CN112218953A - 葡糖淀粉酶及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了使用葡糖淀粉酶将含淀粉材料糖化的方法、生产发酵产物的方法和通过其方法生产的发酵产物，以及使用本文所述的葡糖淀粉酶中的至少一种提高反刍动物中淀粉消化率的方法。

Description

葡糖淀粉酶及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月9日提交的国际专利申请号PCT/CN 2018/078575的优先权，将该国际专利申请的披露通过引用以其全文结合于此。

技术领域

本披露涉及使用至少一种葡糖淀粉酶糖化和/或水解含淀粉材料的方法。本披露的葡糖淀粉酶也可以用作动物的饲料添加剂以增强淀粉消化。此外，本披露还涉及生产发酵产物的方法以及通过所述方法生产的发酵产物。

背景技术

葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由若干种丝状真菌和酵母产生。

葡糖淀粉酶的一种非限制性主要应用是将部分加工的淀粉/糊精糖化成葡萄糖，葡萄糖是许多发酵过程的必需底物。然后可以使用发酵生物将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮基-D-葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H₂和CO₂)以及更复杂的化合物。

尽管据报道多种微生物产生葡糖淀粉酶(因为它们在细胞外分泌大量的酶)，但用于商业目的的葡糖淀粉酶传统上使用丝状真菌生产。

糖化或发酵可在低pH值下进行，因为通常发酵生物会迅速降低pH值，并且某些乳酸杆菌可将pH值进一步降低至约3.5。在另一个方面，低pH值将使污染的风险最小化。然而，商业上使用的真菌葡糖淀粉酶具有某些局限性，例如低pH敏感性或在低pH(例如，像pH值低于6)下的低性能/活性。

在胃蛋白酶存在下在低pH下具有活性的葡糖淀粉酶可用作反刍动物的饲料添加剂。用作反刍动物饲料添加剂的酶主要是纤维蛋白溶酶，例如纤维素酶、β-葡聚糖酶和半纤维素酶(Beauchemin等人,2004的表1)。A rationale for the development of feedenzyme products for ruminants[开发用作反刍动物饲料酶产品的基本原理].Can.J.Anim.Sci.[加拿大动物科学杂志]84:23-36)。关于用于反刍动物用途的淀粉水解酶的报道是有限的。

淀粉在饲料和饲料来源中的消化率高度可变，并且取决于许多因素，包括淀粉和饲料基质两者的物理结构。2005年2月17日公开的美国专利申请公开2005/0037053公开了具有淀粉酶活性并且能够降解单胃动物(如家禽和猪)的包含淀粉的饲料中抗性淀粉的酶的用途。2008年1月17日公开的WO 2008/06881公开了细菌淀粉酶用于牛科亚家族反刍动物的饲料中以改善产奶量、饲喂饮食的表观消化率、喂养料干物质消失、体重增加和/或饲料转换率的用途。2015年9月3日公开的WO 2015/128366公开了将细菌淀粉酶与一种或多种蛋白酶组合用于牛科亚家族反刍动物的饲料中以改善玉蜀黍和/或玉蜀黍青贮的消化率(具体地，以改善产奶量、体重增加和/或饲料转化率)的用途。因此，仍然需要增加动物的淀粉消化率。

因此，需要寻找新的葡糖淀粉酶，以改善糖化和/或发酵过程中的低pH耐受性或增加饲喂含淀粉饲料的动物的淀粉消化率。

发明内容

本披露涉及使用至少一种葡糖淀粉酶糖化含淀粉材料的方法。本披露的葡糖淀粉酶也可以用作动物的饲料添加剂以增强淀粉消化。所述方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一个方面，一种糖化淀粉底物的方法，所述方法包括将所述淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

b)与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

c)与SEQ ID NO:7或8的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

d)具有SEQ ID NO:9的催化结构域的氨基酸序列的多肽；或

e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

其中所述糖化在pH 2.0至pH 6.0之间进行，

2.在如段落1所述的方法的一些实施例中，其中糖化所述淀粉底物产生高葡萄糖糖浆。

3.在如段落1或2所述的方法的一些实施例中，其中所述高葡萄糖糖浆包含选自以下列表的葡萄糖量，该列表由以下组成：至少95.5％葡萄糖。

4.在如段落1-3中任一项所述的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将所述高葡萄糖糖浆发酵成终产物。

5.在如段落4所述的方法的一些实施例中，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

6.在如段落4或5所述的方法的一些实施例中，其中所述终产物是醇，例如乙醇。

7.在如段落4或5所述的方法的一些实施例中，其中所述终产物是选自下组的生物化学品，该组由以下组成：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油和异戊二烯。

8.在如段落1-7中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述淀粉底物是约5％至99％、15％至50％或40％至99％干固体(DS)。

9.在如段落1-8中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述淀粉底物选自小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、买罗高粱、粟、马铃薯、甘薯、木薯淀粉及其任何组合。

10.在如段落1-9中任一项所述的方法的一些实施例中，其中所述淀粉底物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒状淀粉。

11.在如段落1-10中任一项所述的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括向所述淀粉底物中添加己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、水解酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或其组合。

12.在另一个方面，一种糖化和发酵淀粉底物以产生终产物的方法，所述方法包括将所述淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

b)与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

c)与SEQ ID NO:7或8的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

d)具有SEQ ID NO:9的催化结构域的氨基酸序列的多肽；或

e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

其中所述糖化和发酵在pH 2.0至pH 6.0之间进行，优选在pH 2.0至pH 5.0之间、优选在pH 2.0至pH 4.0之间、更优选在pH 2.0至pH 3.0之间进行。

13.在如段落12所述的方法的一些实施例中，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

14.在如段落12或13所述的方法的一些实施例中，其中所述终产物是醇，例如乙醇。

15.在如段落12所述的方法的一些实施例中，其中所述糖化和发酵的淀粉底物与将相同的淀粉底物与AnGA接触相比导致DP3+水平的降低以及DP1水平的增加。

16.在如段落12或13所述的方法的一些实施例中，其中所述终产物是选自下组的生物化学品，该组由以下组成：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油和异戊二烯。

17.在另一个方面，一种提高在动物中的淀粉消化率的方法，所述方法包括添加至少一种葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

b)与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

c)与SEQ ID NO:7或8的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

d)具有SEQ ID NO:9的催化结构域的氨基酸序列的多肽；或

e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

作为饲料添加剂用于动物饲喂，其中所述葡糖淀粉酶(a)与在仅pH6或在或瘤胃液(例如含胃蛋白酶的瘤胃液)存在下的酶活性相比，在胃蛋白酶或瘤胃液(例如含胃蛋白酶的瘤胃液)存在下在pH小于或等于3时，具有至少20％的活性或至少20％更大的残余活性，并且(b)所述酶与胰淀粉酶共同作用以提高葡萄糖产量。

18.在如段落17所述的方法的一些实施例中，其中当所述动物是反刍动物时，所述酶在反刍动物的三个消化腔中的至少两个中具有活性，所述消化腔包含瘤胃、皱胃和小肠。

19.在如段落16或17所述的方法的一些实施例中，其中所述至少一种葡糖淀粉酶能够水解粗淀粉。

20.在另一个方面，一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:4、5或6的核苷酸序列至少80％同一性的核苷酸序列。

21.在另一个方面，一种载体，所述载体包含如段落20所述的多核苷酸，所述多核苷酸序列有效地连接至一个或多个控制序列，所述控制序列控制所编码的多肽在表达宿主中的产生，并且其中所述调控序列对于所述编码核苷酸序列是异源的，或者所述调控序列和所述编码序列并非如自然界中一起发现的那样排列。

22.在另一方面，一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如段落20所述的多核苷酸。

23.在如段落22所述的重组宿主细胞的一些实施例中，所述重组宿主细胞为木霉属、曲霉属、毁丝霉属或酵母属细胞。

24.在如段落22所述的重组宿主细胞的一些实施例中，所述重组宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、或假单胞菌属(Pseudomonas)细胞。

25.在如段落22所述的重组宿主细胞的一些实施例中，所述重组宿主细胞为产乙醇微生物。

26.在如段落22-25任一项所述的重组宿主细胞的一些实施例中，所述重组宿主细胞进一步表达和分泌一种或多种选自下组的另外的酶，该组包含蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶、或其组合。

27.在另一个方面，一种饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料添加剂组合物或预混物包含至少一种葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

(b)与SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:7、8或9的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:7、8或9的接头和催化结构域具有至少83％同一性的多肽；或

(e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；和/或

(f)任选地至少一种矿物质和/或至少一种维生素。

28.在如段落27所述的饲料添加剂组合物或预混物的一些实施例中，所述饲料添加剂组合物或预混物进一步包含选自下组的酶中的一种或多种，该组由以下组成：蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、和植酸酶。

29.在如段落27或段落28所述的饲料添加剂组合物或预混物的一些实施例中，所述饲料添加剂组合物或预混物进一步包含一种或多种直接饲喂的微生物，所述直接饲喂的微生物选自由芽孢杆菌属、乳酸细菌和酵母菌组成的组。

附图和序列的说明

图1是TeGA、FraGA1、WcoGA1和其他真菌葡糖淀粉酶的CLUSTALW多重序列比对。

以下序列遵循37 C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)、以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条、以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37 C.F.R.§1.822中所示的条例。

SEQ ID NO:1是FraGA1的前体蛋白序列。

SEQ ID NO:2是WcoGA1的前体蛋白序列。

SEQ ID NO:3是TeGA的前体蛋白序列。

SEQ ID NO:4是FraGA1基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5是WcoGA1基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6是TeGA的基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:7是FraGA1的预测的成熟蛋白序列。

SEQ ID NO:8是WcoGA1的预测的成熟蛋白序列。

SEQ ID NO:9是TeGA的成熟蛋白序列。

SEQ ID NO:10是来自黑曲霉(Aspergillus niger)的野生型葡糖淀粉酶，并且NCBI登录号为XP_001390530.1。

SEQ ID NO:11是来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的野生型葡糖淀粉酶，并且PDB登录号为2VN4_A。

