KR100867059B1 - 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물 - Google Patents

카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물 Download PDF

Info

Publication number
KR100867059B1
KR100867059B1 KR1020037007577A KR20037007577A KR100867059B1 KR 100867059 B1 KR100867059 B1 KR 100867059B1 KR 1020037007577 A KR1020037007577 A KR 1020037007577A KR 20037007577 A KR20037007577 A KR 20037007577A KR 100867059 B1 KR100867059 B1 KR 100867059B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
proline
polypeptide
protein
specific
peptides
Prior art date
Application number
KR1020037007577A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030066694A (ko
Inventor
데커페트루스자코부스테오도루스
반데르호이벤로베르투스안토니우스민데르트
에덴스루포
드랑게린다
Original Assignee
디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. filed Critical 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Publication of KR20030066694A publication Critical patent/KR20030066694A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100867059B1 publication Critical patent/KR100867059B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A23J3/16—Vegetable proteins from soybean
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
    • A23J3/343—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
    • A23J3/343—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins
    • A23J3/344—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins of casein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
    • A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
    • A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
    • A23J3/346—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/02—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation containing fruit or vegetable juices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
    • A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56961—Plant cells or fungi
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/38—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from Aspergillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 1번부터 526번 또는 그것의 단편과 40%이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; (b) (i) SEQ ID NO:1 또는 60개, 바람직하게는 100개의 뉴클레오티드에 걸쳐 80% 또는 90%이상, 더욱 바람직하게는 200개의 뉴클레오티드에 걸쳐 90%이상 동일한 그것의 단편, 또는 (ii) SEQ ID NO:1의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열과 낮은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는, 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
단백질 가수분해물, 프롤린-특이적 엔도프로테아제, 탈고미 효과

