JP2009165484A - 飲料中の濁りを防止または減少する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プロリル特異的エンドプロテアーゼの添加によって飲料中の濁りを防止または減少する方法、及び得られうる新しい飲料。新しいエンドプロテアーゼ、ゲノムDNA、cDNAの配列情報ならびに蛋白質配列。
【選択図】なし
Description
本願発明は、エンドプロテアーゼの添加によって飲料中の濁りを防止または減少する方法、及び本願発明に従う方法によって得られうる新しい飲料に関する。本願発明はまた、新しいエンドプロテアーゼに関する。
濁りは飲料業界で周知の現象である。濁りは、例えばビール、ワイン及びフルーツジュース中に存在しうる。濁り形成は、醸造工程の間に種々の過程で起こりうる。T. Nagodawithana及びG. Reedによって編集された「Enzymes in food processing」、第3版、アカデミック出版、サンディエゴ、第V章、第448〜449頁では、ビール中の濁りはビール蛋白質とポリフェノール性プロシアニジンンとの間の相互作用の結果であることが提案されている。ビールでは濁りが、ビールの冷却に応じてしばしば形成されることが説明されている。ビールは発酵されて、そしてその後しばしば冷却された条件下で熟成される。清澄を達成するために、ビールは冷えた間にしばしはろ過される。濾過にもかかわらず、ビールは、それが梱包されて顧客に流通され、そして給仕される前に再び冷やされた後にしばしば濁ったようになる。ビールが冷やされない又はもはや冷やされない場合であっても、やがては濁りがビール中に形成され、そして沈殿物が現れうる。濁り形成は、濁り形成によって生じた曇りが微生物損傷によって生成した曇り(それは特にブライト(bright)ビールにおいて望ましくない)と似ている故に望ましくない。
濁りの防止または減少のための全ての知られた技術は欠点を有する故に、飲料中の濁りの防止または減少をするための新しい方法の必要性がまだある。
驚くべきことに、この目的は、プロリル特異的エンドプロテアーゼが飲料中に添加されるところの飲料中の濁りを防止または減少する方法を提供することによって達成されることがわかった。
(a)配列ID No.4、配列ID No.5若しくは配列ID No.7、またはそれらのフラグメントと少なくとも40%の全長アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
(b)(i)配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6の核酸配列、または60、好ましくは100のヌクレオチドにわたって少なくとも80%あるいは90%同一である、より好ましくは200のヌクレオチドにわたって少なくとも90%同一であるそれらのフラグメントと、あるいは(ii)(i)の核酸配列と相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと
から成る群から選択されるプロリル特異的エンドプロテアーゼを有するところの単離されたポリペプチドをさらに提供する。
実験室規模精製は、24ml Q−セファロースFFカラム(ベッド高さ12cm/直径1.6cm)上にAkta Explorerを使用し行われた。10ml UF濃縮物が、バッファーA中に10倍希釈され、そしてカラムに適用された。蛋白質は、グラジエント(20CVで0〜50%B)で溶出された。バッファーAは、20mM NaAc、pH5.1であった。バッファーBは、20mM NaAc+1M NaCl pH5.1であった。流速は、5ml/分であった。
精製は、500ml Q−セファロースFFカラム(ベッド高さ 23.5cm/直径5cm)上にAkta purifierを使用し、作業指示書W−0894.Aに従い行われた。200ml UF濃縮物がバッファーA中に10倍希釈され、そしてカラムに適用された。蛋白質は、グラジエント(20CVで0〜40%B)で溶出された。バッファーAは、20mM NaAc、pH5.1であった。バッファーBは、20mM NaAc+1M NaCl pH5.1であった。流速は、10ml/分であった。フラクションは、手動で集められた。
本願発明のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAを含みうる。それらは、一又は二本鎖でありうる。それらは、その中に、ペプチド核酸を含む、合成の又は修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでまたありうる。ポリヌクレオチドに対する修飾の多くの種々の型が、当業者に知られている。これらは、メチルホスホナート及びホスホロチオエート骨格、及び分子の3及び/又は5末端でアクリジン又はポリリシン鎖の付加を含む。本願発明の目的のために、本明細書中で記載されたポリヌクレオチドは、当業者に利用可能な任意の方法によって修飾されうることが理解されるべきである。