SEQ ID NO:12(NCBI登录号)为KZT67263.1。

SEQ ID NO:13(NCBI登录号)为XP_002475369.1。

SEQ ID NO:14为描述于US 20090325240中的SEQ ID NO:1847。

SEQ ID NO:15(NCBI登录号)为KZT09226.1。

SEQ ID NO:16为描述于WO 2016196202中的SEQ ID NO:12。

SEQ ID NO:17为描述于US 20170314003中的SEQ ID NO:2。

SEQ ID NO:18(NCBI登录号)为GAD95639.1。

SEQ ID NO:19为描述于US 20170306309中的SEQ ID NO:23。

SEQ ID NO:20(NCBI登录号)为CAC28076.1。

具体实施方式

引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，否则适用以下定义。

术语“包括”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包括”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。

除非另有定义，所用的所有技术和科学术语具有其在相关科学领域的普通含义。Singleton,等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wiley and Sons[约翰·威利父子出版公司]，纽约(1994)，以及Hale和Markham，Harper Collins Dictionary of Biology[哈伯科林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)提供了描述本发明的许多术语的普通含义。

术语“葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)活性”在本文被定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶活性。大多数葡糖淀粉酶是由通过可变长度的O-糖基化的接头区域连接至淀粉结合结构域的催化结构域组成的多结构域酶。已经确定并描述了多种葡糖淀粉酶的晶体结构(参见J.Lee和M.Paetzel2011.Acta Cryst[晶体学报].第67卷188-192页“Structure of the catalytic domainof glucoamylase from Aspergillus niger[来自黑曲霉的葡糖淀粉酶的催化结构域的结构]”和J.Sauer等人2000.Biochem.Et Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]第1542卷275-293页“Glucoamylase:structure/function relationships,and proteinengineering[葡糖淀粉酶：结构/功能关系和蛋白质工程]”。

术语“淀粉结合结构域(SBD)或碳水化合物结合模块(CBM)”在本文中可互换使用。SBD可分为九个CBM家族。作为能量来源，淀粉被大量各种淀粉分解酶降解。然而，这些淀粉分解酶中仅约10％能够结合并降解生淀粉。这些酶通常具有称为淀粉结合结构域的独特序列结构模块，所述淀粉结合结构域介导与淀粉颗粒的附接。SBD是指优先结合淀粉(多糖)底物或麦芽糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精等的氨基酸序列。它们通常是在约10％的微生物淀粉分解酶中发现的大约100个氨基酸残基的基序。

术语“催化结构域(CD)”是指含有底物水解的活性位点的多肽的结构区。

术语“糖苷水解酶”可与“糖苷酶”和“糖基水解酶”互换使用。糖苷水解酶有助于复合糖(多糖，例如不限于淀粉)中糖苷键的水解。糖苷水解酶也可分为外切或内切作用，取决于它们分别作用于(通常非还原)寡糖/多糖链的末端还是中间。糖苷水解酶也可以通过基于序列或结构的方法进行分类。

关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。在优选的实施例中，所述食物或饲料供非反刍动物和反刍动物食用。

如本文所用的，术语“直接饲喂的微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然存在的微生物的来源。DFM的类别包括芽孢杆菌属、乳酸细菌和酵母菌。芽孢杆菌属是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。乳酸细菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus)。酵母不是细菌。这些微生物属于植物组真菌。

如本文所使用的，术语“胃蛋白酶”是指在从2.0至3.5的低pH处将蛋白质分解成较小肽的酶，即它是属于天冬氨酸肽酶家族A1的蛋白酶。胃蛋白酶产生并被分泌到胃中，并且是人类和动物消化系统(胃蛋白酶在消化系统中帮助消化食物或饲料中的蛋白质)中的主要消化酶之一。

如本文所使用的，术语“反刍动物”是指能够通过在消化之前在专门的胃中发酵(主要通过微生物作用)从基于植物的食物中获取营养素的哺乳动物。

如本文所使用的，术语“反刍动物的消化腔”是指瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃和小肠(McDonald等人，2011,Animal Nutrition[动物营养](第7版)第156-191页)。皱胃是直接等效的单胃。

术语“颗粒淀粉”是指生的(即未烹调的)淀粉，例如，未经历糊化的颗粒淀粉。

术语“颗粒淀粉水解(GSH)酶”和“颗粒淀粉水解(GSH)活性”在本文中可互换使用并且是指能够在与动物(具体是反刍动物)消化道中发现的条件相当的消化道相关条件下以颗粒形式水解淀粉的酶。

术语“分离的”是指呈自然界中不存在的形式或在自然界中不存在的环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关的天然发生的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换使用并是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。

术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或酶是指没有信号肽序列或前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羧基末端的前序列的蛋白质的形式。前体还可以具有有效地连接到前序列的氨基末端的“信号”序列。

如上所述，调控序列能以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列/基因。

“启动子”或“启动子序列”是指定义在何处RNA聚合酶开始基因转录的DNA序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5'末端。启动子可以全部衍生自天然或天然发生的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。

所述“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。

如本文所用的，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的DNA引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。

如本文所用的，术语“重组”是指例如通过化学合成或者通过经基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的核酸序列区段进行人工组合。例如，其中一个或多个区段或基因已经被插入的DNA，其自然地或通过实验室操作，从不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列插入，导致在基因中引入新的序列并随后在生物体中引入。术语“重组”、“转基因”、“转化”、“工程化”或“外源基因表达修饰”在本文中可互换地使用。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换地使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调控序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。

术语“百分比同一性”是如通过比较这些序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约州(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis ofSequence Data[序列数据的计算机分析],第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。

如本文所用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志]，215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用几个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-3402,1997和Schaffer等人，Nucleic Acids Res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。

如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,LipmanDJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein database searchprograms.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]Nucleic Acids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用此信息，可以对蛋白质序列进行分组，还可以使用氨基酸序列构建系统发生树。也可以使用Megalign程序、AlignX程序、EMBOSS开放软件套件序列(EMBL-EBI；Rice等人,Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))或类似程序进行序列比对和百分比同一性计算。也可以使用带有默认参数的CLUSTAL方法(例如CLUSTALW)来进行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。

作为某些方面的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。在某些实施例中可以使用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，在某些实施例中，变体多肽序列或多核苷酸序列可以与本文披露的序列具有至少83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所披露的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。

在一个方面，所述成熟多肽是基于SignalP(Nielsen等人,1997,ProteinEngineering[蛋白质工程]10:1-6)程序的SEQ ID NO:1的氨基酸17至567、SEQ ID NO:2的氨基酸18至569、SEQ ID NO:3的氨基酸28至618。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以被化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

术语“编码序列”意指直接指明蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由可读框决定，该可读框通常以ATG起始密码子或替代起始密码子(如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

“合成”分子是通过体外化学或酶促合成而不是通过生物体产生的。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。

术语“终产物”是指醇，例如乙醇，或选自由以下组成的组的生物化学品：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油和异戊二烯。

术语“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够在适合的宿主中影响DNA表达的适合控制序列有效地连接。此类控制序列可以包括影响转录的启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

本文将术语“控制序列”定义为包括表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个控制序列对于彼此可以是天然的或外源的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

术语“有效地连接”意指：指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并列)。例如，调控序列与编码序列有效地连接，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是与蛋白质的N-末端部分附接的氨基酸序列，所述氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外的蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。

“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。

如本文所用，术语“残余活性”是指相对于在特定条件下(例如，不限于改变的温度或改变的pH)下在孵育和不孵育的情况下测量的底物而言的活性的比率。

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

关于酶的术语“热稳定”、“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t_1/2)来测量，在此期间酶活性的一半在限定条件下丧失。半衰期可以通过测量例如暴露于(即，受挑战于)升高的温度后的残余淀粉酶活性来计算。术语“热稳定”和“热稳定的”意指加热至指定温度之前添加剂中存在/有活性的酶的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至指定温度之前添加剂中存在且有活性的酶的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品的生产过程，其中在同一工艺步骤中存在微生物，例如产乙醇微生物和至少一种酶，例如淀粉酶。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。

“浆料”是水中包含不溶性淀粉颗粒的水性混合物。

术语“总糖含量”是指包括单糖、寡糖和多糖的淀粉组合物中存在的总可溶性糖含量。

术语“干固体”(ds)是指溶解于水的干固体、分散于水中的干固体或二者的组合。因此干固体包括颗粒状淀粉及其水解产物，包括葡萄糖。

“干固体”含量是指相对于其中分散和/或溶解干固体的水的以重量百分比计溶解的和分散的干固体的百分比。淀粉的初始干固体含量为以含水量折算的颗粒状淀粉的重量除以颗粒状淀粉的重量加上水的重量。后续的干固体含量可由针对任何添加或损失的水和化学增益而调节的初始含量确定。后续的溶解干固体含量可由如下所示的折射率测量。8

术语“高DS”是指具有干固体含量大于38％(wt/wt)的水性淀粉浆料。

“干物质淀粉”是指底物例如淀粉浆料的干淀粉含量，并且可通过从底物质量中扣除任何非淀粉组分如蛋白质、纤维和水的贡献来确定。例如，如果颗粒状淀粉浆料具有20％(wt/wt)的水含量和1％(wt/wt)的蛋白质含量，则100kg的颗粒状淀粉具有79kg的干淀粉含量。干物质淀粉可用于确定要使用的酶单位数量。

“液化物”是指将淀粉或含淀粉的谷物浆(醪液)蒸煮(加热)和液化(降低粘度)的产物。

“液化(liquefaction或liquefy)”是指将淀粉(或含淀粉的谷物)转化为较短链和较低粘度糊精的过程。

“聚合度(DP)”是指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，如麦芽糖和蔗糖。DP4+(>DP3)表示聚合度大于3的聚合物。