Description

카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한 단백질 가수분해물 {PROTEIN HYDROLYSATES ENRICHED IN PEPTIDES HAVING A CARBOXY TERMINAL PROLINE RESIDUE}
본 발명은 단백질 가수분해물, 가수분해물의 생산 방법 및 이들 가수분해물의 사용에 관련된다.
우유의 효소 가수분해물 또는 우유의 부분은 식품 산업에서 단지 제한된 적용을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 가수분해물을 획득하기 위해 최적화된 공정을 설명하고 청구한 많은 양의 문헌에 의해 증명된 것과 같이, 이들 가수분해물은 시장에서 흥미있는 수익성 영역을 점유한다. 우유 또는 우유 부분은 단백질분해 활성을 갖는 효소로 인해, 1차적으로 생성물의 알레르겐성을 최소화하고, 손쉽게 흡수될 수 있는 소화물을 제공함으로써 위-장 흡수를 용이하게 하며, 지속된 저장 기간동안 침전에 대항하여 산성 생성물에서의 단백질을 안정화시키는 가수분해물을 생산하도록 한다.
유단백질의 분자량을 감소시키는 것이 이들 유리한 효과를 얻기 위해 통상적으로 허용되는 관습임에도 불구하고, 유단백질의 효소성 가수분해는 결점을 갖는다. 효소로 우유를 인큐베이션하는 것의 부정적 양태는 불완전한 단백질분해성 소 화, 펩티드 단편의 길이를 감소시킴에 따라 증가하는 쓴 맛, 필수적인 정제 단계로 인한 최종 생성물의 감소된 수율, 및 유리 아미노산의 높은 농도에 의해 야기되는 불쾌한 맛의 변화를 포함한다.
엔도프로테아제로의 인큐베이션을 통한 모든 우유 부분의 균질 및 완전한 분해는 종종 획득하기 어렵다. 예를 들어, 베타-락토글로불린은 프로테아제 내성인 것으로 공지되고 이 분자의 부분적 소화물은 유아용 유동식에 대해 원치않는 강한 면역원성 반응은 물론이고, 산성 스포츠 음료와 같은 제품에서 가시성 단백질 침전물을 일으킬 수 있다. 단백질 가수분해물에서 불완전하게 분해된 단백질의 부재를 증명하기 위해, 가수분해물로부터 어떤 잔재하는 거대 펩티드 단편의 제거를 위한 최종 한외여과 단계가 일반적으로 요구된다. 가수분해물로부터 이들 부분적으로 분해된 단백질 단편을 제거하는 필수불가결한 단계는 필연적으로 최종 분해 생성물의 수율을 낮춤으로써, 제품 가격을 증가시킨다.
단백질 항원성은 단지 8 내지 10 개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드로 단백질을 분해시킴으로써 극복될 수 있지만, 이러한 광범위 단백질분해에 의해 생성되는 펩티드는 매우 쓴 맛을 낼 수 있다. 이 현상에 대한 일반적인 설명은 높은 함유량의 소수성 아미노산을 갖는 펩티드의 크기가 작을 수록 더 쓴 맛을 촉진한다는 것이다. 사용된 단백질성 미가공 물질의 성질, 분해에 사용된 단백질분해 효소의 타입 및 획득된 펩티드의 길이가 주로 최종 가수분해물과 연관된 고미의 정도를 결정한다. 예를 들어, 많은 소수성 아미노산을 함유한 카세인은, 유장 단백질 보다 훨씬 더 쓴 가수분해물을 생성하는 것으로 공지된다.
산업상의 실행에서, 단백질 가수분해물의 탈고미는 활성화된 탄소 또는 소수성 레진으로의 흡수를 이용한 쓴 펩티드의 선택적 제거에 의해 수행된다. 이러한 제거 단계 중 수반하는 수율 감소는 최종 생성물의 가격을 증가시킨다. 게다가, 트립토판, 류신, 페닐알라닌 및 이소류신을 포함하는 몇몇의 영양적으로 필수불가결한 아미노산이 그들의 소수성으로 인해 손실될 수 있기 때문에, 이러한 과정은 최종 생성물의 영양적 가치에 부정적인 효과를 갖는다. 따라서, 이 방법을 이용한 탈고미는 이들 영양적으로 중요한 아미노산이 부족한 가수분해물을 생성하는 경향이 있다.
탈고미는 또한 가수분해물에 엑소펩티다제를 가하여 성취될 수 있다. 이 접근법에서, 아미노-말단 및 카르복시-말단 아미노산은 펩티드의 전반적인 소수성을 감소시키기 위한 시도에서 펩티드로부터 유리된다. 비-선택적 엑소프로테아제로 펩티드의 노출은 불행하게도 최종 가수분해물 내로 제어할 수 없는 양의 유리 아미노산의 방출을 일으킨다. 멸균 또는 스프레이 건조에 요구되는, 유리 아미노산을 함유한 이러한 가수분해물의 그 다음 가열은 종종 Maillard 반응을 통해 육즙의 이취를 생성한다. 더구나, 엑소프로테아제에 의해 생성되는 높은 농도의 유리 아미노산은 삼투성 설사를 야기할 수 있는 수준까지 최종 가수분해물 생성물의 삼투 수치를 증가시킬 수 있다.
그러므로, 단백질 가수분해물의 제품은 단백질분해의 득실 양자간의 균형을 나타낸다. 현재의 관례는 제품 카테고리의 특별한 필요에 대하여 단백질 기질의 효소 분해를 최적화하는 것이다. 예를 들어, 알레르기 체질의 유아를 위해 의도된 단백질 가수분해물은 광범위한 단백질 분해 후 어떤 잔류 거대 분자량의 펩티드 단편의 정밀한 제거를 필요로 한다. 반대로, 우유 알레르기를 거의 나타내지 않는 성인들을 위해 디자인된 제품은 전형적으로, 이취의 가능성을 최소화하고 생성물 수율을 최대화하도록 평균 펩티드 길이가 증가된 가수분해물을 함유한다.
베타-카세인, 베타-락토글로불린 및 알파-락토알부민과 같은 모든 주요 유단백질은 물론이고, 예를 들어, 콩 분리물, 쌀 단백질 및 밀 글루텐으로부터 획득된 식물성 단백질 부분은 중요한 항원성 화합물로 생각된다. 따라서, 이들 우유 및 곡물 단백질을 3000 Da 이하의 분자량으로 효소 분해하는 것은 알레르겐성을 최소화 하는데에 중요한 것으로 생각된다. 유장 내의 베타-락토글로불린 부분은 특히 중요한 알레르겐인 것으로 생각되는데 이는 이 단백질이 모유에서는 나타나지 않으며 베타-락토글로불린의 단백질 분해가 어려운 것으로 증명되었기 때문이다. 광범위하게 가수분해된 단백질 가수분해물을 함유한 유아용 유동식은 전형적으로 높은 농도의 유리 아미노산을 함유하는데, 이는 차선의 맛 및 높은 삼투성을 가리킨다. 현재 시판되는 가수분해된 유아용 유동식의 최근 평가는 이들 대부분이 여전히 유장에 기초된 면역원성 물질을 함유한다는 것을 나타냈다. 이 관찰은 더 낮은 가격에서 개선된 가수분해물을 유도할 수 있는 새로운 효소 혼합물이 계속적으로 요구된다는 것을 가리킨다.
비-의료적 필요를 갖는 소비자, 예를 들어 운동선수 또는 슬리밍 다이어트 중인 사람에 대하여 예정된 제품에서의 단백질 가수분해물은 좋은 맛 성질을 제공하도록 재단되어야 한다. 이러한 상황 하에서, 높은 기호성은 물론이고, 산성 조 건 하에서의 용해성과 같은 물리화학적 양태는 최우선적으로 중요한 것이다. 강화된 과일 주스 및 스포츠 음료를 포함하는, 이 카테고리 내에 있는 제품들은 소비자의 건강을 향상시키기 위해 그 중에서도 특히 글루타민 및 아르기닌의 보충에 촛점을 둔다. 예를 들어, 스포츠 음료는 지속된 높은 강도의 훈련 후 운동선수의 육체적 지구력 및 회복력을 향상시킨다. 밀 글루텐과 같은 글루타민-풍부 곡류 단백질 공급원, 또는 쌀 단백질 및 콩 분리물과 같은 아르기닌-풍부 단백질 공급원은 산성 건강-관련 제품의 보충 욕구를 충족시키는 유단백질의 대안으로서 생각된다. 그러나, 이러한 곡류 단백질, 특히 밀 글루텐은 더욱 산성인 pH 수치 (pH 4 이상)에서는 매우 낮은 용해성을 나타내는데, 이는 완전하게 용해된 글루텐 가수분해물을 얻기가 어렵다는 것을 의미한다.
단백질 가수분해에 연관된 제품 가격 및 질 상의 부정적 영향 때문에, 가수분해물 특성을 개선하고 제품 가격을 낮추도록 의도된 몇몇 효소 혼합물들이 이전의 공보에서 설명되었다. 예는 트립신, 키모트립신 및 판크레아틴과 같은 동물-유래 엔도프로테아제의 사용을 언급한 EP 321 603, Bacillus 또는 Aspergillus 종으로부터 얻은 엔도프로테아제의 사용을 장려한 EP 325 986 및 WO 96/13174를 포함한다. 몇몇 엑소프로테아제가 펩티드의 탈고미 혼합물이 될 수 있는 것으로 설명되었다. 예를 들어, EP 0223 560은 특정 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 사용을 언급한 반면, WO 96/13174는 이 목적을 위하여 아미노-펩티다아제 및 카르복시펩티다아제의 혼합물을 언급한다.
수많은 공보들이 상대적으로 낮은 고미 프로파일을 갖는 단백질 가수분해물 의 생산에 있어서 다양한 엑소펩티다아제와 조합된 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 이로운 효과를 크게 선전한다. 예를 들어, 일본 특허 JP02039896은 낮은 분자량의 펩티드 제제에 있어서 디펩티딜-카르복시펩티다아제와 조합된 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 사용을 언급한다. 세 프롤린-특이적 펩티드 가수분해효소에 의한 프롤린-풍부 올리고펩티드의 분해는 고미없이 치즈 숙성을 가속하는데에 본질적인 것으로서 설명된다 (Journal of Dairy Science, 77 (2) 385-392 (1994)). 더 구체적으로, 카르복시펩티다아제와 조합된 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 탈고미 효과는 JP5015314에 설명된다. JP5015314는 일반적인 비-특이적 단백질분해 활성은 별개로 하고, 적은 양의 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 카르복시펩티다아제 활성을 나타내는, Aspergillus oryzae로부터 얻은 정제되지 않은 효소 제제를 설명한다. JP5015314에 따라서, 펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 프롤린 잔기는 쓴 맛을 야기하고 바람직하지 않다. 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 카르복시펩티다아제 효소 혼합물로 대두 단백질을 인큐베이션 하는 것은, 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 카르복시펩티다아제의 조합이 없는 프로테아제 제제로 얻어진 대두 가수분해물 보다 유의하게 덜 쓴 가수분해물을 수득하였다.
총괄하여, 업계의 상황은 펩티드로부터 카르복시 말단 (또는 아미노 말단) 소수성 아미노산 잔기의 엑소펩티다아제-중재 방출이 유의하게 탈고미된 펩티드 가수분해물에 중요하다는 것을 강하게 제시한다. 마찬가지로, 탈고미에 있어서 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 구체적으로 언급한 문헌은 이 활성의 기능이 카르복시펩티다에제에 의한 소수성 프롤린 잔기의 순차적인 제거를 허용하도록 그들을 노출 시키는 것이라고 교시한다. 이 가설의 함축적 의미는 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 탈고미 활성이 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 생성보다는 이러한 카르복시 말단 프롤린 잔기의 효과적인 제거에 관련된다는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율 (%)이 가수분해물을 생성하는데에 사용된 단백질 기질에 있는 프롤린의 몰분율 (%)보다 두 배 더 많은 펩티드로 이루어진 단백질 가수분해물을 제공한다.
본 발명은 또한
- 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 8%이상, 바람직하게는 15%이상, 더욱 바람직하게는 30 내지 70%인 펩티드로 이루어진 유장 가수분해물;
- 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 25%이상, 바람직하게는 30%이상 및 더욱 바람직하게는 70% 미만인 펩티드로 이루어진 카세인 가수분해물;
- 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 20%이상, 바람직하게는 30 내지 70%인 펩티드로 이루어진 콩 가수분해물;
- 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 20%이상, 바람직하게는 30%이상, 유리하게는 70% 미만인 펩티드로 이루어진 글루텐 가수분해물; 및
- 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 20%이상, 바람직하게는 30%이상, 유리하게는 70% 미만인 펩티드로 이루어진 보리 가수분해물을 제공한다.
본 발명은 나아가
(a) SEQ ID NO.2의 아미노산 1 내지 526과 40%이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 그것의 단편을 갖는 폴리펩티드;
(b) (i) SEQ ID NO.1의 핵산 서열 또는 60 개, 바람직하게는 100 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 80% 또는 90%이상가 동일한, 더욱 바람직하게는 200 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 90%이상이 동일한 그것의 단편, 또는 (ii) SEQ ID NO.1의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열과 낮은 긴축 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 엔도펩티다제를 암호화하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한
- 식품 또는 음료에서 본 발명의 단백질 가수분해물의 사용;
- 본 발명에 따르는 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 사용;
- 단백질 기질로부터 단백질 가수분해물의 효소에 의한 생산 방법 (여기에서, 단백질 기질은 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 인큐베이션되어 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드가 풍부한 단백질 가수분해물을 생산한다);
- 본 발명의 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 이루어진 효소 조성물 (이 조성물은 펩티드로 이루어진 단백질 가수분해물을 생산할 수 있고, 여기에서 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율 (%)은 본 발명의 단백질 또는 가수분해물에서의 프롤린의 몰분율 (%)의 두 배 이상이다); 및
- 본 발명의 단백질 가수분해물로 이루어지거나 또는 본 발명의 방법에 의해 획득될 수 있는 식품을 제공한다.
본 발명자들은 펩티드의 카르복시 말단에서 프롤린 잔기의 높은 발생 빈도가 낮은 고미에 상호연관될 수 있다는 것을 나타냈다. 게다가, 본 발명자들은 카르복시 말단 프롤린 잔기의 원하는 높은 발생 빈도가 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 높은 농도, 즉 몇가지 등급 순으로 그리고 게다가 카르복시펩티다아제의 부재에서 JP5015314에 명시된 활성을 초과하는 농도로만 성취될 수 있다는 것을 예증하였다.
경제적 관점으로부터 이 관찰의 함축적 의미는 많은 양 및 상대적으로 순수한 형태로 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 생산하기 위한 개선된 수단의 명백한 필요가 존재한다는 것이다. 이를 실행하는 바람직한 방법은 재조합 DNA 기술을 이용한 이러한 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 과생산을 통한 것이다. 많은 식품들이 산성이고 산업적인 비-멸균 상황 하에서의 장기간 효소 인큐베이션은 미생물의 오염을 방지하기 위해 산성 인큐베이션 조건을 필요로 하기 때문에, 이것을 실행하는 보다 바람직한 방법은 재조합 DNA 기술을 이용한 산 안정 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 과생산을 통한 것이다. 이것을 실행하는 특히 바람직한 방법은 Aspergillus 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 과생산을 통한 것이고 이것을 실행하는 가장 바람직한 방법은 Aspergillus niger 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 과생산을 통한 것이다. 후자의 방법을 가능하게 하기 위해서 Aspergillus 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 유일한 서열 정보가 중요하다. 암호화 유전 자의 전체 뉴클레오티드 서열이 이용가능해야만 하는 것이 더욱 바람직하다.
일단 새로운 효소가 상대적으로 순수한 형태로 이용가능하게 되었으면, 기술 및 경제적 장점을 갖는 다른 새롭고 놀라운 적용이 생각된다. 새로운 적용은 평범하지 않은 아미노산 조성물을 갖는 단백질 기질로부터의 쓴 맛이 없는 가수분해물의 생성이 될 수 있다. 이런 평범하지 않은 아미노산 조성물은 어떤 식품 적용에 중대한 이익을 제공한다. 예는 높은 농도의 소수성 아미노산 잔기를 갖는 카세인 또는 밀 글루텐 또는 옥수수 단백질이다. 종래의 기술 방법을 이용한 가수분해 상에서 생성되는 혐오스런 쓴 맛 때문에, 지금까지는 이러한 기질들이 실질적으로 사용되지 않았다. 본 발명에 따르는 가수분해 방법을 이용하면, 새롭고, 쓴 맛이 없는 가수분해물이 유아 및 임상 영양식, 치료적 다이어트는 물론이고 소비자 다이어트 및 스포츠 영양식에 사용되도록 이용가능하게 될 수 있다. 이러한 새로운 가수분해물은 별개로 하고, 이와 같은 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 산의 고미 감소 효과에 이용하는 적용이 또한 생각된다. 예를 들어, 치즈 또는 요구르트와 같이 발효 단계를 포함하는 단백질성 식품에 엔도펩티다아제를 혼합하는 것은 숙성 상에서 발생할 수 있는 고미를 억제한다. 또한 효소 변환 치즈 제품 또는 향신료 산업을 위한 단백질 가수분해물 제품과 같이 프로테아제로의 처리를 필요로 하는 단백질성 식품에 본 발명에 따르는 효소를 혼합하는 것은, 고미를 억제하는데에 도움이 될 것이다.
더구나, 쓴 맛을 억제하는 것과 직접적으로 관련 없는 이익들이 또한 연구된다. 이러한 새로운 적용 중 하나는 식품 단백질과 함께 효소를 인큐베이션 하여 이들의 알레르겐성을 감소시키는 것이다. 몇몇 식품 단백질은, 프롤린-풍부 펩티드 서열을 갖는 프롤라민을 함유한 밀 글루텐과 같이, 고도의 알레르겐성 하위부분을 함유한다. 이들 단백질은 새로운 효소가 그들의 항원성을 완화시키도록 할 수 있다. 또다른 새로운 적용은 모든 종류의 반죽에 효소를 혼합하는 것으로, 이는 이렇게 하는 것이 얻어진 빵의 상함을 늦춘다고 관찰되었기 때문이다. 또다른 새로운 적용은 프롤린-풍부 펩티드의 생성을 위한 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 사용이다. 이러한 프롤린-풍부 펩티드는 다양한 식품 또는 기능 식품에 있어서 바람직한 첨가물인데 이는 그들이 식욕감퇴 작용, 섬유소분해 및 항혈전 및 항고혈압 효과, 위 점막의 보호는 물론이고 류마티스 관절염의 예방에 관련되었기 때문이다.
또다른 놀라운 적용은 새로운 효소를 동물 사료에 첨가하여 단백질의 활용을 향상시키는 것이다. 예를 들어, 효소의 첨가는 사료 단백질에 존재하는 난소화성 프롤린 풍부 서열의 소화도를 개선하는 것은 물론이고 높은 농도의 폴리페놀을 함유한, 값싸게 구입가능한 식물성 단백질의 전환률을 개선한다.
또다른 새로운 적용에서, 효소는 맥주 양조에 사용된다. 보리 단백질은 프롤린 풍부 서열이 풍부하고 그것의 비-맥아화 형태에서 곡류 단백질은 적합한 발효가능한 맥아즙을 생성하는데에 요구되는 유리 아미노산으로 분해되기가 극히 어렵다. 상당히 놀랍게도, 매시 (mash)과정에 새로운 효소를 혼합하는 것은 제분된 그러나 비-맥아화된 보리로부터 아미노산 방출을 자극하여 훨씬 더 풍부한 맥아즙이 획득된다는 것을 나타냈다. 유사한 방법으로, 높은 비율의 다른 값싸고 국소적으로 이용가능한 곡물 (예를 들어 사탕수수)을 함유한 매시로부터의 맥주 발효가 개 선될 수 있다.
이들 새로운 적용 대부분에서, 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 바람직하게 산성 pH 최적 조건을 갖는 활성 스펙트럼을 나타내야 한다.
상기-언급된 문제를 극복하기 위하여, 본 발명은 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 단독의 활성, 즉 외부 단백질분해 효소의 실질적인 동시 또는 차후 활성이 없는 활성은, 단백질 가수분해물을 유의하게 탈고미하는데에 충분하다는 것을 예증한다. 그러므로 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 단백질 1 그람 당 본 발명의 효소 제제의 5 유닛(u), 바람직하게는 10 u/g, 더욱 바람직하게는 25 u/g 및 더욱 더 바람직하게는 50 u/g을 포함한다. 게다가, 본 발명에 따라 실행된 연구는 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 단독의 활성, 즉 외부 단백질분해 효소의 실질적인 동시 또는 차후 활성을 갖지 않는 활성이, 단백질 가수분해물의 전반적인 면역원성 수준을 유의하게 감소시키는 것은 물론이고, 산성 조건 하에서 그들의 전반적인 용해성을 유의하게 증가시키는데에 충분하다는 것을 예증한다. 본 발명에 따라 생산된 가수분해물은 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부하다.
본 발명의 구체예는 상당한 수준의 유리 아미노산의 부수적인 생산없이 실질적으로 낮은 고미 및 낮은 알레르겐성을 갖는 단백질 가수분해물의 고수율 생산을 위한, 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 포함하는 효소 혼합물을 제공한다. 이 효소 혼합물은 다양한 단백질 부분의 가수분해물을 제제하는데에 적합하다. 특히, 유단백질과 같은 단백질 기질은, 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 서브틸리신과 인큐베이션되어 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드 단편이 풍부한 단백질 가수분해물을 생산할 수 있다. 용어 "풍부한"은 효소 절단의 가수분해 생성물에서 8%이상의 펩티드 단편이 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는다는 것을 의미하도록 의도된다.
본 발명은 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율 (%)이 가수분해물을 생산하는데에 사용된 단백질 기질 내의 프롤린 몰분율 (%)의 두 배 이상인 펩티드로 이루어진 단백질을 가수분해함으로써 획득된 단백질 가수분해물을 제공한다.
가수분해물에 있는 펩티드의 평균 길이는 일반적으로 3 내지 9 개의 아미노산이다.
본 발명에 따르는 바람직한 가수분해물은, 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 8%이상, 바람직하게는 15%이상, 더욱 바람직하게는 30 내지 70%인 펩티드로 이루어진 유장 가수분해물, 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 25%이상, 바람직하게는 30 내지 70%인 펩티드로 이루어진 카세인 가수분해물, 및 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율이 20%이상, 바람직하게는 30 내지 70%인 펩티드로 이루어진 콩 가수분해물이다.
펩티드 또는 펩티드 단편에 있어서, 펩티드는 400 내지 2000 달톤의 분자량을 갖는 것을 의미한다. 이 펩티드는 "재료 및 방법" 절에 설명된 것과 같이 LC/MC 분석에 따라 분석될 수 있다.
일반적으로 본 발명의 단백질 가수분해물의 생산에 있어서, 단백질 기질은 바람직하게 50%이상이 실질적으로 가수분해된다. 바람직하게는 10%이상의 단백질 기질이 400 내지 2000 달톤의 분자량을 갖는 펩티드로 전환된다. 더욱 바람직하게는 20 내지 90% 및 더욱 더 바람직하게는 30 내지 80%의 단백질 기질이 이러한 펩티드로 전환된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 단백질 기질은 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제, 세린 엔도프로테아제 또는 메탈로 엔도프로테아제로 이루어진 효소 혼합물 및 카르복시펩티다아제로 인큐베이션되어 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드 단편이 풍부한 단백질 가수분해물을 생산할 수 있다.
본 발명의 효소 혼합물은 스포츠 음료 및 쥬스-기초 청량음료의 조미 및 영양 향상을 위한 단백질 가수분해물 생산에서의 사용에 특히 적합한데, 이는 결과로 생긴 가수분해된 펩티드 혼합물이 이러한 청량음료의 우세한 산성 조건 하에서 훌륭한 용해성과 매우 낮은 고미 프로파일을 결합시키기 때문이다. 본 발명의 효소 혼합물은, 예를 들어 세린 프로테아제 또는 메탈로 엔도프로테아제와 같은 하나 이상의 엔도프로테아제를 프롤린-특이적 엔도프로테아제 (E.C. 3.4..21.26)와 함께 함유하여 1차 가수분해물을 제공하는 것으로 특성결정된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 8%이상, 바람직하게는 15%이상, 더욱 바람직하게는 30 내지 70%가 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드 단편으로 이루어진 단백질 가수분해물을 생산할 수 있는, 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 세린 프로테아제 또는 메탈로 프로테아제 효소 혼합물에 관련된다.
본 발명의 또다른 구체예는 카르복시 말단 아미노산 잔기로서 프롤린을 갖는, 상대적으로 높은 함유량의 펩티드가 풍부한 단백질 가수분해물이다. 이런 풍부한 가수분해물은 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는, 8%이상, 바람직하게는 15%이상, 더욱 바람직하게는 30 내지 70%의 펩티드 단편으로 이루어질 수 있다. 단백질 가수분해물 발생에 전형적으로 사용되는 효소 제제는 카르복시 말단에 프롤린 잔기를 갖는 펩티드를 생성할 수 없기 때문에, 이러한 펩티드가 상대적으로 풍부한 단백질 가수분해물은 신규이다.
본 발명의 효소 혼합물에 의한 가수분해를 위한 기질은 전유, 탈지유, 산 카세인, 레닛 카세인, 산 유장 생성물 또는 치즈 유장 생성물을 포함한다. 상당히 놀랍게도, Aspergillus 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 프롤린 잔기의 카르복시 말단 측면을 절단할 뿐만 아니라 히드록시프롤린 잔기의 카르복시-말단 측면도 절단하는데, 이는 다른, 젤라틴과 같은 콜라겐 기초 동물 단백질은 물론이고 뼈 또는 어골 함유 잔여 고기가 효소에 대해 관심있는 기질이 되도록 한다. 더구나, 밀 글루텐, 제분된 보리 및 예를 들어 콩, 쌀 또는 옥수수로부터 얻은 단백질 부분과 같은 식물성 기질이 적합한 기질이다. 본 발명에 따라 생산된 유단백질 가수분해물은 유아 영양식을 위한 저자극성 가수분해물, 장 및 식이 영양식을 위한 기초 가수분해물과 같은 다양한 특수 식품은 물론이고 다양한 형태의 건강 식품을 위한 단백질 농축액에서 추가적인 여과 또는 정제 단계를 거치거나 또는 거치지 않고 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 가수분해물은 유아용 유동식과 같은, 낮은 항원성을 갖는 식료품을 생산하는데에 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명에 따르는 효소 제제는 하나 이상의 단백질 가수분해물에 의해 조미된 식품에서의 고미를 감소시키는데에, 심지어 단백질 가수분해물이 대량으로 존재할 때에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 식품은 5% 내지 10% (질량/부피)의 단백질 가수분해물을 포함할 수 있고 본 발명의 효소 제제를 사용하여 감소된 그것의 고미를 여전히 가질 수 있다.
본 발명은 산성 pH 최적조건을 갖는 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 단독 또는 다양한 식품 적용을 위해 단백질 가수분해물의 제제에 대한 하나 이상의 추가적인 효소와의 조합을 제공한다. 이러한 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 단백질성 물질의 그람당 10 유닛 이상의 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 것으로 정의된다. 이들 유닛은 재료 및 방법 절에 명시된 것과 같이, 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 pH 최적조건이 pH 6 미만일 경우, 예를 들어 Aspergillus niger 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 경우에서는 37℃ 및 pH 5에서 합성 펩티드인 Z-Gly-Pro-pNA를 사용하여 측정되어야 하고 그렇지 않으면 pH = 7에서 측정되어야 한다. 단독으로 또는 효소 혼합물에 있는, 이 분리되어 정제된 효소는 종래 업계에 공지된 효소 혼합물의 수많은 단점을 극복한다. 가장 중요한 것은, 본 발명의 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제가 낮은 알레르겐성 잠재력, 높은 수율 및 낮은 고미 프로파일을 결합시킨 가수분해물 생산에서의 열쇠라는 것이다. 더욱이, 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 또는 이 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 포함하는 효소 혼합물로 생산된 가수분해물은 산에 안정하고 매우 낮은 농도의 유리 아미노산을 함유하여, 스프레이 건조 또는 제품 살균과 같은 가열 단계 도중 최소한의 맛-감소를 생성한다. 본 발명에 따르는 가수분해물은 건조 분말의 그람당 900 마이크로몰 미만의 유리 아미노산, 바람직하게는 건조 분말의 그람당 300 마이크로몰 미만의 유리 아미노산, 더욱 바람직하게는 건조 분말의 그람당 150 마이크로몰 미만의 유리 아미노산, 및 더욱 더 바람직하게는 건조 분말의 그람당 50 마이크로몰 미만의 유리 아미노산을 함유할 것이다.
본 발명에 따르는 효소 혼합물은 분리되어 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 (E.C. 3.4.21.26)와 함께 세린 프로테아제 또는 메탈로 엔도프로테아제와 같은 또다른 엔도프로테아제로 이루어진 것으로 특성결정되는데 이들은 함께 작용하여 1차 단백질 가수분해물을 제공한다.
세린 프로테아제는 알칼리성 엔도프로테아제의 주지된 분류를 대표하고 서브틸리신 (E.C. 3.4.21.62) 및 키모트립신 (E.C. 3.4.21.1)과 같이 그것의 가장 중요한 대표적인 것들 중 몇몇은 Tyr, Trp, Phe 및 Leu과 같은 소수성 아미노산의 카르복시 말단 측면에서 펩티드 사슬을 절단한다. 본 발명의 효소 혼합물은 키모트립신 및/또는 서브틸리신을 함유할 수 있다. 서브틸리신은 Bacillus 종에 의해 생산되고, 특히 광범위한 기질 특이성 및 광범위한 알칼리성 pH 최적조건을 갖는다. 효소는 50℃ 및 60℃ 사이에서 임의적으로 활성이다. 효소는 정식 상품으로서 값싸게 구입가능하고 예를 들어 다양한 우유 가수분해물의 생산에 유용하다. 키모트립신은 동물 판크레아제로부터 얻을 수 있고, 서브틸리신 보다 약간 더 알칼리성인 pH 값에서 어느정도 더 협소한 기질 특이성을 가지며 50℃ 이하에서 임의적으로 활성이다.
메탈로 엔도프로테아제의 분류는 박테리아, 진균 및 고등 생물에 널리 퍼져있다. 그들은 중성 및 산성 메탈로프로테아제로 분리될 수 있다. 이들 두 하위분류 중에서 오직 중성 프로테아제만이 바람직한 절단 선호도, 즉 Phe 및 Leu와 같은 소수성 아미노산 잔기의 카르복시 말단 측면 상에서의 펩티드 사슬 절단을 나타낸다. 중성 메탈로 프로테아제의 카테고리 중 주지된 대표적인 것들은 바실로리신 (E.C. 3.4.24.28) 및 서모리신 (E.C. 3.4.24.27)이고 둘 중 하나 또는 이들 둘 모두는 본 발명의 효소 혼합물에 존재할 수 있다. 두 효소 모두는 Bacillus 종으로부터 획득되고 중성 또는 약한 알칼리성 조건 하에서 최대 활성을 나타낸다. 이들 중성 메탈로 엔도프로테아제 중 덜 주지된 대표적인 것들은 Aspergillus 종으로부터 획득되었다. 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 그것의 탈고미 효과에 사용되지 않고 프롤린 풍부 단백질 서열의 가수분해에 도움이 되는 경우에서, 산성 메탈로프로테아제, 예를 들어 듀테로리신 (EC 3.4.24.39)의 분류와의 조합이 이로울 수 있다. 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 프롤린 잔기의 카르복시-말단에서 펩티드 또는 폴리펩티드를 절단할 수 있는 엔도프로테아제이다. 이러한 효소는 동물 및 식물에서 광범위하게 발견되지만, 미생물에서의 존재는 제한되는 것으로 나타난다. 오늘날까지, 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 Aspergillus (EP 0 522 428), Flavobacterium (EP 0 967 285) 및 Aeromonas (J. Biochem. 113, 790-796), Xanthomonas 및 Bacteroides의 종에서 식별되었다. 대부분의 이들 생물로부터의 프롤린-특이적 효소가 pH 8 주위에서 활성임에도 불구하고, Aspergillus 효소는 pH 5 주위에서 임의적으로 활성이다. 바람직한 구체예에 있어서, 7 아래의 pH 최적조 건을 갖는, 바람직하게는 3.5 내지 6.5의 pH 최적조건을 갖는 프롤린-특이적 엔도프로테아제가 사용되는데 이는 이러한 효소의 기술적 및 경제적 장점 때문이다. 본 발명의 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 상기-언급된 미생물종 중 하나로부터, 특히 Aspergillus 종으로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 Aspergillus niger의 균주로부터 분리된다. 더욱 바람직하게는, 비록 E. coli와 같은 다른 숙주가 적합한 발현 벡터일지라도, 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자를 과발현하도록 엔지니어링된 Aspergillus niger 숙주로부터 분리된다. 예를 들어, 다른 것들 중 E. coli에서 Flavobacterium 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 클로닝 및 과발현은 특정 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 순수한 형태에서 이용가능하게 만든다. 이러한 과생산 구성체의 예는 World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp 209-212에서 제공된다. Aspergillus niger 숙주는 A. niger 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자가 발현되도록 A. niger 프로모터를 사용한 비-재조합 자기-구성체의 생산에 바람직하게 사용된다.
프롤린-특이적-엔도프로테아제의 클로닝 및 생산에 관계된 대부분의 과학 출판물들은 생물학적으로 활성인 단백질의 합성 및 조절에서 이 효소의 역할에 촛점을 둔다. 이 효소를 유용한 단백질 가수분해물의 생산에 연관시킨 출판물은 부족하고 엑소프로테아제를 동반한 효소의 사용에 관심을 둔다. 몇몇 일본 출판물들은 낮은 고미 프로파일을 갖는 가수분해물을 생산할 수 있는 조 및 복합 효소 혼합물에서 프롤린-특이적-내재성단백질분해 활성의 존재를 언급하지만, 사용된 효소 혼 합물은 항상 엑소프로테아제를 함유한다. 카르복시펩티다아제 또는 아미노펩티다아제와 같은 엑소프로테아제의 부재에서 탈고미와 프롤린-특이적 내재성 단백질 분해 활성 간의 어떠한 직접적인 관계는 업계에 없다. 더욱이, 프롤린-특이적-내재성 단백질 분해 활성을 이용하여 생산된 가수분해물과 감소된 면역원성 반응 또는 개선된 산성 용해성과의 어떠한 데이터연결도 이전에 설명된 바가 없었다.
프롤린 특이적 엔도프로테아제를 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태일 수 있다. 여기에서 정의될 때, 분리된 폴리펩티드는 다른 비-프롤린 특이적 엔도프로테아제 폴리펩티드가 본질적으로 없는, 내재적으로 생산되거나 재조합된 폴리펩티드이고, SDS-PAGE에 의해 측정된 것과 같이, 전형적으로는 약 20%이상, 바람직하게는 약 40%이상, 더욱 바람직하게는 약 60%이상, 더욱 더 바람직하게는약 80%이상, 한층 더욱 바람직하게는 약 90%, 및 가장 바람직하게는 약 95% 순수하다. 폴리펩티드는 원심분리 및 크로마토그래피 방법, 또는 조 용액으로부터 순수한 단백질을 얻기 위한 업계에 공지된 어떤 다른 기술에 의해 분리될 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고, 따라서 이 형태의 폴리펩티드는 여전히 분리된 것으로써 간주될 수 있다고 이해될 것이다. 그것은 일반적으로 제제에 있는 단백질의 무게로 20% 이상, 예를 들어 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상이 본 발명의 폴리펩티드인 제제 내의 폴리펩티드로 이루어질 것이다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 유전자를 소유한 미생물로부터 획득될 수 있다. 더욱 바 람직하게, 미생물은 진균류이고, 임의적으로 사상진균류이다. 바람직한 생물은 따라서 종 Aspergillus niger와 같은, Aspergillus 속의 것들이다.
첫번째 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO.2의 1 내지 526 아미노산 (즉, 폴리펩티드)와 약 40%이상, 바람직하게는 약 50%이상, 바람직하게는 약 60%이상, 바람직하게는 약 65%이상, 바람직하게는 약 70%이상, 더욱 바람직하게는 약 80%이상, 더욱 더 바람직하게는 약 90%이상, 한층 더 바람직하게는 약 95%이상, 및 가장 바람직하게는 약 97%이상의 아미노산 동일 정도를 갖고, 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 목적을 위해, 둘 이상의 아미노산 서열 간의 동일 정도는 매트릭스 Blosum 62 및 10의 기대역을 갖는 BLAST P 단백질 데이터베이스 검색 프로그램에 의해 결정된다 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389-3402).
본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO.2 또는 실질적으로 상동인 서열에 설명된 아미노산 서열, 또는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 어떤 서열의 단편을 포함할 수 있다. 일반적으로, SEQ ID NO.1에 나타난 자연적으로 발생하는 아미노산 서열이 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 자연적으로 발생한 변체 또는 SEQ ID NO.2의 폴리펩티드의 종 상동체를 포함할 수 있다.
변체는, 예를 들어, 진균, 박테리아, 효모 또는 식물 세포에서 자연적으로 발생한 폴리펩티드로서, 변체는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성 및 SEQ ID NO.1의 단백질과 실질적으로 유사한 서열을 갖는다. 용어 "변체"는 SEQ ID NO.2의 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 동일한 본질적 특징 또는 기초 생물학적 기능성을 갖는 폴리펩티드를 지칭하고, 대립유전자 변체를 포함한다. SEQ ID NO.2의 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 본질적인 특징은 그것이 단백질 또는 (폴리)펩티드로부터 아미노-말단 아미노산을 절단할 수 있는 효소라는 것이다. 바람직하게, 변체 폴리펩티드는 적어도 SEQ ID NO.2의 폴리펩티드와 동일한 수준의 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는다. 변체는 SEQ ID NO.2의 폴리펩티드와 동일한 계통으로부터 유래되거나, 또는 동일한 속 또는 종의 상이한 계통으로부터 유래된 대립유전자 변체를 포함한다.
이와 유사하게, 본 발명의 단백질의 종 상동체는 유사 서열의 등가 단백질로서, 이는 프롤린 특이적 엔도프로테아제이고 Aspergillus의 또다른 종에서 자연적으로 발생한다.
변체 및 종 상동체는 SEQ ID NO.2의 폴리펩티드를 분리하는데에 사용되었던 여기에 설명된 방법을 이용하고 이러한 방법을 적합한 세포 공급원 (예를 들어, 박테리아, 효모, 진균 또는 식물 세포) 상에서 실행함으로써 분리될 수 있다. SEQ ID NO.2의 폴리펩티드의 변체 또는 종 상동체를 발현하는 클론을 얻기 위해 효모, 박테리아, 진균 또는 식물 세포로부터 제작된 프로브 라이브러리에 대한 본 발명의 프로브를 이용하는 것이 또한 가능하다. 이들 클론은 전통적인 기술에 의해 조작되어 본 발명의 폴리펩티드를 생성할 수 있는데, 이는 그 후 원래 공지된 재조합 또는 합성 기술에 의해 생산될 수 있다.
SEQ ID NO.2의 폴리펩티드 및 변체 및 종 상동체의 폴리펩티드의 서열은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 제공하도록 변형될 수 있다. 예를 들어 1, 2 또는 3 부터 10, 20 또는 30 개의 치환체로 아미노산이 치환될 수 있다. 동일한 수로 결실 및 삽입될 수 있다. 이러한 변화는, 변형된 폴리펩티드가 그것의 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 보유하는 것과 같은, 폴리펩티드의 기능에 있어서 결정적인 구역 외부에 이루어질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 상기 언급된 전장 폴리펩티드 및 그것의 변체의 단편을 포함하고, SEQ ID NO.2에 나타난 서열의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 프롤린 특이적 엔도프로테아제로서 전형적으로 활성을 보유할 것이다. 단편은 적어도 50, 100 또는 200 개의 아미노산 길이가 될 수 있고 또는 SEQ ID NO.2에 나타난 전장 서열보다 동일한 수의 아미노산이 부족한 것이 될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 필요하다면, 합성 수단에 의해 생산될 수 있는 반면 일반적으로 그들은 아래 설명된 것과 같이 재조합으로 제조될 것이다. 합성 폴리펩티드는, 예를 들어, 그들의 확인 또는 정제를 보조하기 위한 히스티딘 잔기 또는 T7 태그의 첨가에 의해, 또는 세포로부터 그들의 분비를 촉진하기 위한 신호 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
따라서, 변체 서열은 SEQ ID NO.2의 폴리펩티드가 분리된 균주 외에 Aspergillus 의 균주로부터 유래된 서열들을 포함할 수 있다. 변체는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 찾고 여기에 설명된 것과 같이 클로닝하고 서열분석함으 로써 다른 Aspergillus 균주로부터 확인될 수 있다. 펩티드가 SEQ ID NO.2의 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 기초 생물학적 기능성을 유지하는 한, 변체는 단백질 서열 내에 있는 단일 아미노산 또는 아미노산 군의 결실, 변형 또는 첨가를 포함할 수 있다.
아미노산 치환은 예를 들어 1, 2 또는 3 부터 10, 20 또는 30 개로 치환될 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 일반적으로 프롤린 특이적 엔도프로테아제로서의 활성을 보유한다. 보존적 치환이 일어날 수 있고; 이러한 치환은 업계에 주지된다. 바람직하게 치환은 폴리펩티드의 폴딩 또는 활성에 영향을 미치지 않는다.
더 짧은 폴리펩티드 서열이 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 길이로 50 개 이상의 아미노산 또는 60, 70, 80, 100, 150 또는 200 개까지의 아미노산의 펩티드는 SEQ ID NO.2의 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 기초 생물학적 기능을 나타내는 한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 특히, 본 발명의 이 양태는 단백질이 완전한 단백질 서열의 단편인 상황을 포함하지만 배타적인 것은 아니다.
