KR20020087571A - 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물 KCTC 0268BP가 생산하는 단백질 분해효소를 포함하는 고효율의 사료첨가용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 사료첨가용 조성물은 단백질을 가수분해시키고 펩타이드의 아미노산을 증가시킴으로써 동물의 소화기능 및 흡수율을 증진시킬 뿐만 아니라 사료에 포함되어 있는 유효 효소와의 상승 효과를 가지므로 동물 성장에 효과적이다.

Description

단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물{Compositions for forage additive comprising protease}
본 발명은 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 미생물 KCTC 0268BP가 생산하는 단백질 분해효소를 포함하는 고효율의 사료첨가용 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
가축 및 이들이 생산해내는 생산품은 인류가 생존하기 위해 필요한 단백질의 중요한 공급원으로서 가축의 사육 및 이용의 발전은 인류의 건강과 생활의 질을 향상시키는데 있어 밀접한 관계를 가진다. 가축을 사육하기 위한 사료는 현재 많은 부분에서 곡물이 사용되고 있는데, 최근 인구가 급격하게 증가함으로써 식량으로의 곡물의 수요가 증대되어 곡물을 사료의 원료로서 이용하기는 점점 어렵게 되었고 이러한 곡물 사료의 부족이 가축 사육의 발전에 제약이 되고 있다. 이에 사료 산업계에서는 곡물을 대체할 수 있는 사료의 개발 및 이용되는 사료의 효율을 극대화시키기 위한 많은 노력을 기울였으며, 동물의 소화기능 및 흡수율을 증진시킬 수 있는 사료첨가용 조성물의 개발이 사료산업에서 중요한 위치를 차지하게 되었다. 사료첨가용 조성물의 개발은 가축의 비육과 소화를 촉진시킴으로써 사료의 효율을 극대화시켜 사료사용량을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 빠른 증식과 비육으로 인해 고품질의 가축 생산을 가능하게 하여 농가의 소득 수준 향상에 기여할 수 있다는 점에서 그 중요성이 매우 크다고 할 수 있다.
전통적으로 돼지 및 가금을 위한 동물 사료로는 주로 대두박, 참깨, 맥류, 볏짚 및 옥수수 등이 사용되어 왔으며, 최근에는 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 대체 제품의 사용이 크게 증가되고 있다. 그러나, 상기 사료들은 고형분의 단백질을 다량으로 포함하고 있어서 가축이 소화시키기에는 어려움이 있으며, 특히 이들 중 대두박은 다량의 단백질을 포함하고 영양이 풍부하여 배합사료로 많이 사용되고 있으나 자연 그대로 이용하는 경우에는 돼지와 닭같은 소화시간이 짧은 가축의 장내에서는 효율적으로 분해되지 못하므로, 대두박을 사료로 공급할 경우에는 가축이 충분히 소화할 수 있도록 고형분 단백질을 분해시켜 공급하는 것이 필요하다.
단백질 분해효소(protease)는 사료의 성분에 포함되어 있는 단백질을 분해함으로써 사료 성분의 소화율을 강화시켜 사료 이용의 효율을 증가시킬 수 있는 효소인데, 이러한 단백질 분해효소에 의해 가수분해된 펩타이드 내 아미노산은 유리 아미노산에 비해 소장내 흡수부위에서의 경쟁이 낮기 때문에 시간당 흡수량 및 흡수효율이 높으며, 가수분해된 펩타이드내의 필수 및 비필수 아미노산의 혈액 내로의 흡수는 유리 아미노산에 비해 균일하게 일어난다. 가수분해된 펩타이드 내의 아미노산의 초기 흡수속도는 유리 아미노산에 비해 빠르기 때문에 체내 대사조절의 중요 호르몬인 인슐린(insulin) 및 글루카곤(glucagon)의 활성화를 촉진시키며, 또한 높은 분자량의 단백질로 인한 가축의 알러지 현상(allergenic symptoms)을 해결할 수 있다. 또한, 옥수수, 밀, 보리 등의 곡물에는 파이타제(phytase), 아밀라제(amylase), 포스파타제(phosphatase), 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 말타제(maltase) 및 전환 효소(invertase) 등과 같은 여러 종류의 당 생성 효소가 존재한다는 것이 밝혀졌는데, 곡물에 단백질 분해효소를 첨가하면 곡물에서 생성되는 자체 당 생성 효소와 첨가해주는 단백질 분해효소의 상승작용(synergism)으로 인해 고효율의 사료를 만들 수 있음이 알려져 있다(Hauakawa et al.Agric. Biol. Chem. 1898, 53(6), 1475-1483; Lei et al.J. Anim. Sci. 1993, 3359-3367 ; N. R. Reddy et al.Advance in Food Research,1982, 28).
