DE60132801T2 - Prolylendoprotease aus aspergillus niger - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinhydrolysate, ein Verfahren zur Herstellung der Hydrolysate und die Verwendung dieser Hydrolysate.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Enzymhydrolysate von Kuhmilch oder Fraktionen von Kuhmilch haben nur beschränkte Anwendung in der Nahrungsmittelindustrie. Dennoch besetzen diese Hydrolysate interessante Nischen auf dem Markt, wie sich durch das große Volumen an Literatur zeigt, das optimierte Verfahren zur Gewinnung solcher Hydrolysate beschreibt und beansprucht. Milch oder Milchfraktionen werden Enzymen mit proteolytischer Aktivität zur Herstellung der Hydrolysate unterworfen, hauptsächlich um die Allergenität des Produkts zu minimieren, die gastrointestinale Aufnahme durch Anbieten eines leicht aufzunehmenden Aufschlussprodukts zu erleichtern und die Proteine in sauren Produkten gegen Ausfällung während längerer Aufbewahrungszeiträume zu stabilisieren.
  • Obwohl das Verringern des Molekulargewichts von Milchproteinen eine allgemein akzeptierte Praxis zur Erzeugung dieser nützlichen Wirkungen ist, hat die enzymatische Hydrolyse von Milchproteinen Nachteile. Negative Aspekte der Inkubation von Milch mit Enzymen sind u. a. unvollständige proteolytische Spaltung, ein zunehmend bitterer Geschmack nach Verringern der Länge der Peptidfragmente, abnehmende Ausbeuten des Endprodukts aufgrund der erforderlichen Reinigungsschritte und unangenehme Geschmacksveränderungen, die durch hohe Spiegel an freien Aminosäuren verursacht werden.
  • Ein gleichmäßiger und vollständiger Abbau aller Milchfraktionen durch die Inkubation mit Endoproteasen ist oft schwierig zu erhalten. Zum Beispiel ist bekannt, dass beta-Lactoglobulin proteaseresistent ist, und partielle Spaltungen dieses Moleküls können zu unerwartet starken immunogenen Reaktionen in Säuglingsformulierungen sowie sichtbaren Protein-Niederschlägen in Produkten, wie sauren Sportgetränken, führen. Um die Abwesenheit unzureichend gespaltener Proteine in einem Proteinhydrolysat sicherzustellen, ist gewöhnlich ein abschließender Ultrafiltrationsschritt zur Entfernung jeglicher verbleibender großer Peptidfragmente aus dem Hydrolysat erforderlich. Der unerlässliche Schritt der Entfernung dieser partiell gespaltenen Proteinfragmente aus dem Hydrolysat senkt unvermeidlich die Ausbeute des Spaltungsendprodukts, wodurch die Produktionskosten steigen.
  • Die Protein-Antigenität kann durch Spalten der Proteine in Peptide mit nur 8-10 Aminosäureresten überwunden werden, aber die durch eine derartig ausgiebige proteolytische Spaltung erzeugten Peptide können sehr bitter sein. Die übliche Erklärung für dieses Phänomen ist, dass kleinere Peptide mit einem hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäuren bittere Geschmäcke fördern. Die Art des verwendeten proteinhaltigen Rohmaterials, der Typ der proteolytischen Enzyme, die zur Spaltung verwendet werden, und die Länge der erhaltenen Peptide bestimmen größtenteils den Grad der Bitterkeit, die mit dem endgültigen Hydrolysat einhergeht. Zum Beispiel ist bekannt, dass Casein, das viele hydrophobe Aminosäuren enthält, weit bitterere Hydrolysate als Molkeproteine erzeugt.
  • Bei industriellen Arbeitsabläufen wird das Entbittern von Proteinhydrolysaten durch die selektive Entfernung bitterer Peptide unter Verwendung von Aktivkohle oder Adsorption an hydrophobes Harz durchgeführt. Die damit einhergehende Ausbeuteverringerung während solcher Entfernungsschritte erhöht die Kosten des Endprodukts. Außerdem hat dieses Verfahren eine negative Auswirkung auf den Nährwert des Endprodukts, da mehrere unter Ernährungsgesichtspunkten unerlässliche Aminosäuren aufgrund ihrer hydrophoben Natur verloren gehen können, einschließlich Tryptophan, Leucin, Phenylalanin und Isoleucin. Somit neigt Entbittern auf diese Weise zur Erzeugung von Hydrolysaten, denen diese unter Ernährungsgesichtspunkten wichtigen Aminosäuren fehlen.
  • Entbittern kann auch erzielt werden, indem Hydrolysate Exopeptidasen unterworfen werden. Bei diesem Ansatz werden aminoterminale und carboxyterminale Aminosäuren von Peptiden bei einem Versuch freigesetzt, ihre Gesamt-Hydrophobizität zu verringern. Das Aussetzen von Peptiden gegenüber nicht-selektiven Exoproteasen führt unglücklicherweise zur Freisetzung unkontrollierbarer Mengen an freien Aminosäuren in das endgültige Hydrolysat. Anschließendes Erhitzen solcher Hydrolysate, die freie Aminosäuren enthalten, wie es zur Sterilisation oder zum Sprühtrocknen erforderlich ist, erzeugt oft über Maillard-Reaktionen brüheartige Beigeschmäcke. Außerdem können die durch Exoproteasen hervorgerufenen hohen Spiegel an freien Aminosäuren den osmotischen Wert des endgültigen Hydrolysatprodukts auf Spiegel erhöhen, die eine osmotische Diarrhö auslösen können.
  • Daher stellt die Produktion von Proteinhydrolysaten eine Abwägung zwischen den Pros und Contras der proteolytischen Spaltung dar. Die derzeitige Praxis ist, die enzymatische Spaltung von Proteinsubstraten hinsichtlich der besonderen Anforderungen einer Produktkategorie zu optimieren. Zum Beispiel erfordern Proteinhydrolysate, die für wirklich allergische Säuglinge bestimmt sind, eine ausgiebige proteolytische Spaltung, gefolgt von einer rigorosen Entfernung jeglicher verbleibender Peptidfragmente mit großem Molekulargewicht. Im Gegensatz dazu enthalten Produkte, die für Erwachsene bestimmt sind, die selten Rindermilchallergien zeigen, üblicherweise Hydrolysate, in denen die durchschnittliche Peptidlänge erhöht ist, um die Möglichkeit von Beigeschmäcken zu minimieren und die Produktausbeute zu maximieren.
  • Alle hauptsächlichen Milchproteine, wie beta-Casein, beta-Lactoglobulin und alpha-Lactoalbumin, sowie pflanzliche Proteinfraktionen, die zum Beispiel aus Sojaisolaten, Reisproteinen und Weizengluten erhalten werden, werden als bedeutende antigene Verbindungen angesehen. Somit wird angenommen, dass eine enzymatische Spaltung dieser Milch- und Getreideproteine auf Molekulargewichte unter 3000 Da zur Minimierung der Allergenität wichtig ist. Die beta-Lactoglobulin-Fraktion in Molke wird insbesondere als wichtiges Allergen betrachtet, weil dieses Protein nicht in humaner Milch vorhanden ist und die proteolytische Spaltung- von beta-Lactoglobulin sich als schwierig erwiesen hat. Säuglingsformulierungen, die Proteinhydrolysate enthalten, die ausgiebig hydrolysiert wurden, enthalten üblicherweise hohe Spiegel an freien Aminosäuren, die einen suboptimalen Geschmack und hohe Osmolalitäten anzeigen. Neuere Untersuchungen von zurzeit vermarkteten hydrolysierten Säuglingsformulierungsprodukten haben gezeigt, dass die meisten von ihnen immer noch auf Molke basierende immunogene Substanzen enthalten. Diese Beobachtung zeigt, dass immer noch ein Bedarf an neuen Enzymgemischen besteht, die verbesserte Hydrolysate zu niedrigeren Kosten ergeben.
  • Proteinhydrolysate in Produkten, die für Verbraucher mit nicht-medizinischem Bedarf bestimmt sind, zum Beispiel für Athleten oder Menschen, die sich einer Abnehmdiät unterziehen, müssen derart zugeschnitten sein, dass sie gute Geschmacksmerkmale bereitstellen. Unter diesen Umständen sind hohe Schmackhaftigkeit sowie physikochemische Aspekte, wie Löslichkeit unter sauren Bedingungen, von überragender Bedeutung. Produkte in dieser Kategorie, einschließlich angereicherter Fruchtsäfte und Sportgetränke, konzentrieren sich u. a. auf eine Glutamin- und Arginin-Anreicherung zur Verbesserung der Verbrauchergesundheit. Sportgetränke dienen zum Beispiel der Verstärkung der physischen Ausdauer und Erholung eines Athleten nach längerem hochintensivem Training. Glutamin-reiche Getreideproteinquellen, wie Weizengluten, oder Arginin-reiche Proteinquellen, wie Reisprotein und Sojaisolate, wurden als Alternativen zu Milchproteinen betrachtet, um den Anreicherungsbedarf saurer Gesundheitsprodukte zu erfüllen. Solche Getreideproteine, insbesondere Weizengluten, zeigen jedoch sehr schlechte Löslichkeiten bei saureren pH-Werten, d. h. solchen oberhalb von 4, was bedeutet, dass vollständig lösliche Glutenhydrolysate schwierig zu erhalten sind.
  • Aufgrund des negativen Einflusses auf die Produktkosten und die Qualität, der mit der Proteinhydrolyse einhergeht, sind in Veröffentlichungen des Standes der Technik mehrere Enzymgemische beschrieben, die auf die Verbesserung der Hydrolysatmerkmale und die Senkung der Produktionskosten abzielen. Beispiele sind u. a. EP 321 603 , das die Verwendung von aus Tieren stammenden Endoproteasen betrifft, wie Trypsin, Chymotrypsin und Pancreatin, und EP 325 986 und WO 96/13174 , welche die Verwendung von Endoproteasen bevorzugen, die aus Bacillus- oder Aspergillus-Spezies erhalten werden. Von mehreren Exoproteasen ist beschrieben, dass sie zum Entbittern von Gemischen von Peptiden in der Lage sind. Während EP 0 223 560 zum Beispiel die Verwendung einer spezifischen prolinspezifischen Endoprotease betrifft, betrifft WO 96/13174 ein Gemisch von Aminopeptidasen und Carboxypeptidasen für diesen Zweck.
  • Eine Reihe von Veröffentlichungen preist die nützlichen Wirkungen prolinspezifischer Endoproteasen in Kombination mit verschiedenen Exopeptidasen zur Herstellung von Proteinhydrolysaten, die vergleichsweise niedrige Bitterkeitsprofile haben. Zum Beispiel betrifft das japanische Patent JP02039896 die Verwendung einer prolinspezifischen Endoprotease, kombiniert mit einer Dipeptidyl-Carboxypeptidase, zum Erzeugen von Zubereitungen von Peptiden mit niedrigem Molekulargewicht. Der Abbau Prolin-reicher Oligopeptide durch drei prolinspezifische Peptidhydrolasen ist als wesentlich für die Beschleunigung der Käsereifung ohne Bitterkeit beschrieben (Journal of Dairy Science, 77 (2) 385–392 (1994)). Genauer gesagt, ist die entbitternde Wirkung von prolinspezifischer Endoprotease in Kombination mit einer Carboxypeptidase in JP5015314 beschrieben. JP5015314 beschreibt eine aus Aspergillus oryzae erhaltene rohe Enzymzubereitung, die neben einer allgemeinen unspezifischen proteolytischen Aktivität kleine Mengen einer prolinspezifischen Endoprotease- und Carboxypeptidaseaktivität zeigt. Laut JP5015314 verursachen Prolinreste an den Carboxytermini von Peptiden bittere Geschmäcke und sind nicht wünschenswert. Die Inkubation von Sojabohnenprotein mit einem Enzymgemisch aus prolinspezifischer Endoprotease und Carboxypeptidase ergab ein Hydrolysat, das signifikant weniger bitter war als ein Sojabohnenhydrolysat, das mit einer Proteasezubereitung ohne die Kombination einer prolinspezifischen Endoprotease und einer Carboxypeptidase erhalten wurde.
  • Zusammengenommen legt der Stand der Technik sehr stark nahe, dass eine Exopeptidase-vermittelte Freisetzung von carboxyterminalen (oder aminoterminalen) hydrophoben Aminosäureresten aus Peptiden für eine signifikante Entbitterung von Peptidhydrolysaten wesentlich ist. Ebenso lehren Bezugsstellen, die spezifisch prolinspezifische Endoproteasen für das Entbittern betreffen, dass es die Funktion dieser Aktivität ist, die hydrophoben Prolinreste freizulegen, um ihre anschließende Entfernung durch eine Carboxypeptidase zu ermöglichen. Die Implikation dieser Hypothese ist, dass die Entbitterungsaktivität prolinspezifischer Endoproteasen eher mit der effizienten Entfernung der carboxyterminalen Prolinreste als mit der Erzeugung von Peptiden, die solche carboxyterminalen Prolinreste tragen, verknüpft ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Proteinhydrolysat bereit, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden (%), die ein carboxyterminales Prolin tragen, mehr als zweimal höher ist als der Molenbruch (%) von Prolin in dem Proteinsubstrat, das zur Erzeugung des Hydrolysats verwendet wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch bereit:
    • – ein Molkehydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 8%, vorzugsweise mindestens 15%, stärker bevorzugt 30 bis 70% ist;
    • – ein Caseinhydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 30% und stärker bevorzugt weniger als 70% ist;
    • – ein Sojahydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 20%, vorzugsweise 30 bis 70% beträgt;
    • – ein Glutenhydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 30%, vorteilhafterweise weniger als 70% ist; und
    • – ein Gerstenhydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 30%, vorteilhafterweise weniger als 70% ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine prolinspezifische Endoprotease bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz mindestens 40% Aminosäuresequenzidentität mit den Aminosäuren 1 bis 526 der SEQ ID NR: 2 aufweist, oder einem Fragment davon; (b) einem Polypeptid, das von einem Polynukleotid codiert wird, das unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz hybridisiert mit (i) der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1 oder einem Fragment davon, das zu mindestens 80% oder 90% über 60, vorzugsweise über 100 Nukleotide identisch ist, stärker bevorzugt zu mindestens 90% über 200 Nukleotide identisch ist, oder (ii) einer Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID Nr: 1 komplementär ist,
    und ein DNA Molekül, das die Endopeptidase codiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch bereit:
    • – die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteinhydrolysats in einem Nahrungsmittel oder Getränk;
    • – die Verwendung einer erfindungsgemäßen prolinspezifischen Endoprotease;
    • – ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung eines Proteinhydrolysats aus einem Proteinsubstrat, wobei das Proteinsubstrat mit einer prolinspezifischen Endoprotease zur Herstellung eines Proteinhydrolysats inkubiert wird, das an Peptiden mit einem carboxyterminalen Prolin angereichert ist;
    • – eine Enzymzusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße prolinspezifische Endoprotease, wobei die Zusammensetzung zur Herstellung eines Proteinhydrolysats in der Lage ist, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch an Peptiden (%), die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens zweimal der Molenbruch (%) an Prolin in dem Protein oder einem erfindungsgemäßen Hydrolysat ist; und
    • – ein Nahrungsmittel, das ein erfindungsgemäßes Proteinhydrolysat umfasst oder durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich ist.
  • Eingehende Beschreibung der Erfindung
  • Wir haben gezeigt, dass ein hohes Auftreten von Prolinresten am carboxyterminalen Ende von Peptiden mit einer niedrigen Bitterkeit korreliert werden kann. Wir haben außerdem gezeigt, dass das gewünschte hohe Auftreten carboxyterminaler Prolinreste nur mit hohen Konzentrationen einer prolinspezifischen Endoprotease, d. h. Konzentrationen, welche die in JP5015314 spezifizierte Aktivität um mehrere Größenordnungen übertreffen, und außerdem in Abwesenheit einer Carboxypeptidase erzielt werden kann.
  • Unter einem ökonomischen Gesichtspunkt impliziert diese Beobachtung, dass ein deutlicher Bedarf an einem verbesserten Mittel zur Herstellung prolinspezifischer Endoproteasen in großen Mengen und vergleichsweise reiner Form besteht. Eine bevorzugte Weise, dies durchzuführen, ist über die Überproduktion einer solchen prolinspezifischen Endoprotease unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken. Weil viele Nahrungsmittelprodukte sauer sind und lang andauernde Enzyminkubationen unter industriellen, unsterilen Bedingungen saure Inkubationsbedingungen zur Verhinderung von mikrobieller Kontamination erfordern, ist eine stärker bevorzugte Weise, dies durchzuführen, über die Überproduktion einer säurebeständigen prolinspezifischen Endoprotease unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken. Eine besonders bevorzugte Weise, dies durchzuführen, ist über die Überproduktion einer aus Aspergillus stammenden prolinspezifischen Endoprotease, und eine an stärksten bevorzugte Weise, dies durchzuführen, ist über die Überproduktion einer aus Aspergillus niger stammenden prolinspezifischen Endopeptidase. Um den letzteren Weg zu ermöglichen, ist einzigartige Sequenzinformation von einer aus Aspergillus stammenden prolinspezifischen Endoprotease wesentlich. Stärker bevorzugt muss die gesamte Nukleotidsequenz des codierenden Gens verfügbar sein.
  • Sobald das neue Enzym in einer vergleichsweise reinen Form zur Verfügung gestellt wurde, werden weitere neue und überraschende Anwendungen in Betracht gezogen, die bestimmte technische und ökonomische Vorteile haben. Eine neue Anwendung wäre die Erzeugung nicht-bitterer Hydrolysate aus proteinhaltigen Substraten mit ungewöhnlichen Aminosäurezusammensetzungen. Solche ungewöhnlichen Aminosäurezusammensetzungen können erhebliche Vorteile bei bestimmten Nahrungsmittelanwendungen bieten. Beispiele sind Casein oder Weizengluten oder Maisproteinisolat mit hohen Spiegeln an vorhandenen hydrophoben Aminosäureresten. Bisher waren solche Substrate von keinem praktischen Nutzen aufgrund der abstoßenden bitteren Geschmäcke, die nach Hydrolyse unter Verwendung von Verfahren des Standes der Technik erzeugt wurden. Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Hydrolyseverfahren können neue, nicht-bittere Hydrolysate zur Verfügung gestellt werden, die in Säuglings- und klinischer Nahrung, in therapeutischen Diäten sowie in Verbraucherdiäten und Sporternährung verwendet werden können. Abgesehen von solchen neuen Hydrolysaten werden auch Anwendungen, welche die bitterkeitsverringernde Wirkung der sauren prolinspezifischen Endoproteasen als solche nutzen, in Betracht gezogen. Zum Beispiel das Einbringen der Endopeptidase in proteinhaltige Nahrungsmittelprodukte, bei denen ein Fermentationsschritt beteiligt ist, wie bei Käsen oder Jogurt, zur Unterdrückung der Bitterkeit, die sich nach Alterung entwickeln kann. Auch bei proteinhaltigen Nahrungsmittelprodukten, die eine Behandlung mit Proteasen erfordern, wie die Produktion von enzymmodifizierten Käsen oder die Produktion von Proteinhydrolysaten für die Geschmacksstoffindustrie, trägt das Einbringen des erfindungsgemäßen Enzyms zur Unterdrückung der Bitterkeit bei.
  • Außerdem werden auch Nutzen untersucht, die nicht direkt mit dem Unterdrücken bitterer Geschmäcke zusammenhängen. Eine solche neue Anwendung ist die Inkubation des Enzyms mit Nahrungsmittelproteinen zur Verringerung ihrer Allergenität. Mehrere Nahrungsmittelproteine enthalten hoch-allergene Unterfraktionen, wie Weizengluten, das Prolamine mit Prolin-reichen Peptidsequenzen enthält. Diese Proteine können dem neuen Enzym unterworfen werden, um ihre Antigenität zu lindern. Eine weitere neue Anwendung ist das Einbringen des Enzyms in alle Arten von Teigen, da beobachtet wurde, dass dies das altbacken Werden der erhaltenen Brote verzögert. Eine weitere neue Anwendung ist die Verwendung der prolinspezifischen Endoprotease zur Erzeugung Prolin-reicher Peptide. Solche Prolin-reichen Peptide sind wünschenswerte Zusatzstoffe zu verschiedenen Nahrungsmitteln oder Nutrazeutika-Produkten, weil sie für eine anorektische Wirkung, fibrinolytische und antithrombotische sowie antihypertonische Wirkungen, beim Schutz der Magenschleimhaut sowie bei der Verhinderung von rheumatoider Arthritis impliziert wurden.
  • Eine weitere überraschende Anwendung ist die Zugabe des neuen Enzyms zu Tierfutter, um die Proteinnutzung zu verbessern. Zum Beispiel führt die Zugabe des Enzyms zu verbesserter Verdaulichkeit von schwer verdaulichen, Prolin-reichen Sequenzen, die in dem Futterprotein vorhanden sind, sowie zu verbesserten Umwandlungsraten günstig erhältlicher pflanzlicher Proteine, die hohe Spiegel an Polyphenolen enthalten.
  • Bei noch einer weiteren neuen Anwendung wird das Enzym beim Bierbrauen verwendet. Gerstenproteine sind reich an Prolin-reichen Sequenzen, und Getreideproteine sind in ihrer nicht-gemälzten Form extrem schwierig in die freien Aminosäuren abbaubar, die zur Herstellung einer geeigneten fermentierbaren Stammwürze erforderlich sind. Ganz überraschend wurde gezeigt, dass das Einbringen des neuen Enzyms in das Maischverfahren die Aminosäurefreisetzung aus gemahlener, aber nicht gemälzter Gerste stimuliert, so dass eine viel reichhaltigere Stammwürze erhalten wird. In ähnlicher Weise kann die Bierfermentierung aus Maischen, die einen hohen Anteil an anderen billigen und örtlich erhältlichen Getreiden, wie zum Beispiel Sorghum, enthalten, verbessert werden.
  • Bei den meisten dieser neuen Anwendungen sollte die prolinspezifische Endoprotease vorzugsweise ein Aktivitätsspektrum mit einem sauren pH-Optimum zeigen.
  • Um die vorstehend genannten Probleme zu überwinden, zeigt die Erfindung, dass die Aktivität einer isolierten, gereinigten prolinspezifischen Endoprotease allein, d. h. ohne die erhebliche gleichzeitige oder anschließende Aktivität eines exoproteolytischen Enzyms, für die signifikante Entbitterung eines Proteinhydrolysats ausreicht. Daher kann die prolinspezifische Endoprotease mindestens 5 Einheiten pro Gramm Protein der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung, vorzugsweise 10 u/g, stärker bevorzugt 25 u/g und noch stärker bevorzugt 50 u/g umfassen. Außerdem zeigen erfindungsgemäß durchgeführte Studien, dass die Aktivität einer isolierten, gereinigten prolinspezifischen Endoprotease allein, d. h. ohne die gleichzeitige oder anschließende Aktivität eines exoproteolytischen Enzyms, zur signifikanten Verringerung des Gesamt-Immunogenitätsspiegels von Proteinhydrolysaten sowie zur signifikanten Erhöhung ihrer Gesamt-Löslichkeit unter sauren Bedingungen ausreicht. Die erfindungsgemäß hergestellten Hydrolysate sind an Peptiden mit einem carboxyterminalen Prolinrest angereichert.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Enzymgemisch bereit, umfassend eine isolierte, gereinigte prolinspezifische Endoprotease zur Produktion von Proteinhydrolysaten in einer hohen Ausbeute mit im Wesentlichen niedriger Bitterkeit und niedrigen allergenen Eigenschaften ohne die gleichzeitige Produktion erheblicher Spiegel an freien Aminosäuren. Dieses Enzymgemisch eignet sich zur Herstellung von Hydrolysaten von verschiedenen Proteinfraktionen. Insbesondere kann ein Proteinsubstrat, wie ein Milchprotein, mit einer isolierten, gereinigten prolinspezifischen Endoprotease und einem Subtilisin zur Herstellung eines Proteinhydrolysats inkubiert werden, das an Peptidfragmenten mit einem carboxyterminalen Prolin angereichert ist. Der Begriff "angereichert" soll bedeuten, dass mindestens 8% der Peptidfragmente in dem Hydrolysatprodukt der enzymatischen Spaltung einen carboxyterminalen Prolinrest besitzen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Proteinhydrolysat bereit, das durch Hydrolyse eines Proteins erhalten wird, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden (%), die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens zweimal der Molenbruch (%) von Prolin in dem zur Herstellung des Hydrolysats verwendeten Proteinsubstrat ist.
  • Die durchschnittliche Länge der Peptide in den Hydrolysaten beträgt gewöhnlich von 3 bis 9 Aminosäuren.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Hydrolysate sind: ein Molkehydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 8%, vorzugsweise mindestens 15%, stärker bevorzugt von 30 bis 70% beträgt, ein Caseinhydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 25%, vorzugsweise von 30 bis 70% beträgt, und ein Sojahydrolysat, das Peptide umfasst, wobei der Molenbruch von Peptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, mindestens 20%, vorzugsweise von 30 bis 70% beträgt.
  • Unter Peptiden oder Peptidfragmenten werden Peptide mit Molekülmassen von 400 bis 2000 Dalton verstanden. Diese Peptide können gemäß der LC/MC-Analyse, wie im Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschrieben, analysiert werden.
