ES2835955T3

ES2835955T3 - Variantes de fitasa de Buttiauxella sp.

Info

Publication number: ES2835955T3
Application number: ES16168636T
Authority: ES
Inventors: Oliver Kensch; Pellengahr Klaus Schulze; Birgitta Leuthner; Jayarama Shetty; Michael Pepsin; Soren Dalsgaard; Isaksen Mai Faurschou
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2008-04-18
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2021-06-23
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: BRPI0910457B1; US20140234490A1; HK1156071A1; EP2283124B1; CN102007211A; BRPI0910457A2; EP3118309B1; MX2010010982A; WO2009129489A2; CA2721691A1; PL3118309T3; EP3118309A2; US20110201081A1; CA2721691C; US9999238B2; CN102007211B; HUE052318T2; DK3118309T3; JP2011519274A; US20180125094A1

Abstract

Uso de una variante de fitasa en pienso para animales para mejorar la digestión de fosfato; donde dicha variante de fitasa presenta actividad térmica mejorada de al menos aproximadamente 5 ºC en comparación con la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1); donde además dicha variante de fitasa comparte al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, donde además dicha variante de fitasa comprende una fitasa que contiene una sustitución en una, dos o tres posiciones seleccionadas del grupo que consiste en S75, Q76 y A374; en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 y/o N270; y en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: N37, G77, H160, F164, T171, S188, G192, K198, A235, Q256 y/o P367, donde cada posición corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de fitasa de Buttiauxella sp.

REFERENCIA CRUZADA

[0001] La presente solicitud reivindica las ventajas de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/046,324, presentada el 18 de abril de 2008, cuya exposición se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad a todos los efectos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La tecnología provista aquí se refiere a variantes mejoradas de fitasas de Buttiauxella sp., ácidos nucleicos que codifican las fitasas, vectores, células huésped que contienen los ácidos nucleicos y métodos para producir las fitasas. Las fitasas abarcadas por esta descripción se pueden usar en numerosas aplicaciones que incluyen, por ejemplo, métodos para licuefacción de almidón, fermentaciones de alcohol, y para mejorar la digestión de fosfato en alimentos y piensos para animales.

ANTECEDENTES

[0003] El fitato es la principal forma de almacenamiento de fósforo en cereales y leguminosas. Sin embargo, los animales monogástricos tales como cerdo, aves de corral y peces no son capaces de metabolizar o absorber fitato (o ácido fítico) y por lo tanto es excretado, lo que conduce a contaminación por fósforo en áreas de intensa producción de ganado. Asimismo, el ácido fítico también actúa como agente antinutricional en animales monogástricos por agentes metálicos quelantes, tales como calcio, cobre y zinc.

[0004] A fin de proveer suficientes fosfatos para el crecimiento y la salud de estos animales, se añade fosfato inorgánico a sus dietas. Dicha adición puede ser costosa y además incrementa los problemas de contaminación.

[0005] A través de la acción de la fitasa, el fitato es generalmente hidrolizado para proporcionar fosfatos de inositol inferiores y fosfato inorgánico. Las fitasas son útiles como aditivos para piensos para animales, donde mejoran la disponibilidad de fósforo orgánico al animal y reducen la contaminación por fosfato del ambiente (Wodzinski R J, Ullah A H. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)).

[0006] Un número de fitasas de origen fúngico (Wyss M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R. M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), 4423-4427 (1998); Lassen S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001)) y bacteriano (Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), 107-113 (1993); Kerovuo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H. W. et al., Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S. J. et al., Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N. V. et al., FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004))) se han descrito en la literatura.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0007] En un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de una variante de fitasa en piensos para animales para mejorar la digestión de fosfato;

donde dicha variante de fitasa presenta una actividad térmica mejorada de al menos aproximadamente 5 °C en comparación con la fitasas de Buttiauxella sp de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1);

donde además dicha variante de fitasa comparte al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, donde además dicha variante de fitasa comprende una fitasa que contiene una sustitución en una, dos o tres posiciones seleccionadas del grupo que consiste en S75, Q76 y A374; en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 y/o N270; y en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: N37, G77, H160, F164, T171, S188, G192, k 198, A235, Q256 y/o P367, donde cada posición corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

SUMARIO DE LA EXPOSICIÓN

[0008] En un primer aspecto, los modos de realización de esta exposición proveen variantes de fitasa que tienen una secuencia de aminoácidos que varía de la de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), y que tienen una o más propiedades ventajosas. Esas propiedades pueden incluir, pero no se limitan a: termoestabilidad; perfil de temperatura/actividad; pH/perfil de actividad; actividad específica; y pH/sensibilidad a la proteasa favorables.

[0009] En un aspecto adicional, los modos de realización de esta exposición se refieren a una variante de fitasa que comprende una fitasa que contiene una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 75, 76 y 374, donde cada posición corresponde a la posición de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).

[0010] En otro aspecto adicional, los modos de realización de esta exposición proveen ácidos nucleicos que codifican variantes de fitasa como se describe en la presente exposición, así como vectores y células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos. En otros modos de realización adicionales, las secuencias se utilizan en procesos que producen las variantes de fitasa.

[0011] Además, las modalidades de esta descripción se refieren generalmente al uso de las variantes de fitasa para liberar fósforo de cualquier sustrato de fitasa, en particular, fosfato inorgánico a partir de fitato o ácido fítico. Ventajosamente, las variantes de fitasa de esta descripción se pueden usar en aplicaciones industriales que incluyen, por ejemplo, métodos para licuefacción de almidón y para mejorar la digestión de fosfato en alimentos y piensos para animales. Ventajosamente, las variantes de fitasa de conformidad con modos de realización de la presente descripción son útiles y se usan en procesos y/o producciones de fermentaciones de alcohol.

[0012] En otros aspectos, esta descripción se refiere a composiciones de enzima que comprenden una variante de fitasa como se describe en la presente memoria, donde la composición de enzima es útil para, o se usa en, aplicaciones comerciales. En un modo de realización, la composición de enzima puede ser una composición de pienso para animales. En otros modos de realización, la composición de enzima se puede usar en procesos de hidrólisis de almidón (p. ej., licuefacción). En un modo de realización ventajoso, las variantes y/o la composición de enzima se pueden usar en procesos de fermentación de alcohol. En modos de realización adicionales, una composición de enzima que comprende una fitasa abarcada por esta descripción incluirá enzimas adicionales, tales como glucoamilasas, alfa amilasas, proteasa, celulasas, hemicelulasas, lipasas, pectinasas, pululanasas, glucosa oxidasas, beta glucosidasas, lacasas, oxidasas, cutinasas, fosfatasas, otras fitasas y combinaciones de las mismas.

[0013] En un aspecto adicional, los modos de realización de esta descripción se refieren a métodos para producir las variantes de fitasa en una célula huésped al transformar la célula huésped con un constructo de a Dn , que incluye ventajosamente un promotor que tiene actividad transcripcional en la célula huésped, al cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo adecuado para permitir la expresión de dicha fitasa y la producción de la fitasa. El método también puede incluir la recuperación de la fitasa producida. En un modo de realización, la célula huésped es una célula bacteriana, o una célula vegetal, o una célula fúngica (tal como una célula de Trichoderma, tal como T. reesei) o una levadura. En modos de realización descritos aquí, la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comparte un porcentaje mínimo de identidad de secuencia con la identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1, p. ej., por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1. En un modo de realización ventajoso de esta exposición, la fitasa tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

[0014] La enzima de la presente invención es la que se define en las reivindicaciones y también en la presente memoria. La enzima de la presente invención también abarca polipéptidos activos que son co- o postraduccionalmente procesados durante la expresión, por ejemplo, mediante escisión de péptido de señal. La escisión postraduccional también puede ocurrir en el C-terminal. Por lo tanto, en un modo de realización preferido, el fragmento eficaz de la misma (también referido como fragmento funcional de la misma) es el polipéptido maduro producido por el huésped nativo o un huésped de expresión apropiado.

[0015] En un aspecto, la fitasa descrita en la presente memoria comprende una secuencia de aminoácidos que es expresada de o es expresable de toda o parte de la secuencia de nucleótidos que codifica las variantes definidas en la presente memoria.

[0016] En general, en un aspecto, se provee la variante de fitasa que tiene actividad térmica mejorada de por lo menos aproximadamente 5 °C en comparación con fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1). En un modo de realización, la fitasa que tiene la actividad térmica mejorada tiene por lo menos aproximadamente 17 °C en comparación con la fitasa SEQ ID NO: 1. En otro modo de realización, la actividad térmica mejorada está en un intervalo de aproximadamente 17 a aproximadamente 21°C. En un modo de realización adicional, la actividad térmica mejorada está en un intervalo de aproximadamente 17,4 a aproximadamente 20,2 °C.

[0017] En general, en un aspecto descrito en la presente memoria, se provee una variante de fitasa termoestable que es capaz de retener más del 50 % de su actividad después de exposición a una temperatura elevada durante 10 minutos a pH 5,5 en tampón, donde la temperatura elevada es por lo menos aproximadamente 5 °C más alta que una temperatura a la cual la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) retiene más del 50 % de su actividad. En un aspecto, la temperatura elevada es por lo menos aproximadamente 20,5°C más alta. En otro aspecto, la temperatura elevada está en un intervalo de aproximadamente 20,5 °C a aproximadamente 27 °C. En un aspecto adicional, la temperatura elevada está en un intervalo de aproximadamente 20,2 °C a aproximadamente 26,8 °C.

[0018] En general, en otro aspecto, se provee una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende una variación en una o más posiciones correspondientes a la posición 75, 76, 77, 198, 367 o 374 de SEQ ID NO: 1. En un modo de realización, la variante de fitasa además comprende una o más variaciones adicionales, donde la variación es 92A, 164E/S, 171I/V, 192A o 256A/E/P. En otro modo de realización, la variación en una o más de las posiciones 75, 76, 77, 198, 367 o 374 respectivamente es 75P, 76R, 77S, 198R, 367L o 374P y la variante de fitasa además comprende una o más variaciones adicionales, donde la variación es 92A, 164E/S, 171V, 192A o 256A/E/P. En otro modo de realización adicional, la variante de fitasa además comprende una o más variaciones adicionales, donde la una o más posiciones de variación adicionales es 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261,270, 303 o 318. En un modo de realización adicional, la una o más variaciones adicionales en la posición 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211,235, 261,270, 303 o 318 es respectivamente 26E, 037Y, 089T, 1341/V, 160R, 176K, 178P, 188N, 190E, 207E/T, 209S, 211C, 235V, 261E, 270K, 303F o 318D. En otro modo de realización, la variante de fitasa además comprende una o más variaciones adicionales, donde la una o más posiciones de variación adicionales es 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 o 413. En otro modo de realización adicional, la una o más variaciones adicionales en la posición 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 o 413 es respectivamente 1S, 10I, 11I, 38S, 66E, 71K, 81A, 92E, 109Q, 111G, 119N, 120L, 121E, 141R, 142L, 152M, 155E, 193Q, 211C, 214V, 235V, 239K, 245D, 248L, 255A, 261E, 268A/T, 270K, 277T, 283D, 285K, 287D, 288A, 293G o 296S.

[0019] En general, en otro aspecto, se provee una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende por lo menos una variación en comparación con SEQ ID NO: 1, y donde la variación de secuencia de fitasa comprende

a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

b) N37Y, G77S, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I. H160R, P164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

d) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P

e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, IH60R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

g) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

h) S75P, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

i) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P

j) N37Y, A89T, D92A, T1341, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

k) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

l) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, E164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

n) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

o) N37Y, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256E, A261E, N270K, A374P

p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T17IV. T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

q) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P

r) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; o

t) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[0020] En un modo de realización, la variación de secuencia de fitasa comprende N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[0021] También se provee una fitasa que tiene por lo menos un porcentaje de identidad de secuencia y/o un porcentaje de homología mínimos con respecto a la(s) fitasa(s) expuesta(s) en la presente memoria, donde el porcentaje de identidad y/o de homología mínimos es de por lo menos un 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 93 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 % o por lo menos 99 %.

[0022] En general, en un aspecto, se provee una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende por lo menos una variación en comparación con SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene una variación en por lo menos cualquiera de las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407. En un modo de realización, la variante tiene por lo menos las siguientes variaciones: N70Y, H193R, F197E, S221P y A407P.

[0023] En general, en otro aspecto, se provee un ácido nucleico que codifica cualquiera de la(s) fitasa(s) descrita(s) en la presente memoria. En otro aspecto, se provee un vector que comprende el ácido nucleico que codifica cualquiera de la(s) fitasa(s) descrita(s) en la presente memoria. En un aspecto adicional, se provee una célula huésped que comprende el ácido nucleico y/o los vectores descritos en la presente memoria.

[0024] En general, en otro aspecto, se provee un método de producción de una variante de fitasa de acuerdo con las variantes expuestas en la presente memoria, en una célula huésped, que comprende

a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN que comprende el ácido nucleico que codifica cualquiera de las variantes de fitasa expuestas en la presente memoria, y

b) cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo adecuado.

En un modo de realización, la célula huésped es una célula fúngica, una célula bacteriana o una célula vegetal.

[0025] En un aspecto, se provee una fitasa preparada por los métodos descritos en la presente memoria.

[0026] En general, en un aspecto, una composición de enzima que comprende por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria, que incluye además una o más de una glucoamilasa, una alfa-amilasa, una proteasa, una pululanasa, una isoamilasa, una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una ciclodextrina glicotransferasa, una lipasa, una lacasa, una oxidasa, una esterasa, una cutinasa, otra fitasa o cualquier combinación de las mismas. En un modo de realización, la composición además incluye una alfa-amilasa.

[0027] En general, en otro aspecto, se provee el uso de una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria, en licuefacción de almidón, sacarificación, fermentación o sacarificación-fermentación simultáneas. En un modo de realización, la licuefacción de almidón, sacarificación, fermentación o sacarificación-fermentación simultáneas es para la producción de alcohol de fermentación. En otro modo de realización, el alcohol es etanol o butanol. En otro modo de realización adicional, un sustrato es sometido a la licuefacción de almidón, sacarificación, fermentación o sacarificación-fermentación simultáneas. En un modo de realización, el sustrato comprende almidón. En otro modo de realización, el sustrato comprende un grano o cereal. En un modo de realización adicional, el grano o cereal es trigo, cebada, centeno, avena, maíz, sorgo, harina de gluten de maíz, solubles de grano seco de destilerías (DDGS, por sus siglas en inglés), salvado de trigo, harinillas de trigo, moyuelos de trigo, arroz, cáscaras de avena, almendra de palmiste, pulpa de cítricos o combinaciones de los mismos. En un modo de realización, el arroz comprende salvado de arroz o cáscaras de arroz.

[0028] En general, en otro aspecto, se provee el uso de por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria como aditivo para un alimento o pienso. En otro aspecto, el uso de por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria como aditivo para un alimento o pienso que contiene solubles de grano seco de destilerías (DDGS).

[0029] En general, en un aspecto adicional, se provee un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria con otro ingrediente de alimento o pienso para formar dicho alimento o pienso para animales.

[0030] En general, en otro aspecto, se provee un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de rociar por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria, en forma líquida sobre dicho alimento o pienso para animales. En un aspecto, un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria como producto seco con dicho alimento o pienso para animales.

[0031] En otro aspecto, se provee un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria con otro ingrediente de alimento o pienso para formar dicho pienso para animales. En un aspecto adicional, se provee un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de rociar por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria en forma líquida sobre dicho pienso para animales. En un aspecto más, se provee un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria como producto seco con dicho pienso para animales.

[0032] En general, en otro aspecto, se provee una composición de alimento o pienso para animales que comprende ya sea i) por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria y/o ii) un alimento o pienso para animales producido por el método como se describe en la presente memoria. En un aspecto adicional, se provee una composición de pienso para animales que comprende ya sea i) por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria y/o ii) un alimento o pienso para animales producido por el método como se describe en la presente memoria.

[0033] En un aspecto, se provee el uso de por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria en alimento o pienso para animales. En otro aspecto, se provee el uso de por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria en un pienso para animales.

[0034] En general, en otro aspecto, se provee un método de reducción de los niveles de fósforo en el estiércol animal, caracterizado por que un animal es alimentado con por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria o un pienso preparado por el método como se describe en la presente memoria o una composición como se describe en la presente memoria, y donde la fitasa está presente en una cantidad eficaz en la conversión de fitato contenido en dicho pienso para animales.

[0035] En general, en un aspecto, se provee el uso de por lo menos una fitasa como se describe en la presente memoria o una composición de enzima como se describe en la presente memoria o un pienso preparado por el método como se describe en la presente memoria o una composición como se describe en la presente memoria, en la fabricación de un pienso para animales para reducir los niveles de fósforo en el estiércol del animal alimentado con dicho polipéptido fitasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0036]

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una fitasa de Buttiauxella sp. P1-29 de tipo silvestre, ("BP-WT"), (SEQ ID NO: 1).

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una variante ventajosa de conformidad con la presente descripción (SEQ ID NO: 2).

La figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico de Buttiauxella sp. PI-29 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3).

La figura 4 muestra la secuencia de ácido nucleico de una variante ventajosa de conformidad con la presente descripción mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO: 4).

La figura 5 presenta las secuencias de aminoácidos para tres enzimas (BP 110, BP-111 y BP-112), así como las secuencias para BP-17 y la secuencia wt.

La figura 6 muestra la resistencia de las fitasas que se originan a partir de Buttiauxella, variantes BP-17, BP-110, BP-111 y BP-112, y de Phyzyme XP, Natuphos y Ronozyme P contra concentraciones cada vez mayores de pepsina. Los datos son relativos a la incubación a pH 2 sin pepsina. A: todos los datos indican, B: los mismos datos pero que muestran sólo más de un 70 % de recuperación.

