24,3% 100,2% ± 14,6% Exemplo 12. Estabilidade térmica de fitase granulada para condi- cionamento de vapor de alimentação animal que contém grânulos de fitase produzidos a partir de ácido esteárico e estearato de zin- co, estearato de zinco e resinas de estearato de zinco e politerpe- no

[00137] O seguinte é um exemplo que ilustra o desempenho dos grânulos de fitase dos Exemplos 6 e 7 conforme avaliado em ensaios de peletização de alimentação animal em conformidade com os proce- dimentos descritos nos Exemplos 8 e 9. A faixa de tamanho de partí- cula de formulações de teste é mostrada na Tabela 13. Tabela 13. Distribuição de tamanho de partícula (% em peso/peso) de formulações de grânulo de fitase avaliada em ensaio de peletização Formulação Faixa de Tamanho de Partícula Amostra 1 Amostra 2 P166.1 212-300 µm 300-425 µm P166.4 212-425 µm - P170.2 212-300 µm 300-425 µm P171.3 212-300 µm 300-425 µm

[00138] A atividade de enzima de formulações de grânulo de fitase medida no mosto de alimentação antes e a atividade residual relativa após o processamento com vapor são mostradas na Tabela 14. A for- mulação de fitase P166.4 (conforme descrito no documento no

WO03056934A2) que contém ácido esteárico de baixo ponto de fusão perdeu toda sua atividade de enzima inicial durante o processo de pe- letização. As formulações de fitase P170.2 e P171.3 produzidas a par- tir de estearato de zinco de alto ponto de fusão e uma resina PIC- COLYTE® mostraram estabilidade de peletização melhorada em com- paração com a formulação P166.1 que foi produzida a partir de estea- rato de zinco sozinho como um material matricial (n = 2, avg ± std dev). Tabela 14. Atividade de enzima de grânulos de fitase produzidos com atomização de disco giratório de fusão a quente Formulação Atividade de enzi- Atividade residual relativa (%) ma inicial (FTU/g) Amostra 1 Amostra 2 Amostra 1 Amostra 2 90oC 95oC 90oC 95oC P166.4 51878 - 0% 0% - - P166.1 40696 ± 43583 ± 73,1% ± 41,1% ± 69,1% ± 48,8% ± 2254 6949 4,3% 4,6% 11,9% 8,3% P170.2 39502 ± 44954 ± 86,3% ± 71,9% ± 77,6% ± 75,0% ± 1740 2524 5,7% 3,4% 4,7% 4,2% P171.3 41851 ± 44320 ± 81,6% ± 58,5% ± 79,6% ± 77,1% ± 3694 305 19,6% 6,5% 7,9% 3,1%

[00139] Exemplos 13 e 14 descrevem estudos de biodisponibilidade realizados em frangos e porcos para avaliar a bioeficiência das pre- sentes formulações de grânulo de fitase em comparação com um pro- duto comercial. Exemplo 13: Bioeficiência de grânulos de fitase de cera polietile- no microencapsulada em frangos

[00140] Três estudos in vivo separados ("A", "B" e "C") foram con- duzidos para avaliar e comparar a bioeficiência das formulações de grânulo de fitase, produzidas com atomização de disco giratório de fu- são a quente conforme descrito no Exemplo 3. Três formulações P75.1M e P75.4M, P96.5 consistiram em fitase seca por aspersão mi-

