JPH09164A - 加水分解蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 蛋白質を酵素により高度に加水分解する方法
を開発する。 【構成】 蛋白質をアスペルギルス オリゼに由来し、
少なくとも５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼを含
有する酵素製剤で消化後、単一微生物由来のプロリルエ
ンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼを
含む酵素製剤で消化することを特徴とする加水分解蛋白
質の製造方法。 【効果】 従来、３工程以上の酵素反応を必要とした蛋
白質の高度加水分解が、本発明により２工程の酵素反応
で実施できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、加水分解蛋白質の製造
方法に関する。加水分解蛋白質は調味料、食品の品質改
良剤等に幅広く利用されている。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質の加水分解は通常塩酸を添加して
高温、高圧処理する事により行われている。しかしなが
らこれらの食品を取り扱う業界では、消費者の天然物嗜
好の拡大に伴い、化学薬品である塩酸を使用しない方法
が望まれるようになりつつある。塩酸加水分解法に代わ
る方法として、蛋白質分解酵素を用いる加水分解方法が
考えられるが、酵素のコストが塩酸に比べて高価である
こと、また塩酸を用いて加水分解した場合と同程度に加
水分解率を高めることは困難であったことから実用化に
は困難を伴う場合が多かった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、特定
の蛋白質分解酵素による加水分解工程を組み合わせるこ
とにより、蛋白質を高度に加水分解する方法を開発する
ことである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】酵素による加水分解で蛋
白質の加水分解率が低い原因の１つとして、蛋白質中の
イミノ酸残基の存在があげられる。すなわち、環状α−
イミノ酸であるプロリンは他のアミノ酸とは異なる立体
構造をしており、蛋白質またはペプチド中のイミノ酸残
基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペプチド結合
は通常の蛋白質分解酵素による加水分解を受けにくい。
蛋白質を通常の蛋白質分解酵素で加水分解すると、プロ
リン残基の部分がジペプチドまたはトリペプチドの状態
にまで加水分解された時点で反応が終了してしまうこと
になる。

【０００５】プロリン残基を含むペプチドを加水分解す
る酵素としては、オリゴペプチド中に存在するプロリン
残基のＣ−末端側のペプチド結合を切断するプロリルエ
ンドペプチダーゼや、Ｐｒｏ−Ｘの構造を有するジペプ
チドを加水分解するプロリナーゼ、Ｘ−Ｐｒｏの構造を
有するジペプチドを加水分解するプロリダーゼ等が知ら
れている。本発明者らは通常の蛋白質分解酵素による加
水分解工程と、単一微生物由来のプロリルエンドペプチ
ダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼを含有する酵
素剤を用いた加水分解工程を組み合わせることにより蛋
白質を高度に加水分解できること見出し、平成５年日本
国特許出願第２６６４６７号にその内容を開示した。し
かしながらこの方法では、エンド型酵素による加水分解
工程、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、お
よびプロリナーゼによる加水分解工程およびエキソ型酵
素による加水分解工程と３段階の工程が必要である。

【０００６】実用上、操作をさらに簡便にするため、本
発明者らは鋭意検討を行った。その結果、アスペルギル
ス・オリゼに由来し、かつ分子量がそれぞれ約２３ｋ
Ｄ、約２７ｋＤ、約３１ｋＤ、約３２ｋＤ、約３５ｋ
Ｄ、約３８ｋＤ、約４２ｋＤ、約４７ｋＤ、約５３ｋ
Ｄ、および約１００ｋＤの中から選ばれる少なくとも５
種のプロテアーゼおよびペプチダーゼを含む酵素製剤に
よる加水分解工程を実施した後、単一の微生物に由来す
るプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプ
ロリナーゼを含有する酵素剤を用いた加水分解工程を実
施するという２段階の反応により、容易に蛋白質を高度
に加水分解できることを見出し、本発明を完成させるに
到った。

