CN111182793A - 接种剂和酶用于增加动物饮食中营养素释放的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了一种改善动物用高含水谷物饲料和/或再水合谷物饲料消化率的方法，所述方法包括a)将谷物饲料加工成碎片和b)使步骤(a)的谷物饲料碎片与至少一种在pH小于5.0下稳定且有活性的淀粉水解酶、任选的至少一种蛋白酶、和至少一种包括至少一种细菌菌株的接种剂的组合接触。

Description

接种剂和酶用于增加动物饮食中营养素释放的用途
技术领域
本领域涉及动物营养，以及，特别涉及接种剂和酶在增加动物饮食中营养素释放的用途。
背景技术
微生物可用于改善饲料成分的利用率。例如，微生物被广泛用作人类健康和动物营养的益生菌(也称为直接饲喂的微生物)。当此类微生物用于改善饲料成分的利用率(例如，对青贮饲料进行预处理)时，它们被称为“接种剂”。青贮饲料接种剂是含有厌氧乳酸菌的添加剂，可用于操纵和增强发酵。益处包括减少青贮饲料的发酵损失和增强动物性能。
商业接种剂中最常见的乳酸菌是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、各种片球菌属(Pecococcus)物种和其他乳杆菌属(Lactobacillus)物种。
另一种选择是使用酶来提高饲料的消化率。例如，还测试了包括植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶的酶通过在厌氧条件下与饲料组分进行预孵育用于增加可溶性营养素水平(Ton Nu等人,High-moisture airtight storage of barley and triticale:Effect of moisture level and grain processing on nitrogen and phosphorussolubility[大麦和黑小麦的高含水气密性储存：含水水平和谷物加工对氮和磷溶解度的影响].Animal Feed Science and Technology[动物饲料科学与技术]210(2015)125-137)。还测试了用α-淀粉酶处理玉米青贮饲料(Leahy等人,Effects of treating cornsilage with alpha-amylase and(or)sorbic acid on beef cattle growth andcarcass characteristics[用α-淀粉酶和(或)山梨酸处理玉米青贮饲料对肉牛生长和屠体特性的影响].J.Anim.Sci[动物科学杂志].1990.,68:490-497)。纤维素酶和接种剂已在苜蓿青贮饲料中进行了测试(Nadeau等人,Intake,digestibility,and composition oforchard grass and alfalfa silages treated with cellulase,inoculant,and formicacid fed to lambs[饲喂羔羊的纤维素酶、接种剂和甲酸处理过的野茅和苜蓿青贮饲料的摄入量、消化率和组合物].J.Anim.Sci[动物科学杂志].2000.78:2980-2989)。
青贮饲料接种剂或酶有助于改善动物饲料的营养素利用率，但仍有改进的空间。已经发现至少一种淀粉水解酶单独或与至少一种蛋白酶和至少一种接种剂组合可以改善动物饲料的营养物利用率。
发明内容
在一个实施例中，描述了一种改善动物用高含水谷物饲料和/或再水合谷物饲料消化率的方法，所述方法包括a)将谷物饲料加工成谷物饲料碎片和b)使步骤(a)的谷物饲料碎片与至少一种在pH小于5.0下稳定且有活性的淀粉水解酶和至少一种包括至少一种细菌菌株的接种剂的组合接触。
在权利要求1的第二实施例中，其中，所述淀粉水解酶优选具有使其能够水解生淀粉的淀粉结合结构域。此外，所述淀粉水解酶选自糖苷水解酶家族13和/或15。
在第三实施例中，所述淀粉水解酶选自由以下组成的组：至少一种α淀粉酶或至少一种葡糖淀粉酶。
在第四实施例中，本文所述的方法在步骤(b)中还包括至少一种蛋白酶。
在第五实施例中，所述蛋白酶是内肽酶，该内肽酶选自由以下组成的组：金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
在第六实施例中，所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
在第七实施例中，所述谷物饲料选自由以下组成的组：玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、高粱、高粱青贮饲料、油籽或其组合。
在第八实施例中，所述动物是反刍动物。
附图说明
图1显示了使用Buehler粉碎机破碎的玉米仁。
图2显示了通过含乳杆菌的接种剂和酶的相互作用葡萄糖可溶性营养素从含水玉米的释放。
具体实施方式
引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。
在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，否则适用以下定义。
在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”在关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。