이러한 단백질 분해작용을 하는 단백질 분해효소는 단백질 또는 펩타이드(peptide)에서 펩타이드결합(peptide bond)의 가수분해를 촉매하는 효소로서 모든 생명체 내에서 존재하며 다양한 생리학적인 기능을 수행하는 효소이다. 미생물에 의해 생산되는 단백질 분해효소는 대부분이 세포외로 분비되며 여러 종류의 탄소원과 질소원에 의해서 활성이 민감하게 조절되고, 온도, 최적 pH, 활성부위 잔기 등의 특성에 따라 다양하게 구분되며 그에 따른 산업적 용도도 달라지는데 온도에 의해서는 내열성, 중온성 및 고온성으로, 효소의 최적 pH에 의해서는 산성, 약산성, 중성 및 염기성으로, 활성부위의 잔기에 의해서는 세린 단백질분해효소(serine protease), 시스테인 단백질 분해효소(cysteine protease), 아스파르테이트 단백질 분해효소(aspartate protease) 및 금속성 단백질 분해효소(metalloprotease)로 구분된다.
본 발명자들은 새로운 단백질 분해효소를 개발하고자 노력한 결과, 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 균주(KCTC 0268BP)에서 신규한 단백질 분해효소를 분리하였으며 상기 단백질 분해효소가 저온과 높은 염 농도에서 안정된 단백질 분해 활성을 나타내고 넓은 pH 범위에서도 안정된 활성을 나타내는 것을 발견하고 그 단백질 분해효소의 유전자를 확인하여 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2000-5479호).
이에, 본 발명자들은 상기 단백질 분해효소를 생산하는 미생물 또는 상기 미생물이 생산하는 단백질 분해효소를 포함하는 동물 사료첨가용 조성물을 제조하였으며, 상기 사료첨가용 조성물이 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료에 존재하는 고형 단백질을 분해하여 가축의 소화율 및 동물 성장의 효과를 높여줄 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus)HY-3 균주(KCTC 0268BP) 및 상기 균주가 생산하는 단백질 분해효소를 사료첨가제로 사용하는 것이다.
도 1은 단백질 분해효소에 의한 대두박의 분해 양상을 나타낸 사진이고,
A ; 대조군(no treatment),
B ; 단백질 분해효소 첨가군
도 2는 단백질 분해효소에 의해 분해된 대두박을 시간별로 나타낸 전기영동 사진이고,
M ; 표준단백질(marker), 1 ; 대조군, 0시간,
2 ; 대조군, 12시간, 3 ; 대조군, 24시간,
4 ; 단백질 분해효소 첨가, 3시간, 5 ; 단백질 분해효소 첨가, 6시간,
6 ; 단백질 분해효소 첨가, 12시간
도 3은 단백질 분해효소에 의해 분해된 전지 대두를 시간별로 나타낸 전기영동 사진이다.
M ; 표준단백질, 1 ; 대조군, 0시간,
2 ; 대조군, 12시간, 3 ; 대조군, 24시간,
4 ; 단백질 분해효소 첨가, 3시간, 5 ; 단백질 분해효소 첨가, 6시간,
6 ; 단백질 분해효소 첨가, 12시간
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP) 및 상기 균주가 생산하는 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주(KCTC 0268BP) 및 상기 균주가 생산하는 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 단백질 분해효소를 생산하는 미생물로서 한국생명공학연구원 유전자은행에 1996년 7월 29일자로 기탁된 수탁번호 KCTC 0268BP호의 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3을 사용한다. 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 거미 장내에서 분리한 호기성의 그람 음성 세균으로서, 0.5 - 0.8 ㎜ 크기의 구형이고 운동성을 가지고 있으며 카탈라아제 (catalase)에는 양성 반응을 옥시다아제 (oxidase)에는 음성반응을 나타낸다(대한민국 특허출원 제2000-5479호 참조). 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 자라는 시간이 매우 빠르며, 기본적으로 질소공급원(N-source)만 있으면 잘 자라므로, 대두박 등의 사료원료에 풍부하게 포함되어있는 단백질을 질소공급원으로 사용하여 매우 왕성하게 자랄 수있다.