【０００７】本発明の方法の最初の工程には、アスペル
ギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ）由来で、分子量がそれぞれ約２３ｋＤ、約２７ｋ
Ｄ、約３１ｋＤ、約３２ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋ
Ｄ、約４２ｋＤ、約４７ｋＤ、約５３ｋＤ、および約１
００ｋＤの中から選ばれる少なくとも５種のプロテアー
ゼおよびペプチダーゼを含む酵素製剤を用いる。詳細に
は、上記の５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼの分
子量はそれぞれ約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約３５ｋＤ、
約３８ｋＤ、約５３ｋＤである。この様な多数のプロテ
アーゼおよびペプチダーゼを同時に含む酵素製剤で蛋白
質を加水分解することにより、プロリン等の環状イミノ
酸を多く含む蛋白質が、後段の工程であるプロリルエン
ドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼを含
有する酵素製剤を用いた加水分解工程において、これら
３種の酵素が充分に作用できる程度に低分子化される。
このような低分子化は、原料蛋白質を特異性の異なる複
数のプロテアーゼおよびペプチダーゼで処理することに
よっても達成できるが、異なる複数のプロテアーゼ製剤
を同時にまたは連続して使用するよりも、複数のプロテ
アーゼおよびペプチダーゼを同時に含む単一のプロテア
ーゼ製剤を用いる方が有利である。

【０００８】本発明の最初の工程に用いることのできる
アスペルギルス・オリゼ由来の酵素製剤として、分子量
がそれぞれ約２３ｋＤ、約２７ｋＤ、約３１ｋＤ、約３
２ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約４２ｋＤ、約４７
ｋＤ、約５３ｋＤ、および約１００ｋＤの中から選ばれ
る少なくとも５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼを
含むノボ・ノルディスク社（ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ
Ａ／Ｓ、デンマーク）のフレ−バ−ザイム（Ｆｌａｖ
ｏｕｒｚｙｍｅ）があげられる。このような酵素製剤に
より環状イミノ酸を多く含む蛋白質の前処理を行った場
合には、単にこの工程での加水分解率が高いのみなら
ず、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよび
プロリナーゼによる加水分解工程において分解率の増加
分がより高くなることが見出される。

【０００９】本発明の後段の工程には、単一微生物由来
のプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプ
ロリナーゼを含有する酵素製剤が用いられる。プロリル
エンドペプチダーゼ（別名ポストプロリンクリービング
酵素またはプロリン特異的エンドペプチダーゼ、ＥＣ
３．４．２１．２６）は、オリゴペプチド中に存在する
プロリン残基のＣ−末端側のペプチド結合を加水分解す
る酵素である。プロリルエンドペプチダーゼを生産する
微生物としては、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、キサントモナス（Ｘａｎｔｈ
ｏｍｏｎａｓ）属細菌、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属の放線菌が報告されている。これら
微生物以外にもプロリルエンドペプチダーゼを生産する
微生物を新たにスクリーニングすることにより新規プロ
リルエンドペプチダーゼを取得することも可能である。
プロリルエンドペプチダーゼを生産する微生物は、その
培養液をカルボベンゾキシ−アラニル−アラニル−プロ
リル−パラニトロアニリド（以下Ｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−ｐＮＡと略す）等に作用させ、黄色のパラニト
ロアニリンを遊離させること等を指標に土壌等より分離
することができる。

【００１０】プロリダーゼ（別名プロリンジペプチダー
ゼ、ＥＣ ３．４．１３．９）はＸ−Ｐｒｏの構造のジ
ペプチドを加水分解するが、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙの構造のト
リペプチドのＸ−Ｐｒｏ結合を加水分解する場合もあ
る。プロリダーゼを生産する微生物としては、エシェリ
シア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ラ
クトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌ
ａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ノイロ
スポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属糸状菌、サーマス・
アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）属細
菌等が報告されている。これら微生物以外にもプロリダ
ーゼを生産する微生物を新たにスクリーニングすること
により新規プロリダーゼを取得することも可能である。
プロリダーゼを生産する微生物は、その培養液をグリシ
ル−プロリン（以下Ｇｌｙ−Ｐｒｏと略す）等に作用さ
せた後に生じる遊離プロリンを指標に土壌等より分離す
ることができる。

【００１１】プロリナーゼ（別名プロリルジペプチダー
ゼ、ＥＣ ３．４．１３．８）はＰｒｏ−Ｘの構造のジ
ペプチドを加水分解する酵素である。プロリナーゼを生
産する微生物としては、ストレプトコッカス・クレモリ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉ
ｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等が
報告されている。これら微生物以外にもプロリナーゼを
生産する微生物を新たにスクリーニングすることにより
新規プロリナーゼを取得することも可能である。プロリ
ナーゼを生産する微生物は、その培養液をプロリル−グ
リシン（以下Ｐｒｏ−Ｇｌｙと略す）等に作用させた後
に生じる遊離プロリンを指標に土壌等より分離すること
ができる。

