BR112020018294A2 - Glucoamilases e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

glucoamilases e métodos de uso dos mesmos . a presente invenção refere-se a métodos para materiais que contêm amido sacarificado com uso de uma glucoamilase, métodos para produzir produtos de fermentação, e produtos de fermentação produzidos pelo método dos mesmos assim como métodos para aumentar a digestibilidade de amido em um animal ruminante com uso de pelo menos uma das glucoamilases descritas no presente documento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "GLUCO- AMILASES E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente In- ternacional nº PCT/CN2018/078575, depositado em 9 de março de 2018, cuja descrição está incorporada a título de referência no presen- te documento em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente descrição se refere aos métodos para sacarifi- car e/ou materiais que contêm amido hidrolisantes com o uso de pelo menos uma glucoamilase. As glucoamilases da presente descrição também podem ser usadas como um aditivo de alimentação para ani- mais para aprimorar a digestão de amido. Além disso, a descrição também se refere aos métodos para produzir produtos de fermentação assim como os produtos de fermentação produzidos pelo método da mesma.

ANTECEDENTES

[0003] A glucoamilase (1,4-alfa-D-glucano-gluco-hidrolase, EC

3.2.1.3) é uma enzima que catalisa a liberação de D-glicose a partir das extremidades não redutoras de amido ou moléculas relacionadas de oligo e polissacarídeo. Glucoamilases são produzidas por diversos fungos e leveduras filamentosos.

[0004] Uma aplicação principal sem limitação de glucoamilase é a sacarificação de amido/dextrina parcialmente processados em glicose, que é um substrato essencial para diversos processos de fermenta- ção. A glicose pode, então, ser convertida direta ou indiretamente em um produto de fermentação com o uso de um organismo de fermenta- ção. Exemplos de produtos de fermentação comerciais incluem álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanodiol); ácidos orgâà- nicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO>), e compostos mais complexos.

[0005] A glucoamilase para propósitos comerciais tradicionalmente tem sido produzida empregando-se fungos filamentosos, embora um grupo diverso de micro-organismos produza glucoamilase, visto que secretam grandes quantidades da enzima extracelularmente.

[0006] Sacarificação ou fermentação pode ser realizada em pH baixo, à medida que, tipicamente, organismos de fermentação diminu- em o pH rapidamente, e alguns lactobacilos podem diminuir, adicio- nalmente, o pH em cerca de 3,5. Em outro aspecto, valores de pH bai- xo minimizarão o risco de contaminação. No entanto, as glucoamilases fúngicas comercialmente usadas têm determinadas limitações, tais como sensibilidade de pH baixo ou desempenho/atividade baixa em pH baixo (tal como, por exemplo, pH abaixo de 6).

[0007] Glucoamilases que são ativas em um pH baixo na presença de pepsina podem ser úteis como um aditivo de alimentação para ru- minantes. Enzimas para uso como aditivos de alimentação para rumi- nantes são principalmente enzimas fibrolíticas, tais como celulases, beta-glucanases e hemicelulases (Tabela 1 em Beauchemin et al. 2004). Uma razão para o desenvolvimento de produtos enzimáticos de alimentação para ruminantes. Can. J. Anim. Sci. 84: 23 a 36). Relatos sobre hidrolases de amido para usos em ruminante são limitados.

[0008] A digestibilidade de amido em alimentações e fontes de alimentação é altamente variável e dependente de diversos fatores que incluem a estrutura física tanto do amido quanto da matriz de ali- mentação. A Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2005/0037053, publicada em 17 de fevereiro de 2005, revela o uso de uma enzima que tem atividade de amilase e capacidade para degradar amido resis-

tente em uma alimentação que compreende amido para animais mo- nogástricos, tais como aves domésticas e suínos. O documento nº WO 2008/06881, publicado em 17 de janeiro de 2008, revela o uso de ami- lases bacterianas em alimentação para animais ruminantes da subfa- mília dos Bovinos para melhorar o rendimento de leite, digestibilidade aparente da dieta alimentada, desaparecimento de matéria seca em alimento para animais, ganho de peso e/ou Razão de Conversão de Alimentação. O documento nº WO 2015/128366, publicado em 3 de setembro de 2015, revela o uso de amilases bacterianas em combina- ção com uma ou mais proteases em alimentação para animais rumi- nantes da subfamília dos Bovinos para melhorar a digestibilidade de mais e/ou silagens de maís, em particular para melhorar o rendimento de leite, ganho de peso e/ou Razão de Conversão de Alimentação. Consequentemente, ainda há uma necessidade em aumentar a diges- tibilidade de amido para animais.

[0009] Consequentemente, há uma necessidade em buscar por novas glucoamilases para melhorar a tolerância ao pH baixo durante a sacarificação e/ou fermentação ou para aumentar a digestibilidade de amido para um animal que recebe uma dieta que contém amido.

SUMÁRIO

[0010] A presente descrição se refere aos métodos para sacarifi- car materiais que contêm amido com o uso de pelo menos uma gluco- amilase. As glucoamilases da presente descrição também podem ser usadas como um aditivo de alimentação para animais para aprimorar a digestão de amido. Aspectos e modalidades dos métodos são descri- tos nos seguintes parágrafos independentemente numerados.

1. Em um aspecto, um método para sacarificar um subs- trato de amido que compreende colocar o substrato de amido em con- tato com uma glucoamilase selecionada a partir do grupo que consiste em:

a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7, ou 8 ou 9; b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 8; c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7 ou 8; d) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 9; ou e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante secreção de um hospedeiro de expressão; sendo que a sacarificação é realizada em um pH entre 2,0 e 6,0,

2. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 1, em que sacarificar o substrato de amido resulta em um xarope com alto teor de glicose.

3. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 1 ou 2, em que o xarope com alto teor de glicose compreende uma quanti- dade de glicose selecionada a partir da lista que consiste em pelo me- nos 95,5% de glicose.

4. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 1 a 3 que compreende adicionalmente fermentar o xa- rope com alto teor de glicose em um produto final.

5. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 4, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas como um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

6. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 4 ou 5, em que o produto final é álcool, por exemplo, etanol.

7. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 4 ou 5, em que o produto final é um produto bioquímico selecionado a partir do grupo que consiste em um aminoácido, um ácido orgânico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gliconato de cálcio, gluconato de potás- sio, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo ômega 3, butanol, lisina, ácido itacônico, 1,3-propanodiol, biodiesel e isopreno.

8. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que o substrato de amido é cerca de 5% a 99%, 15% a 50% ou 40 a 99% de sólido seco (DS).

9. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que o substrato de amido é selecionado den- tre trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandioca, milo, painço, batata, batata-doce, tapioca e qualquer combinação dos mes- mos.

10. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 1 a 9, em que o substrato de amido compreende amido liquefeito, amido gelatinizado ou amido granular.

11. Em algumas modalidades, o método de qualquer um dos parágrafos 1 a 10 que compreende, ainda, adicionar uma hexo- quinase, um xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, uma fosfatase, uma fitase, uma pululanase, uma beta-amilase, uma alfa-amilase, uma glicoamilase, uma protease, uma celulase, uma he- micelulase, uma lipase, uma cutinase, uma trealase, uma isoamilase, uma enzima redox, uma esterase, uma transferase, uma pectinase, uma hidrolase, uma alfa-glicosidase, uma beta-glicosidase ou uma combinação das mesmas ao substrato de amido.

12. Em um aspecto, um método para sacarificar e fermentar um substrato de amido para produzir um produto final que compreende colocar o substrato de amido em contato com uma glucoamilase sele- cionada a partir do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci-

dos de SEQ ID NO: 7, ou 8 ou 9; b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 8; c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7 ou 8; d) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 9; ou e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante secreção de um hospedeiro de expressão; em que a sacarificação e fermentação são realizadas em um pH entre 2,0 e 6,0, preferencialmente entre pH 2,0 e pH 5,0, preferencial- mente entre pH 2,0 e pH 4,0, mais preferencialmente entre pH 2,0 e pH 3,0.

13. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 12, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas como um pro- cesso de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

14. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 12 ou 13, em que o produto final é álcool, por exemplo, etanol.

15. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 12, em que o substrato de amido sacarificado e fermentado resulta em um nível reduzido de DP3+ e um nível aumentado de DP1 em compara- ção com colocar o mesmo substrato de amido em contato com AnGA.

16. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 12 ou 13, em que o produto final é um produto bioquímico selecionado a par- tir do grupo que consiste em um aminoácido, um ácido orgânico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gliconato de cálcio, gluconato de potás-

sio, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo ômega 3, butanol, lisina, ácido itacônico, 1,3-propanodiol, biodiesel e isopreno.

17. Em outro aspecto, um método para aumentar a digesti- bilidade de amido em um animal que compreende adicionar pelo me- nos uma glucoamilase selecionada a partir do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7, ou 8 ou 9; b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 8; c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7 ou 8; d) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 9; ou e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante secreção de um hospedeiro de expressão; como um aditivo de alimentação para alimentar um animal, em que a dita glucoamilase (a) tem pelo menos 20% de atividade ou pelo menos 20% de atividade residual maior em pH menor ou igual a 3 na presença de pepsina ou fluido de rúmen (por exemplo, fluido de rúmen que contém pepsina) em comparação com a atividade das enzimas em pH 6 por si só ou na presença de fluido de rúmen (por exemplo, fluido de rúmen que contém pepsina), e (b) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose.

18. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 17, em que, quando o animal é um ruminante, a dita enzima é ativa em pelo menos duas das três câmaras digestivas do ruminante que com- preende um rúmen, um abomaso e um intestino delgado

19. Em algumas modalidades, o método do parágrafo 16 ou

17, em que a dita pelo menos uma glucoamilase tem capacidade para hidrolisar amido bruto.

20. Em outro aspecto, um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 80% de identida- de à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4, 5ou6.

21. Em outro aspecto, um vetor que compreende a sequên- cia de polinucleotídeos do parágrafo 20 ligado de modo operativo a uma ou mais sequências de controle que controlam a produção do po- lipeptídeo decodificado em um hospedeiro de expressão, e em que a dita sequência reguladora é heteróloga à sequência de nucleotídeos de codificação, ou a dita sequência reguladora e a sequência de codi- ficação não são dispostas conforme encontradas unidas por natureza.

22. Em outro aspecto, uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 20.

23. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recom- binante do parágrafo 22, que é uma célula de Trichoderma, Asper- gillus, Myceliopthora ou Saccharomyces.

24. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recom- binante do parágrafo 22, que é uma célula de E.coli, Bacillus, Strep- tomyces ou Pseudomonas.

25. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recom- binante do parágrafo 22, que é um micro-organismo etanologênico.

26. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recom- binante do parágrafo 22 ou 25, que expressa e secreta adicionalmente uma ou mais enzimas adicionais selecionadas a partir do grupo que compreende protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima |li- política, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, peridrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, alfa-amilase, pululanase, fitase, tanase, pentosanase, malanase, beta-glucanase,

arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, lacase, transferrase ou uma combinação das mesmas.

27. Em outro aspecto, uma composição de aditivo de ali- mentação ou pré-mistura que compreende pelo menos uma glucoami- lase selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um ligante e um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; ou (e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante secreção de um hospedeiro de expressão; e/ou (f) opcionalmente pelo menos um mineral e/ou pelo me- nos uma vitamina.

28. Em algumas modalidades, a composição de aditivo de alimentação ou pré-mistura do parágrafo 27, que compreende adicio- nalmente uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma protease, uma amilase, uma xilanase e uma fi- tase.

29. Em algumas modalidades, a composição de aditivo de alimentação ou pré-mistura do parágrafo 27 ou parágrafo 28, que compreende adicionalmente um ou mais micróbios alimentados dire- tamente selecionados a partir do grupo que consiste em Bacillus, Bac- térias de Ácido Lático e Leveduras.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E SEQUÊNCIAS

[0011] A Figura 1 é um alinhamento de múltiplas sequências CLUSTALW de TeGA, FraGA1, WcoGA1 e outras glucoamilases fún- gicas.

[0012] As seguintes sequências cumprem com o Título 37, Seções

1.821 a 1.825 do C.F.R. ("Requirements for Patent Applications Con- taining Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosu- res - the Sequence Rules") e são consistentes com o Padrão ST.25 da Organização Mundial de Propriedade Intelectual (WIPO) (2009) e as solicitações de listagem de sequência das Regras da Convenção Eu- ropeia de Patente (EPC) e do Tratado de Cooperação em Matéria de Patente (PCT) 5.2 e 49.5(a-bis), e Seção 208 e Anexo C das Instru- ções Administrativas. Os símbolos e o formato usados para os dados de sequência de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras apresentadas no Título 37, Seção 1.822 do C.F.R.

[0013] SEQ ID NO: 1 é sequência de proteína precursora do Fra- GA1.

[0014] SEQ ID NO: 2 é sequência de proteína precursora do WocoGA1.

[0015] SEQ ID NO: 3 é sequência de proteína precursora do Te- GA.

[0016] SEQ ID NO: 4 é sequência de nucleotídeos do gene Fra- GAT.

[0017] SEQ ID NO: 5 é sequência de nucleotídeos do gene Woo- GAT.

[0018] SEQ ID NO: 6 é sequência de nucleotídeos do gene TeGA.

[0019] SEQ ID NO: 7 é sequência de proteína madura prevista do FraGA1.

[0020] SEQ ID NO: 8 é sequência de proteína madura prevista do WocoGA1.

[0021] SEQ ID NO: 9 é sequência de proteína madura do TeGA.

[0022] SEQ ID NO: 10 é glucoamilase de tipo selvagem de Asper- gillus niger, e o número de acesso de NCBI é XP 001390530.1.

[0023] SEQ ID NO: 11 é glucoamilase de tipo selvagem de Tricho- derma reesei, e o número de acesso de PDB é 2VN4 A.

[0024] SEQ ID NO: 12 é KZT67263.1 (número de acesso de NCBI).

[0025] SEQ ID NO: 13 é XP 002475369.1 (número de acesso de NCBI).

[0026] SEQ ID NO: 14 é a SEQ ID NO: 1847 descrita no documen- to nº US20090325240.

[0027] SEQ ID NO: 15 é KZTO09226.1 (número de acesso de NCBI).

[0028] SEQ ID NO: 16 é a SEQ ID NO: 12 descrita no documento nº WO2016196202.

[0029] SEQ ID NO: 17 é a SEQ ID NO: 2 descrita no documento nº US20170314003.

[0030] SEQ ID NO: 18 é GAD95639.1 (número de acesso de NCBI).

[0031] SEQ ID NO: 19 é a SEQ ID NO: 23 descrita no documento nº US20170306309.

[0032] SEQ ID NO: 20 é CAC28076.1 (número de acesso de NCBI).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0033] Todos os documentos de patentes, pedidos de patente e publicações citados são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade. Nesta descrição, diversos termos e abreviações são usados. As seguintes definições se aplicam a menos que seja especificamente afirmado de outra forma.

[0034] O termo "que compreende" significa a presença dos recur-

sos, números inteiros, etapas, ou componentes afirmados, conforme citado nas reivindicações, porém, isso não exclui a presença ou adição de um ou mais outros recursos, números inteiros, etapas, componen- tes ou grupos dos mesmos. O termo "que compreende" deve incluir modalidades englobadas pelos termos "que consiste essencialmente em" e "que consiste em". De maneira similar, o termo "que consiste essencialmente em" deve incluir modalidades englobadas pelo termo "que consiste em". Conforme usado no presente documento, em com- binação com um valor numérico, o termo "cerca de" se refere a uma faixa de +/- 0,5 do valor numérico, a menos que o termo seja definido especificamente de outra forma no contexto. Por exemplo, a frase um "valor de pH de cerca de 6" se refere aos valores de pH de 5,5 a 6,5, a menos que o valor de pH seja especificamente definido de outra for- ma.

[0035] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados têm seu significado comum no campo científico relevante. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2º edição, John Wiley e Sons, Nova lorque (1994), e Hale & Markham, Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Pe- rennial, NY (1991) fornecem o significado comum de diversos dos ter- mos que descrevem a invenção.

[0036] O termo "atividade de glucoamilase (1,4-alfa-D-glucano glu- co-hidrolase, EC 3.2.1.3)" é definido, no presente documento, como uma atividade enzimática, que catalisa a liberação de D-glicose das extremidades não redutoras de amido ou moléculas de oligo- e polis- sacarídeo relacionadas. A maior parte de glucoamilases são enzimas de multidomínios que consistem em um domínio catalítico conectado a um domínio de ligação de amido por uma região de ligante O- glicosilada de comprimentos variantes. As estruturas de cristal de múl- tiplas glucoamilases foram determinadas e descritas (consultar J. Lee e M. Paetzel 2011. Acta Cryst. Volume 67 páginas 188 a 192 "Structu- re of the catalytic domain of glucoamylase from Aspergillus niger" e J. Sauer et al 2000. Biochem. Et Biophys. Acta Volume 1.542, páginas 275 a 293 "Glucoamylase: structure/function relationships, and protein engineering".

[0037] Os termos "domínio de ligação de amido (SBD) ou módulo de ligação de carboidrato (CBM)" são usados intercambiavelmente no presente documento. SBDs podem ser divididos em nove famílias de CBM. Como uma fonte de energia, o amido é degradado por um gran- de número de várias enzimas amilolíticas. No entanto, apenas cerca de 10% delas têm capacidade para se ligar ao amido bruto e degradar o mesmo. Essas enzimas normalmente têm um módulo de sequência estrutural distinto denominado domínio de ligação de amido que media a ligação aos grânulos de amido. SBD se refere a uma sequência de aminoácidos que se liga, preferencialmente, a um substrato de amido (polissacarídeo) ou um maltossacarídeo, alfa, beta e gama-ciclode- xtrina e semelhantes. As mesmas são, normalmente, motivos de apro- ximadamente 100 resíduos de aminoácido encontrados em cerca de 10% das enzimas amilolíticas microbianas.

[0038] O termo "domínio catalítico (CD)" se refere a uma região estrutural de um polipeptídeo que contém o local ativo para a hidrólise do substrato.

[0039] O termo "hidrolase de glicosídeo" é usado intercambiavel- mente com "glicosidases" e "glicosila hidrolases". Glicosídeo hidrola- ses ajudam na hidrólise de ligações glicosídicas em açúcares comple- xos (polissacarídeos, tais como, sem limitação, amido). Glicosídeo hi- drolases também podem ser classificadas como exoatuantes ou endo- atuantes, dependendo se atuam na extremidade (normalmente não redutora) ou no meio, respectivamente, de uma cadeia de oligo/polis- sacarídeos. Glicosídeo hidrolases também podem ser classificadas por métodos com base em sequência ou estrutura.

[0040] O termo "alimentação" é usado em referência aos produtos que são alimentados aos animais na criação de animais. Os termos "alimentação" e "alimentação de animal" são usados intercambiavel- mente. Em uma modalidade preferencial, o alimento ou alimentação é para consumo por não ruminantes e ruminantes.

[0041] O termo "micróbio alimentado direto" ("DFM"), conforme usado no presente documento, é fonte de micro-organismos de ocor- rência natural vivos (viáveis). Categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias de Ácido Lático e Leveduras. Bacillus são únicos, hastes gram-positivas que formam esporos. Tipos de Bactérias de Ácido Láti- co incluem Bifidobacterium, Lactobacillus e Streptococcus. Leveduras não são bactérias. Esses micro-organismos pertencem ao grupo vege- tal dos fungos.

[0042] O termo "pepsina", conforme usado no presente documen- to, se refere a uma enzima que quebra proteínas em peptídeos meno- res em um pH baixo de 2,0 a 3,5, isto é, é uma protease que pertence à família de peptidase Aspártica A1. É produzida e secretada no estô- mago e é uma das principais enzimas digestivas nos sistemas digesti- vos de seres humanos e animais, em que ajuda a digerir as proteínas em alimento ou alimentação.

[0043] O termo "ruminante" conforme usado no presente docu- mento se refere a um mamífero que é capaz de adquirir nutrientes a partir de alimentos à base de plantas por sua fermentação em um es- tômago especializado antes da digestão, principalmente, através de ações microbianas.

[0044] O termo "câmaras digestivas de um ruminante" como usado neste documento, se refere ao rúmen, retículo, omaso, abomaso e in- testino delgado (McDonald et al., 2011 Animal Nutrition (7º Edição), páginas 156 a 191). O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico.

[0045] O termo "amido granular" se refere a amido em bruto (não cozido), por exemplo, amido que não foi submetido à gelatinização.

[0046] Os termos "enzima de hidrolisação de amido granular (GSH)" e "atividade de hidrolisação de amido granular (GSH)" são uti- lizados indistintamente neste documento e se referem a enzimas que têm a capacidade de hidrolisar amido em forma granular sob condi- ções relevantes do trato digestivo comparáveis às condições encon- tradas no trato digestivo dos animais e, em particular, dos ruminantes.