配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6のDNAコード配列の補体に選択的にハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチド配列は本願発明に含まれ、且つ配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6の少なくとも60、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも200連続ヌクレオチドの領域にわたって又は最も好ましくは全長にわたって、配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6のコード配列に少なくとも50%又は60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%配列同一性を一般に有する。同様に、活性プロリル特異的エンドプロテアーゼをコードし且つ配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6のDNAコード配列の補体のフラグメントに選択的にハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチドは、本願発明によってまた包含される。60、好ましくは100のヌクレオチドにわたって少なくとも80%あるいは90%同一である、より好ましくは200のヌクレオチドにわたって少なくとも90%同一である、配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6の核酸配列のC−末端フラグメントは、本願発明によって包含される。
本願発明のポリヌクレオチドは、プライマー又はプローブを含み且つプライマー(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして、代替の増幅反応のプライマーとして)、又は例えば放射活性若しくは非放射活性ラベルを使用し慣用手段によって露出ラベルでラベルされたプローブとして使用されうり、又は該ポリヌクレオチドは、ベクター内にクローニングされうる。そのようなプライマー、プローブ及び他のフラグメントは、少なくとも15例えば少なくとも20、25、30又は40ヌクレオチド長である。それらは、典型的に40、50、60、70、100、150、200又は300ヌクレオチド長まで、又は配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6のコード配列以外はなお少数のヌクレオチド(例えば5若しくは10ヌクレオチド)まである
配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6と100%同一性を有しないが本願発明の範囲内であるポリヌクレオチドは、多くの方法で得られうる。従って、本明細書中で記載されたプロリル特異的エンドプロテアーゼ配列の変種は、生物体例えば本願発明のポリペプチドの起源として記載されたそれらの範囲から作成されたゲノムDNAライブラリーをプローブすることによって例えば得られうる。さらに、他のかびの、植物又は原核相同体のプロリル特異的エンドプロテアーゼが得られうり、且つそのようなそれらの相同体及びフラグメントは、配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6に一般にハイブリダイズすることが可能である。そのような配列は、他の種からcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーをプローブし、そして低い、中程度、高いストリジェンシーの条件下(先に記載したように)で配列ID No.1の全て又は部分を含むプローブでそのようなライブラリーをプローブすることによって得られうる。配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6の全て又は部分を含む核酸プローブは、他の種、例えば本願発明のポリペプチドの起源として記載されたそれらからのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブするために使用されうる。
本願発明は、クローニング及び発現ベクターを含む、本願発明のポリヌクレオチドを含むベクター、及び他の観点において、そのようなベクターを適切な宿主細胞例えば本願発明のポリヌクレオチドの発現又は本願発明の配列によってコードされたポリヌクレオチドの発現が起こるところの条件下で成長し、形質転換し又はトランスフェクションする方法をまた提供する。ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノムに対して異種であるところの本願発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞がまた提供される。用語「異種」は、宿主細胞に関して、ポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム内で天然に生じない又はポリヌクレオチドがその細胞によって天然に生産されることを通常意味する。好ましくは、宿主細胞は、例えばクルイベロミセス(Kluyveromyces)属若しくはサッカロミセス(Saccharomyces)属酵母細胞、又は例えばアスペルギルス(Aspergillus)属の糸状菌細胞である。
本願発明の発現カセットが挿入されるところのベクターは、組み換えDNA手続きに慣用的にさらされうる任意のベクターでありうり、かつ該ベクターの選択は、それが導入されるべきところの宿主細胞にしばしば依存する。従って、該ベクターは自発的に複製ベクターすなわち余分の染色体エンティティとして存在するところのベクターでありうり、それの複製は、染色体複製例えばプラスミドとして独立している。あるいは、宿主細胞内に導入される場合、該ベクターは、宿主細胞ゲノム内に一体化され且つそれが一体化されるところのクロモゾームととともに複製するところの1つでありうる。