术语“接触”是指将参考组分(包括但不限于酶、底物和发酵生物)充分靠近放置以影响预期结果，例如所述酶作用于底物上或发酵生物发酵底物。本领域技术人员将认识到混合溶液可以引起“接触”。

“产乙醇微生物”是指具有将糖或其他糖类转化为乙醇的能力的微生物。

术语“生物化学品”是指微生物的代谢物，如柠檬酸、乳酸、丁二酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、异丁醇、氨基酸、赖氨酸、衣康酸、其他有机酸、1,3-丙二醇、维生素类、或异戊二烯、或者其他生物材料。

术语“约”是指参考值的±15％。

除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

EC 酶学委员会

CAZy 碳水化合物活性酶

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％ 重量百分比

℃ 摄氏度

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

mol 摩尔

mmol 毫摩尔

M 摩尔的

mM 毫摩尔

μM 微摩尔的

nm 纳米

U 单位

ppm 份/百万份

hr和h 小时

在第一方面，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7、8或9的多肽优选具有至少83％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％的氨基酸序列同一性，并且具有葡糖淀粉酶活性。

在一些实施例中，本发明的多肽是包含以下氨基酸序列的同源多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7、8或9的多肽相差十个氨基酸、优选地相差九个氨基酸、优选地相差八个氨基酸、优选地相差七个氨基酸、优选地相差六个氨基酸、优选地相差五个氨基酸、更优选地相差四个氨基酸、甚至更优选地相差三个氨基酸、最优选地相差两个氨基酸、并且甚至最优选地相差一个氨基酸。

在一些实施例中，本发明的多肽是SEQ ID NO:7、8或9的多肽的变体、或其具有葡糖淀粉酶活性的片段。

在一些实施例中，本发明的多肽是包含SEQ ID NO:1的氨基酸17-470、SEQ ID NO:2的氨基酸18-472或SEQ ID NO:3的氨基酸28-500的催化区，其是通过ClustalX https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17846036预测。

在一些实施例中，本发明的多肽是低pH稳定的并且在低pH下保持葡糖淀粉酶活性。本发明的多肽在pH值范围为约2.0至约5.0(例如，约2.0至约4.0、约2.0至约3.0、约2.0至约2.5等)时显示出低pH稳定性。例如，在pH 2.0至约3.0下，本发明的多肽在高温(例如，至少40℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃或更高的温度)下保持大部分葡糖淀粉酶活性持续延长的时间，并且例如，持续至少4小时、至少17小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、或甚至更长的时间。

在一些实施例中，与(来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)AnGA相比，在pH值约为3或甚至pH值约为2下，在约30℃至约70℃(例如，约30℃至约60℃、约40℃至约60℃等)的温度范围内，在孵育时间持续至少24小时、至少48小时、至少72小时、或甚至更长时间情况下，本发明的多肽具有更好的糖化性能。

在一些实施例中，与当前市售的葡糖淀粉酶产物相比，在pH值约为3或甚至pH值约为2下，在约30℃至约70℃(例如，约30℃至约60℃、约30℃至约50℃等)的温度范围内，在孵育时间持续至少17小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、或甚至更长时间情况下，本发明的多肽可以用于同时糖化和发酵(SSF)工艺或低pH发酵。

在第二方面，本发明的葡糖淀粉酶包含相对于SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的一个或几个氨基酸残基的保守取代。示例性保守氨基酸取代列于表1中。一些保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。

表1.保守氨基酸取代

在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶包含相对于SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列或其同源序列的一个或几个氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加。在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶通过保守取代一个或几个氨基酸残基而衍生自SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的葡糖淀粉酶相对于SEQ ID NO7、8或9的氨基酸序列通过缺失、取代、插入、或添加一个或几个氨基酸残基而衍生自SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列。在所有情况下，表述“一个或几个氨基酸残基”是指10个或更少，即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。SEQ ID NO:7、8或9的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入可以是至多10个、优选地至多9个、更优选地至多8个、更优选地至多7个、更优选地至多6个、更优选地至多5个、更优选地至多4个、甚至更优选地至多3个、最优选至多2个、以及甚至最优选地至多1个。

可替代地，所述氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochem.[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的、克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且可适用于未知结构的多肽。

葡糖淀粉酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括来自第一葡糖淀粉酶的至少一部分，和来自第二淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶或其他淀粉降解酶的至少一部分，或甚至其他糖基水解酶，例如但不限于纤维素酶、半纤维素酶等(包括最近被“重新发现”为结构域交换淀粉酶的嵌合淀粉酶)。本发明的葡糖淀粉酶可进一步包括异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。

本发明的葡糖淀粉酶可以在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达。在将葡糖淀粉酶分泌到细胞培养基中后，可以获得包含葡糖淀粉酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，葡糖淀粉酶可以从宿主细胞中分离，或甚至从细胞培养液中分离，这取决于最终葡糖淀粉酶所需的纯度。可以根据本领域熟知的方法克隆和表达编码葡糖淀粉酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesi)或嗜热毁丝霉(Myceliopthora thermophila)。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，以及链霉菌属(Streptomyces)。

另外，宿主可以表达一种或多种辅酶、蛋白质、肽。这些可以有益于液化、糖化、发酵、SSF和下游处理。此外，除了用于消化各种原料的酶之外，宿主细胞还可以产生乙醇和其他生物化学物质或生物材料。此类宿主细胞可用于发酵或同时糖化和发酵过程，以减少或消除添加酶的需要。

可以构建包含编码葡糖淀粉酶多肽的核酸的DNA构建体，使得其适合于在宿主细胞中表达。由于遗传密码中已知的简并性，编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用常规技术进行设计和制备。也已知的是，取决于期望的宿主细胞，在尝试表达之前可能需要密码子优化。

可以将编码本披露的葡糖淀粉酶多肽的多核苷酸整合到载体中。可以使用已知的转化技术(例如以下披露的那些)将载体转移至宿主细胞中。

合适的载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的载体。例如，包含编码本披露的葡糖淀粉酶多肽的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。也可以将载体适当地转化到表达宿主中，使得编码多核苷酸表达为功能性葡糖淀粉酶。

可以将编码本发明的葡糖淀粉酶多肽的多核苷酸有效地连接至允许在宿主细胞中转录的启动子上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。

编码序列可以有效地连接到信号序列。编码信号序列的DNA可以是与待表达的目的葡糖淀粉酶基因天然相关的DNA序列或可以是来自与所述葡糖淀粉酶不同的属或物种。可以将包含DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列引入真菌宿主细胞，并且可以来源于相同的来源。例如，信号序列可能是有效地连接到cbh1启动子的里氏木霉的cbh1信号序列。

表达载体还可以包含合适的转录终止子，以及在真核生物中，包含有效地连接至编码葡糖淀粉酶的DNA序列的聚腺苷酸化序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地来源于与启动子相同的来源。

载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可以包含曲霉属选择标记，例如amdS、argB、和niaD，引起潮霉素抗性的标记，或者选择可以通过共转化(如本领域已知的)实现。参见，例如，公开的国际PCT申请WO 91/17243。

细胞内表达在某些方面可能是有利的，例如，当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞产生大量α-葡糖苷酶用于随后的富集或纯化时。可替代地，葡糖淀粉酶的细胞外分泌至培养基中还可用于制备包含分离的葡糖淀粉酶的培养的细胞材料。

用于分别连接编码葡糖淀粉酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件并将它们插入到含有复制所需的信息的合适载体中的程序是本领域技术人员已知的且容易获得的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室],1989,和第三版,2001。

包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生葡糖淀粉酶的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一或多个拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便地用编码酶的DNA构建体转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定保持。可以根据常规方法，例如，通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。可替代地，可以用与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

适合的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性细菌物种，如芽孢杆菌属(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(原嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；链霉菌属(Streptomyces)物种，如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；乳酸细菌物种，包括乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。可替代地，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种作为宿主生物。

适合的酵母宿主生物可以选自生物技术相关的酵母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种或者酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或者属于裂殖酵母属的物种，例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe)。甲基营养型酵母物种菌种毕赤酵母可以用作宿主生物。可替代地，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。

丝状真菌中适合的宿主生物包括曲霉属(Aspergillus)的物种，例如，黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。可替代地，镰刀菌属(Fusarium)物种(例如，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum))或根瘤菌属(Rhizomucor)物种(如米氏根瘤菌(Rhizomucormiehei))的菌种可以用作宿主生物。其他适合的菌株包括嗜热菌属(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。此外，木霉属物种可以用作宿主。真菌宿主细胞表达的葡糖淀粉酶可以被糖基化，即，将包含糖基部分。糖基化模式可以与野生型葡糖淀粉酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可能改变酶和/或生化特性。

从表达宿主缺失基因是有利的，其中可以通过转化的表达载体治愈基因缺陷。已知方法可用于获得具有一种或多种失活基因的真菌宿主细胞。已克隆的、来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何基因均可以缺失，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。基因缺失可通过本领域已知方法通过将待失活的所需基因的形式插入质粒中来完成。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导的和DEAE-糊精介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；以及原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见，例如Sambrook等人(2001)，同上。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725。对于曲霉属菌种的转化，还参考了Cao等人(2000)Science[科学]9:991-1001。可以用载体系统构建遗传稳定的转化体，由此编码α-葡糖苷酶的核酸被稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择并纯化转化体。

产生葡糖淀粉酶的方法可以包括在有利于产生所述酶的条件下培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收所述酶。

用于培养细胞的培养基可以是适合于宿主细胞生长并获得葡糖淀粉酶多肽表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。

本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中，真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。

分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的葡糖淀粉酶多肽的浓缩溶液或肉汤。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得葡糖淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。

