JPS6322188A - 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は食品、医薬、飼料及びその他の工業原料として
有用な光学活性アミノ酸の製造に広く利用可能なＬ−ア
ミノアシラーゼに関するものである。

従来の技術 Ｎ−アシル−し−アミノ酸よりＬ−アミノ酸を与える反
応を触媒する酵素として、動物由来のものでは豚腎アミ
ノアシラーゼ［メソッヅ・イン・エングー１’−Ｅロジ
ー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第
２巻、第１０９頁（１９５５年）参照］、また微生物由
来のものとしてはラクトバシルス・アラビノ−サス（Ｌ
ａＣｔＯｂａＣｉｌｌｕＳ　ａｒａｂｉｎｏｓｕｓ）　
［Ｐａｒｋ、Ｒ，Ｗ、ｅｔ　ａｌ、　：ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
第２３５巻、第３１９３頁（１９６０年）参照］、コリ
ネバクテリウム（Ｃ０ｒｌ／ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｌｌ
）　［奥田等：特公昭４９−１３９８９号公報参照］、
参照へルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びリゾー
ブス（Ｒｈ１ＺＯｐｕＳ）ファミリー［千畑等ニブレチ
ン・オブ・ジ・アグリカルチュラル・ケミカル・ソサエ
ティ・オブ・ジャパン（Ｂｕｌｌｅｔｉｎｏｆ　ｔｈｅ
　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ　ｏｆＪａｐａｎ　）　２１巻、第５号、第
３０４〜第３０７頁（１９５７年）　：　５ｏｌｏｄｏ
ｖｎｉｋｏｒａ、Ｎ　、Ｉ　、　ｅｔ　ａｌ：Ｉｎ５ｔ
。

Ｂｉｏｓｉｎ、Ｂｅ１ｋｏｖｙｋｈ　Ｖｅｓｈｃｈｅｓ
ｔｏ第１巻、第１４５頁〜１５１頁（１９７２年）参照
コ等の菌体内に広く分布することが知られている。しか
し主に工業的に利用されているのは、コスト上の問題に
より、糸状菌由来のアミノアシラーゼに限られている。

現在市販されているアミノアシラーゼとしては、アシラ
ーゼアマノ（大野製薬製）、アシラーゼ東京化成（東京
化成製）及びアシラーゼ■（マイルス・ラボラトリ−製
）が知られている。

発明が解決しようとする問題点 公知の糸状菌アミノアシラーゼ、例えばアシラーゼアマ
ノなどは、通常のアミノ酸、例えばＬ−メチオニン、し
−フェニルアラニンなどのＮ−アシル誘導体について広
く加水分解することが知られているが、特殊な合成アミ
ノ酸、例えばＬ−スレオ−Ｎ−アセチル−３−（３，４
−ジベンジルオキシフェニル）セリンなどには作用せず
、パーキンソン氏病の治療薬の合成中間体として有用な
し一スレオー３−（３，４−ジベンジルオキシフェニル
）セリンを得ることはできない。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、公知のし一７ミノアシラーゼよりも基質
特異性の広いＬ−アミノアシラーゼを得るべく公知の保
存菌株も含めて、鋭意探索を続けたところ、放線菌が、
従来のＬ−アミノアシラーゼよりも広い基質特異性を有
するＬ−アミノアシラーゼＳ　及びし−アミノアシラー
ゼＳ２を産生することを見い出し本発明を完成した。

作用 本発明は下記の理化学的性状即ち、 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸に作用してＬ−アミノ酸を与
えるＬ−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に加え、非天
然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に対しても作用する
。一方、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸、ＤＬ−Ｎ−アセチ
ル−α−メチル−ベンジルアミン及びＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンには作用しない。

（２）安定性 温度：５０℃では殆んど活性を保持し、６０℃でもなお
僅かに活性が残存する。

（ＰＨ７．０１時間放置） ｐｉ−１：ＰＨ７．０〜９．０で最も安定であり、ｐＨ
１０，０附近でも比較的安定である。但しｐＨ４，０以
下では失活する。（５℃　２４時間放置）（３）反応性 温度：５０℃まで直線的に活性を増加し６０℃以上では
、急激に反応性を失う。

ｐＨ：ｐＨ６，５〜９．５で反応性が高く、反応の至適
ｐＨはＰＨ７．５〜８．５附近である。

（４）分子量 ｓｏ、　ｏｏｏ〜６０，０００（ゲル濾過法）（５）等
電点 ｐｉ−７，００〜７．７０ （６）ディスク電気泳動 Ｒｍ　ＢＰＢ＝　０．１２５〜０．１６７（７）金属イ
オンの影響 Ｆｅ＋“、Ｎｉ　　、Ａｑ　　、Ｈｇ　、及びｃｕ”＋
＋＋＋ によって強く阻害される。またＣＯ＋１よって斌活化さ
れる。

（８）阻害剤 ｐ−クロル水銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード
酢酸では阻害されない。また、エチレンジアミン四酢ｌ
！２２ナトリウムにより緩和に阻害される。

を有する放射線菌由来のＬ−アミノアシラーゼＳ１及び
下記の理化学的性状、即ち、 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アシル−し−アミノ酸に作用してし−アミノ酸を与
えるＬ−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
く、天然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に加え、非天
然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に対しても作用する
。−万Ｎ−アシルーＤ−アミノ酸、ＤＬ−Ｎ−７セチル
ーα−メチル−ベンジルアミン及びＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンには作用しない。

（２）安定性 温度＝５０℃まで失活しないが、６０℃では８０％の活
性を保持し、さらに７０℃においても２０％以上の活性
が残存する。

（ＰＨ７．０１０分間放置） ｐ）−１：ｐＨ８，５〜１０．０で最も安定であり、ｐ
Ｈ３，５及びｐＨ１１，０附近でも５０％の活性が残存
する。（温度５℃　２４時間放置） （３）反応性 温度＝６０℃までは直線的に相対活性は増加し、７０℃
でもなお１０％以上の反応性を有する。

ｐＨ：ＰＨ７．０〜１０．０で反応性が高く、反応の至
適ｐＨはｐＨ８，０〜９．０附近である。

（４）分子ａ ｓｏ、　ｏｏｏ〜６０，０００　（ゲル濾過法）（５）
等電点 ｐＩ＝６．３８〜７．４２ （６）ディスク電気泳動 ＲＩＢ　ＢＰＢ＝０．１８０〜０．２８０（７）金属イ
オンの影響 Ｃｕ　＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ　　、）（（＋　　、Ｆｅ　
　１＋＋ Ｎ、＋＋、及びＡ（Ｊ　　によって強く阻害される。