さらなる観点において、本願発明は、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによって発現するための適切な条件下で、上記で記載されたように発現ベクターとともに、形質転換された又はトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、そして該発現されたポリペプチドを回収することを含む本願発明のポリペプチドを調製するための工程を提供する。本願発明のポリヌクレオチドは、組み換え再生可能なベクター例えば発現ベクター内に組み入れられうる。該ベクターは、互換可能な宿主細胞内に核酸を複製するために使用されうる。従って、さらなる実施態様では、本願発明は、本願発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター内に導入し、該ベクターを互換可能な宿主細胞内に導入し、そして該ベクターの複製を生じるところの条件下で該宿主細胞を培養することによって、本願発明のポリヌクレオチドを作成するための方法を提供する。該ベクターは、宿主細胞から回収されうる。適切な宿主細胞は、細菌例えば大腸菌、酵母、哺乳類の細胞株、及び他の真核細胞株例えばSf9細胞のような昆虫細胞、及び(例えば糸状性)かびの細胞を含む。
本願発明は、プロリル特異的エンドプロテアーゼを発現するために修飾される細胞又はそれらの変種をまた含む。そのような細胞は、一時の又は好ましくは安定に修飾されたより高い真核細胞系列例えば哺乳類の細胞又は昆虫細胞、より低い真核細胞例えば酵母及び糸状菌の細胞、または原核細胞例えば細菌の細胞を含む。
本願発明のポリペプチドは、化学的に修飾、例えばポスト翻訳的に修飾されうる。例えば、それらは、グリコシル化され(1又はそれ以上の回数)又は修飾されたアミノ残基を含みうる。それらは、それらの精製を助けるためにヒスチジン残基の添加によって、又は細胞からの分泌を促進するためにシグナル配列の添加によってまた修飾されうる。ポリペプチドは、アミノ−又はカロボキシル−末端伸長例えばアミノ末端のメチオニン残基、約20−25残基までの小さいリンカーペプチド、又は精製を促進する小さい伸長例えばポリ−ヒスチジン・トラクト、抗原性エピトープ若しくは束縛領域を有しうる。
本願発明のポリペプチドは、単離された形でありうる。ポリペプチドは、ポリペプチドの意図される目的に干渉せず且つ単離されたとなお見なされるキャリヤー又は希釈剤と混合されうると理解される。本願発明のポリペプチドは、実質的に精製された形でまたありうり、その場合、本願発明のポリペプチドである調製物内で蛋白質の70%より上、80%、90%、95%、98%又は99%より上での調製品内のポリペプチドを一般に含む。
材料
プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素(エンドプロテアーゼ)
Aspergillus niger G306が、2001年9月10日にCBS(CBS109712)に預託された。A. niger G306は、本願発明に従うプロリル特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子を含む。この微生物から得られる遺伝子又はcDNAは、公知の方法を使用し、任意のAspergillus niger宿主細胞内でクローニングされそして発現されうる。
1)「エンドプロテアーゼA」、プロリル特異的エンドプロテアーゼが、ビールの実験で使用された。該試料は、プロリル特異的エンドプロテアーゼコードする遺伝子を含むAspergillus niger株の発酵後に得られる発酵培養液の限外濾過後に得られる限外濾過濃縮物であった。該エンドプロテアーゼAサンプルのプロリル特異的活性は、下記方法の項で記載されるように決定され、5.06U/mlであった。蛋白質濃縮物は、90%よりも高い純度でプロリル特異的エンドプロテアーゼのサンプルの特異的活性に基づいて、50g/lであると測定された。
2)「エンドプロテアーゼB」、プロリル特異的エンドプロテアーゼが、ワインの実験で使用された。該試料は、カラム上に精製後に得られ且つ6.0U/mlの活性を有した。
コルプリン(collupulin)(DSM(フランス)から入手可能な液体パパイン調整品)が、パパインの実験のために使用された。該活性は、5280 NF/mgである。1ユニットNFは、pH6.0で1時間あたり溶性のチロシンの1マイクログラム当量を生産するためにカゼインの加水分解を触媒するパパイン活性の量である。該パパイン試料の該ロテイン濃が測定され、それは、119g/l(ローリー法)である。
使用されるPVPPは、「Polyclar AT」という名で商業的に入手可能な非水溶性PVPPであった。
「Les Trosi Brasseus」(リール、フランス)からのモルトビール(ピルスナー タイプ)が、ビールで行われる全ての実験に使用された。このビールのアルコールパーセントは5.2%(容量/容量)であり、且つpHは4.4であった。この特定のビールは、他の商業的に利用可能なビールと比較して、冷やすことでこのビール内に測定できる比較的高い量の濁りの故に選択された。該ビールは、ローリー方法によって測定された場合、0.9g/lの蛋白質濃度を有した。
