KR0127100B1 - 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법 - Google Patents
신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법Info
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Abstract
본 발명은 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC8600P)와 이를 이용하여 고온성이면서 발효소요 시간이 짧고, 특히 유기용매에 대한 내성이 우수하여 식품 및 제약산업 등에 유용하게 사용할 수 있는 신규한 단백질 가수분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
제1도는 본 발명에서 제조된 신규한 단백질 가수분해효소에 대한 최적 온도조건과 안정성을 나타낸 그래프이고,
제2도는 본 발명에서 제조된 신규한 단백질 가수분해효소의 단백질 구조의 열변성도를 나타낸 그래프이고,
제3도는 본 발명에서 제조된 신규한 단백질 가수분해효소의 처리 온도와 시간에 따른 활성변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 신규주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용하여 고온성이면서 발효 송요시간이 짧고, 특히 유기용매에 대한 내성이 우수하여 식품 및 제약산업 등에 유용하게 사용할 수 있는 신규한 단백질 가수분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.
단백질 가수분해효소는 식품공업, 환경공업, 제약공업 및 피혁가공공업 등 다방면의 산업에 사용되고 있을 뿐 아니라 단백질 가수분해효소는 효소전체 시장에서 70%를차지하는 시장성이 큰 효소이기 때문에 이분야에 대한 연구보고는 많은 편이다. 하지만, 효소가 단순히 가수분해하는 작용에서 근래에 들어와서는 유기용매의 존재하에서 비수계 효소반응 시스템을 이용하는 효소반응이 산업적으로 매우 중요한 것으로 평가 받고 단백질 가수분해효소도 이런 비수계 반응시스템으로 산업적으로 유용한 산물의 생산을 실용화하는 단계에 있기 때무에 유기용매에서 잘 작용하는 효소의 필요성이증가하고 있다.
지금까지 단백질 가수분해효소를 생산하는 미생물로 보고된 것으로는 슈우도모나스(Pseudomonas) 속[(Bever, R. A. 등, J. Bacteriol., 170, 4309-4314(1988)/Brumlik, M. J. 등, Mol. Microbiol., 6,337-344(1992)/Kessler, E. 등, J. Bacteriol. 170, 1215-1219(1988)], 써머스(Thermus)속 [Peek. K. 등, Eur. J. Biochem., 207, 1035-1044(1992)], 스트랩토마이세스(Srteptomyces)속 [Taguchi S. 등, Appl. Envir. Micorb., 59(12), 4338-4341(1993)], 피로코커스(Pyrococcus)속 [Blumentals, I. 등, Appl. Envir. Microb., 56(7), 1992-1998(1990)], 스태필로코커스(Staphylococcus)속 [Teufel, P. 등, Bacteriology, 175(13), 4218-4224(1993)] 등이 보고되고 있고, 단백질 가수분해 효소를 탐색하여 특허화한 예로는 스트립토마이세스 속(일본특허출원 91-003169. 1991). 락토바실러스(Lactobacillus)속(유럽특허출원 91-038622. 1991), 아스퍼질루스(Aspergillus)속(일본특허출원 91-12787. 1991). 호알칼리성 스트랩토마이세스 속(한국특허공고 제90-3924호, 1990) 등이 있다. 하지만, 보고되고 있는 단백질 가수분해효소는 주로 정반응에 이용한 가수분해작용을 이용하여 산업적 제제로 사용되었기 때문에 현대사회에서 산업적 제제로 사용하는 비수계 효소반응 시스템에서는 응용성의 한계를 가진다.
본 발명자들은 이점에서 착안하여 효소의 역반응을 활용하기 위해서 비수계 효소 시스템에서 시용되는 유기용매에서 효소의 활성이 잘 유지되는 신규효소의 개발의 필요성을 절감하고 또한, 이와 같은 비수계에서 반응하는 단백질 가수분해효소는 반응시 가열할 것을 고려하여 내열성인 동시에 유기용매에 내성을 가지고 반응 후 부반응이 일어나지 않는 에스터레이제(Esterase)의 역가가 없는 메탈 단백질 가수분해효소(Metalloprotease)가 적합하다는 판단으로상기와 같은 특성을 가지는 단백질 가수분해효소를 개발하게 되었다.