croencapsulada em uma cera de homopolímero de polietileno (PE), POLYWAX™ 2000 (Tabela 15). A bioeficiência de grânulos de fitase de cera de PE microencapsulada foi comparada com aquela de um produto comercial Danisco AXTRA® PHY (uma fitase variante de um Buttiauxella sp.). Os estudos A e B envolveram formulações P75.1M, P75.4M e AXTRA® PHY, e cada um consistiu em oito tratamentos (Ta- bela 16). O estudo C envolveu formulações P75.1M, P96.5 e AXTRA® PHY, e consistiu em oito tratamentos (Tabela 17). Tabela 15. Composição (% em p/p) de grânulos de fitase produzida com atomização de disco giratório de fusão a quente Ingrediente Formulação P75.1M P75.4M P96.5 Pó de fitase 20% 20% 20% Carbonato de cálcio GLC-1012 - 10% 20% POLYWAX™ 2000 80% 70% 60% Total 100% 100% 100% Tamanho de lote 400 g 400 g 400 g Tabela 16. Projeto experimental para os estudos A e B Dose Tratamento dietético Nível de nPP Nível de fitase dietético (%) (FTU/kg) 1 Controle negativo (NC) 0,15 0 2 NC + AXTRA® PHY 0,15 300 3 NC + AXTRA® PHY 0,15 600 4 NC + AXTRA® PHY 0,15 1000 5 NC + P75.1M 0,15 300 6 NC + P75.1M 0,15 600 7 NC + P75.4M 0,15 300 8 NC + P75.4M 0,15 600

Tabela 17. Projeto experimental para o estudo C Dose Tratamento dietético Nível de nPP Nível de fitase dietético (%) (FTU/kg) 1 Controle negativo (NC) 0,15 0 2 NC + AXTRA® PHY 0,15 300 3 NC + AXTRA® PHY 0,15 600 4 NC + AXTRA® PHY 0,15 1000 5 NC + P75.1M 0,15 300 6 NC + P75.1M 0,15 600 7 NC + P96.5 0,15 300 8 NC + P96.5 0,15 600

[00141] Frangos machos Ross 708 de um dia de idade foram usa- dos em todos os estudos. No início do estudo, 8 pássaros foram alea- toriamente alocados em gaiolas em bateria de acordo com os respec- tivos tratamentos por blocos. Somente os pássaros saudáveis foram selecionados para a experiência, e nenhum pássaro foi substituído ao longo do curso do estudo.

[00142] Os pesos dos pássaros foram registrados no início do estu- do (dia 0), no dia 7 e na terminação do estudo (dia 14). A gaiola era a unidade experimental. As dietas foram alimentadas em forma esma- gada e foram formuladas para cumprirem ou excederam os padrões de NRC (National Research Council), exceto para Ca e AvP (Tabela 18). Toda alimentação foi misturada com o uso de um misturador Da- vis S-20 (H.C. Davis Sons Manufacturing Co., Bonner Springs, KS, E.U.A.). O misturador foi nivelado entre cada tratamento para evitar a contaminação cruzada entre rações. As amostras foram coletadas de cada dieta de tratamento a partir do início, meio e final de cada lote e foram picadas em conjunto para análise da atividade de enzimas na alimentação.

[00143] Todos os pássaros foram alimentados com uma ração à base de maís e soja até o dia 7; a partir do dia 7 foram alimentadas as rações de tratamento. Na alteração de alimentação, os alimentadores foram removidos das gaiolas, pesados novamente, esvaziados, e re- enchidos com a dieta de tratamento apropriada. No dia final do estudo, a alimentação foi pesada. Tabela 18. Formulações de dieta Ingrediente Inclusão iniciadora Inclusão de NC (7 a (0 a 7 dias) (%) 14 dias) (%) Maís 52,09 58,27 Farinha de Soja, 48% CP 42,53 37,56 Gordura de porco/aves 1,32 1,62 HCl de L-Lisina 0,12 0,056 DL-metionina 0,30 0,24 L-treonina 0,039 0,0025 Sal 0,32 0,32 Calcário 1,11 1,37 Fosfato dicálcico 1,68 0,061 vit/TE de aves 0,5 0,5 Energia correspondida 12,13 12,55 Proteína bruta 25 23 Cálcio 1 0,7 p de não fitato (nPP) 0,45 0,15 Na 0,16 0,16 Cl 0,25 0,24 Lys disponível 1,27 1,1 Met + Cys disponível 0,94 0,84 Thr disponível 0,83 0,73 Trp disponível 0,26 0,24