두번째 구체예에서, 본 발명은 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 가지며, 낮은 긴축 조건, 더 바람직하게는 중간 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 높은 긴축 조건 하에서 (i) SEQ ID NO.1의 핵산 서열 또는 적어도 SEQ ID NO.1의 C-말단 부분을 포함하되 전체 이하를 갖거나 또는 SEQ ID NO.1의 염기와는 상이한 염기를 갖는 핵산 단편; 또는 (ii) SEQ ID NO.1에 상보적인 핵산 가닥과 혼성화하거나 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 분리된 폴리펩티드를 제공한 다.
용어 "혼성화할 수 있음"은 본 발명의 표적 폴리뉴클레오티드가 백그라운드를 유의하게 상회하는 수준에서 프로브로서 사용된 핵산 (예를 들어, SEQ ID NO.1에 설명된 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 단편, 또는 SEQ ID NO.1의 상보체)과 혼성화할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명은 또한 본 발명의 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 물론이고, 그것에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열은, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 cDNA를 포함하는, RNA 또는 DNA가 될 수 있다. 바람직하게, 뉴클레오티드 서열은 DNA이고 가장 바람직하게는 게놈 DNA 서열이다. 전형적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO.1의 코딩 서열 또는 이것의 상보체와 선택적인 조건 하에서 혼성화 할 수 있는 뉴클레오티드의 인접한 서열을 포함한다. 이러한 뉴클레오티드는 업계에 주지된 방법에 따라 합성될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 백그라운드를 유의하게 상회하는 수준에서 SEQ ID NO.1의 코딩 서열 또는 이것의 상보체와 혼성화될 수 있다. 백그라운드 혼성화는, 예를 들어, cDNA 라이브러리에 존재하는 다른 cDNA 때문에 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 SEQ ID NO.1의 코딩 서열 또는 이것의 상보체 간의 상호작용에 의해 생성되는 신호 수준은, 다른 폴리뉴클레오티드와 SEQ ID NO.1의 코딩 서열 간의 상호작용의 전형적으로는 10배이상, 바람직하게는 20배이상, 더 바람직하게는 50배, 및 더욱 더 바람직하게는 100배이상 만큼 강하다. 상호작용의 강도는, 예를 들어, 32P 등으로 프로브를 방사선 표지함으로써 측정될 수 있다. 선택적 혼성화는 낮은 긴축 (약 40℃에서 0.3 M 염화나트륨 및 0.03 M시트르산 나트륨), 중간 긴축 (예를 들어, 약 50℃에서 0.3 M 염화나트륨 및 0.03 M 시트르산 나트륨) 또는 높은 긴축 (예를 들어, 약 60℃에서 0.3 M 염화나트륨 및 0.03 M 시트르산 나트륨)의 조건을 이용하여 전형적으로 성취될 수 있다.
변형
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 그것은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 그것은 또한 펩티드 핵산을 포함하는 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 그들 내에 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 수많은 상이한 타입의 폴리뉴클레오티드에 대한 변형이 업계에 공지된다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본을 포함하고, 그 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리리신이 첨가된다. 본 발명의 목적을 위하여, 여기에 설명된 폴리뉴클레오티드는 업계에서 이용가능한 어떠한 방법에 의해 변형될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
숙련가들이 평이한 기술을 이용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열이 본 발명의 폴리펩티드가 발현되는 어떤 특정 숙주 생물의 코돈 사용을 반영하는데에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
SEQ ID NO.1의 코딩 서열은 뉴클레오티드 치환 (예를 들어 1, 2 또는 3 부터 10, 25 50 또는 100 개의 치환)에 의해 변형될 수 있다. SEQ ID NO.1의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 삽입 및/또는 결실에 의해 및/또는 한쪽 또는 양쪽 말단에서의 확장에 의해 대안으로 또는 추가적으로 변형될 수 있다. 변형된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 디제네레이트 (Degenerate) 치환이 만들어 질 수 있고/또는 예를 들어 뒤에 폴리펩티드에 대한 참고문헌으로 고찰되는 것과 같이, 변형된 서열이 번역될 때 보존적 아미노산 치환이 일어날 수 있도록 치환될 수 있다.
상동체
SEQ ID NO.1의 DNA 코딩 서열의 상보체와 선택적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함되고, 일반적으로 60이상, 바람직하게는 100이상, 더욱 바람직하게는 200 개 이상의 인접한 뉴클레오티드의 영역 또는 가장 바람직하게는 SEQ ID NO.1의 전장에 걸쳐 SEQ ID NO.의 코딩 서열에 대한 50% 또는 60%이상, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 98%이상 또는 99%이상의 서열 동일성을 가질 것이다. 마찬가지로, 활성 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하고 SEQ ID NO.1의 DNA 코딩 서열의 상보체 단편과 선택적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드가, 본 발명에 의해 또한 포함된다. 60 개, 바람직하게는 100 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 80% 또는 90%이상, 더욱 바람직하게는 200 개의 뉴클레오티드에 걸쳐 90%이상이 동일한 SEQ ID NO.1의 핵산 서열의 C-말단 단편이 본 발명에 포함된다.
상기 언급된 동일의 정도 및 최소 크기의 어떠한 조합은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 정의하는데에 이용될 수 있고, 더욱 긴축인 조합 (즉, 더 긴 길이에 걸친 더 높은 동일성)이 바람직하다. 따라서, 예를 들어 60개, 바람직하게는 100개의 뉴클레오티드에 걸쳐 80% 또는 90%이상가 동일한 폴리뉴클레오티드는, 200개의 뉴클레오티드에 걸쳐 90%이상이 동일한 폴리뉴클레오티드와 같이, 본 발명의 한 양태를 형성한다.
UWGCG Package는 동일성을 계산하는데에 사용될 수 있는 (예를 들어 그것의 디폴트 세팅 상에서 사용되는) BESTFIT 프로그램이다.
PILEUP 및 BLAST N 알고리즘은 서열 동일성을 계산하거나 서열을 정렬하는데에 또한 이용될 수 있다 (예를 들어 그들의 디폴트 세팅 상에서, 등가 또는 상응하는 서열의 확인 등).
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통하여 공공연하게 이용될 수 있다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열에서 동일 길이를 갖는 워드와 얼라이닝될 때 양의 값인 일정 임계값 스코어(T)와 일치하거나 만족시키는 조회 서열에서의 길이(W)를 갖는 짧은 워드를 식별함으로써 우선 하이 스코어링 서열쌍 (HSP)을 식별하는 것을 포함한다. T는 이웃 워드 스코어 임계값이라 불린다. 이들 최초 이웃 워드 히트는 그들을 포함하고 있는 HSP를 찾도록 검색을 개시하기 위한 시드로서 역할한다. 워드 히트는 누적 얼라인먼트 스코어가 증가될 수 있는 때까지 동안 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 확장된다. 각각의 방향으로의 워드 히트에 대한 확장은, 누적 얼라인먼트 스코어가 그 최대 달성값으로부터 양(X)만큼 떨어질 때, 하나 이상의 음의 스코어링 레지듀 얼라인먼트의 축적으로 인해 누적 스코어가 제로 이하로 내려갈 때, 또는 어느 서열의 끝에 도달될 때, 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터(W, T, 및 X)는 얼라인먼트의 속도 및 감도를 결정한다. BLAST 프로그램은 11의 워드 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 얼라인먼트(B), 10의 기대값(E), M=5, N=4, 및 2가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성 측정 중 하나는 최소합(smallest sum) 확률(P(N))인데, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률을 나타낸다. 예를 들어, 서열은, 제 2 서열에 대한 제 1 서열의 비교에서 최소합 확률이 약 1보다 작다면, 바람직하게는 약 0.1보다 작다면, 더 바람직하게는 약 0.01보다 작다면, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001보다 작다면, 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
프라이머 및 프로브
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 프라이머로서, 대안적 증폭 반응을 위한 프라이머로서, 또는 예를 들어, 방사성 또는 비-방사성 표지를 이용하여 전통적인 수단에 의해 노출 표지된 프로브로서 사용될 수 있고, 또는 폴리뉴클레오티드가 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 프라이머, 프로브 및 다른 단편은 길이로 15이상, 예를 들어 20, 25, 30 또는 40 개이상의 뉴클레오티드이다. 이것은 전형적으로 길이로 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 또는 300 뉴클레오티드까지 될 것이고, 또는 심지어 SEQ ID NO.1의 코딩 서열보다 몇 개의 뉴클레오티드 (예를 들어 5 또는 10 뉴클레오티드) 더 짧은 것까지 될 것이다.
일반적으로, 프라이머는 합성 수단에 의해 생산될 것인데, 이는 한번에 하나의 뉴클레오트드를 원하는 핵산 서열의 단계별 제조에 포함시킨다. 자동화된 프로토콜을 이용한 이것을 성취하는 기술은 업계에서 손쉽게 이용가능하다. 더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 수단 (예를 들어 PCR 클로닝 기술)을 이용하여 생산될 것이다. 이것은 한 쌍의 프라이머 (전형적으로 약 15 내지 30 뉴클레오티드)가 클로닝되는 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 원하는 영역을 증폭하도록 만드는 단계, 프라이머가 효모, 박테리아, 식물, 원핵 또는 진균 세포, 바람직하게는 Aspergillus 균주로부터 획득된 mRNA, cDNA 또는 게놈 DNA와 접촉시키는 단계, 원하는 영역의 증폭에 적합한 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응을 실행하는 단계, (예를 들어, 아가로오즈 겔 상에서 반응 혼합물을 정제함으로써) 증폭된 단편을 분리하는 단계 및 증폭된 DNA를 회수하는 단계를 포함할 것이다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터 내로 클로닝 될 수 있게 하기 위하여 적합한 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 디자인될 수 있다.
이러한 기술은 여기에 설명된 프롤린 특이적 엔도프로테아제 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 얻는데에 사용될 수 있다. 인트론, 프로모터 및 트레일러 영역은 본 발명의 범위 내에 있고 (예를 들어, 재조합 수단, PCR 또는 클로닝 기술에 의해) 아날로그 방법에서 또한 얻을 수 있는데, 이는 진균, 효모, 박테리아, 식물 또는 원핵 세포의 게놈 DNA로 시작한다.
폴리뉴클레오티드 또는 프라이머는 노출 표지를 가질 수 있다. 적합한 표지 는 32P 또는 35S와 같은 방사성동위원소, 효소 표지, 또는 바이오틴과 같은 다른 단백질 표지를 포함한다. 이러한 표지는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머에 첨가될 수 있고 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 검출될 수 있다.
표지되거나 표지되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머 (또는 이것의 단편)는 프롤린 특이적 엔도뉴클레오티드 또는 진균 샘플에서의 그것의 변체를 검출하거나 서열분석하기 위한 핵산-기초 시험에 사용될 수 있다. 이러한 검출 시험은 일반적으로, 관심있는 DNA를 함유한 것으로 의심되는 진균 샘플과 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머를 포함하는 프로브를 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계, 및 샘플에서 프로브와 핵산 간에 형성된 어떤 이중체를 검출하는 단계를 포함할 것이다. 검출은 PCR과 같은 기술을 이용하거나 고체 지지물에 프로브를 고정시키고, 프로브와 혼성화되지 않은 어떤 샘플 내의 핵산을 제거한 다음, 프로브와 혼성화된 어떤 핵산을 검출함으로써 성취될 수 있다. 대안으로, 샘플 핵산을 고체 지지물에 고정시키고 프로브를 혼성화한 다음 어떤 결합되지 않은 프로브의 제거 후 이러한 지지물에 결합된 프로브의 양을 검출할 수 있다.
본 발명의 프로브는 적합한 용기에 있는 시험 키트의 형태로 편리하게 포장될 수 있다. 이러한 키트에서 프로브는, 키트가 디자인된 검정 포멧이 이러한 결합을 필요로 하는 고체 지지물에 결합될 수 있다. 키트는 또한 프로빙되는 샘플을 처리하기 위한 시약, 샘플 내의 핵산에 프로브를 혼성화하기 위한 시약, 대조 시약, 설명서 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브 및 폴리뉴클레오티드는 또한 미세검정에 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 진균류, 특히 Asprergillus 속의 진균류와 같은 동일한 생물로부터 폴리펩티드로서 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 SEQ ID NO.1의 서열의 변체를 포함한다. 변체는 첨가, 치환 및/또는 결실에 의해 형성될 수 있다. SEQ ID NO.의 코딩 서열의 이러한 변체는 따라서 프롤린의 카르복시말단 측면에서 폴리펩티드 사슬을 분해할 수 있는 능력을 가진 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 생산
SEQ ID NO.1과 100% 동일성을 갖지는 않지만 본 발명의 범위 내에 있는 폴리뉴클레오티드는 수많은 방법으로 얻을 수 있다. 따라서, 여기에 설명된 프롤린 특이적 엔도프로테아제 서열의 변체는 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 공급원으로서 고찰된 것과 같은 생물로부터 만들어진 게놈 DNA 라이브러리를 프로빙함으로써 얻을 수 있다. 게다가, 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 다른 진균, 식물 또는 원핵 상동체를 또한 얻을 수 있고 이러한 상동체 및 그것의 변체는 일반적으로 SEQ ID NO.1로 혼성화될 수 있을 것이다. 이러한 서열은 다른 종으로부터 유래된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA를 프로빙함으로써, 그리고 (앞서 설명된 것과 같이) 낮은, 중간 또는 높은 긴축 조건 하에서 SEQ ID NO.1의 전부 또는 일부를 포함하는 프로브로 이러한 라이브러리를 프로빙함으로써 얻을 수 있다. SEQ ID NO.1의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산 프로브는 본 발명의 폴리펩티드를 위한 공급원으로서 설명된 것들과 같은, 다른 종으로부터 유래된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙하는데에 사용될 수 있다.
종 상동체는 또한 디제네레이트 PCR을 이용하여 얻을 수 있는데, 이는 보존된 아미노산을 암호화하는 변체 및 상동체 내에 있는 서열을 표적화하도록 디자인된 프라이머를 사용한다. 프라이머는 하나 이상의 디제네레이트 위치를 함유할 수 있고 공지된 서열에 대한 단일 서열 프라이머로 서열을 클로닝하는데에 사용되는 것들 보다 더 낮은 긴축 조건에서 사용될 수 있다.
대안으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 프롤린 특이적 프로테아제 서열 또는 그것의 변체의 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 얻을 수 있다. 이것은 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 선호도를 최적화하는데에 서열로의 침묵 코돈 변화가 필요할 때 유용할 수 있다. 다른 서열 변화는 제한 효소 인식 부위를 도입하거나, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 성질 또는 기능을 변경하도록 만들어질 수 있다.
본 발명은 발명의 폴리뉴클레오티드 및 그것의 상보체로 이루어진 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 설명된 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 서열로서 유용할 것이므로, 그 서열들이 SEQ ID NO.1의 서열에 혼성화하는 것이 일반적으로 바람직함에도 불구하고, 그럴 필요는 없다. 그렇지 않으면, 이러한 폴리뉴클레오티드는 필요에 따라 위에 설명된 것과 같이 표지되고, 사용되 고 만들어질 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는데, 이는 클로닝 및 발현 벡터를 포함하고, 또다른 양태에서 예를 들어, 성장 또는 트랜스포매이션 방법 또는, 본 발명의 폴리펩티드의 발현, 또는 본 발명의 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현이 일어나는 조건 하에서, 적합한 숙주 세포 내로 이러한 벡터를 트랜스펙션하는 방법을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공되는데 여기에서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈에 대해 이종이다. 용어 "이종"은, 일반적으로 숙주 세포에 관하여, 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 게놈에서 자연적으로 발생하지 않거나 폴리펩티드가 그 세포에 의해 자연적으로 생산되지 않는 것을 의미한다. 바람직하게, 숙주 세포는 효모 세포이고, 예를 들어 Kluyveromyces 또는 Saccharomyces 속의 효모 세포이거나 예를 들어 Aspergillus 속의 사상 진균 세포이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 클로닝 또는 발현 벡터와 같은 재조합 복제 가능 벡터 내로 통합될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에 있는 핵산을 복제하는데에 사용될 수 있다. 따라서, 나아간 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제 가능 벡터 내로 도입하고, 그 벡터를 적합한 숙주 세포 내로 도입하고, 벡터의 복제가 일어나는 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 만드는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 발현 벡터와 함께 아래에 설명된다.
벡터
본 발명의 발현 카세트가 삽입된 벡터는 재조합 DNA 방법에 알맞은 어떤 벡터도 될 수 있고, 벡터의 선택은 종종 그것이 도입되는 숙주 세포에 의존할 것이다. 따라서, 벡터는 자발적으로 복제하는 벡터, 즉 플라스미드와 같이, 염색체 외적으로 존재하며 염색체 복제와는 독립적으로 복제하는 벡터가 될 수 있다. 대안으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 숙주 세포 게놈으로 합쳐지고 합쳐진 염색체와 함께 복제하는 것이 될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 벡터 내에 있으면, 숙주 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작동가능하게 연결됨"은 병렬연결을 지칭하는데 여기에서 설명된 성분은 그들의 의도된 방식에서 그들이 작용하도록 허용하는 유연관계에 있다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 프로모터, 인핸서 또는 다른 발현 조절 신호와 같은 조절 서열은 제어 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 코딩 서열의 발현이 성취되는 그러한 경로에 위치된다.
예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지 벡터의 경우에서, 벡터는 복제의 개시점, 임의적으로 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 프로모터의 인핸서 및/또는 조절암호로 제공된다. 종결암호 서열은 폴리아데닐화 서열로서 존재할 수 있다. 벡터는, 박테리아 플라스미드의 경우에서 암피실린 내성 유전자 또는 포유동물 벡터에 대한 네오마이신 내성 유전자와 같이, 하나 이상의 선별가능 마커 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는, 예를 들어 RNA의 생산을 위해, 시험관 내에서 사용될 수 있고 숙주 세포를 트랜스펙션하거나 트랜스포메이션하는데에 사용될 수 있다.
폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 발현 구성체의 일부로서 적합한 숙주 내로 바람직하게 도입되는데 여기에서 DNA 서열은 숙주 세포 내의 DNA 서열의 발현을 지시할 수 있는 발현 신호에 작동가능하게 연결된다. 발현 구성체로 적합한 숙주를 트랜스포메이션 하기 위한 방법은 당업자에게 주지된 것이 이용가능하다. 발현 구성체는 선별가능한 마커를 갖는 벡터의 일부로서 숙주의 트랜스포메이션에 사용될 수 있고, 또는 발현 구성체는 선별가능한 마커를 갖는 벡터와 함께 분리된 분자로서 공동-트랜스포메이션 된다. 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다.
바람직한 선별가능한 마커는 숙주 세포에서의 검출을 보완하거나 약물에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 그들은 아세타미다제 유전자 또는 cDNA (A.nidulans, A.oryae, 또는 A.niger로부터 유래된 amdS, niaD, facA 또는 cDNA군) 또는 G418, 히그로마이신, 블레오마이신, 카나마이신, 플레오마이신 또는 베노밀 저항체 (benA)등의 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자와 같은 대부분의 사상 진균루 및 효모의 트랜스포메이션에 사용될 수 있는 다용성 마커를 포함한다. 대안으로, 특정 선별 마커는 상응하는 돌연변이체 숙주 균주를 필요로 하는 영양요구성 마커와 같이 사용될 수 있다: 예를 들어 URA3 (S. cerevisiae 또는 다른 효모로부터 유래된 유사 유전자), pyrG 또는 pyrA (A. nidulans 또는 A. niger로부터 유래), argB (A. nidulans 또는 A. niger로부터 유 래) 또는 trpC. 바람직한 구체예에서 선별 마커는 선별 마커 유전자가 없는, 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 트랜스포메이션된 숙주 세포를 얻기 위하여 발현 구성체를 도입한 후의 트랜스포메이션된 숙주 세포로부터 검출된다.
다른 마커는 ATP 합성효소 서브유닛 9 (oliC), 오로티딘-5'-포스페이트-디카르복실라제 (pvrA), 박테리아 G4189 내성 유전자 (효모에서 유용하되 사상 진균류에서는 유용하지 않음), 암피실린 내성 유전자 (E.coli), 네오마이신 내성 유전자 (Bacillus) 및 글루쿠로니다제 (GUS)를 코딩하는 E.coli uidA 유전자를 포함한다. 벡터는 예를 들어, RNA의 생산 또는 숙주 세포를 트랜스펙션하거나 트랜스포메이션하기 위해, 시험관 내에서 사용될 수 있다.
대부분의 사상 진균류 및 효모에 있어서, 발현 구성체는 안정한 트랜스포먼트를 얻기 위하여 숙주 세포의 게놈 내로 바람직하게 통합된다. 그러나, 어떤 효모에 있어서 안정하고 높은 수준의 발현을 위해 발현 구성체가 통합될 수 있는 적당한 에피솜 벡터 시스템이 또한 이용가능하다. 그것의 예는 Saccharomyces 및 Kluyveromyces 각각의 2㎛, CEN 및 pKD1 플라스미드, 또는 AMA 서열 (예를 들어, Aspergillus로부터의 AMA1)을 함유한 벡터를 포함한다. 발현 구성체가 숙주 세포 게놈 내로 통합되면, 구성체는 게놈에 있는 무작위 유전자좌, 또는 상동성 재조합을 이용한 사전결정된 표적 유전자좌에 통합되는데, 이 경우에 있어서 표적 유전자좌는 고도로 발현되는 유전자를 포함한다. 고도로 발현되는 유전자는 예를 들어, 유도된 조건 하에서 그 mRNA가 전체 세포 mRNA의 0.01% (w/w)이상까지 이르는 유전자이거나, 또는 대안으로, 그 유전자 생성물이 전체 세포 단백질의 0.2% (w/w)이상까지 이르거나, 또는 분비되는 유전자 생성물의 경우, 0.05 g/l이상의 수준으로 분비되는 유전자이다.
주어진 숙주 세포에 대한 발현 구성체는 보통 첫번째 양태의 폴리펩티드를 암호화하는 서열의 코딩 가닥과 관련하여 5'-말단으로부터 3'-말단으로 연속적인 순서에서 서로 작동가능하게 연결된 다음 요소를 함유할 것이다.
(1) 주어진 숙주 세포에서 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 전사를 지시할 수 있는 프로모터 서열,
(2) 바람직하게는, 5'-비번역 구역 (리더),
(3) 임의적으로, 주어진 숙주 세포로부터 배양 배지 내로 폴리펩티드의 분비를 지시할 수 있는 신호 서열,
(4) 성숙형 및 바람직하게는 활성형의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 및 바람직하게는 또한
(5) 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 하류에서 전사를 종결할 수 있는 전사 종결 구역 (종결암호).
폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 하류에서, 발현 구성체는 바람직하게, 종결암호로서 또한 지칭되는 하나 이상의 전사 종결 부위를 함유한 3' 비번역 구역을 함유한다. 종결암호의 복제 개시점은 덜 중요하다. 종결암호는 예를 들어 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열 고유의 것일 수 있다. 그러나, 바람직하게 효모 종결암호는 효모 숙주 세포에서 사용되고 사상 진균류 종결암호는 사상 진균류 숙주 세포에서 사용된다. 더욱 바람직하게, 종결암호는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열이 발현되는 숙주 세포에서 내인성이다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 향상된 발현은 프로모터, 신호 서열 및 종결암호 구역과 같은, 이종성 조절 구역의 선택에 의해 성취될 수 있는데, 이 구역은 발현 및, 원한다면, 선택된 발현 숙주로부터 관심있는 단백질의 분비 수준을 향상시키고/또는 본 발명의 폴리펩티드의 발현의 유도성 제어를 제공하도록 작용한다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 고유의 프로모터 외에, 다른 프로모터가 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 지시하는데에 사용될 수 있다. 프로모터는 원하는 발현 숙주에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 지시하는데 있어서 그들의 효능에 대해 선택될 수 있다.
프로모터/인핸서 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터가 디자인된 숙주 세포와 양립할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 원핵세포의 프로모터, 특히 E.coli 균주에서의 사용에 적당한 것들이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 발현이 포유동물 세포에서 수행되면, 포유동물 프로모터가 이용될 수 있다. 간세포-특이적 프로모터와 같은 조직-특이적 프로모터가 또한 사용될 수 있다. Moloney 쥐과 백혈병 바이러스 긴 말단 반복역 (MMLV LTR), 로어스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) IE 프로모터, 헤르페스 단순 바이러스 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터와 같은, 바이러스 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
적합한 효모 프로모터는 S. cerevisiae의 GAL4 및 ADH 프로모터 및 S. pombe 의 nmt1 및 adh 프로모터를 포함한다. 포유동물 프로모터는 카드뮴과 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오닌 프로모터를 포함한다. SV40 거대 T 항원 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터와 같은 바이러스 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이들 모든 프로모터는 업계에서 손쉽게 이용가능하다.
β-액틴 프로모터와 같은 포유동물 프로모터가 사용될 수 있다. 조직-특이적 프로모터, 특히 내피 또는 뉴런 세포 특이적 프로모터 (예를 들어 DDAHI 및 DDAHII 프로모터)가 특히 바람직하다. Moloney 쥐과 백혈병 바이러스 긴 말단 반복역 (MMLV LTR), 로어스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) IE 프로모터, 아데노바이러스, HSV 프로모터 (예를 들어 HSV IE 프로모터), 또는 HPV 프로모터, 특히 HPV 상류 조절 구역 (URR)과 같은, 바이러스 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 바이러스 프로모터는 업계에서 손쉽게 이용가능하다.
본 발명의 숙주 세포에서 전사를 지시할 수 있도록 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 바람직하게 프로모터 서열은 앞서 정의된 것과 같이 고도로 발현되는 유전자로부터 유래된다. 프로모터가 바람직하게 유래되고/또는 발현 구성체의 통합을 위한 바람직한 사전결정된 표적 유전자좌에 포함되는 바람직한 고도로 발현되는 유전자의 예는, 트리오스-포스페이트 이성화효소 (TPI), 글리세르알데히드-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH), 포스포글리세레이트 키나아제 (PGK), 피루베이트 키나아제 (PYK), 알콜 탈수소효소 (ADH)와 같은 해당 효소를 암호화하는 유전자는 물론이고, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 프로테아제, 자일라나아제, 셀로비오히드로 라아제, β-갈락토시다아제, 알콜 (메탄올) 옥시다아제, 신장 인자 및 리보솜 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 고도로 발현되는 유전자의 특정 예는 Kluyveromyces 종 유래의 LAC4 유전자, Hansenula 및 Pichia로부터 각각 유래한 메탄올 옥시다아제 유전자 (AOX 및 MOX), A. niger 및 A. awamori 유래의 글루코아밀라아제 (glaA) 유전자, A. oryzae TAKA-아밀라아제 유전자, A. nidulans gpdA 유전자 및 T. reesei 셀로비오히드로라제 유전자 등을 포함한다.
진균 발현 숙주에서의 사용에 바람직한 강력한 구조성 및/또는 유도성 프로모터의 예는 자일라나아제 (xlnA), 파이타아제, ATP-합성효소 서브유닛 9 (oliC), 트리오스 포스페이트 이성화효소 (tpi), 알콜 탈수소효소 (AdhA), 아밀라아제 (amy), 아밀로글루코시다제 (glaA 유전자 유래의 AG), 아세타미다제 (amdS) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소 (gpd) 프로모터의 진균 유전자로부터 얻을 수 있는 것들이다.
사용될 수 있는 강력한 효모 프로모터의 예는 알콜 탈수소효소, 락타아제, 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 트리오스포스페이트 이성화효소의 유전자로부터 얻을 수 있는 것들이다.
사용될 수 있는 강력한 박테리아 프로모터의 예는 아밀라아제 및 SPo2 프로모터는 물론이고 세포외 프로테아제 유전자로부터의 프로모터를 포함한다.
사용될 수 있는 식물 세포에 적합한 프로모터는 나팔린 합성효소 (nos), 옥토핀 합성효소 (ocs), 마노핀 합성효소 (mas), 리불로오스 소형 서브유닛 (rubisco ssu), 히스톤, 벼 액틴, 파세올린, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CMV) 35S 및 19S 및 서코바이러스 프로모터를 포함한다.
벡터는 RNA를 발생시키는 폴리뉴클레오티드의 측면에 위치한 서열을 더욱 포함할 수 있는데 이 서열은 진핵세포 게놈 서열, 바람직하게는 포유동물 게놈 서열, 또는 바이러스 게놈 서열로부터 유래된 하나에 상동인 서열을 포함한다. 이것은 상동성 재조합에 의해 진핵세포 또는 바이러스의 게놈 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 도입되는 것을 허용할 것이다. 특히, 바이러스 서열의 측면에 위치된 발현 카셋트를 포함하는 플라스미드 벡터는 포유동물 세포로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 전달하기에 적합한 바이러스 벡터를 제제하는데에 사용될 수 있다. 적합한 바이러스 벡터의 다른 예는 헤르페스 단순 바이러스 벡터 및 레트로바이러스를 포함하고, 이는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 및 HPV 바이러스 (예를 들어 HPV-16 또는 HPV-18)를 포함한다. 이들 바이러스를 사용한 유전자 전달 기술은 당업자에게 공지된다. 예를 들어 레트로바이러스 벡터는 안티센스 RNA를 발생시키는 폴리뉴클레오티드를 숙주 게놈 내로 안정하게 통합시키는데에 사용될 수 있다. 반대로 복제-결핍 아데노바이러스는 에피좀에 잔류하므로 일시적 발현을 허용한다.
벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 안티센스 방향으로 배향되도록 함유하여 안티센스 RNA의 생산을 제공할 수 있다. 이것은, 바람직하다면, 폴리펩티드의 발현 수준을 감소시키는데에 사용될 수 있다.
숙주 세포 및 발현
더 나아간 양태에서 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현에 적합한 조건 하에서 상기 설명된 것과 같은 발현 벡터로 트랜스포메이션되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 본 발명의 폴리펩티드를 제제하는 과정 및 발현된 폴리펩티드를 회수하는 과정을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터와 같은 재조합 복제가능 벡터 내로 통합될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 핵산을 복제하는데에 사용될 수 있다. 따라서 나아간 구체예에서, 본 발명은 복제가능 벡터 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계, 적합한 숙주 세포 내로 벡터를 도입하는 단계, 및 벡터의 복제가 발생하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계에 의한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 E. coli와 같은 박테리아, 효모, 포유동물 세포주 및 Sf9 세포와 같은 곤충 세포 및 (사상)진균 세포 등의 다른 진핵 세포주를 포함한다.
바람직하게 폴리펩티드는 발현 구성체에 있는 폴리펩티드의 성숙형을 암호화하는 DNA 서열이 신호 서열을 암호화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결되는 경우에서 분비 단백질로서 생산된다. 분비 단백질을 암호화하는 유전자가 야생형 균주에서 신호 서열을 가질 경우, 사용된 신호 서열은 바람직하게 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열 고유 (동종)일 것이다. 대안으로 신호 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열 비고유 (이종)이면, 이 경우에서 신호 서열은 DNA 서열이 발현되는 숙주 세포에 있어서 바람직하게 내부이다. 효모 숙주 세포에 있어서 적합한 신호 서열의 예는 효모 MF알파 유전자로부터 유래된 신호 서열이다. 이와 유사하게, 사상 진균 숙주 세포에 있어서 적합한 신호 서열은 예를 들어 사상 진균 아미노글루코시다아제 (AG) 유전자 (예를 들어 A. niger glaA 유전자)로부터 유래된 신호 서열이다. 이 신호 서열은 아미노글리코시다아제 ((글루코)아밀라아제로 또한 지칭됨) 프로모모터 자체와의 조합으로는 물론이고 다른 프로모터와의 조합으로도 사용될 수 있다. 잡종 신호 서열은 본 발명의 문맥 내에서 또한 사용될 수 있다.
바람직한 이종 분비 리더 서열은 진균 아미노글루코시다제 (AG) 유전자 (glaA - Aspergillus와 같은 것으로부터의 18 및 24 아미노산 버전), MF알파 유전자 (효모, 예를 들어 Saccharomyces 및 Kluyveromyces) 또는 알파-아밀라아제 유전자 (Bacillus)로부터 유래된 것들이다.
벡터는 상기 설명된 것과 같이 적합한 숙주 세포 내로 트랜스포메이션되거나 트랜스펙션되어 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있다. 이 과정은 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 설명된 것과 같은 발현 벡터로 트랜스포메이션된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 발현된 폴리펩티드를 임의적으로 회수하는 단계를 포함한다.
따라서 본 발명의 더 나아간 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 트랜스포메이션되거나 트랜스펙션되거나 또는 이 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 복제 및 발현을 허용하는 벡터에 수반된다. 세포는 상기 벡터에 적합하도록 선택될 것이고 예를 들어 원핵 세포 (예를 들어 박테리아), 또는 진핵 진균, 효모 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 재조합 발현에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 생산을 위한 과정을 포함한다. 이러한 목적으로 본 발명의 DNA 서열은 적합한 동종 또는 이종 숙주 세포에서 폴리펩티드의 경제적 생산을 허용하기 위하여, 유전자 증폭 및/또는 프로모터, 분비 신호 서열과 같은 발현 신호의 교환에 사용될 수 있다. 동종 숙주 세포는 여기에서 동일한 종 또는 DNA 서열이 유래된 종과 동일한 종 내에서의 변체인 숙주 세포로서 정의된다.
적합한 숙주 세포는 바람직하게 박테리아와 같은 원핵 미생물, 또는 더욱 바람직하게는 효모 또는 사상 진균 등의 진균류, 또는 식물 세포와 같은 진핵 생물이다. 일반적으로, 효모 세포는 조작이 더 쉽기 때문에 사상 진균 세포보다 바람직하다. 그러나, 몇몇 단백질은 효모로부터 매우 적게 분비되거나, 또는 몇몇 경우에서 알맞게 프로세싱되지 않는다 (예를 들어, 효모에서의 고글리코실화). 이 경우에서는, 사상 진균 숙주 생물이 선택되어야 한다.
Bacillus 속으로부터의 박테리아는 배양 배지 내로 단백질을 분비하는 그들의 능력으로 인해 이종 숙주로서 매우 적합하다. 숙주로서 적합한 다른 박테리아는 Streptomyces 및 Pseudomonas 속이다. 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 있어서 바람직한 효모 숙죽 세포는 Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, 또는 Schizosaccharomyces 중 하나이다. 더욱 바람직하게, 효모 숙주 세포는 Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (Kluyveromyces marxianus var. lactis로도 공지됨), Hansenula polymorpha, Pichia, Yarrowia, 또는 Schizosaccharomyces로 구성된 군으로부터 선택된다.
그러나, 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 있어서 가장 바람직한 것은 사상 진균 숙주 세포이다. 바람직한 사상 진균 숙주 세포는 Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, 및 Talaromyces 속으로 구성된 군으로부터 선택된다. Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae 또는 Aspergillus nidulans 종 또는 Aspergillus niger 무리로부터의 종 (Raper and Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 2930344, 1965에 정의됨)의 사상 진균 숙주 세포가 더욱 바람직하다. 이들은 Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae 및 Aspergillus ficuum, 및 Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum 및 Thielavia terrestris 종의 것들을 또한 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 범위 내에서 바람직한 발현 숙주의 예는 Aspergillus 종 (특히 EP-A-184,438 및 EP-A-284,603에 설명된 것들) 및 Trichoderma 종과 같은 진균류; Bacillus 종 (특히 EP-A-134,048 및 EP-A-253,455에 설명된 것들), 그 중에서도 특히 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens; Pseudomonas 종; 및 Kluyveromyces 종 (특히 EP-A-096,430 (Kluyveromyces lactis) 및 EP-A-301,670에 설명된 것들) 및 Saccharomyces 종 (Saccharomyces cerevisiae)과 같은 효모이다.
