JPH07115969A - 加水分解蛋白質の製造方法 - Google Patents
加水分解蛋白質の製造方法Info
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- JPH07115969A JPH07115969A JP5266467A JP26646793A JPH07115969A JP H07115969 A JPH07115969 A JP H07115969A JP 5266467 A JP5266467 A JP 5266467A JP 26646793 A JP26646793 A JP 26646793A JP H07115969 A JPH07115969 A JP H07115969A
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- prolinase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 呈味力が増強され、味質の良い加水分解蛋白
質を製造するための酵素剤ならびに製造法を提供する。 【構成】 同一微生物由来のプロリルエンドペプチダ−
ゼ、プロリダ−ゼおよびプロリナ−ゼを含有することを
特徴とする酵素剤および該酵素剤を用いた蛋白質の加水
分解法。 【効果】 蛋白質が高度に加水分解され、呈味力が増強
される。また、最終産物中のアスパラギン酸、スレオニ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン等呈味性の高い
アミノ酸の遊離率が高まり、味質の良い加水分解蛋白質
が製造できる。
質を製造するための酵素剤ならびに製造法を提供する。 【構成】 同一微生物由来のプロリルエンドペプチダ−
ゼ、プロリダ−ゼおよびプロリナ−ゼを含有することを
特徴とする酵素剤および該酵素剤を用いた蛋白質の加水
分解法。 【効果】 蛋白質が高度に加水分解され、呈味力が増強
される。また、最終産物中のアスパラギン酸、スレオニ
ン、グルタミン酸、プロリン、グリシン等呈味性の高い
アミノ酸の遊離率が高まり、味質の良い加水分解蛋白質
が製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、加水分解蛋白質の製造
方法に関する。加水分解蛋白質は調味料、食品の品質改
良剤等に幅広く利用されている。
方法に関する。加水分解蛋白質は調味料、食品の品質改
良剤等に幅広く利用されている。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質の加水分解は従来鉱酸を添加して
高温、高圧処理する事により行われている。特に食品用
途では、製品に苦味を生じさせないために塩酸が用いら
れている。しかしながら、蛋白質を塩酸で加水分解した
場合には蛋白質中に微量に残存している油脂類と塩酸と
が反応する事によりモノクロロプロパンジオール（ＭＣ
Ｐ）やジクロロプロパノール（ＤＣＰ）等の好ましくな
い塩素化化合物が生成することが近年問題になりつつあ
る。一方、蛋白質分解酵素を用いた蛋白質の加水分解も
多く報告されているが、高価な酵素を多量に必要とする
こと、反応中に雑菌汚染を生じる可能性が高いこと、さ
らに蛋白質を高度に加水分解することが困難であること
から、実用化されている例は少ない。
高温、高圧処理する事により行われている。特に食品用
途では、製品に苦味を生じさせないために塩酸が用いら
れている。しかしながら、蛋白質を塩酸で加水分解した
場合には蛋白質中に微量に残存している油脂類と塩酸と
が反応する事によりモノクロロプロパンジオール（ＭＣ
Ｐ）やジクロロプロパノール（ＤＣＰ）等の好ましくな
い塩素化化合物が生成することが近年問題になりつつあ
る。一方、蛋白質分解酵素を用いた蛋白質の加水分解も
多く報告されているが、高価な酵素を多量に必要とする
こと、反応中に雑菌汚染を生じる可能性が高いこと、さ
らに蛋白質を高度に加水分解することが困難であること
から、実用化されている例は少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、複数
の酵素が安定に存在しうる酵素剤を提供することによ
り、該酵素剤を用いて蛋白質を高度に加水分解する方法
を開発することである。
の酵素が安定に存在しうる酵素剤を提供することによ
り、該酵素剤を用いて蛋白質を高度に加水分解する方法
を開発することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】酵素による加水分解で蛋
白質の加水分解率が低い原因としては、蛋白質中に存在
するプロリン残基がポイントと考えられる。すなわち、
プロリンは環状α−イミノ酸であり、他のアミノ酸とは
異なる立体構造をしている。蛋白質またはペプチド中の
プロリン残基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペ
プチド結合は通常の蛋白質分解酵素による加水分解を受
けにくいことが理由として考えられる。本発明者らは上
記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、同一微生物由
来のプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよび
プロリナーゼを含有する酵素剤による処理、あるいは当
該酵素剤処理とエキソペプチダーゼ活性を有する酵素に
よる処理とを組み合わせることにより、従来加水分解さ
れ難かったプロリン残基が関与するペプチド結合が効率
よく加水分解され、その結果、蛋白質の加水分解率を高
めることができることを発見し、本発明を完成させるに
到った。プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼお
よびプロリナーゼは、ほ乳類の臓器に広く分布している
が、臓器の入手が困難であるため、入手容易な微生物由
来の酵素剤を用いることが望ましい。また、上記３種の
酵素を別々の微生物から調製し、これらを混合すること
により本発明と同様の操作を行うことも可能ではある
が、由来の異なる蛋白分解系酵素を混合した場合には、
それぞれの酵素が互いに別の酵素蛋白質を加水分解する
結果、酵素活性が急激に低下する恐れがある。これに対
し、同一微生物由来の酵素の場合には、長期間の培養後
でも安定に存在していたものであり、これらを同時に存
在させても上記の様な活性低下の恐れはない。
白質の加水分解率が低い原因としては、蛋白質中に存在
するプロリン残基がポイントと考えられる。すなわち、
プロリンは環状α−イミノ酸であり、他のアミノ酸とは
異なる立体構造をしている。蛋白質またはペプチド中の
プロリン残基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペ
プチド結合は通常の蛋白質分解酵素による加水分解を受
けにくいことが理由として考えられる。本発明者らは上
記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、同一微生物由
来のプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよび
プロリナーゼを含有する酵素剤による処理、あるいは当
該酵素剤処理とエキソペプチダーゼ活性を有する酵素に
よる処理とを組み合わせることにより、従来加水分解さ
れ難かったプロリン残基が関与するペプチド結合が効率
よく加水分解され、その結果、蛋白質の加水分解率を高
めることができることを発見し、本発明を完成させるに
到った。プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼお
よびプロリナーゼは、ほ乳類の臓器に広く分布している
が、臓器の入手が困難であるため、入手容易な微生物由
来の酵素剤を用いることが望ましい。また、上記３種の
酵素を別々の微生物から調製し、これらを混合すること
により本発明と同様の操作を行うことも可能ではある
が、由来の異なる蛋白分解系酵素を混合した場合には、
それぞれの酵素が互いに別の酵素蛋白質を加水分解する
結果、酵素活性が急激に低下する恐れがある。これに対
し、同一微生物由来の酵素の場合には、長期間の培養後
でも安定に存在していたものであり、これらを同時に存
在させても上記の様な活性低下の恐れはない。
【０００５】プロリルエンドペプチダーゼ（別名ポスト
プロリンクリービング酵素またはプロリン特異的エンド
ペプチダーゼ、ＥＣ ３．４．２１．２６）を生産する
微生物としては、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細
菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の放線菌が
報告されている。通常のプロリルエンドペプチダーゼは
低分子ペプチドには作用するものの高分子ペプチドや蛋
白質には作用しないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘ
ａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ ＨＡ−３６株が生産するプロ
リルエンドペプチダーゼはカゼイン等の高分子基質を加
水分解することが報告されている。これら微生物以外に
もプロリルエンドペプチダーゼを生産する微生物を新た
にスクリーニングすることにより新規プロリルエンドペ
プチダーゼを取得することも可能である。プロリルエン
ドペプチダーゼを生産する微生物は、その培養液をカル
ボベンゾキシ−アラニル−アラニル−プロリル−パラニ
トロアニリド（以下Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮ
Ａと略す）に作用させ、黄色のパラニトロアニリンを遊
離させることを指標に土壌等より分離することができ
る。
プロリンクリービング酵素またはプロリン特異的エンド
ペプチダーゼ、ＥＣ ３．４．２１．２６）を生産する
微生物としては、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細
菌、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の放線菌が
報告されている。通常のプロリルエンドペプチダーゼは
低分子ペプチドには作用するものの高分子ペプチドや蛋
白質には作用しないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘ
ａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ ＨＡ−３６株が生産するプロ
リルエンドペプチダーゼはカゼイン等の高分子基質を加
水分解することが報告されている。これら微生物以外に
もプロリルエンドペプチダーゼを生産する微生物を新た
にスクリーニングすることにより新規プロリルエンドペ
プチダーゼを取得することも可能である。プロリルエン
ドペプチダーゼを生産する微生物は、その培養液をカル
ボベンゾキシ−アラニル−アラニル−プロリル−パラニ
トロアニリド（以下Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮ
Ａと略す）に作用させ、黄色のパラニトロアニリンを遊
離させることを指標に土壌等より分離することができ
る。
【０００６】プロリダーゼ（別名プロリンジペプチダー
ゼ、ＥＣ ３．４．１３．９）を生産する微生物として
は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属糸状
菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎｕｓ属細菌等が報告されている。プロリダーゼ
はＸ−Ｐｒｏの構造のジペプチドを加水分解するが、Ｘ
−Ｐｒｏ−Ｙの構造のトリペプチドのＸ−Ｐｒｏ結合を
加水分解する場合もある。これら微生物以外にもプロリ
ダーゼを生産する微生物を新たにスクリーニングするこ
とにより新規プロリダーゼを取得することも可能であ
る。プロリダーゼを生産する微生物は、その培養液をグ
リシル−プロリン（以下Ｇｌｙ−Ｐｒｏと略す）に作用
させた後に生じる遊離プロリンを指標に土壌等より分離
することができる。
ゼ、ＥＣ ３．４．１３．９）を生産する微生物として
は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属糸状
菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎｕｓ属細菌等が報告されている。プロリダーゼ
はＸ−Ｐｒｏの構造のジペプチドを加水分解するが、Ｘ
−Ｐｒｏ−Ｙの構造のトリペプチドのＸ−Ｐｒｏ結合を
加水分解する場合もある。これら微生物以外にもプロリ
ダーゼを生産する微生物を新たにスクリーニングするこ
とにより新規プロリダーゼを取得することも可能であ
る。プロリダーゼを生産する微生物は、その培養液をグ
リシル−プロリン（以下Ｇｌｙ−Ｐｒｏと略す）に作用
させた後に生じる遊離プロリンを指標に土壌等より分離
することができる。
【０００７】プロリナーゼ（別名プロリルジペプチダー
ゼ、ＥＣ ３．４．１３．８）を生産する微生物として
は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ等が報告されている。プロリナーゼはＰｒｏ−Ｘの構
造のジペプチドを加水分解する酵素であり、これら微生
物以外にもプロリナーゼを生産する微生物を新たにスク
リーニングすることにより新規プロリナーゼを取得する
ことも可能である。プロリナーゼを生産する微生物は、
その培養液をプロリル−グリシン（以下Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
と略す）に作用させた後に生じる遊離プロリンを指標に
土壌等より分離することができる。
ゼ、ＥＣ ３．４．１３．８）を生産する微生物として
は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ等が報告されている。プロリナーゼはＰｒｏ−Ｘの構
造のジペプチドを加水分解する酵素であり、これら微生