또한, 지금까지의 단백질 가수분해효소는 발효조를 이용해서 생산할 경우 보통 곰팡이의 경우 3~5일 세균의 경우는 30~48시간 소요되어서 비교적 생산단가가 높은단점을 갖는다. 이런 단점을 극복하는 차원에서 본 발명자들은 고온성 효소이면서 유기용매에 내성이 강하고 발효하여 생산하는데 소요되는 시간이 짧은 신규기능을 갖은 단백질 가수분해효소를 선발하기 위해서 전국의 토양을 시료로 하여 열에 안정하고, 발효시간이 짧고, 유기용매 존재하에서 내성이 강한 단백질 가수분해효소를 생산하는 미생물을 발견하고 이 미생물이 생산하는 단백질 가수분해효소를 분리 정제하여 특성을 조사한 결과, 상기 기존 단백질 가수분해효소가 갖는 제반 문제점을 해결할 수 있어서 본 발며을 완성하였다.
본 발명은 신규주 슈우도모나스 속 NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용하여 고온성이면서 유기용매에 대한 내성이 우수한 신규한 단백질 가수분해효소를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 토양에서 분리된 신규주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리펩톤, 효모 추출물, 소고기 추출물, 글리세롤, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O 및 NaCl이 포함된 배지를 pH 6재지 8로 조정한 후 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)을 접종하고 35~40℃에서 6시간 배양한 액을 종자로 하여 수용성 녹말, 휘톤펩톤(Phytonpepton), K2HPO4, KH2PO4, MgSO4·7H2O 및 NaCl을 포함하는 배지에서 50℃에서 15시간 발효시켜 제조하는 것을 특징으로하는 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법을 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 토양에서 분리된 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)과 이를 이용하여 제조한 단백질 가수분해효소 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에서 선발된 신규 단백질 가수분해효소를 생산하는 신균주의 미생물학적 특성은 다음과 같다.
1) 형태학적 특성
최적 배지조건에서 배양한 후 그램염색을 실시한 결과 전형적인 그램 양성균임을 확인할 수 있었고, 고체배지상에서 청색의 색소를 생산할 뿐 아니라, 전자현미경을 이용해서 형태를 관찰한 결과 간균(rod type) 형태이고, 운동성을 가지며 프라제라(Flagella) 수가 한개를 가지면서 자외선의 존재하에서 형광을 발생함을 알 수 있었다. 이런 형태적 특성은 슈우도모나스(Pseudomonas) 속이 공통적을 가지는 특성임을 알 수 있었다.
2) 생리학적 특성
분리된 미생물의 생리학적 특성은 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 베타갈락 토시다아제 및 베타글루코시 다아제를 생산하지 못하고, 유레아분해력, 인돌생산, 황화수소의 생산능이 없으며, 카타라아제가 있어서 과산화수소를 분해할 수 있으며 아세토인을 생산하지 못하는 특성을 보아 브리피-테스트(VP-test)에 음성으로 나타날 뿐 아니라, 나이트레이트(Nitrate)에서 나이트리트(Nitrite)로 환원하고 또한 나이트리트를 질소로 환원할 수 있는 특성을 가졌다. 이와 같은 생리적 특성은 슈우도모나스 속이 갖는 일반적인 특성이기 때문에 분리된 신규 미생물은 슈우도모나스 속임을 알았다.
[표1] 분리된 미생물 슈우도모나스 속 NS-83이 갖는 생리적 특성
3) 당이용성 시험
분리된 미생물을 탄소원으로 당의 종류를 달리하여 산이나 가스(Gas)의 생성유무를 판단하는 발효/산화(Fermentation/Oxidation)시험, 당을 이용해서 균체의 생육여부를 보고 판단하는 동화(Assimilation)시험을 행한 결과 다음 표 2에 나타낸 바와 같이 글루코오즈의 경우만 산화시키고 다른 시험당은 발효 또는 산화하는 능력이 없었다. 하지만 동화하는 당의 종류를 상당히 많은 것으로 나타났다.
이와 같은 결과는 슈우도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)가 가지는 특성과 일치한다.