（８）阻害剤 ｐ−クロル水銀安息香酸、Ｌ−システィン及びモノヨー
ド酢酸により強く阻害を受けるが、エチレンジアミン四
酢酸２ナトリウムでは殆んど阻害されない。

を有する放射線菌由来のＬ−アミノアシラーゼＳ２に関
するものである。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

化学的性状を以下に記載する。

（１）基質特異性 各種アミノ酸のＮ−アシル誘導体を基質としてＬ−アミ
ノアシラーゼＳ１酵素活性を測定した。

Ｌ−Ｎ−アセチル−メチオニンを１００とした相対活性
を第１表に示す。

以下余白 第１表　　基質特異性 第１表より本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１は特殊な
合成アミノ酸を含む広い範囲のＬ−アミノ酸のＮ−アシ
ル誘導体に作用し、公知のＬ−アミノアシラーゼより基
質特異性が広いものである。

通常、アシラーゼはアシル基としてアセチル基、クロロ
アセチル基などが好ましくベンゾイル基などは加水分解
しない場合が多い。一部の細菌の生産するアシラーゼは
ベンゾイル基に選択的に作用するが、アセチル基などは
加水分解されない。これに対し、本発明のＬ−アミノア
シラーゼＳ１はアシル基に対しても広い基質特異性を示
し、アセチル基、クロロアセチル基などが最も好ましい
が、ベンゾイル基であっても簡単に加水分解する。

（２）熱安定性 本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ１）のリン酸カ
リウム緩衝溶液（ＰＨ７．０＞を各温度で１時間処理し
た後、残存活性を測定した。なお、基質としてＬ−スレ
オ−Ｎ−アセチル−３−（３゜４−ジベンジルオキシフ
ェニル）セリン、（以下Ｎ−Ａｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳと略
す）を用い、３１℃にて１時間反応させ、ニンヒドリン
法により遊離したし一スレオー３−（３，４−ジベンジ
ルオキシフェニル）セリン（以下ＤＢ−ＤＯＰＳと略す
）を測定することにより酵素活性を定めた。測定結果を
第１図に示す様にＰＨ７．０，６０℃の処理で９５％以
上が失活するが、５０℃以下では全く安定である。

（３）反応温度 本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ１）をリン酸カ
リウム緩衝溶液（ＰＨ７．０）中で、基質であるＮ−Ａ
Ｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳと１時間台種の温度条件で反応させ
、相対活性を上記の方法より測定した。その結果を第２
図に示す。アシラーゼ同様、失活限界であるほぼ５０℃
まで反応性は直線的の上昇するが、これ以上の温度では
急激に失活する。

（４）ｐＨ安定性 本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ１）液を各ｐＨ
条件下で５℃、２４時間放置した。ついで各々をＰＨ７
．０に調整した後、基質であるＮ　−Ａ　Ｃ−ＤＢ−Ｄ
ＯＰＳと３７℃、１時間反応させ、上記の方法により残
存活性を測定した。その結果を第３図に示す。

本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１は弱塩基性条件下す
なわちＰＨ７．０〜９．０で最も安定であり、ｐＨ１０
，０附近においても比較的安定である。

（５）反応りＨ 本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ１）を３７℃で
種々のｐＨ条件下、基質であるＮ−ＡＣ−ＤＢ−ＤＯＰ
Ｓと１時間反応させ、上記の方法により相対活性を測定
した。その結果を第４図に示す。

本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１はＰＨ７．０〜１０
．０で反応性が高く、至適ｐＨは１．５〜８，５附近で
ある。

（６）分子量 セファデックスＧ−１００（ファルマシア社製）のゲル
濾過法により、本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ
１）の分子量を測定した。本酸素のＬ−アミノアシラー
ゼＳ１の分子量はｓｏ、　ｏｏｏ〜６゜、０００ダルト
ンの範囲内にある。

なお、標準タンパク標品としてはチトクロームＣ（分子
量１２，５００）　、カーボニックアンヒドラーゼ（分
子ｆｆ１２９，０００）　、鶏卵アルブミン（分子口４
５．０００）　、及び牛血清アルブミン（分子口６７、
０００）を使用した。

（７）等電点 アンフオラインＰＡＧ　　プレート（ＬＫＢ社製）を用
いて４℃、２時間ａｏｏｖを通電し、本発明のＬ−７ミ
ノアシラーゼＳ１の等電点を測定した。−般に公知のア
ミノアシラーゼが酸性タンパクであることに対し本酵素
（Ｌ−アミノアシラーゼＳ１）の等電点（ｐｉ）は７．
００〜７．７０の範囲内にあり、し−アミノアシラーゼ
Ｓ１が塩基性タンパクであることを示す。

（８）ディスク電気泳動 ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８゜９）のディ
スク電気泳動測定を行い、本酵素（Ｌ−アミノアシラー
ゼＳ１）のブロモフェノールブルー（以下ＢＰＢと略す
）に対する相対移動度を測定した。

し−７ミノアシラーゼＳ１のＢＰＢに対する相対移動度
（Ｒｎ　ＢＰＢ）は０．１２５〜０．１６７である。

（９）金属イオンの影響 種々の金属塩を終濃度１ｍＨを含む０．１Ｈベロナール
緩衝液中に本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１を添加し
、３７℃、時間反応させた。その後、基質であるＮ−Ａ
ｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳと３７℃、１時間反応させ、上記の
方法により相対活性を測定した。

なお、金属無添加のものの活性を１００％とした。その
測定結果を第２表に示す。

以下余白 第２表　　　　金属イオンの影響 アミノアシラーゼの多くと同様にＣＯ＋＋添加によ＋＋ り賦活され、Ｎｉ　　、Ｆｅ　　、Ａ（Ｊ　　、Ｈｇ　
ｚ及びＣｕ＋“添加により強く活性が阻害される。

（１０）阻害剤の影響 本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ１）を各種阻害
剤とともに３７℃、１時間放置し、その後基質であるＮ
−Ａｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳと３７℃、１時間反応させ、上
記の方法によりその残存活性を測定した。その結果を第
３表に示す。

ｐ−クロル水銀安息香酸　　　１ｎ）ｌ　　　　２（％
）モノヨード酸８　　　　　　　１ｍＭ　　　９４エチ
レンジアミン四酢酸 ２ナトリウム　　　　　　　　１ｍＭ　　　７２β−メ
ルカプトエタノール　　１ｍＭ　　　７６本発明のＬ−
アミノアシラーゼＳ１はＳＨ阻害剤であるｐ−クロル水
銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード酢酸では阻害
されない。またキレート剤であるエチレンジアミン四酢
酸２ナトリウムにより緩和な阻害を受ける。