  • Im Allgemeinen wird bei der Produktion der erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate das Proteinsubstrat im Wesentlichen hydrolysiert, vorteilhafterweise zu mindestens 50%. Vorzugsweise werden mindestens 10% des Proteinsubstrats in Peptide mit Molekülmassen von 400 bis 2000 Dalton umgewandelt. Stärker bevorzugt werden von 20 bis 90% und noch stärker bevorzugt von 30 bis 80% des Proteinsubstrats in solche Peptide umgewandelt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann ein Proteinsubstrat mit einem Enzymgemisch, umfassend eine isolierte, gereinigte prolinspezifische Endoprotease, eine Serin-Endoprotease oder eine Metallo-Endoprotease und eine Carboxypeptidase, zur Herstellung eines Proteinhydrolysats inkubiert werden, das an Peptidfragmenten mit einem carboxyterminalen Prolin angereichert ist.
  • Das erfindungsgemäße Enzymgemisch ist insbesondere geeignet für die Verwendung zur Produktion von Proteinhydrolysaten, die zum Aromatisieren und zur Nährstoffanreicherung von Sportgetränken und Getränken auf Saftbasis bestimmt sind, weil das erhaltene hydrolysierte Peptidgemisch ein sehr niedriges Bitterkeitsprofil mit ausgezeichneter Löslichkeit unter den vorherrschenden sauren Bedingungen solcher Getränke vereinigt. Das erfindungsgemäße Enzymgemisch ist dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Endoprotease, zum Beispiel eine Serinprotease oder eine Metallo-Endoprotease, in Verbindung mit einer prolinspezifischen Endoprotease (E. C. 3.4.21.26) zur Bereitstellung eines Primärhydrolysats enthält. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung eine isolierte, gereinigte prolinspezifische Endoprotease und ein Serinprotease- oder Metalloprotease-Enzymgemisch, das zur Herstellung eines Proteinhydrolysats in der Lage ist, das Peptidfragmente umfasst, wobei mindestens 8%, vorzugsweise mindestens 15%, stärker bevorzugt von 30 bis 70% der Peptidfragmente ein carboxyterminales Prolin besitzen.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Proteinhydrolysat, angereichert mit einem vergleichsweise hohen Gehalt an Peptiden mit Prolin als carboxyterminalem Aminosäurerest. Solche angereicherten Hydrolysate können mindestens 8%, vorzugsweise mindestens 15%, stärker bevorzugt von 30 bis 70% Peptidfragmente mit einem carboxyterminalen Prolinrest umfassen. Weil Enzymzubereitungen, die üblicherweise zur Erzeugung von Proteinhydrolysaten verwendet werden, nicht in der Lage sind, Peptide mit Prolinresten an den Carboxytermini herzustellen, sind Proteinhydrolysate, die vergleichsweise reich an solchen Peptiden sind, neu.
  • Substrate für die Hydrolyse durch ein erfindungsgemäßes Enzymgemisch beinhalten Vollmilch, Magermilch, Säurecasein, Labcasein, saure Molkeprodukte oder Käsemolkeprodukte. Ganz überraschenderweise spaltet die aus Aspergillus stammende prolinspezifische Endoprotease nicht nur auf der carboxyterminalen Seite von Prolinresten, sondern auch auf der carboxyterminalen Seite von Hydroxyprolinresten, was andere, auf Kollagen basierende Tierproteine, wie Gelatine, sowie Knochen oder Fischgräten, die verbleibendes Fleisch enthalten, zu interessanten Substraten für das Enzym macht. Außerdem sind pflanzliche Substrate, wie Weizengluten, gemahlene Gerste und Proteinfraktionen, die zum Beispiel aus Soja, Reis oder Mais erhalten werden, geeignete Substrate. Erfindungsgemäß hergestellte Milchproteinhydrolysate können mit oder ohne zusätzliche Filtrations- oder Reinigungsschritte in verschiedenen Spezialnahrungsmitteln verwendet werden, wie hypoallergenen Hydrolysaten zur Säuglingsernährung, basischen Hydrolysaten für die enterische und dietätische Ernährung sowie Proteinkonzentraten für verschiedene Formen von Gesundheitsnahrungsmitteln. Somit können erfindungsgemäße Proteinhydrolysate zur Herstellung von Nahrungsmitteln mit niedriger Antigenität, wie Säuglingsformulierung, verwendet werden. Außerdem können erfindungsgemäße Enzymzubereitungen zur Verringerung der Bitterkeit in Nahrungsmitteln verwendet werden, die durch mindestens ein Proteinhydrolysat aromatisiert sind, sogar wenn das Proteinhydrolysat in großen Mengen vorhanden ist. Zum Beispiel können Nahrungsmittel zwischen 5% und 10% (w/v) eines Proteinhydrolysats umfassen, und ihre Bitterkeit kann immer noch unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Enzymzubereitung verringert worden sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte, gereinigte prolinspezifische Endoprotease mit einem sauren pH-Optimum allein oder in einer Zusammensetzung, umfassend ein oder mehrere zusätzliche Enzyme, zur Herstellung eines Proteinhydrolysats für verschiedene Nahrungsmittelanwendungen bereit. Eine solche isolierte, gereinigte prolinspezifische Endoprotease ist dadurch definiert, dass sie mindestens 10 Einheiten einer prolinspezifischen Endoproteaseaktivität pro Gramm des proteinhaltigen Materials besitzt. Diese Einheiten sollten gemessen werden unter Verwendung des synthetischen Peptids Z-Gly-Pro-pNA bei 37 Grad C und pH 5, falls das pH-Optimum der prolinspezifischen Endoprotease kleiner als pH 6 ist, zum Beispiel im Fall der prolinspezifischen Endoprotease aus Aspergillus niger, oder die Einheiten sollten anderweitig bei pH = 7 gemessen werden, wie im Abschnitt Materialien und Verfahren ausgeführt. Dieses isolierte, gereinigte Enzym überwindet, allein oder in einen Enzymgemisch, eine Reihe von Nachteilen von Enzymgemischen, die bereits im Stand der Technik bekannt sind. Am bedeutsamsten ist, dass die erfindungsgemäße isolierte, gereinigte prolinspezifische Endoprotease ein Schlüsselenzym bei der Produktion von Hydrolysaten ist, die ein niedriges allergenes Potenzial, eine hohe Ausbeute und ein niedriges Bitterkeitsprofil vereinigen. Außerdem sind die Hydrolysate, die mit der isolierten, gereinigten prolinspezifischen Endoprotease oder einem Enzymgemisch, das diese prolinspezifische Endoprotease umfasst, hergestellt werden, säurebeständig und enthalten sehr niedrige Spiegel an freien Aminosäuren, so dass minimale Beigeschmäcke während der Erwärmungsschritte, wie Sprühtrocknen oder Produktsterilisation, erzeugt werden. Erfindungsgemäße Hydrolysate enthalten weniger als 900 Mikromol an freien Aminosäuren pro Gramm trockenem Pulver, vorzugsweise weniger als 300 Mikromol an freien Aminosäuren pro Gramm trockenem Pulver, stärker bevorzugt weniger als 150 Mikromol an freien Aminosäuren pro Gramm trockenem Pulver und sogar noch stärker bevorzugt weniger als 50 Mikromol pro Gramm trockenem Pulver.
  • Das erfindungsgemäße Enzymgemisch ist dadurch gekennzeichnet, dass es eine weitere Endoprotease, wie eine Serinprotease oder eine Metallo-Endoprotease, in Verbindung mit einer isolierten, gereinigten prolinspezifischen Endoprotease (E. C. 3.4.21.26) umfasst, die zusammen wirken, um ein primäres Proteinhydrolysat bereitzustellen.
  • Serinproteasen stellen eine gut bekannte Klasse von alkalischen Endoproteasen dar, und einige ihrer wichtigsten Mitglieder, wie Subtilisin (E. C. 3.4.21.62) und Chymotrypsin (E. C. 3.4.21.1), spalten die Peptidkette bevorzugt auf der carboxyterminalen Seite hydrophober Aminosäuren, wie Tyr, Trp, Phe und Leu. Das erfindungsgemäße Enzymgemisch kann Chymotrypsin und/oder Subtilisin enthalten. Subtilisin wird durch Spezies von Bacillus hergestellt, hat eine besonders breite Substratspezifität und ein breites alkalisches pH-Optimum. Das Enzym ist optimalerweise zwischen 50°C und 60°C aktiv. Das Enzym ist als reguläres kommerzielles Produkt günstig erhältlich und zum Beispiel für die Produktion verschiedener Milchhydrolysate geeignet. Chymotrypsin kann aus Tierpankreas erhalten werden, hat eine etwas schmalere Substratspezifität bei leicht alkalischeren pH-Werten als Subtilisin und ist optimalerweise unterhalb von 50 Grad C aktiv.
  • Die Klasse der Metallo-Endoproteasen ist in Bakterien, Pilzen und höheren Organismen weit verbreitet. Sie können in die neutralen und die sauren Metalloproteasen aufgeteilt werden. Von diesen beiden Unterklassen zeigen nur die neutralen Proteasen die gewünschte Spaltungspräferenz, d. h. Spaltung der Peptidkette auf der carboxyterminalen Seite hydrophober Aminosäurereste, wie Phe und Leu. Bekannte Vertreter der Kategorie der neutralen Metalloproteasen sind Bacillolysin (E. C. 3.4.24.28) und Thermolysin (E. C. 3.4.24.27), und jede oder beide können in dem erfindungsgemäßen Enzymgemisch vorhanden sein. Beide Enzyme werden aus Bacillus-Spezies erhalten und zeigen maximale Aktivität unter neutralen oder leicht alkalischen Bedingungen. Weniger gut bekannte Vertreter dieser neutralen Metallo-Endoproteasen hat man aus Aspergillus-Spezies erhalten. In Fällen, in denen die prolinspezifische Endoprotease nicht aufgrund ihrer entbitternden Wirkungen, sondern zur Unterstützung der Hydrolyse Prolin-reicher Proteinsequenzen verwendet wird, können Kombinationen mit der Klasse der sauren Metalloproteasen, wie zum Beispiel Deuterolysin (E. C. 3.4.24.39), vorteilhaft sein.
  • Eine prolinspezifische Endoprotease ist eine Endoprotease, die in der Lage ist, Peptide oder Polypeptide am carboxyterminalen Ende von Prolinresten zu spalten. Solche Enzyme findet man weit verbreitet in Tieren und Pflanzen, aber ihr Vorhandensein in Mikroorganismen scheint beschränkt zu sein. Bis heute hat man prolinspezifische Endoprotease in Spezies von Aspergillus ( EP 0 522 428 ), Flavobacterium ( EP 0 967 285 ) und Aeromonas (J. Biochem. 113, 790–796), Xanthomonas und Bacteroides identifiziert. Obwohl die prolinspezifischen Enzyme aus den meisten dieser Organismen um pH 8 aktiv sind, ist das Aspergillus-Enzym um pH 5 optimal aktiv. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird prolinspezifische Endoprotease mit einem pH-Optimum unterhalb von 7, vorzugsweise mit einem pH-Optimum von 3,5 bis 6,5, aufgrund der technischen und ökonomischen Vorteile solcher Enzyme verwendet. Die erfindungsgemäße prolinspezifische Endoprotease kann aus einer der vorstehend genannten mikrobiellen Spezies, insbesondere aus einer Aspergillus-Spezies, isoliert werden. Vorzugsweise wird die prolinspezifische Endoprotease aus einem Stamm von Aspergillus niger isoliert. Stärker bevorzugt wird die prolinspezifische Endoprotease aus einem Aspergillusniger-Wirt isoliert, der gentechnisch derart verändert ist, dass er ein Gen überexprimiert, das für eine prolinspezifische Endoprotease codiert, obwohl andere Wirte, wie E. coli, geeignete Expressionsvektoren sind. Zum Beispiel hat die Klonierung und Überproduktion der aus Flavobacterium stammenden prolinspezifischen Endoprotease u. a. in E. coli bestimmte prolinspezifische Endoproteasen in einer reinen Form verfügbar gemacht. Ein Beispiel für ein derartiges überproduzierendes Konstrukt wird im World Journal of Microbiology & Biotechnology, Bd. 11, S. 209–212 bereitgestellt. Ein Aspergillus-niger-Wirt wird vorzugsweise zur Herstellung eines nicht-rekombinanten Selbstkonstrukts verwendet, das A.-niger-Promotoren zum Antreiben der Expression eines Gens nutzt, das für eine prolinspezifische Endoprotease von A. niger codiert.
  • Die meisten wissenschaftlichen Veröffentlichungen hinsichtlich der Klonierung und Produktion von prolinspezifischen Endoproteasen konzentrieren sich auf die Rolle dieses Enzyms bei der Synthese und Regulation biologisch aktiver Proteine. Veröffentlichungen, die dieses Enzym bei der Produktion geeigneter Proteinhydrolysate implizieren, sind selten und betreffen die Verwendung des Enzyms in Verbindung mit einer Exoprotease. Mehrere japanische Veröffentlichungen betreffen das Vorliegen von prolinspezifischer endoproteolytischer Aktivität in rohen und komplexen Enzymgemischen, die zur Herstellung von Hydrolysaten mit niedrigen Bitterkeitsprofilen in der Lage sind, aber die verwendeten Enzymgemische enthalten immer Exoproteasen. Keine direkte Verbindung zwischen Entbittern und prolinspezifischer endoproteolytischer Aktivität in Abwesenheit von Exoproteasen, wie Carboxypeptidasen oder Aminopeptidasen, wird im Stand der Technik vorgeschlagen. Außerdem sind im Stand der Technik keine Daten beschrieben, die Hydrolysate, die unter Verwendung einer prolinspezifischen endoproteolytischen Aktivität hergestellt wurden, mit einer verringerten immunogenen Reaktion oder einer verbesserten Säurelöslichkeit in Verbindung bringen.
  • Ein erfindungsgemäßes Polypeptid, das eine prolinspezifische Endoprotease aufweist, kann in einer isolierten Form vorliegen. Wie hier definiert, ist ein isoliertes Polypeptid ein endogen hergestelltes oder ein rekombinantes Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen, nicht-prolinspezifischen Endoprotease-Polypeptiden ist und üblicherweise zu mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise zu mindestens etwa 40% rein, stärker bevorzugt zu mindestens etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt zu mindestens etwa 80% rein, noch stärker bevorzugt zu etwa 90% rein und am stärksten bevorzugt zu etwa 95% rein ist, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Das Polypeptid kann durch Zentrifugation und chromatographische Verfahren oder eine beliebige andere Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, zur Gewinnung reiner Proteine aus rohen Lösungen isoliert werden. Selbstverständlich kann das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden, die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht behindern, und somit wird das Polypeptid in dieser Form immer noch als isoliert angesehen. Gewöhnlich umfasst sie das Polypeptid in einer Zubereitung, wobei mehr als 20%, zum Beispiel mehr als 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% oder 99%, bezogen auf das Gewicht, der Proteine in der Zubereitung ein erfindungsgemäßes Polypeptid sind.
  • Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polypeptid aus einem Mikroorganismus erhältlich, der ein Gen besitzt, das für ein Enzym mit prolinspezifischer Endoproteaseaktivität codiert. Stärker bevorzugt ist der Mikroorganismus ein Pilz und optimalerweise ein filamentöser Pilz. Bevorzugte Organismen sind somit aus der Gattung Aspergillus, wie diejenigen der Spezies Aspergillus niger.
  • Bei einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bereit, die einen Grad der Aminosäuresequenzidentität mit den Aminosäuren 1 bis 526 der SEQ ID NR: 2 (d. h. dem Polypeptid) von mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90%, stärker bevorzugt mindestens etwa 95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 97% hat und das eine prolinspezifische Endoproteaseaktivität hat.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der Grad der Identität zwischen zwei oder mehr Aminosäuresequenzen mit dem BLAST-P-Protein-Datenbank-Suchprogramm (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389–3402) mit der Blosum-62-Matrix und einer erwarteten Schwelle von 10 bestimmt.
  • Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann die in SEQ ID NR: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine im Wesentlichen homologe Sequenz oder ein Fragment von jeder Sequenz mit prolinspezifischer Endoproteaseaktivität umfassen. Im Allgemeinen ist die in SEQ ID NR: 2 gezeigte, natürlich vorkommende Aminosäuresequenz bevorzugt.
  • Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch eine natürlich vorkommende Variante oder ein Spezieshomologon des Polypeptids der SEQ ID NR: 2 umfassen.
  • Eine Variante ist ein Polypeptid, das natürlicherweise zum Beispiel in Pilz-, Bakterien-, Hefe- oder Pflanzenzellen vorkommt, wobei die Variante prolinspezifische Endoproteaseaktivität und eine im Wesentlichen zu dem Protein der SEQ ID NR: 2 ähnliche Sequenz hat. Der Begriff "Varianten" betrifft Polypeptide, die den gleichen wesentlichen Charakter oder die gleiche grundlegende biologische Funktionalität haben wie die prolinspezifische Endoprotease der SEQ ID NR: 2, und beinhaltet allelische Varianten. Der wesentliche Charakter der prolinspezifischen Endoprotease der SEQ ID NR: 2 ist, dass sie ein Enzym ist, das in der Lage ist, die aminoterminale Aminosäure von einem Protein oder (Poly)Peptid abzuspalten. Vorzugsweise hat ein Variantenpolypeptid mindestens den gleichen Spiegel der prolinspezifischen Endoproteaseaktivität wie das Polypeptid der SEQ ID NR: 2. Varianten beinhalten allelische Varianten entweder aus dem gleichen Stamm wie das Polypeptid der SEQ ID NR: 2 oder aus einem anderen Stamm der gleichen Gattung oder Spezies.
  • Ebenso ist ein Spezieshomologon des erfindungsgemäßen Proteins ein äquivalentes Protein mit ähnlicher Sequenz, das eine prolinspezifische Endoprotease ist und in einer anderen Spezies von Aspergillus natürlich vorkommt.
  • Varianten und Spezieshomologa können unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren, die zur Isolation des Polypeptids der SEQ ID NR: 2 verwendet wurden, und Durchführen solcher Verfahren an einer geeigneten Zellquelle, zum Beispiel einer Bakterien-, Hefe-, Pilz- oder Pflanzenzelle, isoliert werden. Ebenfalls möglich ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Sonde zum Sondieren von Banken, die aus Hefe-, Bakterien-, Pilz- oder Pflanzenzellen hergestellt wurden, um Klone zu erhalten, die Varianten oder Spezieshomologa des Polypeptids der SEQ ID NR: 2 exprimieren. Diese Klone können durch herkömmliche Techniken manipuliert werden, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid herzustellen, das anschließend durch an sich bekannte rekombinante oder synthetische Techniken produziert werden kann.
  • Die Sequenz des Polypeptids der SEQ ID NR: 2 und von Varianten und Spezieshomologa kann auch modifiziert werden, um erfindungsgemäße Polypeptide bereitzustellen. Aminosäuresubstitutionen können vorgenommen werden, zum Beispiel von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen. Die gleiche Anzahl an Deletionen und Insertionen kann ebenfalls vorgenommen werden. Diese Veränderungen können außerhalb von Regionen vorgenommen werden, die für die Funktion des Polypeptids wichtig sind, weil ein derart modifiziertes Polypeptid seine prolinspezifische Endoproteaseaktivität beibehält.
  • Erfindungsgemäße Polypeptide beinhalten Fragmente der vorstehend genannten Volllängen-Polypeptide und von Varianten davon, einschließlich Fragmente der in SEQ ID NR: 2 dargestellten Sequenz. Solche Fragmente behalten üblicherweise ihre Aktivität als prolinspezifische Endoprotease. Fragmente können mindestens 50, 100 oder 200 Aminosäuren lang oder diese Anzahl von Aminosäuren kürzer sein als die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Volllängensequenz.
  • Erfindungsgemäße Polypeptide können, wenn nötig, durch synthetische Mittel hergestellt werden, obwohl sie gewöhnlich rekombinant hergestellt werden, wie nachstehend beschrieben. Synthetische Polypeptide können modifiziert werden, zum Beispiel durch die Addition von Histidinresten oder einer T7-Markierung, um ihre Identifikation oder Reinigung zu unterstützen, oder durch Addition einer Signalsequenz, um ihre Sekretion aus einer Zelle zu fördern.
  • Somit können die Variantensequenzen diejenigen umfassen, die aus anderen Stämmen von Aspergillus stammen als der Stamm, aus dem das Polypeptid der SEQ ID NR: 2 isoliert wurde. Varianten können aus anderen Aspergillus-Stämmen durch Suche nach prolinspezifischer Endoproteaseaktivität und Klonierung und Sequenzierung, wie hier beschrieben, identifiziert werden. Varianten können die Deletion, Modifikation oder Addition einzelner Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren innerhalb der Proteinsequenz beinhalten, solange das Peptid die grundlegende biologische Funktionalität der prolinspezifischen Endoprotease der SEQ ID NR: 2 beibehält.
  • Aminosäuresubstitutionen können zum Beispiel von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen vorgenommen werden. Das modifizierte Polypeptid behält gewöhnlich die Aktivität als prolinspezifische Endoprotease bei. Konservative Substitutionen können vorgenommen werden; solche Substitutionen sind im Stand der Technik bekannt. Vorzugsweise beeinflussen Substitutionen nicht die Faltung oder Aktivität des Polypeptids.
  • Kürzere Polypeptidsequenzen liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Zum Beispiel wird von einem Peptid mit einer Länge von mindestens 50 Aminosäuren oder bis zu 60, 70, 80, 100, 150 oder 200 Aminosäuren angenommen, dass es in den Umfang der Erfindung fällt, solange es die grundlegende biologische Funktionalität der prolinspezifischen Endoprotease der SEQ ID NR: 2 aufweist. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, umfasst dieser Aspekt der Erfindung die Situation, in der das Protein ein Fragment der vollständigen Proteinsequenz ist.
  • Der Begriff "zur Hybridisierung in der Lage" bedeutet, dass das erfindungsgemäße Ziel-Polynukleotid an die Nukleinsäure, die als Sonde verwendet wird, (zum Beispiel die in SEQ ID NR: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder ein Fragment davon oder das Komplement der SEQ ID NR: 1) in einem signifikant über dem Hintergrund liegenden Spiegel hybridisieren kann. Die Erfindung beinhaltet auch die Polynukleotide, welche die erfindungsgemäße prolinspezifische Endoprotease codieren, sowie Nukleotidsequenzen, die komplementär dazu sind. Die Nukleotidsequenz kann RNA oder DNA sein, einschließlich genomischer DNA, synthetischer DNA oder cDNA. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz DNA und am stärksten bevorzugt eine genomische DNA-Sequenz. Üblicherweise umfasst ein erfindungsgemäßes Polynukleotid eine zusammenhängende Sequenz von Nukleotiden, die in der Lage sind, unter selektiven Bedingungen an die codierende Sequenz oder das Komplement der codierenden Sequenz der SEQ ID NR: 1 zu hybridisieren. Solche Nukleotide können gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren synthetisiert werden.
  • Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann an die codierende Sequenz oder das Komplement der codierenden Sequenz der SEQ ID NR: 1 in einem Spiegel signifikant über dem Hintergrund hybridisieren. Hintergrundhybridisierung kann zum Beispiel aufgrund anderer cDNAs auftreten, die in einer cDNA-Bank vorhanden sind. Der durch die Wechselwirkung zwischen einem erfindungsgemäßen Polynukleotid und der codierenden Sequenz oder dem Komplement der codierenden Sequenz der SEQ ID NR: 1 erzeugte Signalspiegel ist üblicherweise mindestens 10-fach, vorzugsweise mindestens 20-fach, stärker bevorzugt mindestens 50-fach und noch stärker bevorzugt mindestens 100-fach so intensiv wie Wechselwirkungen zwischen anderen Polynukleotiden und der codierenden Sequenz der SEQ ID NR: 1. Die Intensität der Wechselwirkung kann zum Beispiel durch radioaktive Markierung der Sonde, zum Beispiel mit 32P, gemessen werden. Eine selektive Hybridisierung kann üblicherweise unter Verwendung von Bedingungen einer niedrigen Stringenz (0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 40°C), mittleren Stringenz (zum Beispiel 0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C) oder hohen Stringenz (zum Beispiel 0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 60°C) erzielt werden.
  • Modifikationen
  • Erfindungsgemäße Polynukleotide können DNA oder RNA umfassen. Sie können einzel- oder doppelsträngig sein. Sie können auch Polynukleotide sein, die in sich synthetische oder modifizierte Nukleotide beinhalten, einschließlich Peptid-Nukleinsäuren. Ein Reihe verschiedener Arten von Modifikationen an Polynukleotiden ist im Stand der Technik bekannt. Diese beinhalten ein Methylphosphonat- und Phosphorthioat-Grundgerüst und die Addition von Acridin- oder Polylysinketten an den 3'- und/oder 5'-Enden des Moleküls. Es sollte selbstverständlich sein, dass für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die hier beschriebenen Polynukleotide durch ein beliebiges, im Stand der Technik verfügbares Verfahren modifiziert werden können.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass der Fachmann unter Verwendung von Routinetechniken Nukleotidsubstitutionen vornehmen kann, welche die durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide codierte Polypeptidsequenz nicht beeinflussen, um die Codonnutzung eines bestimmten Wirtsorganismus, in dem die erfindungsgemäßen Polypeptide exprimiert werden sollen, widerzuspiegeln.
  • Die codierende Sequenz der SEQ ID NR: 1 kann durch Nukleotidsubstitutionen, zum Beispiel von 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen, modifiziert werden. Das Polynukleotid der SEQ ID NR: 1 kann alternativ oder zusätzlich durch eine oder mehrere Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch eine Verlängerung an einem oder beiden Enden modifiziert werden. Das modifizierte Polynukleotid codiert gewöhnlich ein Polypeptid, das prolinspezifische Endoproteaseaktivität hat. Degenerierte Substitutionen und/oder Substitutionen, die zu einer konservativen Aminosäuresubstitution führen, wenn die modifizierte Sequenz translatiert wird, wie zum Beispiel später in Bezug auf Polypeptide erläutert, können vorgenommen werden.
