JPH0561909B2 - - Google Patents

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JPH0561909B2
JPH0561909B2 JP59190726A JP19072684A JPH0561909B2 JP H0561909 B2 JPH0561909 B2 JP H0561909B2 JP 59190726 A JP59190726 A JP 59190726A JP 19072684 A JP19072684 A JP 19072684A JP H0561909 B2 JPH0561909 B2 JP H0561909B2
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laurentii
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は巾広い基質範囲を有する新規なL−ア
ミノ酸オキシダーゼ、クリプトコツカス
(Cryptococcus)属の酵母の発酵によるその単離
および相当するL−α−アミノ酸またはそれらの
誘導体からのα−ケト酸、それらのエステルおよ
びエーテルの調製への前記L−アミノ酸オキシダ
ーゼの使用に関する。 L−アミノ酸オキシダーゼ(以下LAOと略記
する)はクリプトコツカス属の酵母中に誘導しう
る酵素である。それゆえその調製には誘導物質
(Inducer)としてアミノ酸またはアミノ酸を放出
する物質を添加して酵母を発酵させる。本発明の
好ましい態様を以下に詳細に説明する。 クリプトコツカス属のうちではクリプトコツカ
ス・ラウレンテイ(C.Laurentii)例えばクリプ
トコツカス・ラウレンテイ変種マグヌス
(magnus)CBS569菌株、ならびにクリプトコツ
カス・アルビドウス(C.albidus)種が好ましい。 特に好ましいのはクリプトコツカスラウレンテ
イDSM2762菌株である。この菌株の出発物質は
唯一の窒素源としてD−グルタミン酸を含有する
ミネラル培地中28℃で数回の工程にわたりそれぞ
れ2〜3日間保温培養されたボボジオベラシオ
(Bobodiovlassio)(Upper Volta)地方からの
土壌試料であつた。これらの液体培養物をD−α
−アミノアジピン酸エチルアミドを唯一の窒素源
として含有する培地上で培養した。さらに接種し
たのちなかんずくDSM2762菌株を純粋な培養物
として単離した。 この菌株は菌糸体も偽菌糸も形成しない単細胞
の卵形酵母である。増殖は種々の発芽により行わ
れる。子のう胞子またはバリスト胞子の存在は検
出され得なかつた。凸状の帯白色コロニーは粗く
てそして平滑な縁辺を有する。カロチノイドの形
態をした顔料形成は起らない。酵母殿粉の検出は
沃素−沃化カリウムを用いて行われ、コロニーに
おいてもまた液体培養物中においても検出され
た。生理学的な研究では葡萄糖、蔗糖、マルトー
ス、ラフイノース、ガラクト−ス、乳糖、殿粉、
ラムノース、メリビオース、デキストリンおよび
イノシトールが炭素源として吸収されることが示
された。糖の発酵は起らなかつた。硫酸アンモニ
ウム、α−アミノアジピン酸、グルタミン酸、ア
ラニン、ロイシン、セリン、トリプトフアン、チ
ロシンおよびフエニルアラニンの窒素源としての
利用は示され得なかつた。これに対し硝酸ナトリ
ウムでの生育は観察されなかつた。 LAOが生育に平行して形成されそして対数相
の終りに向つてその最大活性に達することが見出
された。好ましい誘導物質はD−アミノ酸特にD
−Leu、D−α−アミノアジピン酸(以下
DαAAAと略記する)ならびにD−Alaである。
見出されたLAO活性についての概略を第1表に
示す。
【表】 好ましいC−源は溶性殿粉および特に乳糖およ
び蔗糖である。 知られた微生物性L−アミノ酸オキシダーゼと
対照的に本発明によるLAOは巾広い基質範囲を
有する。大抵の天然のアミノ酸と並んでL−α−
アミノアジピン酸およびL−セフアロスポリンC
のような他のアミノ酸も相当するα−ケト酸に変
換される。しかしながらそれらと並んでアミノ酸
の誘導体、すなわちそれらのエステル特に低級ア
ルキルエステルおよびベンジルエルテル、ならび
にエーテルしかもセリンのアルコール基のエーテ
ルのみならずチロシンのフエノール性ヒドロキシ
基のエーテル、およびシステインのチオエーテル
も変換される。ここでもまた低級アルキルおよび
ベンジル−エーテルまたは−チオエーテルが好ま
しい。天然のチオエーテルL−メチオニンも同様
に変換される。 すべての反応は厳密に立体特異的である。L−
形が相当するケト酸またはケト酸誘導体に変換さ
れる。従つて本発明によつてラセミ化合物も分割
でき、その場合L−形がケト誘導体に変換され一
方D−形は未変化のまま残る。 L−アミノ酸の反応は好ましくはPH6.5〜8.5好
ましくは7〜8特に7.5で遂行される。それゆえ
適当な緩衝剤は燐酸カリウム緩衝液およびトリス
−HCl緩衝液である。 好ましい反応温度は約30〜60℃、好都合には40
〜55℃特に50℃である。 LAOはL−α−AAAに対しKm値0.25mMお
よびVmax2mMを有する。 本発明によるLAOは高い保存安定性により優
れている。これは4℃で数日間そして−18℃で数
カ月間活性の低下を伴うことなく使用されうる。 本発明によるLAOは外側の細胞質胞に局在す
る。それゆえ透過性となされてない完全な細胞中
における酵素活性はセチル−トリメチル−アンモ
ニウムブロマイドで処理された細胞中における場
合と同じである。細胞を凍結しそして解凍すると
30〜40%の活性増大がひき起される。 本発明によるLAOは細胞質膜からの濃縮物と
して使用されうる。しかしながら特に好ましいの
は固定された細胞の変態における使用である。前
記したように酵素は外側の細胞質膜上に局在する
ので、細胞を固定する場合無毒性条件下に保持す
る必要はない。 より高い安定性および改良された取扱い容易性
なる知られた酵素固定の利点と並んで、全細胞の
埋め込みにおいては酵素の単離および精製が不要
である。 酵素または細胞の固定は知られた方法で天然ま
たは合成の重合体を用いて遂行される(Nachr.
