CN116144538B - 一种可防治根肿病的黄暗色链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可防治根肿病的黄暗色链霉菌CD1‑1，于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25979，还涉及所述黄暗色链霉菌CD1‑1在根肿病中的应用。本发明的黄暗色链霉菌CD1‑1，在平板上对多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液代谢产物对根肿病有很好的防控效果。根肿菌休眠孢子的萌发抑制率为32.64％，白菜根部根毛侵染抑制率为10.93％，经CD1‑1发酵液处理的白菜盆栽防治效果为49.33％，提前7d处理时，白菜盆栽防治效果为66.10％。此外，该菌株与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留。因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及作物病害防治领域，更特别地，涉及一种可防治根肿病的黄暗色链霉菌及其应用。
背景技术
根肿病是一种土传病害，主要侵染十字花科中的一些经济作物，比如油菜、萝卜、榨菜和白菜等。根肿病在世界上的五十多个国家和地区均有着广泛分布，包括非洲、南美洲、北美洲、欧洲、亚洲和大洋洲，世界各地每年因根肿病造成的作物产量损失高达10-15％，因此根肿病被当做重要的十字花科作物病害之一。据统计，危害较轻的年份根肿病在我国发生的面积可达4800-6000万亩，而在爆发年份，危害面积更是高达1.35亿亩。
根肿病在植株的根部发生并产生危害，在植株整个生育期内都可受到根肿菌侵染，但是苗期是最主要的感病时期。地下根部受到根肿菌侵染之后，引起植物体内激素变化，加速植物细胞分裂，主根和侧根膨大形成肿瘤。肿根形成初期根部表面光滑，后期根部腐烂，颜色变成深褐色，且散发着臭气，肿瘤膨大，根毛减少甚至没有，导致植物对水分和养分的吸收、传导被抑制，因此地上部位会呈现缺水萎蔫叶片变黄等症状，严重时会整颗植株枯死。
目前对根肿病的防治仍然以化学药剂为主，其操作较为简便快捷并且成本较低、见效较快，但化学杀菌剂的使用容易导致病原菌产生抗药性、对环境产生污染和残留毒性等严重后果，最终出现防治效果不好、危害生态安全和人类健康等问题。
随着科学研究的进一步深入开展，发现在克服植物病害的抗药性、减少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势，利用生防菌的次生代谢产物制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点；且利用微生物产生的代谢产物处理植物病原菌，达到生物防治病害的研究是目前的热点。放线菌产生的次生代谢产物的生防潜力主要体现在对病原菌菌丝生长、孢子萌发和对侵染的抑制作用，越来越多源于各种植物内生或不同极端环境的放线菌被发现，放线菌产生的代谢物质的种类也会变得越来越丰富。因此，大力开展生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种可防治根肿病的黄暗色链霉菌，于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.25979。
本发明还提供了上述黄暗色链霉菌在防治根肿病中的应用。
本发明还提供了一种防治根肿病的方法，包括将上述的黄暗色链霉菌培养产物施用于作物种植的土中的步骤。
在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：培养所述黄暗色链霉菌，制备黄暗色链霉菌发酵液；
S2：将所述黄暗色链霉菌发酵液施用于所述作物种植的土中。
在一个具体实施方案中，S1中，所述黄暗色链霉菌在高氏一号培养基中培养。
在一个具体实施方案中，S1包括以下步骤：
S11：将所述黄暗色链霉菌接种于高氏一号液体培养基中培养；
S12：于28℃、180rpm的条件下培养7天，得到所述黄暗色链霉菌发酵液。
在一个具体实施方案中，S2中，将所述黄暗色链霉菌发酵液对所述作物进行定期灌根处理。
在一个具体实施方案中，每两次灌根处理之间的时间间隔为7天。