【００１２】プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダー
ゼおよびプロリナーゼを同時に生産する微生物として、
シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．）ＫＵ−２２株およびストレプトマイセス・キサ
ントファエウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔ
ｈｏｐｈａｅｕｓ） ＨＡ−３６株があげられる。シュ
ードモナス・エスピー ＫＵ−２２株は好気性の桿菌で
あり、ＹＭ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス
０．３％、マルトエキス０．３％、グルコース１．０
％、寒天１．０％、ｐＨ７．２）上３０℃で培養した場
合に淡黄土色、湿潤で光沢のあるコロニーを形成する。
細胞のサイズは０．４μｍ×１．６μｍの直桿菌であ
り、グラム染色陰性、運動性あり、極性鞭毛、ウレアー
ゼテスト陽性、カタラーゼテスト陽性、オキシダーゼテ
スト陽性、クエン酸利用テスト陽性、澱粉加水分解テス
ト陰性、グルコース酸化能（ＯＦ−テスト）陽性、キノ
ン系はＱ−９、黄色色素産生なし、水溶性色素産生な
し、蛍光色素産生なし、アルギニン加水分解酵素テスト
陰性、フォーゲス−プロスカウエルテスト（ＶＰテス
ト）陰性、硝酸還元テスト陰性、メチルレッドテスト陰
性、Ｄ−グルコース、Ｄ−マニトール、Ｄ−マンノー
ス、エタノール、スクロースより好気条件下に酸を生成
しない、３７℃、４０℃、４２℃で生育し、４５℃で生
育しない、５％食塩存在下に生育し、１０％食塩存在下
に生育しない、好気条件下にＤ−グルコース、Ｄ−マニ
トール、Ｄ−マンノース、酢酸を資化し、スクロースを
資化しない。尚、本菌株は工業技術院生命工学工業技術
研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３７８８として寄託されてい
る。

【００１３】シュードモナス・エスピー ＫＵ−２２の
培養液より酵素剤を得る方法は公知の方法をそのまま、
または一部修正して用いることができる。これらペプチ
ダーゼの生産に適する培地としては、グルコース、酵母
エキス、ポリペプトン、ＣＳＬ、食塩等を含有する培地
が有効である。培養温度３０℃で２日間程度の培養によ
り著量のプロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼお
よびプロリナーゼが培地中に生産される。酵素の収量を
増大させるために、超音波による菌体破砕または浸透圧
ショック等を行うことも有効である。菌体または菌体残
渣を除去した後、たとえば硫安分画、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロ
マトグラフィー等を行うことによりそれぞれの酵素が精
製できるが、加水分解反応もしくは加水分解物に悪影響
を与える因子が混在せず、かつ食品衛生上の問題が無け
れば、該酵素の粗精製品または培養液からの抽出物をそ
のまま反応に利用することも可能である。

【００１４】ストレプトマイセス・キサントファエウス
ＨＡ−３６株はスターチ・無機塩寒天培地で３０℃で
培養することにより、よく分岐した基菌糸からｓｔｒａ
ｉｇｈｔ〜ｆｌｅｘｕｒｕｓの気菌糸を伸長し、成熟し
た気菌糸の先に１０〜５０個の楕円〜円筒形の胞子から
なる胞子鎖を形成する。胞子嚢は無く、胞子の大きさは
０．７〜１．０×１．０〜１．５μｍで、胞子表面はｓ
ｍｏｏｔｈであり、鞭毛は認められない。本菌株の細胞
壁の糖成分には特に特徴は認められず、細胞壁成分のジ
アミノピメリン酸はＬＬ型である。尚、本菌株は工業技
術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３８２
７として寄託されている。