术语“包括”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包括”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。
在存在的情况下，所有范围是包括端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
术语“糖苷水解酶”与“糖苷酶”、“糖基水解酶”和“淀粉水解酶”互换使用。糖苷水解酶有助于复合糖聚合物(多糖)中糖苷键的水解。与糖基转移酶一起，糖苷酶形成用于糖苷键合成和破坏的主要催化机制。糖苷水解酶被分类为EC 3.2.1，作为催化O-或S-糖苷水解的酶。糖苷水解酶也可根据水解反应的立体化学结果进行分类：因此它们可被分类为构型保持酶(retaining enzyme)或构型翻转酶(inverting enzyme)。糖苷水解酶也可分为外切或内切作用，取决于它们分别作用于(通常非还原)寡糖/多糖链的末端还是中间。糖苷水解酶也可以通过基于序列或结构的方法进行分类。它们通常以它们所作用的底物命名。
术语“淀粉(starch)”和“淀粉(amylum)”可互换使用。淀粉是由通过糖苷键连接的大量葡萄糖单元组成的聚合碳水化合物，并且是植物中最常见的储存碳水化合物。因此，“淀粉”可以指由植物的复合多糖碳水化合物组成的任何材料，所述复合多糖碳水化合物由具有化学式(C6H10O5)x(其中X可以是任何数目)的直链淀粉和支链淀粉组成。具体地，所述术语是指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎、和根，并且更具体地是小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高粱、麸、木薯、粟、马铃薯、甘薯、和树薯。
术语“淀粉结合结构域(SBD)或碳水化合物结合模块(CBM)”在本文中可互换使用。SBD可分为九个CBM家族。作为能量来源，淀粉被很多各种淀粉分解酶降解。然而，这些淀粉分解酶中仅约10％能够结合并降解生淀粉。这些酶通常具有称为淀粉结合结构域的独特序列结构模块，所述淀粉结合结构域介导与淀粉颗粒的附接。SBD是指优先结合淀粉(多糖)底物或麦芽糖、α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精等的氨基酸序列。它们通常是在约10％的微生物淀粉分解酶中发现的大约100个氨基酸残基的基序。
术语“催化结构域”是指多肽的结构区域，所述区域不同于CBM并且含有底物水解的活性位点。
术语“颗粒淀粉”和“生淀粉”在本文互换使用，是指生的(即未烹调的)淀粉，例如，未经历糊化的颗粒淀粉。
术语“α-淀粉酶”与α-1,4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和糖原酶互换使用。α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)通常(但不总是)需要钙才能起作用。这些酶催化寡糖和多糖中α-1,4-糖苷键的内切水解。α-淀粉酶以随机方式作用于淀粉、糖原和相关多糖和寡糖，从而释放α-构型中的还原基团。
术语“葡糖淀粉酶”(EC 3.2.1.3)可与葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶、淀粉葡糖苷酶、γ-淀粉酶、溶酶体α-葡糖苷酶、酸性麦芽糖酶、外切-1,4-α-葡糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、γ-1,4-葡聚糖葡糖水解酶、酸性麦芽糖酶、以及1,4-α-D-葡聚糖水解酶互换使用。这种酶切割直链淀粉和支链淀粉非还原末端的最后的α-1,4-糖苷键以产生葡萄糖。它还切割α-1,6-糖苷键。
术语“蛋白酶”意指衍生自微生物(例如真菌、细菌)或衍生自植物或动物的蛋白质或多肽结构域，且其具有催化肽键在蛋白质主链的一个或多个不同位置的切割的能力(例如E.C.3.4)。术语“蛋白酶”、“肽酶”和“朊酶”可以互换地使用。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。蛋白质水解可通过目前基于其催化机理被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
肽酶可以通过催化的反应进行分类(这是功能分类)或通过分子结构和同源性进行分类(这是MEROPS分类)。
表1.功能分类：
肽酶 类型 说明 NC-IUBMB
氨基- 外切 从N末端切割一个aa EC 3.4.11
二肽基- 外切 从N末端切割两个aa EC 3.4.14
三肽基- 外切 从N末端切割三个aa EC 3.4.14
羧基- 外切 从C末端切割一个aa EC 3.4.16-18
肽基二- 外切 从C末端切割两个aa EC 3.4.15
二- 外切 切割二肽 EC 3.4.13
内切- 内切 切割内部肽键 EC 3.4.21-25
寡聚- 内切 仅作用于肽的内切肽酶。 EC 3.4.21-25
表2.MEROPS分类
Figure BDA0002440225250000061
术语“酸性蛋白酶”意指在酸性条件下能够水解蛋白质的蛋白酶。
术语“天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease)”和“天冬氨酸蛋白酶(asparticacid protease)”在本文中可互换使用，是一种酸性蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)，也称为天冬氨酰蛋白酶，是一个活化的水分子与一个或多个催化天冬氨酸残基结合，以水解多肽底物中的肽键。通常，它们在活性位点上有两个高度保守的天冬氨酸，并且在酸性pH下最具活性。