物以外にもプロリナーゼを生産する微生物を新たにスク
リーニングすることにより新規プロリナーゼを取得する
ことも可能である。プロリナーゼを生産する微生物は、
その培養液をプロリル−グリシン（以下Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
と略す）に作用させた後に生じる遊離プロリンを指標に
土壌等より分離することができる。
【０００８】プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダー
ゼおよびプロリナーゼを同時に生産する微生物として、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＵ−２２株およびＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ
ＨＡ−３６株があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．ＫＵ−２２株はは好気性の桿菌であり、ＹＭ培地
（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、マルト
エキス０．３％、グルコース１．０％、寒天１．０％、
ｐＨ７．２）上３０℃で培養した場合に淡黄土色、湿潤
で光沢のあるコロニーを形成する。細胞のサイズは０．
４μｍ×１．６μｍの直桿菌であり、グラム染色陰性、
運動性あり、極性鞭毛、ウレアーゼテスト陽性、カタラ
ーゼテスト陽性、オキシダーゼテスト陽性、クエン酸利
用テスト陽性、澱粉加水分解テスト陰性、グルコース酸
化能（ＯＦ−テスト）陽性、キノン系はＱ−９、黄色色
素産生なし、水溶性色素産生なし、蛍光色素産生なし、
アルギニン加水分解酵素テスト陰性、フォーゲス−プロ
スカウエルテスト（ＶＰテスト）陰性、硝酸還元テスト
陰性、メチルレッドテスト陰性、Ｄ−グルコース、Ｄ−
マニトール、Ｄ−マンノース、エタノール、スクロース
より好気条件下に酸を生成しない、３７℃、４０℃、４
２℃で生育し、４５℃で生育しない、５％食塩存在下に
生育し、１０％食塩存在下に生育しない、好気条件下に
Ｄ−グルコース、Ｄ−マニトール、Ｄ−マンノース、酢
酸を資化し、スクロースを資化しない。尚、本菌株は工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３
７８８として寄託されている。
ゼおよびプロリナーゼを同時に生産する微生物として、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＵ−２２株およびＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ
ＨＡ−３６株があげられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．ＫＵ−２２株はは好気性の桿菌であり、ＹＭ培地
（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、マルト
エキス０．３％、グルコース１．０％、寒天１．０％、
ｐＨ７．２）上３０℃で培養した場合に淡黄土色、湿潤
で光沢のあるコロニーを形成する。細胞のサイズは０．
４μｍ×１．６μｍの直桿菌であり、グラム染色陰性、
運動性あり、極性鞭毛、ウレアーゼテスト陽性、カタラ
ーゼテスト陽性、オキシダーゼテスト陽性、クエン酸利
用テスト陽性、澱粉加水分解テスト陰性、グルコース酸
化能（ＯＦ−テスト）陽性、キノン系はＱ−９、黄色色
素産生なし、水溶性色素産生なし、蛍光色素産生なし、
アルギニン加水分解酵素テスト陰性、フォーゲス−プロ
スカウエルテスト（ＶＰテスト）陰性、硝酸還元テスト
陰性、メチルレッドテスト陰性、Ｄ−グルコース、Ｄ−
マニトール、Ｄ−マンノース、エタノール、スクロース
より好気条件下に酸を生成しない、３７℃、４０℃、４
２℃で生育し、４５℃で生育しない、５％食塩存在下に
生育し、１０％食塩存在下に生育しない、好気条件下に
Ｄ−グルコース、Ｄ−マニトール、Ｄ−マンノース、酢
酸を資化し、スクロースを資化しない。尚、本菌株は工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３
７８８として寄託されている。
【０００９】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＵ−２
２の培養液より酵素剤を得る方法は公知の方法をそのま
ま、または一部修正して用いることができる。これらペ
プチダーゼの生産に適する培地としては、グルコース、
脱脂大豆、食塩を含有する培地が有効である。培養温度
３０℃で２日間程度の培養により著量のプロリルエンド
ペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼが培地
中に生産される。酵素の収量を増大させるために、超音
波による菌体破砕または浸透圧ショック等を行うことも
有効である。菌体または菌体残渣を除去した後、たとえ
ば硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行う
ことによりそれぞれの酵素が精製できるが、蛋白質の加
水分解を行う場合には培養液や菌体破砕液をそのまま、
または粗精製程度で充分である。
２の培養液より酵素剤を得る方法は公知の方法をそのま
ま、または一部修正して用いることができる。これらペ
プチダーゼの生産に適する培地としては、グルコース、
脱脂大豆、食塩を含有する培地が有効である。培養温度
３０℃で２日間程度の培養により著量のプロリルエンド
ペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼが培地
中に生産される。酵素の収量を増大させるために、超音
波による菌体破砕または浸透圧ショック等を行うことも
有効である。菌体または菌体残渣を除去した後、たとえ
ば硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行う
ことによりそれぞれの酵素が精製できるが、蛋白質の加
水分解を行う場合には培養液や菌体破砕液をそのまま、
または粗精製程度で充分である。
【００１０】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏ
ｐｈａｅｕｓ ＨＡ−３６株はスターチ・無機塩寒天培
地で３０℃で培養することにより、よく分岐した基菌糸
からｓｔｒａｉｇｈｔ〜ｆｌｅｘｕｒｕｓの気菌糸を伸
長し、成熟した気菌糸の先に１０〜５０個の楕円〜円筒
形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子嚢は無く、胞
子の大きさは０．７〜１．０×１．０〜１．５μｍで、
胞子表面はｓｍｏｏｔｈであり、鞭毛は認められない。
本菌株の細胞壁の糖成分には特に特徴は認められず、細
胞壁成分のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。尚、本
菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１３８２７として寄託されている。
ｐｈａｅｕｓ ＨＡ−３６株はスターチ・無機塩寒天培
地で３０℃で培養することにより、よく分岐した基菌糸
からｓｔｒａｉｇｈｔ〜ｆｌｅｘｕｒｕｓの気菌糸を伸
長し、成熟した気菌糸の先に１０〜５０個の楕円〜円筒
形の胞子からなる胞子鎖を形成する。胞子嚢は無く、胞
子の大きさは０．７〜１．０×１．０〜１．５μｍで、
胞子表面はｓｍｏｏｔｈであり、鞭毛は認められない。
本菌株の細胞壁の糖成分には特に特徴は認められず、細
胞壁成分のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。尚、本
菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１３８２７として寄託されている。
【００１１】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏ
ｐｈａｅｕｓ ＨＡ−３６株の培養液より酵素剤を得る
方法は、公知の方法をそのまま、または一部修正して用
いることができる。ペプチダーゼの生産に適する培地と
しては、グルコース、澱粉、乾燥酵母、食塩を含有する
培地が有効である。培養温度３０℃で４日間程度培養す
ることにより著量のプロリルエンドペプチダーセ、プロ
リダーゼおよびプロリナーゼが培地中に生産される。菌
体および不溶性成分を除去した後、たとえば硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行うことによりそ
れぞれの酵素が精製できるが、蛋白質の加水分解を行う
場合には培養液をそのまま、または粗精製程度で充分で
ある。尚、既知のプロリルエンドペプチダーゼは通常高
分子の基質に対しては全く作用しないが、本微生物が生
産するプロリルエンドペプチダーゼは高分子基質である
カゼインに対しても加水分解活性を示すことが特徴であ
る。
ｐｈａｅｕｓ ＨＡ−３６株の培養液より酵素剤を得る
方法は、公知の方法をそのまま、または一部修正して用
いることができる。ペプチダーゼの生産に適する培地と
しては、グルコース、澱粉、乾燥酵母、食塩を含有する
培地が有効である。培養温度３０℃で４日間程度培養す
ることにより著量のプロリルエンドペプチダーセ、プロ
リダーゼおよびプロリナーゼが培地中に生産される。菌
体および不溶性成分を除去した後、たとえば硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行うことによりそ
れぞれの酵素が精製できるが、蛋白質の加水分解を行う
場合には培養液をそのまま、または粗精製程度で充分で
ある。尚、既知のプロリルエンドペプチダーゼは通常高
分子の基質に対しては全く作用しないが、本微生物が生
産するプロリルエンドペプチダーゼは高分子基質である
カゼインに対しても加水分解活性を示すことが特徴であ
る。
【００１２】蛋白質を加水分解する場合には、まず対象
となる蛋白質を通常の蛋白質加水分解酵素で低分子化し
ておくことが望ましい。用いる酵素としてはエンド型活
性の高いものが適している。市販の酵素としてはノボ社
のアルカラーゼやニュートラーゼ、天野製薬のプロテア
ーゼＮ等が利用できる。エンド型酵素による消化が終了
した後に残存する酵素はプロリルエンドペプチダーゼの
安定性に悪影響を及ぼす場合があるため、限外濾過等に
よる除去または加熱失活等を行っておくことが望まし
い。
となる蛋白質を通常の蛋白質加水分解酵素で低分子化し
ておくことが望ましい。用いる酵素としてはエンド型活
性の高いものが適している。市販の酵素としてはノボ社
のアルカラーゼやニュートラーゼ、天野製薬のプロテア
ーゼＮ等が利用できる。エンド型酵素による消化が終了
した後に残存する酵素はプロリルエンドペプチダーゼの
安定性に悪影響を及ぼす場合があるため、限外濾過等に
よる除去または加熱失活等を行っておくことが望まし
い。
【００１３】あらかじめエンド型酵素で処理した蛋白質
をプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプ
ロリナーゼを含む酵素剤で処理する場合には、同一微生
物の培養物や細胞破砕液をそのまま使用するか、または
これらより酵素を粗精製したものを用いることができ
る。反応は通常の酵素反応と同じく酵素が失活しない程
度の一定の温度で撹拌条件で行うことが望ましい。
をプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプ
ロリナーゼを含む酵素剤で処理する場合には、同一微生
物の培養物や細胞破砕液をそのまま使用するか、または
これらより酵素を粗精製したものを用いることができ
る。反応は通常の酵素反応と同じく酵素が失活しない程
度の一定の温度で撹拌条件で行うことが望ましい。
【００１４】加水分解の最終段階として、エキソ型活性
の高い酵素による加水分解を行ってもよい。エキソ型酵
素による加水分解に先立ち、プロリルエンドペプチダー
ゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼの除去または失活
処理を行うことは必ずしも必要ではない。反応液のｐＨ
を適宜調整した後、エキソ型活性の高い酵素を添加して
反応を行う。用いる酵素としては天野製薬のプロテアー
ゼＭ、プロテアーゼＡ、科研製薬のアクチナーゼ等の酵
素が利用可能であるが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の培
養液等を酵素剤の代わりに用いることも可能である。酵
素反応が終了した後、脱色、濃縮、殺菌等の処理を行
い、目的の加水分解蛋白質が調製される。
の高い酵素による加水分解を行ってもよい。エキソ型酵
素による加水分解に先立ち、プロリルエンドペプチダー
ゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼの除去または失活
処理を行うことは必ずしも必要ではない。反応液のｐＨ
を適宜調整した後、エキソ型活性の高い酵素を添加して
反応を行う。用いる酵素としては天野製薬のプロテアー
ゼＭ、プロテアーゼＡ、科研製薬のアクチナーゼ等の酵
素が利用可能であるが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒ
ｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の培
養液等を酵素剤の代わりに用いることも可能である。酵
素反応が終了した後、脱色、濃縮、殺菌等の処理を行
い、目的の加水分解蛋白質が調製される。
【００１５】本発明により得られる加水分解蛋白質は、
プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロ
リナーゼを含む酵素剤による加水分解工程を行わない場
合に比較してその加水分解率（アミノ酸の遊離率）が上
昇しており、中でもグルタミン酸、グリシン、プロリン
等の呈味性の高いアミノ酸の遊離率が特に上昇するた
め、食品用途、特に調味料としての利用価値がより高ま
ることが特徴である。
プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロ
リナーゼを含む酵素剤による加水分解工程を行わない場
合に比較してその加水分解率（アミノ酸の遊離率）が上
昇しており、中でもグルタミン酸、グリシン、プロリン
等の呈味性の高いアミノ酸の遊離率が特に上昇するた
め、食品用途、特に調味料としての利用価値がより高ま
ることが特徴である。
【００１６】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が
これらに限定されるものではない。
これらに限定されるものではない。
【００１７】
【００１８】
【実施例１】 １）ＫＵ−２２粗酵素液の調製 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＵ−２２株を２％グ
ルコース、２％脱脂大豆、０．３％食塩よりなる培地１
００ｍｌ（ｐＨ７．２）を含む５００ｍｌ容坂口フラス
コ６本に移植し、３０℃で４８時間振盪培養を行った。
培養液より遠心分離により（８、０００×ｇ、２０分）
菌体を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で２回洗浄後、菌体を超音波処理することにより粉
砕した。その後遠心分離（８、０００×ｇ、２０分）に
より細胞残渣を除去することにより無細胞抽出液２３３
ｍｌを得た。この無細胞抽出液を氷中で冷却撹拌しなが
ら９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、３
０分間氷中で撹拌させた後４℃で一夜放置した。沈澱物
をセライト濾過により回収し、氷冷した２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下緩衝液Ａと称する）
に溶解し、遠心分離（８、０００×ｇ、２０分）により
セライトを除去した。続いて緩衝液Ａに対して透析を行
い、粗酵素液を得た（以下ＫＵ−２２粗酵素液と称す
る）。
ルコース、２％脱脂大豆、０．３％食塩よりなる培地１
００ｍｌ（ｐＨ７．２）を含む５００ｍｌ容坂口フラス
コ６本に移植し、３０℃で４８時間振盪培養を行った。
培養液より遠心分離により（８、０００×ｇ、２０分）
菌体を集め、２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で２回洗浄後、菌体を超音波処理することにより粉
砕した。その後遠心分離（８、０００×ｇ、２０分）に
より細胞残渣を除去することにより無細胞抽出液２３３
ｍｌを得た。この無細胞抽出液を氷中で冷却撹拌しなが
ら９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、３
０分間氷中で撹拌させた後４℃で一夜放置した。沈澱物
をセライト濾過により回収し、氷冷した２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（以下緩衝液Ａと称する）
に溶解し、遠心分離（８、０００×ｇ、２０分）により
セライトを除去した。続いて緩衝液Ａに対して透析を行
い、粗酵素液を得た（以下ＫＵ−２２粗酵素液と称す
る）。
【００１９】プロリルエンドペプチダーゼ活性の測定は
以下の条件にて行った。即ち、１ｍＭ Ｚ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（４０％メタノールに溶解）２０
０μｌに５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
８００μｌを加え、３７℃で５分間予備保温した後、酵
素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）２００μｌ
を添加して３０分間反応させた。１Ｍの酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ３．５）を４００μｌ加えて反応を停止さ
せた。基質に１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）をあらかじ
め加えた後で酵素サンプルを添加したものをブランクと
して４１０ｎｍの吸光を測定し、反応により遊離したパ
ラニトリアニリンの量を求めた。尚、プロリルエンドペ
プチダーゼ１単位は１分間に１μｍｏｌのパラニトリア
ニリン相当量を遊離させるのに必要な酵素量と定義し
た。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリルエンドペプチダーゼ
の活性は０．１４単位／ｍｌであった。
以下の条件にて行った。即ち、１ｍＭ Ｚ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（４０％メタノールに溶解）２０
０μｌに５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
８００μｌを加え、３７℃で５分間予備保温した後、酵
素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）２００μｌ
を添加して３０分間反応させた。１Ｍの酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ３．５）を４００μｌ加えて反応を停止さ
せた。基質に１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）をあらかじ
め加えた後で酵素サンプルを添加したものをブランクと
して４１０ｎｍの吸光を測定し、反応により遊離したパ
ラニトリアニリンの量を求めた。尚、プロリルエンドペ
プチダーゼ１単位は１分間に１μｍｏｌのパラニトリア
ニリン相当量を遊離させるのに必要な酵素量と定義し
た。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリルエンドペプチダーゼ
の活性は０．１４単位／ｍｌであった。
【００２０】プロリダーゼ活性の測定は以下の条件で行
った。即ち、５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含む緩衝液Ａに
酵素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）１０μｌ
を加え、３７℃で３０分間反応させた。これに和光純薬
製ニンヒドリン液（アミノ酸自動分析装置用）４０μｌ
を加え、７０℃で２０分間加熱した後、蒸留水で１０倍
に希釈した。同時に、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ溶液にニンヒドリ
ン液を添加し、引き続き酵素サンプルを添加してニンヒ
ドリン反応させ、蒸留水で１０倍に希釈したものをブラ
ンクとした。それぞれの３５０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより、酵素反応により生じた３５０ｎｍの吸光度
の増加を求めた。一方、５ｍＭのＧｌｙ−Ｐｒｏ溶液
と、５ｍＭグリシンおよび５ｍＭプロリンを含む溶液を