【００１５】ストレプトマイセス・キサントファエウス
ＨＡ−３６株の培養液より酵素剤を得る方法は、公知
の方法をそのまま、または一部修正して用いることがで
きる。ペプチダーゼの生産に適する培地としては、グル
コース、澱粉、乾燥酵母、食塩を含有する培地が有効で
ある。培養温度３０℃で４日間程度培養することにより
著量のプロリルエンドペプチダーセ、プロリダーゼおよ
びプロリナーゼが培地中に生産される。菌体および不溶
性成分を除去した後、たとえば硫安分画、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過
クロマトグラフィー等を行うことによりそれぞれの酵素
が精製できるが、加水分解反応もしくは加水分解物に悪
影響を与える因子が混在せず、かつ食品衛生上の問題が
無ければ該酵素の粗精製品または培養液からの抽出物を
そのまま反応に利用することも可能である。尚、既知の
プロリルエンドペプチダーゼは通常高分子の基質に対し
ては全く作用しないが、本微生物が生産するプロリルエ
ンドペプチダーゼは高分子基質であるカゼインに対して
も加水分解活性を示すことが特徴である。

【００１６】本発明に用いられる上述の酵素製剤はいず
れも、これら酵素を同時に生産する微生物の培養物や細
胞破砕液をそのまま使用するか、またはこれらより酵素
を粗精製したものを用いることができる。反応は通常の
酵素反応と同じく酵素が失活しない程度の一定の温度で
撹拌条件で行うことが望ましい。シュードモナス・エス
ピー ＫＵ−２２株およびストレプトマイセス・キサン
トファエウス ＨＡ−３６株の生産するプロリルエンド
ペプチダーゼおよびプロリダーゼは、ヒドロキシプロリ
ンを含むペプチドには作用しにくいことから、コラーゲ
ンやゼラチン等ヒドロキシプロリンを多量に含む蛋白質
を加水分解する場合には、Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対する特異
性が高いプロリダーゼを用いた加水分解工程を行うこと
が好ましい。このプロリダーゼによる反応は、プロリル
エンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロリナーゼ
を含む酵素剤による反応と同時に実施しても、別々に実
施してもよい。尚、Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対する特異性が高
いプロリダーゼは、オーレオバクテリウム・エステラロ
マティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅ
ｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ） ＩＦＯ３７５２の培養液よ
り生産される。この微生物は財団法人発酵研究所が保存
する微生物であり、同所に依頼することにより誰でもこ
れら菌株の分譲を受けることができる。

【００１７】Ｐｒｏ−Ｈｙｐに対する特異性が高いプロ
リダーゼは、オーレオバクテリウム・エステラロマティ
カム ＩＦＯ ３７５２をグルコース、ペプトン、酵母
エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を含む培
地に接種し、２８〜３０℃で１〜３日好気培養すること
により生産される。該ペプチダーゼは培養上清中にも多
少蓄積するため、これを濃縮してもよいが、多量の酵素
を取得する場合には菌体を遠心分離等により集め、超音
波処理、浸透圧ショック処理、リゾチーム処理や界面活
性剤処理を行い、菌体内に存在する該ペプチダーゼを抽
出することが望ましい。菌体の抽出液より公知の常法、
例えば硫安またはアセトンによる分画、疎水クロマトグ
ラフ、イオン交換クロマトグラフ、ゲル濾過クロマトグ
ラフ等を用いることにより、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチ
ドを加水分解する酵素を精製することができる。この酵
素を加水分解反応に用いる場合には必ずしも酵素を精製
することは必要ではなく、加水分解反応もしくは加水分
解物に悪影響を与える因子が混在せず、かつ食品衛生上
の問題が無ければ該酵素の粗精製品または培養液からの
抽出物をそのまま反応に利用することも可能である。酵
素反応が終了した後、脱色、濃縮、殺菌等の処理を行
い、目的の加水分解蛋白質が調製される。以下実施例に
より本発明をさらに詳細に記述するが、本発明はこれら
に限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】

【００１９】

【実施例１】 １）ＫＵ−２２粗酵素液の調製 シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．） ＫＵ−２２株をグルコース０．５％、ポリペ
プトン１％、酵母エキス０．５％、ＣＳＬ２％、塩化ナ
トリウム０．３％、リン酸水素二カリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・７水和物０．１％よりなる培地１００
ｍｌ（ｐＨ７．２）を含む５００ｍｌ容坂口フラスコ６
本に移植し、３０℃で４８時間振盪培養を行った。培養
液より遠心分離により（８、０００×ｇ、２０分）菌体
を集め、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
（以下緩衝液Ａと称する）で２回洗浄後、菌体を超音波
処理することにより粉砕した。その後遠心分離（８、０
００×ｇ、２０分）により細胞残渣を除去することによ
り無細胞抽出液５５ｍｌを得た。この無細胞抽出液を氷
中で冷却撹拌しながら９０％飽和となるように硫酸アン
モニウムを加え、３０分間氷中で撹拌させた後４℃で一
夜放置した。沈澱物を遠心分離（８、０００×ｇ、２０
分）により回収し、氷冷した１０ｍｌの緩衝液Ａに溶解
した。続いて緩衝液Ａに対して透析を行い、粗酵素液を
得た（以下ＫＵ−２２粗酵素液と称する）。