[00144] Na terminação do estudo, seis pássaros por gaiola (dois pássaros de peso médio, dois pássaros abaixo do peso médio e dois pássaros acima do peso médio) foram selecionados para medições de cinza óssea. A tíbia direita de cada pássaro foi removida. O osso foi seco de um dia para o outro a 100 ˚C, dividido em três partes iguais,

as duas partes finais (epífise) foram pesadas juntas e a parte interme- diária foi pesada em um cadinho separado, os ossos foram, então, transformados em cinzas em uma mufla por 16 horas a 600 ˚C. As cin- zas foram, então, expressas como uma porcentagem com base no pe- so da cinza de mandrilagem como uma proporção do peso ósseo se- co. A cinza de osso epifisário e cinza de osso médio foram adiciona- das juntas para permitir o cálculo da cinza de tíbia inteira. Para medi- ções de cinza de dedo do pé, todos os pássaros por gaiola foram usa- dos, pegando-se o dedo médio, separado na terceira falange distal- mente para proximamente, os dedos foram agrupados em cercados e transformados em cinzas em cadinhos separados daqueles com os da tíbia. Dados foram analisados com o uso de ANOVA, e significa a se- paração conduzida para testar diferenças entre as diferentes formula- ções de enzima e doses de enzima. A gaiola foi usada como a unidade experimental.

[00145] As Figuras 7 a 9 mostram, respectivamente, a variação de cinza de tíbia epifisária, cinza de tíbia inteira e cinza de dedo do pé com atividade de fitase em alimentação medida no estudo A. Os resul- tados obtidos para a cinza de tíbia epifisária, cinza de tíbia inteira e cinza de dedo do pé indicaram que não houve diferença significativa na biodisponibilidade da enzima entre as formulações desta invenção e o produto comercial AXTRA® PHY. Houve um efeito significativo de fitase sobre a cinza de osso, em que níveis de inclusão maiores de enzima resultaram em mais cinza de osso.

[00146] As Figuras 10 a 12 mostram, respectivamente, a variação de cinza de tíbia epifisária, cinza de tíbia inteira e cinza de dedo do pé com atividade de fitase em alimentação medida no estudo B. Os resul- tados obtidos para a cinza de tíbia epifisária e cinza de tíbia inteira in- dicaram que houve uma diferença significativa na biodisponibilidade da enzima entre as diferentes formulações, em que P75.1M e P75.4M demonstraram maiores níveis de biodisponibilidade em comparação com o produto comercial AXTRA® PHY. Com base nos resultados de cinza de dedo do pé, não houve diferença significativa na biodisponibi- lidade da enzima entre as formulações P75.1M, P75.4M e o AXTRA® PHY. Houve um efeito significativo de fitase sobre a cinza de osso, em que níveis de inclusão maiores de enzima resultaram em mais cinza de osso.

[00147] As Figuras 13 a 15 mostram, respectivamente, a variação de cinza de tíbia epifisária, cinza de tíbia inteira e cinza de dedo do pé com atividade de fitase em alimentação medida no estudo C. Os resul- tados obtidos para a cinza de tíbia epifisária, cinza de tíbia inteira e cinza de dedo do pé indicaram que não houve diferença significativa na biodisponibilidade da enzima entre as formulações P75.1M, P96.5 e o AXTRA® PHY. Houve um efeito significativo de fitase sobre a cinza de osso, em que níveis de inclusão maiores de enzima resultaram em mais cinza de osso. Exemplo 14. Estudo de bioeficiência de grânulos de fitase de cera de polietileno microencapsulada em porcos

[00148] Um estudo in vivo foi conduzido para avaliar e comparar a bioeficiência de formulações de grânulo de fitase P75.1M e P75.4M, produzidas com atomização de disco giratório de fusão a quente (con- sultar o Exemplo 13). A bioeficiência de grânulos de fitase de cera de PE microencapsulada foi comparada com aquela do produto comercial AXTRA® PHY.