  • Homologa
  • Eine Nukleotidsequenz, die in der Lage ist, selektiv an das Komplement der codierenden DNA-Sequenz der SEQ ID NR: 1 zu hybridisieren, ist in die Erfindung eingeschlossen und hat gewöhnlich mindestens 50% oder 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 98% oder mindestens 99% Sequenzidentität mit der codierenden Sequenz der SEQ ID NR: 1 über eine Region von mindestens 60, vorzugsweise mindestens 100, stärker bevorzugt mindestens 200 aufeinander folgenden Nukleotiden oder am stärksten bevorzugt über die volle Länge der SEQ ID NR: 1. Ebenso ist auch ein Nukleotid, das eine aktive prolinspezifische Endoprotease codiert und in der Lage ist, an ein Fragment von einem Komplement der codierenden DNA-Sequenz der SEQ ID NR: 1 selektiv zu hybridisieren, von der Erfindung umfasst. Ein C-terminales Fragment der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NR: 1, das mindestens 80% oder 90% über 60, vorzugsweise über 100 Nukleotide identisch ist, stärker bevorzugt mindestens 90% über 200 Nukleotide identisch ist, wird von der Erfindung umfasst.
  • Jede Kombination der oben genannten Grade an Identität und Mindestgrößen kann zur Definition erfindungsgemäßer Polynukleotide verwendet werden, wobei die stringenteren Kombinationen (d. h. höhere Identität über größere Längen) bevorzugt sind. Somit bildet zum Beispiel ein Polynukleotid, das mindestens 80% oder 90% über 60, vorzugsweise über 100 Nukleotide identisch ist, einen Aspekt der Erfindung sowie auch ein Polynukleotid, das mindestens 90% über 200 Nukleotide identisch ist.
  • Das UWGCG-Packet stellt das BESTFIT-Programn bereit, das zum Berechnen der Identität verwendet werden kann (wird es zum Beispiel in seinen Standard-Einstellungen verwendet).
  • Die PILEUP- und BLAST-N-Algorithmen können ebenfalls zum Berechnen von Sequenzidentität oder zum Ausrichten von Sequenzen aneinander verwendet werden (beispielsweise zum Identifizieren äquivalenter oder entsprechender Sequenzen, zum Beispiel in ihren Standard-Einstellungen).
  • Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist durch das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nim.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst das Identifizieren eines Sequenzpaars mit hoher Bewertung (high scoring pair, HSP) durch Identifizieren kurzer Wörter der Länge W in der abgefragten Sequenz, die entweder übereinstimmen oder eine Schwellenbewertung T mit positivem Wert erfüllen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet werden. T wird als die Nachbarschaftswort-Bewertungsschwelle bezeichnet. Diese anfänglichen Nachbarschaftswort-Treffer wirken als Keime zur Einleitung von Suchen, um HSP zu finden, die sie enthalten. Die Wort-Treffer werden in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit ausgeweitet, wie die kumulative Alignment-Bewertung erhöht werden kann. Ausweitungen der Wort-Treffer in jeder Richtung werden angehalten, wenn: die kumulative Alignment-Bewertung um die Menge X von ihrem erzielten Maximalwert abfällt; die kumulative Bewertung aufgrund der Akkumulation von Alignments von einem oder mehreren Resten mit negativer Bewertung auf Null oder darunter geht; oder das Ende einer der Sequenzen erreicht ist. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Sensitivität und Geschwindigkeit des Alignment. Das BLAST-Programm verwendet als Standard-Einstellung eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Bewertungsmatrix-Alignments (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
  • Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch. Ein durch den BLAST-Algorithmus bereitgestelltes Maß für Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen durch Zufall auftritt. Zum Beispiel wird eine Sequenz als ähnlich zu einer anderen Sequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im Vergleich der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz kleiner als etwa 1, vorzugsweise kleiner als etwa 0,1, stärker bevorzugt kleiner als etwa 0,01 und am stärksten bevorzugt kleiner als etwa 0,001 ist.
  • Primer und Sonden
  • Erfindungsgemäße Polynukleotide beinhalten Primer und können als diese verwendet werden, zum Beispiel als Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Primer, als Primer für alternative Amplifikationsreaktionen oder als Sonden, die zum Beispiel durch herkömmlich Mittel unter Verwendung radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierungen mit einer enthüllenden Markierung markiert werden, oder die Polynukleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente haben eine Länge von mindestens 15, zum Beispiel mindestens 20, 25, 30 oder 40 Nukleotiden. Sie haben üblicherweise eine Länge von bis zu 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 oder 300 Nukleotiden oder sind sogar nur wenige Nukleotide (wie 5 oder 10 Nukleotide) kürzer als die codierende Sequenz der SEQ ID NR: 1.
  • Im Allgemeinen werden Primer durch synthetische Mittel hergestellt, die eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz jeweils eines Nukleotids nach dem anderen beinhalten. Techniken, um dies unter Verwendung automatisierter Protokolle zu erzielen, sind im Stand der Technik leicht erhältlich. Längere Polynukleotide werden gewöhnlich unter Verwendung rekombinanter Mittel, zum Beispiel unter Verwendung von PCR-Klonierungstechniken, hergestellt. Dies beinhaltet die Herstellung eines Paars von Primern (üblicherweise mit etwa 15–30 Nukleotiden), um die gewünschte Region der prolinspezifischen Endoprotease, die kloniert werden soll, zu amplifizieren, indem der Primer mit mRNA, cDNA oder genomischer DNA in Kontakt gebracht wird, die aus einer Hefe-, Bakterien-, Pflanzen-, prokaryotischen oder Pilzzelle, vorzugsweise aus einem Aspergillus-Stamm, erhalten wurde, eine Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen durchgeführt wird, die zur Amplifikation der gewünschten Region geeignet sind, das amplifizierte Fragment (z. B. durch Reinigung des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) isoliert und die amplifizierte DNA gewonnen wird. Die Primer können derart gestaltet werden, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
  • Solche Techniken können dazu verwendet werden, alle oder einen Teil der Polynukleotide zu erhalten, die für die hier beschriebenen prolinspezifischen Endoproteasesequenzen codieren. Introns, Promotor- und Folgeregionen liegen im Umfang der Erfindung und können auch auf analoge Weise (z. B. durch rekombinante Mittel, PCR oder Klonierungstechniken) erhalten werden, wobei von der genomischen DNA aus einer Pilz-, Hefe-, Bakterien-, Pflanzen oder prokaryotischen Zelle ausgegangen wird.
  • Die Polynukleotide oder Primer können eine enthüllende Markierung tragen. Geeignete Markierungen beinhalten Radioisotope, wie 32p oder 35S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie Biotin. Solche Markierungen können an die erfindungsgemäßen Polynukleotide oder Primer angefügt und unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, nachgewiesen werden.
  • Markierte oder unmarkierte Polynukleotide oder Primer (oder Fragmente davon) können in Tests auf Nukleinsäurebasis zum Nachweis oder zur Sequenzierung einer prolinspezifischen Endoprotease oder einer Variante davon in einer Pilzprobe verwendet werden. Solche Nachweistests umfassen gewöhnlich das In-Kontakt-bringen einer Pilzprobe, von der angenommen wird, dass sie die DNA von Interesse enthält, mit einer Sonde, umfassend ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder einen erfindungsgemäßen Primer, unter Hybridisierungsbedingungen und Nachweisen eines beliebigen Duplex, der zwischen der Sonde und Nukleinsäure in der Probe gebildet wurde. Der Nachweis kann unter Verwendung von Techniken erzielt werden, wie PCR oder durch Immobilisieren der Sonde an einem festen Träger, Entfernen jeglicher Nukleinsäure in der Probe, die nicht an die Sonde hybridisiert hat, und dann Nachweisen jeder Nukleinsäure, die an die Sonde hybridisiert hat. Alternativ kann die Probennukleinsäure an einen festen Träger immobilisiert werden, die Sonde hybridisiert und die Menge der Sonde, die an einen solchen Träger gebunden hat, nach Entfernung jeglicher ungebundener Sonde nachgewiesen werden.
  • Die erfindungsgemäßen Sonden können geeigneterweise in Form eines Testkits in einem geeigneten Behälter verpackt werden. In solchen Kits kann die Sonde an einen festen Träger gebunden sein, wenn das Assayformat, für welches das Kit gestaltet worden ist, eine solche Bindung erfordert. Das Kit kann auch geeignete Reagenzien zur Behandlung der Probe, die sondiert werden soll, zur Hybridisierung der Sonde an die Nukleinsäure in der Probe, Kontrollreagenzien, Anleitungen und dergleichen enthalten. Die erfindungsgemäßen Sonden und Polynukleotide können auch in einem Mikroassay verwendet werden.
  • Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polynukleotid aus dem gleichen Organismus erhältlich wie das Polypeptid, wie einem Pilz, insbesondere einem Pilz der Gattung Aspergillus.
  • Die erfindungsgemäßen Polynukleotide beinhalten auch Varianten der Sequenz der SEQ ID NR: 1, die für ein Polypeptid mit prolinspezifischer Endoproteaseaktivität codieren. Varianten können durch Additionen, Substitutionen und/oder Deletionen hergestellt werden. Solche Varianten der codierenden Sequenz der SEQ ID NR :1 können somit Polypeptide codieren, die eine Polypeptidkette auf der carboxyterminalen Seite von Prolin spalten können.
  • Produktion von Polynukleotiden
  • Polynukleotide, die nicht 100% Identität mit der SEQ ID NR: 1 haben, aber in den Umfang der Erfindung fallen, können auf eine Reihe von Weisen erhalten werden. Somit können Varianten der hier beschriebenen prolinspezifischen Endoproteasesequenz zum Beispiel durch Sondierung genomischer DNA-Banken, die aus einem Spektrum von Organismen hergestellt wurden, erhalten werden, wie denjenigen, die als Quellen für erfindungsgemäße Polypeptide dargelegt wurden. Außerdem können andere Pilz-, Pflanzen- oder prokaryotische Homologa der prolinspezifischen Endoprotease erhalten werden, und solche Homologa und Fragmente davon sind im Allgemeinen in der Lage, an die SEQ ID NR: 1 zu hybridisieren. Solche Sequenzen können durch Sondieren von cDNA-Banken oder genomischen DNA-Banken aus anderen Spezies und Sondierung solche Banken mit Sonden, welche die gesamte oder einen Teil der SEQ ID NR: 1 enthalten, unter Bedingungen einer niedrigen, mittleren bis hohen Stringenz (wie vorstehend beschrieben) erhalten werden. Nukleinsäuresonden, welche die gesamte oder einen Teil von SEQ ID NR: 1 umfassen, können zum Sondieren von cDNA- oder genomischen Banken aus anderen Spezies, wie denjenigen, die als Quellen für erfindungsgemäße Polypeptide beschrieben wurden, verwendet werden.
  • Spezieshomologa können auch unter Verwendung von degenerierter PCR erhalten werden, die Primer verwendet, die für Zielsequenzen innerhalb der Varianten und Homologa gestaltet wurden, die konservierte Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer können eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden unter Stringenzbedingungen verwendet, die niedriger sind als diejenigen, die zur Klonierung von Sequenzen mit einzelnen Sequenzprimern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
  • Alternativ können solche Polynukleotide durch stellengerichtete Mutagenese der prolinspezifischen Endoproteasesequenzen oder Varianten davon erhalten werden. Dies kann nützlich sein, wenn zum Beispiel stille Codonveränderungen an Sequenzen erforderlich werden, um die Codonpräferenzen für eine besondere Wirtszelle zu optimieren, in der die Polynukleotidsequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzveränderungen können zum Einführen von Restriktionsenzym-Erkennungsstellen oder zum Verändern der Eigenschaft oder Funktion der Polypeptide, die durch die Polynukleotide codiert werden, vorgenommen werden.
  • Die Erfindung beinhaltet doppelsträngige Polynukleotide, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und sein Komplement umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotide bereit, die für die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polypeptide codieren. Weil solche Polynukleotide als Sequenzen für die rekombinante Produktion erfindungsgemäßer Polypeptide nützlich sind, müssen sie nicht notwendigerweise an die Sequenz der SEQ ID NR: 1 hybridisieren können, obwohl dieses gewöhnlich wünschenswert ist. Ansonsten können solche Polynukleotide wie vorstehend beschrieben markiert, verwendet und hergestellt werden, wenn gewünscht.
  • Rekombinante Polynukleotide
  • Die Erfindung stellt auch Vektoren, einschließlich Klonierungs- und Expressionsvektoren, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, und unter einem weiteren Aspekt Verfahren zur Züchtung, Transformation oder Transfektion solcher Vektoren in eine geeignete Wirtszelle, zum Beispiel unter Bedingungen, unter denen die Expression eines Polypeptids auftritt, das eine erfindungsgemäße Sequenz hat oder von einer erfindungsgemäßen Sequenz codiert wird, bereit. Bereitgestellt werden auch Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder einen erfindungsgemäßen Vektor umfassen, wobei das Polynukleotid zu dem Genom der Wirtszelle heterolog ist. Der Begriff "heterolog" bedeutet, gewöhnlich in Bezug auf die Wirtszelle, dass das Polynukleotid nicht natürlicherweise in dem Genom der Wirtszelle vorkommt, oder dass das Polypeptid nicht natürlicherweise durch diese Zelle produziert wird. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Hefezelle, zum Beispiel eine Hefezelle der Gattung Kluyveromyces oder Saccharomyces, oder eine filamentöse Pilzzelle, zum Beispiel der Gattung Aspergillus.
  • Erfindungsgemäße Polynukleotide können in einen rekombinanten replizierbaren Vektor, zum Beispiel einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, eingebracht werden. Der Vektor kann zur Replikation der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Somit stellt die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Polynukleotide durch Einbringen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Replikation des Vektors herbeiführen, bereit. Das Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind nachstehend in Verbindung mit Expressionsvektoren beschrieben.
  • Vektoren
  • Der Vektor, in den die erfindungsgemäße Expressionskassette eingesetzt wird, kann ein beliebiger Vektor sein, der geeigneterweise DNA-Rekombinationsverfahren unterworfen werden kann, und die Auswahl des Vektors hängt oft von der Wirtszelle ab, in die er eingeführt werden soll. Somit kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d. h. ein Vektor, der als eine extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, wie ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor einer sein, der, wenn er in ein Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom integriert und zusammen mit de(m/n) Chromosom(en) repliziert wird, in das/die er integriert wurde.
  • Wenn ein erfindungsgemäßes Polynukleotid sich in einem Vektor befindet, ist es vorzugsweise operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, die in der Lage ist, die Expression der codierenden Sequenz durch die Wirtszelle bereitzustellen, d. h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Begriff "operativ verknüpft" betrifft ein Nebeneinanderliegen, wobei die beschriebenen Komponenten eine Beziehung zueinander haben, die es ihnen gestattet, auf ihre beabsichtigte Weise zu wirken. Eine regulatorische Sequenz, wie ein Promotor, Enhancer oder ein anderes Expressionsregulationssignal, das mit einer codierenden Sequenz "operativ verknüpft" ist, ist derart platziert, dass eine Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erzielt wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
  • Die Vektoren können, zum Beispiel im Fall von Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder Phagenvektoren, mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls einem Promotor zur Expression des Polynukleotids und gegebenenfalls einem Enhancer und/oder einem Regulator des Promotors ausgestattet werden. Eine Terminatorsequenz sowie eine Polyadenylierungssequenz können vorhanden sein. Die Vektoren können ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten, zum Beispiel ein Ampicillin-Resistenzgen im Fall eines bakteriellen Plasmids, oder ein Neomycin-Resistenzgen für einen Säuger-Vektor. Vektoren können in vitro, zum Beispiel zur Produktion von RNA, oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle verwendet werden.
  • Die DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert, wird vorzugsweise in einen geeigneten Wirt als Teil eines Expressionskonstrukts eingeführt, in dem die DNA-Sequenz mit Expressionssignalen operativ verknüpft ist, die in der Lage sind, die Expression der DNA-Sequenz in den Wirtszellen zu steuern. Zur Transformation des geeigneten Wirts mit dem Expressionskonstrukt sind Transformationsverfahren verfügbar, die dem Fachmann bekannt sind. Das Expressionskonstrukt kann zur Transformation des Wirts als Teil eines Vektors verwendet werden, der einen Selektionsmarker trägt, oder das Expressionskonstrukt wird als ein separates Molekül zusammen mit dem Vektor transformiert, der einen Selektionsmarker trägt. Die Vektoren können ein oder mehrere Selektionsmarkergene enthalten.
  • Bevorzugte Selektionsmarker beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die einen Defekt in der Wirtszelle komplementieren oder Resistenz gegen einen Arzneistoff verleihen. Sie beinhalten zum Beispiel vielseitige Markergene, die zur Transformation der meisten filamentösen Pilze und Hefen verwendet werden können, wie Acetamidase-Gene oder -cDNAs (die amdS-, niaD-, facA-Gene oder -cDNAs aus A. nidulans, A. oryzae oder A. niger), oder Gene, die eine Resistenz gegen Antibiotika verleihen, wie eine G418-, Hygromycin-, Bleomycin-, Kanamycin-, Phleomycin- oder Benomyl-Resistenz (benA). Alternativ können spezifische Selektionsmarker verwendet werden, wie auxotrophe Marker, die entsprechende mutierte Wirtsstämme erfordern: z. B. URA3 (aus S. cerevisiae oder analoge Gene aus anderen Hefen), pyrG oder pyrA (aus A. nidulans oder A. niger), argB (aus A. nidulans oder A. niger) oder trpC. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Selektionsmarker aus der transformierten Wirtszelle nach Einbringen des Expressionskonstrukts deletiert, um transformierte Wirtszellen zu erhalten, die zur Herstellung des Polypeptids in der Lage und frei von Selektionsmarkergenen sind.
  • Andere Marker sind u. a. ATP-Synthetase Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (pvrA), das bakterielle G418-Resistenzgenen (das in Hefe, aber nicht in filamentösen Pilzen geeignet ist), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli), das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus) und das E.-coli-uidA-Gen, das für Glucuronidase (GUS) codiert. Vektoren können in vitro, zum Beispiel zur Produktion von RNA, oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle, verwendet werden.
  • Für die meisten filamentösen Pilze und Hefe wird das Expressionskonstrukt vorzugsweise in das Genom der Wirtszelle integriert, um stabile Transformanten zu erhalten. Für bestimmte Hefen sind jedoch auch geeignete episomale Vektorsysteme erhältlich, in die das Expressionskonstrukt für eine stabile Expression in einem hohen Spiegel eingebracht werden kann. Beispiele dafür beinhalten Vektoren, die aus den 2-μm-, CEN- und pKD1-Plasmiden von Saccharomyces bzw. Kluyveromyces stammen, oder Vektoren, die eine AMA-Sequenz enthalten (z. B. AMA1 aus Aspergillus). Wenn Expressionskonstrukte in Wirtszellgenome integriert werden, werden die Konstrukte entweder an zufallsgemäßen Loci in das Genom oder an zuvor bestimmten Ziellloci unter Verwendung von homologer Rekombination integriert, in welchem Fall die Zielloci vorzugsweise ein hoch exprimiertes Gen umfassen. Ein hoch exprimiertes Gen ist ein Gen, dessen mRNA mindestens 0,01% (w/w) der gesamten zellulären mRNA, zum Beispiel unter induzierten Bedingungen, ausmachen kann, oder alternativ ein Gen, dessen Genprodukt mindestens 0,2% (w/w) des gesamten zellulären Proteins ausmachen kann oder, im Fall eines sezernierten Genprodukts, bis zu einem Spiegel von mindestens 0,05 g/l sezerniert werden kann.
  • Ein Expressionskonstrukt für eine gegebene Wirtszelle enthält gewöhnlich die folgenden Elemente, operativ verknüpft miteinander in aufeinander folgender Reihenfolge vom 5'-Ende zum 3'-Ende relativ zum codierenden Strang der Sequenz, die für das Polypeptid des ersten Aspekts codiert: (1) eine Promotorsequenz, welche die Transkription der DNA-Sequenz, die für das Polypeptid in der gegebenen Wirtszelle codiert, steuern kann, (2) vorzugsweise eine 5'-untranslatierte Region (Leader), (3) gegebenenfalls eine Signalsequenz, die in der Lage ist, die Sekretion des Polypeptids aus der gegebenen Wirtszelle in das Kulturmedium zu steuern, (4) die DNA-Sequenz, die für eine reife und vorzugsweise aktive Form des Polypeptids codiert, und vorzugsweise auch (5) eine Transkriptionsterminationsregion (Terminator), die in der Lage ist, die Transkription stromabwärts der DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert, zu terminieren.
  • Stromabwärts der DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert, enthält das Expressionskonstrukt vorzugsweise eine 3'-untranslatierte Region, die eine oder mehrere Transkriptionsterminationsstellen, auch als Terminator bezeichnet, enthält. Der Ursprung des Terminators ist weniger wichtig. Der Terminator kann zum Beispiel nativ für die DNA-Sequenz sein, die für das Polypeptid codiert. Vorzugsweise wird jedoch in Hefe-Wirtszellen ein Hefe-Terminator verwendet, und ein Terminator aus filamentösem Pilz wird in filamentösen Pilz-Wirtszellen verwendet. Stärker bevorzugt ist der Terminator für die Wirtszelle endogen, in der die DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert, exprimiert wird.
  • Eine verstärkte Expression des Polynukleotids, das für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, kann auch durch Auswahl heterologer regulatorischer Regionen erzielt werden, z. B. Promotor-, Signalsequenz- und Terminator-Regionen, die zur Erhöhung der Expression und, wenn gewünscht, der Sekretionsspiegel des Proteins von Interesse aus dem gewählten Expressionswirt und/oder zum Bereitstellen einer induzierbaren Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids dienen.
  • Neben den Promotor, der für das Gen nativ ist, das für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids zu steuern. Der Promotor kann hinsichtlich seiner Effizienz bei der Steuerung der Expression des erfindungsgemäßen Polypeptids in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
  • Promoter/Enhancer und andere Expressionsregulationssignale können derart ausgewählt werden, dass sie mit der Wirtszelle kompatibel sind, für die der Expressionsvektor gestaltet worden ist. Zum Beispiel können prokaryotische Promotoren verwendet werden, insbesondere diejenigen, die für die Verwendung in E.-coli-Stämmen geeignet sind. Wenn die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide in Säugerzellen durchgeführt wird, können Säuger-Promotoren verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, zum Beispiel Hepatozytenzellspezifische Promotoren, können ebenfalls verwendet werden. Auch virale Promotoren können verwendet werden, zum Beispiel der Promotor aus dem Long Terminal Repeat des Moloney-Mäuseleukämievirus (MMLV-LTR), der Rous-Sarkomvirus-(RSV-)LTR-Promotor, der SV40-Promotor, der IE-Promotor des humanen Cytomegalievirus (CMV), Herpes-simplex-Virus-Promotoren oder Adenovirus-Promotoren.
  • Geeignete Hefe-Promotoren sind u. a. die S.-cerevisiae-GAL4- und ADH-Promotoren und der S.-pombenmt1- und adh-Promotor. Säuger-Promotoren sind u. a. der Metallothionein-Promotor, der als Reaktion auf Schwermetalle, wie Cadmium, induziert werden kann. Virale Promotoren, wie der Promotor des SV40-großen-T-Antigens oder Adenovirus-Promotoren, können ebenfalls verwendet werden. All diese Promotoren sind im Stand der Technik leicht erhältlich.
  • Säuger-Promotoren, wie β-Aktin-Promotoren, können verwendet werden. Gewebespezifische Promotoren, insbesondere für endotheliale oder neuronale Zellen spezifische Promotoren (zum Beispiel die DDAHI- und DDAHII-Promotoren), sind besonders bevorzugt. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel der Promotor aus dem Long Terminal Repeat des Moloney-Mäuseleukämievirus (MMLV-LTR), der Rous-Sarkomvirus-(RSV-)LTR-Promotor, der SV40-Promotor, der IE-Promotor des humanen Cytomegalievirus (CMV), Adenovirus-, HSV-Promotoren (wie die HSV-IE-Promotoren) oder HPV-Promotoren, insbesondere die Upstream Regulatory Region (URR) des HPV. Virale Promotoren sind im Stand der Technik leicht erhältlich.
  • Eine Reihe von Promotoren kann verwendet werden, die in der Lage sind, die Transkription in den erfindungsgemäßen Wirtszellen zu steuern. Vorzugsweise stammt die Promotorsequenz aus einem hoch exprimierten Gen, wie vorstehend definiert. Beispiele für bevorzugte hoch exprimierte Gene, aus denen die Promotoren vorzugsweise stammen und/oder die in den bevorzugten zuvor festgelegten Zielloci für die Integration von Expressionskonstrukten enthalten sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Gene, die für glycolytische Enzyme codieren, wie Triosephosphatisomerasen (TPI), Glyceraldehydphosphatdehydrogenasen (GAPDH), Phosphoglyceratkinasen (PGK), Pyruvatkinasen (PYK), Alkoholdehydrogenasen (ADH), sowie Gene, die für Amylasen, Glucoamylasen, Proteasen, Xylanasen, Cellobiohydrolasen, β-Galactosidasen, Alkohol-(Methanol-)oxidasen, Elongationsfaktoren und ribosomale Proteine codieren. Spezifische Beispiele für geeignete hoch exprimierte Gene beinhalten z. B. das LAC4-Gen aus Kluyveromyces sp., die Methanoloxidase-Gene (AOX und MOX) aus Hansenula bzw. Pichia, die Glucoamylase-(glaA-)Gene aus A. niger und A. awamori, das A. oryzae-TAKA-Amylase-Gen, das A. nidulans-gpdA-Gen und die T.-reesei-Cellobiohydrolase-Gene.
