CN109642223A - 包含酸性蛋白酶的饲料组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包含酸性蛋白酶的饲料组合物。

Description

包含酸性蛋白酶的饲料组合物

发明领域

本发明涉及用于饲料及其他工业应用的蛋白酶的领域。

背景

蛋白酶在不同工业的行业扮演重要的角色，包括动物饲料和护理、水果和饮料加工等(洗涤剂、皮革加工、蛋白质水解物的生产、硬表面清洁或坏死的或烧伤的组织的生物膜清洁处理以促进伤口愈合等)。

常用的蛋白酶主要是属于肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶，如胰凝乳蛋白酶家族，或枯草杆菌蛋白酶家族S8，如来自芽孢杆菌的角蛋白酶。这些酶以及这些家族的其他酶具有在中性或碱性范围内是最佳的pH值。

在某些情况下，酶作为酶原施用，由于增加了热的、水解蛋白的和工艺的稳定性，其在某些条件下是有益的。据描述，酶原到活性酶的活化是一个繁琐的过程，或者在加工条件下的活化可以是缓慢的。参见例如US 9,017,667，来自大麦的半胱氨酸内切蛋白酶(EP)的酶原以包含酸或酸性缓冲系统的酸性制剂提供，以确保在给对象口服施用发酶原时快速活化。

然而，这些酶的最佳pH或性能并不总是适合各自的应用。

因此，在工业应用过程中改善蛋白酶的可加工性是本发明的一个目标。

因此，提供具有更好性能的蛋白酶组合物是本发明的一个目标。

本发明的另一个目的是提供更适合特定应用的蛋白酶组合物。

发明简述

这些和进一步的目标是通过根据本发明的独立权利要求的方法和手段满足的。从属权利要求与具体实施方案相关。

发明的实施方案

在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所述装置的特定组成部分或所述方法的加工步骤，因为这些装置和方法可以改变。还应理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案，并不意图限制。必须注意的是，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括单数和/或复数引用，除非上下文另有明确规定。此外还应了解，如果给出的参数范围由数值划定，则该范围视为包括这些限制值。

进一步理解，本文所公开的实施方案不意味理解为彼此不相关的单独实施方案。在一个实施方案讨论的特征也意味着与本文所示的其他实施方案相连地公开。在一种情况下，如果一个具体特征在一个实施方案中未披露，但在另一个中披露，本领域技术人员将理解并不必须意味着所述特征不打算与所述其他实施方案公开。本领域技术人员将理解，本申请的主旨是也为了其他实施方案公开所述特征，但这并没有做到仅仅为了清晰和保持说明书在可管理的篇幅内的目的。

此外，本文提及的现有技术文件的内容通过引用并入本文中。这尤其是指公开标准或常规方法的现有技术文件。在这种情况下，通过引用并入的主要目的是提供充分的使公开，并避免冗长的重复。

根据本发明的一个方面，提供了一种包含来自肽酶家族S53的蛋白酶的饲料组合物。如本文所用术语“饲料组合物”涉及一种包括来自肽酶家族S53的蛋白酶的用于牲畜和伴生动物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物和/或饲料(feedstuff)。

可选地，提供了来自肽酶家族S53的蛋白酶在饲料组合物中的用途。与所述饲料组合物本身类似，该实施方案能与权利要求中所述的所有实施方案组合作为所述饲料组合物本身的从属实施方案。

发明人已经显示，来自S53家族的蛋白酶比用于饲料中最常用的蛋白酶(RonozymeProAct(，，RPA“)，DSM分销)更好的增加饲料效率。这种酶依赖于来自菌种拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)的肽酶的S1家族的丝氨酸蛋白酶，它在中性到碱性条件下具有最大活性。

与后者相比，包含来自S53家族的蛋白酶的饲料组合物尤其显示，

·食物转化率增加约89％(见下表3，“点FCR增加”3.5-＞6.6)，以及

·回肠消化性增加约84％(见下表4，“平均表观回肠消化性比对照增加％”4.3-＞7.9)这种效力的巨大提高是完全史无前例的，而且是非常令人惊异的。它强调了S53蛋白酶在饲料应用中的新用途提供了相当大的潜力。

S53指的是Sedolisin的蛋白酶家族，其为酸性蛋白酶。术语“Sedolisin”是指来自肽酶家族S53的酸性蛋白酶(MEROPS，也参见Wlodawer等，2003)。这两个术语能互换使用。Sedolisin包括酸作用内肽酶和三肽基肽酶。Sedolisin是具有酸性pH最佳条件的内肽酶，与大多数内肽酶不同，对胃蛋白酶抑制剂的抑制具有抗性(Oda等，1998)。晶体结构显示，许多胃蛋白酶抑制剂不敏感的羧基蛋白酶要么是G1家族中的谷氨酰胺肽酶，要么是家族S53中的Sedolisin，两组均与由胃蛋白酶抑制剂抑制的AA族天冬氨酸肽酶无关。

Sedolisin的活化涉及在低pH 3.5下自催化切割，该切割释放一个或多个肽，以递送成熟和活化形式。所述自催化切割在碱性、中性和轻度酸性条件下被抑制。

Sedolisin包含带有Glu、Asp和Ser(E295、D299和S502，以在比对中编号)的催化三联体，并且在氧阴离子穴中有一个额外的Asp(D385)。所述Ser残基是枯草杆菌蛋白酶的催化三联体Asp、His、Ser三联体中Ser的亲核等价物，并且所述三联体的所述Glu是枯草杆菌蛋白酶中His广义碱的替代物。朝向广义碱侧链的残基在家族之间是完全不同的，然而，在家族S53中是Asp299(序列中紧跟Glu295)，而在枯草杆菌蛋白酶序列中是位于His之前的Asp137。所述氧阴离子穴的Asp385与枯草杆菌蛋白酶中的Asn259相对应。概述参见下表：

Sedolisin的蛋白质折叠与枯草杆菌蛋白酶的蛋白质折叠明显相关，并且这两类蛋白有时被称为丝氨酸蛋白酶。然而，丝氨酸羧基肽酶具有额外的环，并且其氨基酸序列与枯草杆菌蛋白酶不密切相关。综合十分不同的活性位点残基以及导致的用于最大活性的较低pH值，证明了分类在分开的蛋白酶家族中是合理的。

根据本发明的一个实施方案，所述S53蛋白酶是选自由以下组成的下表的至少一种：

类别	MEROPS ID
		Sedolisin	S53.001
Sedolisin-B	S53.002
		Kumamolisin	S53.004
Kumamolisin-B	S53.005
		Aorsin	S53.007
Kumamolisin-AS(又称Kumamolisin 1)	S53.009
		Kumamolisin-AC	S53.009
Grifolisin	S53.010
		Scytalidolisin	S53.011

在具体实施方案中，所述S53蛋白酶是从由Kumamolisin-AS(又称Kumamolisinl)、Kumamolisin-AC和/或Grifolisin组成的组中选择的至少一种。

根据本发明的一个实施方案，所述组合物进一步包含植酸酶，如对磷酸肌醇具有活性的酸性或中性活性磷酸酶。这类植酸酶的实例在EC类3.1.3.8或3.1.3.26或3.1.3.72中。

植酸酶(肌型肌醇己糖磷酸磷酸水解酶)是一种磷酸酶，其催化植酸(肌型肌醇己糖磷酸(IP6))(所述植酸是谷物和油料种子中发现的有机形式的磷)，或其较低磷酸化的部分去磷酸化产物(肌醇五磷酸到一磷酸的水解(IP5、IP4、IP3、IP2、IP))的水解，释放可用形式的无机磷。植酸酶已被发现存在于动物、植物、真菌和细菌中。

还不知道蛋白酶对从植酸/盐或磷酸化蛋白的磷酸/盐释放有直接影响，并且也不能从这些酶的性质和催化机制中预测，可能存在基于蛋白植酸/盐复合物的水解的间接影响。

Selle等人的出版物(2000)整理了有关植酸/盐-蛋白复合物的信息，并讨论了对蛋白质消化性的植酸酶的作用以及植酸酶相关积极作用。在胃的酸性条件下，在蛋白质的等电点下形成二元蛋白-植酸/盐复合物，而在中性pH下形成植酸/盐、金属离子和蛋白的三元复合物(Cosgrove 1966，Anderson 1985)。已经在体外在酸性pH下证实了对几种蛋白的二元蛋白-植酸/盐复合物，所述几种蛋白例如大豆球蛋白(大豆中的主要蛋白质)(Okubo等.1976)。对于大豆球蛋白，最大的至二元复合物的蛋白络合已在pH 2-3记述，取决于植酸/盐与蛋白的比率。Rajendran&Prakash(1993)描述了在蛋白质与植酸/盐的初始结合之后与蛋白的构象变化相关的进行式蛋白-蛋白聚集。由于一些体外研究描述了在酸条件下植酸/盐存在下消化性水解的减少，这种聚集物可能难以被蛋白质水解(Camus&Laporte，1976)。最初的描述被一些研究扩展，这些研究一致表明植物储存和动物蛋白的消化活性降低(Kanaya等.1976；Inagawa等.1987；Knuckles等.1989，Vaintraub&Bulmaga 1991)。

从这些观察中衍生出工作假设，即二元蛋白-植酸/盐复合物的形成是众所周知的植酸/盐的抗营养作用的一个重要方面。除了从植酸/盐释放膳食磷酸/盐的效果之外，目前植酸/盐的抗营养作用只能通过补充微生物植酸酶活性的手段来解决。植酸酶的蛋白质效应很可能与蛋白-植酸/盐复合物有关，通过将植酸/盐水解至较低肌醇磷酸/盐，使其具有形成这种复合物的能力。也可能是剂量推荐的新的传播解读，植酸酶的超剂量通过快速水解植酸/盐并干扰这些复合物的积累而发挥其作用。进一步描述了相比蛋白质修饰的复合物中的植酸/盐(Konishi等人1999年，Bohn等人2007)，植酸酶将更好地水解可溶性植酸/盐(Lonnerdal等人1989)。

通过能在这种复合物中、或者在这些复合物形成之前(并行于植酸酶活化或者在植酸酶活化之前)水解蛋白的蛋白酶作用，从这种二元复合物(其中植酸盐和蛋白均更难以水解)中释放蛋白质和植酸/盐确实与植酸酶一起具有潜在的有益效果。从这些观察，有高度的可能能够在二元复合物中或在这些复合物形成之前水解蛋白的酸性蛋白酶与内源性或添加的磷酸酶组合将对粗蛋白和磷酸盐的消化性产生有益效果。另外，选择酸性酶并不显而易见，因为由于在胃肠道的中性部位的保留时间长4倍使得酸性蛋白酶确实没有时间水解蛋白质、热稳定性大多更低、经济可生产性的实例以及使这种酶性能更好的基因工程实例较少。

同样，发明人已经显示，来自S53家族的蛋白酶当与植酸酶组合使用时，比用于饲料中最常用的蛋白酶Ronozyme ProAct(“RPA”)更好得多地提高饲料效率。

与RPA和植酸酶的组合相比，包含来自S53家族的酸性蛋白酶和植酸酶的饲料组合物尤其显示：

·食品转化率增加约34％(见下表5，“点FCR增加”13.9-＞18.6)，以及

·磷的消化性增加约117％(见下表6，“在Quantum Blue(Quantum Blue)上磷的消化性％增加”2.3-＞5.0)

根据本发明的另一个方面，提供饲料组合物，其包含来自S53家族或G1家族的酸性蛋白酶，及植酸酶，例如对磷酸肌醇具有活性的酸性或中性活性磷酸酶。这类植酸酶的实例在EC类3.1.3.8或3.1.3.26或3.1.3.72中。