有时可能需要浓缩包含葡糖淀粉酶多肽的溶液或肉汤以优化回收。使用未浓缩的溶液或肉汤通常会增加孵育时间，以便收集富集或纯化的酶沉淀。

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。在一些实施例中，在所述酶组合物中还可以使用以下多肽所述多肽包含与SEQ ID NO:7、8或9的多肽优选具有至少83％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和甚至至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且具有葡糖淀粉酶活性。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性多肽。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，所述组合物可包含多重酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氨化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质霉、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、支链淀粉酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或其组合，所述酶可以按本领域技术人员熟知的有效量添加。

可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，包含本发明葡糖淀粉酶的组合物可以是水性或非水性配制品、颗粒、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，所述组合物可进一步包含本文列出的另外的酶中的任何一种或多种，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。此类组合物可与内源酶或已存在于浆料、水浴、洗衣机、食品或饮料产品等中的其他成分(例如，内源植物(包括藻类)酶，来自先前加工步骤的残留酶等)组合起作用。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。

所述组合物可以是表达多肽的细胞，包括能够从发酵产生产物的细胞。此类细胞能以乳膏或干燥形式与合适的稳定剂一起提供。此类细胞可以进一步表达另外的多肽，例如上面提到的多肽。

以下给出了本发明的多肽或组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用所述组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

本发明还针对本发明的多肽或组合物在液化过程、糖化过程、和/或发酵过程中的用途。可以在单个过程中，例如在液化过程、糖化过程、或发酵过程中使用所述多肽或组合物。也可以在过程的组合中(例如在液化和糖化过程、在液化和发酵过程中、或者在糖化和发酵过程中(优选地与淀粉转化有关))使用所述多肽或组合物。

可以使用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶(任选地在另外一种或多种酶的存在下)，将液化淀粉糖化成富含低DP(例如DP1+DP2)糖的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的淀粉的类型。有利地，使用所提供的葡糖淀粉酶可获得的糖浆可以含有糖化淀粉中总寡糖的DP2的重量百分比超过30％，例如45％-65％或55％-65％。糖化淀粉中(DP1+DP2)的重量百分比可以超过约70％，例如，75％-85％或80％-85％。

液化通常作为连续工艺进行，而糖化通常作为分批工艺进行。糖化条件取决于液化物的性质和可用的酶类型。在一些情况下，糖化过程可涉及约60℃-65℃的温度和约4.0-4.5的pH(例如pH 4.3)。糖化可以在例如约40℃、约50℃、或约55℃至约60℃或约65℃的温度下进行，有必要冷却液化物。可以根据需要调节pH。糖化通常在搅拌槽中进行，这可能需要几个小时来填充或清空。酶通常以固定比率添加到干燥固体中(槽被填充时)，或者以单剂量添加(在填充阶段开始时)。制备糖浆的糖化反应通常进行约24-72小时，例如24-48小时。然而，通常仅在30℃-65℃之间(通常约60℃)的温度下进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时糖化和发酵(SSF)中完全糖化。在一个实施例中，本发明的方法包括在同时糖化和发酵(SSF)方法之前将含淀粉的材料预糖化。在移入SSF之前，可以在高温(例如，50℃-85℃，优选是60℃-75℃)下进行预糖化。优选地，糖化最佳地在约30℃至约75℃的较高温度范围(例如45℃-75℃或50℃-75℃)内进行。通过在更高的温度下进行糖化过程，可以在更短的时段内进行所述过程，或可替代地可以使用更低的酶剂量来进行所述过程。此外，当在更高温度下进行液化和/或糖化过程时，微生物污染的风险减小。

在本发明的优选方面，所述液化和/或糖化包括顺序或同时地进行的液化和糖化过程。

通常在约32℃的温度(例如从30℃至35℃)，可以通过使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵可溶性淀粉水解产物(特别是富含葡萄糖的糖浆)。“发酵生物”是指适用于发酵过程并且能够产生所需发酵产物的任何生物(包括细菌和真菌生物)。尤其适合的发酵生物能够直接地或间接地将糖(如葡萄糖或麦芽糖)发酵(即，转化)成所需的发酵产物。发酵生物的实例包括表达乙醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))和细菌(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))。产乙醇微生物可以表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，上述两种酶将木糖转化为木酮糖。例如，可以承受更高温度的改善的产乙醇微生物菌株是本领域已知的并且可以使用的。参见Liu等人，(2011)ShengWu Gong Cheng Xue Bao[生物工程学报]27:1049-56。可商购的酵母包括例如Red Star(TM)/乐斯福(Lesaffre)乙醇红(从美国红星/乐斯福(Red Star/Lesaffre)公司可获得)、FALI(从美国伯恩斯菲利普食品有限公司(Burns Philp Food Inc.)的分公司弗莱施曼酵母(Fleischmann's Yeast)公司可获得)、SUPERSTART(从阿尔泰克公司(Alltech)可获得)、GERT STRAND(从瑞典的Gert Strand AB公司可获得)、

ADY(从杜邦公司可获得)、

THRIVE(从杜邦公司可获得)、FERMIOL(从帝斯曼食品配料部(DSMSpecialties)可获得)。发酵的温度和pH将取决于发酵生物。通过发酵产生其他代谢产物如柠檬酸和乳酸的微生物也是本领域已知的。参见，例如，Papagianni(2007)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]25:244-63；John等人(2009)Biotechnol.Adv.[生物技术进展]27:145-52。

糖化和发酵过程可以作为SSF过程进行。可以用在整个SSF中连续表达和分泌葡糖淀粉酶的真菌细胞进行SSF过程。表达葡糖淀粉酶的真菌细胞也可以是发酵微生物，例如产乙醇微生物。因此，可以使用表达足够葡糖淀粉酶的真菌细胞进行乙醇生产，从而更少地需要或不需要外源地添加酶。真菌宿主细胞可以来自适当工程化的真菌菌株。除了葡糖淀粉酶之外，还可以使用表达和分泌其他酶的真菌宿主细胞。此类细胞可以表达淀粉酶和/或支链淀粉酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶、β-淀粉酶纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、蛋白酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、酯酶、氧化还原酶、转移酶、或其他酶。发酵后可以回收乙醇。

根据本发明，所述发酵包括但不限于用于生产醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)的发酵过程；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H₂和CO₂)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；和激素。在这样的优选实施例中，所述方法通常在28℃至36℃之间，例如29℃至35℃之间、例如30℃至34℃之间、例如32℃左右的温度下，在pH值为3到7之间，优选地从pH3.5到pH6、或更优选在pH 4到pH 5之间进行。

在其他实施例中，低pH值将使污染的风险最小化，因为竞争生物不再能够生长。本发明的发酵过程可以在低pH下进行，例如有机酸的发酵，因为通常发酵生物将pH值迅速降低至约4.0至4.5，并且一些乳酸杆菌甚至将pH值降低至约3.5。溶液中存在的游离乳酸的量(例如至少约50g/L、优选至少约80g/L、更优选至少约100g/L的乳酸)导致相对低的pH值。以游离酸形式存在的乳酸盐百分比越高，溶液的pH值越低。例如，在中等pH值等于乳酸的pKa(约3.8)的情况下，50％的乳酸盐以游离酸形式存在。在pH值为4.2时，约31％的乳酸盐为游离酸，并且在pH值为4.0和3.9时，分别为约41％和47％的

本发明提供了本发明的一种或多种葡糖淀粉酶用于从粗淀粉或颗粒状淀粉中产生葡萄糖和其他糖类的用途。通常，本发明的葡糖淀粉酶单独或在α-淀粉酶存在下可用于粗淀粉水解(RSH)或颗粒状淀粉水解(GSH)过程中用于产生所需的糖和发酵产物。所述颗粒状淀粉通过在糊化温度以下酶法水解来溶解。据报道，此类“低温”系统(也称为“无蒸煮”或“冷蒸煮”)能够处理比常规系统更高浓度的干固体(例如，高至45％)。

“粗淀粉水解”过程(RSH)不同于常规淀粉处理过程，包括通常在至少葡糖淀粉酶和/或淀粉酶存在下，在淀粉底物的糊化温度或低于淀粉底物的糊化温度下顺序或同时糖化和发酵颗粒状淀粉。在水中加热的淀粉在50℃与75℃之间开始糊化，糊化的确切温度取决于特定的淀粉。例如，糊化温度可根据植物物种、植物物种的具体变种以及生长条件而不同。在本发明的上下文中，给出的淀粉的糊化温度是应用Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/Starke，第44卷(12)第461-466页(1992)描述的方法使得淀粉颗粒的双折射损失为5％时的温度。

本发明的葡糖淀粉酶还可以结合仅水解在包含至少四个葡糖残基的分子中的α-(1,6)-糖苷键的酶来使用。优选地，本发明的葡糖淀粉酶与支链淀粉酶或异淀粉酶组合使用。在G.M.A.van Beynum等人,Starch Conversion Technology[淀粉转换技术],MarcelDekker[马塞尔·德克尔],纽约,1985,101-142中描述了异淀粉酶和支链淀粉酶用于淀粉脱支的用途、酶的分子性质、以及酶与葡糖淀粉酶一起使用的潜在用途。

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物体的发酵过程的方法产生的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇类(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇(glycerol)、甲醇、乙二醇、丙烯乙二醇、丁二醇、甘油(glycerin)、山梨醇、以及木糖醇)；有机酸类(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸类(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；烷烃类(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；环烷烃类(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；烯烃类(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；气体类(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；抗生素类(例如，盘尼西林和四环素)；酶类；维生素类(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)以及激素类。

在优选的方面，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒精；或工业乙醇或消费醇类工业(例如啤酒和白酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选使用的发酵过程包括本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵方法为厌氧发酵方法，所述方法是为熟知的

用于制造啤酒的过程在本领域中是熟知的。参见例如Wolfgang Kunze(2004)“Technology Brewing and Malting[技术酿造与制麦芽]”Research and TeachingInstitute of Brewing,Berlin[柏林酿酒研究与教学研究所](VLB),第3版。简而言之，所述过程涉及：(a)制备醪液，(b)过滤醪液以制备麦芽汁，和(c)发酵麦芽汁以获得发酵饮料(如啤酒)。