次に、Ｌ−アミノアシラーゼＳ２の理化学的性状を以下
に記載する。

（１）基質特異性 各種アミノ酸のＮ−アシル誘導体を基質としてＬ−アミ
ノアシラーゼＳ２の酵素活性を測定した。

Ｌ−Ｎ−アセチル−メチオニンを１００とした相対活性
を第４表に示す。

以下余白 第４表　　基質特異性 第４表より、本発明のＬ−アミノアシラーゼ＄２は特殊
な合成アミノ酸を含む広い範囲のＬ−アミノ酸のＮ−ア
シル誘導体に作用する。一方、通常、アシラーゼはＬ−
Ｎ−アシル−アミノ酸のアシル基としてアセチル基、ク
ロロアセチル基などが好ましくベンゾイル基などは加水
分解しない場合が多い。一部の細菌の生産するアシラー
ゼはベンゾイル基に選択的に作用するが、アセチル基な
どは加水分解されない。これに対し、本発明のＬ−アミ
ノアシラーゼＳ２はアシル基に対しても広い基質特異性
を示し、アセチル基、クロロアセチル基などが最も好ま
しいが、ベンゾイル基であっても簡単に加水分解する。

（８）熱安定性 本発明の酵素のくし一７ミノアシラーゼＳ２〉のリン酸
カリウム緩衝溶液（ＰＨ７．０）を各温度で１０分間処
理した後、残存活性を測定した。

なお、基質としてＮ−Ａｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳを用い、３
７℃にて１時間反応させ、ニンヒドリン法により遊離し
たＤＢ−ＤＯＰＳを測定することにより酵素活性を定め
た。測定結果を第５図に示す様に６０℃での処理で２０
％、７０℃で７０％以上が失活するが、５０℃ではまっ
たく安定である。

（３）反応温度 本発明の酵素（Ｌ−７ミノアシラーゼＳ２）をリン酸カ
リウム緩衝液（ＰＨ７．０）の中で、基質であるＮ−Ａ
ｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳと１０分間各種の温度条件下で反応
させ、相対活性を上記方法により測定した。その結果を
第６図に示す。この結果によれば反応性はほぼ６０℃ま
ではほぼ直線的に上昇し、７０℃でも急激には失活する
ことはない。

（４）ｐＨ安定性 本発明の酵素（し−アミノアシラーゼＳ２）液を各種ｐ
Ｈ条件下で５℃、２４時間放置した。ついで各々をＰＨ
７．０に調整した後、基質であるＮ−ＡＣ−ＤＢ−ＤＯ
ＰＳと３７℃、１時間反応させ、上記方法により残存活
性を測定した。その結果を第７図に示す。

本発明のし一７ミノアシラーゼＳ２は弱塩基性条件下す
なわちｐＨ８，０〜１０．０で最も安定である。

（５）反応１）Ｈ 本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ２）を３７℃で
種々のｐＨ条件下、基質であるＮ−ＡＣ−ＤＢ−ＤＯＰ
Ｓと１時間反応させ、上記の方法により相対活性を測定
した。その結果を第８図に示す。

本発明のＬ−アミノアシラーゼ Ｓ２はＰＨ７．０〜１０．０で反応性が高く、至適ｐＨ
は８．０〜９．０附近である。

（６）分子量 セファデックスＧ−１００（ファルマシア社製）のゲル
濾過法により、本発明の酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ
２）の分子量を測定した。その結果、本発明のＬ−アミ
ノアシラーゼＳ２の分子量は５０１０００〜ａｏ、　ｏ
ｏｏダルトンの範囲内にある。

なお、標準タンパク標品としてはチトクロームＣ（分子
１１２，５００）　、カーボニックアンヒドラーゼ（分
子ｆｆ１２９，０００）　、鶏卵アルブミン（分子口４
５．０００）及び生血清アルブミン（分子口６７，００
０）を使用した。

（７）等電点 アンフオラインＰＡＧ　　プレート（ＬＫＢ社製）を用
いて４℃、２時間８００ｖを通電し、本発明のＬ−アミ
ノアシラーゼＳ２の等電点を測定した。

本酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ２）の等電点（ｐｌ）
は６．３８〜７．４２の範囲にある。

（８）ディスク電気泳動 １．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８，９）のディ
スク電気泳動を行い、本酵素（Ｌ−アミノアシラーゼＳ
２）のＢＰＢに対する相対移動度を測定した。Ｌ−アミ
ノアシラーゼＳ２のＢＰＢに対する相対移動度（Ｒｍ　
ＢＰＢ）は０．１８０〜０．２８０である。

（９）金属イオンの影響 種々の金凡塩を終濃度１　＋ｎＨを含むＯ，１Ｍベロナ
ール緩衝液中に本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ２を添
加し、３７℃、１時間反応させた。その後、基質である
Ｎ−ＡＣ−ＤＢ−ＤＯＰＳと３７℃、１時間反応させ、
上記の方法により相対活性を測定した。なお、金属塩無
添加のものの活性を１００ｘとした。その測定結果を第
５表に示す。

Ａａ＋の金属イオンにより阻害される。

（１０）阻害剤の影響 本発明の酊素（し−アミノアシラーゼＳ２）を各種阻害
剤とともに３７℃、１時間放置し、その後基質であるＮ
　　Ａｃ　　ＤＢ−ＤＯＰＳと３７℃、１時間反応させ
、上記の方法によりその残存活性を測定した。その結果
を第６表に示す。

ｐ−クロル水銀安息香酸　　１ｍＬ　　　　Ｏし一シス
ティン　　　　　　１ｍＨ１１モノヨード酢Ｆｉ　　　
　　　　１１１１８　　　　３エチレンジアミン四酢酸 ２ナトリウム　　　　　　　１ｍＮ　　　　９２本発明
のＬ−アミノアシラーゼＳ２はＳＨ阻害剤であるｐ−ク
ロル水銀安息香酸及びモノヨード酢酸により強く阻害さ
れるが、キレート剤である工、チレンジアミン四酢酸２
ナトリウムでは殆ど阻害されない。また、ＳＨ基を有す
るアミノ酸であるシスティンによっても、本発明のＬ−
アミノアシラーゼＳ２は阻害される。

更に公知のＬ−アミノアシラーゼ及び本発明のＬ−アミ
ノアシラーゼ類の基質特異性及び熱安定性に関して比較
した。

（Ａ）基質特異性 本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ　　、Ｌ−アミノアシ
ラーゼ＄２及び公知のＬ−アミノアシラーゼの基質特異
性について測定し、その結果を第７表に示した。