본 발명의 단백질 분해효소는 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주가 생산하는 효소로서,
1) 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계;
2) 상기 배양액을 여과하여 상등액을 얻는 단계; 및
3) 상등액내 포함된 상기 단백질 분해효소를 수지를 이용하여 정제하는 단계로 제조할 수 있다(대한민국 특허출원 제2000-5479호 참조).
본 발명의 단백질 분해효소는 금속이온 존재시 활성의 증가를 나타내는 금속성 단백질 분해효소이다. 대두박 등의 사료원료에는 Ca2+, Mg2+과 같은 금속이온이 다량 함유되어 있으며, 기본적으로 대두단백같은 경우에는 3% 이상의 금속이온을 함유하고 있다. 일반적으로 산업적으로 많이 사용하고 있는 세린 단백질 분해효소 같은 경우에는 금속이온에 의해서 단백질 분해효소의 활성에 저해되어 있으므로 사료용 첨가제로서는 불리한 점이 있다. 그러나 본 발명의 단백질 분해효소는 금속이온이 있음으로 인해 단백질 활성이 증가되어 사료원료속의 단백질을 보다 효과적으로 분해하게 된다. 사료 이용을 위하여 44.4℃ 이상으로 가열한 대두에서는 트립신 불활인자 (trypsin inhibitor)가 생성됨으로 인하여 트립신에 의한 대두 단백질의 분해를 방해하지만, 본 발명의 단백질 분해효소는 트립신 불활인자에 영향을 받지 않으므로 44.4℃ 이상으로 가열한 대두에서도 사용이 가능하다. 또한 대부분의 단백질 분해효소는 다른 효소의 활성을 억제시키나 본 발명의 단백질 분해효소는 당분해 효소의 활성을 증가시켜 서로 상승작용을 일으키는 장점이 있다. 사료로 이용되는 어분 또는 어분단백은 250 내지 350 mM의 염분을 포함하고 있어 대부분의 단백질 분해효소는 효소의 활성을 보일 수가 없다. 그러나, 본 발명의 단백질 분해효소는 높은 염분농도에서도 단백질 분해 활성을 보임으로서 어분 및 어분단백을 이용한 고기능성의 사료첨가제 제조를 가능하게 한다. 또한 저온과 및 넓은 pH 범위에서 안정된 활성을 나타내므로 각종 사료에 첨가시 안정적으로 사료에 존재하는 단백질을 분해할 수 있다.
아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주가 생산하는,서열번호 1로 기재되는 본 발명의 단백질 분해효소의 아미노산 서열을 기존에 알려진 금속성 단백질 분해효소의 아미노산 서열과 비교하여 보면 Zn2+결합 부위와 효소활성 부위의 아미노산 서열이 잘 보존되어 있으며, 또한 세라티아 마르센스 SM6에서 알려진 금속성 단백질 분해효소의 아미노산 서열과 92.6%의 높은 상동성을 보인다. 따라서, 본 발명의 단백질 분해효소는 활성을 위해 Zn2+을 필요로 하는 금속성 단백질 분해효소이며, SDS-PAGE를 수행한 결과 51.5 kDa의 분자량을 갖는 단일체의 밴드 경향을 나타낸다.
상기 단백질 분해효소의 저해제에 대한 영향을 알아본 결과, 금속성 단백질 분해효소의 저해제인 EDTA와 페난트롤린(phenanthroline)에 의해 활성이 저해되었으며, 또한 37℃에서 최대의 활성이 나타내고 약 20℃ ~ 40℃에서 75% 이상의 상대적인 활성이 나타낸다. 또한, 상기 효소는 pH 8.0에서 최대의 활성이 나타났으며 pH 7.0 ~ pH 9.5에서 80% 이상의 상대적인 활성이 나타낸다(대한민국 특허출원 제2000-5479호 참조).