本发明的黄暗色链霉菌CD1-1菌株，在平板上对多种植物病原菌有很强的抑制作用，其发酵液代谢产物对根肿病有很好的防控效果。根肿菌休眠孢子的萌发抑制率为32.64％，水培育苗试验表明，经CD1-1发酵液处理9d后，白菜根部根毛侵染抑制率为10.93％，活体接种试验表明，根肿菌与放线菌发酵液同时接种50d后，经CD1-1发酵液处理的白菜盆栽防治效果为49.33％，提前7d处理时，白菜盆栽防治效果为66.10％。此外，该菌株是从土壤分离获得，与自然生态具有天然的和谐相融性，与化学农药相比对土壤生态无毒副作用、无残留。因此，在病害的生物防治实践中具有潜在的商业开发和应用价值。
生物材料保藏
本发明纯化的黄暗色链霉菌CD1-1于2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25979。
附图说明
图1为黄暗色链霉菌CD1-1的平板形态照片；
图2为黄暗色链霉菌CD1-1的单菌落形态照片；
图3为黄暗色链霉菌CD1-1的孢子链及气生菌丝显微照片；
图4示出了黄暗色链霉菌CD1-1发酵液代谢产物中的成分；
图5示出了黄暗色链霉菌CD1-1产生多种水解酶鉴定；
图6示出了黄暗色链霉菌CD1-1对棉花枯萎病菌病原菌的抑制作用；
图7示出了黄暗色链霉菌CD1-1根肿病的控病作用。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1、黄暗色链霉菌CD1-1的鉴定与保藏
本团队从重庆市北碚、沙坪坝、巴南、南岸4个地区，采集的主要是草坪、竹林、行道树等非农田生态系统的根际土壤，分离获得的多个菌株经初筛和复筛,分离出一株菌株CD1-1，经过活体植株室内盆栽接种测试确定该菌株对根肿病有较好防治作用。
将菌株CD1-1在高氏一号培养平板上于28℃下培养5-7d，得到平板形态照片如图1所示，单菌落照片如图2所示。
提前灭过菌的玻片30°斜插入平板中，在28℃培养箱中倒置培养7d后，取出盖玻片，滴入少许蒸馏水放在载玻片上，使用光学显微镜观察菌株的气生菌丝、孢子链的形态特征的形态，如图3所示。
提取菌株的基因组DNA，以细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,SEQID NO:1，)和1492R(5’-TACGGCTACC TTGACGACTT-3’,SEQ ID NO:2)。以菌株CD1-1的基因组DNA为模板，PCR扩增后经电泳检测，测序，得到16S rDNA序列如SEQ I D NO:3所示。将所得的序列结果在NCBI中进行Bl ast比对，选取相关菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 7.0软件的邻近法(Neighbor-Joi n i ng)进行进化树构建，结合形态学特征鉴定该菌株属于黄暗色链霉菌(Streptomyces xanthophaeus)。
将上述菌株于2022年10月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.25979。
2.CD1-1菌株发酵液制备及代谢产物分析
将拮抗放线菌CD1-1打取菌饼置于无菌的高氏合成一号液体培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡发酵培养7d。取发酵液7500rpm，离心10mi n，弃沉淀取上清液。置于-80℃冷冻，再置于冷冻干燥机冻干12h。
所得冻干样本送于美吉生物公司进行LC-MS非靶向代谢组学检测，称取一定量样本，进行代谢物萃取，再离心取代谢产物溶剂上清液进行液相质谱检测，用代谢组学软件进行数据处理。确定菌株CD1-1的发酵液物质成分。
结果如表1和2及图4所示，菌株CD1-1的发酵液中正离子模式下检测到66种代谢物质成分，负离子模式下检测到48种代谢物质成分，其中脂质和类脂质分子占比最高，为30.26％，其次是有机酸及其衍生物、有机含氧化合物、苯类、有机氮化合物、有机杂环化合物、苯丙烷和聚酮化合物以及核苷、核苷酸和类似物，分别占比25.00％、19.74％、7.89％、5.26％、5.26％、3.95％、2.63％。
表1正离子模式下菌株CD1-1发酵液产生的代谢物质成分分析
表2负离子模式下菌株CD1-1发酵液产生的代谢物质成分分析
3.黄暗色链霉菌CD1-1防治病原菌
2.1黄暗色链霉菌CD1-1对病原菌的抑菌性
将拮抗放线菌点接于ABP培养基(葡聚糖酶筛选培养基)、蛋白酶筛选培养基、CMC-Na培养基(纤维素酶筛选培养基)、几丁质酶筛选培养基。将平板倒置于28℃培养箱培养，7d后观察菌株的生长情况并记录透明圈半径。测定结果显示，黄暗色链霉菌CD1-1可产生多种水解酶，包括蛋白酶和葡聚糖(图5)。推测其对一些病原菌具有较好的抑菌效果。