白ソービニョン(Sauvignon)葡萄から調製された白ワインは、いかなる蛋白質除去の処理なしに使用された。ワイン調製の間のアルコール発酵は、ラレマンド(Lallemand)からの選択された酵母VL3で行われた。ワインのオエノロジック(oenologic)は、次の結果を与えた。
プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性を決定するための分光学的方法
基質溶液は、40%ジオキサンを含む0.1Mクエン酸/0.2Mリン酸二ナトリウムバッファーpH5.0中で作成されたN−カルボベンゾイル−グリシン−プロリン−p−ニトロアニリド(Z−Gly−Pro−pNA;分子量426.43;Bachem社)の2mM溶液である。
濁りの濁度は、Pfeuffer Gmbh(キッチンゲン、ドイツ)からのタンノメーター(Tannometer)と呼ばれる濁度計で、Pfeufferからの操作指示書に沿って測定された。非常に冷やされた下で、ビールは、沈殿したポリフェノール−蛋白質複合体によって生じる可逆の濁度を示す。アルコールの添加は該複合体の溶解性を減少し、従って濁度の形成を加速する。タンノメーターを校正するために、ホルマジン(formazine)標準溶液が、Jean de Clerk、「Cours de Brasseries」、第2版、(第595〜596頁)、ルーバン大学、ベルギーによって記載されたように調製された。標準は、ユニットEBCでの濁度であった。ビールは、濾紙を介して濾過することによって除炭酸された。冷え濁りテストを実行する直前に、エタノールが、6%(容量/容量)にアルコール含量を増加するために足りる量でサンプルに添加された。冷え濁りテストは、30分間、8℃以下まで、各サンプルを冷やすことによって行われた。形成された濁り(濁度、ユニットEBCで)は、測定チェンバーが8℃以下でまた維持されたところの濁度計で直ちに測定された。
K. J. Siebert(K. J. Siebertら、J. Agric. Food Chem. 第44巻、(1996年))によって記載されるように、ワイン又はフルーツジュースのような飲料中の濁りが、加熱試験によって誘導されうる。形成される濁りの量は主に、飲料中の濁り活性蛋白質及びポリフェノールのレベルの作用である。加熱試験では、(例えばワイン又はフルーツジュースの)サンプルの濁度は、30分間、80℃で加熱前又は後に濁度計で測定される。濁度を測定する前に、加熱されたサンプルは、22〜25℃の温度に達するまで冷水かで冷却される。ワイン試験では(実施例3を参照)、濁度計の校正は、NTU−ホルマジン(formazine)標準溶液でおこなわれ、フルーツジュース試験(実施例5を参照)のために、NTU濁度標準溶液が、Reagecon社(アイルランド)から購入された。NTU=ネフェロ濁度ユニット。
(i)外因性でない蛋白質が培養の間に添加されたところのブランク試験がおこなわれた。
(ii)培養前に大量のPVPP(1000g/hl)で処理されたビールが使用されたところの実験がおこなわれた。PVPPがビールからポリフェノールを除去し、従って濁りの形成を妨げる故に、この実験は、ポリフェノール−蛋白質沈殿物によるところの冷え濁り試験によって誘導された濁りの平均量の決定を可能にする。
(iii)外因性蛋白質(プロリル特異的エンドプロテアーゼ又はパパイン、それぞれ)が、40℃で、1時間で培養後に、0℃まで冷却されたビールに添加されたところの実験がおこなわれた。0℃での培養は、濁り測定の前に15分間の間行われた。酵素及びパパインは0℃で活性でない又はほとんど活性でない故に、これらの実験は、酵素活性効果と非酵素的蛋白質効果との間で識別を可能にした。
実施例1.ビール中の濁り形成に対するプロリル特異的エンドプロテアーゼの添加の効果
除炭酸されたモルトビール(Les Trois Brasseurs)に対する、蛋白質含量:0.9g/l、プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素(「エンドプロテアーゼA」、物質の項参照)の様々な量が添加された。濁り測定の2組が実行された。第1組では、ビール−エンドプロテアーゼA組成物は、冷え濁り試験の前に40℃で、1時間培養された。40℃で培養後、冷え濁り試験の直前に、エタノールが6%(容量/容量)にアルコール含量を増加するために足りる量でビール−エンドプロテアーゼA組成物に添加された。第2組は、エンドプロテアーゼAのないビールは、40℃で、1時間培養され、そしてその後0℃まで冷却された。0℃で、エンドプロテアーゼAが添加され、そして結果として生じる組成物は0℃で、15分間培養された。冷え濁り試験の直前に、エタノールが6%(容量/容量)にアルコール含量を増加するために足りる量でビール−エンドプロテアーゼA組成物に添加された。
除炭酸されたモルトビール(Les Trois Brasseurs)に対する蛋白質含量:0.9g/l、パパインの様々な量(0〜100g/hl)が添加された。冷え濁り測定の2組が実行された。第1組では、ビール−パパイン組成物は、冷え濁り試験の前に40℃で、1時間培養された。エタノールは、濁り測定の前に6%アルコール(容量/容量)に達するために培養されたサンプルに添加された。第2組では、ビールサンプルが、40℃で、1時間培養され、引き続き0℃に冷却された。その後、パパインが添加され、そしてサンプルは、0℃で、15分間培養された。添加されたパパインの量、及びパパインが添加されない場合に測定される濁りに比例する濁り減少のパーセントが、表3に示される。