適宜混合し、この混合液２００μｌに蒸留水１０μｌを
加え、上記と同様にニンヒドリン反応と蒸留水による希
釈を行ったものを各種準備し、これらの３５０ｎｍの吸
光度を測定して標準曲線を作成した。標準曲線より遊離
プロリンの濃度を求め、プロリダーゼにより生じたプロ
リン量を算出した。尚、プロリダーゼ１単位は１分間に
１μｍｏｌのプロリンを遊離させるのに必要な酵素量と
定義した。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリダーゼ活性は
０．６４単位／ｍｌであった。
った。即ち、５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含む緩衝液Ａに
酵素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）１０μｌ
を加え、３７℃で３０分間反応させた。これに和光純薬
製ニンヒドリン液（アミノ酸自動分析装置用）４０μｌ
を加え、７０℃で２０分間加熱した後、蒸留水で１０倍
に希釈した。同時に、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ溶液にニンヒドリ
ン液を添加し、引き続き酵素サンプルを添加してニンヒ
ドリン反応させ、蒸留水で１０倍に希釈したものをブラ
ンクとした。それぞれの３５０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより、酵素反応により生じた３５０ｎｍの吸光度
の増加を求めた。一方、５ｍＭのＧｌｙ−Ｐｒｏ溶液
と、５ｍＭグリシンおよび５ｍＭプロリンを含む溶液を
適宜混合し、この混合液２００μｌに蒸留水１０μｌを
加え、上記と同様にニンヒドリン反応と蒸留水による希
釈を行ったものを各種準備し、これらの３５０ｎｍの吸
光度を測定して標準曲線を作成した。標準曲線より遊離
プロリンの濃度を求め、プロリダーゼにより生じたプロ
リン量を算出した。尚、プロリダーゼ１単位は１分間に
１μｍｏｌのプロリンを遊離させるのに必要な酵素量と
定義した。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリダーゼ活性は
０．６４単位／ｍｌであった。
【００２１】プロリナーゼ活性の測定は以下の条件で行
った。即ち、５ｍＭ Ｐｒｏ−Ｇｌｙを含む緩衝液Ａに
酵素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）１０μｌ
を加え、３７℃で３０分間反応させた。これに和光純薬
製ニンヒドリン液（アミノ酸自動分析装置用）４０μｌ
を加え、７０℃で２０分間加熱した後、蒸留水で１０倍
に希釈した。同時に、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ溶液にニンヒドリ
ン液を添加し、引き続き酵素サンプルを添加してニンヒ
ドリン反応させ、蒸留水で１０倍に希釈したものをブラ
ンクとした。それぞれの３５０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより、酵素反応により生じた３５０ｎｍの吸光度
の増加を求めた。一方、５ｍＭのＰｒｏ−Ｇｌｙ溶液
と、５ｍＭグリシンおよび５ｍＭプロリンを含む溶液を
適宜混合し、この混合液２００μｌに蒸留水１０μｌを
加え、上記と同様にニンヒドリン反応と蒸留水による希
釈を行ったものを各種準備し、これらの３５０ｎｍの吸
光度を測定して標準曲線を作成した。標準曲線より遊離
プロリンの濃度を求め、プロリダーゼにより生じたプロ
リン量を算出した。尚、プロリナーゼ１単位は１分間に
１μｍｏｌのプロリンを遊離させるのに必要な酵素量と
定義した。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリナーゼ活性は
１．３単位／ｍｌであった。 ２）ＨＡ−３６粗酵素液の調製 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ
ＨＡ−３６株を１％グルコース、１％可溶性澱粉、２
％乾燥酵母、０．３％食塩よりなる培地１００ｍｌ（ｐ
Ｈ７．２）を含む５００ｍｌ容坂口フラスコ２０本に移
植し、３０℃で４日間振盪培養を行った。培養液を遠心
分離（８、０００×ｇ、２０分）することにより菌体を
除き、この液を氷中で冷却撹拌しながら８０％飽和とな
るように硫酸アンモニウムを加え、３０分間氷中で撹拌
させた後４℃で一夜放置した。沈澱物を遠心分離（８、
０００×ｇ、２０分）により回収し、氷冷した緩衝液Ａ
に溶解させた。続いて緩衝液Ａに対して透析を行い、粗
酵素液を得た（以下ＨＡ−３６粗酵素液と称する）。プ
ロリルエンドペプチダーゼ活性は０．０７３単位／ｍ
ｌ、プロリダーゼ活性は０．０３９単位／ｍｌ、プロリ
ナーゼ活性は０．０７０単位／ｍｌであった。 ３）蛋白質の調製とアルカラーゼ処理 ５リットル容高圧オートクレーブに豚骨３６００ｇと水
７２０ｇを仕込み、密封後に昇温を開始した。オートク
レーブの内圧が０．５ｋｇ／ｃｍ2 に達したらオートク
レーブ内のエア抜きを実施し、再度密封してオートクレ
ーブの内圧が５ｋｇ／ｃｍ2 になるまで加熱し、１時間
煮出しを行った。冷却後、オートクレーブ内の液を５リ
ットル容分液ロートに移し、上層の油を除いて下層の豚
骨抽出液２４００ｇを回収し、これをエバポレーターで
濃縮してＴ−Ｎ７．７％、Ｆ−Ｎ０．３９％の濃縮液４
５０ｇを得た。本濃縮液２１０ｇに水を７８０ｇを加え
て希釈後、１６％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを
８．０に調製した。この溶液にアルカラーゼ０．６Ｌ
（ノボ社製）を４ｇ添加し、５５℃で６時間反応させ
た。反応中のｐＨは１６％水酸化ナトリウム溶液で常時
８．０となるように調整した。反応終了液を分画分子量
６０００の限外濾過膜（旭化成社製ＳＩＰ−１０１３）
で濾過して酵素を除去した。本アルカラーゼ処理液はＴ
−Ｎ＝１．６３％、Ｆ−Ｎ＝０．２０４％であり、加水
分解率は１２．５％と算出された。 ４）粗酵素液およびプロテアーゼＭによる加水分解 ３本の試験管Ａ、Ｂ、Ｃに上記３）で得られたアルカラ
ーゼ処理液をそれぞれ１５ｍｌずつ分注した。試験管Ａ
には上記１）で得られたＫＵ−２２粗酵素液１．５ｍｌ
を、試験管Ｂには上記２）で得られたＨＡ−３６粗酵素
液１．５ｍｌを、また試験管Ｃには蒸留水１．５ｍｌを
添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、ｐ
Ｈをそれぞれ５．０に調整し、天野製薬製プロテアーゼ
Ｍをそれぞれ０．２ｇずつ添加し、５０℃で２４時間反
応させた。反応終了液をそれぞれサンプルＡ、Ｂ、Ｃと
称し、ケルダール窒素（Ｔ−Ｎ）およびホルモール窒素
（Ｆ−Ｎ）の分析を行った。表１に結果を示した通り、
サンプルＡおよびＢではコントロールであるサンプルＣ
に比べて加水分解率が約１０％高くなっていた。
った。即ち、５ｍＭ Ｐｒｏ−Ｇｌｙを含む緩衝液Ａに
酵素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）１０μｌ