来自S53家族和G1家族的酸性蛋白酶形成了一组以前称为“胃蛋白酶抑制剂不敏感的羧基肽酶”。最初，五肽胃蛋白酶抑制剂很快被认作是在酸性pH具有活性的很广泛的内切肽酶抑制剂。后来，发现几种酸作用内切肽酶(即来自S53家族和G1家族)，对胃蛋白酶抑制剂有抵抗力。因此，两个家族都有特定的结构和/或功能关系。

本文使用的术语“酸性蛋白酶”是指在酸性条件(pH 2.0-5.0)中表现其最大活性和稳定性的蛋白酶。相比之下，用于饲料中的最常用的蛋白酶之一是由DSM制造的RonozymeProAct(“RPA”)。这种酶依赖于来自菌种拟诺卡氏菌的丝氨酸蛋白酶，其在中性到碱性条件下具有最大的活性。

通常，酸性蛋白酶是自催化活化的，例如通过从酶原(zymogen)切割一个或多个肽原，从而递送成熟的活性酶。所述自催化切割通常在酸性条件下发生，例如通过酸水解相应的肽键。在非酸性条件下，所述切割被抑制，从而使前酶(proenzyme)保持在其非活性形式。因此，仅仅通过调节pH值至所需值能控制活化。

酸性蛋白酶尚未在工业用途中建立。在动物饲料的应用中，主要使用中性到碱性蛋白酶，因为在小肠中碱性环境占主导地位，在此蛋白酶变得有活性。为了绕过胃(通常具有酸性条件)，这种碱性蛋白酶通常以颗粒提供，所述颗粒在胃通过中存留并在小肠中溶解，从而保护包裹在其中的碱性蛋白酶不变性。

除了如上讨论的Sedolisin外，这种酸性蛋白酶还能来自肽酶家族G1(MEROPSAccession MER001320)。

所述酶主要是以在酸性pH下自催化活化的非活性前酶从细胞分泌的。在碱性、中性和弱酸性条件下，所述自催化切割被抑制。活性位点残基为Q107和E190。进一步解释了Glu136是主要催化残基。最有可能的机制被认为是通过水分子的亲核攻击，所述水分子在易切断的肽键碳原子的Si面上被Glu136侧链活化而形成四面体中间体。通过Gln53的侧链酰胺提供亲电协助和氧阴离子稳定。

在一个实施方案中，来自所述肽酶家族G1的所述酸性蛋白酶是选自由以下组成的列表的至少一种：

在此背景下，重要的是了解用于工业用途的植酸酶(例如来自EC类3.1.3.8或3.1.3.26或3.1.3.72)在酸性或较不常有的中性范围具有其活性。这是因为植酸盐在碱性到中性的范围内不溶。

该理论，尽管不受其约束，但可以解释为什么酸性蛋白酶(即K1)与植酸酶的组合会递送协同效应，所述协同效应超过了相同植酸酶与碱性蛋白酶Ronozyme ProAct(，，RPA“)组合所产生的效果。

要么已经在具有相应pH的饲料原料中，要么在存在酸性条件的动物内脏的部分中，两者都能同时变得有活性。因此，酸性蛋白酶能通过消化二元蛋白-植酸/盐复合物来支持植酸酶介导的磷释放，从而使复合的植酸/盐容易用于同时作用的植酸酶(见上文)。

再次参见图12-13和表5-6，与Ronozyme Proct与植酸酶的组合相比，S53蛋白酶与植酸酶之间的所述协同活性的实验数据。同样的协同作用适用于来自G1家族的酸性蛋白酶(如曲霉胃蛋白酶II)与植酸酶的结合。

根据本发明的一个实施方案，所述饲料组合物具有pH≥5。令人惊讶的是，发明人发现在其中酸性蛋白酶被保持在pH≥5的组合物不会影响所述蛋白酶的活性。

优选地，所述组合物的pH在以下值：≥5.1、≥5.2、≥5.3、≥5.4、≥5.5、≥5.6、≥5.7、≥5.8、≥5.9、≥6、≥6.1、≥6.2、≥6.3、≥6.4、≥6.5、≥6.6、≥6.7、≥6.8、≥6.9、≥7、≥7.1、≥7.2、≥7.3、≥7.4、≥7.5、≥7.6、≥7.7、≥7.8、≥7.9或≥8。

更优选地，所述组合物的pH在以下值：≥5.5、≥6、≥6.5或≥7。

甚至更优选地，所述组合物的pH在≥7的值。

酶在产生、储存和实际应用条件下的稳定性，对于在制药、食品、饲料及其他工业或商业应用中经济地开发其催化性质至关重要。蛋白酶又称为肽酶，通过水解靶蛋白的肽键来支持蛋白质的水解。蛋白酶能在组合物中水解自身或其他蛋白质，包括其他酶。在自然界中，蛋白酶被肽延伸(通常称为肽原)所抑制。这些肽原以非活性的酶原(即包含活性酶核心和肽原延伸的未加工的蛋白酶)控制蛋白酶的活性。这种所谓的自抑制的模式因不同的蛋白酶组而不同。

令人惊讶的是，发明者发现了一种包含酸性蛋白酶的组合物保持在上述pH(即在接近中性、中性或碱性的条件下)，不会显著影响蛋白酶本身。然而，与此同时，所述蛋白酶受到自催化活化的保护，因此避免组合物中其他酶的降解(如果存在)以及还有自催化降解。此外，发明人惊奇地发现，即使在所述接近中性、中性或碱性条件下的长期储存条件下，所述酸性蛋白酶仍然能被活化，例如通过在酸性环境中自催化切割肽原。因此，即使在不利于酸性蛋白酶的条件下长期储存后，它们的自活化能力仍然不受影响。

重要的是了解用于动物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物或饲料优选在酸性条件下储存或以这种方式配制，以避免包括细菌和真菌的微生物的生长。

根据本发明构思所述组合物时，发明者推翻了该教导并且惊奇地发现，如上所讨论的，非酸性组合物通过避免组合物中其他酶(如果存在)的降解以及还有自催化降解而具有有益的效果。然而此外，发明者发现微生物的生长也能被牵制。

优先地，所述饲料添加剂、成分、补充物或饲料是用于选自单胃物种诸如家禽、猪、鱼、伴生动物和水产养殖的至少一种。

在一个实施方案中，所述酸性蛋白酶由同源或异源蛋白表达产生。

在进一步的实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种以适于将所述组合物的pH保持在≥5的值的浓度存在的试剂或缓冲液。

建立这种pH的合适试剂或缓冲剂尤其是：

a)生理上可接受的有机酸/盐，诸如柠檬酸/柠檬酸盐、乳酸/乳酸盐、苹果酸/苹果酸盐、富马酸/富马酸盐、乙酸/乙酸盐、甘氨酸，

b)生理上可接受的无机酸/盐，诸如磷酸/磷酸盐(如磷酸钠或磷酸钾)、HCl/氯盐(如氯化钙)。

在另一个实施方案中，所述pH≥5是通过蛋白质表达本身或通过培养条件或发酵条件引起的。该实施方案包括例如，其中pH≥5的组合物是通过以宿主发酵引起的，所述宿主由自身建立所述范围内的pH条件。这尤其应用于芽孢杆菌(Bacillus)菌株，其在发酵过程中建立如7.5-8的pH，或其他细菌宿主，诸如链霉菌属(Streptomyces sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)或大肠杆菌。

然而，通过蛋白质表达本身或通过培养条件或发酵条件来建立pH，也能取决于蛋白质表达过程中使用的能量来源类型。如果能量来源大部分基于蛋白质，碱性反应产物将把pH驱动到＞5的范围内。通常，在发酵过程中，产生的pH也能通过适当的校正介质进行调整或控制。

在此背景下，重要的是提到迄今为止还没有描述将酸性蛋白酶用作用于牲畜和伴生动物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物和/或饲料。这可能是由于酶工业是一个相当保守的工业的事实，其实际上没留下不寻常的痕迹(例如出于安全考虑或避免官方审批程序)。综上所述，目前用于饲料应用的蛋白酶主要是属于以下的丝氨酸蛋白酶：

(i)肽酶家族S1，例如胰凝乳蛋白酶家族，或

(ii)枯草杆菌蛋白酶家族S8，例如来自芽孢杆菌的角蛋白酶

这些酶与这些家族的其他具有在中性或碱性范围中的pH最佳状态。然而，正如所讨论的，发明人已经意识到在描述的饲料应用中使用酸性蛋白酶(如丝氨酸羧基肽酶)具有显著优势。

因此，根据本发明的另一实施方案，提供了酸性蛋白酶作为以下或在以下之中的用途：用于牲畜和伴生动物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物和/或饲料。

在下文中，将描述关于所述酸性蛋白酶的优选实施方案。重要的是理解这些涉及以下的优选实施方案：(i)Sedolisin酶本身，无论包含后者的配方或组合物如何，更不用说其pH，和其在饲料应用中的用途，以及(ii)包含Sedolisin的组合物，其具有pH≥5。

在本发明的一个实施方案中，提供了所述蛋白酶在pH≥5保持非活性，优选地，在≥5.1、≥5.2、≥5.3、≥5.4、≥5.5、≥5.6、≥5.7、≥5.8、≥5.9、≥6、≥6.1、≥6.2、≥6.3、≥6.4、≥6.5、≥6.6、≥6.7、≥6.8、≥6.9、≥7、≥7.1、≥7.2、≥7.3、≥7.4、≥7.5、≥7.6、≥7.7、≥7.8、≥7.9或≥8的pH值保持非活性。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物包含至少一种另外的酶。优选地所述另外的酶选自由以下组成的组：纤维素酶(EC3.2.1.91)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、阿拉伯半乳聚糖内-β-1，4-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；甘露聚糖内-1，4-β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.78)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；磷脂酶A1(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶、β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)和/或中性或碱性活性蛋白酶。

发明人已经显示，根据本发明的制剂的保护作用也延伸到制剂中的另外的酶上，因此例如在储存期间保持其活性。

在本发明的优选的实施方案中，所述组合物或其中的一种或多种酶具有增加的稳定性和/或储存寿命。

所述组合物具有增加的稳定性，因为在所述条件下蛋白酶被保护免受自催化降解(自消化)。这又增加了储存寿命。

在所述组合物包含另外的蛋白质或甚至酶的情况下，例如在用于动物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物或饲料中可能是这种情况，这些进一步的蛋白质同样被保护免受由所述酸性蛋白酶的消化。这也又增加了储存寿命。

在优选的实施方案中，与各自野生型相比，所述酸性蛋白酶包含一个或多个氨基酸的交换、插入或缺失。

优选地，所述各自的一个或多个交换、插入或缺失为所述酸性蛋白酶提供至少一个选自以下的特征：

·增加的活性

·增加的热稳定性

·优化的底物特异性

·增加的对极端pH值的抗性

·在存在其他饲料成分下增加的抗性或优化的性能

·增加的对动物内源性酶的抗性

·优化的产生能力

·优化的活化速度

·增加的肽原的热稳定性效应，和/或

·优化的肽原核心酶相互作用。

增加的热稳定性是一个特别重要的特征，因为它使酶适合包含在经过热处理的预混料和颗粒饲料中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种活化根据任一上述权利要求的组合物的方法，该方法包括将所述组合物的pH降低到≤5或更小的值。

在一个实施方案中，pH的降低至少部分地可以通过以下实现

·添加合适的试剂或缓冲液至所述组合物，

·添加所述组合物至另一种具有更加酸性pH的组合物，和/或

·允许所述组合物通过自然过程降低其pH。

所述合适的试剂或缓冲液能例如是生理上可接受的有机酸/盐，像例如柠檬酸/柠檬酸盐、乳酸/乳酸盐、苹果酸/苹果酸盐、富马酸/富马酸盐、乙酸/乙酸盐、乙酸/乙酸盐。它也能是生理上可被接受的无机酸/盐，像例如磷酸/磷酸盐(如磷酸钠或磷酸钾)、HCl/氯盐(如氯化钙)。