以下余白 第７表　基質特異性の比較 （注１）＋２作用する 一：作用しない 本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ　　、Ｌ−アミノアシ
ラーゼ＄２と市販のＬ−アミノアシラーゼの作用をＬ−
Ｎ−アセチル−メチオニン、Ｄ−Ｎ−アセチル−メチオ
ニン及びＬ−スレオ−Ｎ−アセチル−３−（３，４−ジ
ベンジルオキシフェニル）セリンを基質として比較した
。用いたＬ−アミノアシラーゼはＬ一体にのみ作用する
が、特殊な基質、すなわち、し−スレオ−Ｎ−アセチル
−３−（３，４−ジベンジルオキシフェニル）セリンに
対しては、本発明の酵素のみしか作用しなかった。

（Ｂ）熱安定性 本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１及びし−アミノアシ
ラーゼＳ２の熱安定性の比較検討を行った。

測定法 各酵素溶液（ＰＨ７．０）　　０．５ｍｌを６０℃で各
所定時間加熱処理し、ついで水冷後基質である０、０２
）４のＮ−Ａｃ−ＤＢ−ＤＯＰＳ溶液０．５ｍｌを加え
、３７℃で１時間放置した。その後ニンヒドリン法によ
りＤＢ−ＤＯＰＳを測定することによりその活性を定め
た。その結果を第９図に示す。

以上の結果より、本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ２は
Ｌ−アミノアシラーゼ＄１以外の公知の７シラーゼ類よ
りも広い基質特異性を備えている。

一方、本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ２は基質特異性
の点でＬ−アミノアシラーゼＳ１とほぼ同等であるが、
熱安定性の面で本発明のし一７ミノアシラーゼＳ２はＬ
−アミノアシラーゼＳ１よりもすぐれている。

本発明において使用するＬ−アミノアシラーゼ産生微生
物としては、本発明のし一７ミノアシラーゼＳ１及びし
−アミノアシラーゼＳ２を生産することができる放線菌
に属する微生物であれば、野生株、変異株、または細胞
融合法、遺伝子操作法、若しくは、その他の遺伝的手法
で誘導される組換え株等いずれも用いることができ、例
えばし−アミノアシラーゼＳ１を生産する能力を有する
微生物の具体例としては、アクチノミセス・アラレオパ
ーティシラーラス（ＡＣｔｉｎｏｌｌｌｙＣｅＳ　ａｕ
ｒｅＯＶｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）　ＩＭＣＳ−０２
３４（ＩＳＰ　　５０８０）（ＦＥＲＭ　Ｐ−７２１６
）ニアクチノミセス・ビカラー（Ａｃ　ｔ　ｉ　ｎｏｍ
ｙｃｅｓ　ｂｉｃｏｌｏｒ）　　ＩＭＣＳ−０２７６（
ＩＳＰ　　５１４０）：ストレプトミセス・プラストマ
イセティクス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｓｅｓ　ｂｌａｓｔ
ｍｙｃｅｔｉｃｓＨＭｃ　　Ｓ−０１８９ＣＩ　ＳＰ　
　５０２９）（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７２１７）　　：スト
レプトミセス・チャルトリウシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｓ）ＩＭＣＳ−０２２６
（ＩＳＰ　　５０８５）　　：ストレプトミセス・フラ
ボペルシクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｌａｖｏ
ｐｅｒｓｉｃｕｓ）　Ｉ　Ｍ　ＣＳ−０２０４（Ｉ　Ｓ
　Ｐ　　５０９３）　　ニアクチノミセス・フラボトリ
シニ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｆｌａｖｏｔｒｉｃｉ
ｎｉ）ＩＭＣＳ−０２１９（ＩＳＰ　　５１５２）　　
：ストレプトパーティシリウム・グリゼオカルネラム（
Ｓｔｒｅｐｔ。

ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕ
ｍ）　　Ｉ　ＭＣＳ−０２３７（ＩＳＰ　　５００４）
　　；ストレプトミセス・ハチジョーエンシス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ）　　
ｒ　ＭＣ３−０２４４（ＩＳＰ　　５１１４）（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−７２１８）　：ストレプトミセス・ハルステ
ディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｌｓｔｅｄｉｉ
　）　ＩＭＣＳ−０１９４（ＩＳＰ　　５０６８）　　
；ストレプトパーティシリウム・ヒロシメンセ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕ＋＋＋　ｈｉｒｏｓｈ
ｉｍｅｎｓｅ）　Ｉ　Ｍ　ＣＳ−＜１１７９（Ｉ　Ｓ　
Ｐ４Ｏ１０）　（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ−７２５２）　；ス
トレプトミセス・テンダニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ｔｅｎｄａｅ）　Ｉ　ＭＣＳ−０１６８（ＩＳＰ　　
５１０１）　：ストレプトミセス・トヨ力エンシス（Ｓ
ｔｒｅｌ）ｔｏｍＶｃｅｓ　ｔＯＶＯｃａｅｎｓｉｓ）
　Ｉ　Ｍ　ＣＳ−０１６３（ｌ　Ｓ　Ｐ　　５０３０）
（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｐ−７２５３）などが好適に使用さ
れる。これらの菌株はすべて文献記載の公知の保存菌で
ある。また、前記の菌株のうち、微工研寄託番号として
Ｆ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ−７２１６、ＦＥＲＭＰ−７２１７、
Ｆ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ−７２１８を付した菌株は昭和５８年
９月５日以来、またＦ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ−７２５２、Ｆ　
Ｅ　ＲＭ　Ｐ−７２５３を付した菌株は昭和５８年９月
２０日以来、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。また、新規な本発明のし一７ミノアシラーゼ
Ｓ２産生能を有する菌の具体例として、例えばストレプ
トバーチシリウム・リモファシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔ
。

ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）
ＭＨ２４０−ＣＰＦ７が挙げられる。　上記のストレプ
トバーチシリウム・リモファシエンス）ｌＨ２４０−Ｃ
ＰＦ７は本発明者らにより茨城県大宮町の土壌より分離
された菌株で、その菌学的性状は、以下に示す通りであ
る。

ストレプトバーチシリウム・リモファシエンスＨＨ２４
０−ＣＰＦ７の菌学的性質 １、形態 ＨＨ２４０−ＣＰＦ７株は、顕微鏡下で、分校した基中
菌糸より輪生技を有する気菌糸を伸長する。また気菌糸
の先端に１０個以上の胞子の連鎖が認められるが、らせ
ん形成は認められない。この胞子の大きさは、０．６Ｘ
　Ｏ，８〜１，４ミクロン位であり、胞子の表面は平滑
である。

２、各種培地における生育状態 （１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）無
色の発育上にうつすらと白色の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
） うす黄茶色［２ｇｃ、　Ｂａｍｂｏｏｌの発育上に、う
つすらと白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められ
ない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５，２７℃培養） うす黄茶色［２１ｅ、Ｈｕｓｔａｒｄｌの発育上に、う
つすらと白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められ
ない。