を加え、３７℃で３０分間反応させた。これに和光純薬
製ニンヒドリン液（アミノ酸自動分析装置用）４０μｌ
を加え、７０℃で２０分間加熱した後、蒸留水で１０倍
に希釈した。同時に、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ溶液にニンヒドリ
ン液を添加し、引き続き酵素サンプルを添加してニンヒ
ドリン反応させ、蒸留水で１０倍に希釈したものをブラ
ンクとした。それぞれの３５０ｎｍの吸光度を測定する
ことにより、酵素反応により生じた３５０ｎｍの吸光度
の増加を求めた。一方、５ｍＭのＰｒｏ−Ｇｌｙ溶液
と、５ｍＭグリシンおよび５ｍＭプロリンを含む溶液を
適宜混合し、この混合液２００μｌに蒸留水１０μｌを
加え、上記と同様にニンヒドリン反応と蒸留水による希
釈を行ったものを各種準備し、これらの３５０ｎｍの吸
光度を測定して標準曲線を作成した。標準曲線より遊離
プロリンの濃度を求め、プロリダーゼにより生じたプロ
リン量を算出した。尚、プロリナーゼ１単位は１分間に
１μｍｏｌのプロリンを遊離させるのに必要な酵素量と
定義した。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリナーゼ活性は
１．３単位／ｍｌであった。 ２）ＨＡ−３６粗酵素液の調製 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ
ＨＡ−３６株を１％グルコース、１％可溶性澱粉、２
％乾燥酵母、０．３％食塩よりなる培地１００ｍｌ（ｐ
Ｈ７．２）を含む５００ｍｌ容坂口フラスコ２０本に移
植し、３０℃で４日間振盪培養を行った。培養液を遠心
分離（８、０００×ｇ、２０分）することにより菌体を
除き、この液を氷中で冷却撹拌しながら８０％飽和とな
るように硫酸アンモニウムを加え、３０分間氷中で撹拌
させた後４℃で一夜放置した。沈澱物を遠心分離（８、
０００×ｇ、２０分）により回収し、氷冷した緩衝液Ａ
に溶解させた。続いて緩衝液Ａに対して透析を行い、粗
酵素液を得た（以下ＨＡ−３６粗酵素液と称する）。プ
ロリルエンドペプチダーゼ活性は０．０７３単位／ｍ
ｌ、プロリダーゼ活性は０．０３９単位／ｍｌ、プロリ
ナーゼ活性は０．０７０単位／ｍｌであった。 ３）蛋白質の調製とアルカラーゼ処理 ５リットル容高圧オートクレーブに豚骨３６００ｇと水
７２０ｇを仕込み、密封後に昇温を開始した。オートク
レーブの内圧が０．５ｋｇ／ｃｍ2 に達したらオートク
レーブ内のエア抜きを実施し、再度密封してオートクレ
ーブの内圧が５ｋｇ／ｃｍ2 になるまで加熱し、１時間
煮出しを行った。冷却後、オートクレーブ内の液を５リ
ットル容分液ロートに移し、上層の油を除いて下層の豚
骨抽出液２４００ｇを回収し、これをエバポレーターで
濃縮してＴ−Ｎ７．７％、Ｆ−Ｎ０．３９％の濃縮液４
５０ｇを得た。本濃縮液２１０ｇに水を７８０ｇを加え
て希釈後、１６％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを
８．０に調製した。この溶液にアルカラーゼ０．６Ｌ
（ノボ社製）を４ｇ添加し、５５℃で６時間反応させ
た。反応中のｐＨは１６％水酸化ナトリウム溶液で常時
８．０となるように調整した。反応終了液を分画分子量
６０００の限外濾過膜（旭化成社製ＳＩＰ−１０１３）
で濾過して酵素を除去した。本アルカラーゼ処理液はＴ
−Ｎ＝１．６３％、Ｆ−Ｎ＝０．２０４％であり、加水
分解率は１２．５％と算出された。 ４）粗酵素液およびプロテアーゼＭによる加水分解 ３本の試験管Ａ、Ｂ、Ｃに上記３）で得られたアルカラ
ーゼ処理液をそれぞれ１５ｍｌずつ分注した。試験管Ａ
には上記１）で得られたＫＵ−２２粗酵素液１．５ｍｌ
を、試験管Ｂには上記２）で得られたＨＡ−３６粗酵素
液１．５ｍｌを、また試験管Ｃには蒸留水１．５ｍｌを
添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、ｐ
Ｈをそれぞれ５．０に調整し、天野製薬製プロテアーゼ
Ｍをそれぞれ０．２ｇずつ添加し、５０℃で２４時間反
応させた。反応終了液をそれぞれサンプルＡ、Ｂ、Ｃと
称し、ケルダール窒素（Ｔ−Ｎ）およびホルモール窒素
（Ｆ−Ｎ）の分析を行った。表１に結果を示した通り、
サンプルＡおよびＢではコントロールであるサンプルＣ
に比べて加水分解率が約１０％高くなっていた。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【実施例２】 １）ＫＵ−２２粗酵素液の調製 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＫＵ−２２株を２％グ
ルコース、２％脱脂大豆、０．３％食塩よりなる培地５
００ｍｌ（ｐＨ７．２）を含む５リットル容フラスコ２
本に移植し、３０℃で４８時間振盪培養を行った。培養
液より遠心分離により（８、０００×ｇ、２０分）菌体
を集め、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で３回洗浄後、５０ｍＭ トリス−塩酸＋１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）＋０．５Ｍ スクロースの緩衝液中
に懸濁した。３０℃で３０分間保温した後菌体を集め
（８、０００×ｇ、２０分）、これに５０ｍＭ トリス
−塩酸＋１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液を加えて懸濁し、３
０℃で３０分間保温することにより浸透圧ショックを施
した。遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）により菌
体を除去し、上澄液を旭化成社製限外濾過モジュールＡ
ＩＰ−００１３で濾過することにより酵素を濃縮し、１
ｍＭの塩化マンガンを含む緩衝液Ａに対して透析を行っ
た結果、プロリルエンドペプチダーゼ活性が０．３８単
位／ｍｌ、プロリダーゼ活性が１．７単位／ｍｌ、プロ
リナーゼ活性が３．２単位／ｍｌの酵素液約４０ｍｌを
得た。 ２）蛋白質の調製とアルカラーゼ処理 前記実施例３の３）と同様の方法を用いて豚骨からの蛋
白質の調製とアルカラーゼ処理を行い、Ｔ−Ｎ＝１．６
％、Ｆ−Ｎ＝０．１４％のアルカラーゼ処理液を得た。 ３）粗酵素液およびプロテアーゼＭによる加水分解 ５００ｍｌ容三角フラスコに上記２）で得られたアルカ
ラーゼ処理液２００ｍｌと上記１）で得られた粗酵素液
３０ｍｌを加え、マグネチックスターラーで撹拌しなが
ら３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、塩酸を加
えてｐＨを５．０に調製し、旭化成社製限外濾過モジュ
ールＡＩＰ−００１３で濾過することにより酵素を除去
した。この液に天野製薬のプロテアーゼＭを５ｇ添加
し、スターラーで撹拌しながら５０℃で３０時間反応さ
せた（サンプルＤ）。一方、粗酵素液の代わりに蒸留水
を添加する以外全く同様に処理したものをコントロール
サンプル（サンプルＥ）とした。サンプルＤ、Ｅにつき
Ｔ−ＮとＦ−Ｎの測定を行った結果（表２）サンプルＥ