[표 2] 분리된 미생물 슈우도모나스 속 NS-83의 당이용성
4)분리된 미생물의 세포벽 지방산 조성
분리된 미생물의 세포벽을 분리하여 지방산의 유형별 분석을 한 결과를 다음 표 3에 나타내었고, 이 결과를 균종류에 따라 세포벽 지방산의 프로파일(profile) 준비된 미디시스템[Microbial Identification System, Clin. Microbiol. Rev. 5(3), 302-327(1992)]에서 조사한 결과 분리된 미생물은 슈우도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 속하는 균주임을 알았다.
[표 3] 분리된 미생물 슈우도모나스 속 NS-83의 세포벽 지방산 조성
5)분리된 미생물의 동정 및 명명
분리된 미생물을 형태학적, 당이용성, 생리학적 특성과 세포벽 지방산 성분의 분석결과 슈우도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 속하는 균주와 유사한 것을 알았지만, 본 발명에서 기술한 유기용매에 내성을 갖고, 열에 해해서 안정할 뿐만 아니라 에스터레이즈(Esterase)의 역가가 없는 신규 단백질 가수분해효소를 생산하는 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) 미생물이기 때문에 본 발명의 균주를 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83이라 명명하고 1994년 3월 18일부로 한국과하기술연구원 부설 유전공학 연구소의 유전자 은행에 기탁하여 수탁번호 KCTC 8500P를 부여받았다.
또한 균주를 동정하기 위한 모든 실험방법과 동정기준은 버지스 매뉴얼[Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci, Bergey's Manual of systematic Bacteriology Vol. 1, 140-199(1986)]을 사용하였다.
본 발명에서 신규 슈우도모나스 NS-83(KCTC 8600P)의 배양배지로는 폴리펩톤 1중량%, 효모 추출물 05.중량%, 소고기 추출물 0.2중량%,글리세롤 0.2중량%, KH2PO40.2중량%, K2HPO40.2중량%, MgSO4·7H2O 0.01중량% 및 NaCl 0.3중량%가 포함된 배지를 pH 6~8, 특히 7.2로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 사용한다.
여기서 상기균주를 접종하고 37℃에서 플라스크로 6시간 종배양한 액을 종자로 하여 수용성 녹말(Soluble starch) 1중량%, 휘톤펩톤(Phytonpepton) 0.5중량%, K2HPO40.2중량%, KH2PO40.2중량%, MgSO4·7H2O 0.01중량% 및 NaCl 0.3중량%의 조성을 갖는 효소생산용 배지를 사용하여 50리터의 용량 발효조에서 공기 유입량 1vvm, 교반속도 300rpm으로 50℃에서 15시간 발효시켜 신규한 단백질 가수분해효소를 제조한다.
이와 같이 제조된 본 발명의 신규한 단백질 가수분해효소는 후기 실시예에 구체적으로 나타내었으며 그 주요특성은 다음과 같다.
1. 작용 : 단백질 가수분해
2. 분자량 : 32,000 Dalton
3. 최적 pH : 8.0
4. 안정 pH 범위 : 4~12
5. 최적온도 : 60℃
6. 열에 대한 안정성 : 65℃에서 30분간 처리시에도 85%의 효소활성이 잔존
프리테아제 역가는 헤마스텐 카제일을 기질로 사용해서 55℃에서 측정하였다. 일정 비율로 희석된 효소액 0.5ml에 기질 3ml을 넣고 55℃에서 30분간 반응시킨 후, 티시에이(TCAS) 용액 3.2ml을 가해 30℃에서 20분간 방치한 다음 여과하여 275nm에서 흡광도를 측정하여 효소 역가를 측정하였다.