  • Beispiele für starke konstitutive und/oder induzierbare Promotoren, die für die Verwendung in Pilz-Expressionswirten bevorzugt sind, sind diejenigen, die aus dem Pilz-Gen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase-Untereinheit 9 (oliC) Triosephosphat isomerase(tpi-), Alkoholdehydrogenase (AdhA), Amylase (amy), Amyloglucosidase (AG aus dem glaA-Gen) erhältlich sind, die Acetamidase-(amdS-) und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(gpd-)Promotoren.
  • Beispiele für starke Hefe-Promotoren, die verwendet werden können, beinhalten diejenigen, die aus dem Gen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
  • Beispiele für starke bakterielle Promotoren, die verwendet werden können, sind u. a. die Amylase- und SPo2-Promotoren sowie Promotoren aus extrazellulären Protease-Genen.
  • Für Pflanzenzellen geeignete Promotoren, die verwendet werden können, sind u. a. die Nopalinsynthase(nos-), Octopinsynthase-(ocs-), Mannopinsynthase(mas-)Promotoren, die Promotoren der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco-ssu), Histon-, Reis-Aktin-, Phaseolin-, Blumenkohlmosaikvirus-(CMV-)-35S- und -19S- und Circovirus-Promotoren.
  • Der Vektor kann ferner Sequenzen enthalten, die das Polynukleotid flankieren, was RNA ergibt, die Sequenzen umfasst, die homolog zu solchen aus eukaryotischen genomischen Sequenzen, vorzugsweise genomischen Säuger-Sequenzen oder viralen genomischen Sequenzen, sind. Dies gestattet die Einführung der erfindungsgemäßen Polynukleotide in das Genom von eukaryotischen Zellen oder Viren durch homologe Rekombination. Insbesondere kann ein Plasmidvektor, der die Expressionskassette, flankiert von viralen Sequenzen, umfasst, zur Herstellung eines viralen Vektors verwendet werden, der zum Zuführen der erfindungsgemäßen Polynukleotide zu einer Säugerzelle geeignet ist. Weitere Beispiele für geeignete virale Vektoren sind u. a. Herpes-simplex-Virus-Vektoren und Retroviren, einschließlich Lentiviren, Adenoviren, adeno-assoziierter Viren und HPV-Viren (wie HPV-16 oder HPV-18). Gentransfertechniken unter Verwendung dieser Viren sind dem Fachmann bekannt. Retrovirus-Vektoren können zum Beispiel dazu verwendet werden, das Polynukleotid, das die Antisense-RNA erzeugt, stabil in das Wirtsgenom integrieren. Replikationsdefiziente Adenovirus-Vektoren bleiben im Gegensatz dazu episomal und gestatten daher eine transiente Expression.
  • Der Vektor kann ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten, das in einer Antisense-Richtung orientiert ist, um die Produktion von Antisense-RNA bereitzustellen. Dies kann dazu verwendet werden, wenn wünschenswert, die Spiegel der Expression des Polypeptids zu verringern.
  • Wirtszellen und Expression
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, transformiert oder transfiziert wurde, unter Bedingungen, die zur Expression einer codierenden Sequenz, die das Polypeptid codiert, durch den Vektor geeignet sind, und Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfasst. Erfindungsgemäße Polynukleotide können in einen rekombinanten replizierbaren Vektor, wie einen Expressionsvektor, eingebracht werden. Der Vektor kann zum Replizieren der Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden. Somit stellt die Erfindung bei einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids durch Einbringen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in einen replizierbaren Vektor, Einbringen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Replikation des Vektors herbeiführen, bereit. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen sind u. a. Bakterien, wie E. coli, Hefe, Säugerzelllinien und andere eukaryotische Zelllinien, zum Beispiel Insektenzellen, wie Sf9-Zellen, und (z. B. filamentöse) Pilzzellen.
  • Vorzugsweise wird das Polypeptid als sezerniertes Protein produziert, in welchem Fall die DNA-Sequenz, die eine reife Form des Polypeptids codiert, in dem Expressionskonstrukt operativ mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die eine Signalsequenz codiert. Falls das Gen, welches das sezernierte Protein codiert, in dem Wildtyp-Stamm eine Signalsequenz hat, ist die verwendete Signalsequenz vorzugsweise nativ (homolog) für die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert. Alternativ ist die Signalsequenz fremd (heterolog) für die DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, in welchem Fall die Signalsequenz vorzugsweise für die Wirtszelle endogen ist, in der die DNA-Sequenz exprimiert wird. Beispiele für geeignete Signalsequenzen für Hefe-Wirtszellen sind die Signalsequenzen, die von den Hefe-MFalpha-Genen stammen. Ebenso ist eine geeignete Signalsequenz für filamentöse Pilz-Wirtszellen z. B. eine Signalsequenz, die aus einem Amyloglucosidase(AG-)Gen eines filamentösen Pilzes, z. B. dem A.-nigerglaA-Gen, stammt. Diese Signalsequenz kann in Kombination mit dem Amyloglucosidase- (auch als (Gluco)amylase bezeichnet) Promotor selbst sowie in Kombination mit anderen Promotoren verwendet werden. Hybrid-Signalsequenzen können im Kontext der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden.
  • Bevorzugte heterologe Sekretions-Leadersequenzen sind diejenigen, die aus dem Pilz-Amyloglucosidase(AG-)Gen (glaA – sowohl die 18- als auch die 24-Aminosäuren-Version, z. B. aus Aspergillus), dem MFalpha-Gen (Hefen z. B. Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem alpha-Amylase-Gen (Bacillus) stammen.
  • Die Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle, wie vorstehend beschrieben, transformiert oder transfiziert werden, um die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereitzustellen. Dieses Verfahren kann das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie vorstehend beschrieben, transformiert wurde, unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, und gegebenenfalls Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfassen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt somit Wirtszellen bereit, die mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid oder Vektor transformiert oder transfiziert worden sind oder die ein(en) solche(s/n) umfassen. Vorzugsweise befindet sich das Polynukleotid in einem Vektor, der die Replikation und Expression des Polynukleotids gestattet. Die Zellen werden derart ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können zum Beispiel prokaryotische (zum Beispiel bakterielle) oder eukaryotische Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
  • Die Erfindung umfasst Verfahren zur Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptids mithilfe der rekombinanten Expression einer DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert. Zu diesem Zweck kann die erfindungsgemäße DNA-Sequenz zur Genamplifikation und/oder zum Austausch von Expressionssignalen, wie Promotoren, Sekretionssignalsequenzen, verwendet werden, so dass eine ökonomische Produktion des Polypeptids in einer geeigneten homologen oder heterologen Wirtszelle möglich ist. Eine homologe Wirtszelle ist hier als eine Wirtszelle definiert, die von derselben Spezies oder einer Variante innerhalb derselben Spezies ist wie die Spezies, aus der die DNA-Sequenz stammt.
  • Geeignet Wirtszellen sind vorzugsweise prokaryotische Mikroorganismen, wie Bakterien, oder stärker bevorzugt eukaryotische Organismen, zum Beispiel Pilze, wie Hefen oder filamentöse Pilze, oder Pflanzenzellen. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber filamentösen Pilzzellen bevorzugt, weil sie leichter zu manipulieren sind. Einige Proteine werden jedoch entweder aus Hefen schlecht sezerniert oder in einigen Fällen nicht richtig prozessiert (z. B. Hyperglykosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein filamentöser Pilz-Wirtsorganismus gewählt werden.
  • Bakterien aus der Gattung Bacillus sind aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine in des Kulturmedium zu sezernieren, als heterologe Wirte sehr geeignet. Weitere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen aus den Gattungen Streptomyces und Pseudomonas. Eine bevorzugte Hefe-Wirtszelle zur Expression der DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, stammt aus der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia oder Schizosaccharomyces. Stärker bevorzugt wird eine Hefe-Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Spezies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (auch als Kluyveromyces marxianus var. lactis bekannt), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica und Schizosaccharomyces pombe besteht.
  • Am stärksten bevorzugt zur Expression der DNA-Sequenz, die das Polypeptid codiert, sind jedoch filamentöse Pilz-Wirtszellen. Bevorzugte filamentöse Pilz-Wirtszellen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, und Talaromyces besteht. Stärker bevorzugt ist eine filamentöse Pilz-Wirtszelle aus der Spezies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae oder Aspergillus nidulans oder ist aus einer Spezies der Aspergillus-niger-Gruppe (wie von Raper und Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, S. 293–344, 1965 definiert). Diese beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae und Aspergillus ficuum, und auch diejenigen der Spezies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum und Thielavia terrestris.
  • Beispiel für bevorzugte Expressionswirte im Umfang der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Spezies (insbesondere die in EPA-184,438 und EP-A-284,603 beschriebenen) und Trichoderma-Spezies; Bakterien, wie Bacillus-Spezies (insbesondere die in EP-A-134,048 und EP-A-253,455 beschriebenen), insbesondere Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas-Spezies; und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies (insbesondere die in EP-A-096,430 beschriebenen, wie Kluyveromyces lactis, und die in EP-A-301,670 beschriebenen) und Saccharomyces-Spezies, wie Saccharomyces cerevisiae.
  • Erfindungsgemäße Wirtszellen beinhalten Pflanzenzellen, und die Erfindung erstreckt sich deshalb auf transgene Organismen, wie Pflanzen und deren Teile, die eine oder mehrere erfindungsgemäße Zellen enthalten. Die Zellen können das erfindungsgemäße Polypeptid heterolog exprimieren oder ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Polynukleotide heterolog enthalten. Die transgene (oder genetisch modifizierte) Pflanze kann daher in ihr Genom eine Sequenz (gewöhnlich stabil) inseriert haben, die für das erfindungsgemäße Polypeptid codiert. Die Transformation von Pflanzenzellen kann unter Verwendung bekannter Techniken durchgeführt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines Ti- oder Ri-Pasmids aus Agrobacterium tumefaciens. Das Plasmid (oder der Vektor) kann somit Sequenzen enthalten, die zur Infektion einer Pflanze notwendig sind, und Derivate der Ti- und/oder Ri-Plasmide können eingesetzt werden.
  • Die Wirtszelle kann das Polypeptid überexprimieren, und Techniken zur genetischen Erzeugung einer Überexpression sind bekannt und können bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Wirt kann somit zwei oder mehr Kopien des Polynukleotids besitzen.
  • Alternativ kann eine direkte Infektion eines Teils einer Pflanze, wie eines Blattes, einer Wurzel oder eines Stängels, durchgeführt werden. Bei dieser Technik kann die Pflanze, die infiziert werden soll, verwundet werden, zum Beispiel durch Schneiden der Pflanze mit einer Rasierklinge, Punktieren der Pflanze mit einer Nadel oder Reiben der Pflanze mit einem Schleifmittel. Die Wunde wird dann mit dem Agrobacterium beimpft. Die Pflanze oder der Pflanzenteil kann dann auf einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet werden, und man kann ihn sich in ein reife Pflanze entwickeln lassen. Die Regeneration transformierter Zellen in genetisch modifizierte Pflanzen kann durch Verwendung bekannter Techniken erzielt werden, zum Beispiel durch Selektieren transformierter Sprosse unter Verwendung eines Antibiotikums und durch Subkultivieren der Sprosse auf ein Medium, das die angemessenen Nährstoffe, Pflanzenhormone und dergleichen enthält.
  • Kultur von Wirtszellen und rekombinante Produktion Die Erfindung umfasst auch Zellen, die derart modifiziert sind, dass sie die prolinspezifische Endoprotease oder eine Variante davon exprimieren. Solche Zellen umfassen transient oder vorzugsweise stabil modifizierte höhere eukaryotische Zelllinien, wie Säugerzellen oder Insektenzellen, niedere eukaryotische Zellen, wie Hefe und filamentöse Pilzzellen, oder prokaryotische Zellen, wie bakterielle Zellen.
  • Es ist auch möglich, dass das erfindungsgemäße Polypeptid in einer Zelllinie oder auf einer Membran, wie zum Beispiel in einem Baculovirus-Expressionssystem, transient exprimiert wird. Solche Systeme, die dazu ausgelegt sind, die erfindungsgemäßen Proteine zu exprimieren, sind ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • Erfindungsgemäß kann die Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids durch Kultivieren mikrobieller Expressionswirte, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Polynukleotiden transformiert wurden, in einem herkömmlichen Nährstoff-Fermentationsmedium durchgeführt werden.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Wirtszellen können unter Verwendung im Stand der Technik bekannter Verfahren kultiviert werden. Für jede Kombination von einem Promotor und einer Wirtszelle sind Kulturbedingungen verfügbar, die zur Expression der DNA-Sequenz führen, die das Polypeptid codiert. Nach Erreichen der gewünschten Zelldichte oder des gewünschten Titers des Polypeptids wird die Kultivierung beendet, und das Polypeptid wird unter Verwendung bekannter Verfahren gewonnen.
  • Das Fermentationsmedium kann ein bekanntes Kulturmedium umfassen, das eine Kohlenstoffquelle (z. B. Glucose, Maltose, Molassen usw.), eine Stickstoffquelle (z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid usw.), eine organische Stickstoffquelle (z. B. Hefeextrakt, Malzextrakt, Pepton usw.) und anorganische Nährstoffquellen (z. B. Phosphat, Magnesium, Kalium, Zink, Eisen usw.) enthält. Gegebenenfalls kann ein Induktor (je nach dem verwendeten Expressionskonstrukt) enthalten sein oder anschließend zugegeben werden.
  • Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirtes und/oder auf den regulatorischen Anforderungen des Expressionskonstrukts basieren. Geeignete Medien sind dem Fachmann bekannt. Wenn gewünscht, kann das Medium zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber potenziell verunreinigenden Mikroorganismen fördern.
  • Die Fermentation kann über einen Zeitraum von 0,5–30 Tagen durchgeführt werden. Die Fermentation kann ein Chargen-, ein kontinuierliches oder ein Fed-Batch-Verfahren bei einer geeigneten Temperatur im Bereich zwischen 0°C und 45°C und zum Beispiel bei einem pH von 2 bis 10 sein. Bevorzugte Fermentationsbedingungen beinhalten eine Temperatur im Bereich zwischen 20°C und 37°C und/oder einem pH zwischen 3 und 9. Die geeigneten Bedingungen werden gewöhnlich auf Basis der Auswahl des Expressionswirtes und des Proteins, das exprimiert werden soll, gewählt.
  • Wenn nötig, können die Zellen nach der Fermentation aus der Fermentationsbrühe mithilfe von Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Nachdem die Fermentation beendet wurde, oder nach der Entfernung der Zellen kann das erfindungsgemäße Polypeptid dann gewonnen und, wenn gewünscht, gereinigt und durch herkömmliche Mittel isoliert werden. Die erfindungsgemäße prolinspezifische Endoprotease kann aus Pilzmycel oder aus der Kulturbrühe gereinigt werden, in die die prolinspezifische Endoprotease von den kultivierten Pilzzellen freigesetzt wird.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polypeptid aus einem Pilz, stärker bevorzugt aus einem Aspergillus, am stärksten bevorzugt aus Aspergillus niger, erhalten.
  • Modifikationen
  • Erfindungsgemäße Polypeptide können chemisch modifiziert, z. B. posttranslational modifiziert, sein. Sie können beispielsweise (ein oder mehrmals) glykosyliert sein oder modifizierte Aminosäurereste umfassen. Sie können auch durch die Addition von Histidinresten modifiziert sein, um ihre Reinigung zu unterstützen, oder durch die Addition einer Signalsequenz, um die Sekretion aus der Zelle zu fördern. Das Polypeptid kann amino- oder carboxyterminale Extensionen haben, wie einen aminoterminalen Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu ungefähr 20–25 Resten oder eine kleine Extension, die die Reinigung erleichtert, wie eine Poly-Histidin-Abfolge, ein Antigenepitop oder eine Bindungsdomäne.
  • Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann mit einer enthüllenden Markierung markiert werden. Die enthüllende Markierung kann jede geeignete Markierung sein, die den Nachweis des Polypeptids ermöglicht. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, z. B. 125I, 35S, Enzyme, Antikörper, Polynukleotide und Linker, wie Biotin.
  • Die Polypeptide können so modifiziert sein, dass nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten sind oder die Stabilität des Polypeptids erhöht wird. Wenn die Proteine oder die Peptide mit synthetischen Mitteln produziert werden, können solche Aminosäuren während der Produktion eingeführt werden. Die Proteine oder die Peptide können auch nach synthetischer oder rekombinanter Produktion modifiziert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch unter Verwendung von D-Aminosäuren hergestellt werden. In solchen Fällen werden die Aminosäuren in umgekehrter Reihenfolge in C-nach-N-Orientierung verbunden. Dies ist im Stand der Technik zur Produktion solcher Proteine oder Peptide herkömmlich.
  • Eine Anzahl von Seitenketten-Modifikationen ist im Stand der Technik bekannt und kann an den Seitenketten der erfindungsgemäßen Proteine oder Peptide vorgenommen werden. Solche Modifikationen umfassen z. B. Modifikationen der Aminosäuren durch reduktive Alkylierung durch Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt von Reduktion mit NaBH4, Amidierung mit Methylacetimidat oder Acylierung mit Essigsäureanhydrid.
  • Die erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzen können auch als Ausgangsmaterialien für die Konstruktion von Enzymen "der zweiten Generation" verwendet werden. Prolinspezifische Proteasen der "zweiten Generation" sind prolinspezifische Proteasen, die durch Mutagenesetechniken (z. B. stellengerichtete Mutagenese) verändert wurden, deren Eigenschaften sich von denjenigen der prolinspezifischen Wildtyp-Protease oder rekombinanten prolinspezifischen Proteasen, wie denjenigen, die durch die vorliegende Erfindung produziert werden, unterscheiden. Zum Beispiel können die Temperatur oder das pH-Optimum, die spezifische Aktivität, die Substrataffinität oder die Thermostabilität so geändert werden, dass diese für die Anwendung in einem bestimmten Verfahren besser geeignet sind.
  • Aminosäuren, die für die Aktivität der erfindungsgemäßen prolinspezifischen Protease essentiell sind und folglich vorzugsweise der Substitution unterliegen, können entsprechend den Verfahren des Standes der Technik identifiziert werden, wie stellengerichtete Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese. Bei der letzteren Technik werden Mutationen an jedem Rest im Molekül eingeführt, und die erhaltenen mutierten Moleküle werden auf biologische Aktivität (beispielsweise prolinspezifische Proteaseaktivität) getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind. Stellen einer Enzym-Substrat-Wechselwirkung können auch durch Analyse der Kristallstruktur festgestellt werden, wie sie durch Techniken, wie magnetische Kernresonanz, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung, ermittelt wird.
  • Es wird erwartet, dass die Verwendung von Hefe- und filamentösen Pilz-Wirtszellen solche posttranslationalen Modifikationen (z. B. proteolytische Prozessierung, Myristylierung, Glycosylierung, Verkürzung und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung) liefert, wie es erforderlich sein kann, um erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsprodukten optimale biologische Aktivität zu verleihen.
  • Zubereitungen
  • Erfindungsgemäße Polypeptide können in einer isolierten Form vorliegen. Selbstverständlich kann das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden, die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht behindern, und immer noch als isoliert angesehen werden. Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann auch in einer im Wesentlichen reinen Form vorliegen, in welchem Fall es gewöhnlich das Polypeptid in einer Zubereitung umfasst, in der mehr als 70%, z. B. mehr als 80%, 90%, 95%, 98% oder 99% der Proteine in der Zubereitung ein erfindungsgemäßes Polypeptid sind.
  • Erfindungsgemäße Polypeptide können in einer Form bereitgestellt werden, so dass sie sich außerhalb ihrer natürlichen Zellumgebung befinden. So können sie im Wesentlichen isoliert oder gereinigt sein, wie vorstehend erörtert, oder sich in einer Zelle befinden, in der sie in der Natur nicht vorkommen, beispielsweise einer Zelle anderer Pilzarten, Tiere, Pflanzen oder Bakterien.
  • Entfernung oder Verringerung der prolinspezifischen Endoproteaseaktivität
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer Mutantenzelle von einer Parentalzelle, die das Zerstören oder Deletieren der endogenen Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder einer Kontrollsequenz davon umfassen, was zu einer Mutantenzelle führt, die weniger von dem Polypeptid produziert als die Parentalzelle.
  • Die Konstruktion von Stämmen mit verringerter prolinspezifischer Endoproteaseaktivität kann geeigneterweise durch Modifikation oder Inaktivierung einer Nukleinsäuresequenz erzielt werden, die zur Expression der prolinspezifischen Endoprotease in der Zelle notwendig ist. Die Nukleinsäuresequenz, die modifiziert oder inaktiviert werden soll, kann zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz sein, die das Polypeptid oder einen Teil davon codiert, der essentiell ist, damit sie prolinspezifische Endoproteaseaktivität aufweist, oder die Nukleinsäuresequenz kann eine regulatorische Funktion haben, die zur Expression des Polypeptids von der codierenden Sequenz der Nukleinsäuresequenz erforderlich ist. Ein Beispiel für eine solche regulatorische oder Kontroll-Sequenz kann eine Promotorsequenz oder ein funktioneller Teil davon sein, d. h. ein Teil, der zur Beeinflussung der Expression des Polypeptids ausreichend ist. Weitere Kontroll-Sequenzen für eine mögliche Modifikation sind u. a., sind aber nicht beschränkt auf eine Leader-Sequenz, eine Polyadenylierungssequenz, eine Propeptid-Sequenz, eine Signalsequenz und eine Terminationssequenz.
  • Eine Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz kann durchgeführt werden, indem die Zelle einer Mutagenese unterworfen wird und Zellen selektiert werden, in denen die Fähigkeit zur Produktion einer prolinspezifischen Endoprotease verringert oder beseitigt wurde. Die Mutagenese, die spezifisch oder zufallsgemäß sein kann, kann zum Beispiel unter Verwendung eines geeigneten physikalischen oder chemischen Mutagenesemittels, unter Verwendung eines geeigneten Oligonukleotids oder, indem die DNA-Sequenz einer PCR-Mutagenese unterzogen wird, durchgeführt werden. Außerdem kann die Mutagenese unter Verwendung einer beliebigen Kombination dieser Mutagenisierungsmittel durchgeführt werden.
  • Beispiele für ein physikalisches oder chemisches Mutagenisierungsmittel, das für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet ist, sind u. a. Ultraviolett-(UV-)Bestrahlung, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), O-Methylhydroxylamin, salpetrige Säure, Ethylmethansulfonat (EMS), Natriumbisulfit, Ameisensäure und Nukleotidanaloga.
  • Wenn solche Mittel verwendet werden, wird die Mutagenese gewöhnlich durchgeführt, indem die Zelle, die mutagenisiert werden soll, in Gegenwart des gewählten Mutagenisierungsmittels unter geeigneten Bedingungen inkubiert und Zellen selektiert werden, die eine verringerte oder keine Expression einer prolinspezifischen Endoproteaseaktivität zeigen.
  • Modifikation oder Inaktivierung der Produktion eines erfindungsgemäßen Polypeptid kann durch Einführung, Substitution oder Entfernung von einem oder mehreren Nukleotiden in der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid codiert, oder einem regulatorischen Element, das für die Transkription oder Translation davon erforderlich ist, erzielt werden. Zum Beispiel können Nukleotide eingefügt oder entfernt werden, so dass die Einführung eines Stoppcodons, die Entfernung des Startcodons oder eine Veränderung des offenen Leserahmens erhalten werden. Eine derartige Modifikation oder Inaktivierung kann durch stellengerichtete Mutagenese oder PCR-Mutagenese gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren erzielt werden.
  • Obwohl die Modifikation im Prinzip in vivo durchgeführt werden kann, d. h. direkt an der Zelle, welche die zu modifizierende Nukleinsäuresequenz exprimiert, ist bevorzugt, dass die Modifikation in vitro durchgeführt wird, wie nachstehend beispielhaft dargelegt.
  • Ein Beispiel für eine geeignete Weise zur Inaktivierung oder Verringerung der Produktion der prolinspezifischen Endoprotease durch eine ausgewählte Wirtszelle basiert auf Techniken zum Genersatz oder zur Genunterbrechung. Bei dem Genunterbrechungsverfahren wird zum Beispiel eine Nukleinsäuresequenz, die dem endogenen Gen oder Genfragment von Interesse entspricht, in vitro mutagenisiert, um eine defekte Nukleinsäuresequenz zu erzeugen, die dann zur Produktion eines defekten Gens in die Wirtszelle transformiert wird. Durch homologe Rekombination ersetzt die defekte Nukleinsäuresequenz das endogene Gen oder Genfragment. Vorzugsweise codiert das defekte Gen oder Genfragment auch einen Marker, der zur Selektion von Transformanten verwendet werden kann, in denen das Gen, welches das Polypeptid codiert, modifiziert oder zerstört worden ist.
  • Alternativ kann eine Modifikation oder Inaktivierung der Nukleinsäuresequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, durch etablierte Antisense-Techniken unter Verwendung einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Sequenz ist, die für das Polypeptid codiert, erzielt werden. Genauer gesagt, kann die Produktion des Polypeptids durch eine Zelle verringert oder beseitigt werden, indem eine Nukleotidsequenz eingeführt wird, die komplementär zu der Nukleinsäuresequenz ist, die das Polypeptid codiert. Das Antisense-Polynukleotid wird dann gewöhnlich in der Zelle transkribiert und ist in der Lage, an die mRNA zu hybridisieren, die die prolinspezifische Endoprotease codiert. Unter Bedingungen, die es der komplementären Antisense-Nukleotidsequenz gestatten, an die mRNA zu hybridisieren, wird die Menge der in der Zelle produzierten prolinspezifischen Endoprotease verringert oder beseitigt.