可以将包含与淀粉酶和任选的支链淀粉酶和/或异淀粉酶组合的葡糖淀粉酶的酿造组合物添加到上述步骤(a)的醪液中，即在醪液的制备期间添加。可替代地或除此之外，可以将酿造组合物添加到上述步骤(b)的醪液中，即在醪液的过滤期间添加。可替代地或除此之外，可以将酿造组合物添加到上述步骤(c)的麦芽汁中，即在麦芽汁的发酵期间添加。

在仍另一个方面，本文所述的葡糖淀粉酶可以用作动物的饲料添加剂以增加淀粉消化率。本文所述的是一种提高在动物中的淀粉消化率的方法，所述方法包括添加至少一种葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(g)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

(h)与SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

(i)与SEQ ID NO:7、8或9的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

(j)与SEQ ID NO:7、8或9的接头和催化结构域具有至少83％同一性的多肽；或

(k)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

作为饲料添加剂用于动物饲喂，其中所述葡糖淀粉酶(a)与在仅pH6或在或瘤胃液(例如含胃蛋白酶的瘤胃液)存在下的酶活性相比，在胃蛋白酶或瘤胃液(例如含胃蛋白酶的瘤胃液)存在下在pH小于或等于3时，具有至少20％的活性或至少20％更大的残余活性，并且(b)所述酶与胰淀粉酶共同作用以提高葡萄糖产量。

在另一个方面，当所述动物是反刍动物时，那时所述酶在反刍动物的三个消化腔中的至少两个中具有活性，所述消化腔包含瘤胃、皱胃和小肠。瘤胃是最大的隔室，体积为150-200升(40-50加仑)。

反刍动物具有通过其微生物/酶消化系统将粗饲料转化为蛋白质和能量的独特能力。因此，反刍动物在地球生态和食物链中起着重要作用。

反刍动物与非反刍动物之间的主要区别在于反刍动物具有由瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃组成的四隔室胃。皱胃是直接等效的单胃(McDonald等人，2011,Animal Nutrition[动物营养](第7版)第156-191页)。

在消化系统中存在数十亿的微生物。它们帮助奶牛消化和利用饲料中的营养素。为了实现有效的饲料利用和高产奶量，细菌必须具有最佳条件。消化饲料的正是细菌。事实上，饲喂奶牛涉及饲喂奶牛瘤胃中的微生物。发酵过程发生在瘤胃和网胃中。奶牛的瘤胃就像一个大发酵桶。超过200种不同的细菌和20种类型的原生动物帮助奶牛利用纤维喂养料和非蛋白质氮源。发酵是一种化学过程，通过该过程厌氧分解例如葡萄糖之类的分子，例如当微生物将碳水化合物转化为挥发性脂肪酸和气体时。所述过程允许奶牛将纤维素纤维转化为能量。在发酵期间(每天500-1500升)(150-400加仑)在瘤胃内产生的气体中，20％-40％由甲烷和二氧化碳组成。发酵气体的生产代表相当大的能量损失。某些发酵调节剂(如离子载体)通过减少那些气体能量损失来改善反刍动物的能量效率。

瘤胃和网胃基本上是一个隔室，但具有不同的功能。虽然大部分发酵作用发生在瘤胃中，但网胃用作进入瓣胃或反刍的暂存区域。

理想的瘤胃pH值在6和7之间。在这个范围内的瘤胃微生物是最健康的。如果pH值变化太大，一些类型的微生物被消除，并且饲料的利用率降低。在pH值低于6.0下，消化纤维素(干草、青贮饲料等)的微生物不能生长或发酵纤维素。当瘤胃pH值降至6以下时，瘤胃被认为是酸中毒的。瘤胃酸中毒可能是急性的，伴随pH值迅速急剧下降。在高产畜群中更常见的是亚临床酸中毒，其特征在于慢性、间歇周期的低瘤胃pH。

如上所述，淀粉在饲料中的消化率高度可变，并且取决于许多因素，包括淀粉和饲料基质的物理结构。

已经发现，通过使用至少一种葡糖淀粉酶作为反刍动物的饲料添加剂可以改善动物饲料中的淀粉消化率，其中所述葡糖淀粉酶：(a)与在仅pH 6或在或瘤胃液(例如含胃蛋白酶的瘤胃液)存在下的酶活性相比，在胃蛋白酶或瘤胃液(例如含胃蛋白酶的瘤胃液)存在下在pH小于或等于3时，具有至少20％的活性(例如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％更大的活性，包括介于这些百分比之间的所有值)或至少20％更大的残余活性(例如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％更大的残余活性，包括介于这些百分比之间的所有值)并且(b)所述水解酶与动物消化腔中存在的消化酶共同作用以增加葡萄糖产量和提高淀粉的消化率。

本文所述的任何葡糖淀粉酶可能被单独使用或与至少一种直接饲喂的微生物结合使用。DFM的类别包括芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸细菌和酵母菌。芽孢杆菌纲(Bacilli)是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可以承受环境条件，如热、水分和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞，并可用于粉和压成丸粒的饮食中。

术语“动物饲料”、“饲料”、“喂养料”和“秣料”可互换使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料材料，所述组包含：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(具体是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。

当用作或用于制备饲料(例如功能性饲料)时，本发明的酶或饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载剂、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，可以提及选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、偏亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在一个优选的实施例中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。本文所使用的术语“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。

可将根据本发明的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。

本文所述的任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

术语“复合饲料”意指以粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、低芥酸菜籽粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。

合适地，如本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(如，cDDGS)、小麦、麦麸、或其任何组合。

在一个实施例中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(如，cDDGS)或其组合。

本文所述的喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米DDGS。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米DDGS。对于猪(swine或pig)，所述喂养料可含有平均5％至40％的玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。

所述饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

如本文所用的，术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食物。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，如狗食或猫食。宠物食物(如狗食和猫食)可以干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。

如本文所用的，术语“接触”是指间接或直接将本文所述的葡糖淀粉酶(或包含葡糖淀粉酶的组合物)应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的配制品中。在一个实施例中，优选将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。这允许所述组合物赋予性能益处。

也可能的是，本文所述的至少一种葡糖淀粉酶(或包含如本文所述的至少一种葡糖淀粉酶的酶组合物)可以均化以产生粉末。

在一个替代性优选的实施例中，将包含至少一种葡糖淀粉酶的酶组合物配制成如WO 2007/044968(称作TPT颗粒)或W0 1997/016076或W0 1992/012645中所述的颗粒，将这些文献通过引用并入本文中。“TPT”意指热保护技术。

在另一方面，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含包覆在蛋白质核心上的水合屏障盐。这样的盐涂层的优点在于使耐热性改善、使保藏稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响所述酶的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。在一些实施例中，盐涂层包含Na₂SO₄。

制备如本文所述的至少一种葡糖淀粉酶(或包含如本文所述的至少一种葡糖淀粉酶的酶组合物)的方法还可以包含将粉末制粒的进一步步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸粒。

任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调节器中加热，如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。应当理解，如本文所述的糖苷水解酶(或包含如本文所述的糖苷水解酶的酶组合物)适合于添加到任何适当的饲料材料中。

任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(如，例如钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。

喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料粉碎成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。

所述饲料添加剂组合物和/或包含其的喂养料可以任何合适的形式使用。所述饲料添加剂组合物能以固体或液体配制品或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。

优选地，食物或饲料添加剂组合物可以包含至少一种生理学上可接受的载剂。所述生理学上可接受的载剂优选地选自以下中的至少一者：麦芽糖糊精、石灰岩(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石、PVA、及其混合物。在一个另外的实施例中，所述食物或饲料添加可还包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂可选自EDTA或柠檬酸。

在一些实施例中，所述食物或饲料添加剂组合物包含水平为至少0.0001g/kg、0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的如本文所述的糖苷水解酶。在一些实施例中，所述食物或饲料添加剂包含一定水平使得当添加至食物或饲料材料时，所述饲料材料包含在1-500mg/kg、1-100mg/kg、2-50mg/kg或2-10mg/kg范围的如本文所述的糖苷水解酶。在本发明的一些实施例中，所述食物或饲料材料包含至少100、1000、2000、3000、4000、5000、10000、20000、30000、50000、100000、500000、1000000或2000000单位的糖苷水解酶/千克饲料或食物材料。

包含本文所述的任何至少一种葡糖淀粉酶和本文所述的组合物的配制品可以以任何合适的方式制备以确保所述配制品包含活性酶。此类配制品可以呈液体、干粉或颗粒。优选地，所述饲料添加剂组合物呈固体形式，适合于添加在饲料丸粒上或添加至饲料丸粒。

在一个实施例中，可将动物饲料配制成包含以下的饲料组合物的颗粒：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自以下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制粒方法，b)蒸汽加热的饲料预处理方法，c)储存，d)作为未经制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。

关于颗粒，至少一个包衣可包含构成所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个包衣可包含两个包衣。所述两个包衣可为水分水合包衣和防潮包衣。在一些实施例中，所述水分水合包衣可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述防潮包衣可为所述颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合包衣可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮包衣可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

所述颗粒可使用饲料制粒方法制备并且所述饲料预处理方法可在70℃至95℃(如在85℃至95℃)进行长达若干分钟。

所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮涂层并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至45％w/w并且所述防潮涂层可为所述颗粒的2％w/w至10％w/w。

可替代地，所述组合物处于适合于消耗的液体配制品中，优选地，这种液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨糖醇和/或甘油。

此外，可通过将一种或多种酶施用(例如喷涂)于载剂底物(如粉碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举个实例，所述预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一些实施例中，至少一种葡糖淀粉酶将处于生理学上可接受的载剂中。合适的载剂可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活病毒颗粒。可以使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。一旦配制，可以直接向反刍动物施用本发明的组合物。