La figura 7 muestra un diagrama esquemático del equipo de procesamiento de pienso (peletización de pienso) usado en el ejemplo 11.

La figura 8 muestra gráficas de datos.

La figura 9 muestra gráficas de datos.

La figura 10 muestra gráficas de datos.

La figura 11 muestra gráficas de datos.

La figura 12 muestra gráficas de datos.

La figura 13 muestra gráficas de datos.

La figura 14 muestra gráficas de datos.

La figura 15 muestra gráficas de datos de HPLC.

La figura 16 muestra gráficas de datos de HPLC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE EXPOSICIÓN

[0037] En la presente memoria, se proveen variantes de fitasas de Buttiauxella sp. que se pueden usar en aplicaciones industriales que incluyen métodos para licuefacción de almidón, fermentaciones de alcohol y para mejorar la digestión de fosfato en alimentos y piensos para animales. En particular, las variantes de fitasa de conformidad con la presente descripción son muy útiles para degradación de fitato en los pasos de licuefacción de almidón en procesos de producción de etanol combustible. Las variantes de esta descripción comprenden una o más variaciones (que incluyen sustituciones, inserciones y deleciones) de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1). En un modo de realización ventajoso, la secuencia de aminoácidos de la variante comprende por lo menos una variación en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 1, y la por lo menos una variación está en una, dos o tres posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 75, 76 y 374, donde cada posición corresponde a la posición de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0038] Por ejemplo, ventajosamente la variación en las variantes de fitasa de conformidad con modos de realización de la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en: S75, Q76 y A374 correspondiente a SEQ ID NO: 1.

[0039] En modos de realización ventajosos de la presente descripción, la variación en la variante de fitasa es una sustitución y la sustitución se puede seleccionar del grupo que consiste en: S75P, Q76R y A374P donde cada posición corresponde a la posición de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0040] En modos de realización ventajosos adicionales, las variantes de fitasa de conformidad con la presente descripción comprenden una variación adicional en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: N37, G77, h 160, F164, T171, S188, G192, K198, A235, Q256 y/o P367 donde cada posición corresponde a la posición de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0041] En otros modos de realización ventajosos, la variación en variantes de fitasa de conformidad con la presente descripción es una sustitución y la sustitución puede estar en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: N37Y, G77S, H160R, F164E, F164S, T171V, T171I, S188P, G192A, K198R, A235V, Q256P, Q256A, Q256E y/o P367L.

[0042] En otros modos de realización ventajosos, las variantes de fitasa de conformidad con la presente descripción comprenden además una variación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A26E y/o N270.

[0043] Además, en otros modos de realización ventajosos, las variantes de fitasa de conformidad con la presente descripción comprenden una variación adicional en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y/o N270K.

[0044] En todavía otros modos de realización ventajosos, las variantes de fitasa de conformidad con la presente descripción comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 2.

[0045] Las variantes de fitasa ventajosas de conformidad con la presente descripción comprenden una secuencia que contiene variaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, R160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

f) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T134I, HI60R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

g) N37Y, Q76R, A89T, D92A. T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

j) N37Y, A89T, D92A, T134I, P164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

m) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

p) A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P

t) N37Y, Q76R, A89T, D92A, T1341, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

[0046] Los modos de realización de la presente descripción también incluyen variantes de cualquiera de las fitasas expuestas en las secuencias a) a t), que tienen actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad de secuencia y/o un porcentaje de homología de por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 93 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 % y, por lo menos, 99 % en comparación con cada una de las variantes de fitasa expuestas en las secuencias a) a t).

[0047] Se hace referencia a los aminoácidos en la presente memoria mediante el uso del nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una sola letra. La siguiente tabla provee una lista de los aminoácidos estándares junto con sus abreviaturas.

[0048] Además de las variaciones de aminoácidos y ácidos nucleicos específicos que codifican las variaciones, en la presente memoria se proveen sustituciones de aminoácidos conservadoras de las variaciones. Dichas sustituciones son aquellas que son conservadoras, por ejemplo, donde la variante de aminoácido es reemplazada por otro aminoácido del mismo tipo general. Los aminoácidos se pueden clasificar como ácidos, básicos, neutros y polares, o neutros y no polares y/o aromáticos, según su cadena lateral. Las sustituciones preferidas de una posición de variante de aminoácido incluyen aquellas que tienen una o más clasificaciones que son las mismas que la variante de aminoácido en esa posición. Por lo tanto, en general, los aminoácidos Lys, Arg e His son básicos; los aminoácidos ácido aspártico y ácido glutámico son ácidos; los aminoácidos Ser, Thr, Cys, Gin y Asn son polares neutros; los aminoácidos Gly, Ala, Val, Ile y Leu son alifáticos no polares, y los aminoácidos Phe, Trp y Tyr son aromáticos. Gly y Ala son aminoácidos pequeños y Val, Ile y Leu son aminoácidos alifáticos.

[0049] A menos que se defina de otra manera en la presente memoria, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que es comúnmente bien entendido por un experto en la materia al cual está dirigida esta descripción. Singleton, el at., DICTIONARY OF MICROBIOLo Gy AND MOLECULAR BIOLOGY, 20a Ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1994) y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proveen a un experto en la materia un diccionario general de muchos de los términos usados en esta descripción.

[0050] Esta descripción no está limitada por los métodos y materiales ilustrativos descritos en la presente memoria, y cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o prueba de modos de realización de esta descripción. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. A menos que se indique otra cosa, las secuencias de ácido nucleico se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente.

[0051] Los encabezados provistos en la presente memoria no son limitaciones de los varios aspectos o modos de realización de esta descripción, que se pueden tener por referencia a la memoria en conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente se definen de forma más completa por referencia a la memoria en conjunto.

[0052] El ácido fítico (mioinositol hexakisfosfato) es un constituyente importante en cereales, leguminosas y cultivos de semilla oleaginosa. La forma de sal, fitato, es la forma de almacenamiento principal de fósforo en estas plantas.

[0053] Las fitasas catalizan la hidrólisis por monoéster de fosfato de ácido fítico que da por resultado la formación paso a paso de pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- y monofosfatos de mioinositol, así como la liberación de fosfato inorgánico.

[0054] Los términos "variante de fitasa" o "variante" o "forma modificada" se refiere a una enzima fitasa con una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de una fitasa original que tiene una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos, que juntas se refieren como "mutaciones".

[0055] Los términos "fitasa original" o "enzima original" se refieren a una enzima fitasa de la cual se deriva una variante de fitasa. Una fitasa original puede ser una fitasa de tipo silvestre u otra variante de fitasa. En particular, en la presente invención, una "fitasa original" se puede derivar de una Buttiauxella sp. De manera adecuada, la "fitasa original" se deriva de la cepa P1-29 de Buttiauxella como se describe en la presente memoria que, preferiblemente, tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la presente memoria.

[0056] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "fitasa" o "actividad de fitasa" se refiere a una proteína o polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de fitato a (1) mioinositol y/o (2) mono-, di-, tri-, tetray/o pentafosfatos de los mismos y (3) fosfato inorgánico. Por ejemplo, las enzimas que tienen actividad catalítica como se define en el número de Ec (Comisión de Enzimas) 3.1.3.8 o número de EC 3.1.3.26.

[0057] El término “fitasa de Buttiauxella sp.”, tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una proteína fitasa obtenida de una Buttiauxella sp. En un modo de realización, la fitasa de Buttiauxella sp. comprende la secuencia de aminoácidos derivada de una cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 41248 (National Collections of Industrial Marine and Food Bacteria, Escocia, Reino Unido). En un modo de realización ventajoso, una fitasa de Buttiauxella sp. comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[0058] El término "correspondiente a una fitasa de Buttiauxella sp.", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una enzima que tiene una o más de las mismas o similares características funcionales o secuencia de una fitasa de Buttiauxella sp., pero no necesariamente obtenida de una fuente de Buttiauxella sp.

[0059] El término "Buttiauxella" se refiere a un género de bacterias gram-negativas, facultativamente anaeróbicas de la familia Enterobacteriaceae y Buttiauxella spp incluyen B. agrestis, B. brennerasa, B.ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, y B. warmboldiae. Cepas de la especie Buttiauxella están disponibles, por ejemplo, del American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo o ATCC, por sus siglas en inglés) y DSMZ, el German National Resource Centre for Biological Material (Centro Alemán de Recursos Nacionales para Material Biológico).

[0060] El término "fitasa de tipo silvestre" o "tipo silvestre" se refiere a una enzima con una secuencia de aminoácidos encontrada en la naturaleza. En particular, la fitasa de tipo silvestre es aquella mostrada como SEQ ID. No. 1.

[0061] El término "variante" de fitasa de Buttiauxella sp." o "variante de fitasa", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa una enzima fitasa con una secuencia de aminoácidos que difiere por lo menos en una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la fitasa de SEQ. ID NO: 1. Los términos "variante" y "variación", como se usan en la presente memoria, simplemente significan que hay una diferencia entre secuencia de la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa y la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO: 1, y no significa que una secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de SEQ. ID NO: 1 o cualquier otra fitasa servida como material de partida en cualquier forma y/o fue físicamente variada, mutada, modificada o alterada de otra manera para producir la variante. Sencillamente, las variantes de fitasa de esta descripción (que incluyen sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos), se pueden preparar mediante cualquier método, y los expertos en la materia estarán fácilmente familiarizados con numerosos métodos, algunos de los cuales se describen en la presente memoria, para hacer las variantes de fitasa.

[0062] El término "proteína", tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.

[0063] Los términos “residuo de aminoácido equivalente a”, “aminoácido correspondiente a” y equivalentes gramaticales de los mismos se usan aquí para referirse a un residuo de aminoácido de una proteína que tiene una posición y efecto similares a los indicados en una secuencia de aminoácidos particular de una proteína particular. El experto en la materia reconocerá la equivalencia de residuos especificados en proteínas fitasa comparables.

[0064] “Porcentaje de identidad de secuencia”, con respecto a dos secuencias de aminoácidos o polinucleótidos, se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias son alineadas de manera óptima. Por lo tanto, 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos significa que el 80 % de los aminoácidos en dos secuencias de polipéptido alineadas en forma óptima son idénticos. El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante una comparación directa de la información de secuencias entre dos moléculas al alinear las secuencias, mediante el recuento del número exacto de emparejamientos entre las dos secuencias alineadas, mediante la división de la longitud de la secuencia más corta y mediante la multiplicación del resultado por 100. Se pueden utilizar programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tales como ALIGN, Dayhoff, M.O. en "Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489 para análisis de péptidos. Algunos programas para determinar identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) por ejemplo, los programas BESTFIT, PASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto 5 recomendados por el fabricante y descritos en el paquete Wisconsin Sequence Analysis Package, mencionado anteriormente. Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Asimismo, los programas informáticos para determinar el porcentaje de homología también están fácilmente disponibles.

[0065] El término "propiedad" o equivalentes gramaticales del mismo en el contexto de un polipéptido, como se utiliza en la presente memoria, se refieren a cualquier característica o atributo de un polipéptido que puede ser seleccionado o detectado. Esas propiedades incluyen, pero no se limitan a estabilidad oxidativa, especificidad de sustrato, actividad catalítica, estabilidad térmica, temperatura y/o perfil de actividad de pH, estabilidad de procesamiento de pienso y capacidad para ser secretado.

[0066] El término “estabilidad mejorada” en el contexto de una propiedad tal como estabilidad a temperaturas más altas, pH más bajo, etc. se refiere a una actividad de enzima retenida superior con el tiempo en comparación con otra fitasa identificada, tal como la de SEQ ID NO: 1. A menos que otra fitasa sea específicamente identificada, el término "estabilidad mejorada” cuando se usa en la presente memoria, se referirá a una actividad de enzima retenida superior con el tiempo en comparación con la fitasa de SEQ ID NO: 1.

[0067] Los términos "térmicamente estable” y “termoestable" se refieren a fitasas de la presente descripción que retienen una cantidad especificada de actividad enzimática después de una exposición a una temperatura elevada. Las variantes de fitasa de conformidad con esta descripción se consideran termoestables a una temperatura especificada si la enzima retiene más del 50 % de su actividad después de una exposición a la temperatura especificada durante 10 minutos a pH de 5,5 en tampón.

[0068] El término "actividad térmica mejorada”, en cuanto se refiere a variantes de fitasa de la presente descripción, significa que la variante de fitasa presenta la misma cantidad o una cantidad mayor de actividad de enzima fitasa a una temperatura elevada en comparación con la actividad de enzima fitasa de otra fitasa identificada tal como la de SEQ ID NO: 1. A menos que otra fitasa sea específicamente identificada, el término "actividad térmica mejorada”, cuando se usa en la presente memoria, se referirá a la actividad térmica de una variante de fitasa de esta descripción en comparación con la actividad térmica de la fitasa de SEQ ID NO: 1. Más adelante, en el ejemplo 6, se proporciona un análisis adicional acerca de la actividad térmica.

[0069] Los términos "polinucleótido" y “ácido nucleico”, usados de manera intercambiable en la presente memoria, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen, pero no se limitan a, un ADN de cadena sencilla, doble o triple, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido de ADN-ARN, o un polímero que comprende las bases purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, químicamente, bioquímicamente modificadas, no naturales o derivadas.

[0070] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "gen" se refiere a un polinucleótido (p. ej., un segmento de ADN) que codifica un polipéptido e incluye regiones precedentes y posteriores a las regiones codificantes, así como secuencias de intervención (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones).

[0071] Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos "constructo de ADN", “ADN transformante" y "vector de expresión” se usan de manera intercambiable para referirse a ADN utilizado para introducir secuencias en una célula u organismo huésped. El ADN puede ser generado in vitro por PCR o cualquier otra técnica adecuada conocida por los expertos en la materia. El constructo de ADN, a Dn transformante o casete de expresión recombinante pueden ser incorporados en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión, constructo de ADN o ADN transformante incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que ha de ser transcrita y un promotor. En modos de realización preferidos, los vectores de expresión tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula huésped.

[0072] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "vector" se refiere a un constructo de polinucleótido diseñado para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores transportadores, plásmidos, casetes y similares.

[0073] Tal y como se utiliza en la presente memoria, en el contexto de introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula, el término "introducido" se refiere a cualquier método adecuado para transferir la secuencia de ácido nucleico a la célula. Dichos métodos para la introducción incluyen, pero no se limitan a fusión de protoplastos, transfección, transformación, conjugación y transducción, e incluyen referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde la secuencia de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (p. ej., cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertido en un replicón autónomo, o transitoriamente expresado (p. ej., ARNm transfectado).

[0074] El término "alineación óptima” se refiere a la alineación que da la puntuación de porcentaje de identidad más alta.

[0075] Los términos "proteína" y “polipéptido” se usan intercambiablemente en la presente memoria. En la presente descripción y reivindicaciones, se utilizan los códigos de una letra y tres letras convencionales para residuos de aminoácido. El código de tres letras para aminoácidos es como se define de conformidad con IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). También se entiende que un polipéptido puede ser codificado por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

[0076] Variantes de esta descripción se describen por la siguiente nomenclatura: [residuos de aminoácido original de SEQ. 10 NO: 1/posición de residuo de aminoácido original en SEQ. ID NO: 1/residuo de aminoácido sustituido]. Por ejemplo, en s Eq ID NO: 2, la sustitución de treonina (T) para la alanina original (A) en la posición 89 de SEQ ID NO: 1 es representada como A89T. Cuando una posición adecuada para sustitución es identificada en la presente memoria sin un aminoácido específico sugerido, se debe entender que cualquier residuo de aminoácido puede sustituir al residuo de aminoácido presente en la posición. Cuando una variante de fitasa contiene una deleción en comparación con otras fitasas, la deleción se indica con "*". Por ejemplo, una deleción en la posición A89 de SEQ. ID NO: 1 es representada como A89*. Una deleción de dos o más aminoácidos consecutivos es indicada, por ejemplo, como (89-91)*.

[0077] El término "secuencia de señal” o “péptido de señal” se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que pueden participar en la secreción de las formas madura o precursora de la proteína. Esta definición de secuencia de señal es una funcional, que significa que incluye todas las secuencias de aminoácidos codificadas por la porción N-terminal del gen de proteína, que participan en la realización de la secreción de proteína. A menudo, pero no universalmente, se une a la porción N-terminal de una proteína o a la porción N-terminal de una proteína precursora.

[0078] “Cepa huésped” o “célula huésped” se refiere a un huésped adecuado para un vector de expresión que comprende ADN de conformidad con la presente descripción.

[0079] Los términos "derivado de” y “obtenido de” se refieren no sólo a una fitasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una fitasa codificada por una secuencia de ADN aislada de dicha cepa y producida en un organismo huésped que contiene dicha secuencia de ADN. Adicionalmente, los términos se refieren a una fitasa que es codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de origen de ADNc y que tiene las características de identificación de la fitasa en cuestión. Por lo tanto, una fitasa que es “derivada de” y “obtenida de” otra fitasa, no necesariamente significa que la fitasa ha sido físicamente derivada o físicamente obtenida de la segunda fitasa, sino más bien también significa que la fitasa en cuestión ha sido preparada mediante el uso de conocimiento o ideas derivadas de conocimiento de la segunda fitasa.

[0080] Por “fragmento funcional” se entiende un fragmento del polipéptido que retiene las propiedades características de ese polipéptido. En el contexto de la presente descripción, un fragmento funcional de una enzima fitasa es un fragmento que retiene la capacidad de escisión de fitasa de la proteína entera.

[0081] El término "aislado”, “recuperado” o “purificado” se refiere a un material que es eliminado de su entorno original. El término "sustancialmente purificado” significa que el material ha sido purificado por lo menos a un grado sustancial.