所述的具有更加酸性pH的组合物能例如是具有酸性pH的饲料，例如用于减少细菌、真菌等的生长。

所述自然过程尤其能涉及微生物生长，通过例如质子氨离子反向转运导致CO₂、乳酸、甲酸、乙酸、丁酸、柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸、丙酸和/或质子的增加。所有这些过程都有助于降低所述组合物的pH。

在另一个实施方案中，所述pH的降低至少部分是在动物消化道原位完成的。在本实施方案中，是所述动物的消化道的部分中的酸性pH活化其中的酸性蛋白酶，所述动物以包含所述组合物的饲料为食。

在本发明的另一方面，提供了包含根据本发明的组合物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物或饲料。饲料添加剂、成分或补充物有时也被称为“预混料”。

在一个进一步的实施方案中，所述饲料添加剂、成分、补充物或饲料原料包含至少一种选自由以下组成的组的物质：

·脂溶性维生素，

·水溶性维生素，

·微量矿物质，和/或

·乳化剂。

脂溶性维生素的例子为维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的例子为维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐(例如Ca-D-泛酸盐)、左旋肉碱、吡咯喹啉醌(PQQ)。微量矿物质的例子为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

乳化剂的例子是来自于糖脂类的那些，例如鼠李糖脂或槐糖脂，或胆固醇(如胆酸等)。

在一个进一步实施方案中，提供包含所述饲料添加剂、成分或补充物的饲料(标准膳食)，其具有在≥10和≤500g/kg之间(1-50％w/w)的粗蛋白质含量。

粗蛋白被计算为氮(N)乘以系数6.25，即粗蛋白质(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮含量通过Kjeldahl法确定(A.O.A.C，1984，Official Methods of Analysis 14th ed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)。

优选地，所述饲料(标准膳食)具有在≥50和≤300g/kg之间(5-30％w/w)的粗蛋白含量。

标准膳食中典型的粗蛋白含量如下表所示：

在这类饲料中，所述添加的蛋白酶将有助于a)提高所述饲料的消化性，以及b)提高从所述饲料的蛋白质的摄取，从而改善动物的健康和营养摄取效率。因此，动物膳食中允许包含低质量的蛋白源。所述添加的蛋白酶将进一步优化以饲料为食的有机体的胃肠道(GIT)微生物群。

在一个实施方案中，所述蛋白质在对象的上胃肠道中可消化并且在下胃肠道中可发酵。

在一个实施方案中，所述饲料以≥0.0005％到≤0.5％w/w的量包含所述蛋白酶。

根据本发明的另一方面，提供一种减少上胃肠道中的种群的方法，所述方法包括向所述对象施用根据本发明的酸性蛋白酶或组合物，其中所述细菌的种群在所述对象的上胃肠道中被减少。本发明的方法特别适用于这种应用，因为在此使用的所述酸性蛋白酶在进入肠道前水解蛋白质。在其一个实施方案中，所述细菌的种群包含产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。

根据本发明的另一方面，提供了一种改善饲料效率的方法，其包括修改标准膳食以含有更少的蛋白质，并用根据本发明的至少一种酸性蛋白酶或组合物补充所述经修改的膳食。优选地，在该方法中，所述经修改膳食含有比标准膳食少≥5％或≤20％之间的蛋白质。这种改良的膳食能通过以等效质量的粮食代替大量的蛋白质补充物来产生。标准膳食的数值在本文的其他地方给出。

根据本发明的另一方面，提供了一种通过在蛋白质表达系统中的同源或异源蛋白质表达来产生酸性蛋白酶的方法，其中所述方法应用导致至少在给定时间段内且至少在局部为5.5或更高的pH的培养条件。

在该方法的一个实施方案中，所述蛋白质表达系统周围的培养基的pH

·通过添加以适于使所述组合物的pH保持在≥5的值的浓度而存在的试剂或缓冲液而建立，和/或

·通过所述蛋白质表达本身、或通过所述培养条件或发酵条件引起。

第二实施方案包括，例如，一种组合物，其中pH≥5是通过宿主发酵引起的，所述宿主由自身建立在所述范围内的pH条件。这尤其应用于芽孢杆菌菌株、大肠杆菌、棒状杆菌属和链霉菌属，其在发酵过程中建立例如7.5-8的pH。

优选地，在所述方法中，所述蛋白表达系统是选自以下组成的组中的至少一种：

·基于酵母的蛋白表达系统

·基于丝状真菌的蛋白表达系统

·细菌蛋白表达系统。

优选地，所述基于酵母的蛋白表达系统选自酵母属(Saccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、汉逊酵母属(Hansenula sp.)和/或裂殖酵母属(Schizosaccharomycessp.)、阿氏酵母属(Arxula sp.)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)。

优选地，所述基于丝状真菌的蛋白表达系统选自木霉菌属(Trichoderma sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、柱顶孢霉属(Scytalidium sp.)、奇果菌属(Grifola sp.)和/或神经孢菌属(Neurospora sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、金孢子菌属(Chrysosporiumsp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)或毁丝霉属(Myceliophthora sp.)。优选地，所述细菌蛋白表达系统选自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、茎杆菌属(Caulobacter sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)和/或大肠杆菌。

根据本发明的另一方面，提供一种筛选或产生对给定条件具有特定稳定性或具有特定酶活性的蛋白酶的方法，该方法包括

b)以给定参数对蛋白酶文库的个体成员进行表型表征，其中至少一部分表征是在保持所述蛋白酶在其失活状态中的条件下进行的，

c)根据步骤b)中选择的结果选择所述文库的一个或多个成员，并且，可选地

d)分离所述一个或多个选择的成员。

在该方法和下列方法的优选实施方案中，所述蛋白酶是如上文所定义的酸性蛋白酶。

在一个实施方案中，步骤b)中的所述表型表征包括以下子步骤：

b1)在给定温度下进行预处理，以及

b2)蛋白酶活性的后续测量。

优选地，所述预处理涉及将所述蛋白酶在≥60℃下孵育≥10分钟。优选地，这导致选择出具有优化的(即增加的)热稳定性的基因型。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括初始步骤：

a1)提供蛋白酶文库，和/或

a2)通过诱变编码给定支架蛋白酶的一个或多个基因或cDNA来产生突变的蛋白酶文库，

该步骤在步骤b)之前。

此外，在一个实施方案中，所述方法进一步包括后续步骤e)通过合适的蛋白质表达方法产生在步骤c)中选择的并且在步骤d)中任选地分离的所述一个或多个成员。

在其一个实施方案中，在步骤b1)中，通过选自以下的至少一个步骤，使所述蛋白酶保持其失活状态

·建立或保持培养基pH≥5，

·添加模拟所述肽原并结合所述活性蛋白酶的活性位点的肽，

·添加可逆结合所述活性位点的小分子抑制剂，

·添加适体或抗体，其以足够高的热稳定性结合所述活性位点或阻断对所述活性位点的接触，

·提供由以下组成或包含以下的肽原：在各自应用的条件下不能从所述蛋白酶切割或水解的D-氨基酸。

同样，所述蛋白酶优选酸性蛋白酶，在非酸性条件下所述肽原不能从其切割或水解。

如上所讨论的，所述蛋白酶优选是酸性蛋白酶。在这种情况下，优选的选项是，所述培养基的pH优选建立在≥5.1、≥5.2、≥5.3、≥5.4、≥5.5、≥5.6、≥5.7、≥5.8、≥5.9、≥6、≥6.1、≥6.2、≥6.3、≥6.4、≥6.5、≥6.6、≥6.7、≥6.8、≥6.9、≥7、≥7.1、≥7.2、≥7.3、≥7.4、≥7.5、≥7.6、≥7.7、≥7.8、≥7.9或≥8中的任何值。

在另一个实施方案中，在培养基中进行给定温度下的预处理，所述培养基的特征为由以下组成的组的至少一个：

b1)pH≥5

b2)添加模拟所述肽原并结合所述活性蛋白酶的活性位点的肽。

b3)添加可逆结合所述活性位点的小分子抑制剂。

b4)添加适体或抗体，其以足够高的热稳定性结合所述活性位点或阻断对所述活性位点的接触，，和/或

b5)提供由以下组成或包含以下的肽原：在各自应用的条件下不能从所述蛋白酶切割或水解的D-氨基酸。

同样地，所述蛋白酶优选酸性蛋白酶，在非酸性条件下所述肽原不能从其切割或水解。

这确保了所述蛋白酶在所述预处理步骤期间是非活性的，因为所述抑制性肽原仍然与所述蛋白酶相连。因此对酶原进行所述预处理。同样，所述蛋白酶优选是上述定义的酸性蛋白酶。在这种情况下，优选的选项是在pH≥5下的预处理。

这样的话，能避免在所述预处理前或所述预处理过程中，所述蛋白酶通过自消化活化自身并降低其自身活性，从而在研究热预处理对蛋白酶活性的影响时导致错误的结果。此外，因此在随后的测量中反映了肽原对热稳定性的潜在影响。

发明人已经显示，如果用活化的蛋白酶、没有所述肽原或缺少可逆蛋白酶抑制剂(这些蛋白酶家族缺乏所述蛋白酶抑制剂)来进行所述预处理，对热稳定性的相应筛选产生非常高的频率(即70％以上)的假阳性。

根据本发明的进一步方面，提供了来自肽酶家族S53的蛋白酶在组合物中作为以下的用途：

·洗涤剂，

·水果与饮料加工，

·皮革加工，

·产生蛋白水解产物，

·硬表面清洁或生物膜清洁，

·坏死或烧伤组织的处理以促进伤口愈合，

·制药用途，

·组织工程中的加工辅助，和/或

·烘焙面团制备。

例如，在水果和饮料的加工中，在中性或碱性范围内具有pH最佳条件的常用蛋白酶面临欠佳的性能，因为要加工的底物大多是酸性的(果汁、麦芽浆、果渣、未发酵葡萄汁、麦芽汁、啤酒等)。在这里，根据本发明的组合物因包含的蛋白酶能在最佳条件下起作用而提供显著优点。

用于饲料或食品的蛋白酶在酸性消化道(GIT)(此处pH是酸性的)早期有活性时，与内源性蛋白水解酶显示协同效应。这些协同效应可能是由于蛋白质类抗菌蛋白或肽在GIT中能发挥其负作用之前被早期降解所致。这可能是单胃动物的胰腺分泌的蛋白酶和其他酶的抑制剂的降解。

已显示对于皮革加工，酸性蛋白酶水解过程(在这种情况下使用的是胃蛋白酶)，比传统使用的碱性蛋白酶更温和，即使在较低的温度下它们能更有效地作用，优化这一过程的经济性和环境效应。

所述蛋白酶的制药用途能是多方面的。它能与食物摄取有关，但也能与药物本身有关。例如，所述蛋白酶能例如用于水解人类或动物食品中不需要的有毒肽或蛋白质。这种有毒肽的一个具体例子是谷蛋白(gluten)肽，其消化蛋白水解障碍是造成口炎性腹泻(celiac sprue)或疱疹样皮炎(dermatitis herpetiformis)的原因。这些肽能通过根据本发明的蛋白酶的手段解毒。另一个例子是B-伴大豆球蛋白，它尤其包含在大豆中，并尤其引起肠道过敏(gut hypersensitivity)。