（４）スターチ・無礪塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４．２
７℃培養） うす黄茶色［２Ｉｅ、　）Ｉｕｓｔａｒｄｌの発育上、
わずかに白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められ
ない。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７．２７℃培養
）うす黄茶色［２１ｅ、Ｈｕｓｔａｒｄｌの発育上に、
白ないし茶色色の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色
味を帯びる程度である。

（６）栄養寒天培地（２７℃培養） 発育はうす黄茶色［２ｎｇ、Ｄｕｌｌ　Ｇｏｌｄｌであ
り、気菌糸を着生せず、溶解性色素はわずかに茶色味を
帯びる程度である。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２，２７
℃培養） 黄茶色［３１ｅ　Ｃｉｎｎａｍｏｎｌの発育上に、黄白
色ないし茶色色の気菌糸を着生する。溶解性色素は茶色
味を帯びる程度である。

（８）オートミール寒天培地＜　ｒｓｐ−培地３．２７
℃培養うす黄茶色［２１ｅ、Ｈｕｓｔａｒｄｌの発育上
に茶色［３ｂａ、Ｐｅａｒｌｌの気菌糸を着生し、溶解
性色素は茶色味を帯びる程度である。

（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）無色
の発育上に、うつすらと白色の気菌糸を着生し、溶解性
色素は認められない。

（１０）スターチ寒天培地（２７℃培養）うす黄茶色［
２ｇｃ、　Ｂａ１ｌｌｂＯＯ］の発育上に、白色の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（１１）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養）無色の発
育上に、わずかに白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。

（１２）セルロース培地（ｉ！ｌｆｆ１片添加合成液、
２７℃培養） 無色の発育上に、うつすらと白色の気菌糸を着生し、溶
解性色素は認められない。

（１３）ゼラチン穿刺培養 １５％の単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、発育は
うす黄茶色であり、気菌糸は着生せず、茶色の溶解性色
素を生産する。

また、グルコース、ペプトン、ゼラチン培地（２７℃培
養）では、発育はうす茶色であり、気菌糸は着生せず、
茶色の溶解性色素を生産する。

（１４）脱脂牛乳（３７℃培養） 発育は無色ないしうす茶色であり、気菌糸は着生ぜず、
溶解性色素はわずかに茶色味を帯びる程度である。

なお、色調の記載について［］内に示す標準はコンテイ
ナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Ｃｏｎｔａ
ｉｎｅｒ　Ｃ０ｒｌ）Ｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｅｒ
ｉｃａ）のカラー・ハーモニイーマニュアル（Ｃｏｌｏ
ｒ　ｈａｒｍｏｎｙ　ｍａｎｎｕａｌ）を用いた。

３、生理学的性質 （１）生育温度範囲 グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース］％、
アスパラギン０゜５％、Ｋ　　ｌ−ｌＰＯ４０，５％、
ひも寒天３．０％ＰＨ７．０）を用い、２０℃、２４℃
、２７℃、３０℃、５０℃の各温度で試験の結果、５０
℃を除いてそのいずれの温度でも発育したが、最適生育
温度は２７℃〜３７℃附近と思われる。

（２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養ニゲルコース・ペプトン・ゼラチン培地２７℃培
養） 単純ゼラチン培地では液化が認められず、グルコース・
ペプトン・ゼラチン培地の場合に、極めて弱い液化が培
養後１４日目頃より始まる。

（３）スターチの加水分解くスターチ・無機塩寒天培地
及びスターチ寒天培地、いずれも２７℃培養）スターチ
・無機塩寒天培地、スターチ寒天培地ともに培養後、７
日目頃よりスターチの氷解性が認められ、その作用は弱
い方である。

（４）脱脂牛乳の凝固及びペプトン化（脱脂牛乳、３７
℃培養） 培養後、５日目頃より凝固が始まり、約２週間で凝固が
完了し、直ちにペプトン化が始まる。その作用は弱い方
である。

（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・１゛−スト
・ブロス、ｌ５Ｐ−培地１　；ペプシン・イースト・鉄
・寒天、ｌ５Ｐ−培地６；チロシン、ｌ５Ｐ−培地７、
いずれも２７℃培養）トリプトン・イースト・ブロス及
びペプトン・イースト・ブロス、ペプトン・イースト・
鉄・寒天培地では陽性であり、チロシン寒天培地では陰
性である。

（６）炭素源の利用性（ブリドハム・ゴトリーブ寒天培
地、ｌ５Ｐ−培地９．２７℃培養）Ｄ−グルコース、Ｄ
−フラクトース、イノシトール及びＤ−マンニトールを
利用して発育し、し−アラビノース、Ｄ−キシロース、
シュクロース、Ｌ−ラムノース及びラフィノースは利用
されない。

（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地、２
７℃培養） 陰性である。

（８）硝酸塩の還元反応（０，１％硝酸カリ含有ペプト
ン水、ｌ５Ｐ−培地８，２７℃培養）陰性である。

以上の性状を要約すると、以下の如くである。

すなわち、ＨＨ２４０−ＣＰＦ７株の気菌糸は輪生技を
有し、らせん形成は認められず、胞子の表面は平滑であ
り、種々の培地でうす黄茶色の発育上に、白色ないし蒼
白色の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められないか又
は茶色味を帯びる程度である。またメラニン様色素の生
成はトリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イー
スト・鉄寒天培地で陽性、チロシン寒天培地では陰性で
ある。蛋白分解力、スターチの氷解性はともに弱い方で
ある。なお、細胞壁に含まれる２、６−ジアミノピメリ
ン酸はＬＬ−型である。

これらの性状より、ＨＨ２４０−ＣＰＦ７株はストレプ
トバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｏｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ）属に属するものと考えられる。更に近縁の既
知菌種を検索するとストレプトミセス・リモファシエン
ス（５ｔｒｅｐむｏｍｙｃｅｓ　ｒｉｍｏｒａｃｉｅｎ
ｓ）（特公昭４２−７５９８号公報参照）が挙げられる
。

次に理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣ）Ｉ）より
ストレプトミセス・リモファシエンスを入手し、ＨＨ２
４０−ＣＰＦＴ株と比較検討した。

その結果を第８表に示す。

以下余白 第８表から明らかなように、ＨＨ２４０−ＣｒＦ２株と
ストレプトミセス・リモファシエンスの性状は全く合致
している。なお、特公昭４２−７５９８号公報における
ストレプトミセス・リモファシエンスの菌学的性質に関
する記載によれば、炭素源の利用試験に、ブリドハム・
ゴトリーブの培地に発育しないため、ツアペック培地を
使用しているが、この比較試験では両者ともブリドハム
・ゴトリーブ培地に生育し、糖料用能の判定は容易であ
った。加つるに、両者とも抗生物質デストマイシンを生
産することは、同種であることを否めない。したがって
、ＨＨ２４０−ＣｒＦ２株をストレプトバーチシリウム
・リモフ？シエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌ
ｌｕｍ　ｒｉｍｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｍ）１２４０−Ｃｒ
Ｆ２株と同定した。なお、ＭＨ２４０−ＣｒＦ２株は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８５９９
号（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ−８５９９）として寄託されてい
る。