[0047] O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos sem limitação de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância que inclui, porém, sem limitação, qualquer célula de hospedeiro, enzima, variante, ácido nucleico, prote- ína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais ou todos os constituintes de ocorrência natural com os quais é associado na natureza; (3) qualquer substância modificada pe- la mão do Homem em relação àquela substância encontrada na natu- reza; ou (4) qualquer substância modificada aumentando-se a quanti- dade da substância em relação aos outros componentes com os quais está naturalmente associada. Os termos "molécula de ácido nucleico isolada", "polinucleotídeo isolado" e "fragmento de ácido nucleico iso- lado" serão usados intercambiavelmente e se referem a um polímero de RNA ou DNA que é de fita única ou dupla que contém, opcional- mente, bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas.

[0048] O termo "purificado" conforme aplicado a ácidos nucleicos ou polipeptídeos denota, de modo geral, um ácido nucleico ou polipep- tídeo que é essencialmente isento de outros componentes, conforme determinado por técnicas analíticas bem conhecidas na técnica (por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo purificado forma uma banda discreta em um gel eletroforético, eluato cromatográfico e/ou um meio submetido à centrifugação de gradiente de densidade). Por exemplo, um ácido nucleico ou polipeptídeo que origina essencialmen- te uma banda em um gel eletroforético é "purificado".

[0049] Os termos "peptídeos", "proteínas" e "polipeptídeos" são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a um polímero de aminoácidos unidos juntos por ligações peptídicas. Uma "proteína" ou "polipeptídeo" compreende uma sequência polimé- rica de resíduos de aminoácido. O código de 3 letras e uma única letra para aminoácidos, conforme definido em conformidade com a IUPAC- IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) é usado ao longo desta descrição. Também se entende que um polipeptídeo pode ser codificado por mais de uma sequência de nucleotídeos devi- do à degeneração do código genético.

[0050] O termo forma "madura" de uma proteína, polipeptídeo ou enzima se refere à forma funcional da proteína, polipeptídeo ou enzi- ma sem uma sequência de peptídeo sinal ou uma sequência de pro- peptídeos.

[0051] O termo forma "precursora" de uma proteína ou peptídeo se refere a uma forma da proteína que tem uma prossequência ligada de modo operativo ao terminal amino ou carbonila da proteína. O precur- sor também pode ter uma sequência "sinal" ligada de modo operativo ao terminal amino da prossequência.

[0052] Conforme observado acima, as sequências reguladoras podem ser operacionalmente ligadas na orientação de sentido ou an- tissenso na sequência codificadora/gene de interesse.

[0053] "Promotor" ou "sequências promotoras" se referem às se- quências de DNA que definem onde a transcrição de um gene por RNA polimerase começa. Sequências promotoras estão tipicamente localizadas diretamente a montante ou na extremidade 5' do sítio de iniciação de transcrição. Promotores podem ser derivados, em sua to- talidade, de uma sequência nativa ou de ocorrência natural, ou ser compostos por diferentes elementos derivados de diferentes promoto- res encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que dife- rentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em dife- rentes tecidos ou tipo celular ou em diferentes estágios de desenvol- vimento, ou em resposta às diferentes condições ambientais ou fisio- lógicas ("promotores induzíveis").

[0054] As "sequências de não codificação 3" referem-se a se- quências de DNA localizadas a jusante de uma sequência de codifica- ção e incluem sequências que codificam sinais reguladores com capa- cidade para afetar o processamento de mRNA ou a expressão de ge- ne, tal como terminação de transcrição.

[0055] O termo "transformação", conforme usado no presente do- cumento, se refere à transferência ou introdução de uma molécula de ácido nucleico em um organismo hospedeiro. A molécula de ácido nu- cleico pode ser introduzida como uma forma linear ou circular de DNA. A molécula de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que se replica autonomamente, ou pode se integrar no genoma de um hospedeiro de produção. Hospedeiros de produção que contêm o ácido nucleico transformado são denominados organismos "transformados" ou "re- combinantes" ou "transgênicos" ou "transformantes".

[0056] O termo "recombinante", conforme usado no presente do- cumento, se refere a uma combinação artificial de dois segmentos se- parados de outra forma de sequências de ácido nucleico, por exemplo, através de síntese química ou através da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos através de técnicas de modificação gené- tica. Por exemplo, DNA no qual um ou mais segmentos ou genes fo- ram inseridos, seja naturalmente ou através de manipulação em labo-

ratório, de uma diferente molécula, de outra parte da mesma molécula, ou uma sequência artificial, que resulta na introdução de uma nova sequência em um gene e subsequentemente em um organismo. Os termos "recombinante", "transgênico", "transformado", "modificado ge- neticamente" ou "modificado para expressão de gene exógeno" são usados intercambiavelmente no presente documento.

[0057] Os termos "construto recombinante", "construto de expres- são", "construto de expressão recombinante" e "cassete de expressão" são usados intercambiavelmente no presente documento. Um constru- to recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências reguladoras e de codifica- ção que não são todas encontradas juntas na natureza. Por exemplo, um construto pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, porém, dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construto pode ser usado por si só ou pode ser usado em conjunto com um vetor.

[0058] O termo "percentual de identidade" é uma relação entre du- as ou mais sequências de polipeptídeo ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado comparando-se as se- quências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, como pode ser o caso, conforme determinado pelo número de nucleo- tídeos ou aminoácidos correspondentes entre cadeias de tais sequên- cias. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas através de métodos conhecidos que incluem, porém, sem limitação aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics e Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993);

Computer Analysis of Sequence Data, Part | (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis.

[0059] Conforme usado no presente documento, "% de identidade" ou "percentual de identidade" ou "PID" se referem à identidade de se- quência de proteínas. Percentual de identidade pode ser determinado com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica. Algoritmos úteis incluem os algoritmos BLAST (Consultar, Altschul et al., J Mol Biol, 215:403 a 410, 1990; e Karlin e Altschul, Proc Natl Acad Sci EUA, 90:5.873 a 5.787, 1993). O programa BLAST usa diversos parâmetros de busca, em que a maioria desses é definida em valores-padrão. O algoritmo NCBI BLAST encontra sequências mais relevantes em ter- mos de similaridade biológica, porém, não é recomendado para se- quências de busca menores que 20 resíduos (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 25:3.389 a 3.402, 1997; e Schaffer et al., Nucleic Acids Res, 29:2.994 a 3.005, 2001). Parâmetros BLAST padrão exemplifica- tivos para buscas de sequência de ácido nucleico incluem: Limite de palavras vizinhas = 11; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = NUC.3.1 (correspondência = 1, divergência = 13); Abertura de Vão = 5; e Extensão de Vão = 2. Parâmetros BLAST padrão exemplificativos para buscas de sequência de aminoácidos incluem: Tamanho de pala- vra = 3; Corte de valor E = 10; Matriz de Pontuação = BLOSUMG6?2; Abertura de Vão = 11; e Extensão de Vão = 1. Um valor percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos é determinado pelo núme- ro de resíduos idênticos correspondentes dividido pelo número total de resíduos da sequência de "referência" que inclui quaisquer vãos cria- dos pelo programa para alinhamento ideal/máximo. Algoritmos BLAST se referem à sequência de "referência" como a sequência de "busca".

[0060] Conforme usado no presente documento, "proteínas homó- logas" ou "enzimas homólogas" se refere às proteínas que têm simila- ridade distinta em estrutura primária, secundária e/ou terciária. Homo- logia de proteína pode se referir à similaridade em sequência de ami- noácidos linear quando as proteínas estão alinhadas. Busca homóloga de sequências de proteína pode ser realizada com o uso de BLASTP e PSI-BLAST da NCBI BLAST com limite (corte de valor E) em 0,001. (Altschul SF, Madde TL, Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. Gapped BLAST e PSI BLAST a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1 de setembro de 1997;25(17):3.389 a 3.402). Com o uso dessas informações, as se- quências de proteínas podem ser agrupadas, e uma árvore filogenéti- ca também pode ser construída com o uso das sequências de amino- ácidos. Os alinhamentos de sequência e cálculos de percentual de identidade também podem ser realizados com o uso do programa Me- galign, do programa AlignX, a suíte de software aberto EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276 a 277 (2000)) ou programas similares. Múltiplos alinhamentos das sequências tam- bém podem ser realizados com o uso do método CLUSTAI (tal como CLUSTALW) com os parâmetros-padrão. Parâmetros adequados para alinhamentos de proteína CLUSTALW incluem penalidade de existên- cia de VÃO = 15, Extensão de VÃO = 0,2, matriz = Gonnet (por exem- plo, Gonnet250), proteína ENDGAP = -1, proteína GAPDIST = 4, e KTUPLE = 1.

[0061] Várias sequências de aminoácido e polipeptídeo e sequên- cias de polinucleotídeo são reveladas no presente documento como recursos de determinados aspectos. Variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70 a 85%, 85 a 90%, ou 90% a 95% idênti- cas às sequências reveladas no presente documento podem ser usa-

das em determinadas modalidades. Alternativamente, uma sequência de polipeptídeo variante ou sequência de polinucleotídeos em deter- minadas modalidades pode ter pelo menos 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência revelada no presente docu- mento. A sequência de aminoácidos variante ou sequência de polinu- cleotídeos tem a mesma função das sequências reveladas, ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% da função das sequências reve- ladas.

[0062] Em um aspecto, o polipeptídeo maduro são os aminoácidos 17 a 567 de SEQ ID NO: 1, 18 a 569 de SEQ ID NO: 2 e 28 a 618 de SEQ ID NO: 3 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).

[0063] O termo "ácido nucleico" engloba DNA, RNA, heteroduple- xes e moléculas sintéticas que têm capacidade para codificar um poli- peptídeo. Ácidos nucleicos podem ser de fita única ou fita dupla, e po- dem ser quimicamente modificados. Os termos "ácido nucleico" e "po- linucleotídeo" são usados intercambiavelmente. Devido ao código ge- nético ser degenerado, mais de um códon pode ser usado para codifi- car um aminoácido particular, e as presentes composições e métodos abrangem sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos particular. A menos que seja indicado de outra forma, as sequências de ácido nucleico são apresentadas na orientação de 5' para 3'.

[0064] O termo "sequência de codificação" significa uma sequên- cia de nucleotídeos, que especifica diretamente a sequência de ami- noácidos de seu produto de proteína. Os limites da sequência de codi- ficação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberto, que normalmente começa com o códon de partida ATG ou códons de partida alternativos, tais como GTG e TTG e termina com um códon de parada, tal como TAA, TAG e TGA. A sequência de codificação pode ser uma sequência de DNA, cDNA, sintética ou de nucleotídeos re- combinantes.

[0065] Uma molécula "sintética" é produzida por síntese química ou enzimática in vitro, e não por um organismo.

[0066] Uma "cepa de hospedeiro" ou "célula de hospedeiro" é um organismo no qual um vetor de expressão, fago, vírus, ou outro cons- truto de DNA, que inclui um polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo de interesse (por exemplo, uma amilase) foi introduzido. Cepas de hospedeiro exemplificativas são células de micro-organismo (por exemplo, bactérias, fungos filamentosos, e levedura) que têm capaci- dade para expressar o polipeptídeo de interesse e/ou sacarídeos de fermentação. O termo "célula de hospedeiro" inclui protoplastos cria- dos a partir de células.

[0067] O termo "expressão" se refere ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido com base em uma sequência de ácido nu- cleico. O processo inclui tanto transcrição quanto tradução.

[0068] O termo "produto final" se refere a um álcool, tal como eta- nol, ou um produto bioquímico selecionado a partir do grupo que con- siste em um aminoácido, um ácido orgânico, ácido cítrico, ácido lácti- co, ácido succínico, glutamato monossódico, ácido glicônico, gluconato de sódio, gliconato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta- lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo ômega 3, butanol, lisina, ácido itacônico, 1,3-propanodiol, biodiesel e isopreno.

[0069] O termo "vetor" se refere a uma sequência de polinucleotí- deos projetada para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos celulares. Vetores incluem vetores de clonagem, vetores de expres- são, vetores de vai e vem, plasmídeos, partículas de fago, cassetes e semelhantes.

[0070] Um "vetor de expressão" se refere a um construto de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica um polipeptídeo de interesse, essa sequência de codificação é ligada de modo operati- vo a uma sequência de controle adequada que tem capacidade para efetuar a expressão do DNA em um hospedeiro adequado. Tais se- quências de controle podem incluir um promotor para efetuar a trans- crição, uma sequência de operador opcional para controlar a transcri- ção, uma sequência que codifica sítios de ligação de ribossomo ade- quados no mRNA, aprimoradores e sequências que controlam a termi- nação de transcrição e tradução.

[0071] O termo "sequências de controle" é definido no presente documento de modo a incluir todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou es- tranha à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo ou na- tiva ou estranha umas às outras. Tais sequências de controle incluem, porém, sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequên- cia de propeptídeos, promotor, sequência de peptídeo sinal e termina- dor de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada transcricionais e traducionais. As se- quências de controle podem ser dotadas de ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região de codificação da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo.

[0072] O termo "ligado de modo operativo" significa que compo- nentes especificados estão em uma relação (que inclui, porém, sem limitação, justaposição) que permite aos mesmos funcionar de uma maneira desejada. Por exemplo, uma sequência reguladora é ligada de modo operativo a uma sequência de codificação de modo que a expressão da sequência de codificação esteja sob controle das se-

quências reguladoras.

[0073] Uma "sequência sinal" é uma sequência de aminoácidos ligada à porção de terminal N de uma proteína, que facilita a secreção da proteína fora da célula. A forma madura de uma proteína extracelu- lar carece da sequência sinal, que é clivada durante o processo de se- creção.

[0074] "Biologicamente ativo" se refere a uma sequência tendo uma atividade biológica especificada, tal como atividade enzimática.

[0075] O termo "atividade específica" se refere ao número de mols de substrato que podem ser convertidos em produto por uma enzima ou preparação de enzima por unidade de tempo sob condições especí- ficas. Atividade específica é geralmente expressa em unidades (U)/mg de proteína.

[0076] Conforme usado no presente documento, o termo "ativida- de residual" se refere à razão de atividades com relação a um substra- to medido com e sem incubação em uma condição específica (tal co- mo, sem limitação, temperatura alterada ou pH alterado).

[0077] Os termos, "tipo selvagem", "parental" ou "referência", com relação a um polipeptídeo, se referem a um polipeptídeo de ocorrência natural que não inclui uma substituição, inserção ou deleção feita pelo Homem em uma ou mais posições de aminoácido. De maneira similar, os termos "tipo selvagem", "parental" ou "referência", com relação a um polinucleotídeo, se referem a um polinucleotídeo de ocorrência na- tural que não inclui uma alteração de nucleosídeo feita pelo Homem. No entanto, nota-se que um polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo de tipo selvagem, parental ou de referência não se limita a um po- linucleotídeo de ocorrência natural, e engloba qualquer polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de tipo selvagem, parental ou de referên- cia.

[0078] Os termos "termicamente estável", "termoestável" e "termo-

estabilidade", em referência a uma enzima, se referem à habilidade da enzima em reter a atividade após exposição a uma temperatura eleva- da. A termoestabilidade de uma enzima, tal como uma enzima amila- se, é medida por sua meia vida (t12) dada em minutos, horas, ou dias, durante essa metade a atividade enzimática é perdida sob condições definidas. A meia vida pode ser calculada medindo-se a atividade de amilase residual, por exemplo, depois da exposição a (isto é, desafia- da por) uma temperatura elevada. Os termos "termicamente estável" e "termoestável" significam que pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% ou 98% da enzima que estava presente/ativa no aditivo antes do aquecimento até a tem- peratura especificada ainda está presente/ativa após a mesma resfriar até temperatura ambiente. Preferencialmente, pelo menos cerca de 80% da enzima que está presente e ativa no aditivo antes do aqueci- mento até a temperatura especificada ainda está presente e ativa após a mesma resfriar até temperatura ambiente.

[0079] Uma "gama de pH", com referência a uma enzima, se refe- re à gama de valores de pH sob os quais a enzima exibe atividade ca- talítica.

[0080] Os termos "estável ao pH " e "estabilidade ao pH", com re- ferência a uma enzima, se relacionam com a capacidade da enzima de reter atividade ao longo de uma gama ampla de valores de pH durante um período de tempo predeterminado (p.ex., 15 min., 30 min., 1 hora).

[0081] A frase "sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)" se refere a um processo na produção de produtos bioquímicos em que um organismo microbiano, tal como um micro-organismo etanologêni- co, e pelo menos uma enzima, tal como uma amilase, estão presentes durante a mesma etapa de processo. SSF inclui a hidrólise contempo- rânea de substratos de amido (granular, liquefeito ou solubilizado) em sacarídeos, que incluem glicose, e a fermentação dos sacarídeos em álcool ou outro produto bioquímico ou biomaterial no mesmo frasco de reator.

[0082] Uma "pasta fluida" é uma mistura aquosa que contém grâ- nulos de amido insolúveis em água.

[0083] O termo "teor de açúcar total" se refere ao teor de açúcar solúvel total presente em uma composição de amido que inclui mo- nossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

[0084] O termo "sólidos secos" (ds) se refere aos sólidos secos dissolvidos em água, sólidos secos dispersos em água ou uma combi- nação de ambos. Sólidos secos, assim, incluem amido granular, e seus produtos de hidrólise que incluem glicose.

[0085] "Teor de sólido seco" se refere à porcentagem de sólidos secos tanto dissolvidos quanto dispersos como uma porcentagem em peso com relação à água na qual os sólidos secos estão dispersos e/ou dissolvidos. O teor de sólido seco inicial de amido é o peso de amido granular corrigido para o teor de umidificação sobre o peso de granular amido mais o peso de água. Teor de sólido seco subsequente pode ser determinado a partir do teor inicial ajustado para qualquer quantidade de água adicionada ou perdida e para ganho químico. Teor de sólido seco dissolvido subsequente pode ser medido a partir do ín- dice de refração, conforme indicado abaixo. 8

[0086] O termo "alto DS" se refere à pasta fluida de amido aquoso com um teor de sólido seco maior que 38% (p/p).

[0087] "Amido de substância seca" se refere ao teor de amido se- co de um substrato, tal como uma pasta fluida de amido, e pode ser determinado subtraindo-se da massa do substrato qualquer contribui- ção de componentes diferentes de amido, tal como proteína, fibra e água. Por exemplo, se uma pasta fluida de amido granular tem um teor de água de 20% (p/p), e um teor de proteína de 1% (p/p), então, 100 kg de amido granular tem um teor de amido seco de 79 kg. Amido de substância seca pode ser usado na determinação de quantas unida- des de enzimas usar.

[0088] "Liquefeito" se refere ao produto de cozimento (aquecimen- to) e liquefação (redução de viscosidade) de um amido ou pasta fluida de grão que contém amido (mistura).

[0089] "Liquefação" ou "liquefazer" se refere a um processo atra- vés do qual o amido (ou grãos que contêm amido) é convertido em dextrinas de cadeia mais curta e dextrinas menos viscosas.

[0090] "Grau de polimerização (DP)" se refere ao número (n) de unidades de anidroglucopiranose em um dado sacarídeo. Exemplos de DP1 são os monossacarídeos, tais como glicose e frutose. Exemplos de DP2 são os dissacarídeos, tais como maltose e sacarose. Um DP4+ (>DP3) denota polímeros com um grau de polimerização maior que 3.

[0091] O termo "em contato com" se refere à colocação dos referi- dos componentes (que incluem, porém, sem limitação, enzimas, subs- tratos e organismos de fermentação) em proximidade suficientemente estreita para afetar um resultado esperado, tal como a enzima que atua sobre o substrato ou o organismo de fermentação que fermenta um substrato. Aqueles versados na técnica reconhecerão que misturar as soluções pode promover "contato".

[0092] Um "micro-organismo etanologênico" refere-se a um micro- organismo com a capacidade para converter um açúcar ou outros car- boidratos em etanol.

[0093] O termo "produtos bioquímicos" refere-se a um metabólito de um micro-organismo, como ácido cítrico, ácido lático, ácido succíni- co, glutamato monossódico, ácido glucônico, gluconato de sódio, glu- conato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta-lactona, eritor- bato de sódio, ácido graxo de ômega 3, butanol, iso-butanol, um ami- noácido, lisina, ácido itacônico, outros ácidos orgânicos, 1,3-propano-

diol, vitaminas, ou isopreno ou outro biomaterial.

[0094] O termo "cerca de" se refere a + 15% em relação ao valor referenciado.

[0095] As seguintes abreviações/acrônimos têm os seguintes signi- ficados, a não ser que especificado de outro modo: ECcomissão de enzima CAZyenzima ativa de carboidrato p/vpeso/volume p/ppeso/peso v/ivvolume/volume % em pesopor cento em peso ºCGraus centígrados g ou gmgrama upomicrograma mgmiligrama kgquilograma ul e ulmicrolitro ml e ml mililitro mmmilímetro ummicrômetro molmol mmolmilimol Mmolar mMmilimolar uMmicromolar nmnanômetro Uunidade Ppmpartes por milhão hr e hhora

[0096] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que têm, preferencialmente, pelo menos 83%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e ainda pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipeptídeo da SEQ ID NO: 7, 8 ou 9, e que tem atividade de glucoamilase.