烘焙面团的制备是蛋白酶的用途的另一个有用的领域。添加到烘焙面团中的蛋白酶有助于降解其中所含的谷蛋白，从而有助于增加面团的弹性，并改善其质量。由于微生物活性(酸性面团乳酸杆菌或酵母)，烘焙面团常常具有酸性或接近中性的pH。此外，常常希望将pH保持在酸性或中性范围，以抑制降解淀粉的淀粉酶。因此，酸性蛋白酶优选应用于此类烘焙面团。根据本发明的组合物在储存期间保护所述酸性蛋白酶，并且能通过简单地将所述组合物添加到已经酸性的烘焙面团中或在将其添加到面团中之前降低其pH来实现活化。

在一个优选实施方案中，所述组合物具有pH≥5。上文讨论的考虑及优势对这些实施方案应用必要的修改。

实施例以及附图

虽然本发明已在附图和前面的说明书中阐明描述，但这些阐明和描述被视为说明性或示范性的，并不是限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。对于所公开实施方案的其他变化，本领域技术人员在实施所述发明时能通过对所述附图、所述公开和所附权利要求的研究来理解和实现。

附图简述

图1：Kumamolisin AS成熟实验结果。图1A：pH 5.5，图1B：pH 6.0，图1C：pH 7.0

K1+用已加工的肽原完全活化蛋白酶

K1-带切口的肽原的酶原

第0天至第21天 在指示的时间在如上文概述的pH储存样品。如实施例5所概述，所有样品均为第0天经热稳定性曲线检查的无切口酶原。箭头指示酶种类Z(未加工肽原的酶原形式)、N(带切口的肽原的非活性酶)和A(无肽原的完全活化酶)的表观移动性。

在高于pH 7.0孵育后，酶在很长一段时间内没有被活化。最初只有一个片段被切开，但随着时间的推移没有变化，并且任何时候没有活化。

在pH 7.0到pH 6.0之间孵育后，酶不会被活化，但酶的切开会随着时间推移进行，直到所有酶都被切开。任何时候都没有观察到活化。

在低于pH6.0孵育后，酶被切开，并随着时间的推移在15天后所有酶被活化，并且所有酶在最初的24小时内被切开。

图2：根据pH条件，曲霉谷氨酸蛋白酶的酶原和活性加工形式。酶原为～35kDa，并且活性加工形式为～30kDa。

图3：pH和储存时间对肽原介导的热稳定性的影响。

如实施例4概述，在不同的储存pH和环境温度下，测试了pH和储存时间对热稳定性的影响。图3显示了在给定的pH值下预培养后各自的热稳定性曲线。

图4：储存在不同pH的Kumamolisin AS的活化动力学。被活化的酶(存储在pH5.5，在pH5.5下时间点t15、t17和t21)显示出快速的活性开始，而在没出现活化或仅出现切开的条件下存储的酶(6.0以上的pH，另参见实施例3和4)显示3分钟活化的滞后阶段。对于切开的或未加工的酶原，没有观察到活化滞后时间的显著差异。

图5：活化和未活化的Kumamolisin AS的pH活性谱。活化的蛋白酶(例如，在酸性培养基中)显示出更宽的pH谱，在仅出现切开但没有活化的pH值处也具有活性。

图6：Kumamolisin AS对酶原(实心圈)或活化的酶(空心圈)的热稳定性。酶原的热失活曲线显示出标准的S型失活曲线，活性急剧下降(曲线能拟合为四参数逻辑)，而由于自水解和热失活的混合效应，活化的酶显示活性早期下降。选择蛋白酶变体以提高活性或活化的酶的热稳定性，导致由于这种混合效应而高频率的假阳性。从测试的61个变种中，只有4个表现出轻微增加的热稳定性，5个表现出野生型稳定性，以及52个具有降低的热稳定性。

图7-11：实验10的结果。图7显示体重增加，图8显示饲料转化率，图9显示粗蛋白的表观消化性，图10显示脂肪的表观消化性，以及图11显示磷的表观消化性。

图12 A-F：实验11的结果。A：体重增加。B：饲料转化率。C：脂肪的表观回肠消化性。D：粗蛋白的表观回肠消化性。E：钙的表观回肠消化性。F：磷的表观回肠消化性。

图13 A-F：实验12的结果。A：体重增加。B：饲料转化率。C：粗蛋白的表观回肠消化性。D：磷的表观回肠消化率。E：钙的表观回肠消化性。F：粗脂肪的表观回肠消化性。

图14：在存在/不存在BBI/KTI和/或+/-以Grifolisin水解BBI/KTI的情况下，在pH7的AAPF上的相对胰蛋白酶活性(％)。黑柱表示以Grifolisin水解BBI/KTI的代表数据，而白柱表示未经Grifolisin处理的数据。所有数据均来自重复数据的平均值。

实施例1：酶的产生

1.1.表达系统

蛋白是通过在不同的宿主系统中的异源表达的手段产生的，取决于来源有机体。表达系统为：

Kumamolisin AS作为蛋白酶家族S53的细菌酸性蛋白酶的参考，在枯草芽孢杆菌菌株(菌株枯草芽孢杆菌168的衍生物)中表达。Kumamolisin AS的密码子使用优化基因从质粒表达为酶原序列(SEQ ID NO 1)，并分泌到培养基中。

曲霉谷氨酸肽酶作为蛋白酶家族G1的酸性蛋白酶的参考，在多形汉逊酵母(菌株CBS4732的营养缺陷型衍生物)中表达。密码子使用优化的基因(SEQ ID NO 4)表达并作为来自具有所述基因的稳定基因整合的菌株的酶原分泌到培养基中。

1.2.发酵与制备

Kumamolisin AS(K1)：以具有密码子优化的基因的质粒在组成型启动子的控制下转化的枯草芽孢杆菌，培养于1L锥形烧瓶中，所述锥形烧瓶含有补充有20μg ml^-1新霉素的200mlTB培养基(12g L^-1胰蛋白胨、24g L^-1酵母提取物、1％(w/v)葡萄糖、80mM磷酸钾，pH7.2)。培养物从预培养物中接种至OD为0.05，所述预培养物在37℃在旋转摇床(150rpm)上，在补充有20μg ml^-1新霉素的2xLuria Bertani培养基(20g L^-1蛋白胨、10g L^-1酵母提取物、5g L^-1Nacl，pH7,5)中孵育。在pH7.5，以200mTris/HCl来缓冲培养基。

将表达培养物在37℃在旋转摇床上以150rpm培养40h。

曲霉谷氨酸蛋白酶(A2)：在诱导启动子的控制下，具有密码优化的基因的稳定基因组整合的多形汉逊酵母菌株，在pH6.0在2％(w/v)葡萄糖和1％(w/v)的YNB合成培养基中发酵。

将在30℃在旋转摇床上以130rpm在1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)蛋白胨2％(w/v)葡萄糖中运行20h的预培养，接种到发酵罐至OD为1。发酵在30℃的培养温度下持续65h。从葡萄糖到甘油的歧化现象开始后，以1，5-6g L^-1h^-1向培养加入75％甘油(w/v)，耦合氧饱和度作为设定值。进一步设定点，空气流速2.5L min^-1，搅拌器转速500-1500rpm，与氧饱和度耦合。用于pH和泡沫控制的校正溶液为33％磷酸(H₃PO₄)、12,5％氢氧化氨(NH₄OH)和抗泡沫J6173。

1.3.粗制备

通过离心(17000转/分，20分钟，4℃)从发酵粗培养液中分离细胞。从沉淀物中倒出上清液，并通过0.45μm的PES膜过滤，以去除残留的宿主细胞。

将无细胞粗发酵上清液于横流膜装置(Vivaflow 200，Hydrosart membrane，10.000Da cutoff)进一步浓缩20倍。根据测试条件，检查初始浓缩物的pH(在所有情况下保持发酵的pH)，并然后在相同的横流系统上进一步将初始浓缩物渗滤到不同的缓冲液中。用于渗滤的缓冲液为：

pH 5,5 100mM乙酸钠缓冲液pH 5.5，0.5mm CaCl₂

pH 6.0 100mM乙酸钠缓冲液pH 6.0+0.5mm CaCl₂

pH7.0 100mM HEPES缓冲液pH7.0+0.5mm CaCl₂

实施例2：蛋白酶测定和稳定性测试

1.1.蛋白酶测定

a)AAPF测定96孔格式

测定缓冲液：200mM乙酸钠或柠檬酸钠，1mM CaCl₂，0.01％Triton X-100，在pH4或pH3(取决于实验)

基质储备溶液：在无水DMSO中100mM

基质工作溶液：基质储备溶液以1∶50在测定缓冲液中稀释，pH4(乙酸盐)或pH3(柠檬酸盐)

执行：将50μL稀释的样品上样到Nunc 96透明平底板的孔中。在含有0.01％Triton-X100的水中进行稀释，与样品的体积活性相对应。

通过加入50μL基质工作溶液开始反应。

通过监测410nm处吸收的增加来测量37℃的动力学以测量酶活性。

b)IT₅₀：IT₅₀定义了在上述条件下50％的活性失活处的温度。虽然不等同，但它是以下应用中热稳定性的一种测量：例如，粒化条件或洗涤剂应用(餐具清洗或清洁织物或硬表面及其他技术应用)中的条件。

测定缓冲液：50mM磷酸钠，0.25mM CaCl₂，pH6.0

800mm甘氨酸，pH2.8

热灭活执行：对应于磷酸钾缓冲液中的体积活性稀释样品。检查最终溶液的pH是否高于5.5。根据PCR仪的温度梯度指示，将样品以每孔20μL的重复转移到384孔的PCR板上。用粘合剂或热熔盖箔密封板，并在温度梯度为+/-12℃的热梯度循环仪上在期望的IT50值附近孵育10分钟。用AAPF-pNA如下测量样品的剩余活性之前，将样品冷却至8℃。在37℃下孵育1小时期间，将来自温度孵育板的各15uL样品转移到Nunc 384透明平底板中，并添加9uL甘氨酸缓冲液以活化蛋白酶。蛋白酶活化后，通过添加24μL AAPF-pNA溶液(含0.01％Triton-X100的水中的2mM AAPF-pNA)开始测定，并按照37℃下的动力学测量活性。将失活温度下残余活性的标准化实验数据拟合到四参数逻辑函数中以评估IT50。

实施例3：非变性条件下通过表观凝胶移动性测试肽原的Kumamolisin AS成熟

对不同pH条件下孵育的蛋白酶样品测试了肽原的加工。调节pH值如下：

pH 5.5	100mM乙酸钠缓冲液pH 5.5+0.1mM CaCl<sub>2</sub>
		pH 6.0	100mM乙酸钠缓冲液pH 6.0+0.1mM CaCl<sub>2</sub>
pH 7.0	100mM HEPES缓冲液pH 7.0+0.1mM CaCl<sub>2</sub>

在非变性凝胶(Mini-Protean TGX Stain free gel，任何KD，Biorad 456-8126，以样品缓冲液62.5mM TriS pH 6.8、12.5％甘油、溴酚蓝，电泳缓冲液25mMTriS pH 8.5，192mM甘氨酸)上进行分离。凝胶要么被染色(用考马斯或使用BioRad的stainfree方案)，要么通过酶谱程序进一步分析。对于酶谱，通过在水中冲洗凝胶，然后在100mM柠檬酸钠pH 3中孵育1h，分离的蛋白酶品种在凝胶中分离后被完全活化。通过在凝胶顶部放置x射线胶片(AGFA或Fuji，曝光和显影，明胶侧面向凝胶)，并在37℃下将凝胶在加湿箱中孵育30分钟，来检测活性条带。孵育后，用水冲洗x射线胶片以去除水解的蛋白。活性条带在黑色胶片上以半透明区域可视。