の分解率が２６％であったのに対しサンプルＤでは４０
％と高くなっていた。
ルコース、２％脱脂大豆、０．３％食塩よりなる培地５
００ｍｌ（ｐＨ７．２）を含む５リットル容フラスコ２
本に移植し、３０℃で４８時間振盪培養を行った。培養
液より遠心分離により（８、０００×ｇ、２０分）菌体
を集め、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で３回洗浄後、５０ｍＭ トリス−塩酸＋１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）＋０．５Ｍ スクロースの緩衝液中
に懸濁した。３０℃で３０分間保温した後菌体を集め
（８、０００×ｇ、２０分）、これに５０ｍＭ トリス
−塩酸＋１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液を加えて懸濁し、３
０℃で３０分間保温することにより浸透圧ショックを施
した。遠心分離（１０、０００×ｇ、２０分）により菌
体を除去し、上澄液を旭化成社製限外濾過モジュールＡ
ＩＰ−００１３で濾過することにより酵素を濃縮し、１
ｍＭの塩化マンガンを含む緩衝液Ａに対して透析を行っ
た結果、プロリルエンドペプチダーゼ活性が０．３８単
位／ｍｌ、プロリダーゼ活性が１．７単位／ｍｌ、プロ
リナーゼ活性が３．２単位／ｍｌの酵素液約４０ｍｌを
得た。 ２）蛋白質の調製とアルカラーゼ処理 前記実施例３の３）と同様の方法を用いて豚骨からの蛋
白質の調製とアルカラーゼ処理を行い、Ｔ−Ｎ＝１．６
％、Ｆ−Ｎ＝０．１４％のアルカラーゼ処理液を得た。 ３）粗酵素液およびプロテアーゼＭによる加水分解 ５００ｍｌ容三角フラスコに上記２）で得られたアルカ
ラーゼ処理液２００ｍｌと上記１）で得られた粗酵素液
３０ｍｌを加え、マグネチックスターラーで撹拌しなが
ら３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、塩酸を加
えてｐＨを５．０に調製し、旭化成社製限外濾過モジュ
ールＡＩＰ−００１３で濾過することにより酵素を除去
した。この液に天野製薬のプロテアーゼＭを５ｇ添加
し、スターラーで撹拌しながら５０℃で３０時間反応さ
せた（サンプルＤ）。一方、粗酵素液の代わりに蒸留水
を添加する以外全く同様に処理したものをコントロール
サンプル（サンプルＥ）とした。サンプルＤ、Ｅにつき
Ｔ−ＮとＦ−Ｎの測定を行った結果（表２）サンプルＥ
の分解率が２６％であったのに対しサンプルＤでは４０
％と高くなっていた。
【００２４】
【表２】
【００２５】サンプルＤおよびＥにつき、アミノ酸分析
を行った。全アミノ酸を測定する場合にはサンプルを６
Ｎの塩酸存在下、１２０℃で１８時間加水分解した後、
遊離アミノ酸を測定する場合にはそのまま、日本電子社
製ＪＬＣ−３００アミノ酸分析装置にて分析した。その
結果を表７に示したが、サンプルＤはサンプルＥに比べ
てアスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、プロリ
ン、グリシン等の呈味性アミノ酸の遊離率が大幅に高ま
っており、苦みを呈する疎水性アミノ酸の遊離率はあま
り増加していないことが確認された。
を行った。全アミノ酸を測定する場合にはサンプルを６
Ｎの塩酸存在下、１２０℃で１８時間加水分解した後、
遊離アミノ酸を測定する場合にはそのまま、日本電子社
製ＪＬＣ−３００アミノ酸分析装置にて分析した。その
結果を表７に示したが、サンプルＤはサンプルＥに比べ
てアスパラギン酸、スレオニン、グルタミン酸、プロリ
ン、グリシン等の呈味性アミノ酸の遊離率が大幅に高ま
っており、苦みを呈する疎水性アミノ酸の遊離率はあま
り増加していないことが確認された。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【発明の効果】蛋白質の加水分解にプロリルエンドペプ
チダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼを含む酵素
剤による処理とエキソペプチダーゼによる処理とを組み
合わせることにより加水分解率が向上し、さらに呈味性
に優れたアミノ酸の遊離率が向上することから、食品、
特に調味料用途の蛋白質の加水分解に効果的に利用でき
る。
チダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼを含む酵素
剤による処理とエキソペプチダーゼによる処理とを組み
合わせることにより加水分解率が向上し、さらに呈味性
に優れたアミノ酸の遊離率が向上することから、食品、
特に調味料用途の蛋白質の加水分解に効果的に利用でき
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (5)
- 【請求項１】 同一微生物由来のプロリルエンドペプチ
ダ−ゼ、プロリダ−ゼおよびプロリナ−ゼを含有するこ
とを特徴とする酵素剤。 - 【請求項２】 微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌
である請求項１記載の酵素剤。 - 【請求項３】 微生物がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細
菌である請求項１記載の酵素剤。 - 【請求項４】 食品蛋白質、食品蛋白質の部分消化物、
および食品蛋白質由来のペプチドを、請求項１乃至請求
項３記載の酵素剤で消化することを特徴とする加水分解
蛋白質の製造方法。 - 【請求項５】 エキソペプチダーゼ活性を有する酵素に
よる消化を組み合わせることを特徴とする請求項４記載
の加水分解蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5266467A JPH07115969A (ja) | 1993-10-25 | 1993-10-25 | 加水分解蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5266467A JPH07115969A (ja) | 1993-10-25 | 1993-10-25 | 加水分解蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07115969A true JPH07115969A (ja) | 1995-05-09 |
Family
ID=17431339
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5266467A Pending JPH07115969A (ja) | 1993-10-25 | 1993-10-25 | 加水分解蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07115969A (ja) |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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