缩写“AFP”是指一种天冬氨酸真菌蛋白酶，是一种来自真菌微生物来源的天冬氨酸蛋白酶。
术语“金属蛋白酶”是其催化机制涉及金属的任何蛋白酶。大多数金属蛋白酶需要锌，但有些使用钴。金属离子通过三个配体与蛋白质配位。配位金属离子的配体可随组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸而变化。第四个配位位置被不稳定的水分子吸收。
存在两个亚组的金属蛋白酶，所述金属蛋白酶包括(a)外肽酶、金属外肽酶(EC编号：3.4.17)，和(b)金属内肽酶(3.4.24)。熟知的金属内肽酶包括ADAM蛋白和基质金属蛋白酶。
在MEROPS数据库中，肽酶家族按其催化类型分组，第一个字符表示催化类型：A，天冬氨酸；C，半胱氨酸；G，谷氨酸；M，金属；S，丝氨酸；T，苏氨酸；和U，未知。丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸肽酶利用氨基酸作为亲核体并形成酰基中间体-这些肽酶也可以很容易地充当转移酶。在天冬氨酸、谷氨酸和金属肽酶的情况下，亲核体是活化的水分子。在许多情况下，表征宗族或家族的结构蛋白质折叠可能失去了其催化活性，但仍保留了其在蛋白质识别和结合中的功能。
术语“丝氨酸蛋白酶”是指切割蛋白质中的肽键的酶，其中丝氨酸在酶的活性位点处充当亲核氨基酸。基于其结构将丝氨酸蛋白酶分为两大类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶。在MEROPS蛋白酶分类系统中，蛋白酶分布在16个超家族和众多家族中。家族S8包括枯草杆菌蛋白酶并且家族S1包括胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)酶。亚家族S1E包括来自链霉菌生物体的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，例如链霉菌蛋白酶(Streptogricin)A、B和C。术语“丝氨酸蛋白酶”、“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”和“胰凝乳蛋白酶样蛋白酶”在本文中可互换地使用。
术语“苏氨酸蛋白酶”是指在活性位点具有苏氨酸残基的蛋白水解酶家族。
术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用。“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。反刍动物具有通过其微生物/酶消化系统将粗饲料转化为蛋白质和能量的独特能力。因此，反刍动物在地球生态和食物链中起着重要作用。
反刍动物和非反刍动物之间的主要区别在于反刍动物的胃有四个隔室：瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。在前两个室(瘤胃和网胃)中，食物与唾液混合并分离成固体物质层和液体物质层。固体堆积在一起形成反刍食物或食团。
然后将反刍食物反刍并咀嚼以使其与唾液完全混合并分解粒度。纤维(尤其是纤维素和半纤维素)主要是通过微生物(大部分是细菌，以及一些原生动物、真菌和酵母)在这些室中分解成三种主要的挥发性脂肪酸(VFA)：乙酸、丙酸和丁酸。蛋白质和非结构碳水化合物(果胶、糖和淀粉)也被发酵。
虽然瘤胃和网胃具有不同的名称，但它们代表相同的功能空间，因为消化物可以在它们之间来回移动。这些室一起被称为瘤网胃。然后这些降解的消化物(现在位于瘤网胃中较低的液体部分)进入下一个室(瓣胃)，在这里水和许多无机矿质元素被吸收进入血流中。
在此之后，消化物移动到真胃(皱胃)中。皱胃是直接等效的单胃，并且消化物在皱胃中以大致相同的方式被消化。消化物最终移入小肠，在小肠中进行消化和营养素素吸收。瘤网胃中产生的微生物也在小肠中被消化。在大肠中，发酵以与在瘤网胃中相同的方式继续进行。
如本文所使用的，术语“秣料”是指一种动物饲料类型，是专门用于饲养驯养的家畜(如牛、山羊、绵羊、马、鸡和猪)的任何农业食料。“秣料”具体是指给予动物的食物(包括切割并喂给它们的植物)，而不是它们自己觅食的食物(称为饲喂料)。术语秣料也被称为干饲料，并且包括干草、秸秆、青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合给养，以及发芽谷物和豆类(如豆芽、新鲜麦芽或麦芽废渣)。大多数动物饲料来自植物，但一些制造商将成分添加到动物来源的加工饲料中。
关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。
如本文所用，术语“谷物饲料”是指用作家畜(如牛、家禽)或其他动物的饲料的任何谷物。特别地，谷物饲料是指通常饲喂反刍动物的植物种子，这些动物可能包括也可能不包括种子的外壳、豆荚或果壳。实例包括，但不限于，大麦、玉米、燕麦、高粱、小麦(黑小麦)、黑麦、和油籽如大豆和菜籽。
术语“高含水谷物饲料”是指具有至少23％水分的谷物。例如，“高含水玉米”是指以百分之23或更高的水分收获的玉米，在料仓或其他储存结构中储存并允许发酵，并用作家畜饲料。
术语“青贮饲料”是指通过厌氧发酵过程保存的饲料(例如玉米青贮饲料、干草青贮饲料、高含水玉米等)。“青贮”是指植物材料通过厌氧发酵保存并且通常存储在袋式、仓库式或立式青贮料仓中。