三种酶品种能根据移动性来区分：酶原(Z)、带有切口的肽原的酶(N)和加工的完全活化的酶(A)(见图1)。

实施例4：曲霉谷氨酸蛋白酶的pH依赖性成熟

活化蛋白酶所需的pH重点取决于显示最高pH的Kumamolisin AS。曲霉谷氨酸蛋白酶的活化pH由于在肽原加工中降低而低于5.0，所述活化通过酶原分子量(理论上28,8kDa)向活性加工形式(理论上23,1kDa)的转变来判断。SDS-PAGE分析结果如图2所示。

实施例5：pH和储存时间对肽原介导的热稳定性的影响

如实施例3所概述，在不同的储存pH和环境温度下测试了pH和储存时间对热稳定性的影响。通过分析实施例2b中所述的IT₅₀值，在指示的孵育时间测试热稳定性。

Kumamolisin AS在预孵育期间未被活化时(因为在pH7下储存)显示83.5℃的表观IT₅₀，而切开的和完全加工的酶(即，由于在pH6或更低下储存而在预孵育期间被活化)显示67.3℃的IT₅₀。

IT₅₀的确定显示了非活性酶和活性酶候选物之间的比例。稳定性更高的酶候选物在更高温度下失活(“右移”)，而稳定性更低的酶候选物在更低温度下已失活(“左移”)。在活化条件下分别发生切开或肽原的完整加工。这导致肽原的稳定作用丧失。因此，所加工的酶候选物具有较低的热稳定性(“左移”)。

因此，切开或活化产生品种的混合物，导致双相热失活曲线，以拐点给出稳定的未加工种类的级分。由于热不稳定性和自蛋白水解的混合效应，从切开的到完全活化形式的转变导致失活的斜率的变化。本实验的结果是按照通过实施例3的非变性凝胶色谱中的表观移动性进行的定量分析。

在给定的pH值5.5、6.0和7.0下预孵育后，各自的热稳定性曲线见图3。t0-t21表示以天为单位的储存时间/预孵育时间。很明显，在pH5.5下，只有未预孵育的样品(储存时间t0)具有高于80℃的IT₅₀，而预培养1天或更长的样品面临对较低温度立即减少的IT50。

在不受限于理论的情况下，看上去活化条件下的预孵育导致IT₅₀的左移这一点是由肽原水解引起的，导致肽原的稳定作用丧失。此外，一旦酶被完全活化，它也会自消化。

实施例6：储存在不同pH的Kumamolisin AS的活化动力学

如实施例4所概述，在不同的储存pH和环境温度下研究了储存时间和pH对活化状态和活化动力学的影响。通过将储存的蛋白酶转移到活性测定(如实施例3所述)中，在单胃动物胃部发现的pH下，在指定时间点测试活化动力学。

完全活化的样品在无任何滞后时间下(时间点t15、t17和t21，在pH5.5)以最大转化速度水解蛋白质或蛋白酶底物，然而在没有活化或仅出现切开的条件下储存的酶(pH高于6.0，另见实施例3和4)显示3分钟的活化滞后阶段。对于有切开或未加工的酶原，活化滞后时间没有观察到显著差异。在酸性pH时有利于快速活化，此时本发明的蛋白酶能被有限活化。结果见图4。

实施例7：活化的和未活化的Kumamolisin AS的pH活性曲线

使用实施例3中所述的测定，但使用Britton和Robinson(1931)描述的宽pH条带测定缓冲液，测定在不发生活化的条件下(即在pH＞6时)产生的Kumamolisin AS制备在不同pH下的活性。

在静态条件下分析活性，并将活性归一化为观察到的最大活性。活化的蛋白酶显示出更宽的pH曲线，在只有切开但没有发生活化的pH值下也有活性。结果见图5。

实施例8：在蛋白酶存在时饲料酶的储存稳定性。

除了对热稳定性有积极影响(参见实施例5)，在酶原是非活性时，酶原的肽原也对蛋白酶的酶活性有影响。这保护蛋白酶免受自水解(参见实施例9)，也保护介质(例如饲料)中的其他酶免受蛋白质水解降解。因此，在酸性蛋白酶未被活化(pH6)的pH和在蛋白酶被活化的pH下，通过酸性蛋白酶Kumamolisin AS(K1)的降解测试用作饲料添加剂的不同酶。

在以相同活性给剂量的蛋白酶的存在下的不同的pH下，或在指定的pH值下仅有纤维素酶/植酸酶作为对照，以50mg/L孵育商业纤维素酶和商业植酸酶。在指定时间点使用以下测定测试酶的残余活性：将20μL底物溶液(1mM MU，甲基伞形藻基(methylumbelliferyl)底物，用于水中的纤维素酶和植酸酶)与20μL孵育的酶混合物混合，在黑色384孔板中按预期活性稀释。在37℃下孵育30分钟。添加40μl 500mm碳酸钠(pH10.3)溶液。读取荧光364ex448nm并计算对于t0的残余活性。结果如表1所示：

表1.在存在或不存在蛋白酶在不同pH下商业纤维素酶的储存，被活化或作为酶原

表2.在存在或不存在蛋白酶在不同pH下商业植酸酶的储存，被活化或作为酶原

数据清楚地显示，在中性或碱性pH下与酸性蛋白酶的共孵育(使蛋白酶作为非活性酶原)保护混合物中的其他酶(纤维素酶、植酸酶)免受消化，而在酸性pH下与酸性蛋白酶的共孵育(通过水解肽原来活化蛋白酶)降解混合物中的其他酶。

实施例9：选择具有更高热稳定性的优化的变体

酶的热稳定性是食品、饲料、洗涤剂、清洁及其他应用中的技术酶的关联参数。酶的热稳定性能通过定向进化的手段来优化，这种表达描述了产生优化的遗传多样性和功能性选择的组合，即增加热稳定的变体酶。在预测条件下对遗传多样性进行功能性选择是必要的。对于像本文所描述的那些蛋白酶，通过实施例2b中所描述的方法筛选热更稳定的变体能受蛋白酶自水解的影响

测试Kumamolisin AS对酶原(图6，实心圆)或活化的酶(图6，空心圆)的热稳定性表现这种差异。酶原的热失活曲线显示了标准的具有活性的急剧下降的S型失活曲线(四参数逻辑能拟合曲线)，然而活化的酶由于自水解和热灭活的混合作用显示活性的早期下降。

实施例10：酸性蛋白酶的体内消化性测试

为了测试酸性蛋白酶在饲料应用中的效力，在体内试验中测试了作为丝氨酸羧基肽酶组的肽酶的例子的Kumamolisin AS(“K1”)。

将如实施例1中所描述产生的酶作为活性酶冷冻干燥，并以35mg/kg样品对K1的活性为依据的剂量并入标准玉米大豆膳食中。

21天不含酶的膳食饲养的预处理期后，雄性肉鸡(Cobb 500)被分到3个处理(每种处理24只动物，每笼3只禽8个重复，基础面积34em x 55em)，并在不含酶(对照组)或在所述剂量水平下补充酶，进一步饲养7天的基础膳食。自动饲养器可随意提供饲料。饮用质量的淡水用奶嘴持续供应。

在7d饲养期(28日龄)结束时，通过从22到28日龄的生产性能(体重、体重增加、饲料摄入、饲料转化率)和表观回肠消化性测量(灰份、粗蛋白、粗脂肪、钙、磷)证明效力。

为了计算单个体重增加使用以下公式：

每只禽在每个时期的平均重量增长F-S(通过死亡或捕杀的鸡的重量增长来校正)

F-称重日时笼中活禽的平均重量

S-前一次称重时笼中活禽的平均重量

通过以下公式计算饲料摄入(针对分散的饲料而校正)

通过使用以下公式估算饲料转化率：

在7d处理期结束时，每个处理组确定所有的禽的表观回肠消化性。将一笼的3只禽的回肠内容物汇集。冷冻干燥进行化学分析之前，在分析之前将汇集的样品保持在-20℃。在22至28日龄的3g/kg膳食的剂量水平下，补充氧化钛(IV)(TiO2)作为惰性志物。为计算表观回肠消化性，使用以下公式：

结果如图7-11，以及表7和表8所示。

图7显示了体重增加，图8显示饲料转化率，图9显示粗蛋白的表观消化性，图10显示脂肪的表观消化性，以及图11显示磷的表观消化性。

确实令人惊讶的是，通过施用酸性蛋白酶，脂肪和磷的消化性增加了。由于蛋白酶不能消化含有脂肪或磷的分子，所以这种效果是无能预料的。在没有理论约束的情况下，发明人推测酸性蛋白酶可能会切割包含蛋白质的特定复合物，其然后释放脂肪或磷。

这些实验显示，根据本发明的酸性蛋白酶(特别是来自Sedolisin组的那些)，确实可用作饲料添加剂，以增加食物的消化性和体重增加。

实施例11：体内性能测试

为了测试酸性蛋白酶作为Sedolisin组(S53)的酸性蛋白酶的一个例子的Kumamolisin AS(K1)的效力，进行了一项针对“Ronozyme Proct”(RPA)的体内试验。如所讨论的，后一种酶是具有中性pH活性性质的蛋白酶，并且被包括以证明相对于中性活性蛋白水解酶，所述Sedolisin组(S53)的酸性蛋白酶的性能优势。

将如实施例1中所述生产的酶作为活性酶冷冻干燥，并以354mg/kg样品对K1的活性为依据的剂量并入标准玉米大豆膳食中。以活性剂量所给的剂量相当于200mg/kg的RPA酶产品的建议剂量。根据建议剂量以200mg/kg的蛋白酶“Ronozyme Proct”给剂量，并且也根据标准建议剂量以500FTU/kg的植酸酶给剂量。

本实验对一日龄雄性肉鸡(Cobb 500)进行，所述肉鸡被分到四个实验组，每组3只重复8次。将鸡尽可能均匀地分布到相同的不锈钢笼中，每笼三只禽(每种处理8个重复)。

将35天的试验期分为两个饲养期；分别为第一天到十四日龄的开始期和随后的十五日龄到三十五日龄的生长期。除了蛋白质、氨基酸和磷含量略有降低外，计算了基础开始和生长膳食，以满足GfE推荐的肉鸡营养需求。一组接受无测试产品的基础膳食(对照组)。进一步的组在整个35天的饲养期间，提供了含有酶原型“K1”商业酶产品“Ronozyme Proct”(RPA)的膳食。进一步的一组接受植酸酶酶产物“Quantum Blue 5G”。

肉鸡在整个35天的饲养期内随意获得饲料(捣碎形式)；饮用钟提供的水也随意获得。试验运行时没有任何不利的技术事件(例如电源故障、饲料/水故障)。总死亡率计为2.5％。

在整个饲养期内的生产性能(体重、体重增加、饲料摄入、饲料转化率)以及在结束时(35日龄)的表观回肠消化性测量(灰分、粗蛋白、粗脂肪、钙、磷)证明效力。

为了计算单个体重增加使用以下公式：

每只禽在每个时期的平均重量增长F-S(通过死亡或捕杀的鸡的重量增长来校正)

F-称重日时笼中活禽的平均重量

S-前一次称重时笼中活禽的平均重量

通过以下公式计算饲料摄入(针对分散的饲料而校正)

通过使用以下公式估算饲料转化率：

在试验第35天(5日龄)确定各处理组所有禽的粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、钙和磷的表观回肠消化性。将一笼3只禽的回肠内容物汇集。冷冻干燥进行化学分析之前，在分析之前将汇集的样品保持在-20℃。