본 발명의 동물 사료첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 다른 효소제제를 첨가할 수 있다. 첨가되는 효소제제는 건조 또는 액체 상태가 모두 가능하며 효소제제로는 리파제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 파이틱애시드(phytic acid)를 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐(glycogen) 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제(amylase), 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스(cellulose)를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일로스(xylose)를 분해하는 자일라나제(xylanase), 말토오스(maltose)를 두 분자의 글루코스(glucose)로 가수분해하는 말타제(maltase) 및 사카로스(saccharose)를 가수분해하여 글루코스-프룩토스(glucose-fructose) 혼합물을 만드는 전환효소(invertase) 등과 같은 당 생성 효소로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 생성 미생물이 첨가된 동물 사료첨가용 조성물에 비병원성의 다른 미생물을 첨가할 수 있다. 첨가할 수있는 미생물로는 단백질 분해 효소, 지질 분해효소 및 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 고초균, 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능이 있는 락토바실러스 균주(Lactobacillussp.), 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 보여주는 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae)와 같은 사상균(Slyter, L. L.J. Animal Sci.1976, 43. 910-926) 및 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모(Jhonson, D. E et al.J. Anim. Sci.,1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al,1990, 211)로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.
각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료는 가공되지 않거나 또는 가공된 것을 사용한다. 가공과정은 사료원료가 충진된 상태에서 가압 하에 일정한 배출구로 압축되는 공정으로 단백질의 경우에는 변성이 되어 이용성이 증가되는 압출 성형(extrusion)을 제공한다. 압출 성형(extrusion)은 열처리 과정을 통해 단백질을 변성시키고 항효소인자를 파괴시키며, 단백질 분해효소의 활성을 분자적 구조변화에 의한 새로운 부위로의 효소적 노출에 의해 증가시키는 등의 장점을 갖는다. 또한 대두 단백질과 같은 경우에는 압출 성형을 통해서 단백질의 소화율을 향상시키고 대두에 존재하는 단백질 분해효소의 저해재 중의 하나인 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 항 영양인자들을 불활성화시키며 단백질 분해효소에 의한 소화율 향상을 증가시켜 대두 단백의 영양적 가치를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 동물 사료첨가용 조성물은 단백질 분해효소의 분해에 의해서 목적으로 하지 않는 부산물을 극히 소량 함유하며 하나 이상의 아미노산을 고농도로 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소를 생산하는 미생물의 발효에 의한 동물 사료첨가용 조성물에는 분자량 30,000 달톤(dalton) 이하를 55% 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 동물 사료첨가용 조성물에는 단백질 분해효소에 의해 가수분해된 아미노산 이외에도 단백질 분해효소를 생산하는 미생물의 일부분 및 기계적으로 분리시킬 수 있는 생성물 또는 발효액을 우세한 함량비로 함유할 수 있다.
본 발명자들은 바람직한 실험예로서, 본 발명의 단백질 분해효소에 의한 대두박의 가수분해 양상을 확인한 결과, 단백질 분해효소를 첨가하지 않은 대조군에서는 일반 고형분이 그대로 존재하는 반면에 단백질 분해효소를 첨가한 대두박에서는 대부분의 고형분이 분해되는 양상을 보였다(도 1참조).
또한, 본 발명자들은 압출 성형(extrusion)을 거친 대두박과 전지 대두에 본 발명의 단백질 분해효소를 첨가한 후, 전기영동을 수행하여 가수분해된 단백질의 경향 및 밴드 경향을 확인하였다.
그 결과, 대두박의 경우 대조군에서는 24시간 동안 반응시킨 후의 시료가 반응 전의 시료와 비교될만한 다른 양상을 보이지 않았으나, 단백질 분해효소를 첨가하여 반응시킨 시료에서는 3시간 이후부터 가수분해되는 양상을 확인하였으며 대조군에서는 단백질 분해효소를 첨가한 대두박의 경우에는 20 kDa 주위에 대량의 단백질과 10 kDa에서 단백질을 확인하였다(도 2참조). 전지 대두의 경우, 대조군에서는 단백질이 전 분자량에 넓게 분포되어 있는 반면에 단백질 분해효소를 첨가하여 반응시킨 경우에는 30 kDa, 15 kDa 및 10 kDa 이하 크기의 단백질이 다량 생성되어있음을 확인하였다(도 3참조).