如本文所用的“油籽”是指由植物产生的任何含有油的种子、坚果、仁等。考虑所有这些植物以及它们的种子、坚果或仁都可用于本文。小谷物，例如小麦的油含量仅为1％-2％；油籽的油含量范围从大豆的约20％到向日葵和菜籽(油菜籽)的超过40％。世界上食用籽油的主要来源是大豆、向日葵、菜籽、棉花和花生。例如，国家可持续农业信息服务列出了以下用于食物、专业或工业用途的油的来源：扁桃、杏仁、鳄梨、山毛榉果实、山桑子、黑加仑、琉璃苣、巴西坚果、金盏花、藏茴香籽、腰果、蓖麻籽、柑橘籽、丁香、可可、咖啡、干椰子肉(干燥的椰子)、芫荽、玉米籽、棉籽、接骨木果、月见草、葡萄籽、落花生、榛子、大麻籽、希蒙得木、亚麻籽、澳洲坚果、肉豆蔻、瓜子、芥菜籽、印楝籽、黑芝麻、肉豆蔻、棕榈仁、鸡蛋果、美洲山核桃、阿月浑子、罂粟籽、南瓜籽、油菜籽、树莓籽、辣椒、野玫瑰果、橡胶籽、红花籽、沙棘、芝麻籽、大豆、大戟、荨麻、向日葵籽、营养植物(tropho plant)、番茄籽或胡桃。
“接种剂”包含被选为主导料仓中作物发酵的细菌。青贮饲料接种剂根据它们发酵普通植物糖、葡萄糖的方式分为两类。同型发酵菌仅生产乳酸，并包括一些乳杆菌物种，例如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、片球菌物种(Pediococcus species)和肠球菌物种(Enterococcus species)。另一类异型发酵菌，生产乳酸、乙酸或乙醇以及二氧化碳。布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)是异型发酵菌的最好实例。
如本文所用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，所述术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。
酶增加了现代动物饲料的消化率，改善了反刍动物和单胃动物等的饲料:谷物的比率。纤维素酶和半纤维素酶等酶改善青贮饲料和基于玉米/大豆的饲料的营养价值。其他酶，例如α-半乳糖苷酶增加非淀粉多糖(NSP)的营养价值。酶可以使狗和猫受益、改善宠物食品的消化率并增强免疫系统。
在一个实施例中，描述了一种改善动物用高含水谷物饲料和/或再水合谷物饲料消化率的方法，所述方法包括a)将谷物饲料加工成谷物饲料碎片和b)使步骤(a)的谷物饲料碎片与至少一种淀粉水解酶和至少一种包括至少一种细菌菌株的接种剂的组合接触。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法将谷物饲料加工成碎片。
当今大多数饲料中的谷物在饲喂之前都经过了某些方式的加工。尽管有些谷物可以完整饲喂，但是加工，即使只是研磨也通常可以使动物更容易地获取营养素，从而提高了消化率和饲料效率。
谷物加工的主要目标是增加能量(淀粉)的利用率以改善动物性能。典型的加工方法在添加或不添加水或蒸汽的情况下减小谷物颗粒尺寸。一些常见的谷物加工方法是蒸汽压片、干轧、高含水收获和储存以及重构(再水合)。
常用的谷物加工方法包括，但不限于机械手段，例如研磨、破裂、轧制和卷曲或热加工。
使用锤磨机或滚压机进行研磨。锤磨机主要通过自由摆动的锤子在谷物落入研磨室时对谷物的冲击进行研磨。带有特定尺寸孔的筛网围绕着研磨室，并且当谷物颗粒变得足够小时，它们会通过孔排出。滚压机具有成对的辊，每个压机通常有两对或三对辊，当谷物在辊之间通过时将其粉碎。辊之间的间距可以调节以给出各种粒径。
示例性谷物饲料包括但不限于：玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷物、高粱、高粱青贮饲料、油籽或其组合。
已经发现，当使这种碎片化的谷物饲料与至少一种在pH值小于5.0下既稳定又有活性的淀粉水解酶合至少一种包括至少一种细菌菌株的接种剂的组合接触时，这种饲料的消化率得到改善。优选地，所述淀粉水解酶具有淀粉结合结构域，其中所述淀粉水解酶能够水解生淀粉。此外，所述淀粉水解酶选自糖苷水解酶家族13和/或15。优选地，所述淀粉水解酶可以选自由以下组成的组：α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
淀粉结合结构域是包括α-淀粉酶和葡糖淀粉酶在内的许多淀粉水解酶所具有的结构基序(Christiansen等人,2009,The carbohydrate-binding module family 20-diversity,structure,and function[碳水化合物结合模块家族20-多样性、结构和功能],FEBS J.[欧洲生化学会联合会杂志]276:5006-5029)。从广义上讲，SBD也可以称为碳水化合物结合模块(CBM)。这种结构基序有助于淀粉水解酶水解生淀粉(Janecek等人2011,Structural and evolutionary aspects of two families of non-catalytic domainspresent in starch and glycogen binding proteins from microbes,plants andanimals[来自微生物、植物和动物的淀粉和糖原结合蛋白中存在的两个非催化结构域家族的结构和进化方面].Enzyme Microb.Technol[酶微生物技术].49:429-440)。
糖苷水解酶家族GH13是主要的糖苷水解酶家族，作用于含有α-葡萄糖苷键的底物。