[0082] En un aspecto, preferiblemente la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se encuentra en una forma aislada. El término "aislado” significa que la secuencia es por lo menos sustancialmente libre de por lo menos otro componente con el cual la secuencia está naturalmente asociada en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza.

[0083] En un aspecto, preferiblemente la secuencia de nucleótidos o aminoácidos se encuentra en una forma purificada. El término "purificado" significa que la secuencia está en un estado relativamente puro por lo menos 1 %, 5 % puro o 10 % puro, más preferiblemente por lo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % puro. En un modo de realización preferido, cuando se hace referencia a un polipéptido, la pureza tal y como ha sido definida anteriormente se determina en términos de ser purificado de otros polipéptidos mediante electroforesis de SDS-PAGE. En un modo de realización preferido, cuando se hace referencia a un polinucleótido, la pureza tal y como ha sido definida anteriormente se determina en términos de ser purificado de otros polinucleótidos.

[0084] Tal y como se utilizan en la presente memoria, los términos "expresión", "expresa", "expresado" y "expresable" son sinónimos de los respectivos términos "transcripción", "transcribe", "transcrito" y "transcribible".

[0085] Tal y como se utilizan en la presente memoria, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a un método para introducir secuencias de ácido nucleico en huéspedes, células huésped, tejidos u órganos.

[0086] Tal y como se utilizan en la presente memoria, los términos "producir", "produciendo", "producido", "producible", "producción" son sinónimos de los términos respectivos "preparar", "preparando", "preparado", "preparación", "generado", "generación" y "preparable".

[0087] Un “pienso” y un “alimento”, respectivamente, significan cualquier dieta natural o artificial, comida o similar o componentes de dichas comidas destinadas o adecuadas para ser ingeridas, tomadas, digeridas por un animal (pienso) y un ser humano (alimento), respectivamente.

[0088] Un “aditivo de alimento o de pienso” es un compuesto o una composición de múltiples componentes destinada para o adecuada para ser añadida a alimento o a pienso. Puede, pero no es necesario, comprender uno o más compuestos tales como vitaminas, minerales o enzimas mejoradoras de pienso y vehículos y/o excipientes adecuados, y normalmente se provee en una forma que es adecuada para ser añadida a pienso para animales.

[0089] El término "licuefacción de almidón” se refiere a un proceso mediante el cual el almidón es convertido a dextrinas de cadena más corta y menos viscosas.

[0090] El término "sustrato" se refiere a una sustancia que es o comprende por lo menos una entidad sobre la cual puede(n) actuar la(s) enzima(s) de la presente invención. Ejemplos de dichas entidades incluyen: fitato y productos intermedios de degradación de fitato, tales como pentafosfatos de inositol, tetrafosfatos, trifosfatos difosfatos, y monofosfatos. Ejemplos de sustratos que comprenden dicha entidad incluyen granos, cereales y otros materiales vegetales o materiales a base de carbohidratos para usarse, por ejemplo, en ingredientes para piensos, licuefacción, sacarificación, fermentación, sacarificación/fermentación simultáneos y/o proceso de un solo paso para la producción de, por ejemplo, alcoholes de fermentación (p. ej., etanol o butanol) o azúcares para usarse en fermentaciones para la producción de alcoholes (p. ej., etanol o butanol) o azúcares para elaborar otros productos (p. ej., productos sin alcohol).

[0091] El término "fermentaciones de alcohol" se refiere a procesos de fermentación en los cuales un microorganismo (p. ej., una levadura) convierte un sustrato en un metabolito que es clasificado como un alcohol (p. ej., etanol o butanol).

[0092] Un “promotor” es una secuencia reguladora que está implicada en la unión de ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen.

[0093] “Bajo control transcripcional" es un término ampliamente entendido en la técnica para indicar que la transcripción de una secuencia de polinucleótido, normalmente una secuencia de ADN, depende de ser operablemente enlazada a un elemento que contribuye al inicio de, o promueve la transcripción.

[0094] “Bajo control traduccional” es un término ampliamente entendido en la técnica que indica un proceso regulador que ocurre después de que se haya formado el ARNm.

[0095] Tal y como se utiliza en la presente memoria, cuando se describen proteínas y genes que las codifican, el término para el gen está en cursiva (p. ej., el gen que codifica fitasa de Buttiauxella). El término para la proteína, en general, no está en cursiva y la primera letra está, en general, en mayúsculas.

[0096] El término "operablemente enlazado” se refiere a yuxtaposición donde los elementos están en una disposición que les permite estar funcionalmente relacionados. Por ejemplo, un promotor está operablemente enlazado a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia.

[0097] El término "marcador selectivo” se refiere a un gen capaz de expresarse en un huésped que permite la fácil selección de los huéspedes que contienen un ácido nucleico o vector introducidos. Algunos ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a antimicrobianos (p. ej., higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica, tal como la ventaja nutricional en la célula huésped.

[0098] El término "heterólogo” con referencia a un polinucleótido o una proteína se refiere a un polinucleótido o una proteína que no está presente de forma natural en una célula huésped.

[0099] El término "endógeno" con referencia a un polinucleótido o proteína se refiere a un polinucleótido o proteína que está presente de forma natural en la célula huésped.

[0100] Los términos "recuperado”, “aislado” y “separado”, tal y como se utilizan en la presente memoria, se refieren a un compuesto, proteína, célula, ácido nucleico o aminoácido que es eliminado de por lo menos un componente con el cual está asociado de forma natural.

[0101] Tal y como se utiliza en la presente memoria, los términos "transformado", "establemente transformado” y "transgénico”, usados en referencia a una célula significan que la célula tiene una secuencia no nativa (p. ej., heteróloga) de ácido nucleico integrada en su genoma o como un plásmido episomal que es mantenido a través de múltiples generaciones.

[0102] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término “expresión” se refiere al proceso por el cual un polipéptido es producido a partir de la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.

[0103] Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o prueba de la presente descripción, métodos y materiales ilustrativos y ventajosos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria son incorporadas aquí por referencia al grado necesario para dar a conocer y describir los métodos y/o materiales conectados con la descripción para los cuales se citan las publicaciones.

[0104] Otras definiciones de términos pueden aparecer a lo largo de la memoria. Antes de que se describan los modos de realización ilustrativos en más detalle, se entiende que esta descripción no está limitada a modos de realización particulares descritos, ya que estos pueden, obviamente, variar. También cabe entender que la terminología usada en la presente memoria tiene como objeto describir modos de realización particulares únicamente y no se pretende que sean limitantes, ya que el alcance de la presente descripción será limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas.

[0105] En los casos en que se provee un intervalo de valores, se entiende que cada valor de intervención, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor o valor de intervención establecido en un intervalo establecido y cualquier otro valor o valor de intervención establecido en dicho intervalo establecido es abarcado en la presente descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden ser independientemente incluidos o excluidos en el intervalo, y cada intervalo en donde cualquiera, ninguno o ambos límites son incluidos en los intervalos más pequeños también son abarcados en esta descripción, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. En los casos en los que el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de dichos límites incluidos también se incluyen en esta descripción.

[0106] Cabe observar que, tal y como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un gen” incluye una pluralidad de los agentes candidatos y la referencia a “ la célula” incluye referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, etc.

[0107] Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proveen únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente memoria debe considerarse como un reconocimiento de que esas publicaciones constituyen técnica anterior a las reivindicaciones anexas a la presente memoria.

[0108] Las enzimas fitasa usadas como enzimas originales o precursoras incluyen fitasa de Buttiauxella sp. y las enzimas correspondientes a una fitasa de Buttiauxella sp. En algunos modos de realización, la fitasa original de Buttiauxella sp. comprende la secuencia de aminoácidos derivada de una cepa de Buttiauxella sp. depositada bajo el número de acceso NCIMB 41248. En algunos modos de realización, la fitasa de Buttiauxella sp. original comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunos modos de realización, la fitasa de Buttiauxella sp. original es derivada de B. agrestis, B. brennerase, B. ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae. Se hace referencia a WO 2006/043178, que es específicamente incorporada aquí por referencia y que describe fitasas obtenibles de o derivadas de una Buttiauxella sp. original y fitasas correspondientes a una enzima fitasa de Buttiauxella sp. En algunos modos de realización, una variante de fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre tiene por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 93 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, y por lo menos 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al polipéptido de SEQ ID NO: 1.

[0109] Los modos de realización de la presente descripción están relacionados con variantes de fitasas (p. ej., variantes de fitasas de Buttiauxella sp.). De manera específica, WO 2006/043178 describe la mutagénesis de una enzima fitasa de tipo silvestre que tiene la secuencia descrita en dicha memoria como SEQ ID NO: 3. Un número de mutaciones preferidas se dan a conocer en WO 2006/043178. Una variante de fitasa contendrá por lo menos una sustitución, deleción o inserción de aminoácidos, donde las sustituciones de aminoácidos a menudo son ventajosas. La sustitución, inserción o deleción de aminoácidos puede producirse en cualquier residuo dentro del péptido de fitasa. Una variante de fitasa de la presente descripción es una variante que no tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de la presente memoria.

[0110] En modos de realización ventajosos de la presente descripción, la variante comprenderá una sustitución en una fitasa de Buttiauxella sp. y, de manera más específica, correspondiente a dichas posiciones equivalentes de SEQ ID NO: 1. En algunos modos de realización, la sustitución comprende cualquiera de los 19 aminoácidos restantes correspondientes a, C, D, E, F, 0, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y. Sin embargo, también podrían utilizarse aminoácidos sintéticos y otros aminoácidos.

[0111] Las variantes se pueden preparar por mutagénesis aleatoria, mutagénesis de saturación de sitio y mutagénesis específicas del sitio de nucleótidos en el ADN que codifica la proteína fitasa, mediante el uso de mutagénesis de casete o de PCR u otras técnicas ampliamente conocidas en la técnica, para producir variantes, que posteriormente se pueden producir en cultivo de células. Se hace referencia a Morinaga et al., (1984) Biotechnology 2: 646 -649; Nelson y Long, (1989) Analytical Biochem., 180: 147 - 151 y Sarkar y Sommer (1999) Biotechniques 8: 404-407. Los fragmentos de proteína de variante de fitasa también se pueden preparar por síntesis in vitro mediante el uso de técnicas establecidas.

[0112] Los polinucleótidos se pueden obtener mediante procedimientos estándares conocidos en la técnica a partir de, por ejemplo, ADN clonado (p. ej., una “biblioteca” de ADN), mediante síntesis química, mediante clonación de A d Nc, mediante PCR (USP 4,683,202 o Saiki et al., Science 239:487 - 491(1988)), mediante métodos sintéticamente establecidos (Beucage et al., (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859 -1869 y Matthes et al, EMBO J.

3:801 - 895(1984)) o mediante la clonación de ADN genómico, o fragmentos del mismo, sustancialmente purificados a partir de una célula deseada, tal como Buttiauxella sp. (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, DM and Harnes, BD (Eds.), 1995, DNA Cloning 1: A Practical Approach and DNA Cloning 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford). Las secuencias de ácido nucleico derivadas de ADN genómico y derivados de las mismas pueden contener regiones reguladoras, además de regiones codificantes.

[0113] Para expresar los polipéptidos, se pueden usar métodos de expresión de ADN recombinante estándares (véase, por ejemplo, Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Por ejemplo, ADN que codifica el polipéptido deseado puede ser insertado en un vector de expresión que después es transfectado en una célula huésped adecuada. Cabe entender que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras se ve afectado por factores tales como la elección de la célula huésped, el nivel de expresión de proteína deseada y ya sea que la expresión sea constitutiva o inducible.

[0114] La transfección del vector de expresión en una célula huésped se puede llevar a cabo mediante el uso de técnicas estándares tales como electroporación, precipitación de fosfato de calcio y transfección de DEAE-dextrano.

[0115] Las células huésped adecuadas para clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente memoria son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores tales como células vegetales, como se ha descrito anteriormente. Además de las células procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para las variantes de fitasa de conformidad con esta descripción.

[0116] Las células huésped pueden transformarse con los vectores de expresión o clonación antes descritos para la producción de proteína y cultivados en medios de nutriente convencionales según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán evidentes para el experto en la técnica.

[0117] El polipéptido preparado a partir de las células puede ser purificado mediante el uso de, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad.

[0118] En algunos modos de realización, una variante de fitasa de conformidad con esta descripción tendrá propiedades alteradas. Ventajosamente, una variante de conformidad con los modos de realización de esta descripción tendrá propiedades mejoradas en comparación con la fitasa de tipo silvestre SEQ. ID NO: 1. En algunos modos de realización, las propiedades alteradas, por ejemplo, mejoradas, serán estabilidad térmica, actividad térmica, estabilidad de procesamiento de pienso y/o actividad específica (véase la figura 2).

[0119] En algunos modos de realización, las variantes abarcadas por esta descripción tendrán una estabilidad térmica incrementada en comparación con fitasas de Buttiauxella sp. conocidas en la técnica (p. ej., fitasas de Buttiauxella sp. de conformidad con SEQ ID NO: 1). En algunos modos de realización, la variante tendrá una diferencia de estabilidad térmica (TD, por sus siglas en inglés) de por lo menos 21,9 °C, por lo menos 22,4 °C, por lo menos 22,6 °C, por lo menos 22,9°C, por lo menos 23,2 °C, por lo menos 23,4 °C, por lo menos 23,5 °C, por lo menos 23,5 °C, por lo menos 23,7 °C, por lo menos 24,1 °C, por lo menos 24,2 °C, por lo menos 24,4 °C, por lo menos 24,9 °C, por lo menos 25,0 °C, por lo menos 25,9 °C, por lo menos 26,5 °C y por lo menos 26,8 °C en comparación con BP-WT.

[0120] En algunos modos de realización, las variantes abarcadas por esta descripción presentarán estabilidad incrementada a temperaturas elevadas en comparación con la fitasa de tipo silvestre de s Eq ID NO: ID NO: 1. En algunos modos de realización, la variante de fitasa será termoestable a aproximadamente 65 °C, a aproximadamente 70 °C, a aproximadamente 75 °C, a aproximadamente 80 °C o superior. Como se ha analizado anteriormente, las fitasas de conformidad con esta descripción se consideran termoestables si la enzima retiene más del 50 % de su actividad después de la exposición a la temperatura especificada durante 10 minutos a pH 5,5.

[0121] En algunos modos de realización, las variantes tendrán una actividad térmica más alta. En algunos modos de realización, las variantes abarcada por esta descripción tendrán una diferencia de actividad térmica (DAT, por sus siglas en inglés) de por lo menos 17,4 °C, por lo menos 17,5 °C, por lo menos 17,6 °C, por lo menos 17,8 °C, por lo menos 17,9 °C, por lo menos 18,4 °C, por lo menos 18,7 °C, por lo menos 18,8 °C, por lo menos 18,9 °C, por lo menos 19,0 °C, por lo menos 19,3 °C, por lo menos 19,5 °C, por lo menos 20,0 °C, por lo menos 20,1 °C y por lo menos 20,2 °C en comparación con BP-WT.

[0122] En algunos modos de realización, las variantes de fitasas de conformidad con esta descripción tendrán actividad específica de por lo menos 1000 U/mg, por lo menos 1200 U/mg, por lo menos 1400 U/mg, por lo menos 1600 U/mg, por lo menos 1800 U/mg, por lo menos 2000 U/mg, por lo menos 2200 U/mg, por lo menos 2300 U/mg, por lo menos 2400U/mg y por lo menos 2500 U/mg, donde la actividad específica es determinada al incubar la fitasa a 67 °C en una solución que contiene 10 mM de fitasa, 1 mM de CaCh en 200 mM de tampón de acetato de sodio a pH 5,5 como se detalla en el ejemplo 3 de la presente descripción.

[0123] En algunos modos de realización, las variantes de fitasas de conformidad con la presente descripción tendrán actividad específica de por lo menos 800 U/mg, por lo menos 1000 U/mg, por lo menos 1200 U/mg, por lo menos 1400 U/mg, por lo menos 1600 U/mg, por lo menos 1800 U/mg, por lo menos 2000 U/mg, por lo menos 2200 U/mg, por lo menos 2300U/mg, por lo menos 2400 U/mg y por lo menos 2600 U/mg, donde la actividad específica es determinada al incubar la fitasa a 80 °C en una solución que contiene 10 mM de fitato, 1 mM de CaCl2 en 200 mM de tampón de acetato de sodio a pH 5,5 como se detalla en el ejemplo 3 de la presente descripción.

[0124] En algunos modos de realización, las variantes de fitasas de conformidad con esta descripción serán termoestables a 80° C, es decir, retendrán el 50 % de actividad después de la exposición a 80 °C durante 10 minutos a un pH de 5,5 y al mismo tiempo tendrán una actividad específica de por lo menos 2500 U/mg a 80 °C y por lo menos 2300 U/mg a 67 °C, donde la actividad específica es determinada al incubar la fitasa a la temperatura especificada en una solución que contiene 10 mM de fitato, 1 mM de CaCh en 200 mM de tampón de acetato de sodio a un pH de 5,5 como se detalla en el ejemplo 3 de la presente descripción.

[0125] En algunos modos de realización, las variantes abarcadas por esta descripción se pueden usar en un método para producir un compuesto de fosfato que comprende tratar un fitato con una variante de fitasa abarcada por esta descripción (p. ej., variante de SEQ ID NO: 2). El fitato puede ser mioinositol di-, tri-, tetra-, y/o pentafosfatos. Otros fosfatos orgánicos adecuados incluyen tetrafosfatos de inositol y oligofosfatos de inositol.

[0126] En algunos modos de realización, las variantes abarcadas por esta descripción conservarán esencialmente el mismo nivel de actividad específica que BP-WT, pero tendrán un incremento de estabilidad a temperaturas más altas, un pH más alto y/o un pH más bajo en comparación con BP-WT.