在3g/kg膳食剂量水平下，补充氧化钛(IV)(TiO2)作为惰性标志物。为计算表观回肠消化性使用以下公式：

行内不同的上标表示P＜0.05的显著性水平。

表3：第1天到第35天的表现

当包含酸性蛋白酶“K1”饲养肉鸡时，对整体体重增加的益处明显高于“RonozymeProct”或植酸酶酶产品“Quantum Blue 5G”报道的那些(表3)。与对照组相比，相应的整体饲料转化率显著降低了6.6个点，而饲养“Quantum Blue 5G”的肉鸡则降低了5.1个点。食物转化率的降低也比“Ronozyme Proct”报道的高出3.1个点。

对酶性能的积极反应是基于在35日龄测量的表观回肠消化性的改善(如实施例10所述进行的测量)。如实施例10显示的饲养试验中所已经报告的，粗蛋白的表观回肠消化性增加，但对钙、磷酸/盐和脂肪的消化性也观察到显著影响(表4)。酸性蛋白酶K1的平均的回肠表观消化性增加7.9％，显著高于中性活性蛋白酶Ronozyme ProAct观察的4.3％的增加。

磷酸盐(K1，比对照组增加8.8％)和钙(K1，比对照组增加12.2％)的表观消化性的显著和意想不到的高度影响能归因于植酸/盐和蛋白质之间的已知相互作用。Selle等人的出版物(2000)整合了植酸盐-蛋白复合物的信息，并讨论了植酸酶和植酸酶相关的正效应对蛋白质消化性的影响。在胃的酸性条件下，低于蛋白质的等电点，形成二元蛋白-植酸/盐复合物，而植酸/盐、金属离子和蛋白质的三元复合物在中性pH形成(Cosgrove 1966，Anderson 1985)。已经在体外在酸性pH下证实了对几种蛋白的二元蛋白-植酸/盐复合物，所述几种蛋白例如大豆球蛋白(大豆中的主要蛋白质)(Okubo等人1976)，也是上面描述的饲养试验和实施例10和12中的蛋白质来源。对于大豆球蛋白，最大的至二元复合物的蛋白络合已在pH 2-3记述，取决于植酸/盐与蛋白的比率。Rajendran&Prakash(1993)描述了在蛋白质与植酸/盐的初始结合之后与蛋白的构象变化相关的进行式蛋白-蛋白聚集。由于一些体外研究描述了在酸条件下植酸/盐存在下消化性水解的减少，这种聚集物可能难以被蛋白质水解(Camus&Laporte，1976)。最初的描述被一些研究扩展，这些研究一致表明植物储存和动物蛋白的消化活性降低(Kanaya等.1976；Inagawa等.1987；Knuckles等.1989，Vaintraub&Bulmaga 1991)。

从这些观察中衍生出工作假设，即二元蛋白-植酸/盐复合物的形成是众所周知的植酸/盐的抗营养作用的一个重要方面。除了从植酸/盐释放膳食磷酸/盐的效果之外，目前植酸/盐的抗营养作用只能通过补充微生物植酸酶活性的手段来解决。植酸酶的蛋白质效应很可能与蛋白-植酸/盐复合物有关，通过将植酸/盐水解至较低磷酸肌醇，使其具有形成这种复合物的能力。也可能是剂量推荐的新的传播读数，植酸酶的超剂量通过快速水解植酸盐并干扰这些复合物的积累而发挥其作用。进一步描述了相比蛋白质修饰的复合物中的植酸/盐(Konishi等人1999年，Bohn等人2007)，植酸酶将更好地水解可溶性植酸盐(Lonnerdal等人1989)。

通过蛋白酶的作用，从这种二元复合物(其中植酸/盐和蛋白均更难以水解)中释放蛋白质和植酸/盐确实与植酸酶一起具有协同效应的潜力。该效应是两种酶同时活性的结果，并且在实施例10、11和12所示的体内试验之前或在体内试验观察中未对中性活性蛋白酶进行测试。在体外测试二元复合物的水解是很难以测试的，因为复杂的制备使得复杂的性质和可预测性随之受到限制(Selle等人2000)。体内饲养试验可能是测试这种效应的最佳方法。能够预期的是，能够在二元复合物中或在形成这种复合物之前水解蛋白质的酸性蛋白酶将对粗蛋白质的消化性具有有益效果，并且至少对植物酶对磷的消化性具有额外作用，而不仅仅是添加剂，即协同效应是所讨论的作用模式和选择对二元蛋白质-植酸/盐复合物具有活性的酸性蛋白酶的创造性步骤的良好证明。另外，选择酸性酶并不显而易见，因为酸性蛋白酶由于在胃肠道的中性部位的保留时间长4倍、热稳定性大多更低、经济可生产性的实例以及使这种酶性能更好的基因工程实例较少，而确实没有时间水解蛋白质。

表4：在第35天表观回肠消化性

为了更好地评价结果，探索图形以箱线图显示在图12A-F，以显示对以下呈现的数据集的分布：体重增加、饲料转化和粗蛋白、磷、钙和粗脂肪的表观回肠消化性。处理组为1对照；2 Ronozyme ProAct；3 KumamolisinAS(K1)，5 Quantum Blue 5G-每个如上所概述地给剂量。

实施例12：体内消化性及性能测试

为了测试植酸酶的任一协同作用，作为Sedolisin组(S53)或G1组的酸性蛋白酶的例子Kumamolisin AS(K1)，在体内试验中结合植酸酶Quantum Blue(AB Vista)相对于“Ronozyme Proct”(RPA)与同样植酸酶的结合进行了测试。如所讨论的，后一种酶是具有中性pH活性性质的蛋白酶，并且被包括以证明相对于中性活性蛋白水解酶，所述Sedolisin组(S53)或G1组的酸性蛋白酶的性能优势。

所述试验与实施例11中所概述的试验并行并在相同条件下进行，除了仅从第29天到第35天饲养蛋白酶。对照、无酶基础膳食(处理1)和植酸酶参照、含植酸酶“Quantum blue5G”的基础膳食(处理5)与实施例11相同。进一步的组将含“Quantum blue 5G”的膳食提供整个饲养期35天，最后7天(第29天至第35天)额外提供“Ronozyme ProAct”(处理6)和Kumamolisin AS(处理7)。进一步的组为蛋白酶对照组，以当在35天饲养期的仅最后7天内饲养和没有植酸酶时，测试蛋白酶“Ronozyme ProAct”(处理8)或和Kumamolisin AS(处理9)的效果。

所述剂量等于并描述在实施例11。简言之，将如实施例1中产生的酶作为活性酶冷冻干燥并以354mg/kg样品对K1的活性为依据的剂量(活性剂量相当于RPA酶产品的建议剂量)并入实施例11中概述的开始和生长膳食中。根据200mg/kg的建议剂量给蛋白酶“Ronozyme ProAct”的剂量，并且根据标准建议剂量也给植酸酶500FTU/kg的剂量。

在整个饲养期内的生产性能(体重、体重增加、饲料摄入、饲料转化率)以及在最后(35日龄)时的表观回肠消化性测量(灰分、粗蛋白、粗脂肪、钙、磷)证明了效力。表观回肠消化性的所有计算也如实施例10和11。

在对比分析饲养试验结果之前，评估了仅在过去7天饲养酶的处理是否与35天的整个饲养期相关。通过发现了“Ronozyme Proct”的相应益处(重量增加；饲料转化率)的事实，且在整个35天饲养期或之前未添加酶的29-35日龄饲养K1(比较表5中处理组2、8和3、9)，第29-35天测量的酶组合结果具有充分相关性。“Ronozyme Proct”和K1的表观回肠消化性结果几乎与饲养持续时间无关的事实(比较以下线：来自实施例11中表3的处理组T2和T3的线，分别与来自实施例12的表6中处理组T8和T7的线)，从29到35日龄测量的酶组合的益处似乎与整个饲养期有关。

在整个饲养期间，K1的总体重增加明显高于饲养任何其他酶的鸡记录的那些。与其他酶相比，相应的总饲料转化率显著降低。在具有K1的作用的与植酸酶“Quantum Blue5G”的组合，发现体重增加和饲料转化率的最高益处，酸性蛋白酶与植酸酶的组合优于中性蛋白酶“Ronozyme ProAct”。

对这些酶和这些酶组合的表现的正面反应是基于对表观回肠消化性的改善。在过去7天内，K1和“Ronozyme Proct”饲料使平均表观消化性分别提高了7,7％和6,2％。

植酸酶“Quantum Blue 5G”和“Ronozyme-Proct”或K1的组合的平均表观回肠消化性的益处最高，分别为11,3％和15,3％，其中与酸性蛋白酶K1的组合优于中性蛋白酶“Ronozyme-Proct”和植酸酶组合。

酸性蛋白酶K1与植酸酶的组合效果(尤其是关于钙和磷的)优于中性活性酶产物“Ronozyme Proct”与植酸酶的组合观察到的。同时参照所讨论的与植酸酶组合的酸性蛋白酶相对于中性蛋白酶的潜在益处，与植酸酶结合的磷酸/盐消化性的增加超过了对酸性蛋白酶K1的附加，表明了与植酸酶的协同效应，而中性活性蛋白酶显示低于附加作用(将表6中T6和T7的“相对Quantum blue，磷消化性的提高％”行与T8和T9的“相对对照，磷消化性的提高％”行分别比较。)。

为了更好地评价结果，以箱线图的探索图形显示在图13A-F，以显示对以下呈现的数据集的分布：体重增加、饲料转化和粗蛋白、磷、钙和粗脂肪的表观回肠消化性。处理组为1对照，2Ronozyme ProAct，3KumamolisinAS(K1)，5Quantum Blue 5G，6 Quantum Blue 5G+Ronozyme ProAct(第29-35天)，7 Quantum Blue 5G+K1(第29-35天)，8 Ronozyme ProAct(第29-35天)，9 K1(第29-35天)-每个如上所概述地给剂量。

这些实验令人印象深刻地表明，来自S53家族的酸性蛋白酶与植酸酶之间存在着真正的协同作用。如前所讨论的，来自S53家族和G1家族的酸性蛋白酶组成了一组以前被称为“胃蛋白酶抑制剂不敏感的羧基肽酶”。因此，两个家族都有特定的结构和/或功能关系。因此，与中性/碱性蛋白酶和植酸酶的组合相比，上述协同作用也适用于来自G1家族的酸性蛋白酶和植酸酶的组合。

行内不同的上标表示P＜0.05时的显著性水平。

表7：第22天至第28天处理期间的表现

表8：第28天处理结束的表观回肠消化性

实施例13：Grifolisin的表达

Grifolisin是另一种源于真菌多叶奇果菌的来自S53家族的肽酶。Grifolisin在酿酒酵母菌株BY4741中表达，在组成型启动子的控制下，用含有密码子优化的基因(SEQ IDNO 3)的质粒作为酶原转化。该酶是通过酿酒酵母特异性前导区分泌到培养基中，并进一步加工以保留活性酶。

这种表达发生在补充2％葡萄糖的调节pH至5.6的SC-Ura培养基中。将10mL SC-Ura 2％葡萄糖培养基的预培养以含有转化的细胞的50μl甘油储备液接种，并在30℃150rpm下培养24h。对于主要培养，1L SC-Ura 2v％葡萄糖培养基补充预培养，调整到OD600为0.05，并且细胞然后在30℃150rpm下进一步生长72h。

实施例14：大豆衍生的Kunitz型和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂(BBI/KTI)的水解

在大豆和其他豆类种子中，发现了两种类型的胰蛋白酶抑制剂：Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)和Bowman-Birk抑制剂(BBI)。KTI是一种大的(20,100道尔顿)胰蛋白酶的强抑制剂，而BBI则小得多(8,000道尔顿)并抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，这两种酶自然存在于人类和牲畜的内脏中。