本発明のＬ−アミノアシラーゼ＄１及びＬ−アミノアシ
ラーゼＳ２は次のように製造することができる。

本発明のＬ−アミノア’ｆｆ１５−　＝♂宅′　　及び
Ｌ−アミノアシラーゼＳ２はＬ−アミノアシラーゼ生産
菌である任意の放線菌を栄養源含有培地に接種して好気
的に発育させることによって得られる。栄養源としては
、細菌、放線菌などの栄養源として公知のものが使用で
きる。例えば、炭素源としては市販されているグリセリ
ン、グルコース、ラクトース、ショ糖、デンプン、マル
トース、糖蜜などの炭水化物、大豆油、綿実油などの植
物油、及び動物脂肪などが、窒素源としては市販されて
いるペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、コ
ーングルーテンミール■°゛、ファルマメディア■、大
豆粉、落花生粉、酵母エキス、Ｎ−Ｚ−アミン、カゼイ
ン、硝酸ソーダ、及び硫酸アンモニウムなどが、無機塩
としては食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、及び硫酸マ
グネシウムなどが挙げられる。

その他、必要に応じて微量の金属塩を添加することもで
きる。これらのものは本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ
　及びＬ−アミノアシラーゼＳ２の生産に役立つもので
あればよい。

培養温度に関しては、ム発−ｄＬ−アミノアシラーゼＳ
　及びＬ−アミノアシラーゼＳ２を生産する範囲であれ
ばいずれでもよく、好ましくは２０℃〜３０℃である。

また、培養時間は通常１日ないし１０日間、好気的に培
養することが望ましい。

培養時のｌ）Ｈ値は、し−アミノアシラーゼＳ１及びＬ
−アミノアシラーゼＳ２が生産される値であれば、特に
限定はされないが、好ましくは、１）Ｈ７，０〜８、Ｏ
が望ましい。

本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１及びＬ−アミノアシ
ラーゼＳ２は菌体外に放出されやすく、主として培養濾
液中に存在する。

よって、本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１及びＬ−ア
ミノアシラーゼＳ２は、他の一般の糸状菌由来のＬ−ア
ミノアシラーゼのＸ１ｌｌｌ法とは異なり、菌体を破壊
し、酵素を抽出することなく、培養濾液そのままを酵素
液として利用することができる。また、必要に応じて、
通常の生化学的手段により精製することができる。すな
わち、硫安分別沈澱法、メンプラン濃縮法、カラムライ
ト■（富士化学社製）クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー及び電気
泳動法等を適宜組み合せて純化することもできる。

１凰３ 以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、これ
らの実施例によって本発明は限定されるものではない。

実施例１ スターチ１．０％、グルコース１．０％、肉エキス０．
７５％、ポリペプトン０゜７５％、塩化ナトリウム０．
３％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸銅０．０００７
％、硫酸第一鉄０．００１％、塩化マンガン０．０００
８％、及び硫酸亜鉛０．０００２％を含む滅菌した培地
１００ｄを含む５００ｄ容エルレンマイヤーフラスコに
本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１の生産菌の１つであ
るストレプトミセス・ハチジョーエンシス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｈａｃｈｉｊｏｅｎｓｉｓ　　Ｉ　Ｍ
　ＯＳ−０２４４ＣＩＳＰ−５１１４）　（Ｆ　Ｅ　Ｒ
Ｍ　Ｐ−７２１８））を無菌的に植菌し２７℃にて４日
間振どう培養し、これを種母とした。同様の培地組成、
操作で、５００ｄ容工ルレンマイヤーフラスコ１００本
を作製し、上記種母フラスコより２ｍｌ当り種母をそれ
ぞれに添加した。

添加後フラスコを２８’Ｃ，４日間振どう培養した。

フラスコの内容物を集め吸引濾過により菌体を除去し、
濾液１．５１を得た。培養濾液は、限外濾過モジュール
（旭化成社ＡＣＬ−１０１０）により４０Ｇｄまで濃縮
した。さらに濃縮液に０．０２８リン酸力リウムＭ　耐
液（ＰＨ７．０）２００Ｉｄヲ加工、再ヒ上記限外′ａ
過モジュールにより３００ｄまで濃縮する操作を２回く
り返した後、内液を上記緩衝液で押し出し粗調製酵素溶
液６３０ｍを得た。　し−アミノアシラーゼ活性は、Ｌ
−スレオ−Ｎ−アセチル−３−（３゜４−ジベンジルオ
キシフェニル）セリンを基質として３７℃１時間反応さ
せ、生成するし一スレオー３−（３，４−ジベンジルオ
キシフェニル）セリンをニンヒドリン法にて測定するこ
とにより決定した。即ち、反応はＮ塩酸を系内に加え酵
素を変性させることにより終了させ、生成するし一スレ
オー３−（３，４−ジベンジルオキシフェニル）セリン
を系内よりブタノ°ニノも泗させた。ブタノール抽出液
は、ニンヒドリン法にて発色させ、５７０ｎｍの吸光度
で比色定量した。脱アセチル体１ｏｏｔｉｇ／ｄの濃度
を与えるＬ−アミノアシラーゼ活性を１単位と定義する
と上記粗調製酵素溶液の単位は５．９２　ｘ１０４単位
であった。また一連の操作の回収率は９８％以上であっ
た。

実施例２ 実施例１により調製された粗ｍ製酵素溶液４０（１ｍ１
（３゜７６Ｘ１０４単位）をあらかじめ５ｍＨのリン酸
カリウム緩衝液（ＰＨ７．０）にて平衡化させたカラム
ライト■（富士化学工業社）の塔（内径３．７ｃＩＩｔ
Ｘ高さ３０ａＲ）に通し、し−７ミノアシラーゼＳ１を
吸着させた。上記緩衝液２００１を流し、塔を同緩衝液
で洗浄後、゛緩衝液濃度を０，５Ｈまで直線的に増加さ
せる方法によりＬ−アミノアシラーゼＳ１を溶離せしめ
た。

本発明のし一７ミノアシラーゼＳ１は、０．２〜０．３
Ｈのリン酸カリウム緩衝液（Ｅ）Ｈ７，Ｏ）で溶離され
、活性画分を集め５ｍ）ｌリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ
７．０，５℃）に対して透゛析をスイ、２００ｍ１の精
製酵素液を得た。一連の操作の回収率は８０％であり、
比活性は約１１倍上昇した。