또한, 본 발명자들은 상기에서 전기영동으로 획득한 대두박 단백질의 분포도를 분석기(Bio-profil analysis)를 사용하여 조사하였다. 먼저, 대두박의 대조군 및 단백질 분해효소 처리군에서 확인된 단백질의 분자량의 분포를 알아보기 위하여 식별 가능한 단백질 밴드를 선택하였다. 선택된 단백질 밴드는 미리 확인된 분자량 마커와 비교하여 상대적인 이동도를 계산함으로써 분자량을 결정하였다.
그 결과, 전체 단백질 중 30 kDa 이하로 확인된 단백질은 대조군에서는 24시간 동안 45%의 분해율을 보인 반면 단백질 분해효소를 처리한 대두박에서는 12시간 동안 63%의 높은 분해율을 보였다. 또한, 분자량 30 kDa 이하인 분해된 단백질에 대해서 반응 전 시료의 단백질 함량과 비교해 보았을 경우 24시간 동안 반응시킨 대조군에서는 1.3배의 증가를 보인 반면 단백질 분해효소를 처리한 대두박에서는 12시간 동안 반응시킨 시료에서의 단백질 함량은 3.1배의 증가율을 보였다(표 4참조).
아울러, 본 발명자들은 단백질 분해효소가 사료원료 자체에 포함되어 있는 당 생성 효소의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 본 발명의 단백질 분해효소를 대두박 및 전지 대두에 첨가한 후 반응시켰고, 반응 중 시간 별로 시료를 획득하고 획득한 시료에 대해서는 DNS 방법(Dinitrosalicylic acid, Miller, G. L, et al,Anal. Biochem,1960, 127-132)을 이용하여 잔존 환원당을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 곡물에 존재하는 파이타제(phytase), 아밀라제(amylase), 포스파타제(phosphatase), 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 말타제(maltase) 및 전환효소(invertase) 등과 같은 여러 종류의 당 생성 효소의 활성에 상승작용(synergism)을 일으켜 잔존 환원당의 양을 증가시킴을 확인하였다(표 5참조).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 ∼ 실시예 6> 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물의 제조
<단계 1> 단백질 분해효소의 제조
본 발명의 단백질 분해효소를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 하기표 1과 같은 조성의 배양 배지를 121℃에서 20분 동안 가압 멸균시킨 후, 단백질 분해효소를 생산하는 미생물 KCTC 0268BP를 전체 부피의 0.1 내지 5%로 첨가하여 25℃에서 20 내지 25시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 막여과(membrane filtration) 과정을 통해 균체와 상등액으로 분리한 후, 브라운 및 쉬미츠의 방법(Braun, V. & Schmitz, G.,Arch. Microbiol.1980, 124, 55-61)에 따라 단백질 분해효소의 활성을 측정함으로써 상등액의 단백질 분해효소의 양을 확인하였다. 구체적으로, 아조카제인(azocasein) 0.24 g을 50 mM 인산 완충 용액(Phosphate buffer, pH 7.5) 10 ㎖에 녹여 기질 용액을 제조하고, 기질 용액 300 ㎕와 세포 배양액 100 ㎕를 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 반응액에 10% 삼염화 초산(trichloride acetate) 300 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 7000 rpm으로 원심분리한 후, 펠렛(pellet)과 상등액을 분리하였고, 상등액 300 ㎕에 10% 수산화나트륨 30 ㎕를 첨가하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 역가는 흡광도 수치가 1.0 증가할 때를 1 유니트(unit)로 정의하였다.
단백질 분해효소 생성 미생물 배지 조성
배지조성 g/ L
소이빈 밀(Soybean meal) 3
효모 추출물(yeast extract) 5
NaCl 5
KH2PO4 5
CaCl2 1
MnSO4 1
글리세롤(glycerol) 10
그 결과,표 1에 의한 배양 후 단백질 분해효소의 활성은 20시간 내지 25시간 후에 32 내지 51 unit/㎖을 보였다.
<단계 2> 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물의 제조
본 발명자들은 상기 단백질 분해효소를 포함하는 본 발명의 사료첨가용 조성물을 하기표 2의 조성으로 제조하였다.