另外，本文披露的含葡糖淀粉酶的组合物可以进一步与一种或多种另外的组分酶(例如另外的饲料酶或酿造或麦芽酶、或谷物加工酶或小麦面筋-淀粉分离酶)配制(例如共混)。

合适地，用于本披露中的含葡糖淀粉酶的组合物的另外的酶可以是选自由以下组成的组的酶中的一种或多种：葡聚糖内切酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣酶(E.C.3.1.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂肪酰基转移酶(通常分类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4,E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、其他木聚糖酶(E.C.3.2.1.8,E.C.3.2.1.32,E.C.3.2.1.37,E.C.3.1.1.72,E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.G.3.2.1.3)、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。

在一个实施例(例如用于饲料应用)中，其他组分酶可以是选自下组的酶中的一种或多种，该组由以下各项组成：淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、形成G4的淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3)；和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或巴曲菌素(bacillolysin)(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。

在一个实施例(例如，用于饲料应用)中，其他组分酶可以是蛋白酶(例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。

在一个实施例(例如用于饲料应用)中，其他组分酶可以是β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。

在一个实施例(例如用于饲料应用)中，其他组分酶可以是甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。

在一个实施例(例如用于饲料应用)中，其他组分酶可以是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂肪酰基转移酶(通常分类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4,E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)，合适的是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。

在一个实施例(尤其是饲料应用)中，其他组分酶可以是丝氨酸蛋白酶(例如E.C.3.4.21，枯草杆菌蛋白酶)、胰蛋白酶样S1或S2蛋白酶、或金属蛋白酶(例如E.C.3.4.24，巴曲菌素)、或天冬氨酰蛋白酶(例如E.C.3.4.23)。

实例

除非在本文中另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wileyand Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。

实例1

葡糖淀粉酶序列

在NCBI数据库(NCBI登录号：NW_012133200.1(基因)和XP_012178139(蛋白质))中找到了FraGA1基因的核酸序列和由FraGA1基因编码的假定蛋白的氨基酸序列。

FraGA1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在JGI数据库(JGI登录号：Wolco1150090(基因)和Wolco1149945(蛋白质))中找到了WcoGA1基因的核酸序列和由WcoGA1基因编码的假定蛋白的氨基酸序列。N末端信号肽通过SignalP软件版本4.0(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测。

WcoGA1前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

来自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的TeGA前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实例2

葡糖淀粉酶的表达

合成编码全长FraGA1和WcoGA1的DNA序列并插入到pTTT表达载体上(描述于公开的PCT申请WO 2011/063308)。合成编码TeGA的DNA序列并插入到pTrex3gM表达载体上(描述于美国公开申请2011/0136197 A1)。

用于表达的FraGA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

用于表达的WcoGA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

用于表达的TeGA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

使用原生质体转化将编码FraGA1、WcoGA1和TeGA酶的质粒转化到合适的里氏木霉菌株(Te’o等人,J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]51:393-99,2002)。通过WO 2016/138315中描述的方法选择并发酵上所述转化体。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析和酶活性测定来确认蛋白质表达。

通过β-环糊精偶联的Sepharose 6亲和色谱，然后通过凝胶过滤色谱，纯化FraGA1。通过β-环糊精偶联的Sepharose 6亲和色谱，然后通过疏水性相互作用色谱，纯化WcoGA1。通过疏水性相互作用色谱，然后通过β-环糊精偶联Sepharose 6亲和色谱，纯化TeGA。进行了葡糖淀粉酶活性测定和SDS-PAGE。合并含有目标蛋白质的级分，并使用具有10K MWCO的Amicon Ultra-15装置进行浓缩。然后将浓缩的溶液在缓冲液A中上样到Superdex 75色谱柱(通用医疗公司(GE Healthcare))上。目标蛋白以单峰从色谱柱中洗脱出来，再次合并和浓缩。纯化的样品纯度高于90％，并在-80℃下储存在40％的丙三醇中直至使用。

FraGA1的预测的成熟蛋白质序列如下SEQ ID NO:7所示。

WcoGA1的预测的成熟蛋白质序列如下SEQ ID NO:8所示。

TeGA的成熟蛋白质序列如下SEQ ID NO:9所示。

实例3

在低pH和在胃蛋白酶存在下葡糖淀粉酶的稳定性

在低pH条件和胃蛋白酶存在下，分析了葡糖淀粉酶TeGA、FraGA1和WcoGA1的经纯化的样品的稳定性。将酶与胃蛋白酶(西格玛公司(Sigma),目录号P7000)在50mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.0)中孵育，并使用在50mM MES-NaOH缓冲液(pH 6.5)中制备的1％(w/w)可溶性淀粉作为活性测量的底物。首先将葡糖淀粉酶和胃蛋白酶以1:0或1:50的比率(w/w)混合，其中葡糖淀粉酶的剂量为100ppm；并且随后将所得的混合物在40℃下孵育30min。同时，将每种葡糖淀粉酶的100ppm等分试样在40℃的50mM MES-NaOH缓冲液(pH 6.5)中孵育30分钟，作为未处理的对照。为了开始活性测量，将10μL酶稀释液(酶剂量在线性范围内选择，或将单独水作为空白对照)添加到含有90μL底物(1％淀粉)溶液的96孔微量滴定板(MTP，康宁公司(Corning)3641)中。随后将MTP密封并在iEMS(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))中在40℃和1150rpm下孵育10min。葡糖淀粉酶活性确定为使用偶联的葡糖氧化酶/过氧化物酶(GOX/HRP)方法(Anal.Biochem.[分析生物化学]105(1980),389-397)测量的葡萄糖释放速率。如表2所示，使用葡萄糖释放作为酶活性的度量，与里氏木霉野生型葡糖淀粉酶(TrGA、pdb文件2VN4_A、SEQ ID NO:11)在pH 2.0下失去所有活性不同，FraGa1、WcoGA1和TeGA葡糖淀粉酶在pH 2.0缓冲液中、在没有外源胃蛋白酶存在的情况下是稳定的。

实例4

葡糖淀粉酶在低pH下对麦芽糊精的生葡糖活性

通过分析糖组成，以5ppm的酶剂量测量在pH 3时对麦芽糊精底物的葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶：在获自主要香精香料有限公司(Staple Flavour&Fragrance Co.Ltd.)的

(带有DE4-7的麦芽糖糊精)上测试了TeGA、FraGA1、WcoGA1、AnGA(黑曲霉野生型葡糖淀粉酶，登录号XP_001390530.1，SEQ ID NO：10)和TrGA(里氏木霉野生型葡糖淀粉酶，pdb文件2VN4_A，SEQ ID NO：11)。通过将10μL的50ppm的经纯化的葡糖淀粉酶样品添加到在25mM甘氨酸/乙酸钠/HEPES缓冲液(pH值为3.0)中的90μL的Maltrin底物(5％w/v)溶液中来启动反应。在PCR培养箱中在55℃下分别进行4小时和22小时的孵育。通过添加50μL的0.5M NaOH并在振荡器中混合2分钟来终止反应。将板离心以收集上清液，然后将其用5mM的H₂SO₄稀释20倍。使用配备折射率检测器、Phenomenex Rezex-RFQ Fast Fruit柱柱和Phenomenex Rezex ROA有机酸保护柱的Agilent 1200系列HPLC分析这些样品(10μL)。流动相为5mM H₂SO₄，在85℃下以1.0mL/min的流速应用。确定了对应于DP1、2、3和3+的峰。计算作为总DP1、DP2、DP3和DP3+的分数的DP1峰面积百分比，并示出于表3中。FraGA1、WcoGA1和TeGA葡糖淀粉酶比AnGA和TrGA表现出更高的生葡糖活性。

实例5

在低pH下测量的葡萄糖淀粉酶对淀粉液化物的生葡糖活性

在低pH下针对淀粉液化物评估了葡糖淀粉酶FraGA1、WcoGA1、TrGA和AnGA，以测量其生葡糖活性以及DP3和DP3+水解。将玉米淀粉液化物的pH(32％ds，经α-淀粉酶预处理)调节至pH 3.0。将上述底物(10g)和葡糖淀粉酶(剂量为0.25mg/gds)分别在32℃和55℃下孵育。将反应混合物(100μL)孵育17、24、41、48、63、或72小时，然后在所述时间在100℃加热15分钟以淬灭反应。离心后，将上清液转移至新容器中，并使用与实例4中所述相同的条件在5mM H₂SO₄中稀释400倍用于HPLC分析。表4中报告的值为作为总DP1、DP2、DP3和DP3+的分数的每个DPn的峰面积百分比。表4中的结果表明，当以相同的蛋白量(0.25mg/gds)给予并在32℃、pH 3下孵育时，与TrGA和AnGA相比，FraGA1和WcoGA1显示出更高的生葡糖活性和更快的DP3+水解。当孵育温度升至55℃时，WcoGA1和FraGA1非常有效地水解了DP3+，在孵育17h后，分别仅保留了3％、4％和5％的DP3+，而TrGA和AnGA反应中分别保留了18％和13％的DP3+。

在pH 2.0下进一步评估了FraGA1、WcoGA1、TrGA和AnGA对淀粉液化物的活性。孵育程序与上述相同，除了酶的剂量为0.2mg/gds并且在pH 2.0下进行孵育。在4、21、29、45、53和70h收集样品。在pH 2下，FraGA1和WcoGA1在DP3+水解速率和最终DP1转化方面大大优于TrGA和AnGA，如表5所示。在32℃和55℃孵育70h后，FraGA1和WcoGA1分别产生≥90％和≥72％DP1，而TrGA仅产生54％和3％。这些结果表明，FraGA1和WcoGA1在糖化以及同时糖化和发酵(SSF)过程中具有很高的潜力，其中在pH 2.0-3.0和30℃-55℃时具有显著的活性。