[0097] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são os polipeptídeos homólogos que compreendem sequên- cias de aminoácidos que diferem em dez aminoácidos, preferencial- mente, em nove aminoácidos, preferencialmente, em oito aminoáci- dos, preferencialmente, em sete aminoácidos, preferencialmente, em seis aminoácidos, preferencialmente, em cinco aminoácidos, com mais preferência, em quatro aminoácidos, ainda com mais preferência, em três aminoácidos, com máxima preferência, em dois aminoácidos, e ainda com máxima preferência, em um aminoácido do polipeptídeo da SEQ ID NO: 7, 8 ou 9.

[0098] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são as variantes de polipeptídeo de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9, ou um fragmento das mesmas que tem atividade de glucoamilase.

[0099] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são as regiões catalíticas que compreendem os aminoácidos 17 a 470 de SEQ ID NO: 1, 18 a 472 de SEQ ID NO: 2 ou 28 a 500 de SEQ ID NO: 3 previsto por ClustalX https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pu- bmed/17846036.

[00100] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são estáveis em pH baixo e retêm atividade de glucoamilase em pH baixo. Os polipeptídeos da presente invenção demonstraram estabilidade de pH baixo em valores de pH na faixa de cerca de 2,0 a cerca de 5,0 (por exemplo, cerca de 2,0 a cerca de 4,0, cerca de 2,0 a cerca de 3,0, cerca de 2,0 a cerca de 2,5, etc). Por exemplo, em pH 2,0 a cerca de 3,0, os polipeptídeos da presente invenção retêm a maios parte da atividade glucogênica por um período de tempo pro- longado em alta temperatura (por exemplo, pelo menos 40 ºC, pelo menos 50 “ºC, pelo menos 55 ºC, pelo menos 60 ºC, pelo menos 65 ºC, pelo menos 70 ºC ou uma temperatura superior) e, por exemplo, por pelo menos 4 horas, pelo menos 17 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, ou mesmo por mais tem- po.

[00101] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção têm melhor desempenho de sacarificação em comparação com (uma glucoamilase de Aspergillus niger) ANGA, em um pH de cerca de 3, ou mesmo em um pH de cerca de 2, em uma faixa de tem- peratura de cerca de 30 a cerca de 70 ºC, (por exemplo, cerca de 30 ºC a cerca de 60 ºC, cerca de 40 “ºC a cerca de 60 ºC, etc.) com o tempo de incubação de pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, ou mesmo mais longo.

[00102] Em algumas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados no processo de sacarificação e fermenta- ção simultâneas (SSF) ou fermentação de pH baixo em comparação com os atuais produtos de glucoamilase comercialmente disponíveis, em um pH de cerca de 3, ou mesmo em um pH de cerca de 2, em uma faixa de temperatura de cerca de 30 ºC a cerca de 70 ºC, (por exem- plo, cerca de 30 ºC a cerca de 60 ºC, cerca de 30 ºC a cerca de 50 ºC, etc.) com tempo de incubação por pelo menos 17 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, ou mesmo mais longo.

[00103] Em um segundo aspecto, as presentes glucoamilases com- preendem substituição conservadora de um ou diversos resíduos de aminoácido com relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

7, 8 ou 9. Substituições de aminoácido conservadoras exemplificativas são listadas na Tabela 1. Algumas mutações conservadoras podem ser produzidas através de manipulação genética, enquanto outras são produzidas introduzindo-se aminoácidos sintéticos em um polipeptídeo através de outros meios. Tabela 1. Substituições de aminoácido conservadoras Arginina D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, A a BatomanDa | [assegna — | N oa As DAS Gu DON GR DR — | [Aedo aspárico |O Ap DAN A GI DGI GR DG | [amenms — a oca DAR UDONARDAR — | [Fio cmamco TE GM DA Asp Am Am Bh GR [ss TT eva ova Ta Ta Te Lisina K D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D- A O loMonDon o era TM [estes e Die Lea Dieu VaLOSA | Fenilalanina F D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4, ou 5-fenilprolina, cis-3,4, ou 5-fenilprolina Prolina D-Pro, ácido L-I-tioazolidino-4-carboxílico, D- ou A lcanaenatate | Serina Ss D-Ser, Thr, D-Thr, alo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D- E loose Treonina T D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, Dn losemooweowow — |

[00104] Em algumas modalidades, a presente glucoamilase com-

preende uma deleção, substituição, inserção, ou adição de um ou al- guns resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 ou uma sequência homóloga da mesma. Em algumas modalidades, as presentes glucoamilases são derivadas da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 através de substi- tuição conservadora de um ou diversos resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, as presentes glucoamilases são derivadas da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 através da dele- ção, substituição, inserção, ou adição de um ou alguns resíduos de aminoácido em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9. Em todos os casos, a expressão "um ou alguns resíduos de aminoácido" se refere a 10 ou menos, isto é, 1, 2, 3,4, 5,6,7,8,9 ou 10, resíduos de aminoácido. As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 po- dem ser de no máximo 10, preferencialmente no máximo 9, mais pre- ferencialmente no máximo 8, mais preferencialmente no máximo 7, mais preferencialmente no máximo 6, mais preferencialmente no má- ximo 5, mais preferencialmente no máximo 4, ainda mais preferenci- almente no máximo 3, com máxima preferência no máximo 2 e ainda com máxima preferência no máximo 1.

[00105] —Alternativamente, as alterações de aminoácido são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, alterações de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de subs- trato, alterar o pH ideal e semelhantes.

[00106] Substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido úni- cas ou múltiplas podem ser feitas e testadas com o uso de métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, se- guido por um procedimento de exame relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57;

Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86: 2.152 a 2.156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usa- dos incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10.832 a 10.837; Documento de Patente nº U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese de região direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[00107] Métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser com- binados com alto rendimento, métodos de exame automáticos para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados clonados expres- sos por células de hospedeiro (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). Moléculas de DNA mutagenizado que codificam poli- peptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células de hos- pedeiro e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos-padrão na técnica. Esses métodos permitem a rápida determinação da impor- tância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados em polipeptídeos de estrutura des- conhecida.

[00108] A glucoamilase pode ser um polipeptídeo "quimérico" ou "híbrido", visto que inclui pelo menos uma porção de uma primeira glu- coamilase, e pelo menos uma porção de uma segunda amilase, gluco- amilase, beta-amilase, alfa-glucosidase ou outras enzimas degradado- ras de amido, ou ainda outras glicosil hidrolases, como, sem limitação, celulases, hemicelulases, etc. (incluindo tais amilases quiméricas fo- ram recentemente "redescobertas" como amilases de troca de domí- nio). As presentes glucoamilases podem incluir, adicionalmente, se- quência sinal heteróloga, um epítopo para permitir rastreamento ou purificação, ou semelhantes.

[00109] As presentes glucoamilases podem ser produzidas em cé- lulas de hospedeiro, por exemplo, através de secreção ou expressão intracelular. Um material de célula cultivada (por exemplo, um caldo de célula inteira) que compreende uma glucoamilase pode ser obtido ao depois da secreção da glucoamilase no meio celular. Opcionalmente, a glucoamilase pode ser isolada das células de hospedeiro, ou mesmo isolada do caldo de célula, dependendo da pureza desejada da gluco- amilase final. Um gene que codifica uma glucoamilase pode ser clona- do e expresso de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Células de hospedeiro adequadas incluem células bacterianas, fúngi- cas (que incluem levedura e fungos filamentosos), e vegetais (que in- cluem algas). Células de hospedeiro particularmente úteis incluem As- pergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesi ou Myceliopthora thermophila. Outras células de hospedeiro incluem células bacteria- nas, por exemplo, Bacillus subtilis ou B. licheniformis, assim como Streptomyces.

[00110] — Adicionalmente, o hospedeiro pode expressar uma ou mais enzimas auxiliares, proteínas, peptídeos. Esses podem beneficiar a liquefação, sacarificação, fermentação, SSF, e processos a jusante. Ademais, a célula de hospedeiro pode produzir etanol e outros produ- tos bioquímicos ou biomateriais além das enzimas usadas para digerir várias matérias-primas. Tais células de hospedeiro podem ser úteis para processos de fermentação ou processos de fermentação e saca- rificação simultâneas para reduzir ou eliminar a necessidade de adici- onar enzimas.

[00111] Um construto de DNA que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de glucoamilase pode ser construído de modo que seja adequado para ser expresso em uma célula de hospe- deiro. Devido à degeneração conhecida no código genético, diferentes polinucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos idênti- ca podem ser projetados e produzidos com a habilidade de rotina. Também se sabe que, dependendo das células de hospedeiro deseja-

das, a otimização de códon pode ser necessária antes de tentar a ex- pressão.

[00112] Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de gluco- amilase da presente descrição pode ser incorporado em um vetor. Ve- tores podem ser transferidos para uma célula de hospedeiro com o uso de técnicas de transformação conhecidas, tais como aquelas reve- ladas abaixo.

[00113] Um vetor adequado pode ser um que pode ser transforma- do em e replicado dentro de uma célula de hospedeiro. Por exemplo, um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica um polipep- tídeo de glucoamilase da presente descrição pode ser transformado e replicado em uma célula de hospedeiro bacteriana como um meio para propagar e amplificar o vetor. O vetor também pode ser adequada- mente transformado em um hospedeiro de expressão, de modo que o polinucleotídeo de codificação seja expresso como uma enzima gluco- amilase funcional.

[00114] Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de gluco- amilase da presente invenção pode ser ligado de modo operativo a um promotor, que permite a transcrição na célula de hospedeiro. O promo- tor pode ser qualquer sequência de DNA que mostra atividade trans- cricional na célula de hospedeiro de escolha e pode ser derivada dos genes que codificam proteínas sejam homólogas ou heterólogas à cé- lula de hospedeiro.

[00115] A sequência de codificação pode ser ligada de modo opera- tivo a uma sequência sinal. O DNA que codifica a sequência sinal po- de ser uma sequência de DNA naturalmente associada ao gene de glucoamilase de interesse a ser expresso, ou pode ser de um gênero ou espécie diferente da glucoamilase. Uma sequência sinal e uma se- quência promotora que compreendem um construto ou vetor de DNA podem ser introduzidas em uma célula de hospedeiro fúngica e podem ser derivadas da mesma fonte. Por exemplo, a sequência sinal pode ser a sequência sinal de Trichoderma reesei cbh1, que é ligada de modo operativo a um promotor cbh1.

[00116] Um vetor de expressão também pode compreender um terminador de transcrição adequado e, em eucariontes, as sequências de poliadenilação ligadas de modo operativo à sequência de DNA que codificam uma glucoamilase. Sequências de terminação e poliadenila- ção podem ser adequadamente derivadas das mesmas fontes que o promotor.

[00117] O vetor também pode compreender um marcador selecio- nável, por exemplo, um gene que o produto do mesmo complementa um defeito na célula de hospedeiro isolada, tais como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou um gene que confere resistência an- tibiótica, tal como, por exemplo, resistência à ampicilina, canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Ademais, o vetor pode compreender mar- cadores de seleção de Aspergillus, tais como amad'S, argB, e niaD um marcador que origina resistência à higromicina, ou a seleção pode ser realizada por cotransformação, tal como conhecida na técnica. Consul- tar, por exemplo, Pedido PCT Internacional Publicado nº WO 91/17243.

[00118] A expressão intracelular pode ser vantajosa em alguns as- pectos, por exemplo, ao usar determinadas bactérias ou fungos como células de hospedeiro para produzir grandes quantidades de alfa- glucosidase para enriquecimento ou purificação subsequente. Alterna- tivamente, a secreção extracelular de glucoamilase no meio de cultura também pode ser usado para produzir um material celular cultivado que compreende a glucoamilase isolada.

[00119] Os procedimentos usados para ligar o construto de DNA que codifica uma glucoamilase, o promotor, terminador e outros ele- mentos, respectivamente, e para inserir os mesmos nos vetores ade-

quados que contêm as informações necessárias para replicação, são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e estão prontamente disponíveis. Consultar, por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2º edição, Cold Spring Harbor, 1989, e 3º edição, 2001.

[00120] Uma célula isolada, que compreende um construto de DNA ou um vetor de expressão, é vantajosamente usada como uma célula de hospedeiro na produção recombinante de uma glucoamilase. A cé- lula pode ser transformada com o construto de DNA que codifica a en- zima, convenientemente integrando-se o construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo hospedeiro. Essa integração é geral- mente considerada como uma vantagem, na medida em que a se- quência de DNA é mais propensa a ser mantida de maneira estável na célula. Integração dos construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, por exem- plo, através de recombinação homóloga ou heteróloga. Alternativa- mente, a célula pode ser transformada com o vetor de expressão em combinação com os diferentes tipos de células de hospedeiro.

[00121] Os exemplos de organismos hospedeiros bacterianos ade- quados são espécies bacterianas Gram-positivas, tal como Bacillace- ae, incluindo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus (anteriormente Bacillus) stearothermophi- lus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagu- lans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium e Bacillus thuringiensis; es- pécies de Streptomyces, tal como Streptomyces murinus; espécies bacterianas produtoras de ácido láctico, incluindo Lactococcus sp., tal como Lactococcus lactis; Lactobacillus sp., incluindo Lactobacillus reu- teri, Leuconostoc sp.; Pediococcus sp.; eStreptococcus sp. Alternati- vamente, cepas de uma espécie bacteriana Gram-negativa que per- tence a Enterobacteriaceae, incluindo E. coli, ou a Pseudomonadace-

ae podem ser selecionadas como o organismo hospedeiro.

[00122] “Um organismo hospedeiro de levedura adequado pode ser selecionado a partir das espécies de leveduras biotecnologicamente relevantes, tais como, porém, sem limitação, espécies de levedura, tais como Pichia sp., Hansenula sp., ou Kluyveromyces, Yarrowinia, espécie Schizosaccharomyces ou uma espécie de Saccharomyces, que inclui Saccharomyces cerevisiae ou uma espécie que pertence aos Schizosaccharomyces, tal como, por exemplo, espécie S. pombe. Uma cepa da espécie de levedura metilotrófica, Pichia pastoris, pode ser usada como o organismo hospedeiro. Alternativamente, o orga- nismo hospedeiro pode ser uma espécie de Hansenula.

[00123] Organismos hospedeiros adequados dentre fungos fila- mentosos incluem as espécies de Aspergillus, por exemplo, Asper- gillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awarmori, ou Aspergillus nidulans. Alternativamente, cepas de uma es- pécie de Fusarium, por exemplo, Fusarium oxysporum ou de uma es- pécie de Rhizomucor, tal como Rhizomucor miehei pode ser usada como o organismo hospedeiro. Outras cepas adequadas incluem es- pécies Thermomyces e Mucor. Além disso, Trichoderma sp. pode ser usada como um hospedeiro. Uma glucoamilase expressa por uma cé- lula de hospedeiro fúngica pode ser glicosilada, isto é, compreenderá uma porção química de glicosila. O modelo de glicosilação pode ser igual ou diferente ao presente na glucoamilase de tipo selvagem. O tipo e/ou grau de glicosilação podem transmitir alterações nas proprie- dades enzimáticas e/ou bioquímicas.

[00124] É vantajoso deletar genes de hospedeiros de expressão, quando a deficiência genética pode ser curada pelo vetor de expres- são transformado. Métodos conhecidos podem ser usados para obter uma célula de hospedeiro fúngica que tem um ou mais genes inativa- dos. Qualquer gene de um hospedeiro Trichoderma sp. ou outro hos-

pedeiro fúngico filamentoso que foi clonado pode ser deletado, por exemplo, genes cbh1, cbh2, egl1, e egl2. A deleção de gene pode ser realizada inserindo-se uma forma do gene desejado a ser inativado em um plasmídeo através de métodos conhecidos na técnica.

[00125] Introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula de hospedeiro inclui técnicas, tais como transformação; eletroporação; microinjeção nuclear; transdução; transfecção, por exemplo, lipofecção mediada e transfecção mediada por DEAE-Dextrina; incubação com precipitado de DNA de fosfato de cálcio; bombardeamento em alta ve- locidade com microprojéteis de DNA revestido; e fusão de protoplasto. Técnicas de transformação geral são conhecidas na arte. Consultar, por exemplo, Sambrook et al. (2001), supra. A expressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita, por exemplo, no documento de Patente nº U.S. 6.022.725. Referência também é feita ao Cao et al. (2000) Science 9:991 a 1001 para transformação de cepas de Asper- gillus. Transformantes geneticamente estáveis podem ser construídos com sistemas vetoriais, em que o ácido nucleico que codifica uma alfa- glucosidase é integrada de maneira estável em um cromossomo de célula de hospedeiro. Transformantes são, então, selecionados e puri- ficados através de técnicas conhecidas.

[00126] Um método para produzir uma glucoamilase pode compre- ender cultivar uma célula hospedeira sob condições conducentes para a produção da enzima e recuperar a enzima das células e/ou meio de cultura.

[00127] O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para cultivar a célula de hospedeiro e obter expressão de um polipeptídeo de glucoamilase. Meios e compo- nentes de meios adequados estão disponíveis a partir dos fornecedo- res comerciais ou podem ser preparados de acordo com as receitas publicadas (por exemplo, conforme descrito nos catálogos da Ameri-

can Type Culture Collection).

[00128] “Qualquer um dos métodos de fermentação bem conhecidos na técnica pode ser usado adequadamente para fermentar a cepa transformada ou a cepa fúngica derivada, conforme descrito acima. Em algumas modalidades, as células fúngicas são cultivadas sob con- dições de fermentação em batelada ou contínua.

[00129] As técnicas de separação e concentração são conhecidas na técnica, e métodos convencionais podem ser usados para preparar um caldo ou solução concentrada que compreende um polipeptídeo de glucoamilase da invenção.

[00130] Após fermentação, um caldo de fermentação é obtido, as células microbianas e vários sólidos suspensos, que incluem materiais de fermentação brutos residuais, são removidos através de técnicas de separação convencionais, de modo a obter uma solução de gluco- amilase. Filtração, centrifugação, microfiltração, filtração de tambor de vácuo giratório, ultra filtração, centrifugação seguida por ultra filtração, extração ou cromatografia, ou semelhantes, são geralmente usadas.

[00131] Pode ser, por vezes, desejável para concentrar uma solu- ção ou caldo que compreende um polipeptídeo de glucoamilase para otimizar recuperação. Uso de soluções ou caldo não concentrados aumentariam, tipicamente, tempo de incubação de modo a coletar o precipitado de enzima enriquecido ou purificado.

[00132] A presente invenção também se refere às composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Em algumas modalidades, um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem preferencialmente pelo menos 83%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo me- nos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e, ainda, pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos ao polipeptídeo de SEQ ID NO: 7, 8, ou 9, e que tem ati-

vidade de glucoamilase também pode ser usado na composição de enzima. Preferencialmente, as composições são formuladas para for- necer características desejáveis, tais como pouca cor, pouco odor e estabilidade de armazenamento aceitável. polipeptídeos.

[00133] A composição pode compreender um polipeptídeo da pre- sente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição de monocomponente. Alternativamente, a composi- ção pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, como uma aminopeptidase, amilase, carbo-hidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxirri- bonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, alfa- glucosidase, beta-glucosidase, beta-amilase, isoamilase, haloperoxi- dase, invertase, lacase, lipase, lisozima, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, pululanase, ribonuclease, transglutaminase, xila- nase ou uma combinação das mesmas, que podem ser adicionadas em quantidades eficazes bem conhecidas pelos versados na técnica.

[00134] As composições de polipeptídeo podem ser preparadas em conformidade com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, as composi- ções que compreendem as presentes glucoamilases podem ser formu- lações aquosas ou não aquosas, grânulos, pós, géis, pastas fluidas, pastas, etc., que podem compreender, adicionalmente, qualquer uma ou mais das enzimas adicionais listadas, no presente documento, jun- tamente com tampões, sais, conservantes, água, cossolventes, tenso- ativos e semelhantes. Tais composições podem funcionar em combi- nação com enzimas endógenas ou outros ingredientes já presentes em uma pasta fluida, banho de água, máquina de lavar, produto ali- mentar ou bebida, etc, por exemplo, enzimas vegetais endógenas (que incluem algas), enzimas residuais de uma etapa de processamento anterior, e semelhantes. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado em conformidade com os métodos conhecidos na técnica.

[00135] A composição pode ser células que expressam o polipeptí- deo que inclui células que têm capacidade para produzir um produto a partir da fermentação. Tais células podem ser fornecidas em um cre- me ou em forma seca juntamente com estabilizadores adequados. Tais células podem expressar, adicionalmente, polipeptídeos adicio- nais, tais como aqueles mencionados, acima.