【００２０】プロリルエンドペプチダーゼ活性の測定は
以下の条件にて行った。即ち、１ｍＭ Ｚ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ（４０％メタノールに溶解）２０
０μｌに５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
８００μｌを加え、３７℃で５分間予備保温した後、酵
素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したもの）２００μｌ
を添加して３０分間反応させた。１Ｍの酢酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ３．５）を４００μｌ加えて反応を停止さ
せた。基質に１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）をあらかじ
め加えた後で酵素サンプルを添加したものをブランクと
して４１０ｎｍの吸光を測定し、反応により遊離したパ
ラニトリアニリンの量を求めた。尚、プロリルエンドペ
プチダーゼ１単位は３７℃の反応で１分間に１μｍｏｌ
のパラニトリアニリン相当量を遊離させるのに必要な酵
素量と定義した。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリルエンド
ペプチダーゼの活性は１．１単位／ｍｌであった。

【００２１】プロリダーゼ活性の測定は以下の条件で行
った。即ち、５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含む緩衝液Ａ２
００μｌに酵素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したも
の）１００μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。
１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を７００μ
ｌ添加して反応を停止させた後、１０％のニンヒドリン
を含む９５％エタノール溶液１００μｌを加えて、７０
℃、１０分間加熱・冷却し、４４０ｎｍの吸光度を測定
した。一方、酵素サンプル添加前に酢酸緩衝液を添加し
たものを同様にニンヒドリン反応させたものにつき４４
０ｎｍの吸光度を測定し、これをブランクとした。ま
た、５ｍＭのＧｌｙ−Ｐｒｏ溶液と、５ｍＭグリシンお
よび５ｍＭプロリンを含む溶液を適宜混合し、この混合
液２００μｌに蒸留水１００μｌを加え、上記と同様に
ニンヒドリン反応を行ったものを各種準備し、これらの
４４０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線を作成した。標
準曲線より遊離プロリンの濃度を求め、プロリダーゼに
より生じたプロリン量を算出した。尚、プロリダーゼ１
単位は３７℃の反応で１分間に１μｍｏｌのプロリンを
遊離させるのに必要な酵素量と定義した。ＫＵ−２２粗
酵素液のプロリダーゼ活性は５．７単位／ｍｌであっ
た。

【００２２】プロリナーゼ活性の測定は以下の条件で行
った。即ち、５ｍＭ Ｐｒｏ−Ｇｌｙを含む緩衝液Ａ２
００μｌに酵素サンプル（緩衝液Ａで適宜希釈したも
の）１００μｌを加え、１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）を７００μｌ添加して反応を停止させた
後、１０％のニンヒドリンを含む９５％エタノール溶液
１００μｌを加えて、７０℃、１０分間加熱・冷却し、
４４０ｎｍの吸光度を測定した。一方、酵素サンプル添
加前に酢酸緩衝液を添加したものを同様にニンヒドリン
反応させたものにつき４４０ｎｍの吸光度を測定し、こ
れをブランクとした。また、５ｍＭのＰｒｏ−Ｇｌｙ溶
液と、５ｍＭグリシンおよび５ｍＭプロリンを含む溶液
を適宜混合し、この混合液２００μｌに蒸留水１００μ
ｌを加え、上記と同様にニンヒドリン反応を行ったもの
を各種準備し、これらの４４０ｎｍの吸光度を測定して
標準曲線を作成した。標準曲線より遊離プロリンの濃度
を求め、プロリナーゼにより生じたプロリン量を算出し
た。尚、プロリナーゼ１単位は３７℃の反応で１分間に
１μｍｏｌのプロリンを遊離させるのに必要な酵素量と
定義した。ＫＵ−２２粗酵素液のプロリナーゼ活性は
４．９単位／ｍｌであった。