这两种抑制剂在体内都有显著的抗营养作用，通过阻碍内脏中蛋白质水解和其他酶的活化来影响消化。整个大豆每克含有15-40mg胰蛋白酶抑制剂，在1.5％w/w和4.0％w/w之间，并因此形成了豆蛋白质含量的一个重要部分。

这些抑制剂的存在被认为是为了保护大豆种子免被动物捕食者消耗。

有趣的是，这两种抑制剂非常稳定，并且此外对蛋白酶的消化有很大的抵抗力。在饲料应用中，这两种抑制剂的酶降解具有双重作用，即(i)使所述蛋白质部分可由动物摄取，和(ii)阻断对动物自身内脏蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制。

这两种作用能增加食物转化率，并提高从饲料原料中蛋白质的摄入。

然而，许多蛋白酶，如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，既不能降解Kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)，也不能降解Bowman-Birk抑制剂(BBI)。在接下来的实验中，已经证明肽酶家族S53中的另一个成员Grifolisin能有效降解KTI和BBI，从而引起恢复正常的胰蛋白酶活性。

实验方案

a)用Grifolisin 96孔格式水解KTI和BBI

将KTI(17.5μg/ml)和/或BBI(4.3μg/ml)与14μg/ml纯化的Grifolisin在37℃下孵育60分钟。

测定缓冲液：100mM柠檬酸钠，1mM CaCl2，pH3

b)使用AAPF测定96孔格式通过Grifolisin水解BBI和KTI后胰蛋白酶的残留活性。

在24μl 100mM柠檬酸钠，1mM CaCl₂，pH3中1∶5稀释来自a)的反应混合物。

在1M磷酸钠(pH8)中1∶1稀释胰蛋白酶溶液(这将反应混合物的pH调整为7)，并在37℃下孵育10min。

通过添加用于蛋白酶测定的底物工作溶液开始反应(参见实施例2，除了测定缓冲液具有用于中性蛋白酶活性的pH7)

通过监测410nm的吸收的增加来测量37℃下的动力学，作为酶活性的测量。我们将比较存在和不存在BBI、KTI和BBI/KTI时胰蛋白酶的残留活性。

蛋白酶测定中的浓度：

KTI	1.5μg/mL
		BBI	0.37μg/mL
BBI/KTI	0.6+0.3μg/mL
		胰蛋白酶	0.1μg/mL
+/-Grifolisin	1.2μg/mL
		AAPF	1mM

图14清楚地显示，抑制剂介导的胰蛋白酶抑制在存在Grifolisin的情况下，对于BBI、KTI和BBI/KTI强烈降低。在数量上，20-40％的初始胰蛋白酶活性能被修复。没有Grifolisin，在存在任何类型的抑制剂的情况下都没有可见的胰蛋白酶活性，而在存在Grifolisin的情况下，所述活性被修复。这些数据表明，Grifolisin对KTI和BBI都有活性，并因此在饲料应用中具有真正的效果，能有助于提高食物转化率和蛋白质摄取效率。

常规的BBI/KTI水解测定通常显示抑制剂通过SDS-PAGE降解，但从未涉及KTI/BBI水解对胰蛋白酶本身的功能性后果，这是最重要的方面。这种功能性测定这里直接测量了来自S53家族的酸性饲料蛋白酶处理BBI和KTI后的胰蛋白酶活性，并因此更接近于现实应用。

参考文献

Wlodawer A1，Li M，Gustchina A，Oyama H，Dunn BM，Oda K.，Acta BiochimPol.2003；50(1)：81-102

Terashita，T.，Oda，K.，Kono，M.&Murao，S.，Agric Biol Chem(1981)45，1937-1943

Oda，K.，Takahashi，S.，Ito，M.&Dunn，B.M.，Adv Exp Med Biol(1998)436，349-353

Britton，H.T.K.and R.A.Robinson.J.Chem.Soc.，1931，1456-1462.

P.H.Selle，V.Ravindran，R.A，Caldwell and W.L.Bryden.Phytate andPhytase：consequences for protein utilisation.Nutrition Research Reviews(2000)，13，p.255-278

D.J.Cosgrove(1966).The chemistry and biochemistry of inositolpolyPhosphates.Reviews of pure and applied chemistry，16，p.209-224

P.A.Anderson(1985)Interactions between proteins and constituents thataffect protein quality.In Digestibility and Amino Acid Availability inCereals and Oilseeds，pp.31-45[J.W.Finley and D.T.Hopkins，editors].St.Paul，MN：American Association of Cereal Chemistry，Inc.

K.Okubo，D.V.Meyers and G.A.Iacobucci(1976)Binding of phytic acid toglycinin.Cereal Chemistry 53，pp 513-524

Rajendran and V.Prakash(1993)Kinetics and thermodynamics of themechanism of interaction of sodium phytate with alpha-globulin.Biochemistry32，pp.3474-3478

M.C.Camus and J.C.Laporte(1976)Inhibitionde la protéolyse pesique parle blé. de l`acide phytique des issues.(Inhibition of pepsin proteolysisby wheat.Role ofphytic acid in the outcome).Annales de Biologie AnimaleBiochimie Biophysique 16，pp.719-729

K.Kanaya，K.Yasumoto and H.Mitsuda(1976)Pepsin inhibition by phytatecontained in rice bran.Eiyo To Shokuyo 29，pp.341-346

J.Inagawa，I.Kiyosawa and T.Nagasawa(1987)Effects of phytic acid onthe digestion of casein and soybean protein with trypsin，pancreatin andpepsin.Nippon Eiyo Shokuryo Gakkaishi 40，pp.367-373

B.E.Knuckles，D.D.Kuzmicky，M.R.Gumbmann and A.A.Betschart(1989)Effectof myo-inositol phosphate esters on in vitro an in vivo digestion ofprotein.J.of Feed Science 54，pp.1348-1350

I.A.Vaintraub and V.P.Bulmaga(1991)Efiect of phytate on the in vitroactivity of digestive proteinases.J.of Agricultural and Food Chemistry 39，pp.859-861

B.Lonnerdal，A.S.Sandberg，B.Sandstrom and C.Kunz(1989)Inhibitoryeffects of phytic acid and other inositol phosphates on zinc and calciumabsorption in suckling rats.J.of Nutrition 119，pp.211-214

Bohn，L.，Josefsen，L.，Meyer，A.S.，Rasmussen，S.K.，2007Quantitativeanalysis of phytate globoids isolated from wheat bran and characterization oftheir sequential dephosphorylation by wheat phytase.J.Agri.Food Chem.55，pp.7547-7552

C.Konishi，T.Matsui，H.Park，H.Yano and F.Yano(1999)Heat treatment ofsoybean and rapeseed meals suppress rumen degradation of phytate phosphorusin sheep.Animal Feed Science and Technology 80，pp.115-122