본 발명에 따르는 숙주 세포는 식물 세포를 포함하므로, 본 발명은 본 발명의 세포를 하나 이상 함유하는 식물체 및 그것의 일부와 같은, 형질전환 생물로 확장된다. 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 이종으로 발현할 수 있고 또는 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이종으로 함유할 수 있다. 그러므로 형질전환 (또는 유전적으로 변형된) 식물체는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열인 그것의 게놈 내로 (전형적으로 안정하게) 삽입될 수 있다. 식물 세포의 트랜스포메이션은, 예를 들어 Agrobacterium tumefaciens 유래 Ti 또는 Ri 플라스미드를 이용하는 것과 같이, 공지된 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서 플라스미드 (또는 벡터)는 식물을 감염시키는데 필요한 서열을 함유할 수 있고, Ti 및/또는 Ri 플라스미드의 유도체가 채택될 수도 있다.
숙주 세포는 폴리펩티드를 과발현할 수 있고, 과-발현을 엔지니어링하기 위한 기술은 주지되며 본 발명에 이용될 수 있다. 따라서 숙주는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 복사본을 가질 수 있다.
대안으로, 잎, 뿌리 또는 줄기와 같은, 식물의 일부의 직접 감염이 실행될 수 있다. 이 기술에서 감염되는 식물은, 예를 들어 면도칼로 식물을 자르거나, 바늘로 식물에 구멍을 뚫거나 또는 연마제로 식물을 마찰시킴으로써 손상될 수 있다. 그 다음 상처는 Agrobacterium으로 접종된다. 그 다음 식물 또는 식물 일부는 적합한 배양 배지에서 배양되어 성숙한 식물로 발생되도록 할 수 있다. 유전적으로 변형된 식물 내로 트랜스포메이션된 세포의 재생은 항생제를 사용한 트랜스포메이션된 발아체의 선별, 및 적당한 영양분, 식물 호르몬 등을 함유한 배지 상에서의 발아체의 계대배양에 의해 성취될 수 있다.
숙주 세포의 배양 및 재조합체 생산
본 발명은 또한 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 발현하도록 변형된 세포 또는 그것의 변체를 포함한다. 이러한 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포와 같이, 일시적 또는 바람직하게는 안정하게 변형된 고등 진핵 세포주, 효모 및 사상 진균 세포와 같은 하등 진핵 세포 또는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드가 세포주 내에서 또는 예를 들어 배큘로바이러스 발현 시스템과 같은 막 상에서 일시적으로 발현되도록 하는 것이 또한 가능하다. 이러한 시스템은, 본 발명에 따르는 단백질을 발현하도록 적응된 것으로, 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 생산은 미생물 발현 숙주의 배양에 의해 실행될 수 있는데, 이 숙주는 전통적인 영양 발효 배지에서 하나 이상의 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 트랜스포메이션된 것이다.
본 발명에 따르는 재조합 숙주 세포는 업업계에 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있다. 프로모터 및 숙주 세포의 각 조합에 있어서, 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 이바지하는 배양 조건이 이용가능하다. 원하는 세포 밀도 또는 폴리펩티드의 적정 농도에 도달한 후, 배양을 중지하고 공지된 방법을 이용하 여 폴리펩티드를 회수한다.
발효 배지는 탄소 공급원 (예를 들어, 포도당, 맥아당, 당밀 등), 질소 공급원 (예를 들어, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 염화 암모늄 등), 유기 질소 공급원 (예를 들어, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤 등) 및 무기 영양 공급원 (예를 들어, 인산, 마그네슘, 칼슘, 아연, 철 등)을 함유한 공지된 배양 배지를 포함할 수 있다. 임의적으로, (사용된 발현 구성체에 의존한) 유도체가 포함되거나 또는 이후로 첨가될 수 있다.
적당한 배지의 선택은 발현 숙주의 선택에 기초하고/또는 발현 구성체의 조절 필요조건에 기초할 수 있다. 적합한 배지는 당업자에게 주지된다. 배지는, 원한다면, 다른 잠재적 오염 미생물 보다 트랜스포메이션된 발현 숙주를 지지하는 추가적인 성분을 함유할 수 있다.
발효는 0.5 내지 30 일의 기간에 걸쳐 실행 될 수 있다. 발효는 0℃ 내지 45℃의 범위에 있는 적합한 온도에서, 예를 들어 pH 2 내지 10에서 회분, 연속 또는 유가식 공정일 수 있다. 바람직한 발효 조건은 20℃ 내지 45℃ 범위의 온도 및 pH 3 내지 9를 포함한다. 적당한 조건은 보통 발현 숙주의 선택 및 발현되는 단백질에 기초하여 선택된다.
발효 후, 필요하다면, 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 발효 육즙으로부터 제거될 수 있다. 발효가 정지된 후 또는 세포의 제거 후, 본 발명의 폴리펩티드는 회수되어, 원한다면, 전통적인 수단에 의해 정제되고 분리될 수 있다. 본 발명의 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 진균 균사체로부터 또는 배양된 진균 세포에 의해 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 방출된 배양 육즙으로부터 정제될 수 있다.
바람직한 구체예에서 폴리펩티드는 진균으로부터, 더욱 바람직하게는 Aspergillus로부터, 가장 바람직하게는 Aspergillus niger로부터 얻는다.
변형
본 발명의 폴리펩티드는 화학적으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 후-번역 변형). 예를 들어, 그들은 (1회 이상) 글리코실화되거나 또는 변형된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그들은 또한 히스티딘 잔기의 첨가에 의해 변형되어 그들의 정제를 돕거나 또는 신호 서열의 첨가에 의해 변형되어 세포로부터의 분비를 촉진할 수 있다. 폴리펩트디는 아미노-말단 메티오닌 잔기와 같은 아미노- 또는 카르복시-말단 신장부, 약 20 내지 25 잔기의 작은 링커 펩티드, 또는 폴리히스티딘 트랙, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같은, 정제를 용이하게 하는 작은 신장부를 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 노출 표지로 표지될 수 있다. 노출 표지는 폴리펩티드가 검출되도록 하는 어떤 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지는 방사성동위원소 (예를 들어, 125I, 35S), 효소, 항체, 폴리뉴클레오티드 및 바이오틴과 같은 링커를 포함한다.
폴리펩티드는 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 포함하거나 폴리펩티드의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 단백질 또는 펩티드가 합성 수단에 의해 생산되면, 이러한 아미노산은 생산 도중 도입될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 또한 합성 또는 재조합 생산 후에 변형될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 D-아미노산을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 경우에서 아미노산은 C에서 N 배향으로 역 서열에 연결될 것이다. 이러한 단백질 또는 펩티드를 생산하는 것은 업계에서 전통적이다.
수많은 측쇄 변형은 업계에 공지되고 본 발명의 단백질 또는 펩티드의 측쇄에 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 알데히드로의 환원 후 NaBH4로의 환원, 메틸아세티미데이트로의 아미딘화 또는 아세트 안히드리드로의 아실화에 의한 환원성 알킬화에 의한 아미노산의 변형을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 서열은 또한 "2차 생성" 효소의 구성을 위한 시작 물질로서 사용될 수 있다. "2차 생성"프롤린 특이적 프로테아제는 돌연변이 유발 기술 (예를 들어, 부위특이적 돌연변이 유발)에 의해 변경되는데, 이는 야생형 프롤린 특이적 프로테아제 또는 본 발명에 의해 생산되는 것들과 같은 재조합 프롤린 특이적 프로테아제와는 상이한 성질을 갖는다. 예를 들어, 그들의 온도 또는 pH 최적조건, 특이적 활성, 기질 친화도 또는 온도안정성은 특정 과정에서의 사용에 더욱 적합하도록 변경될 수 있다.
본 발명의 프롤린 특이적 프로테아제의 활성에 중요하여 바람직하게 치환되는 아미노산은, 부위특이적 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발과 같은, 업계에 공지된 방법에 따라 확인될 수 있다. 후자의 기술에서 돌연변이는 분자 내의 모든 잔기에 도입되고, 결과적 돌연변이체 분자는 생물학적 활성에 대하여 검사되어 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인한다. 효소-기질 상호작용의 부위는 또한 핵 자기 공명, 결정학 또는 광-친화도 표지 등과 같은 기술에 의해 측정된 것과 같이 결정 구조의 분석에 의해 측정될 수 있다.
효모 및 사상 진균 숙주 세포의 사용은 이러한 후-번역 변형 (예를 들어, 단백질분해 프로세싱, 미리스틸화, 글리코실화, 일부절단, 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 포스포릴화)을 제공하는 것으로 기대되는데, 이는 이러한 변형이 본 발명의 재조합 발현 생성물에 최적의 생물학적 활성을 부여하는데에 필요할 수 있기 때문이다.
제제
본 발명의 폴리펩티드는 분리된 형태에서 존재할 수 있다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고 여전히 분리된 것으로서 여겨진다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있는데, 이 경우에서 일반적으로 제제 내에 있는 70% 이상, 예를 들어 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 단백질이 본 발명의 폴리펩티드인 제제에 폴리펩티드를 포함할 것이다.
본 발명의 폴리펩티드는 그들이 그들 원래의 세포성 환경 외부에 있는 형태로 제공될 수 있다. 따라서, 그들은 상기 설명된 것과 같이 실질적으로 분리되거나 또는 정제될 수 있고, 또는 그들이 자연적으로 발생하지 않는, 예를 들어 다른 진균 종, 동물, 식물 또는 박테리아의 세포와 같은 세포에 존재할 수 있다.
프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성의 제거 또는 감소
본 발명은 또한 친 세포의 돌연변이 세포를 생산하는 방법에 관련되는데, 이 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 내부 핵산 서열 또는 그것의 제어 서열의 붕괴 또는 결실을 포함하고, 그 결과 친 세포보다 폴리펩티드를 덜 생산하는 돌연변이 세포가 생긴다.
감소된 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 균주의 구성은 세포에서 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 발현에 필요한 핵산 서열의 변형 또는 비활성화에 의해 손쉽게 성취될 수 있다. 변형 또는 비활성화되는 핵산 서열은, 예를 들어, 프롤린 특이적 활성을 나타내는데에 필수적인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 그것의 일부가 될 수 있고, 또는 핵산 서열은 핵산 서열의 코딩 서열로부터 폴리펩티드의 발현에 필요한 조절 기능을 가질 수도 있다. 이러한 조절 또는 제어 서열의 예는 프로모터 서열 또는 그것의 기능적 일부, 즉, 폴리펩티드의 발현에 영향을 미치기에 충분한 일부가 될 수 있다. 가능한 변형을 위한 다른 제어 서열은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 서열, 및 종결 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵산 서열의 변형 또는 비활성화는 세포를 돌연변이 유발시키고, 프롤린 특이적 엔도프로테아제 생산 능력이 감소되거나 제거된 세포를 선택함으로써 수행될 수 있다. 특이적 또는 무작위적일 수 있는 돌연변이 유발은, 예를 들어, 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 사용, 적합한 올리고뉴클레오티드의 사용, 또는 DNA 서열의 PCR 돌연변이 유발에 의해 수행될 수 있다. 게다가, 돌연변이 유발은 이들 돌연변이 유발제의 어떤 조합의 사용에 의해서 수행될 수 있다.
본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 예는 자외선 (UV) 조사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 설포네이트 (EMS), 중아황산염 나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
이러한 작용제가 사용되면, 선택된 돌연변이 유발제의 존재에서 돌연변이 유발되는 세포를 적합한 조건 하에서 인큐베이션하고, 감소된 또는 전무한 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 나타내는 세포를 선택함으로써 전형적으로 돌연변이 유발이 수행된다. 본 발명의 폴리펩티드의 생산의 변형 또는 비활성화는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 그것의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입, 치환, 또는 제거함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드가 삽입 또는 제거되어 정지 코돈의 도입, 시작 코돈의 제거, 또는 오픈 리딩 프레임의 변화를 일으킬 수 있다. 이러한 변형 또는 비활성화는 업계에 공지된 방법에 따라서 부위특이적 돌연변이 유발 또는 PCR 돌연변이 유발에 의해 성취될 수 있다.
원칙적으로, 변형은 생체내에서, 즉, 변형되는 핵산 서열을 발현하는 세포 상에 직접 수행될 수 있음에도 불구하고, 변형은 아래에 예시된 것과 같이 시험관 내에서 수행되는 것이 바람직하다.
선택된 숙주 세포에 의한 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 생산을 비활성 또는 감소시키는 알맞은 방법의 예는, 유전자 대치 또는 유전자 방해의 기술에 기초된다. 예를 들어, 유전자 방해 방법에서, 관심있는 내부 유전자 또는 유전자 단편 에 상응하는 핵산 서열은 결함있는 유전자를 생산하도록 시험관 내에서 돌연변이 유발된 다음 결함있는 유전자를 생산하도록 숙주 세포 내로 트랜스포메이션 된다. 상동성 재조합에 의하여, 결함있는 핵산 서열은 내부 유전자 또는 유전자 단편을 대치한다. 바람직하게, 결함있는 유전자 또는 유전자 단편은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자가 변형 또는 파괴된 트랜스포먼트를 선별하는데에 사용될 수 있는 마커를 또한 암호화한다.
대안으로, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 변형 또는 비활성화는 폴리펩티드 암호화 서열에 상보적인 핵산 서열을 이용한 확립된 안티센스 기술에 의해 성취될 수 있다. 더욱 구체적으로, 세포에 의한 폴리펩티드의 생산은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 감소 또는 제거될 수 있다. 그 다음 안티센스 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 세포에서 전사될 것이고 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 mRNA에 혼성화될 수 있을 것이다. 상보적 안티센스 뉴클레오티드 서열이 mRNA에 혼성화되도록 허용하는 조건 하에서, 세포에서 생산되는 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 총량은 감소하거나 또는 제거될 것이다.
본 발명의 방법에 따라 변형되는 세포는, 예를 들어, 세포에 동종이거나 또는 이종인, 원하는 단백질 생성물의 생산에 적합한 진균 균주와 같은, 미생물 기원인 것이 바람직하다.
본 발명은 친 세포의 돌연변이 세포에 더욱 관련되는데, 이 돌연변이 세포는 폴리펩티드를 암호화하는 내부 핵산 서열 또는 그것의 제어 서열의 붕괴 또는 결실 을 포함하고, 이 결과 친 세포보다 폴리펩티드를 덜 생산하는 돌연변이 세포가 생긴다.
이와 같이 생성된 폴리펩티드-결핍 돌연변이 세포는 동종 및/또는 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 특히 유용하다. 그러므로, 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건 하에서 돌연변이 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 동종 또는 이종 폴리펩티드의 생산 방법에 더욱 관련된다. 본문에서, 용어 "이종 폴리펩티드"는 숙주 세포 고유의 것이 아니거나, 고유 서열이 변경된 고유 단백질이거나, 또는 그 발현이 재조합 DNA 기술에 의해 숙주 세포의 조작 결과로서 양적으로 변경된 고유 단백질로서 정의된다.
한층 더 나아간 양태에서, 본 발명은 본 발명의 프롤린 특이적 엔도프로테아제 폴리펩티드는 물론이고 관심있는 단백질 생성물을 생산하는 세포의 발효에 의해, 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성이 본질적으로 없는 단백질 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 저해할 수 있는 작용제의 유효량을 발효 도중 또는 발효가 완료된 후 발효 육즙에 첨가하는 단계, 발효 육즙으로부터 관심있는 생성물을 회수하는 단계, 및 회수된 생성물을 임의적으로 더욱 정제하는 단계를 포함한다. 대안으로, 배양 후 결과된 배양 육즙을 pH 또는 온도 처리하여 실질적으로 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 감소시키고, 배양 육즙으로부터 생성물의 회수를 허용할 수 있다. 조합된 pH 또는 온도 처리는 배양 육즙으로부터 회수된 단백질 제제에서 수행될 수 있다.
본빌적으로 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 없는 생성물을 생산하기 위한 본 발명의 방법은 진핵 폴리펩티드의 생산, 특히 효소와 같은 진균 단백질의 생산에 특별히 관심있는 것이다. 프롤린 특이적 엔도프로테아제-결핍 세포는 또한 식품 산업적 관심, 또는 약제학적 관심의 이종 단백질을 발현하는데에 사용될 수 있다.
프롤린-특이적 엔도프로테아제에 있어서 바람직한 공급원은 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 미생물 유전자를 미생물 숙주 내로 클로닝함으로써 얻는다. 프롤린-특이적 엔도프로테아제에 있어서 더욱 바람직한 공급원은 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 Aspergillus-유래 유전자를, 프롤린-특이적 엔도프로테아제 유전자를 과발현할 수 있는 Aspergillus 속에 속한 숙주 내로 클로닝함으로써 얻는다.
비-의료적 필요로 소비자를 목표로 삼는 단백질 가수분해물을 함유한 제품의 카테고리에서, 운동선수를 위한 제품에 단백질 가수분해물을 사용한 수익성 판매가 신속하게 증가하고 있다. 이 제품 카테고리에서, 최종 생성물의 알레르겐성은 논점이 아니다. 대신에, 맛, 영양가 및 지구력을 지지하고 운동 후 육체적인 회복을 자극하는 특정 아미노산의 존재가 이러한 가수분해물에 있어서, 특히 스포츠 음료에 사용될 때, 중요한 매개변수이다. 예를 들어, 글루타민은 대사성 스트레스에 대적하는 것과 연관되지만, 유리 아미노산은 용액에서 안정하지 않기 때문에 소형 펩티드로만 공급될 수 있다. 본 발명에 따라 생산된 단백질 가수분해물은 운동선수-관련 제품에서의 사용에 매우 적합한데, 이는 스포츠 음료에서와 같이 일반적인 산성 pH 조건하에서 그들의 높은 용해성 때문이다. 이 기준의 중요한 함축적 의미 는 본 발명에 따라 생산된 고농도의 가수분해물이 멸균 및 지속된 저장 상에서 단백질 침전의 결점 없이 영양 스포츠 제품에 포함될 수 있다는 것이다. 따라서, 스포츠 제품의 저장 기간은 본 발명의 단백질 가수분해물의 첨가에 의해 연장될 수 있다.
본 발명에 따른 효소 혼합물은 전유, 탈지유, 카세인, 유장 단백질 또는 카세인과 유장 단백질의 혼합물과 같은 동물 기원의 단백질성 물질 가수분해에 사용될 수 있다. 카세인 및 유장 단백질의 이러한 혼합물은, 예를 들어 모유에서 발견되는 것과 유사한 비율로 사용될 수 있다. 더욱이, 콜라겐 기초된 동물 단백질은 이들 단백질을 작은 분자로 분해하는 가능성 때문에 기질을 형성하고 이로써 동물 육질 추출물을 탈고미하거나 또는 운동선수의 관절에 이로운 프롤린 및 히드록시프롤린의 흡수를 개선한다.
본 발명에 따르는 효소 혼합물은 또한, 밀 글루텐, 맥아당화 또는 비맥아당화 보리 또는 맥주의 제조에 사용되는 다른 곡류, 두유, 그것의 농축물 또는 분리물, 옥수수 단백질 농축물 또는 그것의 분리물, 및 쌀 단백질과 같은, 식물 기원의 단백질성 물질 가수분해에 사용될 수 있다.
본 발명은 다음의 제한되지 않는 실시예에 의해 더욱 설명될 것이다.
도 1은 발현 플라스미드인 pGBFIN11-EPO의 플라스미드 지도를 나타낸다. Endo-Pro는 프롤린 특이적 엔도프로테아제에 대한 것이다.
도 2는 숙주 균주 (A. niger CBS513.88) 및, 여기에 화살표로 나타난 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 과발현하는 몇몇 트랜스포먼트의 배양 여과물의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
재료 및 방법
최소 90% 베타-카세인을 갖는 우유 유래 베타-카세인 (동결건조, 본질적으로 무염류 분말)은 Sigma로부터 구입하였다. 콜라겐 (타입 1, 소 아킬레스 건 유래의 비용해성) 또한 Sigma로부터 구입하였다.
카세인염 나트륨 (Miprodan 30®)은 MD Foods (Viby, Denmark)로부터 구입하였다. 당밀 농축물 (비저온살균, 10% ds, 35% 단백질)은 Borculo Domo (Zwolle, The Netherlands)로부터 구입하였다.
저 고미 유장 가수분해물 Vitalarmor® 800 LB 및 베타-락토글로불린 (Protarmor® 905)은 Armor Proteins (Saint-Brice-en-Cogles, France)로부터 구입하였다. 다른 시판중인 가수분해물은 제조자로부터 또는 약국에서 구입하였다.
콩 분리물은 Lucas Meyer, Hamburg, Germany로부터 Soyamin® HV로서 구입하였다.
B. licheniformis 유래 서브틸리신 (Delvolase®, 그람 당 560000 DU)은 DSM Food Specialities (Seclin, France)로부터 구입하였다. Sumizyme® LP 75.000은 Shin Nihon (Anjyo, Japan)으로부터 구입하였다. Flavourzyme® 1000L은 NOVO Industries, Bagsvaerd, Denmark로부터 구입하였다. 서모리신 (서모아제; 14000 PU/mg의 활성을 갖는 Bacillus thermoproteolyticus Rokko 유래의 열에 안정한 메 탈로-엔도프로테아제)은 Daiwa Kasei (Osaka, Japan)로부터 구입하였다.
Flavobacterium meningosepticum으로부터 유래하여 E.coli에 클로닝된 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 공지된 플라스미드 구성체 및 효소 정제 방법 (T. Diefental and H. Dargatz, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209-212 (1995))을 이용하여 분리하였다. 효소 활성은 25℃에서 pH 7.0의 0.1 M 인산 완충 용액 중 CBZ-Gly-Pro-pNA 0.26 mM 상에서 시험하였다. 이 효소의 pH 최적조건이 pH 6.0 이상이기 때문에 이 시험에서 pH 7.0을 사용하였다. 생성물은 410 nm에서 분광광도적으로 모니터링하였다.
이 조건 하에서 분당 1 μmol의 p-니트로아닐리드의 방출을 일으키는 효소의 양으로서 유닛을 정의하였다.
Aspergilli 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 일본 특허 JP5015314에 설명된 것에 사소한 변형을 갖는 방법에 따라 측정하였다. 간단히 말하자면, 효소 활성은 37℃에서 pH 5.0인 인산 시트레이트/이나트륨 완충용액 중 CBZ-Gly-Pro-pNA 상에서 검사한다. 효소의 pH 최적 조건이 pH 6 이하이기 때문에 이 서험에서 pH 5.0을 선택한다. 반응 생성물은 또한 410 nm에서 분광광도적으로 모니터링하였다.
2-차원 겔전기영동
2-차원 겔전기영동 및 Aspergillus niger 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 부분적 아미노산 서열분석
실시예 4에 개설된 것과 같이 A. niger G-306 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 생산하고 분리하였다. 완전한 정제는 2-차원 겔 전기영동을 이용하여 실 현하였다. 이 목적으로 Superdex 75 컬럼으로부터 분리한 활성 물질을 우선 pH 6.8의 10 mM Tris/HCl 완충용액으로 희석 (대략 20 배)하여 탈염한 다음 Centricon 30kD 미니농축기 (Amicon)로 농축하였다.
원래 2-차원 전기영동은 "2-D electrophoresis using immobilized pH gradients; Principle and Methods; Amersham Pharmacia Biotech 80-6429-60 Rev A/10-98"에 설명된 것과 같이 수행하였다. pH 범위가 3 내지 6인 11 cm IPG 스트립 (BioRad)을 사용하여 IPGphor (Amersham-Pharmacia) 상에서 제 1 차원 (IEF)을 수행하였다. 탈염된, 3-배 농축 샘플은 8 M 유레아 (6 M 유레아 및 2 M 티오유레아)에 희석하였다. 이것을 6 M 유레아, 2 M 티오유레아, 20% CHAPS, 및 3 내지 10 범위의 5% IPG 완충용액을 함유한, 18.5 마이크로리터의 10 배 농축 재수화 완충용액과 혼합하였다. IPG 스트립을 재수화하는데에 전체를 사용하였다. 지침서로서 스트립과 함께 제공된 Biorad 전단지에 설명된 것과 같이 프로토콜을 이용하여 29.320 Vh 동안 포커싱을 수행하였다.
BioRad로부터 구입한 12%의 기성 겔 (Type Prep + 2 Comb)을 사용하여 Criterion Mini Vertical Cell (BioRand) 상에서 제 2 차원 (SDS)을 수행하였다. IPG 스트립은 우선 DTT (1%)를 함유한 SDS 평형 완충용액에서 인큐베이션한 다음 요오드아세트아미드 (2.5%)를 함유한 완충용액에서 2차로 인큐베이션하였다. 두번의 인큐베이션은 모두 20℃에서 15분 동안 하였다. SDS 평형 완충용액은 pH 8.8 의 Tris/HCl 50 mM, 6 M 유레아, 30% (v/v) 글리세롤 및 2% (w/v) SDS 및 미량의 브로모페놀 블루로 구성된다.
인큐베이션 후 언급한 겔 타입에 맞도록 IPG 스트립을 다듬고 10배 희석된 TGS 완충용액 (BioRad)으로 런닝하였다. 런닝 후 3-4 시간 동안 Sypro Ruby (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)로 염색하고 Milli Q 물로 2시간 동안 세척하였다. The Imager (Appligene) 상에서 이미지화를 수행하였다. 가장 큰 점을 잘라내어, 50 밀리몰/리터 중탄산 암모늄으로 수차례 세척하고, 서열분석 등급 트립신 (nr. 1047841, Boehringer Mannheim)으로 37℃에서 하루밤동안 인큐베이션하였다. 포름산을 함유한 아세토니트릴/물 (50/50/5, v/v/v)로 수차례 세척함으로써 겔 조각으로부터 펩티드를 추출한다. 진공원심분리기 (New Brunswick Scientific, The Netherlands)를 이용하여 샘플을 건조하고 분석할 때까지 -20℃에 저장하였다.
LC/MS 분석
Qtof-2 (Micromass, Manchester, UK) 질량 분석계를 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피)는 트립신으로 소화하는 동안 형성된 펩티드를 분리하는데에 사용하였다. 0.1% 포름산을 함유한 Milli Q 물을 이용하여 20 마이크로리터/분의 유속으로 5*0.3 mm의 마이크로프리컬럼, C18 (MCA30-05-C18, LC Packings, Amsterdam, Netherlands) 상에서 5 마이크로리터의 펩티드 용액을 용출하였다. 그 다음 Milli Q 물 (Millipore, Bedford, MA, USA) 중 0.1% 포름산 (용액 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (용액 B)의 신속한 구배를 이용하여, 프리컬럼으로부터 펩티드를 용리하였다. 구배는 100%의 용액 A에서 출발하여 20분에 60%의 용액 B까지 증가하였고 또다른 5분 동안 후자의 비율을 유지하였다. 펩티드의 용리동안 사용한 유속은 200 nl/분이었다. LC/MS/MS 분석을 이용하여 적합한 펩티드의 새로운 서열분석에 의해, A. niger 프롤린-특이적 엔도펩티다아제의 부분 아미노산 서열을 결정할 수 있었다.
P4000 펌프 (Thermoquest™, Breda, the Netherlands)에 커플링된 이온 트랩 질량 분석계 (Thermoquest™, Breda, the Netherlands)를 이용한 HPLC는 본 발명의 효소 혼합물에 의해 생산된 효소적 단백질 가수분해물을 특성 결정하는데에 사용하였다. PEPMAP C18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Amsterdam, The Netherlands) 컬럼을, 용리를 위한 Milli Q 물 (Millipore, Bedford, MA, USA) 중 0.1% 포름산 (용액 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (용액 B)의 구배와의 조합으로 이용하여, 형성된 펩티드를 분리하였다. 구배는 100%의 용액 A에서 출발하여 45분에 70%의 용액 B까지 증가하였고 또다른 5분 동안 후자의 비율을 유지하였다. 사용한 주입 부피는 50 마이크로리터였고, 유속은 분당 50 마이크로리터였으며 컬럼 온도는 30℃로 유지하였다. 주입한 샘플의 단백질 농축물은 대략 50 마이크로그람/밀리리터였다.
개개의 펩티드에 대한 상세 정보는 이온 트랩 질량 분석계에 특유한 알고리즘인 "스캔 의존" MS/MS 알고리즘을 이용하여 얻었다.
전체 스캔 질량 범위에서 가장 강한 이온의 변화 단계를 측정하기 위하여 전체 스캔 분석 후 줌 스캔 분석을 하였다. 후자 이온의 그 다음 MS/MS 분석은 부분 펩티드 서열 정보를 가져왔고, 이는 Xcalibur Bioworks (Thermoquest™, Breda, the Netherlands)로부터의 SEQUEST 적용을 이용한 데이터베이스 검색에 이용할 수 있다. 사용한 데이터뱅크는 NCBI (National Centre for Biotechnology informatics)에서 이용가능한 OWL.fasta 데이터뱅크로부터 발췌한 것으로, 이는 사용한 적용에 대하여 관심있는 단백질을 포함한다. 유장 단백질 또는 카세인과 같이 충분히 특성결정된 단백질 기질을 측정하는 이들 실험에서, 분석 기술의 정확도는 50% 미만의 서열 일치를 갖는 MS/MS 스펙트럼을 생략함으로써 증가한다.
대략 400 내지 2000 Dalton 범위의 질량을 갖는 펩티드 만을 MS 서열분석에 의한 더 나아간 분석에 적합한 것으로 생각하였다.
MS 모드에서의 최적 민감성 및 MS/MS 모드에서의 최적 단편화를 튜닝하는데에 안지오텐신 (M=1295.6)을 사용함에 있어서, 60 ㎍/ml의 일정한 주입을 수행하여, MS 모드에서 주로 두배 및 세배로 대전된 종 및, MS/MS 모드에서 약 35%의 최적 충돌 에너지가 발생하였다.
유아용 유동식 및 시판중인 단백질 가수분해물의 LC/MS 분석
LC/MS에 앞서 지방성 물질을 유아용 유동식으로부터 제거하였다. 이 목적으로, 30 ml 헥산으로 완전한 영양 샘플 (100 ml MilliQ 물 중 13.5 g 분말)을 3 회 추출하였다. 소량의 NaCl을 첨가하여 용매 층의 분리를 향상시켰다. 그 다음 5 ml의 물 층을 얻어 동결 건조하였다. 분석에 앞서 샘플은 25 ml의 MilliQ 물에 재용해시키고, 2회 원심분리한 후 (13000 rpm) 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다. 순수한 가수분해 샘플로부터, 400 mg을 100 ml의 MilliQ 물에 재용해시키고, 2회 원심분리한 후 (13000 rpm) 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다. 시판중인 단백질 가수분해물에 존재하는 펩티드를 특성 결정하기 위하여, 본 발명의 효소 혼합물에 의 해 형성된 효소적 가수분해물에 대하여 상기 설명된 것과 동일한 전략을 따랐다. 즉, 여과한 가수분해물을 HPLC 컬럼에 가하고 400 내지 2000 달톤 사이의 분자량을 갖는 개개의 펩티드는 MS/MS 분석으로 더욱 특성결정하였다. 그러나, 유장 또는 카세인 유래 가수분해물에 대한 펩티드 서열 정보를 얻기 위해 사용한 데이터뱅크는 오직 우유 단백질 서열로만 이루어진다.
카르복시말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰분율 (%) 측정
펩티드의 C-말단의 분석에 LC/MS/MS를 이용할 수 있다. 펩티드의 분자량 (LC/MS로 분석) 및 그것의 (부분) 아미노산 서열 (LC/MS/MS로 분석)이 단백질 데이터뱅크 내에 있는 자동 검색 방법에 연결된 알고리즘을 가지고, 복합 펩티드 혼합물을 분석할 수 있다. 이러한 옵션은 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 발생 빈도 정량을 가능하게 한다. 사용된 PEPMAP 펩티드 인리 컬럼에 의해 셋팅된 제한으로 인해, 대략 400 내지 2000 Dalton 사이의 분자량을 갖는 펩티드 만이 이 기술을 이용하여 분석된다. 다행히도, 단백질 가수분해물에서 대부분의 펩티드는 이러한 분자량을 갖는다.
단백질 가수분해물에서 카르복시말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰 분율을 측정하기 위하여, PEPMAP 컬럼으로부터 용리한 개개의 펩티드 피크를 선택하고 상기 설명된 기술을 이용하여 부분 카르복시말단 아미노산 서열을 측정하였다. 따라서 20이상, 바람직하게는 30이상 및 더욱 바람직하게는 40에서 60 사이, 예를 들어 50의 가장 풍부한, 무작위로 선택된 펩티드의 분석은 펩티드의 카르복시말단에 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 발생하는 빈도에서의 통찰을 제공한다. 따라서 카르복시말단 프롤린 잔기를 갖는 것으로 나타나는 펩티드의 100배 수와 분석된 펩티드의 총 수의 몫은 카르복시말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰 분율 (%)을 제공한다.
가수분해물 생성에 사용된 단백질 기질에 있는 프롤린 몰 분율 (%)의 측정
유아용 유동식 제품에서 발생할 수 있는 지방성 물질은 유아용 유동식 및 시판중인 단백질 가수분해물의 LC/MS 분석을 설명한 단락에서 상술된 것과 같이 헥산 추출로써 우선 제거하였다. 존재하는 단백질을 유리 아미노산으로 전환하기 위한 단백질 기질의 산 가수분해는, 2 밀리리터의 6 N HCl 중 100 밀리그람의 단백질성 물질 현탁액을 제조함으로써 성취하였다. 무산소 분위기에서 112℃에서 22 시간동안 수행하였다. 원심분리 후, 상청액은 묽은 HCl에서 10 배로 희석하였다. 이 가수분해 후 Amino Acid Analysis System of Waters (Milford MA, USA)의 조작자 안내서에 명시된 Picotag 방법에 따라 아미노산을 유도화하고 분석하였다. 존재하는 프롤린의 농도는 HPLC 방법을 이용하여 정량하였다. 샘플 내의 프롤린 몰 분율 (%)을 측정하기 위하여, 존재하는 프롤린의 마이크로몰의 100 배를 분석된 샘플에 존재하는 모든 아미노산의 마이크로몰 총합으로 나누었다. 산 가수분해 동안 Trp 및 Cys이 파괴되기 때문에, 이들 두 아미노산은 모든 아미노산의 마이크로몰 총합에 포함하지 않는다.
단백질 가수분해물 또는 유아용 유동식에서 유리 아미노산 농도의 측정
정확히 질량을 측정한 단백질성 물질의 샘플을 묽은 산에 용해시키고 Eppendorf 원심분리기로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. Amino Acid Analysis System of Waters (Milford MA, USA)의 조작자 안내서에 명시된 Picotag 방법에 따라 투명한 상청액 상에서 아미노산 분석을 수행하였다. 이 목적으로 액체로부터 적합한 샘플을 얻어, 묽은 산에 첨가한 후 균질화 하였다. 후자의 용액으로부터 새로운 샘플을 취하고, 건조한 후 페닐이소티오시아네이트를 사용하여 유도화하였다. 존재하는 다양한 유도화 아미노산은 HPLC 방법을 이용하여 정량하고 질량을 측정한 샘플에 있는 유리 아미노산의 총 농도를 계산하여 합하였다.
이 샘플로부터 유리될 수 있는 아미노산의 총 농도에 샘플에 있는 유리 아미노산의 총 농도를 관련시키기 위하여, 샘플을 산 가수분해한 후 상기 상술된 것과 같이 존재하는 총 유리 아미노산을 정량하였다.
실시예 1
F. meningosepticum 유래의 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 조합된 서브틸리신을 사용한 베타-카세인의 가수분해
베타-카세인은 우유의 주요 카세인 부분의 하나를 나타낸다. 단백질은 그것의 아미노산 서열에 있어서 양호하게 특성결정 되었고 거의 순수한 형태로 시중 구입이 가능하다. 이와 같이, 베타-카세인은 효소 절단 부위와 효소 가수분해 도중 생성되는 다양한 펩티드의 길이와의 상호관계를 연구하기 위한 훌륭한 시험 기질을 제공한다.
본 실시예는 서브틸리신의 넓은 스펙트럼 특성에도 불구하고, 프롤린-특이적 엔도프로테아제와 같은 매우 특이적인 효소의 첨가는 형성된 베타-카세인 단편의 크기 상에 주된 영향력을 가질 수 있다는 것을 예증한다. 그러므로 프롤린-특이적 엔도프로테아제와 조합된 서브틸리신으로 인큐베이션한 후의 카세인 단편에 대해 개선된 수율을 얻을 수 있다. 재료 및 방법 절에 따라 수행된 산 가수분해 후 아미노산 분석에 의해 베타-카세인의 프롤린 몰분율이 14% (재료 및 방법 절에 명시된 것과 같이 프롤린의 몰 수/전체 아미노산의 몰 수)인 것으로 나타난 것과 같이, 베타-카세인은 상대적으로 프롤린이 풍부하다.
베타-카세인 분말 (Sigma)을 pH 7.0인 0.1 몰/리터의 인산 완충용액에 0.1% (w/w) Delvolase™와 함께 10% (w/w)의 농도로 용해하였다. 진탕 수욕에서 45℃에서 24시간 동안 인큐베이션 한 후, 15분 동안 90℃에서 용액을 가열하여 반응을 정지시켰다. 용액의 반 (100 밀리그람의 베타-카세인을 함유한 1ml)에 F. meningo-septicum 으로부터 유래된 100 마이크로리터의 프롤린-특이적 엔도프로테아제 (World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp209-212에 설명된 방법에 따른 4 유닛에 상응)를 첨가하고 45℃에서 24시간 동안 반응을 계속하였다. 90℃에서의 또다른 열 쇼크 후, Delvolase™ 및 Delvolase™ + 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 처리된 베타-카세인 재료의 샘플은 재료 및 방법 절에 명시된 것과 같이 LC/MS 장치로 분석하였다.
Delvolase 단독으로 분해된 샘플에서, LC/MS/MS 분석은 베타-카세인 분자의 다양한 부분을 덮고 있는 40 개의 펩티드를 확인하였다. 이들과 함께 펩티드는 전체 베타-카세인 서열의 79%를 차지하였다. C18 컬럼 상에서 펩티드의 상이한 체류 시간은 2 내지 23 아미노산 잔기의 범위에 있는 펩티드 길이로 규명할 수 있었다. 글루타민은 가장 빈번하게 발생하는 카르복시말단 잔기인 것으로 증명되었다 (40 개의 펩티드 중 10 개), 분석된 펩티드 중 어떤 것도 카르복시 말단 잔기로서 프롤린을 갖지 않는 것으로 나타났다.
이에 비하여, Delvolase™ 및 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 분해된 샘플은 베타-카세인으로부터 28 개의 확인가능한 펩티드를 생성하였다. 이들과 함께 펩티드는 전체 베타-카세인 단백질 서열의 63%를 차지하였다. 펩티드 크기 분포는, 펩티드가 3 내지 9 잔기의 길이로만 분포하는 것과 같이, 현저하게 균등하였다. 이 펩티드 집단 내에서, 글루타민은 단지 3 개의 펩티드에서만 카르복시 말단 잔기였고 프롤린이 가장 풍부한 카르복시말단 잔기인 것으로 증명되었다 (분석한 28 개의 펩티드 중 17 개). 결과는 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 만들어진 가수분해물에서, 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 이들 펩티드가 400 내지 2000 달톤 범위의 분자량에 존재하는 총 펩티드의 61% 몰 분율을 나타낸다는 것을 보인다. 따라서, 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 베타-카세인을 인큐베이션하는 것은 카르복시 말단 잔기로서 프롤린을 갖는 펩티드의 생성을 일으킨다. 더욱이, 서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제와의 조합은 생성된 다양한 펩티드의 현저하게 균일한 크기 분포를 일으키며, 이는 이러한 가수분해물의 한외여과 후 높은 생성물 수율을 제시한다.
실시예 2
베타-카세인 가수분해물 및 고미
실시예 1이 펩티드 크기에 대한 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 효과 및 카르복시-말단 아미노산 잔기로서 프롤린을 갖는 펩티드의 비율을 예시하지만, 실시 예 1에서 고미에 대한 이 효소의 효과는 측정하지 않았다. 카세인 가수분해물은 쓴맛을 내기로 유명하고 이것의 성질은 소수성 아미노산 잔기의 상대적으로 높은 함유량에 관련된다.
서브틸리신에 의해 가수분해된 베타-카세인의 맛에 대한 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 효과를 시험하기 위하여, 실시예 1에서 설명된 것과 같이 Delvolase™ 및 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 갖는 Delvolase™을 시용하여 효소 인큐베이션을 수행하였다. 서브틸리신 및 프롤린-특이적 엔도프로테아제 모두를 열 비활성화한 후, 샘플을 실온으로 냉각시키고 4% (w/w)의 최종 카세인 농도까지 증류수를 첨가하였다. 그 다음 후자 용액의 맛은 경험있는 맛 감별 심사단이 평가하였다. 맛 감별단은 서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 얻은 가수분해물이 서브틸리신을 단독으로 사용하여 얻은 가수분해물 보다 유의하게 덜 쓰다는 결론에 만장일치하였다.
따라서, 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 카세인 가수분해물을 처리하는 것은 최종 생성물의 고미를 실질적으로 감소시킨다.
실시예 3
Aspergillus niger 로부터 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 분리