[00136] Exemplos de usos preferenciais dos polipeptídeos ou com- posições da invenção são dados abaixo. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a com- posição é usada podem ser determinadas com base nos métodos co- nhecidos na técnica.

[00137] A presente invenção também é direcionada ao uso de um polipeptídeo ou composição da presente invenção em um processo de liquefação, sacarificação e/ou fermentação. O polipeptídeo ou compo- sição pode ser usado em um processo único, por exemplo, em um processo de liquefação, um processo de sacarificação ou um processo de fermentação. O polipeptídeo ou composição também pode ser usa- do em uma combinação de processos, por exemplo, em um processo de liquefação e sacarificação, em um processo de liquefação e fer- mentação, ou em um processo de sacarificação e fermentação, prefe- rencialmente em relação à conversão de amido.

[00138] O amido liquefeito pode ser sacarificado em um xarope rico em sacarídeos de DP inferior (por exemplo, DP1 + DP2), com o uso de alfa-amilases e glucoamilases, opcionalmente na presença de outra enzima (ou enzimas). A composição exata dos produtos de sacarifica- ção depende da combinação de enzimas usadas, assim como o tipo de amido processado. Vantajosamente, o xarope obtenível com o uso das glucoamilases fornecidas pode conter um percentual de peso de DP2 dos oligossacarídeos totais no amido sacarificado que excede 30%, por exemplo, 45% a 65% ou 55% a 65%. O percentual de peso de (DP1 + DP2) no amido sacarificado pode exceder cerca de 70%, por exemplo, 75% a 85% ou 80% a 85%.

[00139] Enquanto a liquefação é executada, de modo geral, como um processo contínuo, a sacarificação é frequentemente conduzida como um processo em batelada. Condições de sacarificação são de- pendentes da natureza do liquefeito e do tipo de enzimas disponíveis. Em alguns casos, um processo de sacarificação pode envolver tempe- raturas de cerca de 60 a 65 ºC e um pH de cerca de 4,0 a 4,5, por exemplo, pH 4,3. Sacarificação pode ser realizada, por exemplo, em uma temperatura entre cerca de 40 ºC, cerca de 50 ºC, ou cerca de 55 ºC e cerca de 60 ºC ou cerca de 65 ºC, que necessita resfriamento do liquefeito. O pH também pode ser ajustado conforme necessário. Sa- carificação é normalmente conduzida em tanques agitados, que pode demorar muitas horas para encher ou esvaziar. Enzimas são tipica- mente adicionadas em uma razão fixada para sólidos secos, conforme os tanques são enchidos, ou adicionadas como uma dose única no começo do estágio de enchimento. Uma reação de sacarificação para produzir um xarope é tipicamente executada durante cerca de 24 a 72 horas, por exemplo, 24 a 48 horas. No entanto, é comum realizar ape- nas uma pré-sacarificação de, tipicamente, 40 a 90 minutos em uma temperatura entre 30 e 65 ºC, tipicamente cerca de 60 ºC, seguida por sacarificação completa em um processo de sacarificação e fermenta- ção simultâneas (SSF). Em uma modalidade, um processo da inven- ção inclui pré-sacarificar material que contém amido antes do processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). A pré-sacarificação pode ser realizada em uma alta temperatura (por exemplo, 50 a 85 ºC, preferencialmente 60 a 75 ºC) antes de se mover para SSF. Preferen-

cialmente, a sacarificação é conduzida de maneira ideal em uma faixa de temperatura superior de cerca de 30 ºC a cerca de 75 ºC, por exemplo, 45 ºC a 75 ºC ou 50 ºC a 75 ºC. Conduzindo-se o processo de sacarificação em temperaturas maiores, o processo pode ser reali- zado em um período de tempo mais curto ou, alternativamente, o pro- cesso pode ser realizado com o uso de dosagem de enzima inferior. Ademais, o risco de contaminação microbiana é reduzido ao assumir o processo de liquefação e/ou sacarificação em temperatura superior.

[00140] Em um aspecto preferencial da presente invenção, a lique- fação e/ou sacarificação inclui processos de liquefação e sacarificação realizados de modo sequencial ou simultâneo.

[00141] O hidrolisado de amido solúvel, particularmente um xarope rico em glicose, pode ser fermentado colocando-se o hidrolisado de amido em contato com um organismo de fermentação, tipicamente em uma temperatura de cerca de 32 ºC, tal como de 30 ºC a 35 ºC. "Or- ganismo de fermentação" se refere a qualquer organismo que inclui organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um pro- cesso de fermentação e que tem capacidade para produzir um produto de fermentação desejado. Organismos de fermentação especialmente adequados têm capacidade para fermentar, isto é, converter, açúca- res, tais como glicose ou maltose, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Exemplos de organismos de fermentação incluem levedura, tais como Saccharomyces cerevisiae e bactérias, por exemplo, Zymomonas mobilis, que expressam álcool desidroge- nase e piruvato descarboxilase. O micro-organismo etanologênico po- de expressar xilose redutase e xilitol desidrogenase, que convertem xilose em xilulose. Cepas melhoradas de micro-organismos etanolo- gênicos, que podem suportar temperaturas superiores, por exemplo, são conhecidas na técnica e podem ser usadas. Consultar Liu et al. (2011) Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 27:1049 a 1056. Levedura comercialmente disponível inclui, por exemplo, Red Star(TM)/Lesaffre Ethanol Red (disponível pela Red Star/Lesaffre, EUA) FALI (disponível pela Fleischmann's Yeast, uma divisão da Burns Philp Food Inc., EUA), SUPERSTART (disponível pela Alltech), GERT STRAND (dis- ponível pela Gert Strand AB, Suécia), SYNERXIAO ADY (disponível pela DuPont), SYNERXIA & THRIVE (disponível pela DuPont), FER- MIOL (disponível pela DSM Specialties). A temperatura e o pH da fer- mentação dependerão do organismo de fermentação. Micro- organismos que produzem outros metabólitos, tais como ácido cítrico e ácido lático, através de fermentação também são conhecidos na técni- ca. Consultar, por exemplo, Papagianni (2007) Biotechnol. Adv. 25:244 a 263; John et al. (2009) Biotechnol. Adv. 27:145 a 152.

[00142] Os processos de sacarificação e fermentação podem ser realizados como um processo de SSF. Um processo de SSF pode ser conduzido com células fúngicas que expressam e secretam glucoami- lase continuamente ao longo da SSF. As células fúngicas que expres- sam glucoamilase também podem ser o micro-organismo de fermenta- ção, por exemplo, um micro-organismo etanologênico. Produção de etanol, assim, pode ser realizada com o uso de uma célula fúngica que expressa glucoamilase suficiente de modo que nenhuma ou pouca en- zima tenha que ser adicionada exogenamente. A célula de hospedeiro fúngica pode ser de uma cepa fúngica apropriadamente modificada geneticamente. Células de hospedeiro fúngicas que expressam e se- cretam outras enzimas, além da glucoamilase, também podem ser usadas. Tais células podem expressar amilase e/ou a pululanase, fi- tase, alfa-glucosidase, isoamilase, beta-amilase celulase, xilanase, ou- tras hemicelulases, protease, beta-glucosidase, pectinase, esterase, enzimas redox, transferase ou outras enzimas. Fermentação pode ser seguida por recuperação subsequente de etanol.

[00143] Em conformidade com a presente invenção, a fermentação inclui, sem limitação, processos de fermentação usados para produzir álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido lático, áci- do glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO;>); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exem- plo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em tal modalidade preferencial, o processo é tipicamente realizado em uma temperatura entre 28 ºC e 36 ºC, tal como entre 29 ºC e 35 ºC, tal como entre 30 ºC e 34 ºC, tal como em torno de 32 ºC, em um pH na faixa entre 3 e 7, preferencialmente de pH 3,5 a 6, ou mais preferencialmente de pH 4 ao.

[00144] Em outras modalidades, valores de pH baixo minimizarão o risco de contaminação, visto que organismos de competição não têm mais capacidade para crescer. O processo de fermentação da inven- ção pode ser realizado em pH baixo, por exemplo, fermentação de ácidos orgânicos, conforme organismos de fermentação, tipicamente, diminuem o pH rapidamente para cerca de 4,0 a 4,5, e alguns dos lac- tobacilos diminuem ainda o pH para cerca de 3,5. A quantidade de ácido lático livre presente em uma solução (por exemplo, pelo menos cerca de 50 g/l, preferencialmente pelo menos cerca de 80 g/l, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 100 g/|I de lactato) resulta em um pH relativamente baixo. Quanto maior a porcentagem do lactato que está presente em sua forma de ácido livre, menor o pH de solu- ção. Por exemplo, quando o pH do meio é igual ao pKa do ácido lático (cerca de 3,8), 50% do lactato está presente na forma de ácido livre. Em pH 4,2, cerca de 31% do lactato como um ácido livre e em pH 4,0 e 3,9, cerca de 41% e 47%, respectivamente.

[00145] A presente invenção fornece um uso da glucoamilase (ou glucoamilases) da invenção para produzir glicose e outros sacarídeos a partir de amido bruto ou amido granular. De modo geral, glucoamila- se da presente invenção sozinho ou na presença de uma alfa-amilase pode ser usada em processo de hidrólise de amido bruto (RSH) ou hi- drólise de amido granular (GSH) para produzir açúcares desejados e produtos de fermentação. O amido granular é solubilizado através de hidrólise enzimática abaixo da temperatura de gelatinização. Tais sis- temas de "baixa temperatura" (também conhecidos como "sem cozi- mento" ou "cozimento frio") foram relatados com capacidade para pro- cessar concentrações superiores de sólidos secos aos sistemas con- vencionais (por exemplo, até 45%).

[00146] Um processo de "hidrólise de amido bruto" (RSH) se difere dos processos de tratamento de amido convencionais que incluem, sacarificar e fermentar sequencial ou simultaneamente amido granular na ou abaixo da temperatura de gelatinização do substrato de amido tipicamente na presença de pelo menos uma glucoamilase e/ou amila- se. Amido aquecido em água começa a gelatinizar entre 50 º*C e 75 ºC, a temperatura exata de gelatinização depende do amido especiífi- co. Por exemplo, a temperatura de gelatinização pode variar de acordo com a espécie vegetal, com a variedade particular das espécies vege- tais, assim como com as condições de crescimento. No contexto desta invenção, a temperatura de gelatinização de um dado amido é a tem- peratura na qual birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de ami- do com o uso do método descrito por Gorinstein. S. e Lii. C., Starch/Starke, Volume 44 (12), páginas 461 a 466 (1992).

[00147] A glucoamilase da invenção também pode ser usada em combinação com uma enzima que hidrolisa apenas ligações alfa-(1,6)- glucosídicas em moléculas que compreendem pelo menos quatro re- síduos de glucosila. Preferencialmente, a glucoamilase da invenção é usada em combinação com pululanase ou isoamilase. O uso de isoa- milase e pululanase para desramificação de amido, as propriedades moleculares das enzimas e o potencial uso das enzimas juntamente com glucoamilase são descritos em G. M. A. van Beynum et al., Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, Nova lorque, 1985, 101 a 142.

[00148] O termo "produto de fermentação" significa um produto produzido através de um processo que inclui um processo de fermen- tação que usa um organismo de fermentação. Os produtos de fermen- tação contemplados de acordo com a invenção incluem álcoois (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, propilenoglicol, butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido as- córbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, áci- do fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido pro- piônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (por exemplo, ace- tona); aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, gli- cina, lisina, serina e treonina); um alcano (por exemplo, pentano, he- xano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano); um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, ciclo-hexano, ciclo-heptano e ciclo-octano); um alceno (por exemplo, penteno, hexeno, hepteno e octeno); gases (por exemplo, metano, hidrogênio (H>2), dióxido de car- bono (CO>2) e monóxido de carbono (CO)); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios.

[00149] Em um aspecto preferencial, o produto de fermentação é etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol para consumo, isto é, álcoois neutros potáveis; ou etanol ou produtos industriais usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos de laticínios fermentados), indús- tria de couro e indústria de tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, amargas, licores de malte, cerveja de alto teor alcoólico, cerveja de baixo teor alcoólico, cerveja de baixa caloria ou cerveja clara. Processos de fermentação preferen- ciais usados incluem processos de fermentação de álcool, que são bem conhecidos na técnica. Processos de fermentação preferenciais são processos de fermentação anaeróbicos, que são bem conhecidos.

[00150] —Processes para produzir cerveja são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Wolfgang Kunze (2004) "Technology Brewing and Malting," Research and Teaching Institute of Brewing, Berlim (VLB), 3º edição. Brevemente, o processo envolve: (a) preparar uma mistura, (b) filtrar a mistura para preparar um mosto e (c) fermen- tar o mosto para obter uma bebida fermentada, tal como cerveja.

[00151] A composição de fabricação de cerveja que compreende uma glucoamilase, em combinação com uma amilase e opcionalmente uma pululanase e/ou isoamilase, pode ser adicionada à mistura da etapa (a) acima, isto é, durante a preparação da mistura. Alternativa ou adicionalmente, a composição de fabricação de cerveja pode ser adicionada na mistura da etapa (b) acima, isto é, durante a filtração da mistura. Alternativa ou adicionalmente, a composição de fabricação de cerveja pode ser adicionada ao mosto da etapa (c) acima, isto é, du- rante a fermentação do mosto.

[00152] Em ainda outro aspecto, as glucoamilases descritas no pre- sente documento podem ser usadas como um aditivo de alimentação para animais para aumentar a digestibilidade de amido. Um método, descrito no presente documento, para aumentar a digestibilidade de amido em um animal que compreende adicionar pelo menos uma glu- coamilase selecionada a partir do grupo que consiste em: (9) um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; (h) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identida-

de à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; (i)º um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identida- de a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; ()) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identida- de a um ligante e um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, 8 ou 9; ou (k) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamen- to do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante secreção de um hospedeiro de expressão; como um aditivo de alimentação para alimentar um animal, em que a dita glucoamilase (a) tem pelo menos 20% de atividade ou pelo menos 20% de atividade residual maior em pH menor ou igual a 3 na presen- ça de pepsina ou fluido de rúmen (por exemplo, fluido de rúmen que contém pepsina) em comparação com a atividade das enzimas em pH 6 por si só ou na presença de fluido de rúmen (por exemplo, fluido de rúmen que contém pepsina), e (b) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose.

[00153] Em outro aspecto, quando o animal é um ruminante, então, a enzima é ativa em pelo menos duas das três câmaras digestivas de um ruminante que compreende um rúmen, um abomaso e um intestino delgado. O rúmen é o maior compartimento, com um volume de 150 a 200 litros (40 a 50 galões).

[00154] Ruminantes têm a habilidade única de converter fibras em proteína e energia através de seus sistemas digestivos microbia- nos/enzimáticos. Consequentemente, ruminantes têm um papel impor- tante na ecologia terrestre e na cadeia alimentar.

[00155] A diferença primária entre um ruminante e um não ruminan- te é que um ruminante tem um estômago com quatro compartimentos que consistem em um rúmen, retículo, omaso e abomaso. O abomaso é o equivalente direto do estômago monogástrico (McDonald et al.,

2011, Animal Nutrition (7º Edição), páginas 156 a 191).

[00156] No sistema digestivo, existem bilhões de micro-organismos. Eles ajudam a vaca a digerir e utilizar nutrientes na alimentação. Para alcançar utilização de alimentação eficiente e alto rendimento de leite, as bactérias devem ter condições ideais. São as bactérias que dige- rem a alimentação. Alimentar uma vaca, de fato, envolve alimentar os micro-organismos em seu rúmen. O processo de fermentação ocorre no rúmen e no retículo. O rúmen da vaca é como uma cuba de fermen- tação grande. Mais de 200 bactérias diferentes e 20 tipos de protozoá- rios ajudam a vaca a utilizar rações fibrosas e fontes de nitrogênio de não proteína. Fermentação é o processo químico pelo qual as molécu- las, tal como glicose, são decompostas anaerobicamente, tal como quando os micro-organismos convertem carboidratos em ácidos gra- xos voláteis e gases. Esse processo permite que a vaca converta fibra celulósica em energia. Dos gases produzidos dentro do rúmen durante a fermentação (500 a 1.500 litros por dia) (150 a 400 galões), 20 a 40% consistem em metano e dióxido de carbono. Produção de gases de fermentação representa uma perda de energia considerável. De- terminados modificadores de fermentação, tais como ionóforos, melho- ram a eficiência energética de ruminantes reduzindo-se essas perdas de energia gasosa.

[00157] O rúmen e retículo são basicamente um compartimento, porém, com funções diferentes. Embora muito da ação de fermentação ocorra no rúmen, o retículo serve como uma área de preparação para a passagem para o omaso ou regurgitação.

[00158] O valor de pH de rúmen ideal está entre 6 e 7. Os micro- organismos ruminais são mais saudáveis dentro dessa faixa. Se o va- lor de pH varia muito, alguns tipos de micro-organismos são elimina- dos, e há utilização reduzida da alimentação. Micro-organismos que digerem celulose (feno, silagem, etc.) não têm capacidade para culti-

var ou fermentar celulose com um valor de pH abaixo de 6,0. Quando o pH ruminal cai abaixo de 6, o rúmen é considerado como acidótico. Acidose ruminal pode ser aguda com uma queda grave rápida em pH. Mais comum nos rebanhos de alta produção é a acidose subclínica que é caracterizada por períodos intermitentes crônicos de pH ruminal baixo.

[00159] Como notado acima, a digestibilidade de amido em rações é altamente variável e dependente de uma série de fatores, incluindo a estrutura física do amido e da matriz da alimentação.

[00160] Constatou-se que a digestibilidade de amido em uma dieta do animal pode ser melhorada através do uso de pelo menos uma glu- coamilase como um aditivo de alimentação para um ruminante, em que a dita glucoamilase: (a) tem pelo menos 20% de atividade (tal co- mo pelo menos cerca de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% de atividade maior, inclusive de todos os va- lores entre essas porcentagens) ou pelo menos 20% de atividade resi- dual maior (tal como pelo menos cerca de 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ou 80% de atividade residual maior, inclusive de todos os valores entre essas porcentagens) em pH menor ou igual a 3 na presença de pepsina ou fluido de rúmen (por exemplo, fluido de rúmen que contém pepsina) em comparação com a atividade das enzimas em pH 6 sozinhas ou na presença de fluido de rúmen (por exemplo, fluido de rúmen que contém pepsina) e (b) a hidrolase funciona com enzimas digestivas presentes nas câmaras digestivas do animal para aumentar o rendimento de glicose e aumentar a digestibi- lidade de amido.

[00161] Qualquer uma das glucoamilases descritas no presente do- cumento pode ser usada sozinha ou em combinação com pelo menos um microbiano alimentado diretamente. Categorias de DFMs incluem Bacillus, Bactérias de Ácido Lático e Leveduras. Bacilos são hastes únicas gram-positivas que formam esporos. Esses esporos são muito estáveis e podem suportar as condições ambientais, tais como calor, umidificação e uma faixa de pH. Esses esporos germinam em células vegetativas ativas quando ingeridas por um animal e podem ser usa- dos em dietas de farinha e pelotadas.

[00162] Os termos "ração animal", "ração", "composição de ração" e "forragem" são usados intercambiavelmente e podem compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, ce- vada, centeio, aveias e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como mais ou sorgo; b) subprodutos de cereais, como farinha de milho com glúten, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particu- larmente Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e/ou e) minerais e vitaminas.

[00163] “Quando usada como, ou na preparação de uma alimenta- ção, tal como alimentação funcional, a enzima ou composição de aditi- vo de alimentação da presente invenção pode ser usada em combina- ção com um ou mais dentre: um carreador nutricionalmente aceitável, um diluente nutricionalmente aceitável, um excipiente nutricionalmente aceitável, um adjuvante nutricionalmente aceitável, um ingrediente nu- tricionalmente ativo. Por exemplo, poderia ser mencionado pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste em uma proteína, um peptídeo, sacarose, lactose, sorbitol, glicerol, propileno- glicol, cloreto de sódio, sulfato de sódio, acetato de sódio, citrato de sódio, formato de sódio, sorbato de sódio, cloreto de potássio, sulfato de potássio, acetato de potássio, citrato de potássio, formato de potás- sio, acetato de potássio, sorbato de potássio, cloreto de magnésio, sul- fato de magnésio, acetato de magnésio, citrato de magnésio, formato de magnésio, sorbato de magnésio, metabissulfito de sódio, parabeno de metila e parabeno de propila.