[0127] En algunos modos de realización, las variantes abarcadas por esta descripción conservarán esencialmente el mismo nivel de actividad específica que BP-WT, pero tendrán una actividad térmica mejorada.

[0128] En algunos modos de realización, esta descripción provee un método para producir una enzima que tiene actividad de fitasa como se describe en la presente memoria, que comprende: (a) proveer una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica una variante de fitasa como se describe en la presente memoria, (b) cultivar la célula huésped transformada en condiciones adecuadas para que la célula huésped produzca la variante de fitasa; y (c) recuperar la variante de fitasa.

[0129] En algunos modos de realización, el vector de expresión comprenderá un polinucleótido que codifica una fitasa que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una sustitución en residuos de aminoácidos correspondiente a las posiciones mostradas en la figura 2.

[0130] En algunos modos de realización de esta descripción, la cepa huésped es genéticamente manipulada para expresar fitasas heterólogas o variantes que tienen actividad de fitasa de conformidad con esta descripción.

[0131] Las células huésped útiles para la producción de una fitasa abarcada por esta descripción incluyen células bacterianas, células fúngicas y células vegetales. Las células huésped incluyen tanto las células como progenie de las células y protoplastos creados a partir de las células, que se pueden usar para producir una variante de fitasa de conformidad con esta descripción.

[0132] Vectores útiles que incluyen constructos de ADN que comprenden un polinucleótido que codifica una fitasa de esta descripción y métodos de transformación de células huésped son ampliamente conocidos en la técnica y se pueden usar técnicas y metodologías estándares.

[0133] De conformidad con esta descripción, un constructo de ADN que comprende ácido nucleico que codifica una variante de fitasa abarcada por esta descripción es construido para transferir y/o expresar la variante en una célula huésped. En un modo de realización, el constructo de ADN es transferido a una célula huésped por un vector de expresión que comprende secuencias reguladoras (p. ej., promotores, sitios de unión ribosomal, secuencias de inicio y detención de transcripción, secuencias de inicio y detención de traducción, mejoradores, secuencias activadoras de IS, secuencias de expresión específicas de célula, secuencias de señal y/o terminadores) operablemente enlazadas a la secuencia que codifica variante de fitasa.

[0134] Un vector de expresión que comprende un constructo de ADN con un polinucleótido que codifica variante de fitasa puede ser cualquier vector que es capaz de replicarse autónomamente en un organismo huésped fúngico dado o de integrarse en el ADN del huésped. En algunos modos de realización, el vector de expresión es un plásmido o un bacteriófago. En algunos modos de realización, el vector de expresión es preensamblado y contiene secuencias requeridas para transcripción de alto nivel y un marcador seleccionable. En algunos modos de realización, la región codificante para gen de variante de fitasa o parte del mismo es insertado en este vector de expresión de propósito general, de tal manera que esté bajo el control transcripcional de las secuencias del promotor y terminador de constructo de expresión. En algunos modos de realización, genes o partes de los mismos son insertados en dirección 3' del promotor de cbhl fuerte.

[0135] En resumen, con respecto a la producción de una fitasa en células huésped fúngicas se hace referencia a Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) en Bennett y Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) pp. 70-76 y 396-428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4:2306-2315; Boel et al., (1984) 30 EMBO J. 3:1581-1585; Finkelstein en BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), cap. 6; Kinghorn et al.

(1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475 - 479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155-164; y patente estadounidense n.° 5,874,276. Una lista de vectores adecuados se puede encontrar en Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, www en fgsc.net). Vectores adecuados incluyen los obtenidos, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies and Promega. Vectores específicos adecuados para su uso en células huésped fúngicas incluyen vectores tales como pFB6, pBR322, pUC 18, pUC100, pDON™201, pDONR™221, pENTR™, pGEM®3Z y pGEM®4Z.

[0136] En algunos modos de realización, el vector pude ser cualquier vector que, cuando sea introducido en una célula huésped fúngica, es integrado en el genoma de la célula huésped y es replicado. Algunos ejemplos no limitativos de dichos vectores se proveen en Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains (FGSC, < www.fgsc.net»). Ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o integración adecuados se proveen en Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) en Bennett y Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press. 396-428 y patente estadounidense n.° 5,874,276. Vectores particularmente útiles incluyen pTREX, pFB6, pBR322, Pu C i8, pUCI00 y pENTR/D. Plásmidos adecuados para usarse en células bacterianas incluyen pBR322 y pUC19, que permiten la replicación de E. coli y pE194, por ejemplo, que permite la replicación en Bacillus.

[0137] En algunos modos de realización, ácidos nucleicos que codifican variante de fitasa abarcados por esta descripción son operablemente enlazados a un promotor adecuado, que muestra actividad transcripcional en la célula huésped. En general, la expresión de la variante de fitasa se logra bajo cualquier promotor adecuado conocido o posteriormente descubierto en la técnica. En algunos modos de realización, la variante de fitasa es expresada bajo un promotor nativo al huésped. En algunos modos de realización, la variante de fitasa es expresada bajo un promotor heterólogo que es activo en la célula huésped. Por ejemplo, si se usa una célula de Trichoderma como célula huésped, entonces ventajosamente el promotor es activo en una célula huésped de Trichoderma.

[0138] En algunos modos de realización, el promotor es un promotor constitutivo o inducible. Un “promotor constitutivo” es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor “ inducible” o “reprimible” es un promotor que es activo en regulación ambiental o de desarrollo. En algunos modos de realización, los promotores son inducibles o reprimibles debido a cambios en factores ambientales que incluyen, pero no se limitan a disponibilidad de carbono, nitrógeno u otro nutriente, temperatura, pH, osmolaridad, la presencia de metal o de metales pesados, la concentración de inhibidor o de inhibidores, estrés o una combinación de los anteriores, como se conoce en la técnica. En algunos modos de realización, los promotores inducibles o reprimibles son inducibles o reprimibles por factores metabólicos, tales como el nivel de ciertas fuentes de carbono, el nivel de ciertas fuentes de energía, el nivel de ciertos catabolitos o una combinación de los anteriores, como se conoce en la técnica. En un modo de realización, el promotor es uno que es nativo a la célula huésped. Por ejemplo, cuando T. reesei es el huésped, el promotor es un promotor de T. reesei nativo tal como el promotor de cbhl, que es depositado en GenBank con el número de acceso D86235.

[0139] Ejemplos no limitativos adecuados de promotores incluyen cbhl, cbh2, egll, egl2, egl3, egl4, egl5, xyn l y xyn2, promotor de gen de fosfatasa ácida reprimible (phoA) de P. chrysogenus (véase p. ej., Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63 :753-756), promotor PCK1 reprimible de glucosa (véase p. ej., Leuker et al., (1997), Gene, 192:235-240), promotor de MET3 reprimible de glucosa maltosainducible (véase Liu et al., (2006), Eukary. Cell, 5:638-649), promotor de pKi y promotor de cpc1. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de genes de glucoamilasa de A. awamori y A. niger (véase p. ej., Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 154:2306-2315 y Boel et al., (1984) BMBO J. 3:1581-1585). También, los promotores del gen xln1 de T. reesei pueden ser útiles (véase, p. ej., EPA 137280A1).

[0140] En algunos modos de realización, el vector de expresión también incluye una secuencia de terminación de transcripción en dirección 3' del gen estructural para proveer terminación eficiente. En algunos modos de realización, la secuencia de terminación y la secuencia de promotor se derivan de la misma fuente. En otros modos de realización, la secuencia de terminación es homóloga a la célula huésped. Una secuencia de terminador particularmente adecuada es cbh1 derivada de la cepa de Trichoderma y particularmente de T. reesei. Otros terminadores fúngicos útiles incluyen el terminador de gen de glucoamilasa de A. niger o A. awamori (véase p. ej., Nunberg et al. (1984) supra, y Boel et al., (1984) supra).

[0141] Los métodos usados para ligar el constructo de ADN que comprende un polinucleótido que codifica la variante de fitasa, un promotor, un terminador y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado son ampliamente conocidos en la técnica. El enlace se logra generalmente mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si esos sitios no existen, se usan los enlaces de oligonucleótidos sintéticos de conformidad con la práctica convencional (véase, p. ej., Sambrook (1989) supra, y Bennett y Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press, San Diego (1991) pp. 70-76,). Además, los vectores se pueden construir mediante el uso de técnicas de recombinación conocidas (p. ej., Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology). Transformación, expresión y cultivo de células huésped.

[0142] La introducción de un constructo o vector de ADN en una célula huésped incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; traducción; transfección, (p. ej., transfección mediada por lipofección y mediada por DEAE-dextrano); incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio; bombardeo a alta velocidad con microproyectiles revestidos con ADN; y fusión de protoplastos.

[0143] Los métodos de transformación para Aspergillus y Trichoderma se describen, por ejemplo, en Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470 - 1474; Berka et al., (1991) en Applications of Enzyme Biotechnology, Eds. Kelly and Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sci. 9:991 - 1001; Campbell et al., (1989) Curro Genet. 16:53-56; Pentilla et al., (1987) Gene 61:155 - 164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:839 - 842; USP 6,022,725; USP 6,268,328 y EP 238 023. La expresión de proteína heteróloga en Trichoderma se describe en USP 6,022,725; USP 6,268,328; Harkki et al (1991); Enzyme Microb. Technol. 13:227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244,234; EP 215,594; y Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", en MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129 - 148). También se hace referencia a WO96100787 y Bajar et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 88:8202 - 28212 para transformación de cepas de Fusarium.

[0144] Los métodos para hacer constructos de ADN útiles en la transformación de plantas y métodos para transformación de plantas son también conocidos. Algunos de estos métodos incluyen transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens, bombardeo de microproyectiles, trasformación mediada por PEG de protoplastos, electroporación y similares. También se hace referencia, por ejemplo, a USP 5,780,708; USP 6,803,499; USP 6,777,589; Fromm et al. (1990) Biotechnol. 8:833-839; Potrykus et al. (1985) Mol.Gen. Genet.

199:169 - 177; Brisson et al., (1984) Nature 310:511514; Takamatsu et al., (1987) EMBO J 6:307-311; Coruzzi et al., (1984) EMBO J 3:1671-1680; Broglie et al. (1984) Science 224:838-843; Winter J y Sinibaldi RM (1991) Results Probl Cell Differ 17:85-105; Hobbs S o Murry LE (1992) en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, Nueva York, N.Y., pp. 191-196; yWeissbach y Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Nueva York, N.Y., pp. 421-463. Las células transformadas pueden ser cultivadas mediante el uso de técnicas estándares en condiciones adecuadas en cultivo en matraz de agitación, fermentaciones a pequeña escala o gran escala (que incluyen fermentaciones continuas, por lotes y por lotes alimentadas) en fermentadores de laboratorio o industriales, con medio adecuado que contiene sales fisiológicas y nutrientes (véase, p. ej., Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86,1988 y Ilmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Medios comunes comercialmente preparados (p. ej., caldo de extracto de malta de levadura (YM, por sus siglas en inglés), caldo de Luria Bertani (LB) y caldo de dextrosa de Sabouraud (SD) pueden utilizarse en la presente descripción. En la técnica, se conocen condiciones de cultivo preferidas para células fúngicas filamentosas y se pueden encontrar en la literatura científica y/o de la fuente de los hongos, tales como American Type Culture Collection and Fungal Genetics Stock Center.

[0145] En algunos modos de realización, transformantes genéticamente estables son construidos con sistemas de vectores, por lo que el ácido nucleico que codifica una variante de fitasa es integrado establemente en un cromosoma de cepa de huésped. Los transformantes son después purificados mediante técnicas conocidas.

[0146] A fin de evaluar la expresión de variantes de fitasa que tienen actividad de fitasa mediante una línea de células que ha sido transformada con un polinucleótido heterólogo que codifica una variante de fitasa que tiene una actividad de fitasa abarcada por esta descripción, se pueden llevar a cabo ensayos en nivel de proteína, en nivel de ARN o mediante el uso de bioensayos funcionales particulares a actividad y/o producción de fitasa. En general, las pruebas utilizadas incluyen transferencia de Northern, transferencia puntual (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa), o hibridación in situ, mediante el uso de una sonda adecuadamente marcada (a partir de la secuencia codificante de ácido nucleico) y una transferencia de Southern convencional y autorradiografía.

[0147] Además, la producción y/o expresión de una variante de fitasa que presenta actividad de fitasa se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos que miden directamente la actividad de fitasa (FTU) mediante la liberación de fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico forma un complejo amarillo con reactivo de vanadato-molibdato ácido y el complejo amarillo se midió a una longitud de onda de 415 nm en un espectrofotómetro y el fosfato inorgánico liberado se cuantificó con una curva estándar de fosfato. Una unidad de fitasa (FTU) es la cantidad de enzima que libera un micromol de fosfato inorgánico (Pi) a partir de fitato por minuto.

[0148] Además, la expresión de gen se puede analizar mediante métodos inmunológicos tales como tinción inmunohistoquímica de células, secciones de tejido o inmunoensayo de medio de cultivo de tejido, p. ej., mediante técnica de Western Blot o ELISA. Esos inmunoensayos se pueden usar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la expresión de una fitasa. Los detalles de dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica y muchos reactivos para poner en práctica dichos métodos están comercialmente disponibles.

[0149] En la técnica, se conocen ampliamente pruebas para observar la actividad de fitasa y un ejemplo es el ensayo clásico para liberación de fosfato inorgánico desarrollado por Fiske y SubbaRow, Journal of Biological Chemistry 66:375-392 (1925). Una variación de este método se encuentra en Mitchell et al., Microbiol. 143:245-252 (1997). Un método alternativo se describe en FOOD CHEMICALS CODEX, 4a edición, Committee on Food Chemicals Codex, Institute of Medicine, National Academy Press, Washington, DC, 1996 en las páginas 809-810. Cada una de estas referencias se incorpora aquí. En un número de estos ensayos, la colorimetría se realiza, a continuación, mediante el uso de un espectrofotómetro y comparada con controles de concentración conocida de fosfato inorgánico (Pi) y/o controles producidos mediante reacciones con enzimas que tienen actividad de fitasa conocida. Una unidad de actividad es determinada como la cantidad de muestra de enzima requerida para liberar un micromol de Pi por minuto a partir de fitato en condiciones de reacción definidas. También se hace referencia a USP 6,221,644 y USP 6,139,902.

[0150] En algunos modos de realización de esta descripción, las variantes de fitasa que tienen actividad de fitasa expresada por un huésped de Trichoderma o Aspergillus será mayor que un gramo de proteína por litro (g/l), mayor que 2 g/l, mayor que 5 g/l, mayor que 10 g/l, mayor que 20 g/l, mayor que 25 g/l, mayor que 30 g/l, mayor que 50 g/l y también mayor que 100 g/l de medio de cultivo.

[0151] Los polipéptidos producidos bajo la expresión de las secuencias de ácido nucleico de esta descripción pueden ser recuperados o aislados de la fermentación de cultivos de células y sustancialmente purificados en una variedad de formas de conformidad con técnicas bien establecidas en la técnica. Un experto en la técnica es capaz de seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas. La fitasa de esta descripción puede ser recuperada del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si está ligada a la membrana, puede ser liberada de la membrana mediante el uso de una solución de detergente adecuada (p. ej., Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión de fitasa pueden ser alteradas por varios medios físicos o químicos, tales como ciclado de congelación/descongelación, sonicación, perturbación mecánica, o agentes de lisado de células. Puede desearse purificar la fitasa a partir de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ilustrativos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio de iones; precipitación de etanol; HPLc de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de cationes, tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel con el uso de, por ejemplo, columnas de Sephadex G-75; proteína A Sepharose para eliminar contaminantes; y columnas de quelantes metálicos para unir formas etiquetadas con epítopo de la fitasa. Varios métodos de purificación de proteína se pueden utilizar y esos métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY, 182 (1990); Scopes, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag, Nueva York (1982). El paso o los pasos de purificación seleccionados dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y la forma particular de fitasa producida.

[0152] En general, una fitasa o variante de fitasa (que incluye la fitasa de conformidad con SEQ ID NO: 1) producida en un cultivo de células es secretada en el medio y puede ser purificada o aislada, p. ej., al eliminar componentes no deseados del medio de cultivo de células. En algunos casos, la variante de fitasa puede ser producida en una forma celular que necesita recuperarse de un lisado de células. En dichos casos, la enzima es purificada a partir de las células en las que fue producida mediante el uso de técnicas rutinariamente empleadas por los expertos en la materia. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a cromatografía de afinidad (véase, p. ej., Tilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16:215); métodos cromatográficos de intercambio de iones (véase, p. ej., Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36:37; Fliess et al., (1983) Eur. J Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:314; Bhikhabhai et al. (1984) J Appl. Biochem. 6:336; y Ellouz et al., (1987) Chromatography 396:307), que incluye intercambio de iones mediante el uso de materiales con alto poder de resolución (véase, p. ej., Medve et al., (1998) J Chromatography A 808: 153); cromatografía de interacción hidrofóbica (véase, p. ej., Tomaz y Queiroz, (1999) J Chromatography A 865: 123); división de dos fases (véase, p. ej., Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7:287); precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio de cationes tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; y/o filtración en gel con el uso de, p. ej., Sephadex G-75.