사료첨가용 조성물의 구성비율(단위 : %)
단백질분해효소 효소제제 미생물 아미노산 기타
실시예 1 100
실시예 2 90 10
실시예 3 80 10 10
실시예 4 70 10 10 8 2
실시예 5 60 15 15 8 2
실시예 6 50 20 15 10
상기표 2에서, 효소제제는 파이타제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제 및 아밀라제의 혼합제제를 사용하였고 비병원성의 미생물로는 사카로미세스 세레비지에를 사용하였다.
<실시예 7 ∼ 실시예 12> 미생물 KCTC 0268BP를 포함하는 사료첨가용 조성물의 제조
본 발명자들은 미생물 KCTC 0268BP를 포함하는 본 발명의 사료첨가용 조성물을 하기표 3의 조성으로 제조하였다.
사료첨가용 조성물의 구성비율(단위 : %)
KCTC 0268BP 효소제제 미생물 아미노산 기타
실시예 7 100
실시예 8 90 10
실시예 9 80 10 10
실시예 10 70 10 10 10
실시예 11 60 15 15 8 2
실시예 12 50 20 15 8 2
상기표 3에서, 효소제제는 파이타제, 셀룰라제, 자일라나제, 말타제 및 전환효소의 혼합제제를 사용하였고 비병원성의 미생물로는 아스퍼질러스 오리자에를 사용하였다.
<실험예 1> 대두박의 분해 양상 비교
본 발명의 단백질 분해효소에 의한 대두박의 분해 양상을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 상기 <실시예 1 ∼ 실시예 12>에서 획득한 사료첨가용 조성물을 g 당 4 유니트가 되도록 대두박에 첨가한 후, 37℃의 조건으로 항온조(water bath)에서 24시간 동안 반응시켜 대두박의 가수분해된 양상을 확인하였으며, 대표적으로 실시예 1의 사료첨가용 조성물을 사용한 경우를 하기에 나타내었다.
그 결과, 단백질 분해효소를 첨가하지 않은 대조군에서는 일반 고형분이 그대로 존재하는 반면에 실시예 1의 단백질 분해효소를 첨가한 대두박에서는 대부분의 고형분이 분해되는 양상을 보였다(도 1).
또한, 본 발명자들은 압출 성형(extrusion)을 거친 대두박과 전지 대두에 상기 <실시예 1 ∼ 실시예 12>에서 제조한 사료첨가용 조성물을 대두박 g 당 10 유니트가 되도록 첨가하였다. 첨가한 단백질 분해효소가 포함된 대두박은 37℃의 항온조(water bath)에서 배양하였고, 3, 6 및 12시간 간격으로 시료를 채취하였다. 채취한 시료에 대해서는 각각 20 ㎕를 취하여 대두박은 4 내지 20%, 전지 대두는 4 내지 15%의 밀도 겔(gradient gel)을 사용하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동을 수행하여 가수분해된 단백질의 경향 및 밴드 경향을 확인하였으며(Laemmli, U. K.Nature,1970, 680-685), 전기영동 후 겔은 코마쉬 블루(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하였다. 각각 첫 번째 라인(line)에는 분자량 측정용 표준단백질(molecular weight marker)을 사용하였으며, 사용된 단백질 분자량은 97 kDa 크기의 포스포릴라제 b(phosphorylase b), 66 kDa 크기의 우혈청알부민(BSA), 45 kDa 크기의 난알부민(ovalbumin), 31 kDa 크기의 탄산무수효소(carbonic anhydrase), 21.5 kDa 크기의 트림신 저해제(trypsin inhibitor) 및 14.4 kDa 크기의 알파-락트알부민(α-lactalbumin)을 이용하였다. 대표적으로 실시예 1의 사료첨가용 조성물을 사용한 경우를 하기에 나타내었다.
그 결과, 대두박의 경우 대조군에서는 24시간 동안 반응시킨 후의 시료가 반응 전의 시료와 비교될만한 다른 양상을 보이지 않았으나, 실시예 1의 단백질 분해효소를 첨가하여 반응시킨 시료에서는 3시간 이후부터 가수분해되는 양상을 확인하였으며 대조군에서는 단백질 분해효소를 첨가한 대두박의 경우에는 20 kDa 주위에 대량의 단백질과 10 kDa에서 단백질을 확인하였다(도 2).