【００２３】２）ＨＡ−３６粗酵素液の調製 ストレプトマイセス・キサントファエウス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｘａｎｔｈｏｐｈａｅｕｓ） ＨＡ−
３６株を１％グルコース、１％可溶性澱粉、２％乾燥酵
母、０．３％食塩よりなる培地１００ｍｌ（ｐＨ７．
２）を含む５００ｍｌ容坂口フラスコ２０本に移植し、
３０℃で４日間振盪培養を行った。培養液を遠心分離
（８、０００×ｇ、２０分）することにより菌体を除
き、この液を氷中で冷却撹拌しながら８０％飽和となる
ように硫酸アンモニウムを加え、３０分間氷中で撹拌さ
せた後４℃で一夜放置した。沈澱物を遠心分離（８、０
００×ｇ、２０分）により回収し、氷冷した緩衝液Ａ５
０ｍｌに溶解させた。続いて緩衝液Ａに対して透析を行
い、粗酵素液を得た（以下ＨＡ−３６粗酵素液と称す
る）。プロリルエンドペプチダーゼ活性は０．７３単位
／ｍｌ、プロリダーゼ活性は０．４５単位／ｍｌ、プロ
リナーゼ活性は１．１単位／ｍｌであった。

【００２４】３）蛋白質の調製と前段処理 ５リットル容高圧オートクレーブに牛骨３６００ｇと水
７２０ｇを仕込み、密封後に昇温を開始した。オートク
レーブの内圧が０．５ｋｇ／ｃｍ² に達したらオートク
レーブ内のエア抜きを実施し、再度密封してオートクレ
ーブの内圧が３ｋｇ／ｃｍ² になるまで加熱し、１時間
煮出しを行った。冷却後、オートクレーブ内の液を５リ
ットル容分液ロートに移し、上層の油を除いて下層の牛
骨抽出液２４００ｇを回収し、これをエバポレーターで
濃縮してＴ−Ｎ７．７％、Ｆ−Ｎ０．３９％の濃縮液４
５０ｇを得た。本濃縮液２１０ｇに水を３２０ｇを加え
て希釈後、１６％水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを
７．０に調製した。この溶液にノボ・ノルディスク社製
フレーバーザイムを７．３ｇ添加し、５０℃で４８時間
反応させた。反応終了液を８５℃で３０分加熱すること
により酵素を失活させた。本フレーバーザイム処理液は
Ｔ−Ｎ＝２．９５％、Ｆ−Ｎ＝１．２４％であり、加水
分解率は４２．０％と算出された。

【００２５】４）粗酵素液による加水分解 上記３）で得られたフレーバーザイム処理液のｐＨを
８．０に調整した後、これを３本の試験管Ａ、Ｂ、Ｃに
それぞれ１５ｍｌずつ分注した。試験管Ａには蒸留水
１．５ｍｌを、試験管Ｂには上記１）で得られたＫＵ−
２２粗酵素液１．５ｍｌを、試験管Ｃには上記２）で得
られたＨＡ−３６粗酵素液１．５ｍｌを添加して３７℃
で２４時間反応させた。反応終了液のケルダール窒素
（Ｔ−Ｎ）およびホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行
った結果（表１）、サンプルＢおよびＣの加水分解率
は、サンプルＡの加水分解率に比べて高くなっており、
サンプルＢではサンプルＡに比べて約１５％も高い値を
示した。

【００２６】

【表１】

【００２７】

【比較例１】上記実施例１の３）で得られた牛骨抽出濃
縮液２１０ｇに水を３２０ｇを加えて希釈後、１６％水
酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨを７．０に調製した。
この溶液に天野製薬社社製プロテアーゼＭを７．３ｇ添
加し、５０℃で４８時間反応させた。反応終了液を８５
℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた。本プ
ロテアーゼＭ処理液はＴ−Ｎ＝２．９６％、Ｆ−Ｎ＝
０．６７％であり、加水分解率は２２．６％と算出され
た。このプロテアーゼＭ処理液のｐＨを８．０に調整し
た後、これを３本の試験管Ｄ、Ｅ、Ｆにそれぞれ１５ｍ
ｌずつ分注した。試験管Ｄには蒸留水１．５ｍｌを、試
験管Ｅには実施例１の１）で得られたＫＵ−２２粗酵素
液１．５ｍｌを、試験管Ｆには実施例１の２）で得られ
たＨＡ−３６粗酵素液１．５ｍｌを添加して３７℃で２
４時間反応させた。反応終了液のケルダール窒素（Ｔ−
Ｎ）およびホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行った結
果（表１）、サンプルＥおよびＦではコントロールであ
るサンプルＤに比べて加水分解率は高くなっていたもの
の、その増加率は５〜１０％程度であった。