所述α-淀粉酶家族代表三个糖苷水解酶家族GH13、GH70和GH77的宗族GH-H。所述GH13家族包括，但不限于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；寡聚-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)；α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)；环麦芽糖糊精酶(EC 3.2.1.54)；形成麦芽四糖的α-淀粉酶(EC 3.2.1.60)；异淀粉酶(EC 3.2.1.68)；右旋糖酐葡糖苷酶(EC3.2.1.70)；海藻糖-6-磷酸水解酶(EC 3.2.1.93)；形成麦芽六糖的α-淀粉酶(EC3.2.1.98)；形成麦芽三糖的α-淀粉酶(EC 3.2.1.116)；生麦芽糖淀粉酶(EC 3.2.1.133)；新支链淀粉酶(EC 3.2.1.135)；麦芽寡糖基海藻糖海藻糖水解酶(EC 3.2.1.141)；极限糊精酶(EC 3.2.1.142)；形成麦芽五糖的α-淀粉酶(EC 3.2.1.-)；淀粉蔗糖酶(EC 2.4.1.4)；蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)；分支酶(EC 2.4.1.18)；环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(CGTase)(EC 2.4.1.19)；4-α-葡聚糖转移酶(EC 2.4.1.25)；异麦芽酮糖合酶(EC 5.4.99.11)；海藻糖合酶(EC 5.4.99.16)。
糖苷水解酶家族15酶是水解α-葡萄糖苷的非还原性末端残基的外切作用酶。目前，最通常表征的活性是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)，也称为淀粉葡糖苷酶，但是已经描述了葡糖葡聚糖酶(EC 3.2.1.70)和α,α-海藻糖(EC 3.2.1.28)活性。已经发现，真菌葡糖淀粉酶具有一定的底物柔性，并且不仅能够降解α-1,4-糖苷键，而且还能够降解α-1,6-、α-1,3-和α-1,2-键至较低的程度。
可以使用的酸性稳定和活性α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)选自糖苷水解酶家族GH13。可以提到来自白曲霉(Apergillus kawachii)、棒曲霉(A.clavatus)的α-淀粉酶。此外，也可以使用那些具有颗粒淀粉水解活性(GSH)的α-淀粉酶或已经被重组工程化以具有GSH活性的α-淀粉酶。这种GSH活性是有利的，因为这些酶分解更多的淀粉，具体是任何颗粒(生)淀粉，其可存在于任何含有糖蜜等的饲料中。具有GSH活性的α-淀粉酶包括但不限于从白曲霉(例如，AkAA)、黑曲霉(Aspergillus niger)(例如，AnAA)，棒曲霉(A.clavatus)(AcAA)、土曲霉(A.terreus)(AtAA)和里氏木霉(Trichoderma reesei)(例如，TrAA)获得的α-淀粉酶。
α-淀粉酶、AkAA、AcAA和AtAA具有两个碳水化合物结合结构域，其中一个属于碳水化合物结合模块/结构域家族20(CBM20或CD20)，而另一个有时称为二级结合位点(SBS)。SBS和CBM似乎通过以下起作用：1)将酶靶向其底物，2)引导底物进入活性位点沟(activesite groove)，3)底物破坏，4)增强持续性，5)变构调节，6)传递反应产物，和/或7)锚定到亲本微生物的细胞壁上。
许多这些推定的功能与CBM中属于非催化结合的功能一致。与CBM相反，SBS相对于催化位点具有固定位置，使得它们或多或少地适合承担特定的功能(Cuyvers S.,DornezE.,Delcour J.A.,Courtin C.M.(2012),Occurrence and functional significance ofsecondary carbohydrate binding sites in glycoside hydrolases[糖苷水解酶中二级碳水化合物结合位点的发生和功能意义].Crit.Rev.Biotechnol.[生物技术评论]32,93-107)。
一些可商购的具有GSH活性的α-淀粉酶或用于碳水化合物水解过程的酶是可商购的，参见，例如，可从诺和诺德公司(Novo Nordisk A/S)获得的
Figure BDA0002440225250000131
120-L、LC和SC SAN
Figure BDA0002440225250000132
和
Figure BDA0002440225250000133
SC，可从Verenium公司获得的
Figure BDA0002440225250000134
LF，以及可从美国丹尼斯科公司(Danisco,US,Inc.)的杰能科部门(Genencor Division)获得的
Figure BDA0002440225250000135
L、
Figure BDA0002440225250000136
FRED、
Figure BDA0002440225250000137
XTRA、GC626和
Figure BDA0002440225250000138
G997。
葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)选自糖苷水解酶家族GH 15，并且包括但不限于，来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡糖淀粉酶(TrGA及其变体CS4、Brew1)、来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的葡糖淀粉酶(AfuGA)、来自镰孢镰刀菌(Fusariumverticillioides)的葡糖淀粉酶(FvGA)。蛋白酶(protease)(也称为肽酶或朊酶(proteinase))是一种能够切割肽键的酶。蛋白酶经过多次进化，且不同种类的蛋白酶可以通过完全不同的催化机制进行相同的反应。蛋白酶可以在动物、植物、细菌、古细菌和病毒中找到。
蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
因此，在另一个实施例中，本文描述的方法还可以包括蛋白酶连同淀粉水解酶和包括至少一种细菌菌株的接种剂。优选地，所述蛋白酶是内肽酶，该内肽酶选自由以下组成的组：金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
优选地，所述蛋白酶是酸性蛋白酶，并且更优选是酸性真菌蛋白酶。
任何酸性蛋白酶均可用于本公开中。例如，酸性真菌蛋白酶包括从以下获得的那些：曲霉属、木霉属、毛霉菌属和根霉属，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、里氏木霉和米黑毛霉(M.miehei)。AFP可以衍生自细菌、植物和真菌来源的异源或内源蛋白质表达。
金属蛋白酶(“metalloproteinase”或“metalloprotease”)是其催化机制涉及金属的任何蛋白酶。大多数金属蛋白酶需要锌，但有些使用钴。金属离子通过三个配体与蛋白质配位。
存在两个亚组的金属蛋白酶：(a)外肽酶、金属外肽酶(EC编号：3.4.17)，和(b)内肽酶、金属内肽酶(3.4.24)。
熟知的金属内肽酶包括ADAM蛋白和基质金属蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶(或丝氨酸内肽酶)是裂解蛋白质中的肽键的酶，其中丝氨酸在(酶)活性位点处充当亲核氨基酸。它们在真核生物和原核生物中被普遍发现。基于其结构将丝氨酸蛋白酶分为两大类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)或枯草杆菌蛋白酶样。
苏氨酸蛋白酶是在活性位点中带有苏氨酸(Thr)残基的蛋白水解酶家族。
天冬氨酸蛋白酶是催化类型的蛋白酶，其使用与一个或多个天冬氨酸残基结合的活化水分子来催化其肽底物。通常，它们在活性位点上有两个高度保守的天冬氨酸，并且在酸性pH下最具活性。几乎所有已知的天冬氨酰蛋白酶都受到胃酶抑素的抑制。
青贮饲料接种剂是含有产乳酸细菌(LAB)和其他厌氧菌(如布氏乳杆菌)的饲喂料添加剂。这些接种剂用于控制和增强半干青贮(苜蓿、草、谷类)、玉米青贮饲料和高含水玉米中的发酵。目标是更快、更有效的发酵，以减少发酵损失，改善饲喂料品质和适口性，延长铺位寿命(bunk life)，并改善动物性能。
收获用作青贮饲料的谷类作物含有“好的”和“坏的”微生物的自然群体。“好的”微生物包括有助于青贮作物的产乳酸细菌(LAB)。“坏的”或腐败微生物包括梭菌、肠杆菌、杆菌、酵母和霉菌，它们会对青贮饲料的品质产生负面影响。
腐败微生物会导致不良的发酵、过多的干物质、能量和营养素素损失、异味/臭味的产生，从而减少摄入量，甚至产生会损害动物健康的毒素。
青贮饲料依赖于植物糖向酸的转化。所述酸会降低pH值并保存饲喂料。青贮饲料制造过程的第一步是通过压实和密封饲喂料来创造无氧(厌氧)条件。在所有植物材料中都少量存在厌氧(Anaerobic、oxygen hating)细菌。一旦达到无氧条件，这些细菌便开始繁殖并将植物糖转化为发酵酸。随着发酵酸水平的增加，pH值下降，从而将饲喂料保存为青贮饲料。
青贮饲料中可以存在多种天然细菌。它们产生一系列发酵酸。乳酸发酵是最理想的，因为在发酵过程中损失的能量最少，并且乳酸产生可口的、高饲料价值的青贮饲料。
商业接种剂中最常见的产乳酸细菌(“LAB”)是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、各种片球菌属(Pecococcus)物种和其他乳杆菌属(Lactobacillus)物种。商购接种剂中LAB的物种和特定菌株已经被选择，因为它们快速有效地生长，并且主要产生乳酸。它们提高了发酵速度，导致pH值下降更快，最终pH值略低。所述发酵产物被转移，导致更多的乳酸和更少的乙酸、乙醇和二氧化碳。乳酸比乙酸强，并且所含能量几乎与原始糖一样多。
青贮饲料接种剂大部分是兼性厌氧的，如LAB，这意味着无论是否有氧气，它们都可以生长。当有氧气时，接种剂有助于加速使青贮饲料材料厌氧的过程。一旦达到厌氧条件，这些相同的细菌就会转换为快速有效地产生酸(乳酸和一些乙酸)以降低pH值并防止腐败微生物的生长。当氧气较少时，接种剂会限制腐败微生物的产生，这些腐败微生物会在厌氧条件下生长(例如梭状芽孢杆菌、李斯特菌)。
不同的细菌菌株产生乳酸的能力各不相同。最理想的菌株是那些能够以最小的能量和干物质损失将糖转化为乳酸的菌株。可以使用任何可商购的接种剂。可商购的接种剂实例是
Figure BDA0002440225250000161
品牌接种剂
Figure BDA0002440225250000162
品牌1132、1127、11H50和1174。也可以提到
Figure BDA0002440225250000163