实例6

在pH 3.5和pH 4.5下针对糖化评估葡糖淀粉酶

在传统的pH 4.5条件下和较低的pH 3.5下评估FraGA1、WcoGA1和AnGA的糖化性能。通过分析等剂量酶处理后的糖组成来测量DP1的产生。葡糖淀粉酶(以50μg/gds剂量)和α-淀粉酶预处理的玉米淀粉液化物(32％ds)的孵育在60℃、pH 3.5和4.5下进行，并且在在24、48、和72小时收集样品。通过在100℃加热15min来猝灭所有孵育。离心后，将每个样品的上清液转移至新试管中，并在5mM H₂SO₄中稀释400倍用于HPLC分析。使用带有Fast fruit柱(100mm×7.8mm)的Agilent 1200系列HPLC系统在80℃下以1.0mL/min的流速在5mM H₂SO₄的等度梯度下进行HPLC分离。使用折射率检测器检测寡糖产物。样品的生葡糖活性总结在表6中。在pH 3.5下孵育48h后，通过FraGA1和WcoGA1产生的DP1与使用AnGA在pH 4.5下孵育72小时后的结果相当。

实例7

反刍动物消化条件下FraGA1和WcoGA1的稳定性

如下所述，在体外反刍动物消化条件下，在pH 2.2、5.6和6.5下测量FraGA1和WcoGA1酶的稳定性。

在pH 5.6下的测定条件：反应混合物包含1mL从当地奶牛(丹麦富勒姆)收集的测量pH值为5.6的瘤胃液以及20μL的葡萄糖淀粉酶(FraGA1的蛋白质浓度为5mg/mL，并且WcoGA1的蛋白质浓度为6.5mg/mL)。将反应混合物在40℃下以100rpm振荡10h。保持在5℃的反应混合物作为对照；对于空白，不添加酶。每种酶处理或空白重复三次。孵育期结束时，添加0.5mL的10％(w/w)的玉米淀粉(西格玛公司(Sigma)，S-4126)，并且将样品在40℃下以240rpm进一步振荡孵育140分钟。残余活性百分比(％)计算如下：与酶在40℃下孵育后的活性减去空白，除以与酶在5℃下孵育后的活性减去空白，乘以100。

在pH 6.5下的测定条件：除了将pH调节至pH 6.5并且将DTT添加至20mM之外，条件与上述pH 5.6相同。

在pH 2.2下的测定条件：收集后冷冻的瘤胃液在使用前应解冻并离心。弃去上清液，并将沉淀物以1:3的比例(沉淀比水)悬浮在纯净水中。将悬浮的匀浆的pH值调节至pH2.2。将0.6mL等分试样加到2mL试管中，该试管中含有在60mM甘氨酸-HCl(pH 2.0)的0.4mL胃蛋白酶(2500U胃蛋白酶/mL，西格玛公司(Sigma)P7000)和20μL的每种葡萄糖淀粉酶(FraGA1的蛋白质浓度为5mg/mL，并且WcoGA1的蛋白质浓度为6.5mg/mL)。将反应混合物在40℃下以100rpm振荡孵育3h。孵育结束时，添加悬浮于pH 6.5的250mM MES中的0.5mL的15％(w/w)玉米淀粉(西格玛公司(Sigma)，S-4126)，并将样品在40℃下孵育3h。残余活性百分比(％)计算如下：与酶在40℃孵育后的活性减去空白，除以未进行预孵育(对照)的活性减去空白，乘以100。

在每个反应结束时，将测定管离心，并将上清液转移至PCR板，并在95℃下热处理5分钟。将经过热处理的PCR管中的样品在96孔滤板上运行，并使用BioRad碳水化合物柱(Aminex HPX-87N)和水作为洗脱液，在75℃下通过HPLC将每种滤液的10uL等分试样用于定量葡萄糖含量。葡萄糖含量用作葡糖淀粉酶对淀粉底物的活性的量度。如表7所示，观察到葡糖淀粉酶FraGA1和WcoGA1在40℃、在pH 5.6和在pH 6.5孵育10h后保留60％-70％的残余活性。还观察到在猪胃蛋白酶存在下在pH 2.2和40℃下孵育3h后，这两种葡糖淀粉酶保留约90％的活性。

实例8

在小肠消化条件下FraGA1和WcoGA1的稳定性和活性

为了模拟小肠消化条件，按照Menke和Steingass所述的方案(Liu,J.X.,A.Susenbeth,和K.H.Südekum.2002.In vitro gas production measurements toevaluate interactions between untreated and chemically treated rice straws,grass hay,and mulberry leaves[体外产气量测量用于评估未处理的稻草和化学处理过的稻草、干草和桑叶之间的相互作用].Journal of Animal Science[动物科学杂志]80:517-524)将一份瘤胃液与两份人造瘤胃液混合。添加玉米粉至终浓度为10％(w/w)并调节至pH 6.5。将1mL此混合物与50μL的猪胰酶(西格玛公司(Sigma)，P7545，50mg/mL胰酶原液)和15μL的葡糖淀粉酶样品(0.08mg FraGA1或0.10mg WcoGA)混合。对于空白样品，既不添加胰酶，也不添加葡糖淀粉酶。反应在40℃下以240rpm振荡3h。然后将反应混合物以4000rpm离心10分钟，并将150μL的上清液转移至PCR板中，并在95℃加热5分钟。将50μL等分试样转移到0.45μm滤板中，并添加90μL水，并将所述滤板在4000rpm下离心15分钟。如实例7所述，通过HPLC分析滤液的葡萄糖(G1)、麦芽糖(G2)和麦芽三糖(G3)的含量。每种处理或空白反应进行三次重复，并将其平均值记录在表8中。Std.dev表示标准偏差。

如表8所示，猪胰酶从玉米粉释放葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。FraGA1和WcoGA1酶均从玉米粉中的粗淀粉中释放葡萄糖。WcoGA1还能够在实验条件下降低麦芽糖的水平。葡糖淀粉酶与胰酶的组合产生葡萄糖、麦芽糖并减少麦芽三糖。这些结果表明，即使在猪胰酶中存在消化蛋白酶的情况下(如制造商所报道)，葡糖淀粉酶也可以与胰酶中存在的α-淀粉酶一起作用。在体内，产生的葡萄糖可以被动物直接吸收，而形成的麦芽糖可以通过小肠上皮细胞上的与刷状缘结合的麦芽糖酶-葡糖淀粉酶转化为葡萄糖。由马齿玉米制成的玉米粉具有以下组成：88.2％干物质、9.3％粗蛋白、2.0％酸性洗涤剂纤维、6.6％的经淀粉酶处理的中性洗涤剂纤维、78.5％非纤维状碳水化合物、和89.0％全部可消化的养分，并粉碎至200μm以下。

实例9

FraGA1在对玉米的瘤胃发酵中增加干物质消化和气体产生

在使用马齿玉米作为底物(4mm粉碎的)的体外分批发酵系统中评估FraGA1对干物质消化率(DMD)、气体产生、淀粉消化率和pH的影响。在三个单独的运行中以三种剂量(0、0.25、0.5和0.75mg/g的底物作为饲料基础)评估FraGA1的功效，每次运行中每个酶剂量组合四个重复。在较早描述的发酵设置中，将缓冲的瘤胃内容物与底物一起孵育后，根据瘤胃发酵模式确定每种酶的有效性(Adesogan,A.T.,Krueger,N.K.,和Kim,S.C.2005.Anim.Feed Sci.Technol[动物饲料科学与技术].123:211-223；Krueger,N.A.,and A.T.Adesogan.2008.Anim.Feed Sci.Tech[动物饲料科学与技术].145:84-94；Goering,H.K.和P.J.Van Soest.1970.Agric.Handbook[农业手册]编号379.ARS USDA,华盛顿特区，第20页)。实例8给出了该体外分批发酵系统中使用的马齿玉米的组合物。将0.5g的马齿玉米样品粉碎至4mm，称重放入4个重复的F57滤袋(安卡姆科技公司(ANKOMTechnology)，马斯顿(Macedon)，纽约州)中。在0.1M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中制备FraGA1酶，并以每克底物0、0.25、0.5和0.75mg酶蛋白添加到滤袋中的粉碎的马齿玉米。然后用Uline公司的桌面塑料袋封口机(Uline Tabletop Poly Bag Sealer)(

类型)密封滤袋，并立即放入装有缓冲的瘤胃液(52mL)的160mL血清瓶中。还包括仅含有滤袋的空瓶，以及仅含粉碎的马齿玉米的对照(除了缓冲瘤的胃液外没有酶)。然后用橡胶塞将瓶子密封，并用铝密封条密封。将它们在39℃下在加压气流(forced-air)孵育器中孵育7h。孵育结束时，将含有马齿玉米残余物的滤袋在60℃下烘箱干燥48h，并称重以定量DMD。用压力传感器测量瓶内的气体压力，并随后在7h孵育后转换为气体体积。以下公式用于将气体压力转换为气体体积：气体容积(mL)＝(气压(psi)*4.8843)+3.1296。该公式是根据实验条件制定的。

缓冲的瘤胃液的制备如下：在消耗总混合给养(TMR)后，从三头泌乳的、瘤胃插管的荷斯坦奶牛中吸出瘤胃液2h至3h。基于干物质饲喂至瘤胃插管奶牛的TMR成分组合物由以下组成：38.2％玉米青贮饲料、27.3％粉碎的去壳玉米、含有44％粗蛋白的14.5％大豆粉、9.1％柑橘渣、4.5％饲养场预混物、4.0％中期开花的苜蓿干草、1.8％能量增强剂(MS专业营养公司(MS Specialty Nutrition)，敦提(Dundee)、伊利诺伊州)、和0.5％Novasil(巴斯夫公司(BASF)，德国)。将收集的瘤胃液通过四层粗棉布过滤，然后与预热的人工唾液(39℃)混合。人工唾液的组合物包括CaCl₂·2H₂O、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、FeCl₂·6H₂O的微量矿物质溶液；Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O的常量矿物质溶液；(NH₄)₂HCO₃和NaHCO₃的缓冲溶液；胰蛋白酶蛋白胨溶液(胰蛋白胨，西格玛奥德里奇公司(Sigma–Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)；氧化还原指示剂刃天青和含有半胱氨酸HCl、1M NaOH、Na₂S·9H₂O和蒸馏水的还原溶液(Goering,H.K.和P.J.Van Soest.1970.Agric.Handbook[农业手册]编号379.ARS USDA,华盛顿特区，第20页)。瘤胃液与人工唾液的体积比为1:2。