[0153] En algunos modos de realización de la presente descripción, células fúngicas que expresan una variante de fitasa heteróloga son cultivadas en condiciones de fermentación por lotes o continuas. Una fermentación por lotes clásica es un sistema cerrado, donde la composición del medio se establece al principio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al principio de la fermentación el medio es inoculado con el o los organismos deseados. En este método, se deja que la fermentación se produzca sin la adición de cualesquiera componentes al sistema. Normalmente, una fermentación por lotes se califica como un "lote" con respecto a la adición de la fuente de carbono y a menudo se intentan controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. El metabolito y las composiciones de biomasa del sistema por lotes cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. En los cultivos por lotes, las células avanzan a través de una fase de latencia estática a una fase logarítmica de crecimiento elevado y, finalmente, a una fase estacionaria donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente mueren. En general, las células en la fase logarítmica son responsables del volumen de producción del producto final.

[0154] Una variación en el sistema por lotes estándar es el sistema de "fermentación por lotes alimentado", que también se puede utilizar con la presente descripción. En esta variación de un sistema por lotes típico, el sustrato se añade en incrementos a medida que la fermentación avanza. Los sistemas por lotes alimentados son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración de sustrato real en sistemas por lotes alimentados es difícil y, por lo tanto, se calcula a partir de los cambios de factores medibles tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de gases de desecho, tales como CO2. Las fermentaciones por lotes y por lotes alimentados son comunes y bien conocidas en la técnica.

[0155] La fermentación continua es un sistema abierto en el que un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio condicionado es eliminada simultáneamente para su procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad alta constante en la que las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica.

[0156] La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular y/o la concentración de producto final. Por ejemplo, en un modo de realización, un nutriente limitativo tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno es mantenido a una tasa fija y se deja que todos los demás parámetros se moderen. En otros sistemas, un número de factores que afectan el crecimiento puede ser alterado continuamente mientras la concentración de células, medida por turbidez de los medios, se mantiene constante. Los sistemas continuos tratan de mantener condiciones de crecimiento de estado constante. Por lo tanto, la pérdida de células debido a la extracción de medio se debe equilibrar contra la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como las técnicas para aumentar al máximo la tasa de formación de producto son ampliamente conocidos en la técnica de microbiología industrial.

[0157] En un modo de realización de esta descripción, se provee una composición de enzima que comprende por lo menos una fitasa de conformidad con esta descripción. Las composiciones de conformidad con esta descripción se pueden preparar de conformidad con métodos conocidos en la técnica y pueden encontrarse en forma de composición líquida o seca.

[0158] Las composiciones líquidas no necesitan contener nada más que la enzima fitasa, que típicamente puede encontrarse ya sea en forma sustancialmente purificada o por lo menos parcialmente purificada, aunque una forma sustancialmente purificada a menudo será ventajosa. A menudo, puede añadirse un estabilizador tal como glicerol, sorbitol o monopropilenglicol. La composición líquida también puede comprender uno o más de otros aditivos, tales como sales, azúcares, conservantes, agentes ajustadores de pH (es decir, agentes amortiguadores), proteínas o fitato (un sustrato de fitasa). Las composiciones líquidas típicas son suspensiones acuosas o a base de aceite.

[0159] Las composiciones secas pueden ser composiciones secadas por pulverización, en cuyo caso la composición no necesita contener nada más que la enzima en forma seca. Normalmente, sin embargo, las composiciones secas son los denominados granulados, que se pueden mezclar fácilmente, por ejemplo, con componentes de alimento o pienso o, muy preferiblemente, forman un componente de una premezcla. El tamaño de partícula de los granulados de enzima es preferiblemente compatible con el de los otros componentes de la mezcla.

[0160] En algunos modos de realización, una composición de enzima que incluye una variante de fitasa abarcada por esta descripción se usará opcionalmente en combinación con cualquiera o una combinación de las siguientes enzimas - glucoamilasas, alfa-amilasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, ciclodextrina glicotransferasas, lipasas, fitasas, lacasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, glucosa oxidasas, beta glucosidasas, fosfatasas, beta-amilasa, hidrolasas, transferasas, otras fitasas y combinaciones de las mismas.

[0161] En algunos modos de realización, la composición de fitasa es una composición de alimento o de pienso para animales. Una composición de alimento o de pienso para animales puede comprender una fitasa a una concentración de 10 a 15000 U/kg de alimento o pienso para animales (p. ej., 100 a 5000 U/kg, 200-2000 U/kg y también 500-1000 U/kg). La composición de fitasa se puede usar como aditivo que es activo en el tracto digestivo, de ganado y animales domésticos tales como aves de corral, cerdos, alpacas, bisontes, camellos, ganado vacuno, chinchillas, venados, asnos, patos, peces, ranas, cabras, gansos, aves domésticas, caballos, llamas, visones, mulas, avestruces, palomas, renos, ovejas, pavos, yaks, búfalos de agua, gatos, chimpancés, perros, hurones, gerbos, peces dorados, conejillos de indias, hámsteres, monos, periquitos australianos, reptiles y roedores, y animales de granja acuáticos, que incluyen peces y moluscos tales como las gambas. En comparación con la fitasa de tipo silvestre de SEQ. ID NO: 1, las variantes de fitasa de esta descripción pueden proveer resistencia mejorada a las proteasas encontradas en esos animales o pueden proveer, de otra manera, actividad prolongada en los tractos digestivos de esos animales. La presente descripción contempla un método para la producción de un alimento o pienso para animales, caracterizado por que la fitasa de conformidad con esta descripción se mezcla con dicho alimento o pienso para animales para cualquiera de dichos animales. Las composiciones líquidas se pueden añadir a un alimento o pienso después de una peletización opcional de los mismos. En algunos modos de realización, el pienso para animales comprenderá uno o más de los siguientes componentes: a) cereales, tales como granos pequeños (p. ej., trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes tales como maíz o sorgo; b) por productos de cereales, tales como harina de gluten de maíz, solubles de grano seco de destilerías (DDGS), salvado de trigo, harinillas de trigo, moyuelos de trigo, salvado de arroz, cáscaras de arroz, cáscaras de avena, semilla de palmera y pulpa de cítricos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuate, lupino, guisantes, habas, algodón, canola, harina de pescado, proteína de plasma seco, carne y harina de huesos, proteína de patata, suero de leche, copra, ajonjolí; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas; f) complementos, tales como enzimas, betaína, sabores, aceites esenciales, antibióticos promotores del crecimiento, coccidiostáticos, probióticos y prebióticos.

[0162] También se provee un método para la reducción de niveles de fósforo en estiércol animal, caracterizado por que un animal es alimentado con un pienso para animales que comprende una variante de fitasa de conformidad con esta descripción en una cantidad eficaz en la conversión de fitato contenido en dicho pienso para animales.

[0163] Además, las composiciones de fitasa abarcadas por esta descripción se pueden usar en métodos de hidrólisis de almidón. La composición de fitasa se puede añadir durante un paso de licuefacción de almidón, un paso de sacarificación y/o durante un paso de fermentación. Las alfa-amilasas se usan para romper los enlaces 1 4 de almidón durante los procesos de hidrólisis industrial de almidón mediante el uso de material vegetal reducido, tales como granos molidos como materia prima de alimentación (p. ej., en procesos de fermentación, destilación y horneado). Se necesitan amilasas para romper el almidón y la obtención de la actividad adecuada de estas enzimas es algunas veces problemática. Durante un tiempo, se ha sabido que el fitato tiene un efecto inhibidor en las amilasas. Por lo tanto, las composiciones de enzima que comprenden una fitasa de conformidad con esta descripción se pueden usar en procesos de hidrólisis de almidón para reducir el efecto inhibidor de fitato en alfa amilasa (EP 0813607B1).

[0164] Las fitasas, el fitato y derivados de fosfato-fitato inferiores también tienen muchos otros usos en productos de cuidado personal, productos médicos y productos alimenticios y nutricionales, así como varias aplicaciones industriales, particularmente en las técnicas de limpieza, textil, litográfica y química. Ventajosamente, por ejemplo, se pueden utilizar variantes de fitasa de conformidad con modos de realización de la presente descripción en la fermentación de alcohol, por ejemplo, para la producción de biocombustible.

USO DE FITASAS

[0165] Como se indicó antes, la presente descripción también se refiere a la producción de fitasas como se describe en la presente memoria.

[0166] En particular, la presente descripción también se refiere al uso de las secuencias de aminoácidos expuestas en la presente memoria en la producción de compuestos de fosfato orgánicos e inorgánicos.

[0167] Por lo tanto, la presente descripción, además, se refiere al uso de las secuencias de nucleótidos que codifican fitasas en la generación de vectores o sistemas de expresión para la expresión de las fitasas.

[0168] Además, la presente descripción se refiere al uso de dichos vectores o sistemas de expresión en la generación de células huésped que expresan fitasas.

[0169] La invención además se refiere al uso de células huésped modificadas en la generación de precursores de compuestos de fosfato orgánicos e inorgánicos o en la generación de compuestos de fosfato orgánicos específicos.

[0170] Los compuestos de fosfato orgánicos e inorgánicos adecuados incluyen pentakis-, tetrakis-, tris-, bis- y monofosfatos de mioinositol.

[0171] De manera adecuada, en la presente memoria se describe un método de producción de un compuesto de fosfato orgánico que comprende el tratamiento de un fitato con una fitasa.

[0172] De manera adecuada, el fosfato orgánico es fitato o todos los posibles estereoisómeros de di-, tri-, tetra y pentafosfatos de mioinositol. Otros fosfatos orgánicos adecuados incluyen tetrafosfatos de inositol y oligofosfatos de inositol. En un modo de realización preferido, el método es un proceso biotecnológico in vivo.

[0173] Dichos métodos para producir un compuesto de fosfato orgánico pueden comprender adecuadamente los pasos de:

a) proveer una célula huésped que comprende transgenes expresables que comprenden la fitasa descrita en la presente memoria;

b) cultivar el organismo transgénico en condiciones adecuadas para la expresión del transgén; y c) recuperar el compuesto de fosfato orgánico del cultivo.

[0174] Los compuestos se pueden usar para un número de aplicaciones que incluyen ensayos para la caracterización de fitasas. Algunos fosfatos de inositol están implicados como moléculas de señal en regulación intracelular y pueden utilizarse sustancias químicas para la investigación.

[0175] En otro aspecto, se provee un método para la producción de alimento o pienso para animales. El pienso para animales es típicamente producido en molinos de piensos en los que, en primer lugar, se muele la materia prima hasta alcanzar un tamaño de partícula adecuado y, a continuación, se mezcla con aditivos apropiados. A continuación, el alimento puede ser producido a modo de masa o pellets; estos últimos típicamente implican un método por el cual la temperatura es elevada a un nivel objetivo y después se hace pasar el pienso para animales a través de un troquel para producir pellets de un tamaño concreto. Posteriormente, se pueden añadir aditivos líquidos tales como grasa y enzima. Los pellets se dejan enfriar antes de ser transportados. La producción de pienso para animales también puede implicar un paso adicional que incluye la extrusión o expansión antes de la peletización; en particular, mediante técnicas adecuadas, que pueden incluir por lo menos el uso de vapor.

[0176] Por consiguiente, en la presente memoria también se describe el uso de una secuencia de aminoácidos que codifica una fitasa o una célula huésped que expresa una fitasa para producir una fitasa que se utilizará en la fabricación de un producto de alimento o pienso. En un aspecto, se provee el uso de una secuencia de aminoácidos como se describe en la presente memoria en la fabricación de un producto de alimento o pienso. En otro aspecto, se provee el uso de una célula huésped en la fabricación de un producto de alimento o pienso. En otro aspecto, se provee el uso de un vector o sistema de expresión en la fabricación de un producto de alimento o pienso.

[0177] En la presente memoria, también se describe el uso de enzimas como componente de combinaciones de pienso con otros componentes para su suministro a los animales.

COMBINACIÓN CON OTROS COMPONENTES

[0178] Las enzimas descritas en la presente invención se pueden usar en combinación con otros componentes o portadores. En la presente memoria, ya se han proporcionado ejemplos de otros componentes. Estos y otros componentes adicionales se describen ahora.

[0179] Algunos vehículos adecuados para enzimas de alimentos incluyen trigo (molido de manera gruesa). Además, hay un número de técnicas de encapsulación que incluyen las que se basan en cobertura de grasa/cera, la adición de gomas vegetales, etc.

[0180] Ejemplos de otros componentes incluyen uno o más de: espesantes, agentes gelificantes, emulsionantes, aglutinantes, modificadores de cristal, edulcorantes (que incluyen edulcorantes artificiales), modificadores de reología, estabilizadores, antioxidantes, colorantes, enzimas, portadores, vehículos, excipientes, diluyentes, agentes lubricantes, agentes saborizantes, material colorante, agentes de suspensión, desintegrantes, aglutinantes de granulación, etc. Estos otros componentes pueden ser naturales. Estos otros componentes se pueden preparar mediante el uso de técnicas químicas y/o enzimáticas.

[0181] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "agente espesante o gelificante" se refiere a un producto que impide la separación al desacelerar o impedir el movimiento de partículas, ya sea gotas de líquidos inmiscibles, aire o sólidos insolubles.

[0182] El término "estabilizador", tal y como se utiliza en la presente memoria, se define como un ingrediente o combinación de ingredientes que evitan que un producto (p. ej., un producto alimenticio) cambie con el tiempo.

[0183] El término "emulsionante", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (p. ej., un ingrediente de producto alimenticio) que impide la separación de emulsiones.

[0184] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "aglutinante" se refiere a un ingrediente (p. ej., un ingrediente alimenticio) que se une al producto y lo mantiene unido a través de una reacción física o química.

[0185] El término "modificador de cristal", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (p. ej., un ingrediente alimenticio) que afecta la cristalización, ya sea de grasa o agua.

[0186] "Portadores" o "vehículos" significan materiales adecuados para la administración de compuesto e incluyen cualquier material conocido en la técnica tal como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, solvente, diluyente líquido, solubilizante, o similar, que es no tóxico y que no interactúa con ningún componente de la composición de manera dañina.

[0187] Algunos ejemplos de portadores nutricionalmente aceptables incluyen, por ejemplo, grano, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales y similares.

[0188] Algunos ejemplos de excipientes incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dibásico de calcio, glicina, almidón, azúcar de leche y polietilenglicoles de peso molecular alto.

[0189] Algunos ejemplos de desintegrantes incluyen uno o más de: almidón (preferiblemente, almidón de maíz, patata o tapioca), almidón glicolato de sodio, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos.

[0190] Algunos ejemplos de aglutinantes de granulación incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y acacia.

[0191] Ejemplos de agentes lubricantes incluyen uno o más de: estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.

[0192] Ejemplos de diluyentes incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

[0193] Los otros componentes se pueden usar simultáneamente (p. ej., cuando se mezclan juntos o incluso cuando son suministrados por diferentes vías) o secuencialmente (p. ej., pueden ser suministrados por diferentes vías).

[0194] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "componente adecuado para consumo animal o humano" significa un compuesto que es o puede ser añadido a la composición descrita en la presente invención como complemento que puede ser de beneficio nutricional, un sustituto de fibra o tener un efecto generalmente ventajoso para el consumidor.

[0195] A modo de ejemplo, los componentes pueden ser prebióticos, tales como alginato, xantano, pectina, goma garrofín (LBG), inulina, goma guar, galactooligosacárido (GOS), fructooligosacárido (FOS), lactosacarosa, oligosacáridos de soja, palatinosa, isomaltooligosacáridos, glucooligosacáridos y xilooligosacáridos.

SUSTANCIA DE ALIMENTO O PIENSO

[0196] Los compuestos se pueden usar como - o en la preparación de - una sustancia de alimento o pienso. En la presente memoria, el término "alimento" se usa en un sentido amplio - y cubre alimentos o productos alimenticios para humanos, así como pienso para animales (es decir, un pienso). El término "pienso" se usa con referencia a productos que son proporcionados a animales para su alimentación en la cría de ganado. En un aspecto preferido, el alimento o pienso es para consumo por animales monogástricos tales como cerdos, aves de corral y peces.

[0197] El alimento o pienso puede encontrarse en forma de solución o como sólido, según el uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.

INGREDIENTES Y SUPLEMENTOS DE ALIMENTO Y PIENSO

[0198] Los compuestos se pueden usar como un ingrediente de alimento o pienso.

[0199] Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "ingrediente de alimento o pienso" incluye una formulación, que es o puede ser añadida a alimentos o productos alimenticios e incluye formulaciones que se pueden usar a niveles bajos en una amplia variedad de productos.

[0200] El ingrediente de alimento puede encontrarse en forma de solución o como sólido - según el uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.

[0201] Los compuestos pueden ser - o se pueden añadir a - complementos alimenticios.

COMPOSICIONES DE ALIMENTO Y PIENSO

[0202] Las composiciones de pienso para animales monogástricos típicamente incluyen composiciones que comprenden productos vegetales que contienen fitato. Dichas composiciones incluyen piensos a base de harina de maíz, harina de soja, harina de colza, harina de semillas de algodón, maíz, trigo, cebada y sorgo.

[0203] Las fitasas descritas en el presente documento pueden ser o se pueden añadir a sustancias y composiciones de alimentos o pienso.

[0204] En la presente memoria, también se describe un método para preparar un ingrediente o suplemento de alimento o pienso, comprendiendo el método mezclar fitasas producidas por el proceso descrito en la presente memoria o las composiciones descritas en la presente memoria con otro ingrediente de alimento. El método para preparar o un ingrediente de alimento es también otro aspecto descrito en la presente memoria. Anteriormente, se han establecido métodos para preparar pienso para animales. La enzima también se puede añadir en forma de formulación sólida, o como aditivo de pienso, tal como una premezcla. Una forma sólida se añade típicamente antes o durante el paso de mezclado; y una forma líquida se añade típicamente después del paso de peletización.

FORMAS

[0205] El producto y/o los compuestos descritos en la presente memoria se pueden usar en cualquier forma adecuada, ya sea por separado o cuando están presentes en una composición. Asimismo, las fitasas producidas de conformidad con la presente descripción (es decir, ingredientes, tales como ingredientes de alimentos, ingredientes de alimentos funcionales o ingredientes farmacéuticos) se pueden usar en cualquier forma adecuada.