品牌11C33和11CFT，其中包含布氏乳杆菌的专利菌株，其可减少青贮饲料加热和在饲喂外时间时的腐败。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种改善动物用高含水谷物饲料和/或再水合谷物饲料消化率的方法，所述方法包括a)将所述谷物饲料加工成谷物饲料碎片和b)使步骤(a)的谷物饲料碎片与至少一种在pH小于5.0下稳定且有活性的淀粉水解酶和至少一种包括至少一种细菌菌株的接种剂的组合接触。
2.如实施例1所述的方法，其中所述淀粉水解酶选自糖苷水解酶家族13和/或15。
3.如实施例1所述的方法，其中所述淀粉水解酶具有淀粉结合结构域，其中所述淀粉水解酶能够水解生淀粉。
4.如实施例1、2或3所述的方法，其中所述淀粉水解酶选自由以下组成的组：至少一种α淀粉酶或至少一种葡糖淀粉酶。
5.如实施例1、2、3或4所述的方法，其中步骤(b)还包括至少一种蛋白酶。
6.如实施例5所述的方法，其中所述蛋白酶是内肽酶。
7.如实施例6所述的方法，其中所述蛋白酶是内肽酶，该内肽酶选自由以下组成的组：金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
8.如实施例1-7中任一项所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
9.如实施例1-8中任一项所述的方法，其中所述谷物饲料选自由以下组成的组：玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、高粱、高粱青贮饲料、油籽或其组合。
10.如权利要求1-9所述的方法，其中所述动物是反刍动物。
实例
除非在本文中另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wileyand Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。
本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。
实例1
随后实例中使用的材料
表1中列出了生物和蛋白质样品，用于随后实例中。表1显示了酶类型、样品的来源生物体(当已知时)和内部或商业来源，以及序列的专利参考。
表1.评估的酶、组分和生物材料列表。
Figure BDA0002440225250000181
根据生产商，
Figure BDA0002440225250000182
品牌11B91是高含水玉米接种剂产品，目的在于：改善发酵、保留营养素哈量并增强青贮高含水玉米的消化率。适用于水分范围22％至32％的高含水玉米，成熟时在立式、仓库式或袋式青贮料仓中进行青贮。下表2给出了所用酶的蛋白质浓度。
实例2
微生物接种剂预处理中用淀粉水解酶及其与酸性蛋白酶的组合水解破碎的玉米
使用了栽培种P7524的先锋玉米仁。它由88.2％干物质(DM)、9.3％粗蛋白(CP)、2.0％酸性洗涤剂纤维(ADF)、用淀粉酶处理的6.6％中性洗涤剂纤维(aNDF)、78.5％非纤维碳水化合物(NFC)、89.0％总可消化营养素(TDN)组成。首先使用Buehler粉碎机(BühlerAG，乌茨维尔，瑞士)在设置9将其破碎成3-10个碎片。碎片的长度在1mm至0.9cm之间(图1)。通过筛分除去直径小于1mm的碎片。将100g磨碎的玉米放入体积约为0.7升的OBH Nordica食品密封塑料袋(OBH Nordica Group AB，松德比贝里，瑞典)中，添加26g自来水(使最终水分为30％(w/w))、100μL稀释接种剂(先锋11B91)和酶，如表2所示。
表2.酶与接种剂孵育混合物的组合物
Figure BDA0002440225250000191
*AkAA/AcAA、TrGA/CS4和APF的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和真菌酸性蛋白酶的蛋白质重量比分别为29％、70％和1％。
通过将1g粉末状产品悬浮在1000g自来水中来制备先锋11B91接种剂并作为稀释后的接种剂充分混合。使用来自OBH Nordica的真空封口机对装有碎片化的玉米、有和没有(对照)接种剂、以及待测酶的塑料袋进行真空密封。将这些密封袋在22℃或-20℃(空白)下孵育35天。
在22℃下孵育35天后，从每个密封袋中取出5g玉米碎片样品，并将其转移到50mLFalcon离心管中，向其中添加15mL MilliQ-水。将混合物混合1分钟，然后允许静置3分钟。在15℃下通过3500rpm离心10分钟来收集上清液(可溶性营养素提取物)。然后通过Millipore steriflip 0.22μm(目录号SCGP00525)过滤上清液。测量滤液的pH(表3)。葡萄糖浓度通过HPLC定量，如图2所示。对于葡萄糖的HPLC定量，使用水作为洗脱液经15min，在柱温箱温度设置75℃下，将滤液(40μL)在Aminex HPX-87N HPLC柱(伯乐公司(Bio-Rad))上以0.6mL/min的流速注射至HPLC分析。使用串联RI(折射率)检测器检测葡萄糖峰，并根据制造商的说明使用Chromeleon软件(Dionex)对峰面积进行积分，并与0、0.025、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0mg/ml的葡萄糖标准品的峰面积进行比较。
结果列于表3中，表明用给予了布氏乳杆菌和植物乳杆菌的混合物的接种剂11B91(根据制造商)的玉米使pH从6.46(空白或起始pH)降至pH4.25(对照)。