[00164] Em uma modalidade preferencial, uma enzima ou uma composição de aditivo de alimentação da presente invenção é mistu- rada por adição com um componente de alimentação para formar uma ração. O termo "componente de alimentação", conforme usado no pre- sente documento, significa toda ou parte da ração. Parte da ração po- de significar um constituinte da ração ou mais de um constituinte da ração, por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou mais. Em uma modalidade, o termo "componente de alimentação" engloba uma pré-mistura ou constituin- tes de pré-mistura. Preferencialmente, a alimentação pode ser uma forragem, ou uma pré-mistura da mesma, uma alimentação de com- posto ou uma pré-mistura da mesma.

[00165] A composição de aditivo de alimentação de acordo com a presente invenção pode ser misturada com uma alimentação de com- posto, um componente de alimentação de composto ou com uma pré- mistura de uma alimentação de composto ou com uma forragem, um componente de forragem ou uma pré-mistura de uma forragem.

[00166] Qualquer gênero alimentício descrito no presente documen- to pode compreender um ou mais materiais alimentícios selecionados a partir do grupo que compreende a) cereais, como pequenos grãos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveias, triticale e combinações dos mesmos) e/ou grãos grandes como maís ou sorgo; b) subprodutos de cereais, tais como farinha de milho com glúten, torta úmida (particu- larmente, torta úmida à base de milho), Grãos Secos de Destilaria (DDG) (particularmente, Grãos Secos de Destilaria à base de milho

(cDDG)), Grãos Secos de Destilaria com Solúveis (DDGS) (particular- mente, Grãos Secos de Destilaria com Solúveis à base de milho (cDDGS)), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo fino de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, semente de palma e polpa de cítricos; c) proteína obtida a partir de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, fava, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seca, farinha de carne e ossos, proteína da batata, soro, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.

[00167] O termo "alimentação de composto" significa uma alimenta- ção comercial na forma de uma farinha, um pélete, nozes, bolo ou um farelo. Alimentações de composto podem ser mescladas a partir de várias matérias-brutas e aditivos. Essas mesclas são formuladas de acordo com as exigências específicas do animal-alvo.

[00168] As alimentações de composto podem ser alimentações completas que proporcionam todos os nutrientes diários requeridos, concentrados que proporcionam uma parte da ração (proteína, ener- gia) ou suplementos que proporcionam somente micronutrientes adici- onais, tais como minerais e vitaminas.

[00169] Os principais ingredientes usados em alimentação de com- posto são os grãos de alimentação que incluem milho, trigo, farinha de canola, farinha de colza, tremoço, feijão soja, sorgo, aveia e cevada.

[00170] —Adequadamente, uma pré-mistura denominada aqui pode ser uma composição composta por microingredientes, como vitaminas, minerais, conservantes químicos, antibióticos, produtos de fermenta- ção e outros ingredientes essenciais. Pré-misturas são normalmente composições adequadas para se mesclar em rações comerciais.

[00171] Em uma modalidade, a composição de ração compreende ou consiste em milho, DDGS (tais como cDDGS), trigo, farelo de trigo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00172] Em uma modalidade, o componente de alimentação pode ser milho, DDGS (por exemplo, cDDGS), trigo, farelo de trigo ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a ração compreende ou consiste em milho, DDGS (tal como cDDGS) ou uma combinação dos mesmos.

[00173] Um alimento para animais descrito no presente documento pode conter pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 60% em peso de farinha de milho e soja ou milho e soja com gordura total ou farinha de trigo ou farinha de girassol.

[00174] Por exemplo, uma ração pode conter entre cerca de 5 e cerca de 40% de milho DDGS. Para aves domésticas, a ração em mé- dia pode conter entre cerca de 7 e 15% de milho DDGS. Para suínos (porcos), a ração pode conter em média 5 a 40% de milho DDGS. Também pode conter milho como um grão único, em todo caso a ra- ção pode compreender entre cerca de 35% e cerca de 80% de milho.

[00175] A ração pode ser um ou mais dos seguintes: uma ração de composto e pré-mistura, incluindo péletes, nozes ou bolo (de gado); uma cultura ou resíduo de cultura: milho, soja, sorgo, aveia, cevada, copra, palha, joio, desperdício de beterraba-sacarina; farinha de peixe; farinha de carne e ossos; melaços; bolo de óleo e bolo de bagaço; oli- gossacarídeos; plantas de forragem conservadas; silagem; alga mari- nha; sementes e grãos, inteiros ou preparados por esmagamento, mo- agem, etc.; grãos germinados e legumes; extrato de levedura.

[00176] O termo "alimentação", conforme usado no presente docu- mento, engloba, em algumas modalidades, alimento para animais. Um alimento para animais é material vegetal ou animal destinado ao con- sumo por animais domésticos, tais como comida para cães ou comida para gatos. Alimento para animais, tais como comida para cão e gato, pode estar em uma forma seca, tal como croquete para cães, ou forma enlatada úmida. Comida para gatos pode conter o aminoácido taurina.

[00177] Conforme usado no presente documento, o termo "em con- tato com" se refere à aplicação indireta ou direta de uma glucoamilase, conforme descrito no presente documento (ou uma composição que compreende uma glucoamilase), em um produto (por exemplo, a ali- mentação). Exemplos de métodos de aplicação que podem ser usa- dos, incluem, porém, sem limitação, tratamento do produto em um ma- terial que compreende a composição de aditivo de alimentação, apli- cação direta misturando-se a composição de aditivo de alimentação com o produto, pulverizando-se a composição de aditivo de alimenta- ção na superfície de produto ou mergulhando-se o produto em uma preparação da composição de aditivo de alimentação. Em uma moda- lidade, a composição de aditivo de alimentação da presente invenção é preferencialmente misturada por adição com o produto (por exemplo, ração). Alternativamente, a composição de aditivo de alimentação po- de ser incluída na emulsão ou ingredientes brutos de uma ração. Isso permite que a composição transmita um benefício de desempenho.

[00178] Também é possível que pelo menos uma glucoamilase (ou uma composição de enzima que compreende pelo menos uma gluco- amilase, conforme descrito no presente documento) descrita no pre- sente documento possa ser homogeneizada para produzir um pó.

[00179] Em uma modalidade alternativa preferencial, uma composi- ção de enzima que compreende pelo menos uma glucoamilase pode ser formulada em grânulos, conforme descrito nos documentos nº WOZ2007/044968 (denominado grânulos de TPT) ou WO01997/016076 ou WO01992/012645 incorporados no presente documento a título de referência. "TPT" significa Tecnologia de Proteção Térmica.

[00180] Em outro aspecto, quando a composição de aditivo de ali- mentação é formulada em grânulos, os grânulos compreendem um sal de barreira hidratada revestido sobre o núcleo de proteína. A vanta- gem de tal revestimento de sal é tolerância térmica melhorada, estabi-

lidade de armazenamento melhorada e proteção contra outros aditivos de alimentação que têm, de outra forma, efeito adverso sobre a enzi- ma. Preferencialmente, o sal usado para o revestimento de sal tem uma atividade de água maior que 0,25 ou constante de umidade maior que 60% a 20 ºC. Em algumas modalidades, o revestimento de sal compreende Na>zS0a.

[00181] Um método para preparar pelo menos uma glucoamilase, conforme descrito no presente documento (ou uma composição de en- zima que compreende pelo menos uma glucoamilase, conforme des- crito no presente documento), também pode compreender a etapa adi- cional de peletizar o pó. O pó pode ser misturado com outros compo- nentes conhecidos na técnica. O pó, ou mistura que compreende o pó, pode ser forçado através de um molde e as fitas resultantes são corta- das em péletes adequados de comprimento variável.

[00182] —Opcionalmente, a etapa de peletização pode incluir um tra- tamento a vapor, ou estágio de condicionamento, antes da formação dos péletes. A mistura que compreende o pó pode ser colocada em um condicionador, por exemplo, um misturador com injeção a vapor. À mistura é aquecida no condicionador até uma temperatura especifica- da, tal como de 60 a 100 ºC, temperaturas típicas seriam de 70 ºC, 80 ºC, 85 ºC, 90 ºC ou 95 ºC. O tempo de permanência pode ser variável de segundos para minutos e mesmo horas. Tal como 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, minutos, 15 minutos, 30 minutos e 1 hora. Será entendido que um glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento (ou uma composição de enzima que compreende um glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento) é adequado para adição em qualquer material de alimentação apropriado. Opcionalmente, o alimento para animais também pode conter minerais adicionais como, por exemplo, cálcio e/ou vitaminas adicionais. Em algumas modalidades, a ração é uma mistura de farinha de soja e mi- lho.

[00183] “Ração é tipicamente produzida em moinhos de alimentação em que matérias-primas são primeiro moídas em um tamanho de par- tícula adequado e, então, misturadas com aditivos apropriados. A ra- ção pode, então, ser produzida como uma mistura ou péletes; o último envolve, tipicamente, um método através do qual a temperatura é ele- vada até um nível-alvo e, então, a alimentação é passada por um mol- de para produzir péletes de um tamanho particular. Permite-se que os péletes resfriem. Subsequentemente, aditivos líquidos, tais como gor- dura e enzima, podem ser adicionados. Produção de ração também pode envolver uma etapa adicional que inclui extrusão ou expansão antes de peletização, em particular, através de técnicas adequadas que podem incluir pelo menos o uso de vapor.

[00184] A composição de aditivo de alimentação e/ou a ração que compreende a mesma podem ser usadas de qualquer forma adequa- da. A composição de aditivo de alimentação pode ser usada na forma de preparações sólidas ou líquidas ou alternativas das mesmas. Exemplos de preparações sólidas incluem pós, pastas, bolos, cápsu- las, péletes, tabletes, poeiras e grânulos que podem ser umectantes, secos por pulverização ou liofilizados. Exemplos de preparações líqui- das incluem, porém, sem limitação, soluções orgânicas aquosas, or- gânicas ou aquosas, suspensões e emulsões.

[00185] —Preferencialmente, um alimento ou composição de aditivo de alimentação pode compreender pelo menos um carreador fisiologi- camente aceitável. O carreador fisiologicamente aceitável é preferen- cialmente selecionado a partir de pelo menos uma dentre maltodextri- na, calcário (carbonato de cálcio), ciclodextrina, trigo ou um compo- nente de trigo, sacarose, amido, Na2SO:, talco, PVA e misturas dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o alimento ou aditivo de ali-

mentação pode compreender, adicionalmente, um quelante de íon de metal. O quelante de íon de metal pode ser selecionado a partir de EDTA ou ácido cítrico.

[00186] Em algumas modalidades, o alimento ou composição de aditivo de ração compreende um glicosídeo hidrolase conforme des- crito no presente documento, a um nível de pelo menos 0,0001 g/kg, 0,001 g/Kkg, pelo menos 0,01 g/Kkg, pelo menos 0,1 g/Kkg, pelo menos 1 g/Kkg, pelo menos 5 g/kg, pelo menos 7,5 g/Kkg, pelo menos 10,0 g/kg, pelo menos 15,0 g/Kkg, pelo menos 20,0 g/kg, pelo menos 25,0 g/kg. Em algumas modalidades, o alimento ou aditivo de alimentação com- preende em um nível de modo que, quando adicionado a um alimento ou material de alimentação, o material de alimentação compreenda um glicosídeo hidrolase, conforme descrito no presente documento, em uma faixa de 1 a 500 mg/kg, 1 a 100 mg/kg, 2 a 50 mg/kg ou 2 a 10 mg/kg. Em algumas modalidades da presente invenção, o alimento ou material de alimentação compreende pelo menos 100, 1.000, 2.000,

3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 50.000, 100.000,

500.000, 1.000.000 ou 2.000.000 unidades de glicosídeo hidrolase por alimentação de quilograma ou material de alimento.

[00187] —Formulações que compreendem qualquer uma dentre a pe- lo menos uma glucoamilase descrita no presente documento e compo- sições descritas no presente documento podem ser produzidas de qualquer maneira adequada para assegurar que a formulação com- preende enzimas ativas. Tais formulações podem ser como um líqui- do, um pó seco ou um grânulo. Preferencialmente, a composição de aditivo de alimentação está em uma forma sólida adequada para adi- cionar em ou a um pélete de alimentação.

[00188] Em uma modalidade, a alimentação animal pode ser formu- lada em um grânulo para composições de alimentação que compreen- dem: um núcleo; um agente ativo; e pelo menos um revestimento,

sendo que o agente ativo do grânulo retém pelo menos 50% de ativi- dade, pelo menos 60% de atividade, pelo menos 70% de atividade, pelo menos 80% de atividade após as condições selecionadas a partir de um ou mais dentre a) um processo de peletização de alimentação, b) um processo de pré-tratamento de alimentação aquecida a vapor, c) armazenamento, d) armazenamento como um ingrediente em uma mistura não peletizada e e) armazenamento como um ingrediente em uma mistura de base de alimentação ou uma pré-mistura de alimenta- ção que compreende pelo menos um composto selecionado dentre minerais vestigiais, ácidos orgânicos, açúcares redutores, vitaminas, cloreto de colina e compostos que resultam em uma pré-mistura de alimentação ou mistura de base de alimentação ácida ou básica.

[00189] “Com relação ao grânulo, pelo menos um revestimento pode compreender um material hidratante umidificante que constitui pelo menos 55% em p/p do grânulo; e/ou pelo menos um revestimento po- de compreender dois revestimentos. Os dois revestimentos podem ser um revestimento hidratante umidificante e um revestimento de barreira umidificante. Em algumas modalidades, o revestimento hidratante umidificante pode estar entre 25% e 60% em p/p do grânulo e o reves- timento de barreira umidificante pode estar entre 2% e 15% em p/p do grânulo. O revestimento hidratante umidificante pode ser selecionado a partir de sais inorgânicos, sacarose, amido e maltodextrina, e o re- vestimento de barreira umidificante pode ser selecionado a partir de polímeros, gomas, soro de leite e amido.

[00190] O grânulo pode ser produzido com o uso de um processo de peletização de ração e o processo de pré-tratamento de ração pode ser conduzido entre 70 ºC e 95 ºC durante até vários minutos, como entre 85 ºC e 95ºC.

[00191] O grânulo pode ter um revestimento de barreira umidifican- te selecionado a partir de polímeros e gomas e o material hidratante umidificante pode ser um sal inorgânico. O revestimento hidratante umidificante pode estar entre 25% e 45% em p/p do grânulo e o reves- timento de barreira umidificante pode estar entre 2% e 10% em p/p do grânulo.

[00192] —Alternativamente, a composição está em uma formulação líquida adequada para consumo, preferencialmente tal consumo líqui- do contém um ou mais dos seguintes: um tampão, sal, sorbitol e/ou glicerol.

[00193] Também, a composição de aditivo de ração pode ser for- mulada aplicando-se, por exemplo, aspergindo-se, a enzima (ou enzi- mas) em um substrato carreador, tal como trigo triturado, por exemplo.

[00194] Em uma modalidade, a composição de aditivo de alimenta- ção pode ser formulada como uma pré-mistura. Somente a título de exemplo, a pré-mistura pode compreender um ou mais componentes de ração, como um ou mais minerais e/ou uma ou mais vitaminas.

[00195] Em algumas modalidades, pelo menos uma glucoamilase estaria em um carreador fisiologicamente aceitável. Carreadores ade- quados podem ser grandes, macromoléculas lentamente metaboliza- das, tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copo- límeros de aminoácido e partículas de vírus inativo. Sais farmaceuti- camente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácido mi- neral, tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e ben- zoatos. Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao ruminante.

[00196] Adicionalmente, as composições que contêm glucoamilase reveladas no presente documento podem ser formuladas, adicional- mente, com (por exemplo, mescladas com) uma ou mais enzimas de componente adicionais (por exemplo, enzimas de alimentação adicio-

nais ou enzimas de fabricação de cerveja ou fabricação de malte, ou enzimas de processamento de grão ou enzimas de separação de glú- ten de trigo e amido).

[00197] Enzimas adicionais adequadas para uso nas composições que contêm glucoamilase reveladas no presente documento podem ser uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que con- siste em: endoglucanases (E.C. 3.2.1.4); celiobioidrolases (E.C.

3.2.1.91), B-glucosidases (E.C. 3.2.1.21), celulases (E.C. 3.2.1.74), liquenases (E.C. 3.1.1.73), lipases (E.C. 3.1.1.3), aciltransferases de lipídeo (classificadas, de modo geral, como E.C. 2.3.1.x), fosfolipases (E.C. 3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 ou E.C. 3.1.1.5), fitases (por exemplo, 6- fitase (E.C. 3.1.3.26) ou uma 3-fitase (E.C. 3.1.3.8), alfa-amilases (E.C.

3.2.1.1), outras xilanases (E.C. 3.2.1.8, E.C. 3.2.1.32, E.C. 3.2.1.37, E.C. 3.1.1.72, E.C. 3.1.1.73), glucoamilases (E.G. 3.2.1.3), proteases (por exemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) ou uma bacilolisina (E.C.

3.4.24.28) ou uma serina alcalina protease (E.C. 3.4.21.x) ou uma que- ratinase (E.C. 3.4.xx)) e/ou mananases (por exemplo, uma B- mananase (E.C. 3.2.1.78)).

[00198] Em uma modalidade (por exemplo, para aplicações de ali- mentação), a outra enzima de componente pode ser uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma amilase (que inclui a-amilases (E.C. 3.2.1.1), amilases formadoras de G4 (E.C.

3.2.1.60), B-amilases (E.C. 3.2.1.2) e y-amilases (E.C. 3.2.1.3); e/ou uma protease (por exemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) ou uma bacilo- lisina (E.C. 3.4.24.28) ou uma serina alcalina protease (E.C. 3.4.21.x) ou uma queratinase (E.C. 3.4.x.x)).

[00199] Em uma modalidade (por exemplo, para aplicações de ali- mentação), a outra enzima de componente pode ser uma combinação de uma amilase (por exemplo, a-amilases (E.C. 3.2.1.1)) e uma pro- tease (por exemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62)).

[00200] Em uma modalidade (por exemplo, para aplicações de ali- mentação), a outra enzima de componente pode ser uma B-glucanase, por exemplo, endo-1,3(4)-B-glucanases (E.C. 3.2.1.6).

[00201] Em uma modalidade (por exemplo, para aplicações de ali- mentação), a outra enzima de componente pode ser uma mananase (por exemplo, uma B-mananase (E.C. 3.2.1.78)).

[00202] Em uma modalidade (por exemplo, para aplicações de ali- mentação), a outra enzima de componente pode ser uma lipase (E.C.

3.1.1.3), um lipídeo aciltransferase (classificado, de modo geral, como E.C. 2.3.1.x), ou uma fosfolipase (E.C. 3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 ou E.C.

3.1.1.5), adequadamente uma lipase (E.C. 3.1.1.3).

[00203] Em uma modalidade (particularmente para aplicações de alimentação), a outra enzima de componente pode ser uma serina pro- tease (por exemplo, E.C. 3.4.21, subtilisina), proteases S1 ou S2 se- melhantes a tripsina, ou uma metaloprotease (por exemplo, E.C.

3.4.24, bacilolisina), ou uma aspartil protease (por exemplo, E.C.

3.4.23).

EXEMPLOS

[00204] A menos que seja definido de outra forma no presente do- cumento, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como normalmente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta descrição pertence. Sin- gleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2º Edição, John Wiley e Sons, Nova lorque (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) fornecem a uma pessoa versada um dicionário geral de diversos termos usados nesta descrição.

[00205] A descrição é adicionalmente definida nos seguintes Exem- plos. Deve ser entendido que os Exemplos, embora indique determi- nadas modalidades, são dados apenas a título de ilustração. A partir da discussão acima e dos Exemplos, um indivíduo versado na técnica pode determinar características essenciais desta divulgação e, sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modi- ficações para adaptar a vários usos e condições. EXEMPLO 1 Sequências de Glucoamilases

[00206] A sequência de ácido nucleico para o gene FraGA1 e a se- quência de aminoácidos da proteína hipotética codificada pelo gene FraGA1 foram encontradas no banco de dados NCBI (nº de acesso NCBI: NÕy 012133200.1 (gene) e XP 012178139 (proteína)).

[00207] A sequência de aminoácidos da proteína precursora de FraGA1 é apresentada como a SEQ ID NO:1.

MLFLLAALGLACSAAAQSTSVSAYIASESPVAKAGVLANIGTEGSLSS GAYSGVVIASPSTVNPDYLYTWVRDSSLTFQALIDQYVYGEDPTLRS LIDEFITAESILQQTTNPSGTVSTGGLGEPKFNINETAFTGPWGRPQR

DGPALRSTAIITYATYLWNSGNTSYVSDSLWPIIELDLNYIATYWNFST FDLWEEIDSSSFWTTAVQHRALRQGITFANLIGQOTSPVSNYETQAGDI|

LCFLAOTYWNPTGNYMTANTGGGRSGKDSNTVLASVHTFDPDAGCD STTFQPCSDKALSNLKVYVDSFRSLYAINDGIASDAAVATGRYPEDVY YGGNPWYLCTFAVAEQLYDALIVWSSQGYLEITDLSLAFFQQFDSDV GTGTYDSGSSTYSTLTSAIRTFADGFVLTNAKYTPTNGSLSEEYTSAD GTPISAYDLTWSYASALTVFAAEAGTTYGSWGAAGLTVPSTCTSGVA VTFEVDYDTEYGENVYITGSVNALENWSATNALIMSAADYPTWSITVY LPPSTTIQYKYLTQYNGEVTWEDDPNNEITTPASGSMTQVDSWH

[00208] A sequência de ácido nucleico para o gene WcoGAT1 e a sequência de aminoácidos da proteína hipotética codificada pelo gene WcecoGAT1 foram encontradas no banco de dados JGI (nº de acesso JGI: Wolco1150090 (gene) e Wolco1149945 (proteína)). O peptídeo sinal de terminal N foi previsto pelo software SignalP versão 4.0 (Nor- dah! Petersen et al. (2011) Nature Methods, 8:785 a 786).