ビール−プロリル特異的エンドプロテアーゼ実験とビール−パパイン実験の両方において、対照実験は、培養の前にビールに大量のPVPP(0〜1000g/hl)を添加することによって行われた。混合の15分後に、該PVPPは濾過によって除去された(プロリル特異的エンドプロテアーゼ酵素又はパパインは添加されなかった)。両方の対照において、濁りは、冷え濁り試験の間にほとんど形成されなかった。PVPPは飲料からポリフェノールを除去することが知られている故に、これらの対照試験は、ポリフェノールはビール中の濁り形成に参加していることを示す。ビール濁り安定性に対するPVPP効果を測定するために、PVPPの種々の量が除炭酸されたボールに添加され、そして混合の15分後に濾過によって除去された。PVPPを添加する前に、該ビールは、40℃で、1時間培養された。
目的は、100%モルトマッシュに対するプロリル特異的エンドプロテアーゼの添加が、最終のモルトオルトで濁り減少の結果を生ずるかを決定することであった。
6.0U/mlの特異的活性を有するプロリル特異的エンドプロテアーゼ(エンドプロテアーゼB)の種々の用量(0、30、60,150μl)が、500mlの白ワイン(下記「材料」の項で記載されたワイン)を含むフラスコに添加され、そして室温(22〜25℃)で、19日間、窒素環境下で培養された。ワイン濁り安定は、下記「方法」の項で記載された加熱試験を使用し0、6、8、12及び19日後に測定された。
イチゴフルーツジュースは、次のようにして調製された。イチゴは解凍されそして破砕されて、引き続き全ての外因性酵素例えばポリフェノールオキシダーゼを破壊し且つ蛋白質を変成するために、90℃でブランチされた(加熱された)。その後、破砕されたイチゴは、50℃に冷却され、Rapidase BE スーパー(DSMの商業的酵素製品、フランス)の600g/tで30分間、50℃で柔らかくされ、そして空気プレスで圧縮された。変成した蛋白質を除去するために、結果として生じる混合物は、8000rpmの速度で遠心分離され、そして濾過された。ストロベリージュースが集められた。酸性化アルコール試験は陰性であり、それはジュースペクチンがないことが確認された。該ジュースのpH値は、3.3であった。
Claims (37)
- 飲料中の濁りを防止または減少する方法であって、プロリル特異的エンドプロテアーゼが飲料に添加される方法。
- エンドプロテアーゼが添加される飲料のpHに対応するpHで最大のプロリル特異的活性を有するエンドプロテアーゼが添加される、請求項1に記載の方法。
- 飲料が蛋白質を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 飲料がポリフェノールを含む、請求項3に記載の方法。
- 飲料が7未満のpH値を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 基質としてZ−Gly−Pro−pNAを使用し活性測定によって決定されたときに、飲料中の1グラム蛋白質あたりで少なくとも150ミリ・ユニットのプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性が飲料に添加される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 基質としてZ−Gly−Pro−pNAを使用し活性測定によって決定されたときに、飲料中の1グラム蛋白質あたりで少なくとも500ミリ・ユニットのプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性が飲料に添加される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 基質としてZ−Gly−Pro−pNAを使用し活性測定によって決定されたときに、飲料中の1グラム蛋白質あたりで少なくとも1ユニットのプロリル特異的エンドプロテアーゼ活性が飲料に添加される、請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 飲料がビールである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 飲料がワインである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 飲料がフルーツジュースである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- プロリル特異的エンドプロテアーゼが麦芽汁に添加される、請求項9に記載の方法。
- プロリル特異的エンドプロテアーゼは、濁りが生成される前にビールに添加される、請求項9に記載の方法。
- プロリル特異的エンドプロテアーゼは、濁りが生成された後に、発酵させたビールに添加される、請求項9に記載の方法。
- プロリル特異的エンドプロテアーゼが、発酵させたワインに添加される、請求項10に記載の方法。
- プロリル特異的エンドプロテアーゼが、単離された又は精製されたプロリル特異的エンドプロテアーゼである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- プロリル特異的エンドプロテアーゼ活性を有する単離されたポリペプチドであって、