观察到在本文所述的实验条件下，单独使用接种剂11B91可能需要多达3天的孵育来实现pH降低约2.2个pH单位。
表3.预处理的高含水玉米在35天后的水提取物的pH
空白是在-20℃储存而不是22℃孵育下35天后，没有接种剂的高含水玉米的pH。对照是在不添加酶的情况下将高含水玉米与接种剂孵育的对照。有关添加的酶的细节，参见上表2。重复次数(n)为2-5。
Figure BDA0002440225250000201
Figure BDA0002440225250000211
对照(仅接种剂)和蛋白酶加接种剂处理分别测得Ph 4.25和pH4.27。
当将淀粉水解酶处理添加到蛋白酶和接种剂组合中时，观察到pH进一步降低约0.2个pH单位(至pH 4.0左右)。
当淀粉水解酶和蛋白酶与接种剂组合使用时，观察到进一步降低0.2个pH单位。这可能是由于存在的乳杆菌可利用的营养素素的利用率增加，导致产生更多的有机酸。有机酸(称为酸化剂(acidifier或acidulant))是畜牧业重要的饲料添加剂。
图2和表4显示，对照样品(单独的接种剂)以及AFP(蛋白酶和接种剂)和LAT(α淀粉酶和接种剂)处理的样品中的葡萄糖含量均不超过每克玉米0.5mg，实际上，由于接种剂消耗了玉米中发现的游离葡萄糖，因此这三种处理中的葡萄糖水平甚至低于空白。
LAT是一种细菌性α-淀粉酶，可产生麦芽糖、麦芽糖类和葡萄糖。据信由于与乳杆菌接种剂一起孵育，导致消耗了由LAT产生的一些葡萄糖，因此葡萄糖产量较低。
如表4所示，以3-12ppm的剂量添加酸性稳定和活性α-淀粉酶AkAA、AcAA、葡糖淀粉酶TrGA、CS4、Brew1、AfuGA和FvGA可以使葡萄糖释放量范围为1-14mg/克玉米。具体而言，释放的葡萄糖范围为发酵的玉米的0.1％至1％。基于酶给予量，3种酶的混合物AcAA+CS4+AFP(α淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶加接种剂)释放出大量的葡萄糖(参见表4)。基于酶给予量，AkAA+TrGA+AFP的混合物产生的葡萄糖量次高，其次是TrGA，然后是AfuGA，最后是CS4。在测试的葡糖淀粉酶中，发现FvGA的效率较低。
本文表4中呈现的数据表明，具有淀粉结合结构域(SBD)的AkAA和AcAA的两种酸性稳定和酸性活性α-淀粉酶的效率比缺乏SBD的α-淀粉酶如LAT的效率高3-6倍。
表4.释放的葡萄糖与给予的酶蛋白之间的比率。
Figure BDA0002440225250000221

Claims (18)

1.一种改善动物用高含水谷物饲料和/或再水合谷物饲料消化率的方法，所述方法包括a)将所述谷物饲料加工成谷物饲料碎片和b)使步骤(a)的谷物饲料碎片与至少一种在pH小于5.0下稳定且有活性的淀粉水解酶和至少一种包括至少一种细菌菌株的接种剂的组合接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述淀粉水解酶具有淀粉结合结构域，其中所述淀粉水解酶能够水解生淀粉。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述淀粉水解酶选自糖苷水解酶家族13和/或15。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述淀粉水解酶选自由以下组成的组：至少一种α淀粉酶或至少一种葡糖淀粉酶。
5.如权利要求1、2或3所述的方法，其中步骤(b)还包括蛋白酶。
6.如权利要求4所述的方法，其中步骤(b)还包括蛋白酶。
7.如权利要求4或6所述的方法，其中所述蛋白酶是内肽酶。
8.如权利要求5所述的方法，其中所述蛋白酶是内肽酶。
9.如权利要求6或8所述的方法，其中所述内肽酶选自由以下组成的组：金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述内肽酶选自由以下组成的组：金属肽酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
11.如权利要求1、2或3的权利要求所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
12.如权利要求4的权利要求所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
13.如权利要求5的权利要求所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
14.如权利要求6、或8或10的权利要求所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
15.如权利要求7的权利要求所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
16.如权利要求9的权利要求所述的方法，其中所述至少一种接种剂包括至少一种乳杆菌菌株。
17.如权利要求1所述的方法，其中谷物饲料选自由以下组成的组：玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、高粱、高粱青贮饲料、油籽或其组合。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述动物是反刍动物。
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