[0206] Algunos ejemplos adecuados de formas incluyen uno o más de: pastillas, píldoras, cápsulas, óvulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.

[0207] A modo de ejemplo, si el producto y/o la composición se usan en forma de pastilla, como para usarse como ingrediente funcional, las pastillas también pueden contener uno o más de: excipientes, desintegrantes, aglutinantes de granulación o agentes lubricantes.

[0208] Algunos ejemplos de portadores nutricionalmente aceptables para usarse en la preparación de las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina y similares.

[0209] Excipientes preferidos para las formas incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de peso molecular alto.

[0210] Para suspensiones acuosas y/o elíxires, los compuestos de escisión de fitasa pueden combinarse con varios agentes edulcorantes o aromatizantes, materia colorante o tintes, con agentes emulsionantes y/o de suspensión y con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

[0211] Las formas también pueden incluir cápsulas de gelatina; cápsulas de fibra, pastillas de fibra, etc.

[0212] Los siguientes ejemplos se ofrecen con fines ilustrativos únicamente, y no se pretende que limiten el alcance de la presente descripción de ninguna manera.

Métodos y Ejemplos

Nomenclatura para enzimas usadas en los ejemplos

[0213] Fitasa BP-17 (algunas veces denominada BP 17), que es la fitasa descrita en por lo menos la solicitud PCT WO 2008/097619 y que se puede obtener de Danisco A/S. La secuencia de aminoácidos se describe en la presente memoria como SEQ ID NO:5.

BP-110 (algunas veces denominada BP 17 var. 110 o algunas veces denominada BP17-110 o BP17110), que es la fitasa en la presente memoria y que se puede obtener de Danisco A/S. La secuencia de aminoácidos se describe en la presente memoria como SEQ ID NO:6.

BP-111 (algunas veces denominada BP 17 var. 111 o algunas veces denominada BP17-111 o BP17111), que es la fitasa descrita en la presente memoria y que se puede obtener de Danisco A/S. La secuencia de aminoácidos se describe en la presente memoria como SEQ ID NO:7.

BP-112 (algunas veces denominada BP 17 var. 112 o algunas veces denominada BP17-112 o BP17112), que es la fitasa en la presente memoria y que se puede obtener de Danisco A/S. La secuencia de aminoácidos se describe en la presente memoria como SEQ ID NO:2.

[0214] Las secuencias de aminoácidos para BP-17 (SEQ ID NO: 5), BP-110 (SEQ ID NO: 6), BP-111 (SEQ ID NO:7) y BP-112 (SEQ ID NO:2) se presentan en la figura 5. La secuencia de aminoácidos de BP-112 también se muestra en la figura 2. La secuencia de ácido nucleico de BP-112 se muestra en la figura 4 como SEQ ID NO:4. Phyzyme XP, que es una fitasa de Danisco A/S

Natuphos, que es una fitasa de BASF.

Ronozyme P, que es una fitasa de Novozymes.

PARTE A

Ejemplo 1. Purificación de enzimas fitasa

[0215] La purificación de enzimas fitasa se realizó mediante el uso de una etiqueta 6His N-terminalmente fusionada con las enzimas fitasa B. subtilis, transformada con un plásmido que codifica la enzima fitasa etiquetada con 6His, fue cultivada en matraces de agitación a 37 °C y 160 rpm mediante el uso de medio LB estándar con adición de 20 mg/l de neomicina. En esta etapa, el medio de cultivo acumuló una cantidad significativa de actividad de fitasa. Aproximadamente 2 litros del caldo de cultivo se ajustaron a pH 8,0, se filtraron y se aplicaron a una columna empaquetada con 10 ml de resina de sefarosa Ni-NTA (Qiagen). La columna se lavó con 50 mM de tampón Tris-HCl, 300 mM de NaCl, pH 8,0 hasta que DO280 cayó por debajo de 0,05. Posteriormente, la fitasa unida fue eluida con el mismo tampón que contiene 250 mM de clorhidrato de imidazol. El material eluido fue dializado contra 50 mM de tampón de acetato de sodio a pH 5,0 y se almacenó a 4 °C. La solución de enzima se aplicó después a una columna Resource S equilibrada con 20 mM de tampón de acetato de sodio a pH 5,0 y la elución se realizó mediante el uso de un gradiente de sal de 0-1 M de NaCl sobre 10 volúmenes de columna. Opcionalmente, el eluato fue dializado contra 20 mM de tampón de acetato de sodio a pH 5,0 antes de almacenarse a 4 °C.

Ejemplo 2. Prueba de actividad de fitasa

[0216] Las pruebas de fitasa se llevaron a cabo en placas de microtitulación. La reacción tuvo un volumen total de 100 microlitros con tampón, como se describe más adelante, 10 mM de fitato, 1 mM de cloruro de calcio y 0,05 % (p/v) de Pluronic F68. Se dejó que la reacción procediera durante 30 minutos a una temperatura determinada, por ejemplo, entre 37 °C y 90 °C.

[0217] La liberación de fosfato a partir de fitato como medida de la actividad de fitasa se probó al incubar alícuotas de las muestras (típicamente 5 j l ) en un volumen total de 50 j l de prueba de detección de fosfato durante 1 h a 37 °C. La prueba contenía los siguientes compuestos a las concentraciones finales proporcionadas: 1 M de Tris/HCl, pH 7,0, 0,01 % de (v/v) Triton X-100, 0,025 mM de ADHP (MoBiTec, Gottingen, Alemania), 0,2 U/ml de maltosa-fosforilasa, 0,25 mM de maltosa, 1,25 U/ml de glucosa oxidasa, 0,25 U/ml de peroxidasa de rábano picante, 1 mM de EDTA, 0,35 mg/ml de BSA. La reacción se detuvo mediante la adición de 30 j l de catalasa 2700 U/ml en H2O. Posteriormente, se midió la fluorescencia a 595 nm con el uso de 535 nm como longitud de onda de excitación. La cantidad de fosfato se determinó mediante el uso de una curva de calibración con soluciones de fosfato de concentraciones conocidas. Una unidad enzimática se define como la liberación de un micromol de fosfato por minuto.

[0218] Para analizar la actividad de fitasa a diferentes valores de pH, se usaron los siguientes tampones: 200 mM de glicina/HCl de pH 2,0 a pH 3,5 y 100 mM de acetato de sodio/ácido acético entre pH 4,0 y pH 5,5.

Ejemplo 3. Actividad específica

[0219] La actividad específica de BP-WT y variantes de enzimas fitasas se calculó mediante el uso de las enzimas purificadas de conformidad con el ejemplo 1.

[0220] La actividad de la fitasa se determinó en placas de microtitulación mediante el uso de una prueba enzimática acoplada: las preparaciones de enzima se diluyeron en tampón de dilución (50 mM de acetato de sodio, 0,05 % de Pluronic F-68, 1 mg/ml de BSA). Una alícuota de la solución de enzima, típicamente 5 j l a 10 j l se incubó en la prueba de fitato con un volumen total de 80 jl. La prueba contiene los siguientes tampones, sustratos y sales a las concentraciones finales proporcionadas: 200 mM de acetato de sodio, pH 5,5, 10 mM de fitato, 1 mM de CaCl2, 0,05 % (p/v) de Pluronic F-68). Las pruebas se incubaron durante 30 min a 37 °C en el caso de la fitasa BP-WT y durante 30 min a 67 °C u 80 °C en el caso de las variantes de enzimas fitasa.

[0221] La liberación de fosfato a partir de fitato como medida de la actividad de fitasa fue analizada mediante la incubación de alícuotas de las muestras respectivas (típicamente, 5 j l ) en un volumen total de 50 j l de prueba de detección de fosfato durante 1 h a 37 °C. La prueba contenía los siguientes compuestos a las concentraciones finales proporcionadas: 1 M de Tris/HCl, pH 7,0, 0,01 % de (v/v) Triton X-100, 0,025 mM de ADHP (MoBiTec, Gottingen, Alemania), 0,2 U/ml de maltosa-fosforilasa, 0,25 mM de maltosa, 1,25 U/ml de glucosa oxidasa, 0,25 U/ml de peroxidasa de rábano picante, 1 mM de EDTA, 0,35 mg/ml de BSA. La reacción se detuvo mediante la adición de 30 j l de catalasa 2700 U/ml en H2O. Posteriormente, se midió la fluorescencia a 595 nm con el uso de 535 nm como longitud de onda de excitación. La cantidad de fosfato se determinó mediante el uso de una curva de calibración con soluciones de fosfato de concentraciones conocidas. Una unidad enzimática se define como la liberación de un micromol de fosfato por minuto.

[0222] La concentración de fitasa se calculó a partir de la absorbancia de las preparaciones a 280 nm y los coeficientes de extinción respectivos para cada variante de fitasa. Los coeficientes de extinción se calcularon a partir de la composición de aminoácidos de las proteínas de conformidad con un método provisto porGill y von Hippel, Analytical Biochemistry 182:319-326 (1989).

Tab la 1 : Activ idad específica de variantes de fitasa de conform idad con BP-WT,

Seq ID No. 1. La activ idad específica de las varian tes de enzim as fitasa se

determ inó a 67 °C y 80 °C como se describ ió anteriorm ente. La enzima BP-WT

tiene una actividad específica de 1021 U/mg a 37 °C en las condiciones descritas

anteriormente.

Ejemplo 4. Generación y caracterización de variantes de fitasa

[0223] Las variantes de fitasa se generaron mediante el uso de diferentes métodos para la mutagénesis del ADN que codifica las proteínas fitasa como mutagénesis de casete o de PCR u otros métodos de mutagénesis ampliamente conocidos en la técnica. Dichos métodos comprenden los que se han indicado anteriormente, tales como los métodos descritos en Morinaga et al., Biotechnology 2:646-649 (1984); en Nelson y Long, Analytical Biochemistry 180:147-151(1989); o el protocolo de mutagénesis de umbral de error descrito enWO 92/18645. Para PCR mutagénica, otro método adecuado es descrito porCadwell y Joyce, PCR Methods Appl. 3:136-140(1994).

[0224] Las variantes de fitasa se expresaron heterólogamente en uno o más de los siguientes huéspedes de expresión: Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Escherichia coli.

Ejemplo 5. Estabilidad térmica

[0225] La estabilidad térmica de variantes de fitasa fue caracterizada por su temperatura de inactivación. La temperatura de inactivación fue determinada por la actividad residual de las enzimas fitasa después de la incubación durante 10 min a diferentes temperaturas, pH 5,5 e incubación posterior a 37 °C durante 60 min. Las actividades residuales se determinaron mediante la medición de las actividades de fitasa durante 60 min a pH 3,5 y 37 °C. La temperatura de inactivación se define como la temperatura a la cual la actividad residual es del 50 % en comparación con la actividad residual después de la incubación para la misma duración en las mismas condiciones a temperatura ambiente.

[0226] En los casos en los que se hicieron las extrapolaciones e interpolaciones apropiadas de los datos de actividad para determinar la temperatura correspondiente al 50 % de actividad residual. Las diferencias de estabilidad térmica (TD, por sus siglas en inglés) en [°C] se calcularon al sustraer las temperaturas de inactivación de dos enzimas una con respecto a la otra.

T ab la 2: E s tab ilid ad té rm ica de v a ria n te s de fita s a de co n fo rm ida d con BT-WT, Seq ID No. 1. Las m e jo ras en e s ta b ilid a d té rm ica se p resen tan como d ife re n c ia s de e s ta b ilid a d té rm ica TD entre v a ria n te s de enz im a fita sa y de tipo s ilv e s tre (B P -W T), es d e c ir TD = (te m p e ra tu ra de in a c tiv a c ió n de la v a ria n te de fita s a ) - ( te m p e ra tu ra de in a c tiv a c ió n de BP-W T).

Ejemplo 6. Actividad térmica

[0227] La actividad térmica de variantes de fitasa fue caracterizada por su perfil de temperatura-actividad. Como medida del perfil de temperatura-actividad, se definió el valor T50, a la cual la renovación enzimática total del sustrato es del 50 % en comparación con la renovación enzimática total del sustrato en una reacción que se produce esencialmente en las mismas condiciones, pero a la temperatura óptima de la variante de fitasa. Los perfiles de temperatura-actividad fueron determinados por incubación de las enzimas fitasa a pH 5,5 y varias temperaturas en condiciones descritas adicionalmente en el ejemplo 2. Los valores T50 fueron determinados mediante interpolaciones y extrapolaciones apropiadas a partir de los datos experimentales. Las diferencias de actividad térmica (TAD, por sus siglas en inglés) en [°C] se calcularon mediante la sustracción de los valores T50 de dos enzimas una con respecto a la otra.

Tab la 3: D iferencias de activ idad térm ica (TAD) de va rian tes de fitasa de conform idad con BT-WT, Seq ID No: 1. Las mejoras en la actividad térm ica se dan como d ife renc ias de T50 entre va rian te de enzima fitasa y de tipo s ilvestre (BP-W T), es dec ir TAD = T50 (variante de fitasa) - T50 (BP-w T).

Ejemplo 7 - Resumen de propiedades de variantes de fitasa

[0228]

i) La tabla 4 resume las propiedades actividad específica, estabilidad térmica y actividad térmica de variantes de fitasa que se presentaron antes en los ejemplos 3, 5 y 6.

Tab la 4: A ctiv idad específica, estab ilidad térm ica y activ idad térm ica de

d iferentes varian tes de fitasa de conform idad con BT-WT, Seq ID No: 1. Los

va lores para activ idades específicas, estab ilidad térm ica (TD), y activ idad

térm ica (TAD) se derivaron como se describe en el e jem plo 3, e jem plo 5 y

ejem plo 6, respectivam ente.

PARTE B

Ejemplo 8 - Introducción

[0229] La presente exposición es ventajosa, ya que provee fitasas novedosas que tienen propiedades que las hacen particularmente útiles y eficientes como enzimas de pienso. En particular, en la presente memoria se describen polipéptidos de fitasa aislados y/o purificados novedosos, o un fragmento funcional, o variantes o formas modificadas de los mismos, o una forma modificada de los mismos. En la presente memoria, también se describe la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha fitasa.

[0230] Para ser eficiente como aditivo de enzima para alimento o pienso para animales, la fitasa tiene que combinar un número de diferentes propiedades. Para poder degradar ácido fítico en el entorno ácido del estómago de un animal tiene que ser activo a pH bajo, preferiblemente, en un intervalo amplio de valores de pH. Además, tiene que tener actividad específica alta y preferiblemente termoestabilidad alta para permitir que la proteína resista altas temperaturas comúnmente usadas en la preparación de productos alimenticios, tales como pellets de pienso.

[0231] También es importante que la enzima tenga amplia especificidad de sustrato, que le permite hidrolizar no sólo fitato, sino también productos intermedios de degradación de fitato tales como pentafosfatos, tetrafosfatos y trifosfatos de inositol. Estudios sobre la degradación de fitato en cerdos muestran que estos oligofosfatos de inositol de otra manera permanecen en gran medida insolubles en el intestino delgado y el intestino grueso y, por lo tanto, son inaccesibles a fosfatasas alcalinas producidas por el animal y la microflora intestinal. Se han identificado variaciones en perfiles de especificidad de sustrato de diferentes enzimas. Por ejemplo, trifosfatos de inositol generados por la fitasa de B. subtilis son esencialmente resistentes a hidrólisis adicional por esta enzima.

[0232] De manera adecuada, estas variantes muestran características mejoradas con respecto a cualquiera de las siguientes: estabilidad de temperatura, intervalo de pH, estabilidad de pepsina, actividad específica, especificidad de sustrato y especificidad de sustrato más amplia. En la presente memoria, se exponen métodos adecuados para determinar estas características.

[0233] En particular, las mejoras en las características de la fitasa son dirigidas a la estabilidad de enzima en condiciones de procesamiento de alimento y pienso, a la estabilidad de la enzima durante el tránsito en el estómago, y a la actividad y estabilidad de la enzima en el estómago y/o tracto intestinal humano o de animal que hacen que las variantes mejoradas sean particularmente adecuadas para usarse como complementos de pienso. Por lo tanto, dichas mejoras comprenden, entre otros parámetros, el incremento en estabilidad a temperaturas elevadas, preferiblemente, a temperaturas por encima de 65 °C, el incremento en estabilidad contra digestión proteolítica, preferiblemente, proteasa del tracto digestivo tal como pepsina, el incremento en actividad catalítica a pH bajo, preferiblemente, actividad catalítica por debajo de pH 5,5, y la eficiencia general de liberar grupos fosfato a partir de fitato y, preferiblemente, además, fosfatos de inositol.

[0234] Las mejoras en características de fitasa descritas en la presente memoria están orientadas al uso en procesamiento de alimento y pienso, así como para el uso como aditivo para productos de alimento y pienso. En particular, las mejoras están orientadas a la estabilidad en condiciones de procesamiento de alimento y pienso, a la estabilidad durante el tránsito en el estómago, y a la actividad y estabilidad en el estómago y/o tracto intestinal humano o de animal. Dichas mejoras comprenden, entre otros parámetros, el incremento en estabilidad a temperaturas elevadas, preferiblemente, a temperaturas por encima de 65 °C, el incremento en estabilidad contra digestión proteolítica, preferiblemente, proteasa del tracto digestivo, el incremento en actividad catalítica a pH bajo, preferiblemente, actividad catalítica por debajo de pH 5,5, y la eficiencia general de liberar grupos fosfato a partir de fitato.