<실험예 2> 단백질 전기 영동을 통한 전지 대두의 분해 양상 비교
본 발명의 단백질 분해효소에 의한 전지 대두의 분해 양상을 확인하기 위하여, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 대조군에서는 단백질이 전 분자량에 넓게 분포되어 있는 반면에 실시예 1의 단백질 분해효소를 첨가하여 반응시킨 전지 대두의 경우에는 30 kDa, 15 kDa 및 10 kDa 이하 크기의 단백질이 다량 생성되어있음을 확인하였다(도 3).
<실험예 3> 분해된 대두박의 단백질 양상 비교
상기 실험예 1의 전기영동으로 획득한 대두박 단백질의 분포도를 분석기(Bio-profil analysis)를 사용하여 조사하였다. 먼저, 대두박의 대조군 및 단백질 분해효소 처리군에서 확인된 단백질의 분자량의 분포를 알아보기 위하여 식별 가능한 단백질 밴드를 선택하였다. 선택된 단백질 밴드는 미리 확인된 분자량 마커와 비교하여 상대적인 이동도를 계산함으로써 분자량을 결정하였다. 선택된 단백질의 밴드는 약 105, 60, 40, 30, 18, 11 및 9.4 kDa의 크기로 계산되었으며,계산된 각각의 분자량에 대하여 전체 단백질의 함량을 비교하였고, 분자량 30 kDa 이하로 분해된 대두박 단백질에 대한 상대적인 분해율을 하기의표 4에 나타내었다.
분자량 30 kDa 이하의 분해된 대두박
사료첨가용 조성물 상대적인 분해율(%) 대조군 단백질 분해효소 첨가군
0 h 12 h 24 h 3 h 6 h 12 h
실시예 1 전체 단백질에 대한 비(%) 46 44 45 60 62 64
상대적인 분해율(%) 100 111 129 164 223 311
실시예 2 전체 단백질에 대한 비(%) 46 44 46 59 61 63
상대적인 분해율(%) 100 110 120 160 221 315
실시예 3 전체 단백질에 대한 비(%) 46 46 45 61 61 65
상대적인 분해율(%) 100 109 115 170 220 310
실시예 4 전체 단백질에 대한 비(%) 43 44 40 61 65 67
상대적인 분해율(%) 100 115 125 155 215 303
실시예 5 전체 단백질에 대한 비(%) 44 44 42 61 63 69
상대적인 분해율(%) 100 105 122 160 210 329
실시예 6 전체 단백질에 대한 비(%) 41 43 44 67 63 64
상대적인 분해율(%) 100 130 140 167 200 333
실시예 7 전체 단백질에 대한 비(%) 46 44 45 60 62 64
상대적인 분해율(%) 100 110 118 160 220 318
실시예 8 전체 단백질에 대한 비(%) 43 44 45 61 63 68
상대적인 분해율(%) 100 118 132 172 248 340
실시예 9 전체 단백질에 대한 비(%) 46 43 45 60 64 64
상대적인 분해율(%) 100 103 118 160 232 342
실시예 10 전체 단백질에 대한 비(%) 46 44 46 60 66 64
상대적인 분해율(%) 100 110 129 164 232 311
실시예 11 전체 단백질에 대한 비(%) 43 46 47 62 65 68
상대적인 분해율(%) 100 110 132 165 243 324
실시예 12 전체 단백질에 대한 비(%) 42 45 48 61 63 69
상대적인 분해율(%) 100 117 132 164 224 318
그 결과, 상기표 4에서 보듯이 실시예 1의 사료첨가용 조성물의 경우 전체 단백질 중 30 kDa 이하로 확인된 단백질은 대조군에서는 24시간 동안 45%의 분해율을 보인 반면 단백질 분해효소를 처리한 대두박에서는 12시간 동안 63%의 높은 분해율을 보였다. 또한, 분자량 30 kDa 이하인 분해된 단백질에 대해서 반응 전 시료의 단백질 함량과 비교해 보았을 경우 24시간 동안 반응시킨 대조군에서는 1.3배의 증가를 보인 반면 단백질 분해효소를 처리한 대두박에서는 12시간 동안 반응시킨 시료에서의 단백질 함량은 3.1배의 증가율을 보였다.