또한, 상기에서 얻어진 신규주가 접종된 효소생산용 배양액을 원심분리하고 배양상등액을 30~80% 암모늄설페이트 처리 및 탈염과정을 거쳐 페닐-세파로우즈 컬럼과 DEAE-세파로우즈 컬럼, 그리고 세파크릴 S-200 컬럼을 사용하여 효소를 순수 분리정제하여 엠버라이트 XAD-7 수지에 흡착시켜 고정화 효소로 한다. 또한 이 고정화 효소를 이용하여 아스파탐의 중간물질인 벤질 엘 아스팔틱 페닐알라닌 메틸에스트(BZ-L-Asp-L-Phe-OMe)의 에스테르 결합을 끊어주기 않기 때문에 고수율로 아스파탐을 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 신균주에 의해 제조된 신규한 단백질 가수분해효소는 열에 안정하고, 발효 시간이 짧으며 유기용매 존재하에서 내성이 강하여 기존의 단백질 가수분해효소의 문제점을 해결할 수 있어 식품공업, 환경공업, 제약공업 또는 피혁가공공업 등 다방면의 산업에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같은 바 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
신균주 단백질 가수분해효소의 생산
신규 슈우도모나스 NS-83(KCTC 8600P)의 효소생산배지로는 폴리펩톤(polypepton) 1중량%, 효모 추출물 0.5중량%, 소고기 추출물 0.2중량%, 글리세롤(Glycerol) 0.2중량%, KH2PO40.2중량%, K2HPO40.2중량%, MgSO4·7H2O 0.01중량% 및 NaCl 0.3중량%가 포함된 배지를 pH 7.2로 조정한 후 121℃ 15분간 멸균한 후 상기 신규 균주를 접종한 후 37℃에서 플라스크로 6시간 종배양한 액을 종자로 하여 수용성 녹말(Soluble starch) 1중량%, 휘톤펩톤(Phytonpepton) 0.5중량%, K2HPO40.2중량%, KH2PO40.2중량%, MgSO4·7H2O 0.01중량% 및 NaCl 0.3중량%의 조성을 갖는 효소생산용 배지를 사용하여 50리터의 용량 발효조(Fermentor)를 사용하여 공기유입량 1vvm, 교반속도 300rpm으로 50℃에서 15시간 발효하였을때, 최대 생산량 12,000~15,000IU/ml의 효소를 얻을 수 있었다.
실시예 2
신규 단백질 가수분해효소의 특성
상기 실시예 1에서 얻어진 신규 미생물의 배양액 12,000g을 15분간 원심분리한 후 배양상등액을 30~80% 암모늄설페이트 처리 및 탈염, DEAE-Sepharose CL-6B column, Sephacryl S-200column, (이상, Sigma사 제품, 미국)을 사용하여 신규 단배질 가수분해효소를 순수 분리한 후 아래의 실험예에 따라서 신규 단백질 가수분해효소의 특성을 조사하였다.
실험예 1
효소의 분자량 및 등전점(pl)의 결정
순수 분리된 효소를 표준단백질과 함께 SDS-PAGE 전기영동을 행한 결과 분자량이 32,000Dalton 정도로 나타났다. 등전점은 아이소일렉트릭 포커싱(Isoelectric forcusing)장치를 이용하여 역시 표준단백질을 비교하여 측정한 결과 등전점이 5.9로 나타나서 중성의 단백질로 나타났다.
실험예 2
효소의 특성시험
순수 분리된 효소의 특성중 열특성을 조사한 결과 60℃에서 최적 온도임을 알 수 있었고, 열에 대한 안정성도 65℃에서 30분간 처리하였을때 85%이 잔존 효소활성을 갖는 특성을 같고 단백질의 구조도 50℃에서 70℃까지 완만한 속도로 변성되는 성질로 보아 유기화학반응에 사용이 충분히 가능하다(첨부도면 제1,2,3도 참조). pH의 안정성도 pH 4~12 사이에서 광범위하게 안정되게 나타나서 산알칼리 조건하에서 비수계 반응이 가능하다. 최적 작용 pH는 pH 8.0으로나타나서 알칼리 상태에서 잘 작용하는 특성을 지니고 있다. 효소유형을 파악하기 위해서 저해제를 사용하여 저해제에 따라 효소활성을 조사한 결과 세린단백질 가수분해효소(Serine protease)의 특정적이 PMSF(Phenyl Methyl Sulfonny Fluride) 및 아포로티닌(Aprotinin)에는 전혀 효소저해를 받지 않는 반며, 메틸단백질 가수분해효소(Metalloprotease)의 저해제인 페난스로린(1,10-Phenanthroli8ne), 이디티에이(EDTA)에 강하게 저해되는 것으로 보아 메탈단백질 가수분해효소임을 확정지을 수 있었다. 효소단백질의 신규성 여부를 조사하기 위해서 완전히 정제된 효소단백질의 엔-터미날(N-terminal)결정을 한 결과 Alg-Glu-Ala-Gly-Pro-Gly-Gly-Asn-Gln-Lys-Ile-Gly-Lys-Tyr-Thr-Tyr-Gly로 나타났고 이 결과의 균주동정 결과를 이용해서 검색한 결과 기존에 보고된 슈우도모나스가 생산하는 엘라스타아제(Elastase)[Bever, R. A. 등, J. Bacterion., 170, 4309-4314(1988)]와 유사하지만 구성아미노산을 조사한 결과 엘라스타아제는 Gls 16중량%, Ala 26중량%, Met 9중량%, Trr 22 중량%로 나타나는데 비해서 본 발명의 신규단백질 가수분해효소는 Glx 25중량%, Ala 33중량%, Met 3중량%, Tyr 6중량로 나타나서 현격한 차이를 보이기 때문에 기존에 보고되고 있는 엘라스타아제와는 다른 효소단백질임을 알 수 있다. 또한 효소역가적인 면에서도 본 발명의 효소는 에라스틴(Elastin)에 대한 활성이 미약한 것으로 보아 신규효소임을 입증할 수 있었다.