[0235] El incremento en estabilidad a temperaturas elevadas es cuantificado por la temperatura de inactivación de la enzima. La temperatura de inactivación se define como la temperatura a la que la actividad residual de una enzima fitasa después de la incubación durante una determinada duración y el posterior enfriamiento a temperatura ambiente es del 50 % de la actividad residual de la misma enzima fitasa incubada durante la misma duración en las mismas condiciones a temperatura ambiente. Las diferencias de termoestabilidad son las diferencias en °C entre las temperaturas de inactivación de dos enzimas.

Ejemplo 9. Estabilidad de pepsina

Resistencia de pepsina a pH 2 de fitasas de Buttiauxella, variantes BP-17, BP-110, BP-111 y BP-112, en comparación con Phyzyme XP, Natuphos y Ronozyme P

MATERIALES Y MÉTODOS

Tampones:

[0236] Tampón de incubación de pepsina: 0,1 M de glicina-HCl, pH 2,0, 3 mg/ml de BSA, 2,9 mg de cloruro de sodio anhidro/ml, 0,73 mg de cloruro de calcio/ml. Para soluciones con pepsina, el tampón de incubación se prepara para contener 500, 1000, 3000, 6000 o 10000 U/ml de pepsina (Sigma P-7000, 10000 U/mg corresponde a 27 mg/ml), respectivamente. Una unidad de pepsina se define como la cantidad de enzima que producirá una AOD280 de 0,001 por min a pH 2,0 a 37 °C, medido como productos solubles en TCA mediante el uso de hemoglobina como sustrato (Food Chemical Codex).

Tampón de prueba de fitasa: Tampón de acetato 250 mM, pit 5,5

Tampón de prueba de fitasa con BSA:

Tampón de acetato 250 mM, pH 5,5, con 3mg/ml de BSA

Resistencia contra el incremento de concentración de pepsina

[0237] Los valores fijados para todas las enzimas fueron los mismos: se prepararon seis muestras con enzima (por duplicado): cuatro muestras con cantidad cada vez mayor de pepsina en tampón (pH 2), una muestra sin pepsina, pero en tampón de incubación (pH 2) y una muestra de control positivo con enzima en tampón de prueba con BSA (pH 5,5).

[0238] Para cada muestra, se mezclaron 900 pl de tampón de incubación sin o con cantidades cada vez mayores de pepsina o 900 pl de tampón de prueba con 100 pl de solución de enzima, seguido de incubación a 40 °C. Después de 120 min de incubación, se retiraron 100 pl y se mezclaron con 900 pl de tampón de prueba. Las muestras se analizaron inmediatamente para fitasa a pH 5,5 contra curva estándar de fosfato como describe el proyecto de norma internacional de ISO ISO/DIS 30024.

Resultados

Resistencia de pepsina

[0239] Las variantes de Buttiauxella mostraron, en su totalidad, excelente estabilidad hacia la pepsina a pH 2. Por el contrario, la actividad de Natuphos se redujo de forma drástica ya a una concentración de pepsina de 500 U/ml, donde la actividad reducida adicional encontró una meseta de aproximadamente un 45 % de recuperación a una concentración de pepsina de 3000 U/ml. La recuperación de Ronozyme P fue incluso peor con una reducción en recuperación de menos de un 20 % a una concentración de pepsina de sólo 500 U/mg (figura 6A y tabla 4).

[0240] La figura 6 muestra la resistencia de las fitasas, que se origina a partir de Buttiauxella, variantes BP-17, BP-110, BP-111 y BP-112; y de Phyzyme XP, Natuphos y Ronozyme P contra concentraciones cada vez mayores de pepsina. Los datos son relativos a la incubación a pH 2 sin pepsina. A: todos los datos indican, B: los mismos datos pero que muestran sólo más de un 70 % de recuperación.

[0241] Hay pequeñas diferencias entre las variantes de Buttiauxella, donde la variante BP-17 var.110 muestra la mejor estabilidad con un 95 % de actividad que queda después de dos horas de incubación a la concentración de pepsina más alta, 10000 U/ml (figura 6B). En comparación, BP-17 mostró una recuperación de alrededor de un 85 % después de dos horas de incubación.

[0242] Las fitasas de Buttiauxella también mostraron una excelente estabilidad al ácido. La comparación de la actividad medida a pH 5,5 después de dos horas de incubación, ya sea a pH 2 o pH 5,5 mostró que todas las cuatro fitasas de Buttiauxella no perdieron actividad durante las 2 horas de incubación a pH 2, mientras que Phyzyme XP, Natuphos y el nuevo Ronozyme P mostraron reducción entre ligera y significativa en actividad (tabla 6).

Resumen de datos

[0243] Las variantes de fitasa de Buttiauxella descritas en la presente memoria muestran más de un 75 % de recuperación después de 2 horas de incubación a pH 2, 37 °C, 10000 U/ml de pepsina en comparación con la actividad de la muestra incubada en las mismas condiciones, pero sin la presencia de pepsina.

Ejemplo 10. Recuperación de actividad de enzima

Evaluación de recuperación de activ idad de enzim a

MATERIALES Y MÉTODOS

[0244] En el presente apartado, se evalúa la recuperación de la actividad de enzima después de la peletización de la enzima formulada con trigo. La enzima es pulverizada sobre trigo granulado y secada antes de mezclarse con pienso, seguido del proceso de peletización.

[0245] Las enzimas líquidas fueron formuladas en trigo integral molido y secadas hasta alcanzar un contenido de materia seca de aproximadamente un 90 %. La inactivación de enzimas durante estrés térmico en el proceso de peletización se analizó mediante el uso de una unidad de peletización en el Technological Institute en Kolding (esquemáticamente presentado en la figura 7). La muestra de prueba se añade a 10 kg de premezcla y se mezcla durante 10 min. Después, 10 kg de premezcla son añadidos a 150 kg de pienso (mezclador horizontal grande) y mezclados durante 15 minutos antes de acondicionamiento/vapor. El pienso es tratado durante 30 segundos a 90 °C/95 °C antes de la peletización. La temperatura se mide en la salida del mezclador de cascada. Inmediatamente después de dejar la prensa de peletización, los pellets se enfrían a temperatura ambiente.

[0246] La actividad de fitasa se midió de conformidad con la metodología mencionada en el ejemplo 10.

[0247] La actividad de fitasa es 5 unidades por gm en la masa de pienso antes de la peletización.

RESULTADOS

[0248] Los resultados se presentan en la figuras 8 a 10.

[0249] En la figura 8, se exponen los resultados de los ensayos de peletización de tres variantes de fitasa B descritas en la presente memoria. Las enzimas se formularon en trigo integral molido y se secaron hasta alcanzar un contenido de aproximadamente un 10 % de agua. Aquí, la recuperación de la actividad de fitasa después de la peletización para Bp 17 var 111 es de un 90 % a 90 °C en comparación con una recuperación de un 19 % a 90 °C para BP 17.

[0250] Como la referencia es la Phyzyme XP, una fitasa de Ecoli se formuló en trigo integral molido. Los resultados se muestran en la figura 9. Aquí, la recuperación de actividad de fitasa después de la peletización a 90 °C de los tres lotes de Phyzyme XP formulados en trigo integral molido es de un 47 %.

[0251] También se analizó Ronozyme. El producto se vende en una versión recubierta para proteger a la enzima del calor en el proceso de peletización. En este ensayo, la fitasa se extrajo del producto recubierto y se formuló en trigo integral molido para estudiar la termoestabilidad de la molécula de fitasa sin protección. Los resultados se muestran en la figura 10.

Resumen de datos

[0252] Las variantes de fitasa de Buttiauxella descritas en la presente memoria formuladas en trigo muestran más de un 70 % de recuperación después de peletizarse a 90 °C.

Ejemplo 11. Degradación de ácido fítico

R esultados de un estudio de degradación de ácido fítico p o r fitasa

Soluciones

[0253] Tres tampones diferentes se usaron en las incubaciones. Fueron los siguientes:

250 mM acetato, pH 5,5;

250 mM acetato M, pH 3,5; y

250 mM HCl de glicina, pH 2,5.

[0254] Todas las fitasas usadas en las incubaciones se diluyeron en tampón de prueba a nivel de enzima a 1 U/ml.

[0255] La solución de sustrato de fitato usada en la incubación es un fitato al 1 % (1 g/100 ml de tampón).

[0256] El sustrato se prepara en el mismo tampón usado para la dilución de fitasas para mantener el nivel de pH constante en la reacción.

[0257] La reacción es terminada por HCl 1M.

Incubación

[0258] Los volúmenes de incubación son: 1,5 o 3,0 ml de fitato 0,25 ml de enzima 3,25 o 1,75 ml de tampón a 37 °C, un volumen total de 5,0 ml.

[0259] Las submuestras de 0,5 ml se toman en diferentes momentos (0, 30, 60 y 90 min).

[0260] Un tubo de Eppendorf se prepara con 0,2 ml de HCl 1M para cada submuestra antes del submuestreo. Al mezclar la submuestra a partir de la incubación con HCl, la reacción de enzima se termina. Cada submuestra de 0,7 ml es almacenada a 4 °C hasta el análisis de HPLC.

Método de HPLC

[0261] Análisis de fitato e isómeros de inositol por cromatografía de iones de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés). Este método ha sido descrito por Skoglund y Carlsson et al. (J. Agrie. Food Chem., 45(1997), 451-436 5. J. Agrie. Food Chem., 46 (1998), 1877-1882; y J. Agrie. Food Chem., 49(2001), 11695-1701. La columna usada fue un intercambiador de aniones fuerte (4 x 250 mm) de Dionex con una precolumna de 4 x 50 mm. Solvente A, agua MilliQ, Solvente B, HCl 1N preparado en agua. El gradiente es de 2,5 % a 49 % B en 30 min, seguido de 3 minutos de isocrático a 50 % y 2 min de isocrático a 2,5 % a un flujo de 0,8 ml/min. Cada operación es de 35 min. Es posible reducir la operación a 25 minutos en total, ya que la fitasa no produce tantos isómeros IP como es teóricamente posible. El eluyente fue derivado en línea con una solución acuosa que contenía 0,1 % Fe(NO3)3-9HO2 y 2 % de ácido perclórico (HCO4) a un flujo de 0,4 ml/min. El fitato y los isómeros de IP fueron detectados a 290 nm como pico positivo. Esto se debe a la formación de complejo de fitato-Fe3+-ClO4. Una solución de ácido perclórico de 60 % se obtuvo de Sigma.

Resultados

[0262] Los resultados se presentan en las figuras 11-14.

Resumen de datos

[0263] Todas las enzimas descritas en la presente memoria muestran características favorables. Las fitasas descritas en la presente memoria descomponen el fitato en todos los niveles de pH analizados. Las enzimas descritas en la presente memoria son muy activas a pH 5,5.

BP 11O y BP 111 muestran una actividad similar a pH 2,5 y 3,5.

BP 110 y BP 111 descomponen todo el fitato añadido a las incubaciones después de 90 min tanto a pH 2,5 como a pH 3,5

BP112 descompone el 75 % del fitato añadido a las incubaciones después de 90 min tanto a pH 2,5 como a pH 3,5.

[0264] Las enzimas descritas en la presente memoria muestran mejores características que Ronozyme y Natuphos a pH 2,5 (véase, por lo menos, la figura 14) (La concentración de enzima es más alta que la que se ve en las figuras 11-13, por lo que Buttiauxella BP17 está ahí como referencia).

Ejemplo 12. H idrólisis de ácido fítico en un licuado

Determinación de ácido fítico:

[0265] Contenido de ácido fítico: El ácido fítico se extrajo de una muestra ajustando el pH de la suspensión al 5 % (si es muestra seca) a pH 10 y después se determinó mediante un método de HPLC mediante el uso de una columna de intercambio de iones. El ácido fítico se eluyó de la columna mediante el uso de un sistema de gradiente de NaOH. El contenido de ácido fítico en el líquido después se calculó mediante la comparación con un estándar de ácido fítico.

Resultados

[0266] Se estudió el efecto de la temperatura en la hidrólisis de ácido fítico del licuado de maíz entero molido de un proceso de licuefacción por molienda en seco convencional (fuente: Illinois River Energy, Monroe, Illinois) mediante diferentes variantes de fitasa de BP termoestables, es decir, BP110, BP111 y BP112. El pH de un 32 % de ms ("materia seca") de un licuado de maíz entero molido se ajustó a un pH 5,0 y se colocó en un baño de agua mantenido a 85 °C y 89 °C. Después de la regulación de la temperatura, se añadió fitasa BP a 4,0 FTU/gds. de maíz. A continuación, se recogieron muestras a los 20 minutos y la reacción de enzima se terminó mediante la adición de 10 mM de hidróxido de sodio (diluido 1 a 10 veces). Las muestras diluidas después se filtraron y se analizaron mediante HPLC para observar su perfil de derivados de fitato (IP1 a IP6). Los cromatogramas de HPLC de las figuras 15 y 16 mostraron claramente que la fitasa de las tres variantes catalizó la hidrólisis de ácido fítico a una temperatura superior a 85 °C. El contenido de ácido fítico (ácido fítico [IP6] y productos intermedios IP1 a IP5) en licuado de maíz entero molido es de alrededor de 1,7 % ms. de maíz y los datos de la figura 15 mostraron que más del 95 % del ácido fítico fue hidrolizado por fitasa termoestable en las condiciones de licuefacción actuales. De manera significativa, el perfil de HPLC de las muestras incubadas a 89 °C mostró que la variante de fitasa BP-111 presentaba termoestabilidad más alta en comparación con la fitasa de otras dos variantes (véase la figura 16; BP-110 y BP-112).

ASPECTOS DE SUMARIO

[0267] Los aspectos de sumario descritos en la presente memoria serán descritos, a continuación, por medio de párrafos numerados.

Una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende por lo menos una variación en comparación con SEQ ID NO: 1, y donde la por lo menos una variación se produce en una posición seleccionada del grupo que consiste en las posiciones 75, 76 y 374 de SEQ ID NO: 1, y donde cada una de dicha por lo menos una variación puede ser la misma o diferente y puede comprender una sustitución, deleción o inserción.

Una fitasa de acuerdo con el párrafo 1, donde la por lo menos una variación comprende una variación de una, dos o las tres de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: S75, Q76 y A374.

Una fitasa de acuerdo con el párrafo 2, donde la por lo menos una variación comprende una variación seleccionada del grupo que consiste en: S75P, Q76R y A374P.

Una fitasa de acuerdo con los párrafos 1 a 3, donde la por lo menos una variación también comprende una variación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: N37, G77, H160, F164, T171, S188, G192, K198, A235, Q256 y/o P367.

Una fitasa de acuerdo con el párrafo 4, donde la por lo menos una variación comprende una variación seleccionada del grupo que consiste en: N37Y, G77S, H160R, F164E, F164S, T171V, T171I, S188P, G192A, K198R, A235V, Q256P, Q256A, Q256E y/o P367L.

Una fitasa de acuerdo con los párrafos 1 a 5, donde la por lo menos una variación también comprende una variación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 y/o N270.

Una fitasa de acuerdo con el párrafo 6, donde la por lo menos una variación comprende una variación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: A89T, D92A, T134I, F164S, T176K, A178P, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E y/o N270K.

Una fitasa de acuerdo con el párrafo 7, donde dicha fitasa comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2. Una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1-8, donde dicha fitasa comprende una secuencia que comprende variaciones seleccionadas del grupo que consiste en:

e) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

j) N37Y, A89T, D92A, T134I, F164E, T171I, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

s) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; y

Una fitasa que tiene por lo menos un porcentaje de identidad de secuencia y/o un porcentaje de homología mínimo con respecto a la fitasa de cualquiera de los párrafos 1-9, donde el porcentaje de identidad y/o de homología mínimo se selecciona del grupo que consiste en por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 93 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 %, y por lo menos 99 %.

Una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 10 que tiene por lo menos una propiedad mejorada en comparación con la fitasa de SEQ ID NO: 1, donde la propiedad mejorada se selecciona del grupo que consiste en actividad específica incrementada; sensibilidad disminuida a una o más proteasas; actividad térmica incrementada; estabilidad térmica incrementada, estabilidad incrementada en un pH ácido, estabilidad mejorada en un pH básico, estabilidad de procesamiento de pienso incrementada. Una fitasa de acuerdo con los párrafos 10, donde la por lo menos una propiedad mejorada es una sensibilidad disminuida con respecto a una o más proteasas encontradas en un animal seleccionado del grupo que consiste en humanos, alpacas, bisontes, camellos, ganado vacuno, pollos, aves de corral, chinchillas, venados, asnos, patos, peces, ranas, cabras, gansos, aves domésticas, caballos, llamas, visones, mulas, avestruces, palomas, renos, ovejas, mariscos, cerdos, pavos, yaks, búfalos de agua, gatos, chimpancés, perros, hurones, gerbos, peces dorados, conejillos de indias, hámsteres, monos, periquitos, reptiles y roedores.

Una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1-11, que tiene actividad prolongada, en comparación con la fitasa de SEQ. ID NO: 1, en el tracto digestivo de un animal seleccionado del grupo que consiste en humanos, alpacas, bisontes, camellos, ganado vacuno, pollos, aves de corral, chinchillas, venados, asnos, patos, peces, ranas, cabras, gansos, aves domésticas, caballos, llamas, visones, mulas, avestruces, palomas, renos, ovejas, mariscos, cerdos, pavos, yaks, búfalos de agua, gatos, chimpancés, perros, hurones, gerbos, peces dorados, conejillos de indias, hámsteres, monos, periquitos, reptiles y roedores.

Un ácido nucleico que codifica una fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 13.

Un vector que comprende el ácido nucleico del párrafo 14.

Una célula huésped que comprende el ácido nucleico del párrafo 14.

Una composición de enzima que comprende por lo menos una fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 13.

Una composición de enzima que comprende por lo menos una fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 13, donde la composición es útil en la licuefacción de almidón.