统计分析：对于实例9中的所有实验，使用SAS的GLIMMIX程序(版本9.1；SAS研究所(SAS Institute)，凯利(Cary)，北卡罗来纳州)分析收集的数据。将实验被设计为完全随机区组设计，其中每次运行被认为是一个区组。当以不同剂量测试酶时，剂量用作模型中的固定效应。响应变量包括体外DMD和气体产生。运行被认为是一个随机因素。模型的固定效应包括在孵育后不同时间测量的发酵参数的采样时间。在进行最终分析之前，使用SAS的UNIVARIATE程序测试残差的离群值和正态性。处理影响在P<0.05被证明是显著的，而在0.05≤P≤0.10定义了任何趋势。

结果：下表9中示出的结果表明，在本文所述的体外瘤胃发酵条件下，葡糖淀粉酶FraGA1以剂量依赖方式增加DMD和气体产生。在每克粉碎的马齿玉米中在0、0.25和0.5mg的酶蛋白剂量下，淀粉消化率有增加的趋势。pH值与酶剂量无关，都非常恒定。

^a-b意指行内不同上标具有差异(P<0.05)。

实例10

蛋白质序列比较

针对NCBI和基因组查询专利数据库(其中搜索参数设置为默认值)，使用用于FraGA1(SEQ ID NO:7)、WcoGA1(SEQ ID NO:8)和TeGA(SEQ ID NO:9)的预测的成熟氨基酸序列，通过BLAST搜索(Altschul等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],25:3389-402,1997)鉴定了相关蛋白质，并且子集分别显示于表10A和10B(FraGA1)、表11A和11B(WcoGA1)和表12A和12B(TeGA)中。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。表上标有“序列长度”的值对应于以所列出的登录号提及的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”是针对用于比对和PID计算的序列。

使用CLUSTALW软件(Thompson等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],22:4673-4680,1994)以默认参数来进行FraGA1(SEQ ID NO:7)；WcoGA1(SEQ ID NO:8)；TeGA(SEQ ID NO:9)；AnGA(XP_001390530.1(SEQ ID NO:10)的aa 25-640,)；TrGA(2VN4_A,SEQID NO:11)；KZT67263.1(SEQ ID NO:12的aa 19-571)；XP_002475369.1(SEQ ID NO:13的aa18-569)；US 20090325240-1847(SEQ ID NO:14的aa 17-570)；KZT09226.1(SEQ ID NO:15的aa 18-570)；WO2016196202-0012(SEQ ID NO:16)；US 20170314003-0002(SEQ ID NO:17的aa 19-575)；GAD95639.1(SEQ ID NO:18的aa 38-622)；US 20170306309-0023(SEQ IDNO:19)；和CAC28076.1(SEQ ID NO:20的aa 29-618)预测的成熟序列的比对。多重序列比对如图1所示。

实例11

在pH 1.9、4.5和6.0时葡糖淀粉酶的相对活性

在模仿那些反刍动物消化系统中经历的条件下，测量了葡萄糖淀粉酶FraGA1和WcoGA1从玉米淀粉底物中的葡萄糖释放。每个反应混合物均以1mL体积包含0.1mg纯化的酶和10％(w/v)的玉米淀粉(西格玛公司(Sigma)S-4126)。对于pH 1.9反应，使用0.1M甘氨酸HCl(pH 1.9)作为稀释剂，反应中还含有1000单位的猪胃蛋白酶(西格玛公司(Sigma)P-7000)。对于pH 4.5反应，使用5N NaOH将0.1M甘氨酸的pH值调节至4.5，并省略胃蛋白酶。对于pH 6.0反应，将0.1M Mes-NaOH(pH 6.0)用作稀释剂，并省略胃蛋白酶。

反应在40℃下振荡2h。离心样品以分离上清液和未反应的玉米淀粉粒。将上清液在99℃下加热10分钟，过滤并将20μl的滤液注入到使用Na-碳水化合物柱的HPLC进行以分离并定量使用1mg/mL葡萄糖标准液产生的葡萄糖。

反应结果示出于表13中。葡萄糖释放活性表示为每mL反应释放的mg葡萄糖。相对于pH 1.9和6.0，两种葡糖淀粉酶均在pH 4.5下显示出最高活性。令人惊讶地发现，在胃蛋白酶存在下，两种葡糖淀粉酶均在pH 1.9下显示出活性，并且在pH 1.9下的活性超过在pH6.0下的活性的80％。

Claims (29)

1.一种糖化淀粉底物的方法，所述方法包括将所述淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

a.具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

b.与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

c.与SEQ ID NO:7或8的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

d.具有SEQ ID NO:9的催化结构域的氨基酸序列的多肽；或

e.在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

其中所述糖化在pH 2.0至pH 6.0之间进行。

2.如权利要求1所述的方法，其中糖化所述淀粉底物产生高葡萄糖糖浆。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述高葡萄糖糖浆包含选自以下列表的葡萄糖量，该列表由以下组成：至少95.5％葡萄糖。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述高葡萄糖糖浆发酵成终产物。

5.如权利要求4所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述终产物是醇，例如乙醇。

7.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述终产物是选自下组的生物化学品，该组由以下组成：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油和异戊二烯。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物是约5％至99％、15％至50％或40％至99％干固体(DS)。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物选自小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、买罗高粱、粟、马铃薯、甘薯、木薯淀粉及其任何组合。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述淀粉底物包含液化淀粉、糊化淀粉或颗粒状淀粉。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述淀粉底物中添加己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、水解酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或其组合。

12.一种糖化和发酵淀粉底物以产生终产物的方法，所述方法包括将所述淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

b)与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

c)与SEQ ID NO:7或8的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

d)具有SEQ ID NO:9的催化结构域的氨基酸序列的多肽；或

e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

其中所述糖化和发酵在pH 2.0至pH 6.0之间进行，优选在pH 2.0至pH 5.0之间、优选在pH 2.0至pH 4.0之间、更优选在pH 2.0至pH 3.0之间进行。

13.如权利要求12所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述终产物是醇，例如乙醇。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述糖化和发酵的淀粉底物与将相同的淀粉底物与AnGA接触相比导致DP3+水平的降低以及DP1水平的增加。

16.如权利要求12或13所述的方法，其中所述终产物是选自下组的生物化学品，该组由以下组成：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油和异戊二烯。

17.一种提高在动物中的淀粉消化率的方法，所述方法包括添加至少一种葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

b)与SEQ ID NO:7或8的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

c)与SEQ ID NO:7或8的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

d)具有SEQ ID NO:9的催化结构域的氨基酸序列的多肽；或

e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；

作为饲料添加剂用于动物饲喂，其中所述葡糖淀粉酶(a)与在仅pH6或在瘤胃液存在下的酶活性相比，在胃蛋白酶或瘤胃液存在下在pH小于或等于3时，具有至少20％的活性或至少20％更大的残余活性，并且(b)所述酶与胰淀粉酶共同作用以提高葡萄糖产量。

18.如权利要求17所述的方法，其中当所述动物是反刍动物时，所述酶在所述反刍动物的三个消化腔中的至少两个中具有活性，所述消化腔包含瘤胃、皱胃和小肠。

19.如权利要求16或17所述的方法，其中所述至少一种葡糖淀粉酶能够水解粗淀粉，如在使用粗淀粉的葡萄糖释放测定法中所测量的。

20.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:4、5或6的核苷酸序列至少80％同一性的核苷酸序列。

21.一种载体，所述载体包含如权利要求20所述的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列有效地连接至一个或多个控制序列，所述控制序列控制所编码的多肽在表达宿主中的产生，并且其中所述调控序列对于编码核苷酸序列是异源的，或者所述调控序列和编码序列并非如自然界中一起发现的那样排列。

22.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含如权利要求20所述的多核苷酸。

23.如权利要求22所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞为木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、毁丝霉属(Myceliopthora)或酵母属(Saccharomyces)细胞。

24.如权利要求22所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、或假单胞菌属(Pseudomonas)细胞。

25.如权利要求22所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞为产乙醇微生物。

26.如权利要求22-25中任一项所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞进一步表达和分泌一种或多种选自下组的另外的酶，该组包含：蛋白酶、半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂肪分解酶、金属脂肪分解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、植酸酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、转移酶或其组合。

27.一种饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料添加剂组合物或预混物包含至少一种葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(a)具有SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列的多肽；

(b)与SEQ ID NO:7、8或9的氨基酸序列具有至少83％同一性的多肽；

(c)与SEQ ID NO:7、8或9的催化结构域具有至少83％同一性的多肽；

(d)与SEQ ID NO:7、8或9的接头和催化结构域具有至少83％同一性的多肽；或

(e)在从表达宿主分泌过程中通过信号肽酶或翻译后修饰对SEQ ID NO:1、2或3的多肽进行加工而产生的成熟多肽；和/或

(f)任选地至少一种矿物质和/或至少一种维生素。

28.如权利要求27所述的饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料添加剂组合物或预混物进一步包含选自下组的酶中的一种或多种，该组由以下组成：蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶和植酸酶。

29.如权利要求27或权利要求28所述的饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料添加剂组合物或预混物进一步包含一种或多种直接饲喂的微生物，所述直接饲喂的微生物选自由芽孢杆菌属、乳酸细菌和酵母菌组成的组。

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