실시예 3
발명효소의 유기용매의 내성시험
발명효소와 기존의 효소가 유기용매의 존재하에서 효소활성이 미치는 영향을 조사하기 위해서 물을 용매로 사용하여 효소활성을 측정한 결과 다음 표 4에서 보는 바와 같이 기존효소에 유기용매활성이 강하게 나타남을 알 수 있었다.
[표 4] 유기용매에 대한 내성실험
실시예 4
신규효소를 이용한 아스파탐의 제조
신규효소를 상기 실시예 1에 의해서 대량 생산하여 상기 실시예 2에 의해서 분리 정제한 후에 엠버라이트(Amberlite) XAD-7에 흡착시킨 고정화효소를 이용하여 벤질 아스파틱산(BZ-L-Asp)와 페닐알라닌 메틸에스트(L-Phe-OMe)를 반응시켰을때 아스파탐(Aspartam)의 중간물질인 벤질 엘 아스팔틱 페닐알라니 메틸에스트(Bz-L-Asp-L-Phe-OMe)를 합성할 수 있었고 신규효소가 에스터레이제(Esterase)의 역가가 전혀 없어서 페닐알라닌 메틸에스트(L-Phe-OMe)의 에스테르(Ester) 결합을 끊어주지 않기 때문에 생산 수율이 10% 이상 증가하였다.
Claims (5)
- 토양에서 분리된 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P).
- 폴리펩톤, 효모 추출물, 소고기 추출물, 글리세롤, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4·7H2O 및 NaCl이 포함된 배지를 pH 6 내지 8로 조정한 후 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)을 접종하고 3~40℃에서 6시간 배양한 액을 종자로 하여 수용성 녹말, 휘톤펩톤(Phytonpe-pton), K2HPO4, KH2PO4, MgSO4·7H2O 및 NaCl을 포함하는 배지에서 50℃에서 15시간 발효시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법.
- 제2항의 방법에 의해 제조된 다음과 같은 특성을 갖는 신규한 단백질 가수분해효소.분자량 : 32,000 Dalton최적 pH : 8.0안정 pH : 4~12최적온도 : 60℃
- 제3항의 단백질 가수분해효소를 엠버라이트 XAD-7 수지에 흡착시킨 고정화 효소.
- 제4항의 고정화 효소를 이용하여 아스파탐을 제조하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1019940010758A KR0127100B1 (ko) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1019940010758A KR0127100B1 (ko) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법 |
Publications (2)
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|---|---|
| KR950032610A KR950032610A (ko) | 1995-12-22 |
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ID=19383239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019940010758A KR0127100B1 (ko) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | 신균주 슈우도모나스 속(Pseudomonas sp.) NS-83(KCTC 8600P)와 이를 이용한 신규한 단백질 가수분해효소의 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR0127100B1 (ko) |
-
1994
- 1994-05-17 KR KR1019940010758A patent/KR0127100B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR950032610A (ko) | 1995-12-22 |
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