<실험예 4> 단백질 분해효소에 의한 상승 효과 측정
본 발명의 단백질 분해효소가 사료원료 자체에 포함되어 있는 당 생성 효소의 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1 ∼ 실시예 12>에서 제조한 사료첨가용 조성물을 대두박 및 전지 대두 g 당 1 유니트가 되도록 첨가한 후 37℃의 항온조에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 중 시간 별로 시료를 획득하고 획득한 시료에 대해서는 DNS 방법(Dinitrosalicylic acid, Miller, G. L, et al,Anal. Biochem,1960, 127-132)을 이용하여 잔존 환원당을 측정하였다. 잔존 환원당의 표준 곡선은 0.1% 포도당을 사용하여 작성하였고, 표준곡선의 범위에서 넘어갈 경우에는 희석하여 잔존 환원당을 측정하였으며, 대표적으로 실시예 1의 사료첨가용 제성물에 대한 결과를 하기표 5에 나타내었다.
잔존 환원당의 양
대두박(g/L) 전지 대두(g/L)
대조군 첨가군 대조군 첨가군
무반응 0.32 0.32 0.94 0.94
1 h 0.35 0.45 1.09 1.89
3 h 0.68 0.90 2.22 3.40
6 h 1.26 1.40 2.43 3.64
12 h 1.63 1.80 3.32 3.95
24 h 4.48 5.89 3.59 4.11
그 결과, 상기표 5에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시예 1의 사료첨가용 조성물은 곡물에 존재하는 파이타제(phytase), 아밀라제(amylase), 포스파타제(phosphatase), 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 말타제(maltase) 및 전환효소(invertase) 등과 같은 여러 종류의 당 생성 효소의 활성에 상승작용(synergism)을 일으켜 잔존 환원당의 양을 증가시킴을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단백질 분해효소는 금속이온 존재시 활성의 증가를 나타내는 금속성 단백질 분해효소로서 대두박 등의 사료원료에 풍부하게 존재하는 Ca2+등의 금속이온으로 인해 단백질 분해효소의 활성을 증가 시켜 보다 효과적으로 사료원료를 분해하며, 또한 당분해 효소의 활성을 증가시켜 서로 상승작용을 일으키며 저온과 높은 염농도 및 넓은 pH 범위에서 안정된 활성을 나타내므로 각종 사료에 첨가시 안정적으로 사료에 존재하는 단백질을 분해할 수 있다. 또한, 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주는 성장하는 시간이 매우 빠르며 기본적으로 질소공급원(N-source)만 으로도 높은 성장속도 및 성장률을 보이며, 대두박 등의 사료원료에 풍부하게 포함되어 있는 단백질을 질소공급원으로 사용하여 매우 왕성하게 자랄 수 있다. 따라서, 본 발명의 사료첨가용 조성물은 각종 곡물 및 대두 단백을 비롯한 땅콩, 완두콩, 사탕무우, 펄프, 곡물 부산물, 동물 내장 가루 및 어분 가루 등과 같은 사료원료에 존재하는 고형 단백질을 분해하여 가축의 소화율 및 동물 성장의 효과를 높여줄 수 있을 뿐만 아니라 사료에 포함되어 있는 유용 효소와의 상승 효과를 일으키므로 사료첨가용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 수탁번호 KCTC 0268BP의 미생물을 포함하는 사료첨가용 조성물.
  2. 제 1항의 미생물이 생산하는 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사료첨가용 조성물은 추가로 하나 또는 그 이상의 효소제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 효소제제는 리파제(lipase), 파이타제(phytase), 아밀라제(amylase), 포스파타제(phosphatase), 카르복시메틸셀룰라제(carboxymethylcellulase), 자일라나제(xylanase), 말타제(maltase) 및 전환효소(invertase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사료첨가용 조성물은 추가로 비병원성의 다른 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 균주(Lactobacillus sp.), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사료첨가용 조성물은 추가로 하나 이상의 아미노산을 고농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사료첨가용 조성물은 분자량 30,000 달톤 이하를 55% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가용 조성물.
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