[00209] A sequência de aminoácidos da proteína precursora de WeocoGA1 é apresentada como a SEQ ID NO: 2.

MRLSLASVFALAGGALAQTTSVTSYIASESPIAKAGVLANIGADGSLS SGAYSGIVIASPSTVNPNYLYTWTRDSSLTFMELINQYIYGEDDTLRTL IDEFVYSAEATLAQVTNPSGTVSTGGLGEPKFNINETAFTGPWGRPOR DGPALRATAIMAYATYLYENGNTSYVTDTLWPIIELDLGYVAEYWNES TFDLWEEIDSSSFFTTAVQHRALRAGVTFANLIGETSDVSNYQENAD DLLCFLAOSYWNPTGSYVTANTGGGRSGKDANTLLASIHTFDPDAGC NATTFQPCSDKALSNHKVYVDSFRSLYAINDDISSDAAVATGRYPED VYYNGNPWYLCTLAAAEQLYDSLIVWKAQGYIEVTSLSLAFFQOQFDA SVSAGTYDSSSDTYTTLLDAVQTYADGFVLMVAQYTPANGSLSEQY AKADGSPTSAYDLTWSFAAALTAFAARDGKTYGSWGAADLSSTCSG STDTVAVTFEVQYDTQYGENLYITGSVSQLEDWSADDALIMSSADYP TWSITVDLPPSTLIQYKYLTKYNGDVTWEDDPNNEITTPASGSYTQVD SWH

[00210] A sequência de aminoácidos da proteína precursora TeEGA de Talaromyces emersonii é apresentada como a SEQ ID NO: 3.

MASLVAGALCILGLTPAAFARAPVAARATGSLDSFLATETPIALQGVL NNIGPNGADVAGASAGIVVASPSRSDPNYFYSWTRDAALTAKYLVDA FNRGNKDLEQTIQQYISAQAKVQTISNPSGDLSTGGLGEPKFNVNET AFTGPWGRPQRDGPALRATALIAYANYLIDNGEASTADEIIWPIVOQND LSYITQYWNSSTFDLWEEVEGSSFFTTAVQHRALVEGNALATRLNHT CSNCVSQAPQVLCFLASYWTGSYVLANFGGSGRSGKDVNSILGSIH TFDPAGGCDDSTFQPCSARALANHKVVTDSFRSIYAINSGIAEGSAVA VGRYPEDVYQGGNPWYLATAAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITDVSLPF FQDIYPSAAVGTYNSGSTTFNDIISAVAQTYGDGYLSIVEKYTPSDGSLT EQFSRTDGTPLSASALTWSYASLLTASARRQSVVPASWGESSASSV LAVCSATSATGPYSTATNTVWPSSGSGSSTTTSSAPCTTPTSVAVTF DEIVSTSYGETIYLAGSIPELGNWSTASAIPLRADAYTNSNPLWYVTV NLPPGTSFEYKFFKNQTDGTIVWEDDPNRSYTVPAYCGQTTAILDDS

WQA EXEMPLO 2 Expressão de Glucoamilases

[00211] Sequências de DNA que codificam FraGA1 e WcoGA1 de comprimento completo foram sintetizadas e inseridas no vetor de ex- pressão pTTT (descrito no Pedido PCT publicado nº WO2011/063308). Uma sequência de DNA que codifica o TeGA foi sintetizada e inserida no vetor de expressão pTrex3gM (descrito no Pedido Publicado nº U.S. 2011/0136197 A1).

[00212] A sequência de nucleotídeos do gene FraGA1 usado para expressão é apresentada abaixo como a SEQ ID NO: 4.

ATGCTCTTCCTCCTCGCTGCTCTGGGCCTCGCTTGTAGCOGCTGCT GCCCAATCCACTTCCGTCTCCGCTTACATOGCCAGCGAGAGCCCC GTTGCCAAAGCCGGTGTTCTGGCTAACATTGGCACTGAAGGTAGC CTGAGCTCCGGTGCCTACTCCGGCGTTGTCATEGCCOTCCCOCCAG CACCGTCAACCCTGACTACCTCTATACTTGGGTTCGCGACTCCAG CCTCACTTTCCAAGCCCTGATTGACCAGTACGTTTACGGCGAGGA CCCCACCCTCCGAAGCCTGATCGACGAGTTCATTACCGCTGAGTC CATCCTGCAGCAAACTACCAACCCCAGCGGCACCGTTAGCACCG GCGGTCTGGGCGAGCCCAAGTTCAACATCAATGAGACTGCCTTTA CCEGGTCCCTGGGGCCGACCCCAACGCGACGGTCCTGCCCTCCG CAGCACTGCCATCATTACTTATGCCACCTACCTGTGGAACTCCGG TAACACCTCCTACGTTTCCGATTCCCTCTGGCCCATCATCGAACTC GACCTGAATTACATTGCTACCTACTGGAATTTCTCCACTTTTGATC TGTGGGAAGAGATTGACTCCTCCAGCTTCTGGACCACTGCCGTTC AGCATCGAGCCCTGCGCCAGGGTATCACCTTCGCTAATCTGATTG GCCAGACCAGCCCTGTCAGCAACTATGAGACCCAAGCCGGCGAT ATCCTCTGTTTCCTCCAAACCTATTGGAATCCTACCGGCAACTACA TGACCGCCAATACTGGCGGTGGTCGAAGCGGCAAGGACTCCAAC ACCGTTCTCGCTTCCGTTCATACCTTOGATCCCGATGCCGGCTGET GATAGCACTACTTTTCAACCTTGCTCCGACAAGGCCCTGAGCAAC CTCAAGGTCTACGTCGACTCCTTTCGCAGCCTGTACGCCATCAAC GACGGTATTGCCTCCGACGCTGCCGTCGCCACCGGCCGCTATCC TGAGGACGTCTACTACGGCGGTAACCCCTGGTACCTCTGCACCTT TGCTGTCGCCGAACAACTCTACGACGCCCTCATCGTCTGGAGCAG CCAGGGCTATCTCGAAATCACTGACCTCAGCCTGGCCTTCTTCCA GCAGTTTGATTCCGATGTCGGTACTGGCACCTACGACAGCGGCTC CAGCACTTACTCCACTCTCACCTCCGCCATCCGAACTTTTGCTGAT GGCTTCGTTCTGACCAACGCCAAATACACCCCTACCAATGGTTCC CTGTCCGAGGAGTACACCAGCGCCGATGGCACTCCTATCTCCOGC CTATGACCTGACCTGGAGCTACGCCTCCGCTCTGACCGTCTTTGC CGCCGAGGCCGGCACCACTTACGGCTCCTGGGGTGCTGCTGGC CTGACTGTCCCTAGCACCTGCACTAGCGGCGTCGCTGTTACTTTC GAGGTCGATTACGACACCGAGTATGGCGAAAACGTCTATATCACC GGTTCCGTCAATGCCCTGGAAAATTGGTCCGCCACTAATGCTCTG ATTATGTCCGCCGCTGACTATCCCACCTGGTCCATCACCGTTTAC CTGCCCCCCTCCACCACCATTCAGTATAAGTATCTCACCCAGTAC

AACGGCGAAGTCACTTGGGAGGACGACCCTAACAACGAGATTACT ACCCCTGCTAGCGGTTCCATGACCCAGGTTGACAGCTGGCACtaa

[00213] A sequência de nucleotídeos do gene WcoGAT1 usado para expressão é apresentada abaixo como a SEQ ID NO: 5.

ATGCGACTGAGCCTGGCCTCCGTTTTTGCTCTCGCCGGTGGTEC CCTCGCCCAGACCACTAGCGTCACCTCCTACATTGCTAGCGAAAG CCCCATTGCCAAAGCCGGTGTTCTCGCTAACATTGGCGCTGACGG CTCCCTGAGCTCCGGTGCTTATTCCGGCATTGTTATOGCCAGCCC CTCCACCGTTAACCCTAACTATCTCTATACCTGGACTCGCGACTCC AGCCTGACCTTCATGGAACTGATCAACCAGTACATCTACGGCGAG GACGATACTCTGCGAACTCTGATTGATGAGTTCGTTTCCGCTGAA GCCACCCTCCAACAGGTCACTAATCCTAGCGGCACTGTCTCCACT GGTGGCCTCGGCGAGCCCAAGTTCAACATCAACGAGACTGCTTTT ACTGGTCCCTGGGGCCGACCCCAACGCGATGGCCCTGCCCTGCG CGCTACTGCTATCATGGCCTATGCCACCTACCTGTATGAAAACGG TAATACTAGCTATGTTACTGACACCCTCTGGCCCATCATTGAACTC GACCTCGGTTACGTCGCCGAATATTGGAACGAAAGCACCTTTGAT CTCTGGGAGGAAATCGACAGCAGCTCCTTTTTCACTACCGCTGTT CAGCACCGCGCTCTCCGCGCTGGCGTTACCTTCGCCAATCTCATC GGTGAGACCAGCGACGTCAGCAACTACCAGGAAAATGCCGACGA CCTCCTCTGCTTCCTCCAAAGCTACTGGAACCCCACTGGCAGCTA CGTCACTGCTAACACTGGCGGTGGTCGAAGCGGCAAGGACGCCA ACACTCTCCTGGCTAGCATCCACACCTTCGATCCCGACGCTGGCT GCAACGCCACTACCTTTCAACCCTGTTCCGACAAAGCCCTCAGCA ATCACAAGGTCTACGTTGACTCCTTCCGCAGCCTCTACGCCATCA ATGACGACATTAGCAGCGATGCCGCTGTCGCTACCGGCCGATAC CCTGAGGATGTCTACTACAACGGCAACCCCTGGTACCTCTGTACC CTGGCCGCTGCTGAGCAACTCTACGACTCCCTCATCGTCTGGAAG GCCCAAGGCTACATCGAAGTCACCAGCCTCAGCCTCGCCTTTTITT CAACAGTTCGATGCTTCCGTTAGCGCCGGTACTTATGATTCCAGC TCCGACACCTACACCACCCTGCTCGACGCCGTTCAGACCTATGCT GATGGCTTCGTCCTGATGGTCGCTCAGTACACCCCTGCCAACGGT TCCCTCTCCGAGCAGTACGCCAAGGCCGATGGCAGCCCCACTTC CGCCTACGACCTGACTTGGTCCTTTGCTGCTGCCCTCACCGCCTT CGCTGCCCGCGACGGCAAAACCTATGGTAGCTGGGGTGCCGCCG ATCTCTCCAGCACCTGCAGCGGTTCCACCGACACTGTCGCCGTCA CTTTCGAGGTCCAGTACGACACCCAATATGGTGAAAATCTGTACAT TACCGGCAGCGTCTCCCAGCTCGAGGATTGGAGCGCTGATGATG CTCTCATCATGTCCAGCGCCGACTATCCCACCTGGTCCATCACCG TCGATCTGCCCCCTAGCACCCTGATCCAATACAAATACCTCACCA AGTATAACGGCGATGTCACCTGGGAAGACGATCCCAACAACGAAA

TTACCACTCCTGCCTCCGGCTCCTATACCCAGGTTGACAGCTGGC ACtaa

[00214] A sequência de nucleotídeos do gene TeGA usado para expressão é apresentada abaixo como a SEQ ID NO: 6.

ATGGCCTCCCTGGTTGCTGGTGCTCTGTGCATCCTCGGCCTGACC CCTGCCGCCTTEGCCoGAGCCCceGToGCTGCCOGCGCCACTG

GCAGCCTCGACAGCTTCCTCEGCCACCGAGACCCCTATOGCCCOTC CAGGGCGTTCTGAACAACATCGGTCCCAACGGCGCTGACGTCGC CGGTGCTAGCGCCGGTATOEGTCGTTGCCAGCCCTAGCCGATCCG ACCCCAACTACTTCTACAGCTGGACCCGCGACGCCGCTCTCACC GCTAAGTACCTGGTCGACGCCTTCAATCGCGGCAACAAAGACCTC GAGCAAACCATCCAGCAGTACATCTCCGCTCAGGCCAAGGTCCA GACCATTTCCAACCCCAGCGGCGATCTGAGCACTGGCGGCCTGG GCGAGCCCAAGTTCAACGTCAATGAGACCGCTTTCACTGGCCCCOT GGGGCCGACCTCAACGCGATGGCCCTGCTCTCCGAGCCACCOGCC CTCATCGCCTATGCTAACTACCTGATCGACAACGGTGAGGCCAGC ACTGCCGACGAGATCATCTGGCCCATCGTCCAAAATGACCTCAGC TACATCACCCAATACTGGAACTCCAGCACCTTTGACCTGTGGGAG GAGGTCGAGGGCTCCAGCTTCTTCACCACTGCTGTTCAGCACCG

CGCCCTCGTTGAGGGTAATGCCCTGGCCACCCGACTCAATCACA CTTGCTCCAACTGCGTCAGCCAGGCCCCccocAGGTCCOTCOTGCTTTC

TCCAGAGCTACTGGACCGGCAGCTACGTCCTGGCCAACTTTGGT GGCAGCGGCCGAAGCGGCAAGGACGTCAACAGCATCCTGGGTTC CATCCACACCTTCGACCCCGCTGGCGGTTGCGACGACTCCACTTT CCAGCCTTGCAGCGCTCGCGCTCTCGCCAACCACAAGGTCGTCA CCGATTCCTTCOGCTCCATCETACGCCATCAATTCCGGCATCGCCG AGGGTAGCGCTGTTGCTGTCGGCCGCTACCCCGAGGACGTCTAC CAAGGCGGCAATCCCTGGTATCTCGCTACTGCCGCTGCCGCCGA GCAGCTCTATGACGCTATCTATCAGTGGAAAAAGATCGGTAGCAT CAGCATTACCGACGTCAGCCTCCCCTTCTTCCAGGACATCOTACCOC CTCCGCCGCTGTTGGCACCTACAATTCCGGCTCCACCACCTTCAA CGACATCATCAGCGCCGTCCAGACTTATGGCGACGGCTACCTGA

GCATTGTCGAGAAGTACACCCCCAGCGATGGCAGCCTCACCGAG CAATTCAGCCGCACCGACGGCACCCCCCeTGTCCGCTTCOGCCCOT

CACCTGGAGCTACGCTTCCCTGCTCACCGCCTCCGCTCGCCGCC AGAGCGTCGTTCCCGCTAGCTGGGGCGAGAGCAGCGCCAGCTCC GTCCTGGCCGTCTGCTCCGCTACTAGOGCCACCGGCCCCTACTCOE

CACTGCCACCAACACCGTTTGGCCTTCCAGCGGCTCCGGCAGCT CCACTACCACCTCCAGCGCCCCoTTGCACCACCCCTACCAGCGTCE

GCCGTCACCTTCGACGAGATCGTCAGCACCAGCTACGGCGAGAC CATCTATCTGGCTGGCAGCATCCCCGAGCTGGGCAATTGGTCCAC CGCCAGCGCTATTCCTCETGEGCGCTGACGCCTACACTAATAGCAA CCCTCTGTGGTATGTCACCGTTAACCTCCCTCCCGGCACTAGCTT

TGAGTATAAGTTTTTCAAGAACCAGACCGATGGTACTATTGTCTGG GAGGACGACCCCAACCGATCCTACACCGTCCCcGCCTACTGCOGG TCAGACTACCGCTATCCTCGACGATTCCTGGCAGtaa

[00215] Os plasmídeos que codificam as enzimas FraGA1, Woco- GA1 e TeGA foram transformados em uma cepa de Trichoderma ree- sei adequada com o uso de transformação de protoplasto (Te'o et al., J. Microbiol. Methods 51:393 a 399, 2002). Os transformantes foram selecionados e fermentados pelos métodos descritos no documento nº WO 2016/138315. Sobrenadantes dessas culturas foram usados para confirmar a expressão de proteína através da análise SDS-PAGE e ensaio para atividade enzimática.

[00216] FraGA1 foi purificado por meio da cromatografia de afinida- de de Sefarose 6 acoplada de beta-ciclodextrina, seguida por croma- tografia de filtração de gel. WcoGA1 foi purificado por meio da croma- tografia de afinidade de Sefarose 6 acoplada de beta-ciclodextrina se- guida por cromatografia de interação hidrofóbica. TeGA foi purificado por meio de cromatografia de interação hidrofóbica seguida por uma afinidade cromatografia de Sefarose 6 acoplada de beta-ciclodextrina. Ensaio de atividade de glucoamilase e SDS-PAGE foram realizados.

Frações que contêm proteína-alvo foram agrupadas e concentradas com o uso de um dispositivo Amicon Ultra-15 com 10 K MWCO. A so- lução concentrada foi, então, aplicada em uma coluna Superdex 75 (GE Healthcare) em tampão A. A proteína-alvo eluída da coluna em um pico único, que foi novamente agrupada e concentrada. A amostra purificada está acima de 90% de pureza e é armazenada em 40% de glicerol a -80 ºC até o uso.

[00217] A sequência de proteína madura prevista do FraGA1 é apresentada abaixo como a SEQ ID NO: 7.

QSTSVSAYIASESPVAKAGVLANIGTEGSLSSGAYSGVVIASPSTVNP DYLYTWVRDSSLTFQALIDQYVYGEDPTLRSLIDEFITAESI/LQQTTNP SGTVSTGGLGEPKFNINETAFTGPWGRPOQRDGPALRSTAIITYATYL WNSGNTSYVSDSLWPIIELDLNYIATYWNFSTFDLWEEIDSSSFWTTA VQHRALRQGITFANLIGQTSPVSNYETQAGDILCFLAOTYWNPTGNYM TANTGGGRSGKDSNTVLASVHTFDPDAGCDSTTFQPCSDKALSNLK VYVDSFRSLYAINDGIASDAAVATGRYPEDVYYGGNPWYLCTFAVAE QLYDALIVWSSQGYLEITDLSLAFFOQOQFDSDVGTGTYDSGSSTYSTLT SAIRTFADGFVLTNAKYTPTNGSLSEEYTSADGTPISAYDLTWSYASA LTVFAAEAGTTYGSWGAAGLTVPSTCTSGVAVTFEVDYDTEYGENV YITGSVNALENWSATNALIMSAADYPTWSITVYLPPSTTIQYKYLTQY NGEVTWEDDPNNEITTPASGSMTQVDSWH

[00218] A sequência de proteína madura prevista do WcoGA1 é apresentada abaixo como a SEQ ID NO: 8.

QTTSVTSYIASESPIAKAGVLANIGADGSLSSGAYSGIVIASPSTVNPN YLYTWTRDSSLTFMELINQYIYGEDDTLRTLIDEFVSAEATLQOQVTNP SGTVSTGGLGEPKFNINETAFTGPWGRPOQRDGPALRATAIMAYATYL YENGNTSYVTDTLWPIIELDLGYVAEYWNESTFDLWEEIDSSSFFTTA VQHRALRAGVTFANLIGETSDVSNYQENADDLLCFLOSYWNPTGSY VTANTGGGRSGKDANTLLASIHTFDPDAGCNATTFQPCSDKALSNHK VYVDSFRSLYAINDDISSDAAVATGRYPEDVYYNGNPWYLCTLAAAE QLYDSLIVWKAQGYIEVTSLSLAFFQQFDASVSAGTYDSSSDTYTTLL DAVQTYADGFVLMVAQYTPANGSLSEQYAKADGSPTSAYDLTWSFA AALTAFAARDGKTYGSWGAADLSSTCSGSTDTVAVTFEVQYDTOYG ENLYITGSVSQLEDWSADDALIMSSADYPTWSITVDLPPSTLIQYKYLT KYNGDVTWEDDPNNEITTPASGSYTQVDSWH

[00219] A sequência de proteína madura do TeGA é apresentada abaixo como a SEQ ID NO: 9.