  • Es ist bevorzugt, dass die Zelle, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert werden soll, von mikrobiellem Ursprung ist, zum Beispiel ein Pilz-Stamm, der zur Produktion gewünschter Proteinprodukte, die für die Zelle entweder homolog oder heterolog sind, geeignet ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Mutantenzelle einer Parentalzelle, die eine Zerstörung oder Deletion der endogenen Nukleinsäuresequenz, die für das Polypeptid codiert, oder einer Kontroll-Sequenz davon umfasst, die dazu führt, dass die Mutantenzelle weniger von dem Polypeptid produziert als die Parentalzelle.
  • Die so erzeugten Polypeptid-defizienten Mutantenzellen sind besonders als Wirtszellen für die Expression homologer und/oder heterologer Polypeptide geeignet. Daher betrifft die vorliegende Erfindung ferner Verfahren zur Produktion eines homologen oder heterologen Polypeptids, die (a) das Kultivieren der Mutantenzelle unter Bedingungen, die zur Produktion des Polypeptids führen; und (b) Gewinnen des Polypeptids umfassen. Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist der Begriff "heterologes Polypeptid" hier definiert als Polypeptide, die für die Wirtszelle nicht nativ sind, als ein natives Protein, in dem Modifikationen vorgenommen wurden, um die native Sequenz zu verändern, oder ein natives Protein, dessen Expression infolge einer Manipulation der Wirtszelle durch DNA- Rekombinationstechniken quantitativ verändert worden ist.
  • Unter noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Proteinprodukts, das im Wesentlichen frei von prolinspezifischer Endoproteaseaktivität ist, durch Fermentation einer Zelle bereit, die sowohl ein erfindungsgemäßes prolinspezifische-Endoprotease-Polypeptid sowie das Proteinprodukt von Interesse produziert. Das Verfahren umfasst die Zugabe einer wirksamen Menge eines Mittels, das in der Lage ist, prolinspezifische Endoproteaseaktivität zu hemmen, zu der Fermentationsbrühe entweder während der Fermentation oder nachdem diese beendet ist, Gewinnen des Produkts von Interesse aus der Fermentationsbrühe und gegebenenfalls Unterwerfen des gewonnenen Produkts einer weiteren Reinigung. Alternativ kann nach der Kultivierung die erhaltene Kulturbrühe einer pH- oder Temperaturbehandlung unterzogen werden, um die prolinspezifische Endoproteaseaktivität erheblich zu verringern und eine Gewinnung des Produkts aus der Kulturbrühe zu ermöglichen. Die kombinierte pH- oder Temperaturbehandlung kann an einer aus der Kulturbrühe gewonnenen Proteinzubereitung durchgeführt werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen von prolinspezifischer Endoprotease freien Produkts sind von besonderem Interesse bei der Produktion eukaryotischer Polypeptide, insbesondere bei der Produktion von Pilzproteinen, wie Enzymen. Die an prolinspezifischer Endoprotease defizienten Zellen können auch zum Exprimieren heterologer Proteine von Interesse für die Nahrungsmittelindustrie oder von pharmazeutischem Interesse verwendet werden.
  • Bevorzugte Quellen für die prolinspezifische Endoprotease werden durch Klonierung eines mikrobiellen Gens, das für eine prolinspezifische Endoprotease codiert, in einen mikrobiellen Wirtsorganismus erhalten. Stärker bevorzugte Quellen für die prolinspezifische Endoprotease werden durch Klonierung eines von Aspergillus stammenden Gens, das für eine prolinspezifische Endoprotease codiert, in einen Wirt, der zur Gattung Aspergillus gehört und in der Lage ist, das Gen für die prolinspezifische Endoprotease überzuexprimieren, erhalten.
  • In der Kategorie von Produkten, die Proteinhydrolysate enthalten, die auf Verbraucher mit nichtmedizinischen Bedürfnissen abzielen, vergrößert sich der Nischenmarkt des Einsatzes von Proteinhydrolysaten in Produkten für Athleten schnell. In dieser Produktkategorie ist die Allergenität des Endprodukts kein wichtiger Punkt. Stattdessen sind Aspekte, wie Geschmack, Nährwert und das Vorliegen spezifischer Aminosäuren zur Unterstützung der Ausdauer und zur Stimulation der physiologischen Erholung nach dem Training, wichtige Parameter für solche Hydrolysate, besonders wenn sie in Sportgetränken eingesetzt werden. Zum Beispiel hat man Glutamin zur Bekämpfung von Stoffwechselbelastungen impliziert, das aber nur in kleinen Peptiden zugeführt werden kann, weil die freie Aminosäure in Lösung nicht stabil ist. Erfindungsgemäß hergestellte Proteinhydrolysate sind aufgrund ihrer sehr hohen Löslichkeit unter den sauren pH-Bedingungen, die zum Beispiel in Sportgetränken vorherrschen, für die Verwendung in Produkten in Zusammenhang mit Athleten sehr gut geeignet. Eine wichtige Implikation dieses Kriteriums ist, dass hohe Spiegel von erfindungsgemäß hergestellten Hydrolysaten in nährstoffhaltige Sportprodukte ohne den Nachteil von Proteinniederschlägen nach Sterilisation und längerer Lagerung eingeschlossen werden können. Somit kann die Haltbarkeit von Sportprodukten durch Zugabe eines erfindungsgemäßen Proteinhydrolysats ausgeweitet werden.
  • Das erfindungsgemäße Enzymgemisch kann zur Hydrolyse proteinhaltiger Materialien tierischen Ursprungs, wie Vollmilch, Magermilch, Casein, Molkeprotein oder Gemische von Casein und Molkeprotein, verwendet werden. Such Gemische von Casein und Molkeprotein können zum Beispiel in Verhältnissen ähnlich denjenigen, die man in menschlicher Milch findet, verwendet werden. Außerdem stellen auf Kollagen basierende tierische Proteine aufgrund der Möglichkeit, diese Proteine in kleine Moleküle abzubauen, ein Substrat dar, wodurch tierische Fleischextrakte entbittert werden oder die Aufnahme von Prolin- und Hydroxyprolinresten mit Vorteilen für die Gelenke von Athleten verbessert wird.
  • Das erfindungsgemäße Enzymgemisch kann auch verwendet werden, um proteinhaltige Materialien pflanzlichen Ursprungs, wie zum Beispiel Weizengluten, gemälzte oder ungemälzte Gerste oder andere Cerealien, die zur Herstellung von Bier verwendet werden, Sojamilch, Konzentrate oder Isolate davon, Maisproteinkonzentrate und Isolate davon und Reisproteine, zu hydrolysieren. Die Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.
  • Beispiele
  • Materialien und Verfahren
  • Beta-Casein aus boviner Milch (lyophilisiertes, im Wesentlichen salzfreies Pulver) mit mindestens 90% beta-Casein wurde von Sigma erhalten. Kollagen (Typ 1, unlöslich, aus Rinder-Achillessehne) wurde ebenfalls von Sigma erhalten.
  • Natriumcaseinat (Miprodan 30®) wurde von MD Foods (Viby, Dänemark) erhalten. Süßmolkekonzentrat, nichtpasteurisiert, 10% ds, 35% Protein wurde von Borculo Domo (Zwolle, Niederlande) erhalten.
  • Ein Molkehydrolysat niedriger Bitterkeit Vitalarmor® 800 LB sowie an beta-Lactoglobulin angereichertes Molkeprotein (Protarmor® 905) wurde von Armor Proteines (Saint-Brice-en-Cogles, Frankreich) erhalten. Weitere kommerzielle Hydrolysate wurden vom Produzenten erhalten oder in Apotheken gekauft.
  • Sojaisolat wurde als Sogamin® 90 HV von Lucas Meyer, Hamburg, Deutschland, erhalten.
  • Subtilisin aus B. licheniformis (Delvolase®, 560000 DU pro Gramm) wurde von DSM Food Specialities (Seclin, Frankreich) erhalten. Sumizyme® LP 75.000 wurde von Shin Nihon (Anjyo, Japan) erhalten. Flavourzyme® 1000 L wurde von NOVO Industries, Bagsvaerd, Dänemark erhalten. Thermolysin (Thermoase; eine hitzestabile Metallo-Endoprotease aus Bacillus thermoproteolyticus Rokko mit einer Aktivität von 14000 PU/mg (wie von Daiwa Kasei, Osaka, Japan, produziert).
  • Prolinspezifische Endoprotease aus Flavobacterium meningosepticum und kloniert in E. coli wurde unter Verwendung bekannter Plasmidkonstrukte und Enzymreinigungsverfahren (T. Diefenthal und H. Dargatz, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209–212 (1995)) isoliert. Die enzymatische Aktivität wurde an 0,26 mM CBZ-Gly-Pro-pNA in 0,1 M Phosphat-Puffer pH 7,0 bei 25°C getestet. pH 7,0 wurde bei diesem Test verwendet, weil das pH-Optimum dieses Enzyms oberhalb von pH 6,0 liegt. Das Produkt wurde spektralphotometrisch bei 410 nm überwacht. Eine Einheit war definiert als die Menge an Enzym, welche die Freisetzung von 1 μmol p-Nitroanilid pro Minute unter diesen Bedingungen bewirkt.
  • Prolinspezifische Endoproteasen aus Aspergilli wurden gemäß dem im japanischen Patent JP5015314 beschrieben Verfahren mit kleinern Modifikationen gemessen. Kurz gesagt, wird die enzymatische Aktivität an CBZ-Gly-Pro-pNA bei 37 Grad C in einem Citrat/Dinatriumphosphat-Puffer pH 5 getestet. pH 5,0 wird gewählt, weil bei diesem Test das pH-Optimum des Enzyms unterhalb von pH 6 ist. Das Reaktionsprodukt wurde ebenfalls spektralphotometrisch bei 410 nM überwacht.
  • Zweidimensionale Gelelektrophorese
  • Zweidimensionale Gelelektrophorese und partielle Aminosäuresequenzierung einer prolinspezifischen Endopeptidase aus Aspergillus niger.
  • Prolinspezifische Endoprotease aus A. niger G-306 wurde produziert und isoliert, wie in Beispiel 4 dargestellt. Die vollständige Reinigung wurde unter Verwendung von zweidimensionaler Gelelektrophorese durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde das aus der Superdez-75-Säule isolierte aktive Material zuerst durch Verdünnung (etwa 20-fach) in 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 6,8 entsalzt und dann mit einem Centricon-30-kD-Miniconcentrator (Amicon) aufkonzentriert.
  • Die zweidimensionale Elektrophorese wurde grundsätzlich durchgeführt, wie in "2-D electrophoresis using immobilized pH gradients; Principles and Methods; Amersham Pharmacia Biotech 80-6429-60 Rev A/1098" beschrieben. Die erste Dimension (IEF) wurde an einem IPGphor (Amersham-Pharmacia) unter Verwendung eines 11-cm-IPG-Streifens pH-Bereich 3–6 (BioRad) durchgeführt. Die entsalzte, 3-fach konzentrierte Probe wurde in 8 M Harnstoff (6 M Harnstoff und 2 M Thioharnstoff) verdünnt. Dies wurde mit 18,5 Mikrolitern 10X-konzentriertem Rehydratisierungspuffer gemischt, der 6 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 20% CHAPS und 5% IPG-Puffer Bereich 3–10 enthält. Das Ganze wurde zum Rehydratisieren des IPG-Streifens verwendet. Die Fokussierung erfolgte für 29.320 VStd. unter Verwendung des Protokolls, wie in der mit den Streifen mitgelieferten Biorad-Packungsbeilage beschrieben, als Richtlinie.
  • Die zweite Dimension (SDS) erfolgte an einer Criterion-Mini-Vertical-Zelle (BioRad) unter Verwendung eines vorgegossenen 12%-Gels (Typ Prep + 2 Comb), das von BioRad bezogen wurde.
  • Der IPG-Streifen wurde zuerst in SDS-Äquilibrierungspuffer, der DTT (1%) enthielt, und ein zweites Mal in Puffer, der Iodacetamid (2,5%) enthielt, inkubiert. Beide Inkubationen erfolgten für 15 Minuten bei 20°C. Der SDS-Äquilibrierungspuffer bestand aus 50 mM Tris/HCl pH 8,8, 6 M Harnstoff, 30% (v/v) Glycerin und 2% (w/v) SDS und einer Spur Bromphenolblau.
  • Nach Inkubation wurde der IPG-Streifen zurechtgeschnitten, damit er zu dem erwähnten Geltyp passte, und mit 10X verdünntem TGS-Puffer (BioRad) pherographiert. Nach dem Lauf wurde das Gel mit Sypro Ruby (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) für 3–4 Stunden angefärbt und mit Milli-Q-Wasser für 2 Stunden gewaschen. Die Bildgebung wurde am Imager (AppliGen) durchgeführt. Der größte Fleck wurde ausgeschnitten, mehrmals mit 50 Millimol/Liter Ammoniumbicarbonat gewaschen, über Nacht bei 37 Grad C mit Trypsin von Sequenzierungsqualität (Nr. 1047841, Boehringer Mannheim) inkubiert. Peptide wurden aus dem Gelstück durch mehrmaliges Waschen mit Acetonitril/Wasser, das Ameisensäure (50/50/5, v/v/v) enthielt, extrahiert. Die Proben wurden unter Verwendung einer Vakuumzentrifuge (New Brunswick Scientific, Niederlande) getrocknet und bis zur Analyse bei –20°C aufbewahrt.
  • LC/MS-Analyse
  • HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) unter Verwendung eines Qtof-2-(Micromass, Manchester, GB)Massenspektrometers wurde verwendet, um die während der Spaltung mit Trypsin gebildeten Peptide aufzutrennen. 5 Mikroliter der Peptidlösung wurden auf einer Mikro-Vorsäule, C18, 5·0,3 mm (MCA30-05-C18, LC Packings, Amsterdam, Niederlande) unter Verwendung von Milli-Q-Wasser, das 0,1% Ameisensäure enthielt, bei einer Flussrate 20 Mikroliter/min aufgefangen. Die Peptide wurden dann von der Vorsäule unter Verwendung eines schnellen Gradienten von 0,1% Ameisensäure in Milli-Q-Wasser (Millipore, Redford, MA, USA; Lösung A) und 0,1% Ameisensäure in Acetonitril (Lösung B) eluiert. Der Gradient startete bei 100% Lösung A und erhöhte sich bis auf 60% Lösung B in 20 Minuten und wurde bei dem letzteren Verhältnis weitere 5 Minuten gehalten. Die während der Elution der Peptide verwendete Flussrate betrug 200 nl/min. Unter Verwendung der LC/MS/MS-Analyse konnten partielle Aminosäuresequenzen der prolinspezifischen Endopeptidase aus A. niger durch De-novo-Sequenzierung geeigneter Peptide bestimmt werden.
  • HPLC unter Verwendung eines Innenfallen-Massenspektrometers (ThermoquestTM, Breda, Niederlande), gekoppelt an eine P4000-Pumpe (ThermoquestTM, Breda, Niederlande), wurde zur Charakterisierung des enzymatischen Proteinhydrolysats verwendet, das durch das erfindungsgemäße Enzymgemisch produziert wurde. Die gebildeten Peptide wurden unter Verwendung einer PEPMAP-C18-300A-(MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Amsterdam, Niederlande) Säule in Kombination mit einem Gradienten von 0,1% Ameisensäure in Milli-Q-Wasser (Millipore, Redford, MA, USA; Lösung A) und 0,1% Ameisensäure in Acetonitril (Lösung B) für die Elution aufgetrennt. Der Gradient startete bei 100% Lösung A und erhöhte sich bis auf 70% Lösung B in 45 Minuten und wurde bei dem letzteren Verhältnis weitere 5 Minuten gehalten. Das verwendete Injektionsvolumen betrug 50 Mikroliter, die Flussrate war 50 Mikroliter pro Minute, und die Säulentemperatur wurde bei 30°C gehalten. Die Proteinkonzentration der injizierten Probe war etwa 50 Mikrogramm/Milliliter.
  • Detaillierte Informationen zu den einzelnen Peptiden wurde unter Verwendung des "scan-abhängigen" MS/MS-Algorithmus erhalten, der ein charakteristischer Algorithmus für ein Innenfallen-Massenspektrometer ist.
  • Auf eine Voll-Scan-Analyse folgte eine Zoom-Scan-Analyse zur Bestimmung des Ladungszustandes des intensivsten Ions im Voll-Scan-Massenbereich. Eine anschließende MS/MS-Analyse des letzteren Ions führte zu einer partiellen Peptidsequenz-Information, die für Datenbank-Suchen unter Verwendung der SEQUEST-Anwendung von Xcalibur Bioworks (ThermoquestTM, Breda, Niederlande) verwendet werden konnte. Die verwendeten Datenbanken wurden aus der OWL.fasta-Datenbank extrahiert, die beim NCBI (National Centre for Biotechnology Informatics) erhältlich ist, welche die Proteine von Interesse für die verwendeten Anwendungen enthielt. In Experimenten, in denen gut charakteri sierte Proteinsubstrate, wie Molkeproteine oder Caseine, gemessen wurden, wurde die Genauigkeit der Analysetechnik erhöht, indem diejenigen MS/MS-Spektren mit einer Sequenzübereinstimmung von weniger 50% weggelassen wurden.
  • Nur Peptide mit einer Masse im Bereich von etwa 400 bis 2000 Dalton wurden für die weitere Analyse mittels MS-Sequenzierung als geeignet angesehen.
  • Angiotensin (M = 1295,6) wurde zum Einstellen der optimalen Sensitivität im MS-Modus und zur optimalen Fragmentierung im MS/MS-Modus verwendet, wobei eine konstante Infusion von 60 μg/ml durchgeführt wurde, die zu größtenteils doppelt und dreifach geladenen Spezies im MS-Modus und einer optimalen Kollisionsenergie von etwa 35% im MS/MS-Modus führte.
  • LC/MS-Analyse an Säuglingsformulierungen und kommerziellen Proteinhydrolysaten.
  • Vor der LC/MS musste fetthaltiges Material aus den Säuglingsformulierungen entfernt werden. Zu diesem Zweck wurden die vollständigen Nährstoffproben (13,5 g Pulver in 100 ml MilliQ-Wasser) 3 Mal mit 30 ml Hexan extrahiert. Kleine Mengen NaCl wurden zur Verbesserung der Trennung der Lösungsmittelschichten zugegeben. Dann wurden 5 ml der Wasserschicht entnommen und gefriergetrocknet. Vor der Analyse wurde die Probe erneut in 25 ml MilliQ-Wasser gelöst, 2 Mal (bei 13000 U/min) zentrifugiert und durch ein 0,22-μm-Filter filtriert. Von reinen hydrolysierten Proben wurden 400 mg in 100 ml MilliQ-Wasser gelöst, 2 Mal (bei 13000 U/min) zentrifugiert und durch ein 0,22-μm-Filter filtriert. Um die in den kommerziellen Proteinhydrolysaten vorliegenden Peptide zu charakterisieren, wurde nach der gleichen Strategie vorgegangen, wie vorstehend für die enzymatischen Hydrolysate beschrieben, die durch das erfindungsgemäße Enzymgemisch gebildet wurden, d. h. das filtrierte Hydrolysat wurde auf die HPLC-Säule aufgetragen und einzelne Peptide mit Molekülmassen zwischen 400 und 2000 Dalton wurden durch die MS/MS-Analyse weiter charakterisiert. Die Datenbank, die verwendet wurde, um Peptidsequenzinformation über aus Molke oder Casein stammende Hydrolysate zu erhalten, bestand jedoch nur aus Kuhmilchproteinsequenzen.
  • Bestimmung des Molenbruchs von Peptiden (%) mit einem carboxyterminalen Prolin.
  • LC/MS/MS kann für die Analyse des C-Terminus eines Peptids verwendet werden. Mit einem Algorithmus, in dem die (mittels LC/MS analysierte) Molekülmasse des Peptids und seine (mit LC/MS/MS analysierte) (partielle) Aminosäuresequenz mit automatischen Suchverfahren innerhalb von Proteindatenbanken verknüpft werden, können komplexe Peptidgemische analysiert werden. Diese Möglichkeiten haben es uns gestattet, das Auftreten von Peptiden mit einen carboxyterminalen Prolinrest zu quantifizieren. Aufgrund der Beschränkungen durch die verwendete PEPMAP-Peptid-Trennsäule werden nur Peptide mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 400 und 2000 Dalton unter Verwendung dieser Technik analysiert. Glücklicherweise hat in Proteinhydrolysaten der Großteil der Peptide solche Molekulargewichte.
  • Um in einem Proteinhydrolysat den Molenbruch von Peptiden mit einem carboxyterminalen Prolin zu bestimmen, werden einzelne Peptidmaxima, die von der PEPMAP-Säule eluieren, ausgewählt, und partielle carboxyterminale Aminosäuresequenzen werden unter Verwendung der vorstehend angegebenen Techniken bestimmt. Eine Analyse von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30 und stärker bevorzugt zwischen 40 bis 60, zum Beispiel 50, der häufigsten, zufallsgemäß ausgewählten Peptide stellt somit einen Einblick in die Häufigkeit bereit, mit der Peptide auftreten, die einen Prolinrest am Carboxyterminus des Peptids tragen. Der Quotient aus der Anzahl an Peptiden, für die gefunden wird, dass sie einem carboxyterminalen Prolinrest tragen, mal 100 und der Gesamtzahl an analysierten Peptiden liefert somit den Molenbruch an Peptiden (%) mit einem carboxyterminalen Prolin.
  • Bestimmung des Molenbruchs (%) von Prolin in dem zur Herstellung des Hydrolysats verwendeten Proteinsubstrat.
  • Fetthaltiges Material, wie es in Säuglingsformulierungsprodukten auftreten kann, wurde zuerst durch Hexanextraktion entfernt, wie in dem Absatz ausgeführt, der die LC/MS-Analyse von Säuglingsformulierungen und kommerziellen Proteinhydrolysaten beschreibt. Eine Säurehydrolyse der Proteinsubstrate, um die vorhandenen Proteine in freie Aminosäuren umzuwandeln, wurde erzielt, indem eine Suspension von 100 Milligramm proteinhaltigem Material in 2 Milliliter 6 N HCl hergestellt wurde. Die Säurehydrolyse wurde für 22 Stunden bei 112 Grad C in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand 10-fach in verdünnter HCl verdünnt. Nach dieser Hydrolyse wurden die Aminosäuren derivatisiert und gemäß dem Picotag-Verfahren, wie im Betriebshandbuch des Aminosäure-Analyse-Systems von Waters (Milford MA, USA) angegeben, analysiert. Der vorhandene Spiegel an Prolin wurde unter Verwendung von HPLC-Verfahren quantifiziert. Um den Molenbruch (%) von Prolin in der Probe zu bestimmen, wurden die vorhandenen Mikrocool Prolin mal 100, dividiert durch die Summe der Mikromol aller in der Probe vorhandenen Aminosäuren, analysiert. Da während der Säurehydrolyse Trp und Cys zerstört werden, sind diese zwei Aminosäuren nicht in dieser Summe der Mikromol aller Aminosäuren enthalten.
  • Bestimmung der Spiegel an freien Aminosäuren in Proteinhydrolysaten oder Säuglingsformulierungen.
  • Eine genau gewogene Probe des proteinhaltigen Materials wurde in verdünnter Säure gelöst, und Niederschläge wurden durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge entfernt. Eine Aminosäureanalyse wurde an dem klaren Überstand gemäß dem PicoTag- Verfahren, wie im Betriebshandbuch des Aminosäure-Analyse-Systems von Waters (Milford MA, USA) angegeben, durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde eine geeignete Probe aus der Flüssigkeit entnommen, zu verdünnter Säure zugegeben und homogenisiert. Aus der letzteren Lösung wurde eine neue Probe entnommen, getrocknet und unter Verwendung von Phenylisothiocyanat derivatisiert. Die verschiedenen vorhandenen derivatisierten Aminosäuren wurden unter Verwendung von HPLC-Verfahren quantifiziert und aufaddiert, um den Gesamtspiegel an freien Aminosäuren in der gewogenen Probe zu berechnen.
  • Um diesen Gesamtspiegel an freien Aminosäuren in der Probe zu dem Gesamtspiegel an Aminosäuren in Beziehung zu setzen, die aus dieser Probe freigesetzt werden können, wird die Probe ferner einer Säurehydrolyse, gefolgt von Quantifizierung der gesamten vorhandenen freien Aminosäuren, unterworfen, wie vorstehend ausgeführt.
  • Figurlegenden
  • 1: Plasmidkarte des Expressionsplasmids pGBFIN11-EPO. Endo-Pro steht für die prolinspezifische Endoprotease.
  • 2: SDS-PAGE-Analyse von Kulturfiltraten des Wirtsstammes (A. niger CBS513.88) und mehreren Transformanten, welche die prolinspezifische Endoprotease überexprimieren, hier mit dem Pfeil angedeutet.
  • Beispiel 1
  • Hydrolyse von beta-Casein unter Verwendung von Subtilisin in Kombination mit einer prolinspezifischen Endoprotease aus F. meningosepticum.