Chem.Tech.Lab.第29巻第850頁(1981年)、西ド
イツ特許公開公報第2252815号、同第2343633号、
同第2414128号、同第2420102号および同第
2805607号参照)。 以下の実施例において本発明の特に好ましい態
様を詳細に説明する。 実施例 1 酵母クリプトコツカス・アルビドウス(C.
albidus)下記固形栄養培地上に保持する。 「栄養肉汁」 8g 寒天 15g 蒸留水 1 培地を試験管に分配しそして121℃で30分間滅
菌し、次に冷却し、培養物を接種しそして25℃で
3〜4日間保温培養する。生育した培養物を滅菌
食塩溶液10mlで洗い流しそして下記組成の培地に
加える。
【表】 この培地500mlを2のエレンマイヤーフラス
コ中に入れそして121℃で30分間滅菌する。 10mlの接種物を接種したフラスコを次に28℃お
よび190rpmで回転振盪器中で保温培養する。72
時間後生育した培養物を収穫し、洗浄しそして燐
酸カリウム緩衝液(PH7.5、50mM)中にとる。
完全な細胞のLAO活性を基質としてのL−α−
AAAを用いo−フエニレンジアミン−ペルオキ
シダーゼ依存性試験において測定すると細胞1g
当り1.34であつた。 実施例 2 クリプトコツカス・ラウレンテイ(C.
laurentii)DSM2762株を実施例1の記載に従い
栄養溶液500ml中で生育させそして3日後に、同
じ培地9を有するがしかしD−α−AAAの代
りにD−ロイシンを含有する12の発酵器中に移
しそして28℃、400rpmおよび通気率毎時400で
保温培養する。 4日後に細胞1g当りLAO活性3.5Uが測定さ
れた。 実施例 3 χ−カラゲエニン(Marine Colloids社製、
Rockland,Maine、USA)の6%溶液を75℃で
溶解させ、40℃に冷却しそして生理食塩溶液中の
クリプトコツカス細胞の4%細胞懸濁液と1:1
の割合で混合する。この懸濁液をカニユーレから
沈殿床(CaCl210mM、KCl300mM)中に注射す
るとビードが形成される。1時間撹拌後0.3M
KClで3回洗う。カラゲエニンビードを0.02%の
ナトリウムアジドを含有する0.13M燐酸カリウム
緩衝液(PH7.5)中4℃で保存する。ビードの活
性は触媒の湿つた塊1g当り約80mUであつた。 実施例 4 0.1M燐酸カリウム緩衝液(PH8.0)中に溶解し
た10mMのL−フエニルアラニン10mlを実施例3
記載の操作により固定されたクリプトコツカス・
ラウレンテイDSM2762細胞4gと37℃で通気し
ながら反応させる。工業上のカタラーゼ
(Boehringer社製、Mannheim)10μを添加す
ると生成した過酸化水素が分解されそして生成物
の品質が損なわれるのを阻止する。基質の消失お
よび生成物の形成は薄層クロマトグラフイーによ
り追跡されうる。生成物の検出は薄層クロマトグ
ラフイーに2,4−ジニトロフエニルヒドラジン
を噴霧することにより遂行される。同様に、アン
モニウムイオンの形成はニトロプルシツド法によ
り追跡される。 5時間後に出発物質は定量的に反応した。 以下の第2表および第3表に示される結果は実
施例4により得られたものである。基質濃度は別
に記載がなければ4mMである。
【表】
【表】
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 クリプトコツカス(Cryptococcus)属の酵
    母からのL−アミノ酸オキシダーゼ。 2 クリプトコツカス・ラウレンテイ(C.
    Laurentii)種の酵母からのL−アミノ酸オキシ
    ダーゼからなる前記特許請求の範囲第1項記載の
    L−アミノ酸オキシダーゼ。 3 クリプトコツカス・ラウレンテイDSM2762
    株からのL−アミノ酸オキシダーゼからなる前記
    特許請求の範囲第1または2項記載のL−アミノ
    酸オキシダーゼ。 4 クリプトコツカス属の酵母をアミノ酸または
    アミノ酸を放出する物質を添加して発酵させるこ
    とを特徴とするクリプトコツカス属の酵母からの
    L−アミノ酸オキシダーゼの製法。 5 D−アミノ酸が用いられることを特徴とする
    前記特許請求の範囲第4項記載の方法。 6 D−Leu、D−Ala、D−α−アミノアジピ
    ン酸またはD−α−アミノアジピン酸−δ−セミ
    エチルアミドが用いられることを特徴とする前記
    特許請求の範囲第5項記載の方法。 7 炭素源として乳糖または蔗糖が用いられるこ
    とを特徴とする前記特許請求の範囲第4ないし6
    項のいずれか1項に記載の方法。
JP59190726A 1983-09-16 1984-09-13 クリプトコツカス属の酵母からのl−アミノ酸オキシダ−ゼ、それらの調製および使用 Granted JPS6087786A (ja)

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