흑색 포자를 형성할 수 있는 곰팡이의 거대 콜렉션을, 0.1 그람의 K2HPO4, 0.5 그람의 KH2PO4, 0.5 그람의 KCl, 0.5 그람의 MgSO4·7H2O, 0.01 그람의 FeSO4·7H2O, 5 그람의 포도당, 15 그람의 콜라겐 (Sigma) 및 1 리터의 부피를 얻도록 첨가된 증류수를 함유한 pH 6.5의 배지에서 배양하였다. 각 실험을 위한 접종물은 한천 사면 상에서 배양한 (5일간) 진균의 포자를 5 밀리리터의 증류수에 넣는 방법으로 제조하였다. 후자의 현탁액 중, 2% (v/v)를 pH 6.5 배지의 접종에 사용하였다. 진탕하면서 28℃에서 100시간 동안 배양한 후 배양물을 여과하고 투명 여과물의 샘플을 pH 5.0, 50℃에서 합성 펩티드 Z-Ala-Pro-pNA (Bachem; Bubendorf, Switzerland)로 인큐베이션 하였다. pNA를 방출할 수 있는 샘플은 410 나노미터에서 흡광도의 증가를 측정함으로써 확인하였다. 상대적으로 높은 활성을 수득하는 양성 균주는 더욱 연구하였다.
균주 G-306은 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 분비하고 Aspergillus niger Van Tieghem var. niger로서 동정하였다. 이 특별한 균주는 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 분리, 정제 및 나아간 특성결정에 사용하였다. 효소를 정제하기 위하여 pH 5.0의 0.05 몰/리터 아세트산 나트륨으로 평형화된 400 밀리리터 바시트라신-실로크롬 컬럼에 1 리터의 배양 현탁액을 부었다. 1 몰/리터의 NaCl 및 10% (v/v) 이소프로판올을 보충한 아세테이트 완충용액을 이용하여 컬럼에 결합된 프로테아제를 용리하였다 (J. Appl. Biochem., 1983 pp420-428). 활성 부분을 수집하여 증류수에 대해 투석하고 아세테이트 완충용액으로 다시 평형화시킨 200 밀리리터 바시트라신-세파로오스 컬럼에 부었다. 전과 같이, NaCl 및 이소프로판올을 첨가한 아세테이트 완충용액을 사용하여 용리를 수행하였다. 활성 부분을 수집하고, pH 5.0인 5 밀리몰/리터의 아세테이트 완충용액에 대하여 투석한 다음 Amicon PM-10 막으로 한외여과하여 농축하였다. 거의 완전히 순수한 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 얻기 위하여, pH 5.0인 0.05 몰/리터의 아세트산 나트륨 완충 용액으로 평형화시키고 0.5 몰/리터의 NaCl이 보충된 Superdex™ 75 컬럼을 통해, 농축된 액체를 크로마토그래피 하였다.
정제된 효소로 수행한 더 나아간 실험은 66.6 kDalton 부근의 분자량, pH 4.2 부근의 IEP, 5.0 부근의 pH 최적 조건 및 50℃에서 4시간 동안의 인큐베이션 후 거의 100%인 열안정성을 가리켰다.
효소의 부분 아미노산 서열을 얻기 위하여, 분리된 효소 제제는 우선 재료 및 방법 절에 설명된 방법에 따라 2-차원 겔 전기영동 하였다. 가장 큰 점을 잘라내어, 트립신으로 인큐베이션한 후 용리하였다. 그 다음 회수한 펩티드는 재료 및 방법 절에 설명된 것과 같이 LC/MS/MS 분석하여 부분 아미노산 서열을 측정하였다.
하기 아미노산 서열은 Aspergillus niger의 프롤린-특이적 엔도프로테아제로부터 유래된 것일 수 있다.
NH2-ATTGEAYFE-COOH
NH2-ATVNSWTGGWDFTR-COOH
NH2-DGAPEGTST-COOH
NH2-EREAGAAVTP-COOH
이들 아미노산 서열은 Aspergillus niger 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 분리에 필요한 DNA 서열을 합성하는데에 사용하였다.
뒤의 실험에서 (실시예 10 참조) 서열 NH2-ATTGEAYFE-COOH는 성숙한 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 아미노 말단을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
실시예 4
콩 단백질의 가수분해에서 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 그것의 효과
일본 특허 JP501314는 Aspergillus oryza FS1-32로부터 얻은 정제되지 않은 효소 제제를 설명하는데 이것의 다수는 비-특이적 내부 단백질분해 활성을 나타내고 소수는 프롤린-특이적 엔도프로테아제 및 카르복시펩티다아제 활성을 나타낸다. 카르복시펩티다아제와 조합된 프롤린-특이적 엔도프로테아제가 없는 또다른 프로테아제 제제로 얻어질 수 있는 대두 가수분해물보다 유의하게 덜 쓴 가수분해물을 수득할 수 있는 것으로 이 정제되지 않은 효소 제제로의 대두 단백질의 인큐베이션을 청구한다. JP5015314에서, 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 활성은 이후로 카르복시펩티다아제에 의해 제거되는 프롤린 잔기를 노출시킨다고 제시된다. 카르복시펩티다아제에 의한 이들 소수성인, 카르복시 말단 잔기의 제거는 덜 쓴 가수분해물을 얻는데에 본질적인 것으로 생각된다.
이 주장을 시험하기 위하여, JP5015314에서 제공된 실시예 중 하나를 반복하였고 맛에 대한 효과를 평가하기 보다는 상기 설명된 LC/MS 기술을 이용하여 결과된 콩 가수분해물을 분석하였다.
JP5015314에 따라, Aspergillus oryzae FS 1-32로의 인큐베이션은 기질의 그람 당 하기 효소적 활성을 함유한다.
프로테아제 : 대략 650 PU; 카르복시다아제 : 대략 0.01 유닛; 및 프롤린-특이적 엔도펩티다아제 : 대략 0.03 밀리-유닛
오리지널 Aspergillus oryzae FS 1-32 제제를 구입할 수는 없기 때문에, 본 실시예에서는 Aspergillus oryzae로부터 유래된 두 개의 시판중인 효소 제제를 사 용하였다. 더욱이, 산 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 과투여를 성취하기 위하여 Aspergillus niger로부터 분리된, 크로마토그래피로 정제된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 (실시예 3 참조)를 사용하였다.
다양한 제제의 효소 활성은 JP5015314에 제공된 방법에 따라 측정하였고 아래에 제공된다.
- Sumizyme LP 75.000 : 내부 단백질분해 활성이 풍부한 것으로 공지된, 시판중인 Aspergillus oryzae 효소 제제.
JP5015314의 방법에 따라 평가된 효소 활성
프로테아제 : 226 PU/그람 생성물; 카르복시펩티다아제 : 10 유닛/그람 생성물; 프롤일-엔도펩티다아제 : 430 밀리-유닛/그람 생성물
- Flavourzyme 1000L : 외부 단백질분해 활성이 풍부한 것으로 공지된, 시판중인 Aspergillus oryzae 효소 제제.
JP5015314의 방법에 따라 평가된 효소 활성
프로테아제 : 322 PU/그람 생성물; 카르복시펩티다아제 : 10 유닛/그람 생성물; 프롤일-엔도펩티다아제 : 검출되지 않음
- Aspergillus niger로부터 얻어 실시예 3에 설명된 것과 같이 분리된, 크로마토그래피로 순수한 프롤린-특이적 엔도프로테아제.
JP5015314의 방법에 따라 평가된 효소 활성:
프로테아제 : 검출되지 않음; 카르복시펩티다아제 : 검출되지 않음; 프롤일-엔도펩티다아제 : 45 밀리-유닛/밀리리터
이들 데이터로부터, Sumizyme 및 Flavourzyme이 그들의 높은 단백질분해 활성에 대해 주지되었음에도 불구하고, 이들 중 어떤 것도 JP5015314에서 인용된 것과 동일한 (엔도)프로테아제 대 카르복시펩티다아제의 매우 높은 비율을 제공할 수 없다는 것이 분명하다. 놀랍게도 Sumizyme LP 75.000은 JP5015314에서 보고된 것보다 상당히 더 높은 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 활성을 함유하는 것으로 나타났다.
다양한 효소 제제는 JP5015314에 설명된 프로토콜에 따라 인큐베이션 하였으나 원하는 카르복시다아제 활성에 따라 표준화하였다 (기질 그람 당 0.01 유닛). 이 반응에서 콩 분리물 (Soyamin 90 HV)을 기질로서 사용하였다. pH 5 및 50℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, 샘플을 원심분리하고 LC/MS 분석 때까지 상청액을 동결 유지하였다. LC/MS 분석은 재료 및 방법 절에 명시된 것과 같이 수행하였다. 이 실험에서 단백질 데이터 뱅크는 콩 단백질로만 이루어졌다. 얻은 결과는 표 1에 명시하였다.
Figure 112003020231364-pct00001
Sumizyme LP 75.000은 균주 FS 1-32에서 보고된 프롤린-특이적 엔도프로테아제 활성보다 대략 7 배 더 높은 프롤린-특이적 내부 단백질분해 활성을 함유하고 카르복말단 프롤린을 갖는 콩 펩티드를 대략 10% 몰 분율로 산출한다. Aspergillus niger로부터 분리된 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 풍부하게 된 Sumizyme LP 75.000은 균주 FS 1-32로 기록된 활성 보다 약 50 배 더 높은 프롤린-특이적 내부 단백질분해 활성을 함유하지만 또한 카르복시 말단 프롤린을 갖는 콩 펩티드를 대략 10% 몰 분율로 산출한다. 펩티드에는 존재하되 카르복시 말단 위치 에는 존재하지 않는 프롤린 잔기의 수를 분석함으로써 이들 데이터를 확인하였다. Flavourzyme은 검출가능한 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 함유하지 않지만 생성되어 LC/MS 기술로 분석하기에 적합한 펩티드 중 카르복시 말단에 프롤린을 갖는 펩티드를 6%의 몰 분율로 산출한다. 이들 콩 단백질 분리물의 대략 5%의 프롤린 함량과 조합한다면, 이들 세가지 관찰은 카르복시펩티다아제 활성과 조합된 프롤린-특이적 엔도프로제아제의 존재 및 활성이 카르복시 말단 프롤린 잔기의 몰 발생 빈도만에는 중요하지 않은 효과를 갖는다는 것을 가리킨다. 그러므로, JP5015314에 설명된, 0.03 밀리-유닛의 프롤린-특이적 엔도프로테아제 활성만으로 야기되는 탈고미 효과가 카르복시 말단 아미노산 잔기로서 프롤린을 갖는 펩티드의 높은 발생 빈도에 관련될 수 있다는 것으로 추측하기는 어렵다.
실시예 5
프롤린-특이적 엔도프로테아제의 증가된 용량 및 콩 단백질의 가수분해에 대한 그것의 효과
본 실시예에서, 높은 수준의 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 상당한 양을 함유한 콩 가수분해물을 생성하는데에 필요하다는 것을 예증한다. 이들 실험의 전반적인 디자인은 실시예 4에서 설명된 것들과 동일하다. 다시 콩 단백질 분리물을 Sumizyme LP 75.000으로 인큐베이션하고 JP5015314에서 설명된 조건 및 콩 단백질 그람 당 0.01 유닛의 원하는 카르복시펩티다아제 활성에 따라 표준화하였다. 인큐베이션은 pH 5 및 50℃에서 2.5 또는 5.0 시간 동안 일어났고 100℃에서 10분 동안 재료를 두어 정지시켰다. 다음에 5 시간 동안 인큐베이션한 몇몇 재료를 얻어 그것의 pH를 7.0까지 증가시켰다. 이 재료로부터 3 개의 샘플을 얻어 E. coli에서 생산된 F. meningosepticum 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 상이한 부분을 첨가하였다. 첫번째 샘플에 1.5 밀리-유닛의 프롤린-특이적 엔도프로테아제 (JP5015314에 따르되 E. coli 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 pH 및 온도 최적조건에 맞는 pH 7.0 및 30℃에서 측정됨)를 첨가하고, 두번째 샘플에 150 밀리-유닛을 첨가하고 세번째 샘플에 15000 밀리-유닛을 첨가한 다음 40℃에서 2시간 동안 샘플을 다시 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 샘플을 원심분리하고 LC/MS 분석 때까지 상청액을 동결 유지하였다. LC/MS 분석은 앞서 명시한 것과 같이 수행하였다. 얻은 결과는 표 2에 명시하였다.
Figure 112003020231364-pct00002
얻은 결과는 가수분해물에서 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 발생 빈도에서의 유의한 증가가 전체적으로 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 첨가에 의존한다는 것을 분명하게 예증한다. 그러나, JP5015314에 언급된 활성을 초과하는 활성 및 Sumizyme LP 75000의 수십배에 존재하는 활성만이 이것을 행할 수 있다. 이 관찰의 의미는 순수하고 분리된 프롤린-특이적 엔도프로테아제가 가수분해물의 원하는 펩티드 조성물을 얻는데에 중요하다는 것이다.
실시예 6
시판중인 가수분해물에서 카르복시 말단 잔기로서 프롤린을 갖는 펩티드의 몰 발생 빈도
앞서 설명한 것과 같이, LC/MS/MS는 펩티드의 C-말단의 분석에 이용할 수 있다. 펩티드의 분자량 (LC/MS로 분석) 및 그것의 (부분) 아미노산 서열 (LC/MS/MS로 분석)이 단백질 데이터뱅크 내에 있는 자동 검색 방법과 연결된 알고리즘으로, 복잡한 펩티드 혼합물을 분석할 수 있다.
이 실시예에서 이들 가능성은 400 내지 2000 달톤 사이의 분자량을 갖는 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생 빈도에 대하여 시판중인 단백질 가수분해물은 물론이고 수많은 시판중인 유아용 유동식을 분석하는데에 사용할 수 있다.
하기 제품을 분석하였다.
1. Nidal®HA1 (Nestle), 100 g 분말당 11.5 g의 유장-단백질 가수분해물 함유
2. Alfare® (Nestle), 100 g 분말당 16.5 g의 유장-단백질 함유
3. Nutrilon® Pepti Plus (Nutricia), 100 g 분말당 13.5 g의 유장-단백질 함유
4. Nutrilon® Pepti Junior (Nutricia), 100 g 분말당 16.5 g의 유장-단백질 가수분해물 함유
5. Aptamil® HA(Milupa), 100 g 분말당 12.3 g의 유장 단백질 및 카세인 가수분해물 함유
6. Pregomin® (Milupa), 100 g 분말당 13.3 g의 예상 콩 및 콜라겐 가수분해물 함유
7. Nutramigen® (Mead Johnson), 100 g 분말당 14.0 g의 예상 카세인 가수분해물 함유
8. Vitalarmor® 800LB, 100% 유장-단백질 가수분해물 함유
9. WPH 916 (New Zealand Milk Products), 100% 유장-단백질 가수분해물 함유
10. WE80 BG (DMV International), 100% 유장-단백질 가수분해물 함유
유아용 유동식이 대략 15%의 단백질 가수분해물 및 지방 (25%) 그리고 탄수화물 (50%)을 함유하기 때문에, 지방 상을 제거하기 위한 이들 제품의 헥산 추출이 필수불가결한 것으로 증명된다. 순수한 가수분해물은 그 자체로 사용될 수 있다.
획득한 부분 단백질 서열을 공지된 단백질의 서열과 관련시키기 위하여, 우유 단백질 서열만을 포함하는 데이터뱅크를, Pregomin 샘플을 제외한 모든 샘플에 대하여 사용하였다. Pregomin 샘플은 콩- 및 콜라겐-특이적 서열 데이터를 포함하는 데이터뱅크를 이용하여 분석하였다. 분석적 이유로 LC/MS 분석은 400 내지 대략 2000 Dalton 범위의 분자량을 갖는 펩티드에 촛점을 맞추어 이 범위를 벗어나는 펩티드는 고려 대상에 포함하지 않는다.
각각의 샘플에서, 사용된 가수분해 단백질의 서열 정보를 함유한 32 내지 76 개 사이의 펩티드를 확인할 수 있었다. 대부분의 샘플에서 크로마토그람에서 가장 강한 25개의 피크 중 95% 이상이 유단백질의 서열 정보에 관련될 수 있었다. 이것에 대해 가능한 이유는 단백질 베이스에서 다른 단백질 공급원의 통합 또는 작거나 공동용리 피크로 인한 빈약한 MS/MS 데이터이다.
시스템의 반복성 및 재생성을 시험하기 위하여 Nutrilon Pepti Plus 샘플을 2회 추출하여 (시리즈의 처음, 중간 및 끝에) 3번 분석하였다. 카르복시 말단 아미노산 잔기의 분포에 대한 다양한 분석으로부터 얻은 데이터는 양호하게 일치하는 것으로 나타났다.
다양한 상업성 제품에서 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도는 표 3에서 제공한다. 이러한 펩티드의 몰 발생빈도는 또한 가수분해물을 제조하는데에 사용된 단백질성 비가공 물질의 프롤린 함유량에 관련된다. 예를 들어, 카세인 및 콜라겐은 유장 또는 콩 단백질 보다 훨씬 높은 프롤린 함유량을 갖는다. 이러한 양태를 계산에 넣기 위하여, 각 상업성 제품에 사용된 단백질 주성분에 존재하는 아미노산 중에서 프롤린의 몰 분율은 또한 산 가수분해 후 재료 및 방법 절에 설명된 방법을 이용한 아미노산 분석을 이용하여 감소시켰다. 게다가 사용된 비가공 재료는, 예를 들어 특정 반복 아미노산의 존재로 인해 효소 절단에 대한 그들의 감수성에서 상이할 수 있다.
Figure 112003020231364-pct00003
표 3에 나타난 데이터로부터, 대중적인 유장 가수분해물에서 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도가 낮다는 것이 분명하다. 또한 유장의 프롤린 함유량을 계산에 넣는다면, 본 발명자들은 어떠한 상업성 유장 기초 제품도 단백질 주성분에서 발생하는 프롤린의 몰 분율보다 더 높은 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 분율을 함유하지 않는다고 결론 내린다. 전형적으로 이들 유장 기초 상업성 제품에 있는 카르복시 말단 프롤린을 갖는 펩티드의 몰 분율은 5% 또는 그 이하이다.
Nutramigen과 같은 카세인 기초 제품에 있는 카르복시 말단 프롤린 잔기의 몰 발생 빈도를 관찰하면, 본 발명자들은 비록 카세인의 상대적으로 높은 프롤린 함유량을 계산에 넣는다 하더라도 유장 기초 제품에서 나타날 수 있는 것보다 상당히 더 높은 수준을 본다. 그러나, 서브틸리신 및 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 인큐베이션하여 만든 베타-카세인 가수분해물 (실시예 1 참조)과 Nutramigen 제품을 비교하는 것은, 기존의 상업성 카세인 가수분해물 및 본 발명에 따르는 카세인 가수분해물 간에 발생할 수 있는 광대한 조성적 차이점을 나타낸다. 상업성 제품은 22%의 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도를 나타내는 반면, 실시예 1에 따른 카세인 가수분해물에 대한 이 값은 61%이다.
실시예 7
첨가된 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 농도에 관련된 카르복시 말단 프롤린을 갖는 유장 펩티드의 몰 발생빈도
이 실시예에서 상업성 유장 단백질은 E. coli에 의해 생산된 것과 같은 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 다양한 조건 하에서 인큐베이션 하였다. 결과 가수분해물에서 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도를 측정하였다.
물 중 Protarmor 905 (Armor Proteins)의 용액을 pH 8.5에서 2.5% Delvolase (효소 질량/기질 질량)의 존재에서 1시간 동안 25℃부터 60℃까지 서서히 가열하였다. 1시간 후 용액을 80℃로 신속하게 가열하고 즉시 60℃로 냉각한 다음 새로운 2.5% 용량의 Delvolase를 첨가하였다. 또다른 1시간 동안 가수분해를 계속한 다음, 5분동안 95℃로 가열하고 다시 냉각하였다. pH 7.4로 조절한 후 0, 87 및 170 유닛/기질의 그람 (표 4에서는 U/g; World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 11, pp209-212에 설명된 방법에 따른 유닛)의 농도로 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 첨가하고 45℃에서 또다른 3시간 동안 가수분해를 진행시켰다. 최종적으로 용액을 95℃에서 5분 동안 유지하여 효소를 비활성화시키고 용액을 저온살균하였다. 얻은 가수분해물은 그 다음 LC/MS 로 분석하여 앞서 설명된 것과 같이 형성된 펩티드에서 카르복시 말단 프롤린 잔기의 몰 발생빈도를 측정하였다. 얻은 결과는 표 4에 나타난다.
Figure 112003020231364-pct00004
이 표로부터, 45℃에서 C-말단에 프롤린을 갖는 펩티드의 몰 발생빈도는 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 용량으로 증가한다는 것이 나타난다. 가장 높은 효소 용량을 사용하면, 이 유장 제품으로부터 얻은 펩티드의 50%까지는 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 것으로 나타났다. 30℃에서 인큐베이션을 수행했을 때, 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생 빈도는 87 유닛/기질 그람으로 52%에 도달할 수 있고 효소의 더 많은 용량으로는 거의 증가하지 않는다. 45℃에 비하여 30℃에서 87 U/g으로 도달한 더 높은 발생빈도는 E. coli 효소의 낮은 열안정성으로 설명할 수 있다.
실시예 8
프롤린-특이적 엔도프로테아제로 생산된 유당 가수분해물 및 그렇지 않은 것의 맛 및 조성
이 실시예에서 E. coli로부터 얻은 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 서브틸리신 (Delvolase)과의 조합으로 사용하여 낮은 고미의 유당 가수분해물을 생산하였다. 실시예 7에서 생성된 데이터를 이용하여 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 한계 증가만이 기대되도록 프롤린-린이적 엔도프로테아제의 용량을 선택하였다. 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 형성된 가수분해물은 프롤린-특이적 엔도프로테아제 없이 형성된 유사 가수분해물은 물론이고 상업성의, 낮은 쓴 맛을 내는 유당 가수분해물과도 비교하였다. 세 가지 제품은 모두 맛 및 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 함유량에 관하여 특성결정 하였다.
물 중 Protarmor 905 (Armor Proteins)의 용액을 pH 8.5에서 2.5% Delvolase (효소 질량/기질 질량)의 존재에서 1시간 동안 25℃부터 60℃까지 서서히 가열하였다. 1시간 후 용액을 80℃로 신속하게 가열하고 즉시 60℃로 냉각한 다음 새로운 2.5% 용량의 Delvolase를 첨가하였다. 또다른 1시간 동안 가수분해를 계속한 다음, 5분동안 95℃로 가열하고 다시 냉각하였다. pH 7.4로 조절한 후 50 유닛/기질의 그람의 농도로 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 첨가하였다. 이것은 45℃에서 3시간 동안 계속하였다. 실시예 7에서 얻은 데이터에 따라 이들 조건은 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드에서의 한계 증가만을 일으킨다. 최종적으로 용액을 95℃에서 5분 동안 유지하여 효소를 비활성화 하고 용액을 저온살균하였다. 그 다음 용액을 냉각하였다. 또다른 샘플에도 동일한 처리를 적용하되 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 첨가하지 않았다.
가수분해물의 감각 분석은 소위 2-쌍체 비교 시험으로 수행하였다. 이 타입의 시험은 American Society of Brewers Chemists (ASBC)에서 2개의 상이한 맥주의 고미를 비교하는데에 이용한다. 만약 본 발명자들이 이러한 한쪽으로 치우친 시험에서 오차의 5% 위험을 허용한다면, 통계적 차이점을 갖기 위한 임계값은 24 반응 중 17이다. 각 시험에서, 가수분해물은 2.5% 건조 제재 농도로 맛을 보고 각 용액의 1 ml 부분은 1회용 바이알에 넣었다. 각 평가자들에게는 삼키지 말고 고미 수준을 평가할 것과 그 후 물로 입을 씻어낼 것을 요청하였다. 모든 샘플은 암호화하고 평가자들 중에 무작위로 할당하였다.
첫번째 시험은 서브틸리신 단독에 대한 서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 조합의 장점을 평가하고자 했다. 두번째 시험은 상업성의, 낮은 쓴 맛을 내는 가수분해물 (Vitalarmor 800LB)에 대한 서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 조합으로 얻은 가수분해물의 고미를 평가하고자 했다. 이 목적으로 Vitalarmor 800LB는 다른 가수분해물에 사용한 것과 동일한 완충용액으로 희석하여 비교가능한 단백질 농도를 얻었다.
첫번째 시험을 담당한 24명 중, 17명은 서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 얻은 샘플이 서브틸리신 단독으로 얻은 샘플보다 덜 쓴 것으로 평가했 다. 이 결과는 통계적으로 유의하며, 상대적으로 낮은 농도로 적용될지라도 (실시예 7 참조) 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 탈고미 활성을 확증한다. 주목할 만한 것은 이들 "낮은" 효소 농도가 JP505314에서 적용되고 탈고미 효과를 청구한 효소 용량보다 수십배 더 높다는 것이다.
두번째 쌍체 샘플 비교에서, 24명 중 19명은 서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제로 얻은 샘플이 상업성 Vitalarmor 800LB 제품보다 덜 쓴 것으로 평가하였다. 후자의 관찰 또한 통계적으로 유의하며 본 발명의 가수분해물 및 효소 혼합물의 경제적 가치를 예증한다.
프롤린-특이적 엔도프로테아제를 가지고 또는 이것 없이 얻은 가수분해물은 앞에서 설명한 것과 같이 LC/MS로 분석하였다. 서브틸리신 단독으로 얻은 가수분해물에서, 41개의 펩티드를 분석하였다. 18개의 펩티드가 하나 이상의 프롤린 잔기를 함유하는 것으로 나타났음에도 불구하고 이들 펩티드 중 어떤 것도 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖지 않는 것으로 드러났다.
서브틸리신과 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 조합으로 얻은 가수분해물에서 31 개의 펩티드를 분석하였고 6개는 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 것으로 나타났다. 실시예 6에서 얻은 결과의 기초 상에 있는 것으로 기대되는 것과 동일 선상에 있는 이 관찰은, 프롤린-특이적 엔도프로테아제로의 인큐베이션 결과로서 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도가 0부터 19%까지 증가하였음을 나타낸다. 후자 제품의 감각 분석이 통계적으로 유의한 감소된 고미를 예증하는 것과 같이, 이 실험은 카르복시 말단 프롤린 잔기의 몰 발생빈도에서 약간 의 증가와 감소된 고미를 명백하게 연관시킨다.
고미의 수준을 감소시키는 것은 제외하고, 낮은 수준의 프롤린-특이적 엔도프로테아제로의 이 인큐베이션은 가수분해물의 펩티드 길이를 감소시키는 것으로 또한 나타날 수 있다. Delvolase 단독으로 처리한 가수분해물에서, LC/MS 분석은 펩티드가 7.5 아미노산의 평균 길이로 4 내지 14 아미노산 길이에서 다양하다는 것을 드러냈다. Delvolase 및 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 조합으로 처리된 가수분해물에서, 펩티드 길이는 6.1 아미노산의 평균 길이로 4 내지 12 아미노산까지 변화하는 것으로 나타났다. 이러한 감소된 펩티드 길이는 가수분해물 생산 과정의 수율을 개선할 뿐만 아니라, 가수분해물의 전반적인 알레르겐성을 감소시키고 산 조건 하에서 침전물을 최소화할 것이다.
실시예 9
Aspergillus niger 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 클로닝
실시예 3에서 설명된 펩티드 서열을 사용하여 전방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머를 개발하였다. 프라이머의 디제네라시를 감소시키기 위하여, 몇몇 위치에 이노신 염기를 도입하였다. 이것은 PCR 반응을 촉발할 수 있는 풀 (pool)에서 올리고뉴클레오티드 프라이머의 풍부도를 증가시키지만, 단점은 반응의 특이성을 감소시킨다는 것이다.
A. niger G306 (2001년 9월 10일 CBS에 CBS109712로서 기탁됨) 유래 게놈 DNA는 표준 기술을 이용하여 분리하여 표 5에 지적된 올리고뉴클레오티드 프라이머로의 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다.
Figure 112003020231364-pct00005
실험에서 전방향 및 역방향 프라이머의 모든 가능한 조합은 A. niger 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자를 증폭하는데에 사용하였다. 초기 실험은 표준 PCR 조건 하에서 수행하였다 (94℃에서 변성, 55℃에서 어닐 및 72℃에서 확장). 놀랍게도 이들 실험은 어떠한 특정 PCR 생성물도 산출하지 않았다. 부정적 결과는 주형 DNA에서의 불순물로 인한 것일 수 있기 때문에, 본 발명자들은 공지된 A. niger 유전자 중 몇몇 상이한 것에 대한 PCR 프라이머를 사용하여 대조 PCR 반응을 수행하였다. 비교가능한 반응에서 이들 후자의 유전자를 A. niger G306 게놈 DNA로부터 성공적으로 증폭하였는데, 이는 엔도-Pro 프라이머를 사용하여 단편을 증폭하는 것이 불가능한 것은 게놈 DNA 제제에 있는 불순물로 인한 것이 아니라는 것을 나타낸다.
이후로 어닐 온도를 45℃로 감소시킴으로써 PCR 반응의 긴축을 감소하도록 결정하였다. 그 결과 PCR의 특이성은 감소하였고 몇몇 밴드가 증폭되었지만, 이들 밴드 대부분은 프라이머 중 하나가 없는 대조 PCR 반응에서도 또한 검출되었다. 이들 PCR 생성물 중 몇몇은 일반 클로닝 벡터인 pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands)로 클로닝하였고 이들 단편의DNA 서열을 측정하였다. 불행하게도 코딩 단편 중 어떤 것도 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자를 코딩하지 않았다.
부가적으로, 상이한 중합효소의 사용, 프라이머- 또는 주형-농도의 증가, 터치-다운 PCR 및 고온 시동의 도입과 같은 많은 다른 조절을 PCR 프로토콜에 도입하였지만, 이들 프로토콜 중 어떤 것도 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 특정 단편을 산출하지 않았다. 이런 불확실한 접근의 명백한 위험을 최소화하기 위하여, 또다른, 덜 주지된 클로닝 방법을 시도하기로 결정하였다.
3'-RACE
A. niger G306 게놈 DNA 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자를 증폭하기 위한 본 발명자들의 어떠한 시도도 성공하지 못했기 때문에, 본 발명자들은 cDNA 합성을 위한 주형으로서 RNA를 사용하는 상이한 접근법을 이용하기로 결정하였다. 완전한 오픈 리딩 프레임의 3'-RACE, 5'-RACE 및 증폭을 이용한 미지의 유전자를 클로닝하는 접근법은, WO9938956에 설명되었다. 이 방법의 장점은, 상기 설명된 직접 PCR 방법과 비교하여 볼 때, 추가적인 촉발 부위가 cDNA의 3'-말단에 도입되어서, 코딩 서열의 일부를 증폭하는데에 두 개의 변성 프라이머 대신 단일 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 및 만능 프라이머만이 필요하다는 것이다. 게다가, 주형으로서 cDNA를 사용하는 것은 인트론으로 인산 증폭에서의 문제점을 회피한다. 증폭 반응에서 주형으로서 cDNA의 사용은 또한 게놈 DNA로부터의 증폭에 비하여 주형의 농도를 증가시킨다.
이 접근법에 따라, A. niger G306은 콜라겐을 유일한 탄소 공급원으로서 함유한 배지에서 배양하여 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하였다. 배지 조성은 재료 및 방법 절에 설명된다. 48시간 동안 34℃에서 배양한 어린 균사체를 수확하여, 전체 RNA의 분리에 사용하였다. 이 목적으로, Miracloth 여과 렙을 통한 여과를 이용하여 균사체를 수확하고 얼음 냉각된 멸균 데미워터로 세척하였다. 균사체 (250 mg)은 액체 질소에서 즉시 냉동하고 막자사발 및 막자를 사용하여 미세한 흰색 분말로 마멸하였다. 흰색 분말을 멸균 15 ml Greiner 튜브로 옮기고 제조업자 (Life Technologies, Paisley, UK)에 의해 설명된 것과 같이 정확하게 Trizol 방법으로 RNA를 분리하였다.
RNA 제제는 3'-RACE 키트 (AP; Life Technologies)의 앵커 프라이머로부터 cDNA를 합성하는데에 사용하였고, 이는 mRNA의 폴리-A 꼬리로부터 cDNA를 확장한다. RNase H 처리 후, 요약된 만능 증폭 프라이머 (AUAP; Life Technologies) 및 상기 설명된 이노신 치환 유전자 특정 전방향 프라이머 (No. 1, 3, 5 및 7)로 PCR하여 cDNA를 증폭하였다. 프라이머 No. 1 및 AUAP로 PCR한 경우에서만, A. niger G306 RNA로부터 ~1.4kb의 특정 증폭 생성물을 증폭할 수 있었다. 다른 프라이머로는 낮은 긴축에서 비-특이적 증폭만을 얻었다. 이 1.4 kb cDNA 단편은 pCR2.1로 클로닝하여 DNA 서열을 측정하였다.
5'-RACE
이 서열로부터 유전자의 5'-말단의 더 나아간 증폭을 위한 세 개의 유전자 특이적 프라이머를 디자인하였다. 세 프라이머, 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3', 5'-TGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3' 및 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3' 모두는 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 코딩하는 유전자의 코딩 서열에 상보적이고 역이다.
A. niger G306 유래 전체 RNA는 프라이머 5'-TTCAGTACTCCACCAGTACCTC-3'을 사용한 5'-RACE 키트 (Life Technologies)로 cDNA를 합성하는데에 사용하였다. RNase 처리 후, Glasmax 카트리지 (Life Technologies)를 사용하여 cDNA를 정제하였다. 터미널 트랜스퍼라아제 (TdT; Life Technologies)를 사용하여 cDNA에 폴리-dC 꼬리를 첨가하였다. 요약된 앵커 프라이머 (AAP; Life Technologies) 및 제 1의 포개진 프라이머 5'-TTGGGAAAAGGTGCCCTTCTCC-3'을 사용한 PCR 반응에서 cDNA를 증폭하였다. ~0.25 KB의 특정 증폭 생성물을 얻기 위하여 AUAP 프라이머 (Life Technologies) 및 제 2 프라이머 5'-GGATTATGATGGTCCAGCAGC-3'을 사용한 제 2 증폭 반응이 필요하였다. 아가로오스 겔 전기 영동을 통해 이 단편을 정제하고 pCR2.1로 클로닝 한 후 DNA 서열을 측정하였다. 이것은 이 단편이 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 코딩하는 유전자의 5'-부분을 함유한다는 것을 나타내었다.
유전자의 특성결정
3'-RACE 및 5'-RACE의 겹치는 서열을 결합한 것은 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 완전한 코딩 서열을 결과로 가져왔다. SEQ ID 1은 이 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전체 서열을 나타낸다. 526 아미노산의 감소된 단백질 서열은 SEQ ID 2에서 서술한다. 펩티드 ATTGEAYFE는 완전하게 올바른 것으로 나타난다. 펩티드 DGAPEGTST는 또한 올바르지만 인트론에 의해 개재된 게놈 DNA에 의해 암호화된다 (Aspergillus niger CBS513.88의 게놈 DNA의 클로닝 및 서열분석 을 위해 SEQ ID 15 및 실시예 11 참조). 다른 두개의 펩티드는 그들의 특성결정에 사용된 LC/MS/MS로 인한 에러를 포함한다 (실시예 3 참조). 이러한 불확실성에도 불구하고 본 발명자들은 처음으로 Aspergillus로부터 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 원하는 유전적 정보를 성공적으로 선택하고 확인하였다.
Aspergillus 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 신규성은 SwissProt, PIR 및 trEMBL과 같은 주지된 데이터베이스와 BLAST 검색을 비교함으로써 확증하였다. 어떤 다른 단백질과 이 단백질의 어떤 강한 동일성은 단백질 서열 데이터베이스에 비교해 볼 때 검출되지 않았다.
실시예 10
프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 과발현, 및 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 분리
프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 완전한 오픈 리딩 프레임은 A. niger G306의 cDNA로부터 프라이머 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' 및 AUAP 프라이머 (Life Technologies)를 사용하여 PCR 증폭하였다. 얻은 PCR 단편은 클로닝 벡터 pCR2.1 (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 결과 플라스미드를 EcoRI으로 절단하고 엔도-Pro 유전자를 함유한 단편을 발현 벡터인 pGBFIN-11 (WO9932617)의 EcoRI 부위로 클로닝하였다. 결과 클론은 XhoI으로 효소처리함으로써 체크하였는데, 이는 올바른 배향으로 단편이 삽입될 때 ~0.65 kb의 단편을 산출한다. 결과 플라스미드는 도 1에 나타나고 pGBFIN11-EPO로 명명하였다.
A. niger CBS 513.88은 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자 의 과발현을 위한 숙주로서 사용하였다. 그러므로, NotI으로 발현 벡터 pGBFIN11-EPO를 직선화하였는데, 이는 발현 벡터로부터 모든 E. coli 유래 서열을 제거한다. 효소 처리된 DNA는 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (24:23:1) 추출 및 에탄올로의 침전을 이용하여 정제하였다. A. niger 트랜스포메이션 방법은 WO 98/46772에 광범위하게 설명된다. 아세트아미드를 함유한 한천 배지 상에서 트랜스포먼트를 선택하는 방법, 및 표적화된 멀티카피 통합체를 선별하는 방법 또한 설명된다. 바람직하게, 발현 카세트의 다중 카피를 함유한 A. niger 트랜스포먼트는 샘플 물질의 더 나아간 생성에 대하여 선택된다.
배양 및 프로테아제의 분리
발현 카세트의 다중 카피를 함유한 A. niger 균주는 진탕 플라스크 배양물에서 균주를 배양함으로써 샘플 물질의 크로마토그래피 생성에 사용하였다. A. niger 균주의 배양 및 배양 육즙으로부터 균사체의 분리를 위한 유용한 방법은 WO 98/46772에 설명된다. 얻은 육즙 배지는 도 2에 묘사된 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 그 다음, 배양 육즙을 프로테아제의 크로마토그래피 정제에 사용하여 어떤 오염성 내부- 및 외부 단백질분해 활성을 제거하였다. 이 목적으로 우선 발효 육즙을 원심분리하여 진균 덩어리의 대부분을 제거한 다음 기공의 크기가 감소하는 다수의 필터로 상청액을 통과시켜 모든 세포 조각을 제거하였다. 최종적으로, 얻은 한외여과물을 pH 5.1의 20 밀리몰/리터 아세트산 나트륨에서 10 배 희석하고 Q-Sepharose FF 컬럼에 부었다. pH 5.1의 20 밀리몰/리터 아세트산 나트륨 중 0부터 0.4 몰/리터까지의 NaCl 구배로 단백질을 용리하였다. World Journal of Microbiology & Biotechnology 11. 209-212 (1995)에 설명된 프로토콜에 따르되 약간 변형된 검정 조건 하에서, Z-Gly-Pro-pNA (Bachem, Switzerland)의 절단을 향한 활성을 나타내는 피크 부분을 수집하여 모았다. A. niger 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 산 pH 최적조건을 고려하여, 37℃의 시트르산염/인산염 완충용액 에서 pH 5에서 효소 검정을 수행하였다. 활성 부분을 모아 농축함으로써, SDS-PAGE 상에서 오직 하나의 밴드 및 HP-SEC 상에서 하나의 피크만을 나타내는 제제를 최종적으로 수득하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 더 나아간 분석은 얻은 효소 제제의 순도를 확증하였다.
더욱이, 정제된 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 Edman 분해에 의한, 성숙한 단백질의 아미노-말단의 측정에 사용하였다. 성숙한 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 아미노-말단은 SEQ ID 2 및 SEQ ID 17의 42번 위치에서 시작한다.
실시예 11
A. niger 외의 진균 종에서 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 존재에 대한 스크리닝
프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 F. meningosepticum 및 A. niger 유전자 간의 낮은 뉴클레오티드 서열 상동성을 기초로 하여, 이들 두 유전자 간의 교차 혼성화를 배제할 수 있다. 더 많은 관련 미생물에 있는 A. niger 특이적 뉴클레오티드 서열 보존의 효과를 얻기 위하여, 혼성화 실험에 있어서 하기 균주들을 선택하였다. 진균 종 Aspergillus niger CBS102.12, Aspergillus niger CBS513.88, Aspergillus niger G306, Aspergillus carbonarius ATCC 1025, Aspergillus sojae DSM2809, Aspergillus ochraceus ATCC18500, Aspergillus acculeatls CBS101.43, Verticillium psalliotae CBS396.58, Phialophore mustea CBS142.41, Penicillium chrysogenum URCM237, Phoma exigua CBS431.74, Microsporum gallinae CBS221.55, Acremonium strictum ATCC20371, Rhizomucor miehei CBS370.65, Alternaria alternata CBS103.33, Talaromyces emersonii CBS393.64, Cladosporium chlorocephalum CBS213.73, Cladosporium tenuissinum CBS117.79 및 Trichoderma reesil ATCC26921을 30℃ (50℃에서 배양한 Talaromyces 균주는 제외)에서 100 ml PDB (Potato Dextrose Broth, Difco)에서 220 rpm으로 진탕하면서 배양하였다.
배양물이 충분히 자라면, Miracloth 필터를 통한 여과로써 균사체 덩어리를 수확하고, 10 mM KPi 완충용액 (pH 7.0)으로 세척한 후, 필터페이퍼 사이에서 건조시켰다. 균사체는 막자 및 막자사발로 액체 질소 하에서 미세한 흰색 분말을 얻을 때까지 마멸하였다. 그 다음으로, 제조업자에 의한 사용 설명서에 따라 PureGene 키트 (Gentra Systems, Minneapolis USA)를 이용하여 염색체 DNA를 분리하였다.
Saccharomyces cerevisiae ATCC20785는 실험에서 네가티브 대조구로서 사용하였고 YePD에서 30℃ 및 220 rpm으로 진탕하면서 배양하였다.
서던 블롯의 준비를 위하여, 모든 종의 염색체 DNA를 XhoI으로 효소처리하고 TAE 완충용액 중 0.8% 아가로오스 겔 상에서의 아가로오스 겔 전기영동으로써 효소 절단 단편을 분리하였다. 분리 후, 전통적인 방법 (Sambrook et al. (1982): Molecular cloning; a laboratory manual, ISBN 0-87969-309-6)으로 DNA 단편을 니 트로셀룰로오스 (0.2㎛, Schleicher & Schuell) 막에 블롯팅하고, 2시간 동안 80℃에서 블롯을 흡취하였다.