  • Beta-Casein stellt eine der hauptsächlichen Caseinfraktionen von Kuhmilch dar. Das Protein ist hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz gut charakterisiert und in einer fast reinen Form kommerziell erhältlich. Als solches bietet beta-Casein ein ausgezeichnetes Testsubstrat zur Untersuchung der Beziehung zwischen Enzymspaltstellen und der Länge der während der Enzymhydrolyse gebildeten verschiedenen Peptide. Dieses Beispiel zeigt, dass trotz des Breitsprektrumcharakters von Subtilisin die Zugabe eines sehr spezifischen Enzyms, wie einer prolinspezifischen Endoprotease, eine große Auswirkung auf die Größe der gebildeten beta-Caseinfragmente haben kann. Verbesserte Ausbeuten für Caseinfraktionen nach Inkubation mit Subtilisin in Kombination mit einer prolinspezifischen Endoprotease können daher erhalten werden. Beta-Casein ist relativ reich an Prolin, da eine Säurehydrolyse, gefolgt von Aminosäureanalyse, die gemäß dem Abschnitt Materialien & Verfahren durchgeführt wurde, zeigte, dass sein Molenbruch an Prolin 14% beträgt (Mole Prolin/Mole aller Aminosäuren, wie im Abschnitt Materialien & Verfahren angegeben).
  • Beta-Casein-Pulver (Sigma) wurde in einer Konzentration von 10% (w/w) zusammen mit 0,1% (w/w) DelvolaseTM in einem 0,1 mol/Liter Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst. Nach einer Inkubation für 24 Stunden bei 45°C in einem Schüttelwasserbad wurde die Reaktion durch Erhitzen der Lösung für 15 Minuten bei 90°C gestoppt. Zu einer Hälfte der Lösung (1 ml, der 100 Milligramm beta-Casein enthält) wurden 100 Mikroliter prolinspezifische Endoprotease aus F. meningosepticum (entsprechend 4 Einheiten gemäß dem im World Journal of Microbiology & Biotechnology, Bd. 11, S. 209–212 beschriebenen Verfahren) zugegeben, und die Reaktion wurde weitere 24 Stunden bei 45°C fortgesetzt. Nach einem weiteren Hitzeschock bei 90°C wurden Proben sowohl von dem mit DelvolaseTM als auch dem mit DelvolaseTM + prolinspezifischer Endoprotease behandelten beta-Casein-Material mittels LC/MS-Ausrüstung analysiert, wie im Abschnitt Materialien und Verfahren angegeben.
  • In der nur mit DelvolaseTM gespaltenen Probe identifizierte die LC/MS/MS-Analyse 40 Peptide, die verschiedene Teile des beta-Casein-Moleküls abdeckten. Zusammen machten diese Peptide 79% der gesamten beta- Casein-Sequenz aus. Verschiedene Retentionszeiten der Peptide auf der C18-Säule konnten bis zu Peptidlängen im Bereich von 2 bis 23 Aminosäureresten zurückverfolgt werden. Glutamin erwies sich als der am häufigsten auftretende carboxyterminale Rest (10 von 40 Peptiden). Von keinem der analysierten Peptide konnte gezeigt werden, dass es Prolin als carboxyterminalen Rest enthielt.
  • Im Gegensatz dazu erzeugte die mit DelvolaseTM und prolinspezifischer Endoprotease gespaltene Probe 28 identifizierbare Peptide aus beta-Casein. Zusammen deckten diese Peptide 63% der gesamten beta-Casein-Proteinsequenz ab. Die Peptidgrößenverteilung war bemerkenswert homogen, weil die Peptide in der Länge nur im Bereich zwischen 3 und 9 Resten lagen. Innerhalb dieser Peptidpopulation war Glutamin nur in 3 Peptiden der carboxyterminale Rest, und Prolin erwies sich als der häufigste carboxyterminale Rest (in 17 der 28 analysierten Peptide). Die Ergebnisse zeigen, dass in dem Hydrolysat, das mit der prolinspezifischen Endoprotease hergestellt worden war, die Peptide, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, einen Molenbruch von 61% der gesamten in dem Molekulargewichtsbereich zwischen 400 und 2000 Dalton vorhandenen Peptide darstellen. Somit führt eine Inkubation von beta-Casein mit einer prolinspezifizischen Endopeptidase zur Erzeugung von Peptiden mit Prolin als carboxyterminalem Rest. Außerdem führt die Kombination von Subtilisin plus einer prolinspezifischen Endoprotease zu einer bemerkenswert homogenen Größenverteilung der verschiedenen erzeugten Peptide, was auf hohe Produktausbeuten nach Ultrafiltration eines solchen Hydrolysats hindeutet.
  • Beispiel 2
  • Beta-Casein-Hydrolysate und Bitterkeit.
  • Obwohl Beispiel 1 die Wirkung einer prolinspezifischen Endoprotease auf die Peptidegröße und den Anteil an Peptiden mit Prolin als carboxyterminalem Aminosäurerest veranschaulicht, wurde die Wirkung dieses Enzyms auf die Bitterkeit in Beispiel 1 nicht gemessen. Caseinhydrolysate sind notorisch bitter, und diese Eigenschaft wurde mit ihrem vergleichsweise hohen Gehalt an hydrophoben Aminosäureresten in Verbindung gebracht.
  • Um die Wirkung einer prolinspezifischen Endoprotease auf den Geschmack von beta-Casein, das durch ein Subtilisin hydrolysiert worden war, zu testen, wurden Enzyminkubationen unter Verwendung von DelvolaseTM und der DelvolaseTM mit prolinspezifischer Endoprotease durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Hitzeinaktivierung von sowohl Subtilisin als auch der prolinspezifischen Endoprotease wurden Proben auf Raumtemperatur abgekühlt, und destilliertes Wasser wurde zugegeben, um Casein-Endkonzentrationen von 4% (w/w) zu erhalten. Der Geschmack der letzteren Lösungen wurde dann von einem Paneel erfahrener Geschmackstester unersucht. Die Geschmackstester waren sich in ihrer Schlussfolgerung einig, dass das durch die Kombination von Subtilisin plus prolinspezifischer Endoprotease erhaltene Hydrolysat signifikant weniger bitter war als das Hydrolysat, das unter Verwendung von Subtilisin allein erhalten worden war.
  • Somit verringert die Behandlung von Caseinhydrolysaten mit einer prolinspezifischen Endoprotease erheblich die Bitterkeit des Endprodukts.
  • Beispiel 3
  • Isolation einer prolinspezifischen Endoprotease aus Aspergillus niger.
  • Man ließ eine große Kollektion von Schleimpilzen, die zur Bildung schwarzer Sporen in der Lage waren, in einem Medium mit pH 6,5 wachsen, das 1,0 Gramm K2HPO4, 0,5 Gramm KH2PO4, 0,5 Gramm KCl, 0,5 Gramm MgSO4·7H2O, 0,01 Gramm FeSO4·7H2O, 5 Gramm Glucose, 15 Gramm Kollagen (Sigma) enthielt, und destilliertes Wasser wurde zugegeben, um ein Volumen von 1 Liter zu erhalten. Das Impfgut für jedes Experiment wurde durch ein Verfahren hergestellt, wobei die Sporen von Pilzen, die auf Schrägagar wuchsen (5 Tage alt), in 5 Milliliter sterilem Wasser aufgenommen wurden. Von der letzteren Suspension wurden 2% (v/v) zum Animpfen des pH-6,5-Mediums verwendet. Man ließ sie für 100 Stunden bei 28 Grad C unter Schütteln wachsen, wonach die Kultur filtriert wurde und Proben des klaren Filtrats mit dem synthetischen Peptid Z-Ala-Pro-pNA (Bachem; Bubendorf, Schweiz) bei pH 5,0, 50 Grad C inkubiert wurden. Proben, die in der Lage waren, pNA freizusetzen, wurden mithilfe der Zunahme in der Extinktion bei 410 Nanometer identifiziert. Positive Stämme, die relativ hohe Aktivitäten ergaben, wurden weiter untersucht.
  • Der Stamm G-306 exkretierte eine prolinspezifische Endoprotease und wurde als Aspergillus niger Van Tieghern var. niger identifiziert. Dieser besondere Stamm wurde zur Isolation, Reinigung und weiteren Charakterisierung einer prolinspezifischen Endoprotease verwendet. Um das Enzym zu reinigen, wurde 1 Liter Kulturüberstand auf eine 400-Milliliter-Bacitracin-Silochrome-Säule aufgetragen, die mit 0,05 mol/Liter Natriumacetat pH 5,0 äquilibriert worden war. An die Säule gebundene Proteasen wurden unter Verwendung des Acetatpuffers eluiert, der mit 1 mol/Liter NaCl und 10% (v/v) Isopropanol angereichert war (J. Appl. Biochem., 1983 S. 420–428). Aktive Fraktionen wurden gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf eine 200-Milliliter-Bacitracin-Sepharose-Säule aufgetragen, die wiederum mit Acetatpuffer äquilibriert worden war. Wie zuvor wurde die Elution unter Verwendung des Acetatpuffers durchgeführt, der mit NaCl und Isopropanol angereichert war. Aktive Fraktionen wurden gesammelt, gegen einen 5 Millimol/Liter Acetatpuffer pH 5,0 dialysiert und dann mithilfe von Ultrafiltration mit einer Amicon-PM-10-Membran konzentriert. Um eine fast vollständig reine prolinspezifische Endoprotease zu erhalten, wurde die konzentrierte Flüssigkeit über eine SuperdexTM-75-Säule chromatographisch aufgetrennt, die mit dem 0,05 mol/Liter Natriumacetat-Puffer pH 5,0 äquilibriert worden und mit 0,5 mol/Liter NaCl angereichert war.
  • Weitere Experimente, die mit dem gereinigten Enzym durchgeführt wurden, zeigten ein Molekulargewicht um etwa 66,6 kDalton, einen IEP um pH 4,2, ein pH-Optimum um 5,0 und eine fast 100%ige Wärmebeständigkeit nach Inkubation für 4 Stunden bei 50 Grad C.
  • Um partielle Aminosäuresequenzen des Enzyms zu erhalten, wurde die isolierte Enzymzubereitung zuerst einer zweidimensionalen Gelelektrophorese gemäß dem im Abschnitt Materialien & Verfahren beschriebenen Verfahren unterworfen. Der größte Fleck wurde ausgeschnitten, mit Trypsin inkubiert und eluiert. Die gewonnenen Peptide wurden dann einer LC/MS/MS-Analyse, wie im Abschnitt Materialien & Verfahren beschrieben, unterworfen, um partielle Aminosäuresequenzen zu bestimmen.
  • Die folgenden Aminosäuresequenzen konnten von der prolinspezifischen Endoprotease von Aspergillus niger abgeleitet werden:
    NH2-ATTGEAYFE-COOH
    NH2-ATVNSWTGGWDFTR-COOH
    NH2-DGAPEGTST-COOH
    NH2-EREAGAAVTP-COOH.
  • Diese Aminosäuresequenzen wurden zur Synthese der DNA-Sequenzen verwendet, die für die Isolation des Gens benötigt wurden, das die prolinspezifische Endoprotease aus Aspergillus niger codiert.
  • In späteren Experimenten (siehe Beispiel 10) konnte gezeigt werden, dass die Sequenz NH2-ATTGEAYFE-COOH den Aminoterminus der reifen prolinspezifischen Endoprotease darstellt.
  • Beispiel 4
  • Prolinspezifische Endoprotease und ihre Wirkungen bei der Hydrolyse von Sojaprotein.
  • Das japanischen Patent JP501314 beschreibt eine aus Aspergillus oryzae FS1-32 erhaltene rohe Enzymzubereitung, die größere Mengen einer unspezifischen endoproteolytischen Aktivität und kleinere Mengen einer prolinspezifischen Endoprotease- und eine Carboxypeptidaseaktivität zeigt. Von der Inkubation von Sojabohnenprotein mit dieser rohen Enzymzubereitung wird behauptet, dass sie ein Hydrolysat ergibt, das signifikant weniger bitter ist als ein Sojabohnenhydrolysat, das mit einer anderen Proteasezubereitung erhalten werden kann, der eine prolinspezifische Endoprotease in Kombination mit einer Carboxypeptidase fehlt. In JP5015314 wird vorgeschlagen, dass die Aktivität der prolinspezifischen Endoprotease Prolinreste freilegt, die anschließend durch die Carboxypeptidase entfernt werden. Es wird angenommen, dass die Entfernung dieser hydrophoben carboxyterminalen Prolinreste durch die Carboxypeptidase für den Erhalt eines weniger bitteren Hydrolysats wesentlich ist.
  • Um diese Aussage zu testen, wurde eines der in JP5015314 bereitgestellten Beispiele wiederholt, und die erhaltenen Sojahydrolysate wurden unter Verwendung der oben beschriebenen LC/MS-Technologie anstelle der Bewertung einer Wirkung auf den Geschmack analysiert.
  • JP5015314 zufolge enthielten deren Inkubationen mit Aspergillus oryzae FS 1-32 pro Gramm Substrat die folgenden Enzymaktivitäten.
  • Protease: in der Größenordnung von 650 PU; Carboxypeptidase: in der Größenordnung von 0,01 Einheit und prolinspezifische Endopeptidase: in der Größenordnung von 0,03 Milli-Einheiten.
  • Weil die ursprüngliche Zubereitung aus Aspergillus oryzae FS 1-32 nicht erhältlich war, wurden zwei kommerzielle Enzymzubereitungen, die ebenfalls aus Aspergillus oryzae stammten, bei dem erfindungsgemäßen Beispiel verwendet. Außerdem wurde eine chromatographisch gereinigte prolinspezifische Endoprotease, die aus Aspergillus niger isoliert worden war (siehe Beispiel 3), dazu verwendet, eine Überdosierung der sauren prolinspezifischen Endoprotease zu erzielen.
  • Die enzymatischen Aktivitäten der verschiedenen Zubereitungen wurden gemäß den in JP5015314 bereitgestellten Verfahren gemessen und sind nachstehend dargestellt.
    • – Sumizyme LP 75.000, eine kommerzielle Aspergillusoryzae-Enzymzubereitung, von der bekannt ist, dass sie reich an endoproteolytischer Aktivität ist. Enzymaktivitäten, wie gemäß den Verfahren von JP5015314 untersucht:
    • – Protease: 226 PU/Gramm Produkt; Carboxypeptidase: 21 Einheiten/Gramm Produkt, Prolyl-Endopeptidase: 430 Milli-Einheiten/Gramm Produkt
    • – Flavourzyme 1000 L, eine kommerzielle Aspergillusoryzae-Enzymzubereitung, von der bekannt ist, dass sie reich an endoproteolytischer Aktivität ist. Enzymaktivitäten, wie gemäß den Verfahren von JP 5015314 untersucht:
    • – Protease: 332 PU/Gramm Produkt; Carboxypeptidase: 10 Einheiten/Gramm Produkt, Prolyl-Endopeptidase: nicht nachweisbar
    • – Chromatographisch reine prolinspezifische Endoprotease, die aus Aspergillus niger erhalten und wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert wurde. Enzymaktivitäten, wie gemäß den Verfahren von JP 5015314 untersucht:
    • – Protease: nicht nachweisbar; Carboxypeptidase: nicht nachweisbar, Prolyl-Endopeptidase: 45 Milli-Einheiten/Milliliter.
  • Aus diesen Daten ist ersichtlich, dass obwohl Sumizyme und Flavourzyme für ihre hohen proteolytischen Aktivitäten bekann sind t, keines von ihnen das gleiche sehr hohe Verhältnis von (Endo)Protease- zu Carboxypeptidaseaktivität bereitstellen kann, wie in JP 5015314 beansprucht. Überaschenderweise wurde gefunden, dass Sumizyme LP 75.000 eine erheblich höhere Aktivität einer prolinspezifischen Endoprotease enthält als in JP 5015314 beschrieben.
  • Die verschiedenen Enzymzubereitungen wurden gemäß dem in JP5015314 beschriebenen, aber hinsichtlich der gewünschten Carboxypeptidaseaktivität (0,01 Einheit pro Gramm Substrat) standardisierten Protokoll inkubiert. Sojaisolat (Sogamin 90 HV) wurde als Substrat in diesen Reaktionen verwendet. Nach Inkubation für 5 Stunden bei pH 5 und 50 Grad C wurden die Proben zentrifugiert, und die Überstände bis zur LC/MS-Analyse gefroren aufbewahrt. Die LC/MS-Analyse wurde durchgeführt, wie im Abschnitt Materialien & Verfahren ausgeführt. Bei diesem Experiment bestand die Proteindatenbank nur aus Sojaproteinen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1: Mit mehreren Enzymen behandeltes Sojaprotein.
    Enzymeinheiten pro Gramm Substrat Anzahl analysierter Peptide Molenbruch von Peptiden mit Prolin am C-Terminus(%)
    keine (Referenz) 10 0
    Sumizyme 39 10
    Protease: 0,11
    Carboxypep: 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 0,2
    Flavourzyme 31 6
    Protease: 0,34
    Carboxypep: 0,01
    PEP: keine
    Sumizyme + A. niger 31 10
    Protease: 0,11
    Carboxypep: 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 1,5
    JP5015314 Unbekannt Unbekannt
    Protease: 650
    Carboxypep: 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 0,03
    • PEP: Prolyl-Endopeptidase oder prolinspezifische Endoprotease.
  • Sumizyme LP 75.000 enthält eine prolinspezifische endoproteolytische Aktivität, die etwa 7 Mal höher ist als die beschriebene prolinspezifische endoproteolytische Aktivität im Stamm FS 1-32 und liefert einen Molenbruch von etwa 10% Sojapeptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen. Sumizyme LP 75.000, das mit der aus Aspergillus niger isolierten prolinspezifischen Endoprotease angereichert ist, enthält eine prolinspezifische endoproteolytische Aktivität, die etwa 50 Mal höher ist als die mit dem Stamm FS 1-32 beschriebene Aktivität, ergibt aber auch einen Molenbruch von etwa 10% Sojapeptide, die ein carboxyterminales Prolin tragen. Diese Daten wurden durch Analysieren der Anzahl von Prolinresten bestätigt, die in den Peptiden, aber nicht in carboxyterminaler Position vorhanden sind. Flavourzyme enthält keine nachweisbare prolinspezifische Endpoprotease, ergibt aber unter den Peptiden, die erzeugt werden und für die Analyse mit der LC/MS-Technik geeignet sind, einen Molenbruch von 6% Peptiden, die ein Prolin am carboxyterminalen Ende tragen. Kombiniert mit einem Prolingehalt von etwa 5% dieses Sojaproteinisolates zeigen diese drei Beobachtungen, dass das Vorliegen und die Aktivität der prolinspezifischen Endoprotease in Kombination mit der Carboxypeptidaseaktivität nur eine kleinere Wirkung auf das molare Vorkommen carboxyterminaler Prolinreste hat. So ist es schwierig vorstellbar, dass die in JP5015314 beschriebene und einer prolinspezifischen Endoproteaseaktivität von nur 0,03 Milli-Einheiten zugeschriebene entbitternde Wirkung mit einem hohen Auftreten von Peptiden, die Prolin als carboxyterminalen Aminosäurerest tragen, verknüpft werden kann.
  • Beispiel 5
  • Erhöhte Dosierungen von prolinspezifischer Endoprotease und ihre Wirkungen auf die Hydrolyse von Sojaprotein.
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, dass hohe Spiegel einer prolinspezifischen Endoprotease zum Erzeugen von Sojahydrolysaten erforderlich sind, die eine signifikante Menge an Peptiden enthalten, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen. Die Gesamtgestaltung dieser Experimente war identisch mit den in Beispiel 4 beschriebenen. Wiederum wurde Sojaproteinisolat mit Sumizyme LP 75.000, das hinsichtlich der gewünschten Carboxypeptidaseaktivität von 0,01 Einheit pro Gramm Sojaprotein standardisiert worden war, und unter den in JP5015314 beschriebenen Bedingungen inkubiert. Die Inkubation erfolgte für entweder 2,5 oder 5,0 Stunden bei pH 5 und 50 Grad C und wurde gestoppt, indem das Material für 10 Minuten bei 100 Grad C gehalten wurde. Anschließend wurde etwas von dem für 5 Stunden inkubierten Material entnommen und sein pH auf 7,0 erhöht. Aus diesem Material wurden 3 Proben erhalten, zu denen verschiedene Portionen der in E. coli hergestellten prolinspezifischen Endoprotease aus F. meningosepticum zugegeben wurden. Zu der ersten Probe wurden 1,5 Milli-Einheiten der prolinspezifischen Endoprotease (gemäß JP5015314 , aber bei pH 7,0 und 30 Grad C gemessen, um das pH- und Temperaturoptimum der aus E. coli stammenden prolinspezifischen Endoprotease aufzunehmen) zugegeben, zu der zweiten Probe wurden 150 Milli-Einheiten zugegeben und zu der dritten Probe wurden 15 000 Milli-Einheiten zugegeben, und dann wurden die Proben wiederum für 2 Stunden bei 40 Grad C inkubiert. Nach Inkubation wurden die Proben zentrifugiert, und die Überstände wurden bis zur LC/MS-Analyse gefroren aufbewahrt. Die LC/MS-Analyse erfolgte wie zuvor angegeben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2: Mit hohen Konzentrationen an prolinspezifischer Endoprotease behandeltes Sojarotein.
    Enzym in Milli-Einheiten pro Gramm Substrat Anzahl analysierter Peptide Molenbruch von Peptiden mit Prolin am C-Terminus(%)
    keine (Referenz) 4 0
    Sumizyme 2,5 Stunden PEP: 0,2 26 12
    Sumizyme 5,0 Stunden PEP: 0,2 27 11
    Sumizyme 5,0 Stunden PEP: 0,2 + PEP (E. coli) 1,5 22 14
    Sumizyme 5,0 Stunden PEP: 0,2 + PEP (E. coli) 150 24 17
    Sumizyme 5,0 Stunden PEP: 0,2 + PEP (E. coli) 15000 22 36
    • PEP: Prolyl-Endopeptidase oder prolinspezifische Endoprotease.
  • Die erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine signifikante Zunahme im Auftreten von Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, in dem Hydrolysat völlig von der Zugabe der prolinspezifischen Endoprotease abhängig ist. Dazu sind jedoch nur Aktivitäten in der Lage, welche die in JP5015314 erwähnte Aktivität und die in Sumizyme LP 75 000 vorhandene Aktivität um mehrere Größenordnungen übersteigen. Die Implikation dieser Beobachtung ist, dass eine reine und isolierte prolinspezifische Endoprotease wesentlich ist, um die gewünschte Peptidzusammensetzung des Hydrolysats zu erhalten.
  • Beispiel 6
  • Molares Auftreten von Peptiden, die Prolin als carboxyterminalen Rest tragen, in kommerziellen Hydrolysaten.
  • Wie vorstehend beschrieben, kann LC/MS/MS zur Analyse des C-Terminus eines Peptids verwendet werden. Mit einem Algorithmus, bei dem die (mittels LC/MS analysierte) Molekülmasse des Peptids und seine (mittels LC/MS/MS analysierte) (partielle) Aminosäuresequenz mit automatischen Suchverfahren innerhalb von Proteindatenbanken verknüpft werden, können komplexe Peptidgemische analysiert werden.
  • Bei diesem Beispiel wurden diese Möglichkeiten zur Analyse einer Reihe von kommerziellen Säuglingsformulierungsprodukten sowie kommerziellen Proteinhydrolysaten hinsichtlich des molaren Auftretens von Peptiden verwendet, die carboxyterminale Prolinreste tragen und ein Molekulargewicht zwischen 400 und 2000 Dalton haben.
  • Die folgenden Produkte wurden analysiert.
    • 1. Nidal® HA 1 (Nestle), das 11,5 g Molkeproteinhydrolysate pro 100 g Pulver enthält
    • 2. Alfare® (Nestle), das 16,5 g Molkeprotein pro 100 g Pulver enthält
    • 3. Nutrilon® Pepti Plus (Nutricia), das 13,5 g Molkeprotein pro 100 g Pulver enthält
    • 4. Nutrilon® Pepti Junior (Nutricia), das 16,5 g Molkeproteinhydrolysate pro 100 g Pulver enthält
    • 5. Aptamil® HA (Milupa), das 12,3 g Molkeprotein und Caseinhydrolysate pro 100 g Pulver enthält
    • 6. Pregomin® (Milupa), das 13,3 g von wahrscheinlich Soja- und Kollagenhydrolysaten pro 100 g Pulver enthält
    • 7. Nutramigen® (Mead Johnson), das 14,0 g von wahrscheinlich Caseinhydrolysaten pro 100 g Pulver enthält
    • 8. Vitalarmor® 800 LB (Armor Proteins), das 100% Molkeproteinhydrolysate enthält
    • 9. WPH 916 (New Zealand Milk Products), das 100% Molkeproteinhydrolysate enthält
    • 10. WE80 BG (DMV International), das 100% Molkeproteinhydrolysate enthält
  • Weil die Säuglingsformulierungen etwa 15% Proteinhydrolysat plus Fette (25%) und Kohlenhydrate (50%) enthalten, erwies sich eine Hexan-Extraktion dieser Produkte zur Entfernung der Fettphase als unerlässlich. Die reinen Hydrolysate konnten als solche eingesetzt werden.
  • Um die erhaltenen partiellen Proteinsequenzen mit Sequenzen bekannter Proteine zu verknüpfen, wurde eine Datenbank, die nur Kuhmilchproteinsequenzen enthielt, für alle Proben mit Ausnahme der Pregonin-Probe verwendet. Die Pregonin-Probe wurde unter Verwendung einer Datenbank analysiert, die Soja- und Kollagenspezifische Sequenzdaten enthielt. Aus analytischen Gründen konzentriert sich die LC/MS-Analyse auf Peptide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 400 bis etwa 2000 Dalton, so dass Peptide außerhalb dieses Bereichs nicht berücksichtigt wurden.