(a)配列ID No.4、配列ID No.5若しくは配列ID No.7、またはそれらのフラグメントと少なくとも40%の全長アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドと、
(b)(i)配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列IDNo.6の核酸配列、または60、好ましくは100のヌクレオチドにわたって少なくとも80%あるいは90%同一である、より好ましくは200のヌクレオチドにわたって少なくとも90%同一であるそれらのフラグメントと、あるいは(ii)(i)の核酸配列と相補的な核酸配列と、低いストリンジェンシィー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと
から成る群から選択される、ポリペプチド。 - 配列ID No.4、配列ID No.5または配列ID No.7と少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、一層より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、及び一層最も好ましくは少なくとも97%同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項17に記載のポリペプチド。
- 配列ID No.4、配列ID No.5または配列ID. No.7のアミノ酸配列を含む、請求項17または18のポリペプチド。
- (i)配列ID No.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列IDNo.6の核酸配列、またはそれらのフラグメントと、あるいは(ii)配列ID No.1、配列IDNo.2、配列ID No.3若しくは配列ID No.6の核酸配列と相補的な核酸配列と、低いストリンジェンシィー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシィー条件下で、及び最も好ましくは高いストリンジェンシィー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項17または18に記載のポリペプチド。
- 菌類、好ましくはAspergillusから、より好ましくはAspergillusnigerから得られうる、請求項17〜21のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 請求項17〜21のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列、または低いストリンジェンシィー条件下で、より好ましくは中程度のストリンジェンシィー条件下で、及び最も好ましくは高いストリンジェンシィー条件下で、配列IDNo.1、配列ID No.2、配列ID No.3若しくは配列IDNo.6とハイブリダイズする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 適切な発現ホストにおいて上記ポリペプチドの生産を指示する1またはそれ以上の制御配列に動作可能に結合された請求項22に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構成物。
- 請求項23に記載の核酸構成物を含む組み換え発現ベクター。
- 請求項23に記載の核酸構成物または請求項24に記載のベクターを含む組み換え宿主細胞。
- 請求項25の記載の菌株/組み替え宿主細胞を培養して、上記ポリペプチドを含む上清及び/又は細胞を生産し、そして該ポリペプチドを回収することを含む請求項16、18〜22のいずれか1項に記載のポリペプチドを生産する方法。
- 請求項26に記載の方法によって生産されたポリペプチド。
- ポリペプチドの生産に適切な条件下で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構成物を含む宿主細胞を培養し、そして前記ポリペプチドを回収することを含む請求項16、18〜21のいずれか1項に記載のポリペプチドを生産する方法。
- 請求項28に記載の方法によって生産されたポリペプチド。
- 請求項16に記載のエンドプロテアーゼをコードするDNA分子。
- 飲料中の濁りの防止または減少において、請求項28に記載の方法によって得られうる発酵培養液から得られたろ液を使用する方法。
- 飲料の調製において、請求項17〜21のいずれか1項に記載のプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する方法。
- ビール、ワインまたはフルーツジュースの調製において、精製されたプロリル特異的エンドプロテアーゼを使用する方法。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法によって得られる飲料。
- 請求項9に記載の方法によって得られうるビール。
- 請求項10に記載の方法によって得られうるワイン。
- 請求項11に記載の方法によって得られうるフルーツジュース。
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