[00149] Um total de 70 porcos (16,82 ± 1,34 kg de BW inicial) foram atribuídos a um projeto de bloco completo aleatorizado com 7 dietas e 10 porcos repetidos por dieta e dois períodos. A dieta de controle for- mulada com milho e farinha de soja (SBM) e nenhuma fitase foi adici- onado a essa dieta. As outras seis dietas foram similares à dieta de controle com a exceção de que a fitase foi incluída na dieta (Tabela

19). As dietas foram alimentadas em forma esmagada e foram formu- ladas para cumprirem ou excederam os padrões de NRC (National Research Council), exceto para Ca e AvP (Tabela 20). Tabela 19. Projeto experimental para estudos HB1304 Dosagem Tratamento dietético Nível de fitase (FTU/kg) 1 Controle negativo (NC) 0 ® 2 NC + AXTRA PHY 300 3 NC + AXTRA® PHY 600 4 NC + P75.1M 300 5 NC + P75.1M 600 6 NC + P75.4M 300 7 NC + P75.4M 600 Tabela 20. Formulações de dieta Ingrediente Inclusão (%) Milho 65,72 Farinha de soja (48% CP) 30,00 Calcário 0,96 HCl de L-Lisina 0,41 DL-Met 0,09 L-Thr 0,12 Graxa branca de escolha 2,00 Sal 0,40 Pré-mistura de vitamina padrão 0,30 Composição analisada Matéria seca, % 89,60 Cinzas (%) 4,64 Ca (%) 0,66 Fósforo (%) 0,34

[00150] Em cada período, após 5 dias de adaptação, as amostras fecais foram coletadas no dia 6 a 12 e analisadas para fósforo (P) com o uso do método de coleta total. Porcos foram alimentados em um ní- vel diária de 3 vezes a exigência de manutenção para energia (isto é,

197 kcal de ME por kg de BW0,60; NRC, 2012) dividido em 2 refeições iguais. Água estava disponível em todos os momentos ao longo da ex- periência. Os pesos dos porcos foram gravados no começo do período de adaptação (dia 0) e no fim de cada período de coleta (dia 13). A quantidade de alimentação fornecida a cada dia durante o período de coleta também foi gravada.

[00151] O começo e o fim da coleta fecal foram marcados pela adi- ção de um marcador indigestível. Na conclusão da experiência, as amostras fecais foram secas em um forno de ar forçado e finamente moídas antes da análise. Dietas, ingredientes e amostras fecais foram analisadas para P e a digestibilidade de trato total aparente (ATTD) de % de P foi calculada a partir da equação: ATTD P (%) = [(Pin - Pfo) / Pi] x 100, em que Pi é a admissão total de P a partir do dia 6 até 12, e Pf é a excreção fecal total de P que se origina da alimentação que foi consumida a partir do dia 6 até 12. Os dados foram analisados usando ANOVA, e separação de mínimos conduzida para testar diferenças entre as diferentes enzimas e doses de enzimas. Porco foi usado co- mo a unidade experimental.

[00152] Conforme mostrado na Figura 16, houve um efeito significa- tivo da enzima sobre a Digestibilidade de Trato Total Aparente de % de P (ATTD P %), em que P75.4M demonstrou ATTD P % maior que P75.1M e o produto comercial AXTRA® PHY, o que sugere um nível maior de biodisponibilidade para a formulação P75.4M.

[00153] Com base nos resultados dos Exemplos 13 e 14, é aparen- te que o desempenho das composições de cera de PE de alto ponto de fusão foi, em todos os casos, maior ou igual ao produto comercial AXTRA® PHY em termos de marcadores de biodisponibilidade investi- gados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Partícula caracterizada pelo fato de que compreende par- ticulados que contêm uma ou mais enzimas dispersas em uma matriz de cera de alto ponto de fusão.