  • In jeder Probe konnten zwischen 32 und 76 Peptide identifiziert werden, die Sequenzinformation zu den verwendeten hydrolysierten Proteinen enthielten. In den meisten Proben konnten mehr als 95% der 25 intensivsten Maxima in dem Chromatogramm mit Sequenzinformation zu Milchproteinen in Bezug gesetzt werden. In der Pregonin-Probe konnten nur 65% der 25 intensivsten Maxima in dem Chromatogramm mit Sequenzinformation zu Soja- und Kollagenproteinen in Bezug gesetzt werden. Mögliche Gründe dafür sind das Einbringen anderer Proteinquellen in die Proteinbasis oder schlechte MS/MS-Daten aufgrund kleiner, zusammen eluierender Maxima.
  • Um die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit des Systems zu testen, wurde die Nutrilon Pepti Plus-Probe zweimal extrahiert und in Dreifachproben (zu Beginn der Reihe, in der Mitte und am Ende) analysiert. Es wurde gefunden, dass die aus den verschiedenen Analysen erhaltenen Daten zur Verteilung der carboxyterminalen Aminosäurereste gut übereinstimmten.
  • Das molare Auftreten von Peptiden mit carboxyterminalen Prolinresten in den verschiedenen kommerziellen Produkten wird in Tabelle 3 bereitgestellt. Das molare Auftreten solcher Peptide steht auch in Bezug zum Prolingehalt des zur Herstellung des Hydrolysats verwendeten proteinhaltigen Rohmaterials. Zum Beispiel haben Casein und Kollagen viel höhere Prolingehalte als Molke- oder Sojaproteine. Um diesen Aspekt zu berücksichtigen, wurden die Molenbrüche an Prolin unter den Aminosäuren, die in der Proteinbasis vorlagen, die für jedes kommerzielle Produkt verwendet wurde, auch unter Verwendung von Säurehydrolyse und anschließender Aminosäureanalyse unter Verwendung von Techniken, wie im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben, abgeleitet. Außerdem kann das verwendete Rohmaterial in seiner Empfindlichkeit gegenüber Enzymspaltung unterschiedlich sein, zum Beispiel aufgrund des Vorliegens spezifischer wiederholter Aminosäuresequenzen. Tabelle 3: Molares Auftreten von Peptiden mit carboxyterminalem Prolin in kommerziellen Produkten.
    Säuglingsformulierung Proteinbasis Anzahl analysierter Peptide Molenbruch von Peptiden, die ein C-terminales Prolin tragen (%) Molenbruch von Prolin in Proteinbasis (%)
    Nidal HA 1 Molke 49 0 5
    Alfare Molke 50 2 7
    N. Pepti Plus Molke 74 7 7
    N. Pepti Molke 72 3 7
    Junior
    Aptamil HA Molke/Casein 69 3 9
    Pregomin Soja/Kollagen 41 7 8
    Nutramigen Casein 32 22 11
    reine Hydrolysate
    Vitalarmor 800 LB Molke 54 6 6
    WPH 916 Molke 69 0 5
    WE 80 BG Molke 76 3 8
  • Aus den in Tabelle 3 dargestellten Daten wird deutlich, dass in den populären Molkehydrolysaten das molare Auftreten von Peptiden, die carboxyterminale Prolinreste tragen, niedrig ist. Wenn wir auch den Prolingehalt von Molke berücksichtigen, schließen wir, dass keines der kommerziellen, auf Molke basierenden Produkte einen Molenbruch an Peptiden, die carboxyterminale Prolinreste tragen, enthält, der höher ist als der Molenbruch von Prolin, der in der Proteinbasis vorkommt. Üblicherweise ist der Molenbruch an Peptiden, die ein carboyterminales Prolin tragen, in diesen auf Molke basierenden kommerziellen Produkten 5% oder niedriger.
  • Betrachtet man das molare Auftreten von carboxyterminalen Prolinresten in einem auf Casein basierenden Produkt, wie Nutramigen, sehen wir einen erheblich höheren Spiegel als er in den auf Molke basierenden Produkten gefunden werden kann, sogar wenn man den vergleichsweise hohen Prolingehalt von Casein in Betracht zieht. Jedoch zeigt ein Vergleich des Nutramigen-Produkts einerseits mit dem beta-Caseinhydrolysat, das durch Inkubation mit Subtilisin und einer prolinspezifischen Endoprotease hergestellt wurde (siehe Beispiel 1), den großen Unterschied in der Zusammensetzung, der zwischen einem bestehenden kommerziellen Caseinhydrolysat und einem erfindungsgemäßen Caseinhydrolysat auftreten kann. Während das kommerzielle Produkt (d. h. Nutramigen) ein molares Auftreten von Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, von 22% zeigt, beträgt diese Zahl für das Caseinhydrolysat gemäß Beispiel 1 61%.
  • Beispiel 7
  • Molares Auftreten von Molkepeptiden, die ein carboxyterminales Prolin tragen, in Bezug auf die Konzentration an zugegebener prolinspezifischer Endoprotease.
  • In diesem Beispiel wurde ein kommerzielles Molkeprotein unter verschiedenen Bedingungen mit einer prolinspezifischen Endoprotease, wie von E. coli produziert, inkubiert. In dem erhaltenen Hydrolysat wurde das molare Auftreten von Peptiden, die carboxyterminale Prolinreste tragen, bestimmt.
  • Eine Lösung von Protarmor 905 (Armor Proteins) in Wasser (10% w/w) wurde langsam von 25°C auf 60°C während 1 Stunde in Gegenwart von 2,5% (Gewicht Enzym/Gewicht Substrat) Delvolase bei pH 8,5 erwärmt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung schnell auf 80°C erhitzt und sofort auf 60°C abgekühlt, wonach eine neue 2,5%ige Dosierung von Delvolase zugegeben wurde. Man ließ die Hydrolyse eine weitere Stunde lang ablaufen; dann wurde für 5 min auf 95°C erhitzt und wieder abgekühlt. Nach Einstellen des pH auf 7,4 wurde die prolinspezifische Endoprotease in Konzentrationen von 0,87 und 170 Einheiten/Gramm Substrat zugegeben (U/g in Tabelle 4; Einheiten gemäß dem in World Journal of Microbiology & Biotechnology, Bd. 11, S. 209–212 beschriebenen Verfahren), und man ließ die Hydrolyse für weitere 3 Stunden bei 45°C ablaufen. Am Ende wurde die Lösung für 5 Minuten bei 95°C gehalten, um das Enzym zu inaktivieren und die Lösung zu pasteurisieren. Die Hydrolysate wurden dann wie erhalten durch LC/MS analysiert, um das molare Auftreten von carboxyterminalen Prolinresten in den wie vorstehend beschrieben gebildeten Peptiden zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4: Enzymdosierung und molares Auftreten von Petiden, die carboxyterminales Prolin tragen.
    Temperatur Dosierung der prolinspezifischen Endoprotease Anzahl analysierter Peptide Anzahl von Peptiden, die Prolin in C-terminaler Position tragen Molares Auftreten von Peptiden mit Prolin in C-terminaler Position (%)
    30°C 0 U/g 40 2 4
    87 U/g 33 12 52
    170 U/g 46 19 53
    45°C 0 U/g 45 0 0
    87 U/g 49 15 36
    170 U/g 29 13 50
  • Aus dieser Tabelle ergibt sich, dass bei 45°C das molare Auftreten von Peptiden, die Prolin an ihrem C-Terminus tragen, sich mit der Dosis der prolinspezifischen Endoprotease erhöht. Es wurde gezeigt, dass unter Verwendung der höchsten Enzymdosierung bis zu 50% der Peptide, die aus diesem Molkeprodukt erhalten werden konnten, einen carboxyterminalen Prolinrest tragen. Wenn die Inkubation bei 30°C durchgeführt wird, kann das molare Auftreten von Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, 52% mit 87 Einheiten/Gramm Substrat erreichen und wird mit höheren Dosen des Enzyms kaum erhöht. Das mit 87 U/g bei 30°C verglichen mit 45°C erreichte höhere Auftreten kann durch eine niedrige Wärmebeständigkeit des E.-coli-Enzyms erklärt werden.
  • Beispiel 8
  • Geschmack und Zusammensetzung von Molkehydrolysaten, die mit und ohne prolinspezifische Endoprotease hergestellt wurden.
  • In diesem Beispiel wurde eine aus E. coli erhaltene prolinspezifische Endoprotease in Kombination mit Subtilisin (Delvolase) zur Herstellung eines Molkehydrolysats von niedriger Bitterkeit verwendet. Unter Verwendung der in Beispiel 7 erzeugten Daten wurde die Dosierung der prolinspezifischen Endoprotease derart gewählt, dass nur eine marginale Zunahme an Peptiden, die carboxyterminale Prolinreste tragen, erwartet werden konnte. Das mit der prolinspezifischen Endoprotease gebildete Hydrolysat wurde mit einem ähnlichen Hydrolysat, das ohne eine prolinspezifische Endoprotease gebildet wurde, sowie mit einem kommerziellen, wenig bitteren Molkehydrolysat verglichen. Alle drei Produkte wurden hinsichtlich des Geschmacks und ihres Gehaltes an Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, charakterisiert.
  • Eine Lösung von Protarmor 905 (Armor Proteins) in Wasser (10% w/w) wurde langsam von 25°C auf 60°C während 1 Stunde in Gegenwart von 2,5% (Gewicht Enzym/Gewicht Substrat) Delvolase bei pH 8,5 erwärmt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung schnell auf 80°C erhitzt und sofort auf 60°C abgekühlt, wonach eine neue 2,5%ige Dosierung von Delvolase zugegeben wurde. Man ließ die Hydrolyse eine weitere Stunde lang ablaufen; dann wurde für 5 min auf 95°C erhitzt und wieder abgekühlt. Nach Einstellen des pH auf 7,4 wurde die prolinspezifische Endoprotease in Konzentrationen von 50 Einheiten/Gramm Substrat zugegeben. Dies ließ man für 3 Stunden bei 45°C ablaufen. Den im Beispiel 7 erhaltenen Daten zufolge führen diese Bedingungen nur zu einer marginalen Zunahme an Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen. Am Ende wurde die Lösung für 5 Minuten bei 95°C gehalten, um das Enzym zu inaktivieren und die Lösung zu pasteurisieren. Dann wurde die Lösung abgekühlt. Die gleiche Behandlung wurde auf eine weitere Probe angewendet, aber ohne Zugabe der prolinspezifischen Endoprotease.
  • Eine sensorische Analyse des Hydrolysats wurde in so genannten Two-Paired-Vergleichstests durchgeführt. Dieser Testtyp wird durch die American Society of Brewers Chemists (ASBC) verwendet, um die Bitterkeit von 2 verschiedenen Bieren zu vergleichen. Wenn wir ein 5%iges Fehlerrisiko in einem solchen einseitigen Test akzeptieren, ist die Schwelle für den Erhalt eines statistischen Unterschieds 17 von 24 Antworten. In jedem Test wurden die Hydrolysate in Konzentrationen von 2,5% Trockensubstanz probiert, und 1-ml-Portionen von jeder Lösung wurden in einem Einmalgefäß präsentiert. Jeder Bewerter wurde gebeten, den Bitterkeitsspiegel ohne Schlucken zu bewerten und den Mund anschließend mit Wasser zu spülen. Alle Proben wurden codiert und den Bewertern zufallsgemäß übereicht.
  • Der erste Test zielte auf den Nutzen der Kombination von Subtilisin und der prolinspezifischen Endoprotease gegenüber Subtilisin allein. Der zweite Test zielte auf die Bewertung der Bitterkeit der Hydrolysate, die mit der Kombination von Subtilisin und prolinspezifischer Endoprotease erhalten wurden, gegenüber einem kommerziellen, wenig bitteren Hydrolysat (Vitalarmor 800LB). Dazu wurde Vitalarmor 800LB in dem gleichen Puffer verdünnt, wie er für die anderen Hydrolysate verwendet wurde, um eine vergleichbare Proteinkonzentration zu erhalten.
  • Von den 24 an dem Test teilnehmenden Personen bewerteten 17 die Probe, die mit der Kombination von Subtilisin und prolinspezifischer Endoprotease erhalten wurde, als weniger bitter als die mit Subtilisin allein erhaltene Probe. Dieses Ergebnis ist statistisch signifikant und bestätigt die entbitternde Aktivität einer prolinspezifischen Endoprotease, sogar wenn sie in vergleichsweise niedrigen Konzentrationen angewendet wird (vgl. Beispiel 7). Es soll jedoch darauf hingewiesen werden, dass diese "niedrigen" Enzymkonzentrationen mehrere Größenordnungen höher sind als die Enzymdosierungen, die im Patent JP5015314 angewendet werden und für die eine entbitternde Wirkung beansprucht wurde.
  • Im zweiten paarweisen Probenvergleich bewerteten 19 der 24 Teilnehmer die Probe, die mit der Kombination von Subtilisin und prolinspezifischer Endoprotease behandelt worden war, als weniger bitter als das kommerzielle Vitalarmor-800LB-Produkt. Die letztere Beobachtung ist ebenfalls statistisch signifikant und veranschaulicht den ökonomischen Wert der erfindungsgemäßen Hydrolysate und Enzymgemische.
  • Die mit oder ohne die prolinspezifische Endoprotease erhaltenen Hydrolysate wurden mittels LC/MS analysiert, wie vorstehend beschrieben. In dem mit Subtilisin allein erhaltenen Hydrolysat wurden 41 Peptide analysiert. Es stellte sich heraus, dass keines dieser Peptide einen carboxyterminalen Prolinrest trug, trotz der Tatsache, dass von 18 Peptiden gezeigt wurde, dass sie mindestens einen Prolinrest enthalten.
  • In dem Hydrolysat, das mit der Kombination von Subtilisin und prolinspezifischer Endoprotease erhalten wurde, wurden 31 Peptide analysiert, und von 6 wurde gezeigt, dass sie einen carboxyterminalen Prolinrest trugen. Diese Beobachtung, die mit dem übereinstimmt, was aufgrund der in Beispiel 6 erhaltenen Ergebnisse erwartet werden konnte, zeigt, dass als Ergebnis der Inkubation mit der prolinspezifischen Endoprotease das molare Auftreten von Peptiden mit einem carboxyterminalen Prolinrest von 0 auf 19% erhöht wurde. Da die sensorische Analyse der letzteren Produkte eine statistisch signifikant verringerte Bitterkeit gezeigt hat, verbindet dieses Experiment deutlich eine leichte Zunahme im molaren Auftreten von carboxyterminalen Prolinresten mit verringerter Bitterkeit.
  • Es konnte gezeigt werden, dass neben der Verringerung der Spiegel an Bitterkeit diese Inkubation mit einem niedrigen Spiegel an prolinspezifischer Endoprotease auch die Peptidlänge des Hydrolysates verringert. Die LC/MS-Analyse ergab, dass in dem mit Delvolase allein behandelten Hydrolysat die Peptide in der Länge von 4 bis 14 Aminosäuren mit einer durchschnittlichen Länge von 7,5 Aminosäuren variieren. Es konnte gezeigt werden, dass in dem mit der Kombination von Delvolase und der prolinspezifischen Endoprotease behandelten Hydrolysat die Peptidlänge von 4 bis 12 Aminosäuren mit einer durchschnittlichen Länge von 6,1 Aminosäuren variiert. Diese verringerten Peptidlängen verbessern nicht nur die Ausbeute des Hydrolysatproduktionsverfahrens, sondern verringern auch die Gesamt-Allergenität des Hydrolysats und minimieren die Ausfällung unter sauren Bedingungen.
  • Beispiel 9
  • Klonierung der prolinspezifischen Endoprotease aus Aspergillus niger
  • Vorwärts- und Revers-Oligonukleotidprimer wurden unter Verwendung der Peptidsequenzen entwickelt, die in Beispiel 3 aufgeklärt wurden. Um die Degeneriertheit der Primer zu verringern, wurden Inosinbasen an mehreren Positionen eingeführt. Dies erhöht die Häufigkeit von Oligonukleotidprimern in dem Pool, die zur Initiation einer PCR-Reaktion in der Lage sind, aber der Nachteil ist, dass die Spezifität der Reaktion abnimmt.
  • Genomische DNA aus A. niger G306 (als CBS109712 bei der CBS am 10. September 2001 hinterlegt) wurde unter Verwendung von Standardtechniken isoliert und als Matrize in einer PCR-Reaktion mit den in Tabelle 5 dargestellten Oligonukleotidprimern verwendet.
  • Tabelle 5: Peptid- und Oligonukleotidprimer von endo-Pro (I = Inosin)
    Figure 00860001
  • In dem Experiment wurden alle möglichen Kombinationen von Vorwärts- und Revers-Primern zur Amplifikation des Gens verwendet, das für die prolinspezifische Endoprotease aus A. niger codiert. Anfängliche Experimente wurden unter Standard-PCR-Bedingungen (Denaturierung bei 94°C, Hybridisierung bei 55°C und Verlängerung bei 72°C) durchgeführt. Überraschenderweise lieferten diese Experimente keinerlei spezifisches PCR-Produkt. Weil ein negatives Ergebnis auch auf Verunreinigungen in der Matrizen-DNA zurückgeführt werden kann, führten wir Kontroll-PCR-Reaktionen unter Verwendung von PCR-Primern für mehrere verschiedene, aber bekannte A.-niger-Gene durch. In vergleichbaren Reaktionen konnten diese letzteren Gene erfolgreich aus genomischer A.-niger-G306-DNA amplifiziert werden, was zeigt, dass die Unfähigkeit, ein Fragment unter Verwendung der endo-Pro-Primer zu amplifizieren, nicht auf Verunreinigungen in der genomischen DNA-Präparation zurückzuführen war.
  • Anschließend wurde entschieden, die Stringenz der PCR-Reaktion durch Senken der Hybridisierungstemperatur auf 45°C zu verringern. Folglich wurde die Spezifität der PCR verringert, und mehrere Banden wurden amplifiziert, obwohl die meisten diese Banden auch in Kontroll-PCR-Reaktionen, in denen einer der Primer fehlte, ermittelt wurden. Mehrere dieser PCR-Produkte wurden in den allgemeinen Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert, und die DNA-Sequenz dieser Fragmente wurde bestimmt. Unglücklicherweise codierte keines der klonierten Fragmente für das Gen, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert.
  • Zusätzlich wurden viele andere Einstellungen an dem PCR-Protokoll durchgeführt, wie die Verwendung einer anderen Polymerase, Erhöhen der Primer- oder Matrizenkonzentration, eine Touch-Down-PCR und Einführung von eines Heißstarts, aber keines dieser Protokolle ergab ein spezifisches Fragment des Gens, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert. Um die offensichtlichen Risiken dieses unsicheren Ansatzes zu minimieren, wurde entschieden, ein anderes, weniger gut bekanntes Klonierungsverfahren einzusetzen.
  • 3'-RACE
  • Weil keiner unserer Versuche, das Gen, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert, aus genomischer A.-niger-G306-DNA zu amplifizieren, erfolgreich war, entschieden wir, einen anderen Ansatz zu verwenden, wobei RNA ist als Matrize zur cDNA-Synthese verwendet wird. Der Ansatz der Klonierung eines unbekannten Gens unter Verwendung von 3'-RACE, 5'-RACE und Amplifikation des vollständigen offenen Leserahmens ist in W09938956 beschrieben. Der Vorteil dieses Verfahrens verglichen mit dem vorstehend beschriebenen direkten PCR-Verfahren ist, dass eine zusätzliche Initiationsstelle am 3'-Ende der cDNA eingeführt wird, so dass nur ein einziges genspezifisches Oligonukleotid plus ein universeller Primer anstelle von zwei degenerierten Primern zur Amplifikation eines Teils der codierenden Sequenz erforderlich ist. Zusätzlich umgeht die Verwendung von cDNA als Matrize Probleme bei der Amplifikation aufgrund von Introns. Die Verwendung von cDNA als Matrize bei der Amplifikationsreaktion erhöht auch die Konzentration der Matrize verglichen mit der Amplifikation aus genomischer DNA.
  • Gemäß diesem Ansatz wurde A. niger G306 in einem Medium gezüchtet, das Kollagen als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, um die Expression des Gens, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert, zu induzieren. Die Mediumzusammensetzung ist im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Junges Mycel wurde nach 48-ständigem Wachstum bei 34°C geerntet und zur Isolation von Gesamt-RNA verwendet. Dazu wurde Mycel unter Verwendung von Filtration durch eine Miracloth-Filtrationsbinde geerntet und mit eiskaltem sterilem Demiwasser gewaschen. Das Mycel (250 mg) wurde sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und unter Verwendung von Mörser und Pistill zu einem feinen weißen Pulver zermahlen. Das weiße Pulver wurde in ein steriles 15-ml-Greiner-Röhrchen überführt, und Gesamt-RNA wurde mit dem Trizol-Verfahren genau wie vom Zulieferer (Life Technologies, Paisley, GB) beschrieben isoliert.
  • Die RNA-Zubereitung wurde zur Synthese von cDNA von dem Ankerprimer des 3'-RACE-Kits (AP; Life Technologies) verwendet, der cDNA vom Poly-A-Schwanz der mRNA verlängert. Nach RNase-H-Behandlung wurde die cDNA durch PCR mit dem verbrückten universellen Amplifikationsprimer (AUAP; Life Technologies) und dem vorstehend beschriebenen inosinsubstituierten genspezifischen Vorwärtsprimer (Nr. 1, 3, 5 und 7) amplifiziert. Nur mit Primer Nr. 1 plus AUAP konnte ein spezifisches Amplifikationsprodukt von ~1,4 kb aus A.-niger-G306-RNA amplifiziert werden. Mit den anderen Primern wurde bei niedriger Stringenz nur unspezifische Amplifikation erhalten. Dieses 1,4-kb-cDNA-Fragment wurde in pCR2.1 kloniert, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt.
  • 5'-RACE
  • Aus dieser Sequenz wurden drei genspezifische Primer für die weitere Amplifikation des 5'-Teils des Gens gestaltet. Alle drei Primer, 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3', 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3' und 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3', waren komplementär und revers zu der codierenden Sequenz des Gens, das für prolinspezifische Endoprotease codiert.
  • Gesamt-RNA aus A. niger G306 wurde zur Synthese von cDNA mit dem 5'RACE-Kit (Life Technologies) unter Verwendung des Primers 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3' verwendet. Nach RNase-Behandlung wurde die cDNA unter Verwendung der Glasmax-Kartusche (Life Technologies) gereinigt. Ein Poly-dC-Schwanz wurde an die cDNA unter Verwendung von terminaler Transferase (TdT; Life Technologies) angefügt. Die cDNA wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung des verbrückten Ankerprimers (AAP; Life Technologies) und mit dem ersten geschachtelten Primer 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3' amplifiziert. Eine zweite Amplifikationsreaktion unter Verwendung des AUAP-Primers (Life Technologies) und eines zweiten Primers 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3' war erforderlich, um ein spezifisches Amplifikationsprodukt von ~0,25 kb zu erhalten. Dieses Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und in pCR2.1 kloniert, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt. Diese zeigte, dass dieses Fragment den 5'-Teil des Gens enthält, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert.
  • Charakterisierung des Gens
  • Die Kombination der überlappenden Sequenzen der 3'-RACE- und 5'-RACE-Ergebnisse führt zu der vollständigen codierenden Sequenz des Gens, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert. SEQ ID 1 zeigt die gesamte Sequenz des offenen Leserahmens dieses Gens. Die abgeleitete Proteinsequenz von 526 Aminosäuren ist in SEQ ID 2 dargestellt. Das Peptid ATTGEAYFE scheint vollständig korrekt zu sein. Das Peptid DGAPEGTST ist ebenfalls korrekt, wird aber durch genomische DNA codiert, die durch ein Intron unterbrochen ist (siehe SEQ ID 15 und Beispiel 11 zur Klonierung und Sequenz von genomischer DNA von Aspergillus niger CBS513.88). Die anderen zwei Peptide beinhalten Fehler aufgrund des LC/MS/MS-Ansatzes, der für ihre Charakterisierung verwendet wurde (siehe Beispiel 3). Trotz dieser Unsicherheiten haben wir die gewünschte genetische Information, die für die prolinspezifische Endoprotease aus Aspergillus codiert, zum ersten Mal selektiert und identifiziert.
  • Die Neuheit der prolinspezifischen Endoprotease aus Aspergillus wurde durch BLAST-Suchen in bekannten Datenbanken, wie SwissProt, PIR und trEMBL, bestätigt. Keine starke Identität dieses Proteins mit einem anderen Protein konnte ermittelt werden, wenn es mit Proteinsequenzdatenbanken verglichen wurde.
  • Beispiel 10
  • Überexpression des Gens, das für prolinspezifische Endoprotease codiert, und Isolation der prolinspezifischen Endoprotease
  • Der gesamte offene Leserahmen des Gens, das für prolinspezifische Endoprotease codiert, wurde aus cDNA von A. niger G306 unter Verwendung des Primers 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' und des AUAP-Primers (Life Technologies) PCR-amplifiziert. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in den Klonierungsvektor pCR2.1 (Invitrogen) kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit EcoRI gespalten, und das Fragment, welches das endo-Pro-Gen enthielt, wurde in die EcoRI-Stelle des Expressionsvektors pGBFIN-11 ( WO9932617 ) kloniert. Die erhaltenen Klone wurden durch Restriktion mit XhoI überprüft, was ein Fragment von ~0,65 kb ergab, wenn das Fragment in der korrekten Orientierung inseriert war. Das erhaltene Plasmid ist in 1 gezeigt und wurde als pGBFIN11-EPO bezeichnet.