Un método para producir una variante de fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 13 en una célula huésped, que comprende

a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN que comprende el ácido nucleico que codifica la fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 13, y

b) cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo adecuado.

El método de conformidad con el párrafo 19, donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula fúngica, una célula bacteriana o una célula vegetal.

Una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende por lo menos una variación en comparación con SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene una variación en por lo menos una o más de las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407. Preferiblemente, la variante tiene una variación en por lo menos dos o más de las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407. Preferiblemente, la variante tiene una variación en por lo menos tres o más de las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407. Preferiblemente, la variante tiene una variación en por lo menos cuatro o más de las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407. Preferiblemente, la variante tiene una variación en por lo menos las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407.

Una fitasa de acuerdo con el párrafo 21, donde la variante tiene por lo menos las siguientes variaciones: N70Y, H193R, F197E, S221P y A407P.

Un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de mezclar un polipéptido como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada por el método del párrafo 19 o 20 con otro ingrediente de alimento o pienso para formar dicho alimento o pienso para animales.

Un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de pulverizar un polipéptido como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 en forma líquida sobre el alimento o pienso para animales.

Un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de mezclar un polipéptido como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 como producto seco con dicho alimento o pienso para animales.

Un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de mezclar un polipéptido como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 con otro ingrediente de alimento o pienso para formar dicho pienso para animales.

Un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de pulverizar un polipéptido como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 en forma líquida sobre dicho pienso para animales.

Un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de mezclar un polipéptido como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 como producto seco con dicho pienso para animales.

Una composición de alimento o pienso para animales que comprende ya sea i) una fitasa como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 y/o ii) un alimento o pienso para animales producido mediante el método de conformidad con cualquiera de los párrafos 23 a 28.

Una composición de pienso para animales que comprende ya sea i) una fitasa como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 y/o ii) un pienso para animales producido mediante el método de conformidad con cualquiera de los párrafos 23 a 28.

El uso de un polipéptido fitasa como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 en alimento o pienso para animales.

El uso de un polipéptido fitasa como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 en un pienso para animales.

Un método para reducir los niveles de fósforo en estiércol animal, caracterizado por que un animal es alimentado con un polipéptido fitasa como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 o un pienso de conformidad con el párrafo 29 o 30, y donde dicha fitasa se encuentra en una cantidad eficaz para convertir fitato contenido en dicho pienso para animales.

34. El uso de un polipéptido fitasa como se menciona en cualquiera de los párrafos 1 a 13 o 21 a 22 o una composición de enzima de conformidad con el párrafo 17 o el párrafo 18 o preparada mediante el método del párrafo 19 o 20 o un pienso de conformidad con el párrafo 29 o 30, en la fabricación de un pienso para animales para reducir los niveles de fósforo en estiércol del animal alimentado con dicho polipéptido fitasa.

[0268] Los siguientes párrafos numerados contienen más indicaciones sobre diversos aspectos descritos en la presente memoria:-

1. Una variante de fitasa que tiene actividad térmica mejorada de por lo menos aproximadamente 5 °C en comparación con la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).

2. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 1, donde la actividad térmica mejorada es de por lo menos aproximadamente 17 °C en comparación con la fitasa de SEQ ID NO: 1.

3. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 1 o el párrafo 2, donde la actividad térmica mejorada se encuentra en el intervalo de aproximadamente 17 y aproximadamente 21 °C.

4. La variante de fitasa de conformidad con cualquiera de los párrafos 1 a 3, donde la actividad térmica mejorada se encuentra en el intervalo de aproximadamente 17,4 y aproximadamente 20,2 °C.

5. Una variante de fitasa termoestable que puede conservar más del 50 % de su actividad después de una exposición a una temperatura elevada durante 10 minutos a pH 5,5 en tampón, donde la temperatura elevada es por lo menos 5 °C superior que una temperatura a la que la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (s Eq ID NO: 1) conserva más del 50 % de su actividad.

6. La variante de fitasa termoestable de acuerdo con el párrafo 5, donde la temperatura elevada es por lo menos aproximadamente 20,5 °C superior.

7. La variante de fitasa termoestable de acuerdo con el párrafo 5 o el párrafo 6, donde la temperatura elevada se encuentra en un intervalo de entre aproximadamente 20,5 °C y aproximadamente 27 °C. 8. La variante de fitasa termoestable de acuerdo con cualquiera de los párrafos 5 a 7, donde la temperatura elevada está en un intervalo de entre aproximadamente 20,2 °C y aproximadamente 26,8 °C.

9. Una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende una variación en una o más posiciones correspondientes a la posición 75, 76, 77, 198, 367 o 374 de SEQ ID NO: 1.

10. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 9, donde la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la variación es 92A, 164E/S, 171I/V, 192A o 256A/E/P.

11. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 9 o el párrafo 10, caracterizada por que la variación en una o más de las posiciones 75, 76, 77, 198, 367 o 374 es respectivamente 75P, 76R, 77S, 198R, 367L o 374P y la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales donde la variación es 92A, 164E/S, 171V, 192A o 256A/E/P.

12. La variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 9 a 11, donde la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la posición de la una o más variaciones adicionales es 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211,235, 261, 270, 303 o 318.

13. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 12, donde la una o más variaciones adicionales en la posición 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261, 270, 303 o 318 es respectivamente 26E, 037Y, 089T, 1341/V, 160R, 176K, 178P, 188N, 190E, 207E/T, 209S, 211C, 235V, 261E, 270K, 303F o 318D.

14. La variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 9 a 13, donde la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la posición de la una o más variaciones adicionales es 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 o 413.

15. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 14, donde la una o más variaciones adicionales en la posición 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 243, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371, 372, 396, 399, 406 o 413 es respectivamente 1S, 10I, 11I, 38S, 66E, 71K, 81A, 92E, 109Q, 111G, 119N, 120L, 121E, 141R, 142L, 152M, 155E, 193Q, 211C, 214V, 235V, 239K, 245D, 248L, 255A, 261E, 268A/T, 270K, 277T, 283D, 285K, 287D, 288A, 293G o 296S.

16. Una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende por lo menos una variación en comparación con SEQ ID NO: 1, y donde la variación de secuencia de fitasa comprende

a) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, FI64E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

c) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F1614E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P

d) N37Y, A89T, D92A, TI34I, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256P, A261E, N270K, A374P

17. La variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 16, donde la variación de secuencia de fitasa comprende N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P.

18. Una fitasa que tiene por lo menos un porcentaje de identidad de secuencia y/o un porcentaje de homología mínimo con respecto a la fitasa de los párrafos 1 a 17, donde el porcentaje de identidad y/o de homología mínimo es de por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 %, por lo menos 90 %, por lo menos 93 %, por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 % o por lo menos 99 %.

19. Una variante de fitasa que tiene actividad de fitasa y una secuencia de aminoácidos que varía de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), donde la secuencia de aminoácidos de la variante de fitasa comprende por lo menos una variación en comparación con SEQ ID NO: 1, y donde la variante tiene una variación en por lo menos cualquiera de las siguientes posiciones: 70, 193, 197, 221 y 407.

20. Una fitasa de acuerdo con el párrafo 19, donde la variante tiene por lo menos las siguientes variaciones: N70Y, H193R, F197E, S221P y A407P.

21. Una variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 4, donde dicha fitasa comprende cualesquiera una o más de las características de los párrafos 5 a 8 y/o los párrafos 9 a 15 y/o los párrafos 16 o 17 y/o el párrafo 18 y/o los párrafos 19 o 20.

22. Una variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 5 a 8, donde dicha fitasa comprende cualesquiera una o más de las características de los párrafos 1 a 4 y/o los párrafos 9 a 15 y/o 16 o 17 y/o el párrafo 18 y/o los párrafos 19 o 20.

23. Una variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 9 a 15 donde dicha fitasa comprende cualesquiera una o más de las características de los párrafos 1 a 4, y/o los párrafos 5 a 8 y/o 16 o 17 y/o el párrafo 18 y/o los párrafos 19 o 20.

24. Una variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 16 a 17, donde dicha fitasa comprende cualesquiera una o más de las características de los párrafos 1 a 4 y/o los párrafos 5 a 8 y/o 9 a 15 y/o el párrafo 18 y/o los párrafos 19 o 20.

25. Una variante de fitasa de acuerdo con el párrafo 18, donde dicha fitasa comprende cualesquiera una o más de las características de los párrafos 1 a 4 y/o los párrafos 5 a 8 y/o los párrafos 9 a 15 y/o 16 a 17 y/o los párrafos 19 o 20.

26. Una variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 19 a 20, donde dicha fitasa comprende cualesquiera una o más de las características de los párrafos 1 a 4 y/o los párrafos 5 a 8 y/o los párrafos 9 a 15 y/o los párrafos 16 o 17 y/o el párrafo 18.

27. Un ácido nucleico que codifica una fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 26.

28. Un vector que comprende el ácido nucleico del párrafo 27.

29. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico del párrafo 27 o el vector del párrafo 28. 30. Un método para producir una variante de fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 26 en una célula huésped, que comprende

a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN que comprende el ácido nucleico que codifica la fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 26, y

b) cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo adecuado.

31. El método de acuerdo con el párrafo 19, donde la célula huésped es una célula fúngica, una célula bacteriana o una célula vegetal.

32. Una fitasa preparada mediante el método de acuerdo con el párrafo 30 o el párrafo 31.

33. Una composición de enzima que comprende por lo menos una fitasa de cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32, que incluye adicionalmente una o más de una glucoamilasa, una alfa-amilasa, una proteasa, una pululanasa, una isoamilasa, una celulasa, una hemicelulasa, una xilanasa, una ciclodextrina glicotransferasa, una lipasa, una lacasa, una oxidasa, una esterasa, una cutinasa, otra fitasa o cualquier combinación de las mismas.

34. La composición de enzima de conformidad con el párrafo 33, donde se incluye una alfa-amilasa. 35. El uso de una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o la composición de enzima del párrafo 33 o el párrafo 34 en la licuefacción de almidón, sacarificación, fermentación o sacarificación-fermentación simultáneas.

36. El uso de acuerdo con el párrafo 35, donde la licuefacción de almidón, sacarificación, fermentación o sacarificación-fermentación simultáneas es para la producción de alcohol de fermentación.

37. El uso de acuerdo con el párrafo 36, donde el alcohol es etanol o butanol.

38. El uso de acuerdo con cualquiera de los párrafos 35 a 37, donde un sustrato es sometido a la licuefacción de almidón, sacarificación, fermentación o sacarificación-fermentación simultáneas.

39. El uso de acuerdo con el párrafo 38, donde el sustrato comprende almidón.

40. El uso de acuerdo con el párrafo 38 o el párrafo 39, donde el sustrato comprende un grano o cereal.

41. El uso de acuerdo con el párrafo 40, donde el grano o cereal es trigo, cebada, centeno, avena, maíz, sorgo, harina de gluten de maíz, solubles de grano seco de destilerías (DDGS), salvado de trigo, harinillas de trigo, moyuelos de trigo, arroz, cáscaras de avena, semilla de palmera, pulpa de cítricos o combinaciones de los mismos.

42. El uso del párrafo 41, donde el arroz comprende salvado de arroz o cáscaras de arroz.

43. El uso de por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 como aditivo para un alimento o pienso.

44. El uso de por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 como aditivo para un alimento o pienso que contiene solubles de grano seco de destilerías (DDGS).

45. Un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 con otro ingrediente de alimento o pienso para formar dicho alimento o pienso para animales.

46. Un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de pulverizar por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 en forma líquida sobre dicho alimento o pienso para animales.

47. Un método para la producción de alimento o pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 como producto seco con dicho alimento o pienso para animales.

48. Un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 con otro ingrediente de alimento o pienso para formar dicho pienso para animales.

49. Un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de pulverizar por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 en forma líquida sobre dicho pienso para animales.

50. Un método para la producción de pienso para animales que comprende un paso de mezclar por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 como producto seco con dicho pienso para animales.

51. Una composición de alimento o pienso para animales que comprende ya sea i) por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con 33 o el párrafo 34 y/o ii) un alimento o pienso para animales producido mediante el método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 45 a 50.

52. Una composición de pienso para animales que comprende ya sea i) por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 y/o ii) un alimento o pienso para animales producido por el método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 45 a 50.

53. El uso de por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 en alimento o pienso para animales.

54. El uso de por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 en un pienso para animales.

55. Un método para reducir los niveles de fósforo en estiércol animal, caracterizado por que un animal es alimentado con por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o párrafo 34 o un pienso preparado mediante el método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 45 a 50 o una composición de acuerdo con cualquiera de los párrafos 51-52 y donde dicha fitasa se encuentra en una cantidad eficaz para la conversión de fitato contenido en dicho pienso para animales.

56. El uso de por lo menos una fitasa de acuerdo con cualquiera de los párrafos 1 a 26 o el párrafo 32 o una composición de enzima de acuerdo con el párrafo 33 o el párrafo 34 o un pienso preparado mediante el método de acuerdo con cualquiera de los párrafos 45 a 50 o una composición de acuerdo con cualquiera de los párrafos 51-52, en la fabricación de un pienso para animales para reducir los niveles de fósforo en estiércol del animal alimentado con dicho polipéptido fitasa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una variante de fitasa en pienso para animales para mejorar la digestión de fosfato;

donde dicha variante de fitasa presenta actividad térmica mejorada de al menos aproximadamente 5 °C en comparación con la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1);

donde además dicha variante de fitasa comparte al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, donde además dicha variante de fitasa comprende una fitasa que contiene una sustitución en una, dos o tres posiciones seleccionadas del grupo que consiste en S75, Q76 y A374; en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en A89, D92, T134, F164, T176, A178, K207, A209, S248, Q256, A261 y/o N270; y en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: N37, G77, H160, F164, T171, S188, G192, K198, A235, Q256 y/o P367, donde cada posición corresponde a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con la reivindicación 1, donde la actividad térmica mejorada es de al menos aproximadamente 17 °C en comparación con la fitasa SEQ ID NO: 1.

3. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la actividad térmica mejorada se sitúa en el intervalo de aproximadamente 17 y aproximadamente 21 °C.

4. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la actividad térmica mejorada se sitúa en un intervalo de aproximadamente 17,4 y aproximadamente 20,2 °C.

5. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con la reivindicación 1;

donde dicha variante de fitasa es una variante de fitasa termoestable que puede conservar más del 50 % de su actividad tras la exposición a una temperatura elevada durante 10 minutos a pH 5,5 en tampón; donde además la temperatura elevada es al menos 5 °C superior que una temperatura a la que la fitasa de Buttiauxella sp. de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) conserva más del 50 % de su actividad.

6. Uso de la variante de fitasa termoestable de acuerdo con la reivindicación 5, donde la temperatura elevada es al menos aproximadamente 20,5 °C superior.

7. Uso de la variante de fitasa termoestable de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, donde la temperatura elevada se sitúa en un intervalo de aproximadamente 20,5 °C y aproximadamente 27 °C.

8. Uso de la variante de fitasa termoestable de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde la temperatura elevada se sitúa en un intervalo de aproximadamente 20,2 °C y aproximadamente 26,8 °C.

9. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la variación es 92A, 164E/S, 171l/V, 192A o 256A/E/P.

10. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la variación en una o más de las posiciones 75, 76, 77, 198, 367 o 374 respectivamente es 75P, 76R, 77S, 198R, 367L o 374P y la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la variación es 92A, 164E/S, 171V, 192A o 256A/E/P.

11. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la posición de la una o más variaciones adicionales es 26, 37, 89, 134, 160, 176, 178, 188, 190, 207, 209, 211, 235, 261, 270, 303 o 318, p. ej., donde la una o más variaciones adicionales es 26E, 37Y, 89T, 134I/V, 160R, 176K, 178P, 188N, 190E, 207E/T, 209S, 211C, 235V, 261E, 270K, 303F o 318D.

12. Uso de la variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la variante de fitasa comprende también una o más variaciones adicionales, donde la posición de la una o más variaciones adicionales es 1, 10, 11, 38, 66, 71, 81, 92, 109, 111, 119, 120, 121, 141, 142, 152, 155, 193, 214, 239, 245, 248, 255, 268, 277, 283, 285, 287, 288, 293, 296, 314, 337, 345, 350, 364, 371,372, 396, 399, 406 o 413, p. ej., donde la una o más variaciones adicionales es 1S, 10I, 11I 38S, 66E, 71K, 81A, 92E, 109Q, 111G, 119N, 120L, 121E, 141R, 142L,152M, 155E, 193Q, 211C, 214V, 235V, 239K, 245D, 248L, 255A, 261E, 268A/T, 270K, 277T, 283D, 285K, 287D, 288A, 293G o 296S.

13. Uso de una variante de fitasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la variación de secuencia de fitasa comprende:

(i) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, SI88P, G192A, K198R, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P;

(ii) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, TI76K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P;

(iii) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171I, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256Y, A261E, N270K, A374P;

(iv) S75P, A89T, D92A, T134I, FI64E, T171V, T176K, A178P, SI88P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261 E, N270K, A374P;

(v) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261E, N270K, P367L, A374P;

(vi) N37Y, S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256A, A261 E, N270K, A374P;

(vii) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, K207E, A209S, A235V, S248L, Q256Y, A261 E, N270K, A374P;

(viii) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, H160R, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, K207E, A209S, S248L, Q256H, A261E, N270K, A374P;

(ix) N37Y, S75P, A89T, D92A, T134I, F164S, T171V, T176K, A178P, S188P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261E, N270K, A374P; o

(x) S75P, Q76R, A89T, D92A, T134I, H160R, F164E, T171V, T176K, A178P, G192A, K207E, A209S, S248L, Q256A, A261 E, N270K, A374P.