프라이머 5'-ATGCGTGCCTTCTCCGCTGTC-3' 및 AUAP 프라이머를 이용하여 주형으로서 사용한 pGBFIN11-EPO 상에서의 PCR로 혼성화를 위한 프로브를 합성하였다. 제조업자의 사용 설명서에 따라 RadPrime DNA 표지화 시스템 (Life Technologies)으로써 약 30 나노그람의 cDNA 단편을 32P-알파-dATP로 표지하였다. 표지 후, 스펀-컬럼 방법 (Sambrook et al., 1982)에 따른 Sephadex G-50 컬럼 상에서 프로브 단편을 정제함으로써, 통합되지 않은 dNTP's를 제거하였다.
혼성화 혼합물로 첨가하기에 앞서, 정제된 프로브는 끓는 물에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 변성시킨 후 얼음에서 신속하게 냉각하여, 즉시 사용하였다.
블롯의 사전혼성화는 연속적인 교반 하에서 50℃에서 1시간 동안 50 ml의 6 x SSC, 0.5% SDS, 5 x Denhardt, 0.1 mg/ml 청어 정자 DNA (Life Technologies)에서 수행하였다. 사전혼성화 용액에 프로브를 첨가한 후, 50℃에서 16시간 동안 혼성화를 수행하였다. 블롯은 대기 온도에서 30분 동안 200 ml 6 x SSC, 0.1% SDS로 2회, 그리고 50℃에서 30분 동안 200 ml 6 x SSC, 0.1% SDS로 1회 세척하여, 블롯에 비특이적으로 혼성화된 것을 제거하였다. 혼성화의 시각화에는 X-Omat AR (Kodak) 필름을 사용하였다.
이 실험의 결과는 표 6에서 설명한다. A. niger 및 A. carbonarlus 균주는 프로브와 강하게 혼성화한다. 또한 다른 A. sojae, A. ochraceus 및 A. acculeatis와 같은 Aspergillus 균주는 프로브와 혼성화한다. 대안으로 프롤린-특 이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자는 Aspergillus 속 내에서 양호하게 보존된다. 놀랍게도, Phialophora mustea, Rhizomucor miehei, Alternaria alternata, Talaromyces emersonii, 및 Trichoderma reesii와 같은, Aspergillus와의 혈연이 더욱 먼 진균류 또한 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 cDNA에 양호하게 혼성화한다. 네가티브 대조구로서 포함된 Saccharomyces cerevisiae는 물론이고 몇몇 다른 종들은 A. niger 유래 cDNA와 어떠한 혼성화도 나타내지 않는다 (표 6 참조). 이 결과는 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자가 많은 진균 종에서 보존된다는 것을 나타내며, 당업자는 이들 종 유래 유전자가 검출 방법으로서 여기 보여진 이종 혼성화를 이용하여 분리될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
이를 예시하기 위하여, 이 실시예에서 사용된 Aspergillus niger G306의 cDNA 단편을 Aspergillus niger CBS513.88의 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용하였다. 당업자는 게놈 DNA 라이브러리를 생성하고, 표지된 DNA 프로브로 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 지식을 가질 것이다. 이 방법은 또한 문헌에 광범위하게 설명되었다 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). 스크리닝에 있는 포지티브 클론을 정제하고 DNA를 서열분석 하였다. 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 Aspergillus niger CBS513.88 게놈 DNA는 SEQ ID 15에 나타난다. 이 예는 Aspergillus niger G306 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 유전자의 cDNA로의 혼성화를 이용하여 다른 종 및 균주 유래의 이 유전자를 분리하는 것이 가능하다는 것을 예시한다.
CBS513.88의 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 감소된 코딩 서열 및 아미노산 서열은 SEQ ID 16 및 SEQ ID 17에 각각 설명된다.
Figure 112003020231364-pct00006
실시예 12
Aspergillus oryzae로부터 얻은 효소 혼합물 및 콩 단백질 가수분해에서 그것의 효과
일본 특허 JP5015314는 대부분의 비-특이적 내부 단백질분해 활성 및 소량의 프롤린-특이적 엔도프로테아제를 함유한, Aspergillus oryzae FS 1-32로부터 얻은 정제되지 않은 효소 제제를 개시한다. 이 정제되지 않은 제제는 유의한 카르복시펩티다아제 활성을 더욱 함유한다. 이 정제되지 않은 효소 제제로 대두 단백질을 인큐베이션하면, 다른 프로테아제 제제로 얻을 수 있는 대두 가수분해물보다 유의 하게 덜 쓴 것으로 청구된 대두 단백질 가수분해물을 얻는다. 이 이로운 탈고미 효과에 대해 JP5015314에서 부여된 설명은 다른 프로테아제 제제는 카르복시펩티다아제와 조합된 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 존재가 없다는 것이다. JP5015314는 탈고미 효과에 대한 기초는 프롤린-특이적 엔도프로테아제의 활성에 의해 노출된 후 카르복시펩티다아제에 의해 제거되는 프롤린 잔기의 제거임을 제시한다.
본 출원의 실시예 4는 A. oryzae FS 1-32의 단백질분해 활성 프로파일을 닮은 상업성 효소의 혼합물이 콩 단백질에 미치는 영향을 설명한다. 이 실험적 작업 중 하나의 결론은, 기록된 것과 같은 수준에서 균주 FS 1-32로 프롤린 특이적 내부 단백질분해 활성을 통합하는 것은 카르복시말단 프롤린 잔기를 갖는 콩 펩티드의 감지할 수 있을 정도의 증가를 일으키지 않는다는 것이다. 이 결론은 본 출원에서 설명된 비-고미 단백질 가수분해물에 관하여 중요한 의미를 갖기 때문에, 본 발명자들은 실험을 반복하되 JP5015314에 설명된 조건하에서 A. oryzae FS 1-32로부터 얻은 혼합물을 사용하기로 결정하였다.
Aspergillus oryzae FS 1-32 (일본 Micr. Ind Lab의 저장소 12193으로부터 구입)를 맥아 추출 한천 플레이트에 플레이팅하고, 4일 동안 35℃에서 인큐베이션한 다음 4℃에서 하루동안 저장하였다. 이들 플레이트로부터의 포자는 20 그람/kg의 덱스트로오스, 15 그람/kg의 탈지 콩가루, 5 그람/kg의 저염 효모 추출물, 1 그람/kg의 KH2PO4 및 0.2 그람/kg의 소포제를 함유한 접종 배지를 접종하는데에 사용하였다. 탈미네랄 수에 용해한 후, 황산으로 배지의 pH를 5.5로 조절한 다음 배플을 갖는 100 ml 진탕플라스크에 20 ml의 부분으로 분할하였다. 진탕플라스크에 담 긴 배지는 121℃에서 30분 동안 멸균하고 냉각 후 접종하였다. 32℃에서 진탕 배양기에서 2일 후, 1 ml은 또다른 100 ml 접종 배지를 접종하는데에 사용하였다. 진탕배양기에서 32℃에서 또다른 하루가 지난 후, 이 배양물은 배양 배지를 접종하는데에 사용하였다. JP5015314가 사용된 발효 방법에 관한 정보를 제공하지 않기 때문에, EP 0 522 428에 제공된 발효 프로토콜 및 배지를 이용하였다.
EP 0 522 428에 따른 배양 배지는 다음의 성분을 함유한다 : 산성 카세인 (Armor Proteins, France) 25.4 그람/리터, 구운 대두 가루 (Cargill, Netherlands) 8.6 그람/리터, 밀 왕겨 (Zonnatura, Netherlands) 15.0 그람/리터, 옥수수 전분 20.0 그람/리터, 타닌산 (Omnichem) 16.0 그람/리터 및 KH2PO4 26.6 그람/리터. (프롤린-특이적 엔도프로테아제의 형성을 자극하기 위해) 제시된 타닌산은 EP 0522428에 명시되지 않기 때문에, 두 가지 타닌산, 즉 BREWTAN C 및 TANAL W2 (둘 모두 Omnichem (Wetteren, Belgium)으로부터 구입)를 사용하였다. 최종적으로 배양 배지의 pH 값은 인산 (20%)으로 4.5로 조절한 다음 배플로 500 ml 진탕플라스크에 100 ml의 부분으로 분할하였다. 플라스크는 121℃에서 30분 동안 멸균하였다.
1 밀리리터의 사전-배양된 접종 배지로 접종한 다음, 2일 및 4일 동안 32℃, 250 rpm으로 배양물을 인큐베이션하였다. 바이오매스를 제거하기 위해, 배양 육즙을 Whatman 유리 미세섬유 필터 (cat no 1820090)로 여과하고 -20℃에 저장하였다. 이 동결 재료의 일부는 동결건조하여 활성 측정은 물론이고 콩 단백질과의 인큐베 이션에 사용하였다.
동결건조 재료에서 폴리-엔도펩티다아제, 카르복시펩티다아제 및 엔도프로테아제의 활성은 JP5015314에 설명된 것과 똑같이 측정하였다. 2일 동안 발효시킨 샘플은 제시된 4일 동안 발효시킨 샘플보다 상당히 더 높은 효소 활성을 나타냈으므로 콩 단백질과의 최종 인큐베이션에 이 2일 샘플을 사용하기로 결정하였다. 가장 높은 프롤일-엔도펩티다아제 활성을 나타낸 이들 샘플의 효소 활성 데이터는 아래에 나타난다.
Figure 112003020231364-pct00007
샘플 1,3 및 4에서 측정한 프롤일-엔도펩티다아제 및 카르복시펩티다아제 활성은 JP5015314에 제공된 수치와 유사하다. 그러나, 이들 샘플에서 측정된 엔도프로테아제 활성은 JP5015314에 지적된 것보다 200 배 더 낮은 것으로 드러났다. 다양한 산업적 효소 제제에서 보고된 내부 단백질분해 활성을 고려하여 (실시예 4 참조); A. oryzae로부터 획득되어 JP5015314에 명시된 극단적으로 높은 내부 단백질분해 활성은 비현실적인 것으로 생각된다.
가능한 한 정확하게 JP5015314의 실시예 2를 모방한 시도에서, 다음 실험을 실행하였다. 10 그람의 콩 단백질 Soyamin 90HV (Lucas Meyer, Hamburg, Germany) 를 100 ml 탈미네랄 수에 현탁한 다음 4N NaOH로 pH를 8.5로 조절하였다. 그 다음 0.5 g Delvolase (DSM Food specialities, Seclin, France)를 (Daiwa Kasei로부터 구입한 Protin AY 대신) 첨가하고 (Delvolase 및 Protin AY는 둘 모두 Bacillus-유래 알칼리성 엔도프로테아제이다) 60℃에서 2시간 동안 단백질 용액을 인큐베이션 하였다 (JP5015314에는 Protin AY로의 인큐베이션 시간 및 온도가 명시되어 있지 않다). 최종적으로 10분 동안 92℃로 용액을 가열하여 Delvolase를 비활성화하였다.
그 다음 결과 단백질 가수분해물을 JP5015314에 설명된 그러나 원하는 카르복시펩타다아제 활성 (기질 그람당 0.01 유닛)에 있어서 표준화된 프로토콜에 따라 효소 샘플 1,3 및 4로 인큐베이션 하였다. 이것은 콩 분리물 그람 당, 2.0 밀리그람의 동결건조된 효소 샘플 1, 2.7 밀리그람의 동결건조된 효소 샘플 3 및 1.3 밀리그람의 동결건조된 효소 샘플 4가 첨가되야 한다는 것을 의미한다. 결과 엔도프로테아제 및 프롤일 엔도프로테아제 활성은 표 8에 나타난다.
pH 5 및 50℃에서 5시간 동안 인큐베이션 한 후, 샘플을 원심분리하여 LC/MS 분석까지 상청액을 냉동 유지하였다.
LC/MS 분석은 재료 및 방법 절에 명시된 것과 같이 실행하였다.
이 실험에서 단백질 데이터 뱅크는 콩 단백질만으로 이루어졌다. 얻은 펩티드에서 검출되는 카르복시말단 프롤린 잔기의 빈도는 아래에 명시한다.
Figure 112003020231364-pct00008
얻은 데이터로부터, Aspergillus oryzae FS 1-32로부터 얻은 정제되지 않은 효소 제제로 콩 단백질을 인큐베이션하는 것은 카르복시말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 분율에서 유의한 증가를 일으키지 않는다는 것이 분명하다. 그러므로 JP5015314에 설명된 탈고미 효과는 최종 가수분해물에서 이러한 펩티드의 높은 발생 빈도 때문일 수 없다.
실시예 13
Aspergillus 유래 프롤린-특이적 엔도프로테아제와 서모리신의 결합에 의해 얻은 비-고미 카세인 가수분해물
A. niger 유래 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 과발현하고 크로마토그래피로 정제한 다음 (실시예 10 참조) 비-고미 카세인 가수분해물을 생산하는데에 사용하였다. 이 목적으로 본 발명자들은 리터 당 60 그람을 함유한 100 ml의 카세인산염 나트륨 용액에 100 mg의 서모리신 (Thermoase)을 첨가하였다. pH 6.7 및 85℃에서의 인큐베이션은 카세인성 단백질의 즉각적인 양모형 응집 및 침전을 일으켰다. 2시간 동안의 인큐베이션의 결과 최종적으로 몇몇 침전물을 여전히 함유한, 투명한 용액이 발생하였다. 그 다음 용액의 pH를 pH 5.0으로 조절하고 95℃에서 45분 동안 가열함으로써 Thermoase를 비활성화 하였다. 냉각 후, 용액의 맛을 보고 매우 쓰다는 것을 관찰하였다. 이 단계에서 카세인산염 용액의 DH (가수분해의 정도; TNBS 방법을 이용하여 확립)는 대략 35%이었다. 소 카세인산염에 대한 데이터뱅크를 이용하여 LC/MSMS로써 수행된 64 펩티드의 분석은 14%의, 카르복시말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도를 지적하였다.
그 다음 크로마토그래피로 정제한, A. niger로부터 유래된 3 유닛의 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 25 밀리리터의 가수분해물에 첨가하였다. 20시간 동안 50℃에서 인큐베이션 한 후, 용액을 30분 동안 90℃에서 가열함으로써 또다른 효소 비활성 주기를 수행하였다. 실온으로 냉각한 후, 용액은 버리고 투명한 상청액은 pH 값을 4.0으로 조절하였다; 카세인산염 가수분해물은 완전하게 용해되어 투명하게 남는 것으로 밝혀졌다. 맛보기는 어떤 고미 또는 이취가 없음을 예증하였다. TNBS 방법을 사용한 이 최종 가수분해물의 DH는 대략 50%이었고, 64 펩티드의 LC/MS/MS 분석은 카르복시말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드의 몰 발생빈도가 45%로 증가하였음을 나타냈다. 이 45%는 Miprodan 기질에서 발생한 프롤린의 몰 분율보다 거의 4배 더 높은 것이다.
Figure 112006090497548-pct00012
<110> DSM NV <120> PROTEIN HYDROLYSATES ENRICHED IN PEPTIDES HAVING A CARBOXY TERMINAL PROLINE RESIDUE <130> 20001WO <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1581 <212> DNA <213> Aspergillus niger G306 <400> 1 atgcgtgcct tctccgctgt cgctgctgcg gccctggcgc tctcttgggc gtctctggct 60 caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctgtctctc ggccagcctc gagtaaatcg 120 gctgcgacca cgggcgaggc ttactttgag cagctgctgg accatcataa tccggagaag 180 ggcacctttt cccagaggta ctggtggagt actgaatact ggggtggtcc tgggtcaccg 240 gtcgtcctct ttactcctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaat 300 gggactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgagcac 360 cgcgactggg gtgattcttc tccttatgag gtgctcaatg ccgaaactct tcagtacctc 420 acactggacc aagccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtgaa gctgcaattc 480 gataacagca cccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggatcatac 540 agtggtgcct tgacggcttg gaccgaatct gtcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600 gccactagtg ctcctgtgga ggctatctac gactattggc aatactttta ccccatccag 660 caaggtatgg cacagaactg cagcaaggac gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaag 720 attggaaaga acggaactgc caaggagcag caggcactca aggaattgtt tggtctggga 780 gctgttgagc attttgatga ctttgccgct gtcctcccca acggaccgta cctctggcaa 840 gacaacgact ttgccacggg atactcttcc ttcttccagt tctgtgacgc cgtcgagggt 900 gtcgaagccg gcgcggcagt aacccccggc cccgagggtg tcggcctcga aaaggccctg 960 gccaactacg caaactggtt caattcaacc attctccctg attactgcgc aagctacggc 1020 tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgc ttcgacagct acaacgcctc gagccccatc 1080 tacaccgata cctccgtagg caatgccgtc gaccgccaat gggaatggtt cctctgcaac 1140 gagcctttct tctactggca ggacggtgct cccgagggta cctccaccat tgtgccccga 1200 ctcgtcagcg cctcctactg gcaacggcaa tgtccgctct acttccccga aacgaacggc 1260 tacacgtacg gcagcgcgaa gggtaagaac gccgccacgg tgaacagctg gaccggtgga 1320 tgggatatga cccgcaacac gacgcggttg atctggacga acgggcaata tgacccctgg 1380 cgggactccg gtgtgtcgag cactttccgg cccggtggac cgctggcgag cacggcgaat 1440 gaacccgtgc agattatcca gggcggattc cattgctcgg atttgtatat ggcggattat 1500 tatgcgaatg agggggttaa aaaggtggtg gataatgagg tgaagcagat caaggagtgg 1560 gtggaggagt attatgcctg a 1581 <210> 2 <211> 526 <212> PRT <213> Aspergillus niger G306 <400> 2 Met Arg Ala Phe Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ser Trp 1 5 10 15 Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Val 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Gly Ala Tyr 35 40 45 Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Glu Lys Gly Thr Phe Ser 50 55 60 Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro 65 70 75 80 Val Val Leu Phe Thr Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly 85 90 95 Tyr Leu Thr Asn Gly Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln 100 105 110 Gly Ala Val Ile Leu Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro 115 120 125 Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Thr Leu Thr Leu Asp Gln 130 135 140 Ala Ile Leu Asp Met Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe 145 150 155 160 Asp Asn Ser Thr Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val 165 170 175 Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Val Ala 180 185 190 Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala 195 200 205 Ile Tyr Asp Tyr Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala 210 215 220 Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys 225 230 235 240 Ile Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Ala Leu Lys Glu Leu 245 250 255 Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Phe Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu 260 265 270 Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Ala Thr Gly Tyr 275 280 285 Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly 290 295 300 Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu 305 310 315 320 Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asp Tyr Cys 325 330 335 Ala Ser Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp 340 345 350 Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Tyr Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn 355 360 365 Ala Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe 370 375 380 Tyr Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg 385 390 395 400 Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Pro Leu Tyr Phe Pro 405 410 415 Glu Thr Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ala Ala 420 425 430 Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr 435 440 445 Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly 450 455 460 Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ser Thr Ala Asn 465 470 475 480 Glu Pro Val Gln Ile Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr 485 490 495 Met Ala Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Lys Lys Val Val Asp Asn 500 505 510 Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala 515 520 525 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Aspergillus niger G306 <400> 3 Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr Phe Glu 1 5 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(26) <223> /mod_base="inosine" at positions 3,6,9,12 and 18 <400> 4 gcaacaacag gagargcata yttyga 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(26) <223> /mod_base="inosine" at positions 9,15,18,21 and 24 <400> 5 tcraartaag cytcaccagt agtagc 26 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Aspergillus niger G306 <400> 6 Ala Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Phe Thr Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> /mod_base="inosine" at positions 6,9 and 12 <400> 7 tggacaggag gatgggaytt yac 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> /mod_base="inosine" at positions 12,15 and 18 <400> 8 gtraartccc aaccaccagt cca 23 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Aspergillus niger G306 <400> 9 Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr 1 5 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> /mod_base="inosine" at positions 6,9,12 and 18 <400> 10 gayggagcac cagarggaac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> /mod_base="inosine" at positions 3,9,12 and 15 <400> 11 gtaccytcag gagcaccrtc 20 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Aspergillus niger G306 <400> 12 Glu Arg Glu Ala Gly Ala Ala Val Thr Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> /mod_base="inosine" at positions 6,9,12,15,18 and 21 <400> 13 gargcaggag cagcagtaac acc 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(23) <223> /mod_base="inosine" at positions 3,6,9,12,15 and 18 <400> 14 ggagtaacag cagcaccagc ytc 23 <210> 15 <211> 3290 <212> DNA <213> Aspergillus niger CBS513.88 <400> 15 gagaggcaga aggagtcatt tatcacttgt attccaatgt attttccatt tatagatact 60 gcattcaaat gcaccgttta gcatagcatc ccacattcta tttcattcca atctcatgcc 120 attgccatcc ccggtattaa tttacttctc cgccttatct tgcaatcttg caatctcttt 180 ctcctcgtta tcacgcgttc ctgcaggcgc acctccgatg gcactgcagc cggagtcccc 240 gcggcgccgg cactactaaa gactaaagtg tctagtctag cctccaatgt gctcacctcc 300 atcagcatct catccattta tcttctgacg atgtcatctg caggctccac cccctccggc 360 cgccccgacg ctctccgacg gtgcacaaca atcaattctg cagtcacgct caagattcgt 420 ccctgccgga ctcctcatgc cgtgcctggt ttaatctatg caatggagta aggtagtatc 480 gcctagcagg agcggagttc ctgctgcgct cacgccatgg tgccggcgca gacataaatc 540 gctcgtttcc tccggcgctg gccgttctct cgagccagtt tgtctgttgt ggttgtagga 600 tcctctgttc ccctcgacag ctcacaatgc gttccttctc cgttgtcgct gccgcgtcac 660 tggcgctctc ttgggcgtct ctggcccagg ctgctcgccc ccgtcttgtg cccaagccta 720 tctctcggcc agcttcgagt aagtcggctg cgactacggg tgaggcttat tttgagcagc 780 tgctggacca tcacaacccg gagaagggaa cgttttccca gcggtactgg tggagtactg 840 aatactgggg tggacctggg tcaccggtgc gtctctgaca tttggtctta tgaccggcca 900 tattgaaact tagccggtgg caaggtccgc aatcatgagg aacattgctg attaaactag 960 gtggtcctct ttaaccctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaac 1020 gatactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgaacgt 1080 gagtgtcact gctaccatgg aaaaaagaca ttcgctgatc gaccccaatc tagaccgcta 1140 ctggggcgac tcttcgcctt atgaggtgct caatgccgaa acacttcagt atctcacact 1200 ggatcagtcc attctggaca tgacctactt cgccgagacg gtaaagctgc agttcgataa 1260 tagcagccgc agcaatgcgc agaatgctgt atgttacctt caccgctcta tgtttctgat 1320 aggtactgac aacgtagccc tgggtcatgg tcggtggctc atacagcggt gccttgacgg 1380 cttggaccga gtctatcgcg cctggaacgt tctgggctta ccatgccacc agtgcgcctg 1440 tggaggctat ctatgacttt gtaggtgtag cctgctcttg ttatctatac ttgcagctaa 1500 ccaagccagt ggcaatactt ctaccccatt cagcaaggta tggcacagaa ctgcagcaag 1560 gatgtgtctc tggtagccga gtatgtcgac aaaattggga agaatggaac tgccaaggaa 1620 cagcaggagc tcaaagaatt gtttggtctg ggagctgttg agcattacga tgactttgcc 1680 gcgtgagtac ttcaaagtct atagacgagc ttttctgaca ggaacagtgt cctgcccaac 1740 ggaccgtacc tctggcaaga caacgacttt gtcacaggat actcttcctt cttccagttc 1800 tgtgatgctg tcgaggtgag ttaccaccag attcctcttg attgaagcaa tatactaacg 1860 gacacagggt gtcgaagccg gcgcggcagt gacccccggc cccgagggcg tcggacttga 1920 aaaggccctg gccaactacg caaactggtt caattcaacc atactcccta actgtatttc 1980 accatctctt gtctcgttcc tctcccttat cctcccagac taacctagtg acagactgcg 2040 caagctacgg ctactggacc gacgaatgga gcgtcgcctg tttcgacagc tataatgcct 2100 cgagccccat cttcaccgac acctccgtgg gtaaccctgt cgaccgccaa tgggaatggt 2160 tcctctgcaa cgagcctttc ttctggtggc aggagtgcgt accccttacc tcattcatga 2220 taacacacga acaattccac taacaaagat ccagcggtgc ccccgaggga acctccacta 2280 ttgtgccccg gctcgtcagc gcctcctact ggcaacgcca atgcccgctc tacttccccg 2340 aagttaacgg ctacacgtac ggcagcgcga agggtaaaaa ctccgctacg gtgaacagct 2400 ggacgggtgg atgggatatg acccgcaaca cgacgcggtt gatctggacg aacgggtagg 2460 tctcccccta atttccgttg attgtgatgt gaagataaac tcaatgctaa taaattgaga 2520 aggcaatatg acccctggcg cgactccggt gtgtcgagca ctttccggcc cggtggtccg 2580 ctggttagca cggcgaacga acccgtgcag attattccgg gcgggttcca ttgctcggac 2640 ttgtatatgg aggattacta tgcgaatgag ggtgtgagga aggtggttga taatgaggtg 2700 aagcagatta aggagtgggt ggaggagtat tatgcttgat gaagatactg gtggacatat 2760 ggagtgtaca taagatgaat ggtcataaaa tgatgatggt agatacggct atggctgttg 2820 attagatggt cctttcgcat ttcctaatta ctgagcacgt gctccatggt atgggaagtg 2880 gagacgttgc tatatatatt gactgtcggg cgattgttca cggcgtagaa gctagacgct 2940 ttgtctatgt ggccttcact aaagaccgtg actctgccca gtcttccccc cttcgaggac 3000 ctggtattag ccaaacccac ccacaaacct aacaaagatc atcgtgacat tgaagtcact 3060 ctaggtactg ctggcgctga ttacagtggc tcaattcgaa catttcaaca gcacataagg 3120 gaagggtcgc ttcacttgct accttgatac gaaagcagcc acgcccaaca cttatagggg 3180 tgacaaccat cggcatgctg ggttatctac tatatctcct gattctgtgg atcctggaga 3240 tcgatctggt acactaatct actacaatgc atgtgaagta gggataggca 3290 <210> 16 <211> 1581 <212> DNA <213> Aspergillus niger CBS513.88 <400> 16 atgcgttcct tctccgttgt cgctgccgcg tcactggcgc tctcttgggc gtctctggcc 60 caggctgctc gcccccgtct tgtgcccaag cctatctctc ggccagcttc gagtaagtcg 120 gctgcgacta cgggtgaggc ttattttgag cagctgctgg accatcacaa cccggagaag 180 ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggacc tgggtcaccg 240 gtggtcctct ttaaccctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaac 300 gatactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgaacac 360 cgctactggg gcgactcttc gccttatgag gtgctcaatg ccgaaacact tcagtatctc 420 acactggatc agtccattct ggacatgacc tacttcgccg agacggtaaa gctgcagttc 480 gataatagca gccgcagcaa tgcgcagaat gctccctggg tcatggtcgg tggctcatac 540 agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct atcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600 gccaccagtg cgcctgtgga ggctatctat gacttttggc aatacttcta ccccattcag 660 caaggtatgg cacagaactg cagcaaggat gtgtctctgg tagccgagta tgtcgacaaa 720 attgggaaga atggaactgc caaggaacag caggagctca aagaattgtt tggtctggga 780 gctgttgagc attacgatga ctttgccgct gtcctgccca acggaccgta cctctggcaa 840 gacaacgact ttgtcacagg atactcttcc ttcttccagt tctgtgatgc tgtcgagggt 900 gtcgaagccg gcgcggcagt gacccccggc cccgagggcg tcggacttga aaaggccctg 960 gccaactacg caaactggtt caattcaacc atactcccta actactgcgc aagctacggc 1020 tactggaccg acgaatggag cgtcgcctgt ttcgacagct ataatgcctc gagccccatc 1080 ttcaccgaca cctccgtggg taaccctgtc gaccgccaat gggaatggtt cctctgcaac 1140 gagcctttct tctggtggca ggacggtgcc cccgcgggaa cctccactat tgtgccccgg 1200 ctcgtcagcg cctcctactg gcaacgccaa tgcccgctct acttccccga agttaacggc 1260 tacacgtacg gcagcgcgaa gggtaaaaac tccgctacgg tgaacagctg gacgggtgga 1320 tgggatatga cccgcaacac gacgcggttg acttggacga acgggcaata tgacccctgg 1380 cgcgactccg gtgtgtcgag cactttccgg cccggtggtc cgctggttag cacggcgaac 1440 gaacccgtgc agattattcc gggcgggttc cattgctcgg acttgtatat ggaggattac 1500 tatgcgaatg agggtgtgag gaaggtggtt gataatgagg tgaagcagat taaggagtgg 1560 gtggaggagt attatgcttg a 1581 <210> 17 <211> 526 <212> PRT <213> Aspergillus niger CBS513.88 <400> 17 Met Arg Ser Phe Ser Val Val Ala Ala Ala Ser Leu Ala Leu Ser Trp 1 5 10 15 Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Ile 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr 35 40 45 Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Glu Lys Gly Thr Phe Ser 50 55 60 Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro 65 70 75 80 Val Val Leu Phe Asn Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly 85 90 95 Tyr Leu Thr Asn Asp Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln 100 105 110 Gly Ala Val Ile Leu Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro 115 120 125 Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln 130 135 140 Ser Ile Leu Asp Met Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe 145 150 155 160 Asp Asn Ser Ser Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val 165 170 175 Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Ile Ala 180 185 190 Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala 195 200 205 Ile Tyr Asp Phe Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala 210 215 220 Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys 225 230 235 240 Ile Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Glu Leu Lys Glu Leu 245 250 255 Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Tyr Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu 260 265 270 Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Val Thr Gly Tyr 275 280 285 Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly 290 295 300 Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu 305 310 315 320 Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asn Tyr Cys 325 330 335 Ala Ser Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp 340 345 350 Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Phe Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn 355 360 365 Pro Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe 370 375 380 Trp Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg 385 390 395 400 Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Pro Leu Tyr Phe Pro 405 410 415 Glu Val Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ser Ala 420 425 430 Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr 435 440 445 Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly 450 455 460 Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Val Ser Thr Ala Asn 465 470 475 480 Glu Pro Val Gln Ile Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr 485 490 495 Met Glu Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Arg Lys Val Val Asp Asn 500 505 510 Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Thr Ala 515 520 525