実施例３ 実施例２により調製した酵素溶液はさらにイオン交換セ
ファディクス等により精製することができる。即ち予め
５ｍｔ４のリン酸カリウム緩衝液にて平衡化したＣＭ−
セフ７デイクスＣ−５０■（ファルマシア社）の塔（内
径３．０ＣＩＩＩＸ高さ２５．０ｃｍ）に通し、し−ア
ミノアシラーゼＳ１を吸着させる。

上記緩衝液８００ｍ　ｌを流して塔を洗浄した後直線的
に緩衝液濃度を増加させることにより酵素活性画分を溶
出せしめる。

本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１は、０．０８〜０．
１２８のリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７．０）にて溶出
された。一連の操作の回収率は９０％であり、比活性は
、実施例１、及び実施例２の酵素溶液に比較して、それ
ぞれ８．５倍及び７．３倍に上昇した。

実施例４ 実施例３により調製された酵素溶液はさらにＤＥＡＥ−
セファデックスＡ−５０■（ファルマシア社）によって
精製される。即ち、１２００単位の酵素を含む酵素液を
予め５ｍ）！リン酸緩衝液にて平衡化させておいたＤＥ
ＡＥ−セファデックスＡ−５０■カラム（内径１．６ｃ
ｍｘ高さ１１．Ｏｃ＋ｎ）に通しｉｏｏｍ＋の上記緩衝
液でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を直線的に増加させる
ことによって酵素活性画分を溶出せしめた。

本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１は、０．２〜０、２
５）１のリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）で溶離した。一連
の操作の回収率は８５％であった。また比活性は実施例
３のものに比べ１．７倍上昇した。

実施例５ 実施例４にて調製した精製酵素について、セファデック
スＧ−１００■（ファルマシア社）を用いたゲル濾過を
行った。予め５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化
されたセファデックスＧ−１００■カラム（内径１．７
ｃｍｘ高さ８１．５ｃｍ）に実施例４にて調製したＩ製
醇素０．２ｍｇアルブミン換算量及びそれぞれ０．５〜
１ｍｇの各種夕゛ン’ｔ＜？ｊＡ品を含む０．５％グリ
セリン溶液１．Ｏｉｌを通した。溶出液は上記緩衝液を
３．６ｍｌ／時の流速で流し、溶出液と２゜Ｏｉｌずつ
フラクションコレクターにて分取した。酵素活性は２８
０ｎｍの吸光度、Ｌｏｗｒｙ法によるタンパク定量及び
酵素活性等により検出した。ゲルクロマトグラフィーの
結果、精製酵素が単一タンパクバンドであり、かつ排除
体積の１．４倍附近に溶出されることにより分子量がｓ
ｏ、　ｏｏｏ〜６０．０００であることが証明された。

実施例６ グルコース３％、ファルマメディア■１．５％、塩化ナ
トリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．１％、硫酸銅
０．０００７％、硫酸第一鉄ｏ、　ｏｏｏｉ％、塩化マ
ンガン０．０００８％及び硫酸亜鉛０．０００２％を含
む滅菌した培地１００ｄを含む５００ｄ容エルレンマイ
ヤーフラスコに本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ２生産
菌であるストレプトバーチシリウム・リモフ７シエンス
ＭＨ２４０−ＣＰＦＴ株を無菌的に植菌し、２７℃にて
３日間振盪培養し、これらを種母とした。

前記と同様の培地１．５１ずつを５１容工ルレンマイヤ
ーフラスコ１８本に分注し、滅菌後前記種母１０ｄずつ
を各フラスコに添加し、２７℃で４日間振盪培養した。

ついで各フラスコの培養物を集め、吸引濾過により菌体
を除去し、濾液１９．６ｊ！を得た。

こうして得られた培養濾液を、予め５ｍＭのリン酸カリ
ウム緩衝液（１）８７．０）にて平衡化させたカラムラ
イト０（富士化学社製）２１を充填したカラムに通し、
し−アミノアシラーゼＳ２を吸着させた。水７１で該カ
ラムを洗浄後、０．５Ｍリン酸カリウムＩＩＩ液（ＰＨ
７．ｏ）ｓｉによりＬ−アミノアシラーゼＳ２を溶出し
、活性画分を集め、粗製酵素溶液１．９５４を得た。実
施例１と同様にしてＬ−アミノアシラーゼ活性を測定し
たところ、この粗製酵素溶液の活性単位は１．６９　Ｘ
１０５単位であり、また一連の操作の回収率は９５％以
上であった。

実施例７ 実施例６により調製された粗酵素溶液１．９５　ｊ！（
１，６９ＸＩＯ５単位）に硫酸アンモニウム５４０ｇを
加え、４５％飽和溶液とし、予め４５％飽和硫酸アンモ
ニウム溶液で平衡化されたトヨパールＨトロ５■（東洋
曹達社製）を充填したカラム（内径２．５ｃｍ×高さ２
５ａＲ）に通し、Ｌ−アミノアシラーゼＳ２を吸着させ
た。

ついで４５％飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄後、３５
％飽和硫酸アンモニウム溶液を流し、さらに２５％飽和
硫酸アンモニウム溶液を流してＬ−アミノアシラーゼＳ
２を溶出した。活性画分を集め、２ｍＨトリスー塩酸緩
衝液（ｐＨ８，２）に対して透析を行い、精製要素液４
４０ｍ　＜収率９５％以上）を得た。

実施例８ 実施例７で得られた酵素液を予め２ｍＭ　トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ８，２）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパ
ール６５０Ｈ■（東洋曹達社製）のカラム（内径２Ｃｍ
×高さ２１．５ａＲ）に通し、Ｌ−アミノアシラーゼＳ
２を吸着させた。ついでトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
２）の濃度を５ｍＭから２００ｍＭに直線的に増加させ
ることにより、し−アミノアシラーゼＳ２を溶出し、活
性画分を集め、精製酵素液８４ｎｅ　（７，７×１０４
単位）（収率５９％）整（ｉ−６−実施例９ 実施例８で得られた精製酵素液８４成（比活性７、７Ｘ
　１０’単位）を水に対して透析し、予め５＋＋＋Ｈす
′／酸カリウム緩衝液（ＰＨ７．０）で平衡化させたＣ
Ｍ−トヨパール６５０Ｍ■（東洋曹達社製）のカラム（
内径２Ｃｍ×高さ２８ａＩｉ）に通した。こうして得ら
れたＣＭ−トヨバール６５０Ｍカラム通過液２１５ｄに
硫酸アンモニウム６０．９ｇを加え、予め４５％飽和硫
酸アンモニウム溶液で平衡化させたトヨバールＨＷ　−
６５’　（東洋曹達社製）のカラム（内径２ＣＩＲ×高
さ４５ｃｍ＞に通し、し−アミノアシラーゼＳ２を吸着
させた。ついで硫酸アンモニウム溶液の濃度を直線的に
減少させることにより、°Ｌ−アミノアシラーゼＳ２を
溶出した。活性画分を集め、５ｍＭ）−リス−塩酸緩衝
液（Ｆ４′４８．２）に対して透析を行い、精製酵素液
１０５ｍ　（比活性２３２３単位／　２８０ｎｍ吸光度
）（収率４６ｘ）を得た。