序列

SEQ ID No 1：为枯草芽孢杆菌优化的Kumamolisin AS密码子

SEQ ID No 2：为酿酒酵母优化的曲霉胃蛋白酶2密码子

SEQ ID No 3：为酿酒酵母优化的Grifolisin密码子

SEQ ID No 4：为多形汉逊酵母优化的曲霉胃蛋白酶2密码子

序列表

<110> EW营养有限责任公司

<120> 包含酸性蛋白酶的饲料组合物

<130> ED 40991

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 为枯草芽孢杆菌优化的KumamolisinAS密码子

<400> 1

tcagatatgg aaaaaccgtg gaaagaaggc gaagaagcta gagcagttct gcaaggccat 60

gcaagagcac aagcaccgca agcagttgat aaaggaccgg ttgcaggcga cgaaagaatg 120

gcagttacag ttgttctgcg cagacaaaga gcaggcgaac tggcagcaca tgttgaaaga 180

caagcagcaa ttgcaccgca tgcaagagaa catctgaaaa gagaagcatt tgcagcatca 240

catggcgcat cactggatga ttttgcagaa ctgagaagat ttgcagatgc gcatggcctg 300

gcactggata gagcaaatgt tgcagcaggc acagcagttc tgtcaggacc ggttgatgca 360

attaatagag catttggcgt tgaactgcgc cattttgatc atccggatgg ctcatataga 420

tcatatctgg gcgaagttac agttccggca tcaattgcac cgatgattga agcagttctg 480

ggcctggata caagaccggt tgcaagaccg cattttagaa tgcaaagacg cgcagaaggc 540

ggatttgaag caagatcaca agcagcagca ccgacagcat atacaccgct ggatgttgca 600

caagcatatc aatttccgga aggcctggat ggacaaggcc aatgcattgc aattattgaa 660

cttggcggag gctatgatga agcatcactg gcacaatatt ttgcatcact gggcgttccg 720

gcaccgcaag ttgtttcagt ttcagttgat ggcgcatcaa atcaaccgac aggcgatccg 780

tcaggaccgg atggcgaagt tgaactggat attgaagttg caggcgcact ggcacctggc 840

gcaaaatttg cagtttattt tgcaccgaat acggatgcag gctttctgga tgcaattaca 900

acagcaattc atgatccgac actgaaaccg tcagttgttt caattagctg gggaggaccg 960

gaagattcat ggacatcagc agcgattgca gcaatgaata gagcgtttct tgatgcagca 1020

gcactgggcg ttacagttct ggcagcagca ggcgattcag gcagcacaga tggcgaacaa 1080

gatggcctgt atcatgttga ttttccggca gcatcaccgt atgttctggc atgcggaggc 1140

acaagacttg ttgcatcagg cggaagaatt gcacaagaaa cagtttggaa tgatggacct 1200

gatggcggag caacaggcgg aggcgtttca agaatttttc cgcttccggc atggcaagaa 1260

catgcaaatg ttccgccttc agcaaatcct ggcgcatcat caggcagagg cgttccggat 1320

ctggcaggca atgcagatcc ggcaacaggc tatgaagttg ttattgatgg cgaagcgaca 1380

gttattggcg gaacatcagc agttgcaccg ctgtttgcag cactggttgc aagaattaat 1440

caaaaactgg gcaaagcagt cggctatctg aatccgacac tgtatcaact tccggcagat 1500

gtctttcatg atattacaga aggcaacaac gatattgcga atcgcgcaca aatttatcaa 1560

gcaggaccgg gatgggatcc gtgcacaggc ctgggctcac cgattggcgt tagactgctg 1620

caagcactgc tgccgtcagc atcacaaccg caaccgtaa 1659

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 为酿酒酵母优化的曲霉胃蛋白酶2密码子

<400> 2

gctccattga ctgaaaaaag aagagctaga aaagaagcta gagctgctgg taagagacat 60

tctaatccac catatattcc aggttccgac aaagaaatct tgaagttgaa cggtactacc 120

aacgaagaat actcttctaa ttgggctggt gctgttttga ttggtgatgg ttatacaaag 180

gttaccggtg aattcactgt tccatctgtt tctgctggtt cttcaggttc ttctggttat 240

ggtggtggtt acggttattg gaaaaacaag agacaatccg aagaatattg tgcttctgct 300

tgggttggta ttgatggtga tacttgtgaa actgctatct tgcaaactgg tgttgatttc 360

tgttacgaag atggtcaaac ttcttacgat gcttggtatg aatggtatcc agattacgct 420

tacgatttct ccgatattac catctctgaa ggtgattcca tcaaggttac tgttgaagct 480

acctctaaat catctggttc tgccactgtt gaaaacttga ctactggtca atctgttacc 540

catactttct ctggtaatgt tgaaggtgac ttgtgtgaaa ctaatgccga atggatcgtt 600

gaagatttcg aatctggtga ttctttggtt gcttttgctg atttcggttc tgttactttc 660

actaacgctg aagctacttc tggtggttct actgttggtc catctgatgc tactgttatg 720

gatattgaac aagacggttc cgttttgacc gaaacttctg tttcaggtga ttctgttacc 780

gttacttacg tttga 795

<210> 3

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 为酿酒酵母优化的Grifolisin密码子

<400> 3

actccaagag ttccattgtc cgaacaatct catccttcca atatgatcac ctcttctttc 60

ttggttgtct ccttgtttac tttggctttg tctaagccaa tgtccagatc tatgaaggtt 120

cacgaaacta gagaaggtat tccagatggt tttgctttgg ctggttctcc ttcttctgat 180

acttctttga acttgagaat tgccttggtc caaaatgatc cagctggttt ggaaactgca 240

ttatacgatg ttaatacccc atcctctgct aactacggta accatttgtc taaagccgaa 300

gttgaaaagt tcgttgctcc agaaccagaa tctgttgatg ctgttaatgc ttggttggaa 360

gaaaatggtt tgactgctac tactatttct cctgctggtg attggttggc ttttgaagtt 420

ccagtttcta aggccaacga attattcgat gctgatttct ctgtttacac ccatactgat 480

actggtttag aagccattag aaccttgtcc tattctattc cagctgaatt gcaaggtcac 540

ttggatttgg ttcatccaac tattactttc ccaaacccat actcaagatt gccagttgtt 600

gcttcttcta ttaagactgc tgctccaact tctgataact tgacttcttt ggctgttcca 660

tcttcttgtg cttctacaat tactccagct tgtttacaag ccttgtacgg tattccaact 720

acaccagcta ctcaatcttc taacaaattg gctgtttccg gttacattga acaattcgct 780

aatcaagccg acttgaaaac tttcttgact aagttcagaa ccgacatctc ttcttctact 840

actttcacta ctcaaacctt ggatggtggt gaaaatccac aaaatggtaa tgaagctggt 900

gttgaagctg atttggatgt tcaatatact gttggtttgg ctactgatgt tccaaccgtt 960

ttcatttctg ttggtgataa ctttcaagac ggtgctttgg aaggtttctt ggacattatc 1020

aatttcttgt tggacgaatc taccccacct caagttttga ctacttctta tggtcaaaac 1080

gaaaacacca tctccagaaa cttggctaac aatttgtgta acgcttacgc tcaattgggt 1140

gctagaggta cttctatttt gtttgcttca ggtgacggtg gtgtttctgg ttcacaatct 1200

gattcttgtt ctaagttcgt tccaactttc ccatctggtt gtccttttat gacttcagtt 1260

ggtgctacta caggtattaa cccagaaact gctgctgatt tttcttctgg tggtttctct 1320

aattacttcg gtactccatc ttatcaagcc tctgctcatt ctgcttactt gcaagccttg 1380

ggttctacta atgctggtaa gtttaatacc tctggtagag gttttccaga cgtttctact 1440

caaggtgaaa acttccaaat cgttgttgat ggtcaaaccg gtacagttga tggtacatca 1500

tgtgcttctc caacctttgc ttctgttgtt tctttgttga acgatagatt gattgctgcc 1560

ggtaaatctc cattgggttt tttgaatcca ttcttgtact ctactggtgc ttctgccttt 1620

aactctatta catctggttc taacccaggt tgtaacacta atggtttccc agctaaaact 1680

ggttggtcac cagttactgg tttgggtact ccaaattttg ctaagttgtt aaccgccgtt 1740

ggttta 1746

<210> 4

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 为多形汉逊酵母优化的曲霉胃蛋白酶2密码子

<400> 4

gctccattga ctgaaaaaag aagagctaga aaagaagcta gagctgctgg taagagacat 60

tctaatccac catatattcc aggttccgac aaagaaatct tgaagttgaa cggtactacc 120

aacgaagaat actcttctaa ttgggctggt gctgttttga ttggtgatgg ttatacaaag 180

gttaccggtg aattcactgt tccatctgtt tctgctggtt cttcaggttc ttctggttat 240

ggtggtggtt acggttattg gaaaaacaag agacaatccg aagaatattg tgcttctgct 300

tgggttggta ttgatggtga tacttgtgaa actgctatct tgcaaactgg tgttgatttc 360

tgttacgaag atggtcaaac ttcttacgat gcttggtatg aatggtatcc agattacgct 420

tacgatttct ccgatattac catctctgaa ggtgattcca tcaaggttac tgttgaagct 480

acctctaaat catctggttc tgccactgtt gaaaacttga ctactggtca atctgttacc 540

catactttct ctggtaatgt tgaaggtgac ttgtgtgaaa ctaatgccga atggatcgtt 600

gaagatttcg aatctggtga ttctttggtt gcttttgctg atttcggttc tgttactttc 660

actaacgctg aagctacttc tggtggttct actgttggtc catctgatgc tactgttatg 720

gatattgaac aagacggttc cgttttgacc gaaacttctg tttcaggtga ttctgttacc 780

gttacttacg tttga 795

Claims (33)

1.一种饲料组合物，其包含来自肽酶家族S53的蛋白酶。

2.根据权利要求1的组合物，其中所述蛋白酶是选自以下的至少一种：Kumamolisin-AS(也称为Kumamolisin 1)、Kumamolisin-AC和/或Grifolisin。

3.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物进一步包含植酸酶。

4.根据前述权利要求中任一项的组合物，其具有pH≥5。

5.根据前述权利要求中任一项的组合物，其用于选自以下的至少一项：单胃物种诸如家禽、猪、鱼、伴生动物和水产养殖。

6.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述蛋白酶由同源或异源蛋白表达产生。

7.根据前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物进一步包含至少一种以适合将所述组合物的pH保持在≥5的值的浓度存在的试剂或缓冲液。

8.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述pH≥5是通过所述蛋白质表达本身或通过培养条件或发酵条件引起的。

9.根据前述权利要求中任一项的组合物或用途，其中所述蛋白酶在pH≥5时保持无活性。

10.根据前述权利要求中任一项的组合物，所述组合物包含至少一种另外的酶。

11.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物或其中的一种或多种酶具有增加的稳定性和/或储存寿命。

12.根据前述权利要求中任一项的组合物或用途，其中所述蛋白酶与各自野生型相比包含一个或多个氨基酸交换、插入或缺失。

13.根据权利要求12的组合物或用途，其中所述各自的一个或多个交换、插入或缺失向所述酸性蛋白酶提供至少一个选自以下的特征：

·增加的活性，

·增加的热稳定性，

·优化的底物特异性，

·增加的对极端pH值的抗性，

·在存在其他饲料成分下增加的抗性或优化的性能，

·增加的对动物内源性酶的抗性，

·优化的产生能力，

·优化的活化速度，

·增加的肽原的热稳定性效应，和/或

·优化的肽原核心酶相互作用。

14.一种活化根据前述权利要求中任一项的组合物的方法，所述方法包括将所述组合物的pH降低到≤5或更小的值。

15.根据权利要求14的方法，其中所述pH的降低至少部分地通过以下实现：

·将合适的试剂或缓冲液添加至所述组合物，

·将所述组合物添加至另一种具有更加酸性pH的组合物，和/或

·允许所述组合物通过自然过程降低其pH。

16.根据权利要求14或15的方法，其中所述pH的降低至少部分地是在动物消化道原位完成的。

17.包含根据权利要求1-13中任一项的组合物的饲料添加剂、饲料成分、饲料补充物或饲料。

18.根据权利要求17的饲料添加剂、成分、补充物或饲料，其进一步包含至少一种选自由以下组成的组的试剂：

·脂溶性维生素，

·水溶性维生素，

·微量矿物质，和/或

·乳化剂。

19.一种饲料，其包含根据权利要求17-18中任一项的饲料添加剂、成分或补充物，或根据权利要求1-13中任一项的组合物，所述饲料具有在≥10和≤500g/kg之间(1-50％w/w)的粗蛋白质含量。

20.根据权利要求19的饲料，所述饲料以≥0.0005％到≤0.5％w/w的量包含所述蛋白酶。

21.一种减少对象的上胃肠道中细菌种群的方法，所述方法包括向所述对象施用根据权利要求1-13中任一项的组合物，其中在所述对象的上胃肠道中所述细菌的种群被减少。

22.根据权利要求21的方法，其中所述细菌的种群包含产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)。

23.一种改善饲料效率的方法，所述方法包括修改标准膳食为含有更少的蛋白质，并且用根据权利要求17-20中任一项的饲料添加剂、成分、补充物或饲料或根据权利要求1-13中任一项的组合物补充所述经修改的膳食。

24.根据权利要求23的方法，其中所述经修改的膳食含有比标准膳食少≥5％或≤20％之间的蛋白质。

25.一种通过在蛋白质表达系统中的同源或异源蛋白质表达来产生酸性蛋白酶的方法，所述方法中应用导致至少在给定时间段内且至少在局部为5.5或更高的pH的培养条件。

26.根据权利要求25的方法，在所述方法中所述蛋白质表达系统周围的培养基的pH：

·通过添加以适于使所述组合物的pH保持在≥5的值的浓度存在的试剂或缓冲液而建立，和/或

·通过所述蛋白质表达本身、或通过所述培养条件或发酵条件引起。

27.根据权利要求25或26的方法，在所述方法中所述蛋白质表达系统是选自以下的至少一种：

·基于酵母的蛋白表达系统，

·基于丝状真菌的蛋白表达系统，

·细菌蛋白表达系统。

28.一种筛选或产生具有针对给定条件的特定稳定性或具有特定酶活性的蛋白酶的方法，该方法包括

b)以给定参数对蛋白酶文库的个体成员进行表型表征，其中至少一部分表征是在保持所述蛋白酶在其失活状态中的条件下进行的，

c)根据步骤b)中选择的结果选择所述文库的一个或多个成员，并且，任选地

d)分离所述一个或多个选择的成员。

29.根据权利要求28的方法，其中步骤b)中的所述表型表征包括以下子步骤：

b1)在给定温度下进行预处理，以及

b2)蛋白酶活性的后续测量。

30.根据权利要求28或29的方法，所述方法进一步包括初始步骤：

a1)提供蛋白酶文库，和/或

a2)通过诱变编码给定支架蛋白酶的一个或多个基因或cDNA来产生突变的蛋白酶的文库，

该步骤在步骤b)之前。

31.根据权利要求28-30中任一项的方法，所述方法进一步包括后续步骤：

e)通过合适的蛋白质表达方法产生在步骤c)中选择的并且任选地在步骤d)中分离的所述一个或多个成员。

32.根据权利要求28-31中任一项的方法，其中在步骤b1)中，通过选自以下的至少一个步骤使所述蛋白酶保持其失活状态：

·建立或保持≥5的培养基pH，

·添加模拟所述肽原并结合所述活性蛋白酶的活性位点的肽，

·添加可逆结合所述活性位点的小分子抑制剂，

·添加适体或抗体，其以足够高的热稳定性结合所述活性位点或阻断对所述活性位点的接触，

·提供由以下组成或包含以下的肽原：在各自应用的条件下不能从所述蛋白酶切割或水解的D-氨基酸。

33.根据权利要求28-32中任一项的方法，其中所述在给定温度下的预处理在培养基中进行，所述培养基的特征为由以下组成的组的至少一个：

b1)pH≥5，

b2)添加模拟所述肽原并结合所述活性蛋白酶的活性位点的肽，

b3)添加可逆结合所述活性位点的小分子抑制剂，

b4)添加适体或抗体，其以足够高的热稳定性结合所述活性位点或阻断对所述活性位点的接触，和/或

b5)提供由以下组成或包含以下的肽原：在各自应用的条件下不能从所述蛋白酶切割或水解的D-氨基酸。