ATGSLDSFLATETPIALAQGVLNNIGPNGADVAGASAGIVVASPSRSDP NYFYSWTRDAALTAKYLVDAFNRGNKDLEQTIQQYISAQAKVQTISN PSGDLSTGGLGEPKFNVNETAFTGPWGRPOQRDGPALRATALIAYAN YLIDNGEASTADEIIWPIVOQNDLSYITQYWNSSTFDLWEEVEGSSFFTT AVQHRALVEGNALATRLNHTCSNCVSQAPQVLCFLOSYWTGSYVLA NFGGSGRSGKDVNSILGSIHTFDPAGGCDDSTFQPCSARALANHKV VTDSFRSIYAINSGIAEGSAVAVGRYPEDVYQGGNPWYLATAAAAEQ LYDAIYQWKKIGSISITDVSLPFFQDIYPSAAVGTYNSGSTTFNDIISAV QTYGDGYLSIVEKYTPSDGSLTEQFSRTDGTPLSASALTWSYASLLT ASARRQSVVPASWGESSASSVLAVCSATSATGPYSTATNTVWPSSG SGSSTTTSSAPCTTPTSVAVTFDEIVSTSYGETIYLAGSIPELGNWSTA SAIPLRADAYTNSNPLWYVTVNLPPGTSFEYKFFKNQTDGTIVWEDD

PNRSYTVPAYCGOQTTAILDDSWQ EXEMPLO 3 Estabilidade de glucoamilases em pH baixo e na presença de pepsina

[00220] A estabilidade de amostras purificadas de glucoamilases TeGA, FraGA1 e WcoGA1 foi analisada em condições de pH baixo e na presença de pepsina. As enzimas foram incubadas com pepsina (Sigma, nº de categoria P7000) em 50 mM de tampão de glicina-HCI (pH 2,0) e 1% (em p/p) de amido solúvel preparado em 50 mM de tampão MES-NaOH (pH 6,5) foi usado como o substrato para medi- ções de atividade. Glucoamilases e pepsina foram primeiro misturadas em razões (p/p) de 1:0 ou 1:50, em que as glucoamilases foram dosa- das em 100 ppm; e a mistura resultante foi subsequentemente incuba- da a 40 ºC por 30 min.

Enquanto isso, alíquotas de 100 ppm de cada glucoamilase foram incubadas em 50 mM de tampão de MES-NaOH (pH 6,5) a 40 ºC por 30 min, que servem como os controles não trata- dos.

Para iniciar a medição de atividade, 10 ul de diluição de enzima (dose de enzima selecionada em faixa linear, ou água sozinha como o controle bloco bruto) foram adicionados à placa de microtitulação de 96 poços (MTP, Corning 3641) que contém solução de substrato de 90 ul (1% de amido). A MTP foi subsequentemente vedada e incubada por 10 min em iEMS (ThermoFisher) a 40 ºC e 1.150 rpm.

A atividade de glucoamilase foi determinada como a taxa de liberação de glicose que foi medida com o uso de um método de glicose oxida- se/peroxidase acoplado (GOX/HRP) (Anal.

Biochem. 105 (1980), 389 a 397). Conforme mostrado na Tabela 2, com o uso de liberação de glicose como medição de atividade enzimática, as glucoamilases Fra- Ga1, WcoGA1 e TeGA são estáveis em tampão de pH 2,0, na ausên- cia de pepsina exógena, diferente da glucoamilase de tipo selvagem Trichoderma reesei (TTGA, arquivo pdb 2VN4 A, SEQ ID NO: 11) que perde toda a atividade em pH 2,0. Tabela 2. Estabilidade relativa de glucoamilases em pH baixo e apenas na presença de sm lsermstamto fame mena o PR6S 5 eH20 | PAH20 5 | JEAGA a AR eoSAT as Ro Ro | SR ee

EXEMPLO 4 Atividade glucogênica de glucoamilases em maltodextrina em pH baixo

[00221] A atividade de glucoamilase em substrato de maltodextrina foi medida em pH 3 analisando-se composições de açúcar, com enzi- mas dosadas a 5 ppm. Glucoamilases: TeGA, FraGA1, WcoGA1, An- GA (glucoamilase de tipo selvagem de Aspergillus niger, número de acesso XP 001390530.1, SEQ ID NO: 10) e TrGA (glucoamilase de tipo selvagem de Trichoderma reesei, arquivo pdb 2VN4 A, SEQ ID NO: 11) foram testadas em MALTRINGOMO40 (Maltodextrina com DE4- 7) obtida da Staple Flavour & Fragrance Co. Ltd. As reações foram ini- ciadas adicionando-se 10 ul de uma amostra de 50 ppm das glucoami- lases purificadas em 90 ul de solução de substrato de Maltrina (5% em p/v) em 25 mM de tampão de glicina/acetato de Na/HEPES em pH 3,0. As incubações foram realizadas em uma incubadora de PCR a 55 ºC por 4 e 22 h, respectivamente. As reações foram paradas através da adição de 50 ul de 0,5 M de NaOH e misturando-se em um agitador por 2 min. A placa foi centrifugada para coletar os sobrenadantes que foram, então, diluídos 20 vezes com 5 mM de H2SO.,. Essas amostras (10 ul) foram analisadas com o uso de uma HPLC da série Agilent 1200 equipada com um detector de índice de refração, uma coluna Phenomenex Rezex-RFQ Fast Fruit e uma coluna de guarda de ácido orgânico Phenomenex Rezex ROA. Uma fase móvel de 5 mM de H2SO,4, em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min a 85 ºC foi aplicada. Picos que correspondem ao DP1, 2, 3 e 3+ foram identificados. Porcenta- gens de área de pico de DP1 como uma fração do total de DP1, DP?2, DP3 e DP3+ foram calculadas e são mostradas na Tabela 3. Glucoa- milases FraGA1, WcoGA1 e TeGA exibiram atividade glucogênica maior que as AnGA e TrGA.

Tabela 3. Percentual de DPs totais (DP1, 2, 3 e 3+) detectadas pe- la separação por HPLC a partir da digestão de maltodrextrina por várias glucoamilases após 4 e 22 horas.

metção fome oras Jor Jara do incubação v E mr Re O Fes e e 5 rs aan jane a o Ta E ns e os Ts mese po e os EXEMPLO 5 Atividade glucogênica em amido liquefeito de glucoamilases me- dida em pH baixo

[00222] As glucoamilases FraGA1, WcoGA1, TrGA e AnGA foram avaliadas em amido liquefeito para medir sua atividade glucogênica e hidrólise de DP3 e DP3+ em pH baixo. O pH de amido liquefeito de milho (32% de ds, alfa-amilase-pré-tratada) foi ajustado para pH 3,0. O substrato acima (10 g) e as glucoamilases (dosadas em 0,25 mg/gds) foram incubadas a 32 ºC e 55 ºC, respectivamente. As misturas de re- ação (100 ul) foram incubadas por 17, 24, 41, 48, 63 ou 72 h, nesse tempo as reações foram arrefecidas aquecendo-se a 100 ºC por 15 min. Depois da centrifugação, sobrenadantes foram transferidos para novos recipientes e diluídos 400 vezes em 5 mM de H2SO. para análi- se de HPLC com o uso das mesmas condições conforme descritas acima no Exemplo 4. Os valores relatados na Tabela 4 são as porcen-

tagens de área de pico de cada DPn como uma fração do total de DP1, DP2, DP3 e DP3+. Os resultados na Tabela 4 mostram que Fra- GA1 e WcoGA1 exibiram atividade glucogênica superior e hidrólise de DP3+ mais rápida do que TrGA e AnGA quando dosadas em quanti- dade de proteína igual (0,25 mg/gds) e incubadas a 32 ºC em pH 3. Quando a temperatura de incubação foi aumentada para 55 ºC, Wco- GA1 e FraGA1 hidrolisaram DP3+ de maneira muito eficiente, em que apenas 3%, 4% e 5% de DP3+ restaram após uma incubação por 17 h, respectivamente, embora 18% e 13% tenham restado nas reações de TrGA e AnGA, respectivamente.

[00223] FraGA1, WcoGA1, TrGA e AnGA foram adicionalmente avaliadas para atividade em direção ao amido liquefeito em pH 2,0. O procedimento de incubação foi igual ao descrito acima exceto pelo fato de que as enzimas foram dosadas a 0,2 mg/gds e incubações foram realizadas em pH 2,0. Amostras foram coletadas em 4, 21, 29, 45, 53 e 70 h. Em pH 2, FraGA1 e WcoGA1 superaram bastante TrGA e An- GA em taxa de hidrólise de DP3+ e na conversão de DP1 final, con- forme mostrado na Tabela 5. FraGA1 e WcoGA1 produziram > 90% e 2 72% de DP1 após uma incubação de 70 h a 32 ºC e 55 ºC, respecti- vamente, enquanto TrGA rendeu apenas 54% e 3%. Esses resultados indicam que FraGA1 e WcoGA1 têm alto potencial em processo de sacarificação e processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), com atividade significativa em pH 2,0 a 3,0 e 30 a 55 "ºC. ºC ou 55 ºC com o uso de amido liquefeito como um substrato. Temperatura mm me DR (O) (h) DP3+ DP3 DP2 DP1 PE Er Ee) e ro oia

Tabela 4. Hidrólise relativa em pH 3 através de glucoamilases testadas a 32 do lncubação Tempo |% de/% de/% dei% de

(O) (h) DP3+ |DP3 DP2 DP1 | Roses A az jon aa 708 tea so [4 os os ns 77 | [24 ós og as eos | [63 aa oo 6a a [2 oro os 6a ess | WeoGA1 | 32 [VT eo oa as es ms je ds e [8 ss fo sz 5 re Es e Te e e 7) rr Esses

Tabela 4. Hidrólise relativa em pH 3 através de glucoamilases testadas a 32 ºC ou 55 ºC com o uso de amido liquefeito como um substrato.

Temperatura p Tempo |% de/% de/% dei% de de incubação (O) (h) DP3+ |DP3 DP2 DP1 [48 oe og ar eo | [63 qa oo ao 6a [7 ae os 6a ea | [A 6 jog 62 69 FraGA1 55 [68 ão on as esa | Fr ee) WeoGA1 | s5 [1º | [63 ato joao ez na Tabela 5. Hidrólise relativa em pH 2 através de glucoamilases testadas a 32 ºC ou 55 ºC com o uso de amido liquefeito como um substrato.

Temperatura de | Tempo /% dei% de/% dej/% de incubação (1) |(h) DP3+ DP3 DP2 DP1 AGA | so oo jean | [48 jato jon as ros | TA | rn

Tabela 5. Hidrólise relativa em pH 2 através de glucoamilases testadas a 32

Temperatura de | Tempo /% dei% de/% dej/% de

[Mme Ramo mo Joe Jos fare om = Rss oe e er Fe e

|) EEE 8 jeto oo 24 eos |

[58 jós oo as lena o jato jose at [762 |

WeoGA1 | 32 [2 ja jon ao ema o je jon as jeas

TA los [2 jera so ar ar [45 jess 60 39 34 o je so az aa

| EITTE FRAGA | 55 2 ji67 os 46 [789 | [8 ja os 44 ires

ºC ou 55 ºC com o uso de amido liquefeito como um substrato. Temperatura de | Tempo /% dei% de/% dej/% de [Mme Ramo mo Joe Jor fare om pod e 16 dor das 7% | Pole pe e e) —l) DE E es A) pese e mm) EXEMPLO 6 Avaliação de glucoamilases em sacarificação em pH 3,5 e 4,5

[00224] O desempenho de sacarificação de FraAGA1 e WcoGA1 e AnGA foi avaliado em condição de pH 4,5 tradicional, e um pH inferior, 3,5. Produção de DP1 foi medida analisando-se a composição de açú- car após o tratamento com dosagem de enzima igual. As incubações de glucoamilases (dosadas em 50 ug/gds) e amido liquefeito de milho de alfa-amilase-pré-tratada (32% de ds) foram realizadas a 60 ºC, pH 3,5 e 4,5, e amostras foram coletadas em 24, 48 e 72 h. Todas as in- cubações foram arrefecidas aquecendo-se a 100 “ºC por 15 min. De- pois da centrifugação, sobrenadantes de cada amostra foram transfe- ridos para novos tubos e diluídos 400 vezes em 5 mM de H2SO. para análise de HPLC. A separação de HPLC foi realizada com o uso de um sistema de HPLC da série Agilent 1200 com uma coluna Fast fruit (100 mm x 7,8 mm) a 80 ºC com um gradiente isocrático de 5 mM de H2SO, em uma taxa de flux de 1,0 ml/min. Os produtos de oligossaca- rídeo foram detectados com o uso de um detector de índice de refra- ção. As atividades glucogênicas das amostras são resumidas na Tabe- la 6. A produção de DP1 por FraGA1 e WcoGA1 em pH 3,5 após 48h a incubação foi comparável com resultados de com o uso de ANnGA em pH 4,5 após uma incubação de 72 h.

Tabela 6. Análise de composição de açúcar de amido liquefeito de milho tratada com FraGA1, WcoGA1 ou AnGA a 60 ºC, em pH 3,5 ou 4,5 para 24, “mp TE] DP3+ DP3 DP2 mm is e as sr |WeoGAT [156 Jos ae et [Ansa isto jog 15 620 | as je

EEE nen em Es re [usem 25 Jor das Jar EXEMPLO 7 Estabilidade de FraGA1 e WcoGA1 sob condições de digestão de ruminante

[00225] A estabilidade de enzimas de FraGA1 e WcoGA1 foi medi- da em pH 2,2, 5,6 e 6,5 sob condições de digestão ruminante in vitro conforme descrito abaixo.

[00226] Condições de ensaio em pH 5,6: A mistura de reação con- teve 1 ml de fluido de rúmen coletado de vacas leiteiras locais (Fou- lum, Dinamarca), que tem um pH medido de 5,6 e 20 ul de glucoamila-

se (a proteína concentração de FraGA1 foi de 5 mg/ml e a concentra- ção de proteína de WcoGA1 foi de 6,5 mg/ml). As misturas de reação foram mantidas a 40 ºC por 10 h com agitação a 100 rpm. Uma mistu- ra de reação mantida a 5 ºC serviu como controle; para bloco bruto, nenhuma enzima foi adicionada. Cada tratamento de enzima ou bloco bruto foi realizado em triplicado. No fim do período de incubação, 0,5 ml de 10% (p/p) de amido de milho (Sigma, S-4126) foi adicionado e as amostras foram incubadas adicionalmente por 140 min a 40 “Ce com agitação a 240 rpm. O percentual (%) de atividade residual foi calculado como a seguir: atividade após incubação com enzima a 40 ºC menos o bloco bruto, dividido pela atividade após incubação com enzima a 5 ºC menos o bloco bruto, multiplicado por 100.

[00227] Condições de ensaio em pH 6,5: As condições foram as mesmas conforme descrito acima de pH 5,6, exceto pelo fato de que o pH foi ajustado para pH 6,5 e DTT foi adicionado a 20 mM.

[00228] Condições de ensaio em pH 2,2: Fluido de rúmen que foi congelado após coleta foi, então, descongelado e centrifugado antes do uso. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi suspenso em água purificada a uma razão (precipitado contra água) de 1:3. O pH de pasta fluida suspensa foi ajustado para pH 2,2. Alíquotas de 0,6 ml foram adicionadas em tubos de 2 ml que contêm 0,4 ml de pepsina (2.500 U de pepsina/ml, Sigma P7000) em 60 mM de glicina-HCI (pH 2,0) e 20 ul de cada uma das glucoamilases (a concentração de prote- ína do FraGA1 foi de 5 mg/ml e a concentração de proteína de Wco- GA1 foi de 6,5 mg/ml). As misturas de reação foram incubadas a 40 ºC por 3 h com agitação a 100 rpm. No fim da incubação, 0,5 ml de 15% (em p/p) de amido de milho (Sigma, S-4126) suspenso em 250 mM de MES em pH 6,5 foi adicionado e as amostras foram incubadas por 3 h a 40 ºC. O percentual (%) de atividade residual foi calculado como a seguir: atividade após incubação com enzima a 40 ºC menos o bloco bruto, dividido pela atividade sem pré-incubação (controle) menos blo- co bruto, multiplicado por 100.

[00229] No fim de cada reação, os tubos de ensaio foram centrifu- gados e sobrenadantes foram transferidos para placas de PCR e tra- tados termicamente a 95 ºC por 5 min. Amostras nos tubos de PCR tratados termicamente foram executadas sobre placas de filtro de 96 poços, e alíquotas de 10 ul de cada filtrado foram usadas para quanti- ficar o teor de glicose através de HPLC com o uso de uma coluna de carboidrato BioRad (Aminex HPX-87N) e água como o eluente, a 75 ºC. Teor de glicose foi usado como uma medição de atividade de glu- coamilase no substrato de amido. Conforme mostrado na Tabela 7, observou-se que as glucoamilases FraGA1 e WcoGA1 retiveram 60 a 70% de atividade residual após incubações a 40 ºC em pH 5,6 e em pH 6,5 após 10 h. Também foi observado que depois da incubação na presença de pepsina de suíno em pH 2,2 e 40 ºC por 3h, essas duas glucoamilases retiveram aproximadamente 90% de atividade. e WcoGA1 sob condições de digestão ruminante medida em amido de mi- lho. 5,6, 10 h 6,5, 10 h presença de pepsina EXEMPLO 8 Estabilidade e atividade de FraAGA1 e WcoGA1 sob condições de digestão de intestino delgado

[00230] De modo a simular condições de digestão de intestinal del- gado, uma porção de fluido de rúmen foi misturada com duas porções de fluido de rúmen artificial de acordo com o protocolo descrito por Menke e Steingass (Liu, J. X., A. Susenbeth, e K. H. Súdekum. 2002. ln vitro gas production measurements to evaluate interactions between untreated and chemically treated rice straws, grass hay, and mulberry leaves. Journal of Animal Science 80:517 a 524). Farinha de milho foi adicionada a uma concentração final de 10% (em p/p) e ajustada para pH 6,5. Um ml desta mistura foi misturado com 50 ul de pancreatina porcina (Sigma, P7545, 50 mg/ml de solução reserva de pancreatina) e 15 ul de uma amostra de glucoamilase (0,08 mg de FraGA1 ou 0,10 mg de WcoGA). Para amostra de bloco bruto, nem pancreatina nem a glucoamilase foram adicionadas. As reações foram realizadas a 40 ºC por 3 h com agitação a 240 rpm. As misturas de reação foram, então, centrifugadas a 4.000 rpm por 10 min e 150 ul de sobrenadante foram transferidos a uma placa de PCR e aquecidos a 95 ºC por 5 min. Alí- quotas de 50 ul foram transferidos para uma placa de filtro de 0,45 um e 90 ul de água foi adicionado e a placa foi centrifugada a 4.000 rom por 15 min. O filtrado foi analisado para teor de glicose (G1), maltose (G2) e maltotriose (G3) através de HPLC, conforme descrito no Exem- plo 7. Cada reação de tratamento ou bloco bruto foi realizada em tripli- cado e a média dos valores é relatada nas Tabela 8. Std. dev significa desvio padrão. Tabela 8. Liberação de glicose (G1), maltose (G2) e maltotriose (G3) da farinha de milho por glucoamilase FraGA1 e WcoGA1 e sua mistura com pancreatina porcina. Tratamento Área de pico Área de pico Área de pico médio de G1 médio de G2 médio de G3 Bloco bruto (ne- nhuma enzima) 5,7 0,38 [9,4 0,48 |2,2 0,17 Fe ae alo Fra- GA1+pancreatina 24,7 1,58 | 39,4 1,08 |4,0 1,91 Weoo- GA1+pancreatina 36,1 0,98 | 30,4 0,25 |3,4 0,49

[00231] “Conforme mostrado na Tabela 8, a pancreatina porcina |i- bera glicose, maltose e maltotriose da farinha de milho. Ambas enzi-

mas de FraGA1 e WcoGA1 liberam glicose do amido bruto na farinha de milho. A WcoGA1 também tem capacidade para reduzir o nível de maltose sob as condições experimentais. Uma combinação das gluco- amilases com a pancreatina gera glicose, maltose e reduz a maltotri- ose. Esses resultados sugerem que as glucoamilases podem funcionar juntamente com a alfa-amilase presente na pancreatina mesmo na presença de proteases digestivas presentes em pancreatina porcina (conforme relatada pelo fabricante). /n vivo, a glicose gerada poderia ser absorvida diretamente pelo animal, embora a maltose formada pu- desse ser convertida em glicose pela maltase-glucoamilase ligada à borda de escova nas células epiteliais do intestino delgado. A farinha de milho feita de milho maduro teve a seguinte composição: 88,2% de matéria seca, 9,3% de proteína bruta, 2,0% de fibra de detergente de ácido, 6,6% de fibra de detergente neutro tratado com amilase, 78,5% de carboidratos não fibrosos e 89,0% de nutrientes digestivos totais, e foi moída até menos que 200 um. EXEMPLO 9 FraGA1 para aumentar a digestão de matéria seca e produção de gás na fermentação ruminal em milho

[00232] Os efeitos de FraGA1 foram avaliados em digestibilidade de matéria seca (DMD), produção de gás, digestibilidade de amido e pH em um sistema de fermentação em batelada in vitro com o uso de mi- lho maduro como substrato (4 mm moídos). A eficácia de FraGA1 foi avaliada em três doses (0, 0,25, 0,5 e 0,75 mg/g de substrato em base alimentada) em três execuções separadas com quatro replicações por combinação de dose de enzima em cada execução. A eficácia de cada enzima foi determinada no modelo de fermentação de rúmen após in- cubação de conteúdo de rúmen tamponado com substrato em uma configuração de fermentação descrita anteriormente (Adesogan, A.T., Krueger, N.K., e Kim, S.C. 2005. Anim. Feed Sci. Technol. 123: 211 a

223; Krueger, N. A., e A. T. Adesogan. 2008. Anim. Feed Sci. Tech. 145: 84 a 94; Goering, H. K.e P. J. Van Soest. 1970. Agric. Handbook No. 379. ARS USDA, Washington, DC, página 20). A composição do milho maduro usado neste sistema de fermentação em batelada in vi- tro foi dada no Exemplo 8. Amostras de 0,5 g do milho maduro, moí- das até 4 mm, foram ponderadas em 4 bolsas de filtro F57 replicadas (ANKOM Technology, Macedon, NY). A enzima FraGA1 foi preparada em 0,1 M de tampão de citrato e fosfato (pH 6,0) e adicionada no milho maduro moído nas bolsas de filtro em O, 0,25, 0,5 e 0,75 mg de proteí- na de enzima por gramas de substrato. As bolsas de filtro foram, en- tão, vedadas com um vedador Uline Tabelatop Poly Bag (Impulse& tipo AIE-200) e colocadas imediatamente em garrafas de 160 ml de soro que contêm fluido de rúmen tamponado (52 ml). Garrafas vazias que contêm apenas uma bolsa de filtro, assim como controles que contêm apenas milho maduro moído sem enzima além do fluido de rúmen tamponado também foram incluídos. As garrafas foram, então, fechadas com batentes de borracha e vedadas com vedações de alu- mínio. Foram incubadas por 7 h a 39 ºC em uma incubadora de ar for- çado. No fim da incubação, as bolsas de filtro que contêm os resíduos do milho maduro foram secas em forno a 60 ºC por 48 h e ponderadas de modo a quantificar DMD. A pressão de gás dentro das garrafas foi medida com um transdutor de pressão e posteriormente convertida em volume de gás após as 7 h de incubação. A seguinte fórmula foi usada para a conversão de pressão de gás em volume de gás: Volume de gás (ml) = (pressão de gás (psi) * 4,8843) + 3,1296. A equação foi formulada com base nas condições experimentais.