进一步地，采用平板对峙划线法测定拮抗菌对病原真菌(棉花枯萎病菌)菌丝生长的影响。在平板中央接种病原真菌8mm菌饼，距菌饼25mm两侧处接种拮抗放线菌，画两条30mm的直线，放线菌比病原真菌提前3d接种，对照组在平板中心接种病原真菌，不接种放线菌，每个处理3个重复，28℃恒温培养箱中培养。待对照组病原真菌长满平板时观察处理组是否产生抑菌带，测量病原真菌菌落直径并计算抑菌率。确定CD1-1菌株对病原真菌的抑制效果。结果如图6所示，CD1-1菌株对棉花枯萎病菌具有显著的抑制效果。
2.2黄暗色链霉菌CD1-1对根肿病的防治
以白菜的根系分泌物作为培养基，在灭菌的三角瓶中加入5mL根系分泌物、0.5mL根肿菌休眠孢子悬液和0.5mL菌株CD1-1发酵液，放在黑暗、24℃条件下培养，以灭菌的液体培养基作为对照，每个处理3组重复。第5d显微镜观察休眠孢子萌发情况，用1％地衣红(溶于45％醋酸中)染色10-15s，计算孢子萌发率及萌发抑制率。结果显示，根肿菌休眠孢子的萌发抑制率为32.64％。
将白菜种子放在垫有湿润滤纸的培养皿里，置于24℃光照湿润条件下催芽，3d后幼苗移植到装有Hoagl and营养液的10mL离心管中水培，5d后接种根肿菌休眠孢子以及CD1-1菌株发酵液，根肿菌休眠孢子终浓度为107个/mL，处理组以1:30的比例加入发酵液，对照组加Hoagl and营养液。水培9d后取幼苗根部用清水冲洗，放在荧光桃红染液中染色30mi n，放在显微镜下移动观察幼苗根毛侵染情况。结果显示，经CD1-1发酵液处理9d后，白菜根部根毛侵染抑制率为10.93％。
采用灌根法接种白菜。从冰箱中拿出肿根放于25℃、黑暗环境下腐烂5d，以1:5的比例混合肿根和水，榨汁机间歇性搅拌过滤，制备并调整根肿菌休眠孢子悬浮液浓度为2.5×108个/mL。将拮抗菌菌饼接种到高氏一号液体培养基中，28℃、180r·mi n-1条件下培养7d，得到浓度为107CFU/mL的放线菌发酵液。每株白菜用30mL根肿菌休眠孢子悬浮液灌根处理，使每克土壤最终含菌量为3×107个。处理A：拮抗菌与根肿菌同时接种，每隔7d浇灌放线菌发酵液20mL，共浇灌五次，处理B：拮抗菌提前7d接种，每隔7d浇灌放线菌发酵液20mL，共浇灌五次。以接种根肿菌休眠孢子悬浮液并浇灌高氏一号液体培养基为发病对照，每个处理重复20株白菜，在接种50d后调查发病，统计记录。结果显示，根肿菌与CD1-1发酵液同时接种50d后，经CD1-1发酵液处理的白菜盆栽防治效果为49.33％，CD1-1发酵液提前7d处理时，白菜盆栽防治效果为66.10％(图7)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可防治根肿病的黄暗色链霉菌(Streptomyces xanthophaeus)，其特征在于，2022年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.25979。
2.权利要求1所述的黄暗色链霉菌在防治根肿病中的应用。
3.一种防治根肿病的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的黄暗色链霉菌培养产物施用于作物种植的土中的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：培养所述黄暗色链霉菌，制备黄暗色链霉菌发酵液；
S2：将所述黄暗色链霉菌发酵液施用于所述作物种植的土中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S1中，所述黄暗色链霉菌在高氏一号培养基中培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：
S11：将所述黄暗色链霉菌接种于高氏一号液体培养基中培养；
S12：于28℃、180rpm的条件下培养7天，得到所述黄暗色链霉菌发酵液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2中，将所述黄暗色链霉菌发酵液对所述作物进行定期灌根处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，每两次灌根处理之间的时间间隔为7天。
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