【００２８】

【実施例２】オーレオバクテリウム・エステラロマティ
カム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｓｔｅｒａｒ
ｏｍａｔｉｃｕｍ） ＩＦＯ ３７５２を、グルコース
０．５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．５％、Ｃ
ＳＬ２％、塩化ナトリウム０．３％、リン酸水素二カリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１％よ
りなる培地１リットルに接種し、２８℃で３日間振盪培
養した。培養液より集菌し、緩衝液Ａで２回洗浄後、１
０ｍＭのＥＤＴＡを含む同緩衝液２００ｍｌに懸濁させ
た。これにリゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなる
ように添加し、３７℃で１時間保温した。これを超音波
処理し、１５、０００ｇで１０分間遠心分離して上清１
５０ｍｌを回収し、粗酵素抽出液とした。酵素活性の測
定は以下のように行った。５ｍＭのＰｒｏ−Ｈｙｐを含
む２００μｌの緩衝液Ａに酵素液（緩衝液Ａで適宜希釈
したもの）を１００μｌ添加し、３７℃で３０分間反応
させた。反応液に１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
２．８）７００μｌを添加して反応を停止させ、１０％
ニンヒドリンを含む９５％エタノール溶液１００μｌを
加えて７０℃で１０分間ニンヒドリン反応を行い、プロ
リンおよびヒドロキシプロリンに由来する４４０ｎｍの
吸光度を測定した。標準液として、基質ペプチドとその
想定加水分解物（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、プロリンおよびヒド
ロキシプロリン）とを適宜混合したものにつき同様のニ
ンヒドリン反応を行って標準曲線を作成し、これをもと
にプロリン、ヒドロキシプロリンの遊離量を求めた。
尚、酵素１単位は３７℃、１分間の反応で１μｍｏｌの
Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する酵素量と定義した。本粗
酵素液の活性は２．５単位／ｍｌであった。

【００２９】実施例１で得られたフレーバーザイム反応
液のｐＨを実施例１と同様に８．０に調整し、その１５
ｍｌに上記の粗酵素抽出液１．５ｍｌと実施例１で得ら
れたＫＵ−２２粗酵素液１．５ｍｌとを添加して５０℃
で４８時間加水分解させた（反応液Ｇ）。反応液Ｇにつ
きケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモ
ール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行
い、両者の比より加水分解率を計算した。その結果、反
応液Ｄは約６５％もの加水分解率を示し、後段処理にお
ける増分加水分解率は２３％であった（表１）。

【００３０】

【発明の効果】蛋白質の加水分解を複数のプロテアーゼ
およびペプチダーゼを同時に含む特定の酵素製剤と、プ
ロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼおよびプロリ
ナーゼを含む酵素製剤による処理とを組み合わせること
により高い加水分解率が得られることから、食品、特に
調味料用途の蛋白質の加水分解に効果的に利用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 食用蛋白質、食品蛋白質の部分消化物、
   および食品蛋白質由来のペプチドをアスペルギルス・オ
   リゼに由来し、かつ分子量がそれぞれ約２３ｋＤ、約２
   ７ｋＤ、約３１ｋＤ、約３２ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８
   ｋＤ、約４２ｋＤ、約４７ｋＤ、約５３ｋＤ、および約
   １００ｋＤの中から選ばれる少なくとも５種のプロテア
   ーゼおよびペプチダーゼを含む酵素製剤で消化し、その
   後単一微生物由来のプロリルエンドペプチダーゼ、プロ
   リダーゼおよびプロリナーゼを含有する酵素製剤で消化
   することを特徴とする加水分解蛋白質の製造方法。
2. 【請求項２】 ５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼ
   の分子量が約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約３５ｋＤ、約３
   ８ｋＤ、約５３ｋＤである請求項１に記載の加水分解蛋
   白質の製造方法。
3. 【請求項３】 単一微生物がシュードモナス（Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓ）属細菌由来である請求項１乃至２記載
   の加水分解蛋白質の製造方法。
4. 【請求項４】 単一微生物がストレプトマイセス（Ｓｔ
   ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属由来である請求項１乃至２記
   載の加水分解蛋白質の製造方法。