2. Partícula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a matriz de cera compreende uma cera insolúvel em água.

3. Partícula, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizada pelo fato de que a cera tem um ponto de fusão máximo de pico maior do que 100 °C, opcionalmente maior do que 110 °C, e até opci- onalmente maior do que 120 °C.

4. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a cera tem um ponto de fu- são inicial de pelo menos 100 °C e um ponto de fusão máximo de pico de pelo menos 110 °C.

5. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a cera tem um ponto de fu- são inicial de pelo menos 110 °C e um ponto de fusão máximo de pico de pelo menos 120 °C.

6. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a cera tem uma viscosidade de fusão de menos do que 500 centipoises a temperaturas dentro de 25 °C acima da temperatura de fusão de cera.

7. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a cera tem um peso molecu- lar ponderal médio de menos do que 3.000 e um índice de polidisper- são de menos do que 3.

8. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o ECR(40,140) é menos do que 20%, e preferencialmente menos do que 15%.

9. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a enzima é pelo menos uma dentre amilase, celulase, fitase, protease ou xilanase.

10. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende uma carga útil de enzima ativa maior do que 5% em p/p, e uma atividade de água de menos do que 0,3.

11. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizada pelo fato de que os particulados de enzima estão na faixa de cerca de 1 a cerca de 250 micrômetros.

12. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende um teor de água de menos do que 5% em p/p, e uma atividade de água de menos do que 0,4.

13. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizada pelo fato de que as partículas estão na fai- xa de cerca de 100 a cerca de 500 micrômetros.

14. Partícula, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que o tamanho de partículas está na faixa de cerca de 212 a cerca de 425 micrômetros.

15. Partícula, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zada pelo fato de que o tamanho de partículas está na faixa de cerca de 212 a cerca de 300 micrômetros.

16. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizada pelo fato de que os particulados de enzima são produzidos com qualquer um dentre secagem por aspersão, res- friamento por aspersão, granulação a seco, granulação úmida ou gra- nulação de leito fluidizado.

17. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizada pelo fato de que compreende um ingredien-

te de carga selecionado dentre o grupo de substâncias minerais que consistem em calcário, mica, argila e óxido de titânio.

18. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a cera é selecionada den- tre o grupo de ceras de polímero que consiste em cera de polietileno, cera de polietileno oxidado, cera de polipropileno, cera Fischer- Tropsch, cera de sal de ácido carboxílico ou uma mistura das mesmas.

19. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a cera é uma cera de po- lietileno.

20. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a cera é selecionada den- tre o grupo de ceras que consistem em estearato de alumínio, esteara- to de cálcio, estearato de magnésio, beenato de zinco, laurato de zin- co, estearato de zinco ou uma mistura dos mesmos.

21. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizada pelo fato de que cera é estearato de zinco.

22. Partícula, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 21, sendo que a partícula é caracterizada pelo fato de que compreende uma resina de politerpeno, uma resina de breu, goma damar ou uma mistura das ditas resinas.

23. Partícula, de acordo com a reivindicação 21, sendo que a partícula é caracterizada pelo fato de que compreende uma resina de politerpeno, uma resina de breu, uma goma damar ou uma mistura das ditas resinas.

24. Método para preparar uma partícula que compreende particulados de enzima dispersos em uma matriz de cera de alto ponto de fusão caracterizado pelo fato de que compreende: (a) dispersar um pó de enzima seco em uma cera fundida para fornecer uma suspensão de enzima-cera;

(b) atomizar a suspensão de enzima-cera para formar gotí- culas distintas; e (c) resfriar, solidificar e coletar as partículas de enzima- cera.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que as partículas de enzima-cera resultantes são as partículas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.

26. Método para melhorar o crescimento de aves ou porci- nos caracterizado pelo fato de que compreende introduzir uma partícu- la, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, na dieta do animal e medir uma melhora no crescimento em relação ao animal de controle não tratado com tal partícula.