[00233] Preparação do fluido de rúmen tamponado foi como a se- guir: fluido ruminal foi aspirado a partir de três vacas leiteiras Holstein ruminalmente canuladas lactantes 2 a 3 h após o consumo de ração misturada total (TMR). A composição de ingrediente de TMR dada às vacas leiteiras ruminalmente canuladas, com base em matéria seca, consistiu em: 38,2% de silagem de milho, 27,3% de milho descascado moído, 14,5% de farinha de soja com 44% de proteína bruta, 9,1% de polpa cítrica, 4,5% de pré-mistura de Feedlot, 4,0% de meia florescên- cia de feno de alfafa, 1,8% de intensificador de energia (MS Specialty Nutrition, Dundee, IL), e 0,5% de Novasil (BASF, Alemanha). O fluido de rúmen coletado foi filtrado através de quatro camadas de morim antes de misturar com saliva artificial pré-aquecida (39 ºC). A compo- sição da saliva artificial incluiu uma solução micromineral de CaCl2:2H20, MnCl2:4H20, CoCl2:6H20, FeCl2:6H20; uma solução ma- cromineral de Na2HPO4: 12H20, KH2PO4, MgSO4 7H20; uma solução de tampão de (NHa4)2=HCO;3 e NaHCO;3; uma solução de tripticase pep- tona (triptona, Sigma-Aldrich, St Louise, MO, EUA); resazurina indica- dora de redução de oxidação e uma solução redutora que contém cis- teína HCl, 1 M de NaOH, Na>2S:9H2O e água destilada (Goering, H. K. e P. J. Van Soest. 1970. Agric. Handbook No. 379. ARS USDA, Wa- shington, DC, página 20). A razão de volume entre o fluido de rúmen e a saliva artificial foi de 1:2.

[00234] Análise estatística: Para todos os experimentos no Exemplo 9, os dados coletados foram analisados com o uso do procedimento GLIMMIX de SAS (versão 9.1; Instituto SAS, Cary, NC). Experimentos foram projetados como projeto de bloco completamente aleatorizado, em que cada execução foi considerada um bloco. A dose foi usada como efeito fixado no modelo quando as enzimas foram testadas em diferentes doses. A resposta variável incluiu DMD in vitro e produção de gás. A execução foi considerada um fator aleatório. Efeitos fixados do modelo incluíram tempo de amostragem para os parâmetros de fermentação medidos em diferentes momentos após a incubação. O procedimento UNIVARIATE de SAS foi usado para testar os resíduos para valores atípicos e normalidade antes das análises finais serem realizadas. Efeitos de tratamento foram declarados significativos em P < 0,05 embora nenhuma tendência tenha sido definida em 0,05 < P < 0,10.

[00235] “Resultados: Os resultados mostrados na Tabela 9 abaixo indicam que sob condições de fermentação de rúmen in vitro descritas no presente documento, a glucoamilase FraAGA1 aumentou DMD e produção de gás de uma maneira dependente de dose. Há uma ten- dência de digestibilidade de amido aumentada em dose de 0, 0,25 e 0,5 mg de proteína de enzima por grama de milho maduro moído. O pH foi bastante constante independentemente das dosagens de enzi- ma. digestibilidade de matéria seca, produção de gás, níveis de pH e digestibilidade de amido com o uso de grão de milho maduro como substrato. E rede esses o To Te Tom se vaarr| a? As médias dentro de uma linha com diferentes sobrescritos diferem (P<0,05). EXEMPLO 10 Comparações de sequência de proteínas

[00236] Proteínas relacionadas foram identificadas por uma busca BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389 a 3402, 1997) com o uso das sequências de aminoácido maduro previstas para FraGA1 (SEQ ID NO: 7), WcoGA1 (SEQ ID NO: 8) e TeGA (SEQ ID NO: 9) contra banco de dados NCBI e Genome Quest Patent com parâmetros de busca definidos em valores padrão e um subconjunto são mostra- dos nas Tabelas 10A e 10B (FraGA1), Tabelas 11A e 11B (WcoGA1) e Tabelas 12A e 12B (TeGA), respectivamente. Percentual de identidade

(PID) para ambas configurações de busca é definido como o número de resíduos idênticos dividido pelo número de resíduos alinhados no alinhamento em par. O valor marcado "comprimento de sequência" nas Tabelas corresponde ao comprimento (em aminoácidos) para as proteínas referidas com os números de acesso listados, enquanto "Comprimento alinhado" se refere à sequência usada para cálculo de alinhamento e PID. Tabela 10A: Lista de sequências com percentual de identidade à proteína madura prevista FraGA1 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante

NCBI Comprimento | Comprimento de Nº de Acesso Organismo de Sequência | Alinhamento XP 012178139 100% | Fibroporia radiculosa Postia placenta Mad- XP 002475369.1 | 80% |698R 569 552 PCH39892.1 80% Wolfiporia cocos MD- | 569 104 SS10 554 BMENTISST — [77% | Fomiíopsis palustris Daedalea — quercina KZT67263.1 77% |L-15889 571 553 Fomitopsis — pinicola EPS97511.1 76% | FP-58527 SS1 570 554 Tabela 10B: Lista de sequências com percentual de identidade à proteina madura prevista FraGA1 identificada a partir do banco de dados Genome Quest Compri- Comprimento de Identificador GQ Organismo mento alinhamento US20090325240-1847 Fomitopsis palustris KR834708- AUZ02575 Fomitopsis palustris WO?2014177541 Trametes — cingulata (múltiplas sequências) |72,8 | sintético 556 555 US20170314003-0002 Nigrofomes sp. US20080318284-0005 Trametes cingulata WO2015065871- BBZ68582 71,6 Trametes cingulata 561 560 vista WcoGA1 identificada a partir do banco de dados de proteína não redundante NCBI Lines nes mo jorgamemo Sans o Rmnm Nº de Acesso Organismo de Sequência | de Alinhamento PCH39892.1 100% | Wolfiporia cocos MD-104 | 569 sv as Fomitopsis pinicola FP- abela 11B: Lista de sequências com percentual de identidade à proteína madura prevista mi O e ramo nhamento 02014177541 Trametes cingulata Tabela 12A: Lista de sequências com percentual de identidade à proteína madu- ra prevista TeGA identificada a partir do banco de dados de proteína não redun- dante NCBI Comprimento | Comprimento Lince acesso ro forame — ds Sequéncia. | de Almramento CAC28076.1 99% Rasamsonia emer- | 618 590 Ss o Aa XP 013329152.1 | 93% Rasamsonia emer- | 617 A e cassa se GAD95639.1 75% Byssochlamys 622 591 MA E a KUL85250.1 71% Talaromyces verru- | 616 A A Pr ia PS GAMA40728.1 70% Talaromyces cellu-|616 O a

ITabela 12B: Lista de sequências com percentual de identidade à proteina madura prevista TeGA identificada a partir do banco de dados Genome Quest ompri- Comprimento Identificador GQ Oo ento de alinhamento

[00237] Um alinhamento das sequências maduras previstas de FraGA1 (SEQ ID NO: 7); WcoGA1 (SEQ ID NO: 8); TeGA (SEQ ID NO: 9); ANGA (aa 25 a 640 de XP 001390530.1, SEQ ID NO: 10); TrGA (2VN4 A, SEQ ID NO: 11); KZT67263.1 (aa 19 a 571 de SEQ ID NO: 12); XP 002475369.1 (aa 18 a 569 de SEQ ID NO: 13); US20090325240-1847 (aa 17 a 570 de SEQ ID NO: 14); KZT09226.1 (aa 18 a 570 de SEQ ID NO: 15); WO2016196202-0012 (SEQ ID NO: 16); US20170314003-0002 (aa 19 a 5/75 de SEQ |D NO: 17); GAD95639.1 (aa 38 a 622 de SEQ ID NO: 18); US20170306309-0023 (SEQ ID NO: 19); e CAC28076.1 (aa 29 a 618 de SEQ ID NO: 20) foi realizado com parâmetros-padrão com o uso do software CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22:4.673 a 4.680, 1994). O alinhamento de múltiplas sequências é mostrado na Figura 1. Exemplo 11 Atividade Relativa de Glucoamilases em pH 1,9, 4,5e 6,0

[00238] Liberação de glicose do substrato de amido de milho foi medida para as glucoamilases FraGA1 e WcoGA1 sob condições que imitaram aquelas sentidas no sistema digestivo ruminante. Cada mis-

tura de reação conteve 0,1 mg de enzima purificada e 10% (em p/v) de amido de milho (Sigma S-4126) em um volume de 1 ml. Para as rea- ções de pH 1,9, 0,1 M de glicina-HCI (pH 1,9) foi usado como diluente, e as reações também contiveram 1.000 unidades de pepsina porcina (Sigma P-7000). Para as reações de pH 4,5, o pH de 0,1 M de glicina foi ajustado para 4,5 com o uso de 5 N de NaOH e pepsina foi omitida. Para as reações de pH 6,0, 0,1 M de Mes-NaOH (pH 6,0) foi usado como diluente e pepsina foi omitida.

[00239] As reações foram realizadas a 40 ºC com agitação por 2 h. Amostras foram centrifugadas para separar o sobrenadante e grânulos de amido de milho não reagidos. O sobrenadante foi aquecido a 99 ºC por 10 min, filtrado e 20 ul de filtrado foi injetado em uma HPLC com o uso de coluna de carboidrato de Na para separar e quantificar a glico- se gerada com o uso de um padrão de glicose em 1 mg/ml.

[00240] Os resultados das reações são mostrados na Tabela 13. A atividade de liberação de glicose é expressa em mg de glicose libera- da por ml de reação. Ambas glucoamilases mostraram a maior ativida- de em pH 4,5 em relação ao pH 1,9 e 6,0. Constatou-se, surpreenden- temente, que ambas glucoamilases demonstraram atividade em pH 1,9 na presença de pepsina, e essa atividade em pH 1,9 foi mais que 80% da atividade em pH 6,0. milho Lo] FSM | WseGAt | [SS SEESTTTEENT] mr | mm

Claims (29)

UT REIVINDICAÇÕES

1. Método para sacarificação de um substrato de amido, ca- racterizado pelo fato de que compreende colocar o substrato de amido em contato com uma glucoamilase selecionada a partir do grupo que consiste em: a. um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou 8 ou 9; b. um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 8; c. um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, ou 8; d. um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 9; ou e. um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante a secreção de um hospedeiro de expressão; em que a sacarificação é realizada em um pH entre 2,0 e 6,0.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que sacarificar o substrato de amido resulta em um xarope com alto teor de glicose.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que o xarope com alto teor de glicose compreende uma quantidade de glicose selecionada a partir da lista que consiste em pelo menos glicose a 95,5%.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente fer- mentar o xarope com alto teor de glicose a um produto final.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sacarificação e fermentação são realizadas como um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracteri- zado pelo fato de que o produto final é álcool, por exemplo, etanol.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracteri- zado pelo fato de que o produto final é um produto bioquímico selecio- nado a partir do grupo que consiste em um aminoácido, um ácido or- gânico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato de mo- nossódio, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo de ômega 3, butanol, lisina, ácido itacônico, 1 ,3-propanediol, biodiesel e isopreno.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o substrato de amido é cerca de 5% a 99%, 15% a 50% ou 40 a 99% de sólido seco (DS).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o substrato de amido é selecio- nado dentre trigo, cevada, milho, centeio, arroz, sorgo, farelo, mandio- ca, milo, painço, batata, batata doce, tapioca e qualquer combinações dos mesmos.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o substrato de amido com- preende amido liquefeito, amido gelatinizado ou amido granular.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmen- te adicionar uma hexoquinase, uma xilanase, uma glicose isomerase, uma xilose isomerase, um fosfato, uma fitase, uma pululanase, uma beta-amilase, uma alfa-amilase, uma glucoamilase, uma protease, uma celulase, uma hemicelulase, uma lipase, uma cutinase, uma trea- lase, uma isoamilase, uma enzima de redução, uma esterase, uma transferase, uma pectinase, uma hidrolase, uma alfa-glucosidase, uma beta-glucosidase, ou uma combinação dos mesmos ao substrato de amido.

12. Método para sacarificação e fermentação de um subs- trato de amido para produzir um produto final, caracterizado pelo fato de que compreende colocar o substrato de amido em contato com uma glucoamilase selecionada a partir do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou 8 ou 9; b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 8; c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, ou 8; d) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 9; ou e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante a secreção de um hospedeiro de expressão; em que a sacarificação e fermentação são realizadas em um pH entre 2,0 e 6,0, preferencialmente entre pH 2,0 e pH 5,0, prefe- rencialmente entre pH 2,0 e pH 4,0, mais preferencialmente, entre pH 2,0 e pH 3,0.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que a sacarificação e fermentação são realizadas co- mo um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

14. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, carac- terizado pelo fato de que o produto final é álcool, por exemplo, etanol.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que o substrato de amido sacarificado e fermentado resulta em um nível reduzido de DP3+ e um nível aumentado de DP1 em comparação a colocar o substrato de amido em contato com An- GA.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, carac- terizado pelo fato de que o produto final é um produto bioquímico sele- cionado a partir do grupo que consiste em um aminoácido, um ácido orgânico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido succínico, glutamato de monossódio, ácido glucônico, gluconato de sódio, gluconato de cálcio, gluconato de potássio, glucono delta-lactona, eritorbato de sódio, ácido graxo de ômega 3, butanol, lisina, ácido itacônico, 1 ,3-propanediol, biodiesel e isopreno.

17. Método para aumentar a digestibilidade de amido em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar pelo menos uma glucoamilase selecionada a partir do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou 8 ou 9; b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 8; c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, ou 8; d) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 9; ou e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante a secreção de um hospedeiro de expressão; como um aditivo de alimentação para alimentar para um animal em que a dita glucoamilase (a) tem pelo menos 20% de ativi- dade ou pelo menos 20% de atividade residual maior em pH menor ou igual a 3 na presença de pepsina ou fluido de rúmen conforme compa- rado à atividade das enzimas em pH 6 por si só ou na presença de flu- ido de rúmen, e (b) a enzima funciona com amilase pancreática para aumentar o rendimento de glicose.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que, quando o animal é um ruminante, a dita enzima é ativa em pelo menos duas ou três câmaras digestivas do animal rumi- nante que compreendem um rúmen, um abomaso e um intestino del- gado

19. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, carac- terizado pelo fato de que a dita pelo menos uma glucoamilase tem ca- pacidade de hidrolisar amido bruto conforme medido em um ensaio de liberação de glicose com uso de amido bruto.

20. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compre- ende uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 80% de identidade à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4, 5 ou 6.

21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a se- quência de polinucleotídeos, como definida na reivindicação 20, ligado de modo operativo a uma ou mais sequências de controle que contro- lam a produção do polipeptídeo decodificado em um hospedeiro de expressão, e em que a dita sequência reguladora é heteróloga à se- quência de nucleotídeos de codificação, ou a dita sequência regulado- ra e a sequência de codificação não são dispostas conforme encontra- das unidas por natureza.

22. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fa- to de que compreende os polinucleotídeos, como definidos na reivindi- cação 20.

23. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que é uma célula de Tricho- derma, Aspergillus, Myceliopthora ou Saccharomyces.

24. Célula hospedeira recombinante de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que é uma célula de E. coli, Bacillus, Streptomyces ou Pseudomonas.

25. Célula hospedeira recombinante, de acordo com a rei- vindicação 22, caracterizada pelo fato de que é um micro-organismo etanologênico.

26. Célula hospedeira recombinante, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que ainda expressa e secreta uma ou mais enzimas adicionais seleciona- das dentre o grupo que compreende protease, hemicelulase, celulase, peroxidase, enzima lipolítica, enzima metalolipolítica, xilanase, lipase, fosfolipase, esterase, per-hidrolase, cutinase, pectinase, pectato liase, mananase, queratinase, redutase, oxidase, fenoloxidase, lipoxigenase, ligninase, alfa-amilase, pululanase, fitase, tanase, pentosanase, mala- nase, beta-glucanase, arabinosidase, hialuronidase, condroitinase, laccase, transferrase ou uma combinação dos mesmos.

27. Composição de aditivo de alimentação ou pré-mistura, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma glucoami- lase selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, ou 9; (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, ou 9; (c) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, 8, ou 9; (d) um polipeptídeo que tem pelo menos 83% de identidade a um ligante e um domínio catalítico de SEQ ID NO: 7, 8, ou 9; ou (e) um polipeptídeo maduro produzido pelo processamento do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1, 2, ou 3 por um sinal peptidase ou modificação pós-translacional durante a secreção de um hospedeiro de expressão; e/ou (f) opcionalmente pelo menos um mineral e/ou pelo menos uma vitamina.

28. Composição de aditivo de alimentação ou pré-mistura, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais das enzimas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma protease, uma amilase, uma xilanase e uma fitase.

29. Composição de aditivo de alimentação ou pré-mistura, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais micróbios alimentados diretos se- lecionados a partir do grupo que consiste em Bacillus, Bactérias de ácido láctico e leveduras.

FIG. | s = le Ss ã 2 | 3 &ê.

Ss à ls 2 E gg 8/1 e É / 2/2 [És 2 =- |= | à | é [2/8 | 8 [8/8 [/8|s ã = | /8| 5 /8| 8 IS / = [1/2 [4 1l< 2 |< s É 1 IE Ss s so s 2 s & S Ss õ É Ss & NS EP NS = n < F Z SW e 1 = z =“ £ = E z -) o = - = = < sm | spo e ps a 7 7 so [ss] US2009032524 | 76.2 | 79.5 85 732 | 743 [712 [511 | 503 | 494 | 49.5 [481 [47.9 0-1847 wo201619620 [723 [71 [739 [732 [743 [| 688 80.6 | 51.6 | 50.6 | 499 | 49.8 [49.6 | 45.2 2-0012 Us2017031400 [715 [69.9 [752 [715 [712 [684 | 806 497 [495 | 487 | 48.6 [ 49.3 | 46.2 3-0002 Us2017030630 | 47.2 [482 | 474 | 486 | 503 | 476 | 506 | 495 | 75,7 95.1 [946 | 57.7 | 613 9-0023 ss — ps Tas pes es os [55 [os 56 75 se 55] [57 Te] TONBNNA | 158 [465 [461 [ 119 [ 617 [ 115 | D6 | DS SA | 57 | SA | 53] — [0] Fe Es FFP EFE STE)