  • A. niger CBS 513.88 wurde als Wirt zur Überexpression des Gens, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert, verwendet. Dazu wurde der Expressionsvektor pGBFIN11-EPO durch Spaltung mit NotI linearisiert, was alle aus E. coli stammenden Sequenzen aus dem Expressionsvektor entfernt. Die gespaltene DNA wurde unter Verwendung von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol- (24:23:1) Extraktion und Ausfällung mit Ethanol gereinigt. Das A.-niger-Transformationsverfahren ist in WO 98/46772 ausgiebig beschrieben. Es ist auch beschrieben, wie Transformanten auf Agarplatten selektiert werden, die Acetamid enthalten, und wie angestrebte Merhfachkopie-Integranten selektiert werden. Vorzugsweise werden A. niger-Transformanten, die mehrere Kopien der Expressionskassette enthalten, für die weitere Erzeugung von Probenmaterial ausgewählt.
  • Kultivierung und Isolation der Protease
  • Ein A.-niger-Stamm, der mehrere Kopien der Expressionskassette enthielt, wurde für die chromatographische Erzeugung von Probenmaterial durch Kultivierung des Stammes in Schüttelkolbenkulturen verwendet. Ein geeignetes Verfahren zur Kultivierung von A.-niger-Stämmen und Abtrennung des Mycels aus der Kulturbrühe ist in WO 98/46772 beschrieben. Die erhaltene Kulturbrühe wurde auf SDS-PAGE analysiert, die in 2 dargestellt ist. Anschließend, wurde die Kulturbrühe für die chromatographische Reinigung der Protease verwendet, um alle kontaminierenden endo- und exoproteolytischen Aktivitäten zu entfernen. Zu diesem Zweck wurde die Fermentationsbrühe zuerst zentrifugiert, um den Großteil der Pilzmasse zu entfernen, und der Überstand wurde dann durch eine Reihe von Filtern mit abnehmenden Porengrößen geleitet, um alle Zellfragmente zu entfernen. Schließlich wurde das erhaltene Ultrafiltrat zehnmal in 20 Millimol/Liter Natriumacetat pH 5,1 verdünnt und auf eine Q-Sepharose-FF-Säule aufgetragen. Die Proteine wurden in einem Gradienten von 0 bis 0,4 Mol/Liter NaCl in 20 Millimol/Liter Natriumacetat pH 5,1 eluiert. Peakfraktionen, die eine Aktivität hinsichtlich der Spaltung von Z-Gly-Pro-pNA (Bachem, Sschweiz) zeigten, wurden gemäß dem in World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209–212 (1995) beschriebenen Protokoll, aber unter leicht modifizierten Assaybedingungen, gesammelt und vereinigt. Unter Berücksichtigung des sauren pH-Optimums der aus A. niger stammenden prolinspezifischen Endoprotease wurde der Enzymassay bei pH 5 in einem Citrat/Phosphat-Puffer bei 37°C durchgeführt. Das Vereinigen der aktiven Fraktionen, gefolgt von Konzentration, ergab schließlich eine Zubereitung, die nur eine einzelne Bande auf der SDS-PAGE und einen Peak bei der HP-SEC zeigte. Weitere Analyse mittels hydrophober Wechselwirkungschromatographie bestätigte die Reinheit der erhaltenen Enzymzubereitung.
  • Ferner wurde die gereinigte prolinspezifische Endoprotease zur Bestimmung des Aminoterminus des reifen Proteins durch Edman-Abbau verwendet. Der Aminoterminus der reifen prolinspezifischen Endoprotease beginnt bei Position 42 in SEQ ID 2 und SEQ ID 17.
  • Beispiel 11
  • Screening anderer Pilzspezies als A. niger hinsichtlich des Vorliegens des Gens, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert
  • Aufgrund der niedrigen Nukleotidsequenzhomologie zwischen dem F. meningosepticum- und dem A.-niger-Gen, das für prolinspezifische Endoprotease codiert, kann eine Kreuzhybrdisierung zwischen diesen zwei Genen ausgeschlossen werden. Um einen Eindruck von der Konservierung der A.-niger-spezifischen Nukleotidsequenz in näher verwandten Organismen zu erhalten, wurden die folgenden Mikroorganismen für ein Hybridisierungsexperiment ausgewählt. Die Pilzspezies Aspergillus niger CBS102.12, Aspergillus niger CBS513.88, Aspergillus niger G306, Aspergillus carbonarius ATCC1025, Aspergillus sojae DSM2809, Aspergillus ochraceus ATCC18500, Aspergillus acculeatis CBS101.43, Verticillium psalliotae CBS396.58, Phialophora mustea C3S142.41, Penicillium chrysogenum URCM237, Phoma exigua CBS431.74, Microsporum gallinae CBS221.55, Acremonium strictum ATCC20371, Rhizomucor miehei CBS370.65, Alternaria altemata CBS103.33, Talaromyces emersonii CBS393.64, Cladosporium chlorocephalum CBS213.73, Cladosporium tenuissinum CBS117.79 und Trichoderma reesi ATCC26921 wurden in 100 ml PDB (Potato Dextrose Broth, Difco) bei 30°C gezüchtet (mit Ausnahme des Talaromyces-Stammes, der bei 50°C gezüchtet wurde) und bei 220 U/min geschüttelt.
  • Wenn die Kulturen ausreichend angewachsen waren, wurde die Mycelmasse mittels Filtration durch Miracloth-Filter geerntet, mit 10 mM KPi-Puffer (pH 7,0) gewaschen und zwischen Filterpapier getrocknet. Das Mycel wurde unter flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill zermahlen, bis ein feines weißes Pulver erhalten wurde. Anschließend wurde die chromosomale DNA unter Verwendung des PureGene-Kits (Gentra Systems, Minneapolis, USA) gemäß den Anweisungen des Zulieferers isoliert.
  • Saccharomyces cerevisiae ATCC20785 wurde als negative Kontrolle bei dem Experiment verwendet und in YePD bei 30°C und unter Schütteln bei 220 U/min kultiviert.
  • Zur Herstellung eines Southern-Blots wurde chromosomale DNA aller Spezies mit XhoI gespalten, und die Restriktionsfragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel in TAE-Puffer aufgetrennt. Nach der Trennung wurden die DNA-Fragmente durch ein herkömmliches Verfahren (Sambrook et al. (1982): Molecular cloning; a laboratory manual, ISBN 0-87969-309-6) auf Nitrocellulose- (0,2 μm, Schleicher & Schuell) Membranen überführt, und der Blot wurde für 2 Stunden bei 80°C gebacken.
  • Die Sonde für die Hybridisierung wurde mittels PCR an pGBFIN11-EPO als Matrize unter Verwendung des Primers 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' und des AUAP-Primers synthetisiert. Etwa 30 Nanogramm des cDNA-Fragments wurden mit 32P-alpha-dATP (Amersham, England) mit dem RadPrime-DNA-Markierungssystem (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Zulieferers markiert. Nach der Markierung wurden die nicht eingebauten dNTPs durch Reinigen des Sondenfragments über eine Sephadex-G50-Säule gemäß dem Säulenzentrifugationsverfahren (Sambrook et al., 1982) entfernt.
  • Vor der Zugabe zu dem Hybridisierungsgemisch wurde die gereinigte Sonde durch Inkubation in kochendem Wasser für 5 Minuten, gefolgt von schnellem Abkühlen in Eis, denaturiert und sofort verwendet.
  • Die Vorhybridisierung der Blots erfolgte in 50 ml 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardt, 0,1 mg/ml Heringssperma-DNA (Life Technologies) für 1 Stunde bei 50°C unter ständigem Schütteln. Nach Zugabe der Sonde zur Vorhybridisierungslösung wurde die Hybridisierung für 16 Stunden bei 50°C durchgeführt. Die Blots wurden zweimal mit 200 ml 6 × SSC, 0,1% SDS für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur und einmal mit 200 ml 6 × SSC, 0,1% SDS für 30 Minuten bei 50°C gewaschen, um unspezifische Hybridisierung von dem Blot zu entfernen. X-Omat-AR-Filme (Kodak) wurden zum Sichtbarmachen der Hybridisierung verwendet
  • Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6 dargestellt. A.-niger- und A.-carbonarius-Stämme ergeben eine starke Hybridisierung mit der Sonde. Auch andere Aspergillus-Stämme, wie A. sojae, A. ochraceus und A. acculeatis, liefern eine Hybridisierung mit der Sonde. Anscheinend ist das Gen, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert, in der Gattung Aspergillus gut konserviert. Überraschenderweise ergeben auch Pilze, die weiter von Aspergillus entfernt sind, wie Phialophora mustea, Rhizomucor miehei, Alternaria alternata, Talaromyces emersonii und Trichoderma reesii, eine gute Hybridisierung mit der cDNA der prolinspezifischen Endoprotease. Saccharomyces cerevisiae, das als negative Kontrolle eingeschlossen wurde, sowie wenige andere Spezies, zeigen keinerlei Hybridisierung mit der cDNA aus A. niger (siehe Tabelle 6). Dieses Ergebnis zeigt, dass das Gen, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert, in vielen Pilzspezies konserviert ist, und ein Fachmann erkennt, dass die Gene aus diesen Spezies unter Verwendung der hier dargestellten heterologen Hybridisierung als Nachweisverfahren isoliert werden können.
  • Um dies zu verdeutlichen, wurde das in diesem Beispiel verwendete cDNA-Fragment aus Aspergillus niger G306 als Sonde für das Screening einer genomischen DNA-Bank von Aspergillus niger CBS513.88 verwendet. Ein Fachmann verfügt über das Wissen, um eine genomische DNA-Bank herzustellen und eine solche Bank mit einer markierten DNA-Sonde zu durchmustern. Dieses Verfahren ist ferner ausgiebig in der Literatur beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Positive Klone beim Screening wurden gereinigt, und die DNA wurde sequenziert. Genomische DNA aus Aspergillus niger CBS513.88, die für die prolinspezifische Endoprotease codiert, ist in SEQ ID 15 dargestellt. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass es möglich ist, das Gen, das für die prolinspezifische Endoprotease codiert, aus anderen Spezies und Stämmen unter Verwendung von Hybridisierung an die cDNA dieses Gens aus Aspergillus niger G306 zu isolieren.
  • Die abgeleitete codierende Sequenz und die Aminosäuresequenz der prolinspezifischen Endoprotease von CBS513.88 sind in SEQ ID 16 bzw. SEQ ID 17 dargestellt. Tabelle 6: Heterologe Hybridisierung des A.-niger-endo-Pro-Gens an chromosomale DNA verschiedener Pilze.
    Spezies Hybridisierung
    Aspergillus niger CBS102.12 +++
    Aspergillus niger CBS513.88 +++
    Aspergillus niger G306 +++
    Aspergillus carbonarius ATCC1025 +++
    Aspergillus sojae DSM2809 +
    Aspergillus ochraceus ATCC18500 ++
    Aspergilus acculeatis CBS101.43 +
    Saccharomyces cerevisiae ATCC20785 -
    Verticillium psalliotae CBS396.58 -
    Phialophora mustea CBS142.41 +
    Penicillium chrysogenum URCM237 -
    Phoma exigua CBS431.74 -
    Microsporum gallinae CBS221.55 -
    Acremonium strictum ATCC20371 -
    Rhizomucor miehei CBS370.65 +
    Alternaria alternata CBS103.33 +
    Talaromyces emersonii CBS393.64 +
    Cladosporium chlorocephalum CBS213.73 -
    Cladosporium tenuissinum CBS117.79 -
    Trichoderma reesii ATCC26921 +
  • Beispiel 12
  • Aus Aspergillus oryzae FS 1-32 erhaltenes Enzymgemisch und seine Wirkungen bei der Hydrolyse von Sojaprotein.
  • Das japanische Patent JP5015314 offenbart eine aus Aspergillus oryzae FS 1-32 erhaltene rohe Enzymzubereitung, die größere Mengen einer nicht genauer angegebenen endoproteolytischen Aktivität und kleinere Mengen einer prolinspezifischen Endoprotease enthält. Diese rohe Zubereitung enthält weiterhin eine signifikante Carboxypeptidaseaktivität. Nach Inkubation von Sojabohnenprotein mit dieser rohen Enzymzubereitung wird ein Sojabohnenproteinhydrolysat erhalten, von dem beansprucht wird, dass es signifikant weniger bitter ist als ein Sojabohnenhydrolysat, das mit anderen Proteasezubereitungen erhalten werden kann. Die in JP5015314 für diese nützliche entbitternde Wirkung gegebene Erklärung ist, dass in anderen Proteasezubereitungen das Vorliegen einer prolinspezifischen Endoprotease in Kombination mit einer Carboxypeptidase fehlt. JP5015314 schlägt vor, dass die Basis für die entbitternde Wirkung die Entfernung der Prolinreste ist, die durch die Aktivität der prolinspezifischen Endoprotease freigelegt und anschließend durch die Carboxypeptidase entfernt werden.
  • Das erfindungsgemäße Beispiel 4 beschreibt die Wirkungen eines Gemischs kommerzieller Enzyme, die dem proteolytischen Aktivitätsprofil des Stammes A. oryzae FS 1-32 ähneln, auf Sojaprotein. Eine der Schlussfolgerungen dieser experimentellen Arbeit ist, dass das Einbringen einer prolinspezifischen endoproteolytischen Aktivität in Spiegeln, wie sie mit dem Stamm FS 1-32 berichtet werden, nicht zu einer merklichen Zunahme an Sojapeptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, führt. Da diese Schlussfolgerung wichtige Implikationen im Hinblick auf das in der vorliegenden Anmeldung beschriebene nicht- bittere Proteinhydrolysat hat, beschlossen wir, das Experiment, jedoch unter Verwendung des Enzymgemischs, wie aus A. oryzae FS 1-32 erhalten, und unter Bedingungen, wie in JP5015314 beschrieben, zu wiederholen.
  • Aspergillus oryzae FS 1-32 (wie aus der Hinterlegung 12193 des Micr. Ind Lab in Japan erhalten) wurde auf Malzextrakt-Agarplatten plattiert, für vier Tage bei 35°C inkubiert und dann einen Tag bei 4°C aufbewahrt. Sporen von dichten Platten wurden zum Beimpfen des Impfmediums verwendet, das 20 Gramm/kg Dextrose, 15 Gramm/kg entfettetes Sojamehl, 5 Gramm/kg Niedrig-Salz-Hefeextrakt, 1 Gramm/kg KH2PO4 und 0,2 Gramm/kg Antischaummittel enthielt. Nach Lösen in entmineralisiertem Wasser wurde der pH des Mediums mit Schwefelsäure auf 5,5 eingestellt und dann in Portionen von 20 ml in 100-ml-Schüttelkolben mit Schikanen verteilt. Die Schüttelkolben mit Medium wurden für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert und nach Abkühlen beimpft. Nach zwei Tagen in einem Schüttelinkubator bei 32°C wurde 1 ml zum Animpfen von weiteren 100 ml Impfmedium verwendet. Nach einem weiteren Tag im Schüttelinkubator bei 32°C wurde diese Kultur zum Animpfen des Kulturmediums verwendet. Weil JP501314 keine Information hinsichtlich der verwendeten Fermentationsverfahren liefert, wurden das Fermentationsprotokoll und -medium, wie in EP 0 522 428 bereitgestellt, verwendet.
  • Das Kulturmedium gemäß EP 0 522 428 enthält die folgenden Komponenten: Säurecasein (Armor Proteins, Frankreich) 25,4 Gramm/Liter, geröstetes Sojabohnenmehl (Cargill, Niederlande) 8,6 Gramm/Liter, Weizenkleine (Zonnatura, Niederlande) 15,0 Gramm/Liter, Maisstärke 20,0 Gramm/Liter, Tanninsäure (Omnichem) 16,0 Gramm/Liter und KH2PO4 26,6 Gramm/Liter. Weil die empfohlene Tanninsäure (zur Stimulation der Bildung der prolinspezifischen Endoprotease) in EP 0522428 nicht angegeben wurde, wurden zwei Arten von Tanninsäuren, d. h. BREWTAN C und TALAAL W2 (beide von Omnichem (Wetteren, Belgien), verwendet. Schließlich wurde der pH-Wert des Kulturmediums mit Phosphorsäure (20%) auf 4,5 eingestellt, und dann wurde es in Portionen von 100 ml in 500-ml-Schüttelkolben mit Schikanen aufgeteilt. Die Kolben wurden für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.
  • Nach Beimpfen mit 1 Milliliter des vorgezogenen Impfmediums wurden die Kulturen für 2 und 4 Tage bei 32°C, 250 U/min inkubiert. Um die Biomasse zu entfernen, wurden die Kulturbrühen über Whatman-Glasmikrofaserfilter (Kat.-Nr. 1820090) filtriert, die dann bei –20°C aufbewahrt wurden. Ein Teil dieses gefrorenen Materials wurde lyophilisiert und für Aktivitätsmessungen sowie Inkubationen mit Sojaprotein verwendet.
  • Die Aktivitäten der Prolyl-Endopeptidase, Carboxypeptidase und Endoprotease in den lyophilisierten Materialien wurden genau wie in JP5015314 beschrieben gemessen. Die Proben, die für 2 Tage fermentiert worden waren, zeigten merklich höhere Enzymaktivitätsspiegel als die Proben, die für die empfohlenen 4 Tage fermentiert worden waren, so dass entschieden wurde, diese 2-Tage-Proben für die endgültige Inkubation mit Sojaprotein zu verwenden. Enzymaktivitätsdaten von denjenigen Proben, welche die höchsten Prolyl-Endopeptidaseaktivitäten aufwiesen, werden im folgenden dargestellt. Tabelle 7. Enzymaktivitäten pro Gramm lyophilisiertem Material
    Probe Prolyl-Endopeptidaseaktivität Carboxypeptidaseaktivität Proteaseaktivität
    [mU/g] [U/g] [PU/g]
    1 +Brewtan 2,87 4,99 609
    3 +Tanal 2,38 3,68 595
    4 +Tanal 6,30 7,79 592
    Die in den Proben 1, 3 und 4 gemessenen Prolyl-Endopeptidase- und Carboxypeptidaseaktivitäten sind mit den in JP5015314 bereitgestellten Zahlen vergleichbar. Es stellte sich jedoch heraus, dass die in diesen Proben gemessenen Endoproteaseaktivitäten etwa 200-fach niedriger waren als in JP501314 angegeben. Angesichts der in verschiedenen industriellen Enzymzubereitungen beschriebenen endoproteolytischen Aktivitäten (siehe Beispiel 4) sind die extrem hohen endoproteolytischen Aktivitäten, die mit A. oryzae FS 1-32 erhalten und in JP5015314 angegeben werden, wahrscheinlich unrealistisch.
  • In einem Versuch, das Beispiel 2 von JP5015314 so genau wie möglich zu kopieren, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Zehn Gramm Sojaprotein Sogamin 90HV (Lucas Meyer, Hamburg, Deutschland) wurden in 100 ml entmineralisiertem Wasser suspendiert, und der pH wurde mit 4 N NaOH auf 8,5 eingestellt. Dann wurden 0,5 g Delvolase (DSM Food Specialities, Seclin, Frankreich) (anstelle von Protin AY von Daiwa Kasei; Delvolase und Protin AY sind aus Bacillus stammende alkalische Endoproteasen) zugegeben, und die Proteinlösung wurde für 2 Stunden bei 60°C inkubiert (in JP5015314 sind die Inkubationszeit und -temperatur mit Protin AY nicht angegeben). Schließlich wurde die Delvolase durch Erhitzen der Lösung für 10 Minuten bei 92°C inaktiviert.
  • Das erhaltene Proteinhydrolysat wurde dann mit den Enzymproben 1, 3 und 4 gemäß dem in JP5015314 beschriebenen, aber hinsichtlich der gewünschten Carboxypeptidaseaktivität (0,01 Einheit pro Gramm Substrat) standardisierten Protokoll inkubiert. Die Implikation war, dass pro Gramm Sojaisolat 2,0 Milligramm der lyophilisierten Enzymprobe 1, 2,7 Milligramm der lyophilisierten Enzymprobe 3 und 1,3 Milligramm der lyophilisierten Enzymprobe 4 zugegeben werden mussten. Die erhaltenen Endoprotease- und Prolyl-Endoproteaseaktivitäten sind in Tabelle 8 dargestellt.
  • Nach Inkubation für 5 Stunden bei pH 5 und 50 Grad C wurden die Proben zentrifugiert, und die Überstände wurden bis zur LC/MS Analyse gefroren aufbewahrt.
  • Die LC/MS Analyse wurde durchgeführt, wie im Absatz Materialien & Verfahren angegeben.
  • Bei diesem Experiment bestand die Proteindatenbank nur aus Sojaproteinen. Die Häufigkeit von carboxyterminalen Prolinresten, die in den erhaltenen Peptiden nachgewiesen wurden, ist nachstehend angegeben. Tabelle 8: Mit mehreren Enzymen behandeltes Sojaprotein.
    Enzymeinheiten pro Gramm Substrat Anzahl analysierter Peptide Molenbruch von Peptiden mit Prolin am C-Terminus (%)
    Keine (Referenz) 73 3
    Probe 1 (2,0 mg) 76 1
    Protease (PU): 1,20
    Carboxypep (U): 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 0,006
    Probe 3 (2,7 mg) 78 3
    Protease (PU): 1,60
    Carboxypep (U): 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 0,006
    Probe 4 (1,3 mg) 70 2
    Protease (PU): 0,80
    Carboxypep (U): 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 0,008
    JP5015314 Unbekannt Unbekannt
    Protease: 650
    Carboxypep: 0,01
    PEP (Milli-Einheiten): 0,03
    • PEP: Prolyl-Endopeptidase oder prolinspezifische Endoprotease.
  • Aus den erhaltenen Daten ist ersichtlich, dass die Inkubation von Sojaprotein mit der aus Aspergillus oryzae FS 1-32 erhaltenen rohen Enzymzubereitung nicht zu einer signifikanten Zunahme des Molenbruchs an Peptiden führt, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen. Deshalb kann die in JP5015314 beschriebene entbitternde Wirkung nicht einem hohen Vorkommen solcher Peptide in dem endgültigen Hydrolysat zugeschrieben werden.
  • Beispiel 13
  • Ein nicht-bitteres Caseinhydrolysat, das durch Kombination von Thermolysin mit einer prolinspezifischen Endoprotease aus Aspergillus erhalten wird.
  • Prolinspezifische Endoprotease aus A. niger G306 wurde überexprimiert und chromatographisch gereinigt (siehe Beispiel 10) und anschließend zur Herstellung eines nicht-bitteren Caseinhydrolysats verwendet. Zu diesem Zweck gaben wir zu 100 ml einer Lösung von Natriumcaseinat (Miprodan 30), die 60 Gramm pro Liter enthielten, 100 mg Thermolysin (Thermoase) hinzu. Eine Inkubation bei pH 6,7 und 85 Grad C führte zu unmittelbarer Ausflockung und Ausfällung von Caseinprotein. Eine Inkubation für zwei Stunden führte schließlich zu einer geklärten Lösung, die immer noch etwas Niederschlag enthielt. Dann wurde der pH der Lösung auf pH 5,0 eingestellt und die Thermoase durch Erhitzen für 45 min bei 95 Grad C inaktiviert. Nach Abkühlen wurde die Lösung probiert, und es wurde festgestellt, dass sie sehr bitter war. In diesem Stadium betrug der DH (Degree of Hydrolysis (Hydrolysegrad); unter Verwendung des TNBS-Verfahrens festgestellt) der Caseinatlösung etwa 35%. Eine Analyse von 64 Peptiden mittels LC/MS/MS unter Verwendung einer Datenbank für bovine Caseinate ergab ein molares Auftreten von Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, von 14%.
  • Dann wurden 3 Einheiten der chromatographisch gereinigten prolinspezifischen Endoprotease aus A. niger zu 25 Milliliter des Hydrolysats zugegeben. Nach Inkubation für 20 Stunden bei 50 Grad C wurde ein weiterer Enzyminaktivierungszyklus durch Erhitzen der Lösung für 30 Minuten bei 90°C durchgeführt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung dekantiert, und der klare Überstand wurde auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt; es wurde gefunden, dass das Caseinathydrolysat vollständig gelöst war und klar blieb. Probieren zeigte die Abwesenheit von jeglicher Bitterkeit oder Beigeschmäcken. Der DH dieses endgültigen Hydrolysats unter Verwendung des TNBS-Verfahrens betrug etwa 50%; LC/MS/MS-Analyse von 64 Peptiden zeigte, dass das molare Auftreten von Peptiden, die einen carboxyterminalen Prolinrest tragen, auf 45% erhöht wurde. Diese 45% sind fast 4-mal höher als der Molenbruch von Prolin, der in dem Miprodan-Substrat vorhanden ist.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001

Claims (6)

  1. Zubereitung, die zu mehr als 20 Gew.-% der Proteine in der Zubereitung ein isoliertes Polypeptid umfasst, das prolinspezifische Endoproteaseaktivität besitzt und eine Aminosäuresequenz hat, die mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit den Aminosäuren 1 bis 526 der SEQ ID NR: 2 aufweist.
  2. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 97% Identität mit den Aminosäuren 1 bis 526 der SEQ ID NR: 2 aufweist.
  3. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst.
  4. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aus einem Pilz, vorzugsweise einem Aspergillus, stärker bevorzugt aus Aspergillus niger erhältlich ist.
  5. Zubereitung nach Anspruch 1, die mehr als 30, 40, 50, 80, 90, 95 oder 99 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Proteine, des Polypeptids mit prolinspezifischer Endoproteaseaktivität umfasst.
  6. Verfahren zur Herstellung der Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend das Kultivieren eines mikrobiellen Expressionswirtes, der mit einem Polynukleotid transformiert wurde, das ein Polypeptid mit einer prolinspezifischen Endoproteaseaktivität codiert, dessen Aminosäuresequenz mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit den Aminosäuren 1 bis 526 der SEQ ID NR: 2 aufweist, zur Herstellung eines Überstands und/oder von Zellen, die das Polypeptid umfassen, und Gewinnen des Polypeptids.
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