発明の効果 本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１及びＬ−アミノアシ
ラーゼＳ２は安価な培地中で産生菌により多量に産生さ
れ、しかも菌体外へ放出されることから、特別な抽出操
作を施すことなく、培養濾液をそのままま酵素溶液とし
て利用することができる。さらに特にＬ−アミノアシラ
ーゼＳ２の基質特異性の広いこと及び耐熱性にすぐれて
いることから、天然のアミノ酸はもとより、非天然型ア
ミノ酸の光学分割を行うことができ、加えてその際に微
生物による汚染に対し特別の操作をすることなく、また
基質濃度をより高くすることが可能である。

また本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１及びＬ−アミノ
アシラーゼＳ２は、公知のＬ−アミノアシラーゼよりも
広い基質特異性を有する。たとえば、公知のアシラーゼ
であるアシラーゼアマノが作用しないＤＬ−スレオ−Ｎ
−アセチル−３−（３゜４−ジベンジルオキシフェニル
）セリンに本発明のＬ−アミノアシラーゼを作用させる
と、該化合物の１体のアセチルアミノ基のみを特異的に
加水分解して、パーキンソン氏病の治療薬として有用な
し一スレオー３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−
Ｎ−メチルセリンの合成中間体であるＬ−スレオ−３−
（３，４−ジベンジルオキシフェニル）セリンを得るこ
とができる。

したがって、本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１及びＬ
−アミノアシラーゼＳ２を利用することにより、光学活
性アミノ酸の工業的製法の簡略化及び効率化が可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ１の熱安定性
を、第２図はその反応温度（至適温度）を、第３図はそ
のｐＨ安定性を、第４図は反応ｐＨ（至適ｐＨ）をそれ
ぞれ示す。 第５図は本発明のＬ−アミノアシラーゼＳ２の熱安定性
を、第６図はその反応温度（至適温度）を、第７図はそ
のｐＨ安定性を、第８図は反応ｐＨ（至適ｐＨ）をそれ
ぞれ示す。また第９図は本発明のＬ−７ミノアシラーゼ
Ｓ１　（・−・）とＬ−アミノアシラーゼＳ２　（０−
０）との熱安定性に関する比較を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記の理化学的性状、即ち、 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸に作用してＬ−アミノ酸を与
   えるＬ−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
   く、天然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に加え、非天
   然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に対しても作用する
   。一方、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸、ＤＬ−Ｎ−アセチ
   ル−α−メチル−ベンジルアミン及びＮ−アセチル−Ｄ
   −グルコサミンには作用しない。 （２）安定性 温度：５０℃では殆んど活性を保持し、６０℃でもなお
   僅かに活性が残存する。 （ｐＨ７．０１時間放置） ｐＨ：ＰＨ７．０〜９．０で最も安定であり、ｐＨ１０
   ．０附近でも比較的安定である。但しｐＨ４．０以下で
   は失活する。（５℃２４時間放置） （３）反応性 温度：５０℃までは直線的に活性を増加し６０℃以上で
   は、急激に反応性を失う。 ｐＨ：ｐＨ６．５〜９．５で反応性が高く、反応の至適
   ｐＨはｐＨ７．５〜８．５附近である。 （４）分子量 ５０，０００〜６０，０００（ゲル濾過法） （５）等電点 ｐＩ＝７．００〜７．７０ （６）ディスク電気泳動 ＲｍＢＰＢ＝０．１２５〜０．１６７ （７）金属イオンの影響 Ｆｅ＾＋＾＋、Ｎｉ＾＋＾＋、Ａｇ＾＋、Ｈｇ＾＋＾＋
   、及びＣｕ＾＋＾＋によつて強く阻害される。またＣｏ
   ＾＋＾＋によつて賦活化される。 （８）阻害剤 ｐ−クロル水銀安息香酸で阻害を受けるが、モノヨード
   酢酸では阻害されない。また、エチレンジアミン四酢酸
   ２ナトリウムにより緩和に阻害される。 を有する放射線菌由来のＬ−アミノアシラーゼＳ＿１及
   び下記の理化学的性状、即ち、 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸に作用してＬ−アミノ酸を与
   えるＬ−アミノアシラーゼであり、その基質特異性は広
   く、天然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に加え、非天
   然型のＬ−アミノ酸のＮ−アシル体に対しても作用する
   。一方Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸、ＤＬ−Ｎ−アセチル
   −α−メチル−ベンジルアミン及びＮ−アセチル−Ｄ−
   グルコサミンには作用しない。 （２）安定性 温度：５０℃まで失活しないが、６０℃では８０％の活
   性を保持し、さらに７０℃においても２０％以上の活性
   が残存する。（ｐＨ７．０　１０分間放置） ｐＨ：ｐＨ８．５〜１０．０で最も安定であり、ｐＨ３
   ．５及びｐＨ１１．０附近でも５０％の活性が残存する
   。 （５℃２４時間放置） （３）反応性 温度：６０℃までは直線的に相対活性は増加し、７０℃
   でもなお７０％以上の反応性を有する。 ｐＨ：ｐＨ７．０〜１０．０で反応性が高く、反応の至
   適ｐＨはｐＨ８．０〜９．０附近である。 （４）分子量 ５０，０００〜６０，０００（ゲル濾過法） （５）等電点 ｐＩ＝６．３８〜７．４２ （６）ディスク電気泳動 ＲｍＢＰＢ＝０．１８０〜０．２８０ （７）金属イオンの影響 Ｃｕ＾＋＾＋、Ｍｎ＾＋＾＋、Ｃｏ＾＋＾＋、Ｈｇ＾＋
   ＾＋、Ｆｅ＾＋＾＋Ｎｉ＾＋＾＋、及びＡｇ＾＋によつ
   て強く阻害される。 （８）阻害剤 ｐ−クロル水銀安息香酸、Ｌ−システイン及びモノヨー
   ド酢酸により強く阻害を受けるが、エチレンジアミン四
   酢酸２ナトリウムでは殆んど阻害されない。 を有する放射線菌由来のＬ−アミノアシラーゼ