Claims (20)

  1. SEQ ID NO:2의 아미노산 1번부터 526번까지의 아미노산 서열을 가지며, 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 진균으로부터 얻는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 적합한 발현 숙주에서 폴리펩티드의 생산을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제 6 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체.
  8. 제 7 항의 핵산 구성체를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  9. 제 7 항의 핵산 구성체 또는 제 8 항의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  10. 제 7 항의 핵산 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하여, 폴리펩티드를 포함하는 상청액, 세포, 또는 상청액과 세포 모두를 생산하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법.
  11. 제 10 항의 방법에 의해 생산된 폴리펩티드.
  12. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법.
  13. 제 12 항의 방법에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 제 1 항에 따르는 엔도프로테아제를 암호화하는 DNA 분자.
  15. 삭제
  16. 제 1 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 포함하는 식품 또는 사료의 제제.
  17. 제 5 항에 있어서, 상기 진균은 Aspergillus인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 Aspergillus는 Aspergillus niger인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  19. 제 8 항의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하여, 폴리펩티드를 포함하는 상청액, 세포, 또는 상청액과 세포 모두를 생산하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 또는 제 5 항의 폴리펩티드를 생산하기 위한 방법.
  20. 제 19 항의 방법에 의해 생산된 폴리펩티드.
KR1020037007577A 2000-12-07 2001-12-06 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물 KR100867059B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00204404 2000-12-07
EP00204404.8 2000-12-07
EP01204464.0 2001-11-15
EP01204464 2001-11-15
PCT/EP2001/014480 WO2002045524A2 (en) 2000-12-07 2001-12-06 Prolyl endoprotease from aspergillus niger

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030066694A KR20030066694A (ko) 2003-08-09
KR100867059B1 true KR100867059B1 (ko) 2008-11-04

Family

ID=26072896

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087029681A KR100905849B1 (ko) 2000-12-07 2001-12-06 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한 단백질가수분해물
KR10-2003-7007576A KR20030085112A (ko) 2000-12-07 2001-12-06 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물
KR1020037007577A KR100867059B1 (ko) 2000-12-07 2001-12-06 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087029681A KR100905849B1 (ko) 2000-12-07 2001-12-06 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한 단백질가수분해물
KR10-2003-7007576A KR20030085112A (ko) 2000-12-07 2001-12-06 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물

Country Status (17)

Country Link
US (3) US7608697B2 (ko)
EP (3) EP1339837B1 (ko)
JP (3) JP4559023B2 (ko)
KR (3) KR100905849B1 (ko)
CN (2) CN1300328C (ko)
AT (2) ATE386110T1 (ko)
AU (3) AU2002234561B2 (ko)
BR (2) BRPI0116036B1 (ko)
CA (2) CA2430893C (ko)
CY (1) CY1111322T1 (ko)
DE (2) DE60132801T2 (ko)
DK (2) DK1339837T3 (ko)
ES (2) ES2347320T3 (ko)
MX (2) MXPA03005128A (ko)
NZ (2) NZ526270A (ko)
PT (1) PT1383393E (ko)
WO (2) WO2002045524A2 (ko)

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0115998B1 (pt) 2000-12-07 2015-02-18 Dsm Ip Assets Bv Método para a prevenção ou redução de turvação em uma bebida, bem como bebidas obteníveis a partir de dito método.
DK1339837T3 (da) 2000-12-07 2008-06-09 Dsm Ip Assets Bv Prolyl-endoprotease fra Aspergillus Niger
US7323327B2 (en) * 2001-02-23 2008-01-29 Dsm Ip Assets B.V. Genes encoding novel proteolytic enzymes
BR0210680A (pt) 2001-07-18 2004-09-21 Dsm Ip Assets Bv Processo para a hidrólise de proteìnas do leite
US7320788B2 (en) * 2002-02-14 2008-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue
US8143210B2 (en) 2002-02-14 2012-03-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue
DK1572127T4 (da) * 2002-02-14 2014-11-24 Univ Leland Stanford Junior Enzymbehandling af fødevarer til cøliaki
WO2003096984A2 (en) * 2002-05-14 2003-11-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for celiac sprue
US7202216B2 (en) * 2002-05-14 2007-04-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for celiac sprue
US7462688B2 (en) * 2002-05-14 2008-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptides for diagnostic and therapeutic methods for celiac sprue
WO2004045392A2 (en) * 2002-11-20 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnostic method for celiac sprue
US7265093B2 (en) * 2002-05-14 2007-09-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for Celiac Sprue
US20050256057A1 (en) * 2002-06-04 2005-11-17 Luppo Edens Protein hydrolysate rich in tripeptides
EP1511835B9 (en) 2002-06-07 2015-02-25 DSM IP Assets B.V. Improved method for the prevention or reduction of haze in beverages
EP1534314B1 (en) * 2002-09-04 2014-10-22 DSM IP Assets B.V. A nutritional and therapeutic composition of an insulin sensitizer and a peptide fraction
WO2004023647A1 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson Composite power amplifier
DE10331202A1 (de) 2003-07-10 2005-03-31 S.K. Enterprise Gmbh Verwendung von Molkenpermeat zur Behandlung des Metabolischen Syndroms
RU2370279C2 (ru) * 2003-09-23 2009-10-20 ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. Применение пролинспецифичных эндопротеаз для гидролиза пептидов и белков
US7579313B2 (en) * 2003-11-18 2009-08-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof
ES2350048T3 (es) 2004-04-02 2011-01-17 Dsm Ip Assets B.V. Mutantes fúngicos filamentosos con eficiencia mejorada de recombinación homóloga.
US7628985B2 (en) * 2004-04-26 2009-12-08 The Board Of Regents Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic enzyme formulations and uses thereof in celiac sprue and/or dermatitis herpetoformis
US7563864B2 (en) * 2004-04-26 2009-07-21 Celiac Sprue Research Foundation Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten
US7534426B2 (en) * 2004-04-26 2009-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Glutenase enzyme assays
WO2005117595A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Dsm Ip Assets B.V. Method to improve flavour of baked cereal products
ATE551048T1 (de) * 2004-06-28 2012-04-15 Dsm Ip Assets Bv Proteinhydrolysate enthaltende kosmetische zusammensetzungen
CN101163712B (zh) * 2004-07-31 2012-04-25 脑保护株式会社 改善神经保护和神经功能作用的丝素肽及其制备方法
NL1026931C2 (nl) * 2004-08-31 2006-03-01 Friesland Brands Bv ACE-remmende wei-hydrolysaten.
EP1827477B1 (en) * 2004-12-22 2015-10-21 DSM IP Assets B.V. Blood pressure lowering oligopeptides in a single enzymatic step
JP5068174B2 (ja) 2004-12-23 2012-11-07 カンピナ ネーデルランド ホールディング ビー．ブイ． Ｄｐｐ−ｉｖを阻害するペプチド中に濃縮されたタンパク質の加水分解物及びその使用
JP4637896B2 (ja) * 2005-02-03 2011-02-23 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 色調が改善されたクチナシ青色素とその製造方法
AU2006217901B2 (en) * 2005-02-24 2011-09-29 Dsm Ip Assets B.V. Blood pressure lowering peptides from glycomacropeptide
ES2755775T3 (es) 2005-11-28 2020-04-23 Dsm Ip Assets Bv Preparación de enzima que produce un sabor puro
EP1954299B1 (en) 2005-11-30 2016-01-13 Campina Nederland Holding B.V. Use of a protein hydrolysate for enhancing activity of glucagon-like peptide-1
DE102006004714A1 (de) * 2006-01-31 2007-08-02 Henkel Kgaa Pflegende Haarbehandlungsmittel mit Proteinhydrolysat(en)
CA2637701A1 (en) * 2006-02-02 2007-08-09 Dsm Ip Assets B.V. Food product comprising a proline specific protease, the preparation thereof and its use for degrading toxic or allergenic gluten peptides
WO2007113279A1 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for the hydrolysis of milk proteins
CA2649003A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-18 Mileutis Ltd. Livestock management for improved reproductive efficiency
WO2007122210A2 (en) * 2006-04-25 2007-11-01 Dsm Ip Assets B.V. Proline-specific proteases free from amylolytic activities
DK2402425T3 (da) * 2006-07-13 2021-07-05 Dsm Ip Assets Bv Forbedret brygningsproces
DE102006036285A1 (de) * 2006-08-03 2008-02-07 "S.U.K." Beteiligungs Gmbh Fraktionen aus Molkepermeat und deren Verwendung zur Prävention und Therapie des Typ-2 Diabetes und des Metabolischen Syndroms
EP2511372A1 (en) 2006-11-02 2012-10-17 DSM IP Assets B.V. Improved production of secreted proteins by filamentous fungi
NZ580425A (en) * 2007-03-16 2011-12-22 Univ Leland Stanford Junior Combination enzyme therapy for digestion of dietary gluten
US8557553B2 (en) * 2007-08-20 2013-10-15 Novozymes A/S Nuclease reduction
CN101294153B (zh) * 2007-11-22 2011-05-04 天津科技大学 一种黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶及其制备方法
EP2719379A1 (en) 2008-04-17 2014-04-16 DSM IP Assets B.V. Hydroxytyrosol benefits mitochondria
JP2011530274A (ja) * 2008-06-20 2011-12-22 ソレイ リミテッド ライアビリティ カンパニー 酸性条件下で安定なタンパク質加水分解組成物
WO2010009400A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Novozymes A/S Method for preparing a protein hydrolysate
US8498729B2 (en) * 2008-08-29 2013-07-30 Smp Logic Systems Llc Manufacturing execution system for use in manufacturing baby formula
US9055752B2 (en) 2008-11-06 2015-06-16 Intercontinental Great Brands Llc Shelf-stable concentrated dairy liquids and methods of forming thereof
WO2010133543A2 (en) * 2009-05-18 2010-11-25 Dsm Ip Assets B.V. Process to produce a wine or fruit juice stabiliser
US20120107847A1 (en) 2009-07-02 2012-05-03 Dsm Ip Assets B.V. Testing efficacy for celiac disease
AU2010334383B2 (en) * 2009-12-21 2014-10-02 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
GB201012539D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Savantium Ltd Nutritional compositions
UA112972C2 (uk) 2010-09-08 2016-11-25 Інтерконтінентал Грейт Брендс ЛЛС Рідкий молочний концентрат з високим вмістом сухих речовин
WO2013056038A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Abbott Laboratories Sterilized liquid protein supplement
WO2013133442A1 (ja) * 2012-03-09 2013-09-12 株式会社明治 水分吸収性に優れた飲食品
ES2444299B1 (es) * 2012-08-23 2014-12-12 Nutrición Técnica Deportiva, S.L. Uso de un hidrolizado de caseina como agente antiherpético
WO2014060495A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of an infant formula
EP2996487B1 (en) 2013-03-08 2019-12-11 Axiom Foods Inc. Rice protein supplements
US9820504B2 (en) 2013-03-08 2017-11-21 Axiom Foods, Inc. Rice protein supplement and methods of use thereof
JP2016523552A (ja) 2013-07-10 2016-08-12 ノバルティス アーゲー 多重プロテアーゼ欠損糸状菌細胞及びその使用方法
US9530146B2 (en) * 2013-09-05 2016-12-27 Dsm Ip Assets B.V. Marketing the use of an acidic soft drink to enhance the efficacy of a gluten-digesting enzyme
US9867872B2 (en) 2013-09-05 2018-01-16 Dsm Ip Assets B.V. Use of an acidic soft drink to enhance the efficacy of a gluten-digesting enzyme
ES2544153B1 (es) 2014-02-24 2016-06-06 Ntd Labs, S.L. Uso de un hidrolizado de caseína como agente antiviral
EP3146043B1 (en) * 2014-05-19 2019-06-26 DSM IP Assets B.V. Proline-specific endoprotease
US10294467B2 (en) * 2014-06-03 2019-05-21 Dsm Ip Assets B.V. Proline-specific endoprotease and use thereof
US10604780B2 (en) * 2014-07-01 2020-03-31 Dsm Ip Assets B.V. Low gluten yeast hydrolysates
WO2016012468A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
JP6505211B2 (ja) * 2015-04-30 2019-04-24 チャイナ ナショナル リサーチ インスティテュート オブ フード アンド ファーメンテーション インダストリーズ 低アレルギー誘発性で苦味の低下した大豆オリゴペプチド、その調製方法、およびその用途
ES2742175T3 (es) * 2016-09-01 2020-02-13 Metax Inst Fuer Diaetetik Gmbh Proteína sin fenilalanina para el tratamiento de PKU
JP2018057346A (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 森永乳業株式会社 カゼイン酵素処理物及びその製造方法
CN108064937A (zh) * 2016-11-15 2018-05-25 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 利用脯氨酸内切酶改性的饮用型发酵乳制品及其制备方法
CN106635845B (zh) * 2016-12-09 2020-04-14 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种高产脯氨酸蛋白酶的黑曲霉菌株
CN106754837B (zh) * 2016-12-09 2020-04-14 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种脯氨酸蛋白酶突变体及其应用
CN108588060B (zh) * 2017-03-07 2020-12-01 武汉康复得生物科技股份有限公司 一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶
JP2018184367A (ja) * 2017-04-26 2018-11-22 国立大学法人京都大学 ペプチド
CN110868870A (zh) * 2017-05-12 2020-03-06 艾斯姆食品公司 大米产物及制备它们的系统和方法
BR112019025950A2 (pt) 2017-06-09 2020-09-15 Novozymes A/S polipeptídeo, uso e método para hidrolisar proteína
KR20190081232A (ko) 2017-12-29 2019-07-09 토탈바이오 주식회사 곤충(귀뚜라미)의 단백질과 산야초 추출물의 혼합물를 피부 미백, 세포재생, 보습 유효성분으로 포함하는 화장품 조성물
CN109486707B (zh) * 2018-11-23 2021-11-02 北京林业大学 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用
EP3893669A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 DSM IP Assets B.V. Umami flavour composition
CN112680371A (zh) * 2019-10-18 2021-04-20 广东利世康低碳科技有限公司 一种水解餐厨垃圾中蛋白成分的产朊假丝酵母双基因共表达菌株及其构建方法
WO2021254943A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Dsm Ip Assets B.V. Umami flavour composition
CN112126668B (zh) * 2020-09-09 2024-03-01 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 一种特异性内切复合酶制备无苦味大豆多肽的方法
WO2022072718A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
US20240228917A1 (en) * 2021-06-18 2024-07-11 International N&H Denmark Aps Proteases for beer haze reduction
ES2940736B2 (es) 2021-11-09 2023-09-19 Ntd Labs S L U Uso combinado de imiquimod y de un hidrolizado de caseina para el tratamiento de condilomas
WO2023099480A2 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Dsm Ip Assets B.V. Improved beverage production process
WO2023148301A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Biotalys NV Modified microbial cells and uses thereof
WO2024126712A1 (en) * 2022-12-14 2024-06-20 Dsm Ip Assets B.V. Process for preparing hydrolyzed vegetable proteins

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2608540B2 (ja) 1982-05-19 1997-05-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ クルイベロミセス種のためのクローニング系
JP2669457B2 (ja) 1983-07-06 1997-10-27 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 工業微生物種中の分子クローニングおよび発現
US4885249A (en) 1984-12-05 1989-12-05 Allelix, Inc. Aspergillus niger transformation system
DE3650783T2 (de) 1985-04-15 2004-07-15 Dsm Ip Assets B.V. Verwendung des Glucoamylasepromotors aus Apergillus
GB8528100D0 (en) 1985-11-14 1985-12-18 Imp Biotechnology Zenymatic hydrolysis of proteins
IL83192A (en) 1986-07-18 1992-11-15 Gist Brocades Nv Method for the preparation of proteins with factor viii activity by microbial host cells;expression vectors,host cells,antibodies
JPS6386485A (ja) 1986-09-30 1988-04-16 Agency Of Ind Science & Technol トンネル型ジヨセフソン接合素子
CN1026994C (zh) 1987-07-28 1994-12-14 吉斯特布罗卡德斯股份有限公司 在克鲁维酵母宿主生产所需肽的方法
EP0321603A1 (fr) 1987-12-23 1989-06-28 Societe Des Produits Nestle S.A. Procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de lactosérum et d'un aliment hypoallergéniques
EP0325986A3 (en) 1988-01-28 1989-10-11 Miles Inc. Enzymatic hydrolysis of proteins
JPH0630615B2 (ja) 1988-07-27 1994-04-27 江崎グリコ株式会社 低分子ペプチド組成物及びその製造方法
JP2862418B2 (ja) * 1990-09-20 1999-03-03 森永乳業株式会社 脂質代謝改善に有効な機能性食品
JPH04297923A (ja) 1991-03-27 1992-10-21 Nec Software Kansai Ltd 文字コード変換方式
JPH051314A (ja) 1991-06-24 1993-01-08 Kawasaki Steel Corp 光フアイバ式温度分布測定装置
JP3010795B2 (ja) * 1991-07-04 2000-02-21 不二製油株式会社 ペプチドの苦味除去方法
JPH0614776A (ja) * 1991-07-04 1994-01-25 Fuji Oil Co Ltd プロリルエンドペプチダーゼ及びその製造方法
DE69233710T2 (de) 1991-07-24 2008-06-19 Novartis Ag Expressionsvektor für Prolylendopeptidase von Flavobacterium meningosepticum
JPH07115969A (ja) 1993-10-25 1995-05-09 Asahi Chem Ind Co Ltd 加水分解蛋白質の製造方法
ES2213164T3 (es) 1994-10-26 2004-08-16 Novozymes A/S Metodo de produccion de un hidrolizado de proteina de leche.
DE19502168C1 (de) * 1995-01-25 1996-06-27 Henkel Kgaa Verfahren zur Herstellung von Weizenproteinhydrolysaten
JPH09164A (ja) * 1995-06-22 1997-01-07 Asahi Chem Ind Co Ltd 加水分解蛋白質の製造方法
JP3171560B2 (ja) 1996-05-21 2001-05-28 仁 苅野 ヘテロポリ酸触媒
WO1998014599A1 (en) * 1996-10-04 1998-04-09 Novo Nordisk Biotech, Inc. Carboxypeptidases from aspergillus oryzae and nucleic acids encoding same
WO1998027827A1 (en) * 1996-12-23 1998-07-02 Dsm N.V. Method for producing a protein hydrolysate
PL336345A1 (en) 1997-04-11 2000-06-19 Dsm Nv Genic conversion as a tool for constructing recombined filiform fungi
DK1042461T3 (da) 1997-12-22 2007-09-24 Dsm Ip Assets Bv Ekspressionskloning i filiforme svampe
WO1999038956A2 (en) 1998-01-30 1999-08-05 Institut National De La Recherche Agronomique Enzyme modifying rhamnogalacturonane ii, dna encoding for said enzymes and method for producing the enzyme
JPH11221024A (ja) 1998-02-06 1999-08-17 Fuji Oil Co Ltd ポリペプチド、ポリペプチド混合物及び乳化剤
JPH11225686A (ja) 1998-02-10 1999-08-24 Morinaga Milk Ind Co Ltd カゼイン加水分解物及びその製造方法
JPH11243866A (ja) 1998-03-05 1999-09-14 Morinaga Milk Ind Co Ltd カゼイン加水分解物及びその製造法
DK1339837T3 (da) 2000-12-07 2008-06-09 Dsm Ip Assets Bv Prolyl-endoprotease fra Aspergillus Niger
BR0115998B1 (pt) 2000-12-07 2015-02-18 Dsm Ip Assets Bv Método para a prevenção ou redução de turvação em uma bebida, bem como bebidas obteníveis a partir de dito método.
US7323327B2 (en) 2001-02-23 2008-01-29 Dsm Ip Assets B.V. Genes encoding novel proteolytic enzymes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Dairy Science, 77 (2):385-392 (1994)

Also Published As

Publication number Publication date
CN1484694A (zh) 2004-03-24
CN100506981C (zh) 2009-07-01
JP4559023B2 (ja) 2010-10-06
PT1383393E (pt) 2010-09-16
WO2002045523A2 (en) 2002-06-13
WO2002045524A3 (en) 2002-10-24
BR0116003A (pt) 2004-03-30
US7608697B2 (en) 2009-10-27
MXPA03005128A (es) 2004-12-06
EP1339837A2 (en) 2003-09-03
DE60142704D1 (en) 2010-09-09
DE60132801D1 (de) 2008-03-27
US20040241664A1 (en) 2004-12-02
EP1339837B1 (en) 2008-02-13
JP4119248B2 (ja) 2008-07-16
JP4991897B2 (ja) 2012-08-01
US20040241791A1 (en) 2004-12-02
CY1111322T1 (el) 2015-08-05
ATE386110T1 (de) 2008-03-15
JP2004517832A (ja) 2004-06-17
CA2437081C (en) 2010-10-19
CN1300328C (zh) 2007-02-14
ES2301579T3 (es) 2008-07-01
JP2010213703A (ja) 2010-09-30
AU1608902A (en) 2002-06-18
CA2430893A1 (en) 2002-06-13
DK1339837T3 (da) 2008-06-09
BR0116036A (pt) 2004-02-17
KR20030066694A (ko) 2003-08-09
CA2437081A1 (en) 2002-06-13
DE60132801T2 (de) 2009-02-12
KR100905849B1 (ko) 2009-07-02
NZ526270A (en) 2004-11-26
MXPA03005127A (es) 2004-10-15
US20100112635A1 (en) 2010-05-06
EP1383393A2 (en) 2004-01-28
US7309595B2 (en) 2007-12-18
EP2175013A1 (en) 2010-04-14
NZ526271A (en) 2005-02-25
JP2004519221A (ja) 2004-07-02
WO2002045524A2 (en) 2002-06-13
BRPI0116036B1 (pt) 2016-03-08
AU2002234561B2 (en) 2007-01-18
DK1383393T3 (da) 2010-10-11
KR20080108630A (ko) 2008-12-15
WO2002045523A3 (en) 2003-01-30
EP1383393B1 (en) 2010-07-28
ES2347320T3 (es) 2010-10-28
KR20030085112A (ko) 2003-11-03
AU3456102A (en) 2002-06-18
CN1484497A (zh) 2004-03-24
CA2430893C (en) 2013-07-30
ATE475324T1 (de) 2010-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100867059B1 (ko) 카르복시 말단 프롤린 잔기를 갖는 펩티드가 풍부한단백질 가수분해물
AU2002234561A1 (en) Protein hydrolysates enriched in peptides having a carboxy terminal proline residue
EP2077324B1 (en) Genes encoding proteolytic enzymes from aspargilli
JP2009540847A (ja) ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、およびシトルリン化タンパク質およびペプチド生成におけるその使用
JP2011525349A (ja) ペニシリウム・クリゾゲヌム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のプロリン特異的プロテアーゼ
AU2002216089B2 (en) Prolyl endoprotease from aspergillus niger
CN100497616C (zh) 富含具有羧基末端脯氨酸残基的肽的蛋白质水解产物
AU2002216089A1 (en) Prolyl endoprotease from aspergillus niger
AU2008202554B2 (en) Novel genes encoding novel proteolytic enzymes
KR20030080229A (ko) 신규 단백질 분해효소를 암호화하는 신규 유전자

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121009

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131001

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141006

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151002

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160929

Year of fee payment: 9