JPS6319158B2 - - Google Patents

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JPS6319158B2
JPS6319158B2 JP55064655A JP6465580A JPS6319158B2 JP S6319158 B2 JPS6319158 B2 JP S6319158B2 JP 55064655 A JP55064655 A JP 55064655A JP 6465580 A JP6465580 A JP 6465580A JP S6319158 B2 JPS6319158 B2 JP S6319158B2
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JP
Japan
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hydantoin
substituted
hydrolysis
medium
amino acid
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Application number
JP55064655A
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English (en)
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JPS55153595A (en
Inventor
Jironieeru Kuroodo
Guibarushu Maruseru
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AA EE SEE SOC DO SHIMI ORUGANIKU E BIOROJIKU
Original Assignee
AA EE SEE SOC DO SHIMI ORUGANIKU E BIOROJIKU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AA EE SEE SOC DO SHIMI ORUGANIKU E BIOROJIKU filed Critical AA EE SEE SOC DO SHIMI ORUGANIKU E BIOROJIKU
Publication of JPS55153595A publication Critical patent/JPS55153595A/ja
Publication of JPS6319158B2 publication Critical patent/JPS6319158B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/009—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving hydantoins or carbamoylamino compounds

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
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  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、５―置換ヒダントイン、相当するヒ
ダントイン酸またはそれらの混合物を酵素で加水
分解してＤ―α―アミノ酸を製造する方法に関す
る。 本発明の方法によつて得ることのできる好まし
いＤ―α―アミノ酸は、薬剤として、または製薬
業および農業の分野において利用可能な製品を製
造する際の中間生成物として特に有用なＤ―フエ
ニルアラニン、Ｄ―メチオニン、Ｄ―フエニルグ
リシンまたはＤ―ｐ―ヒドロキシフエニルグリシ
ンであり、多数のＤ―アミノ酸、例えばＤ―ロイ
シン、Ｄ―バリンおよびＤ―トリプトフアンが、
本方法により製造可能である。 本発明により、微生物シユードモナス
（Pseudomonas ）sp.HM―40（CBS259.79）を培養
して作つた酵素を用い、５―置換ヒダントイン、
相当するヒダントイン酸またはそれらの混合物の
加水分解からなるＤ―α―アミノ酸の製造法が提
供される。５―置換ヒダントインを加水分解する
のが好ましい。 前記微生物は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第5614号として寄託された。 本発明の方法における出発物質として用いられ
る５―置換ヒダントインは、５の位置において、
場合によつてはアルキル部分に１〜４個の炭素原
子を直鎖もしくは分枝鎖で有するアルキルチオ
基、シアノ基、または場合によつて１個もしくは
それ以上のヒドロキシ基で置換されたアリール
基、好ましくはフエニル基で置換されるか、また
は５の位置において、場合によつては１個もしく
はそれ以上のヒドロキシ基で置換されたアリール
基、好ましくはフエニル基で置換されることが好
ましい。また、相当するヒダントイン酸も出発物
質として用いることができる。 本発明の方法に使用する酵素は、下記に詳しく
その特性を述べる微生物シユードモナスsp.HM
―40を、適当な媒質中で培養して得られる。 適切な条件下における培養によつて、本発明に
使用される酵素を提供する微生物は、シユードモ
ナス属に属する新しい種と考えるべきである。 この微生物は、Commentry（フランス）で採取
した土壌試料から、通常の微生物単離法によつて
単離された。菌株の試料は、Baarn（オランダ）
にあるCentraalbureau voor Schimmelcultures
に寄託され、そこでCBS259.79の番号で登録され
た。この研究所は、本明細書に記載された知識を
適法に有する者であれば、誰にでもこの微生物の
菌株を分配するよう委任されている。 微生物HM―40は、その特性のあるものが
Bergey著Manual of Determinative
Bacteriology第８刊に記載されている種の特性
と一致しないプソイドモナスである。その微生物
は、シユードモナスsp.HM―40の名称で標示さ
れる。 シユードモナスsp.HM―40の培養および形態
上の特性を挙げると次のとおりである。 １ 種々の媒質での培養状況（appearance of
culture） ａ 30℃における「トリプチカーゼ大豆寒天
（Trypticase soy agar）」 接種24時間後：非常に小さいコロニー。 接種４８時間後：はつきりした際縁
（edge）を有し半透明であるより大きなコロ
ニー（直径約１〜1.5mm）。 接種４日後：不透明で粘性を有するより大
きなコロニー（直径約４mm）。 ｂ 30℃における養素ブイヨン（Nutrient
broth） ５c.c.の媒質を含む試験管（16×160mm）中
において、24時間後において菌の生育
（development）が明白ではあるが、非常に
充分である（abundant）とはいえない。次
の日以降に生育が増大する。管の底部にかな
り強力に付着する沈殿物によつて均一な混濁
の形成が起こる。二酸化炭素（10％）は菌の
生育を増大させない。 ｃ 種々の固体媒質 養素寒天上および「脳心臓浸出寒天
（Brain Heart Infusion agar）」上における
生育および培養状況は、「トリプチカーゼ大
豆寒天」で述べたと同じである。 ｄ 種々の液体媒質 「脳心臓浸出寒天」、ペプトンを含有する
水トリプトンを含有する水、および酵母抽出
物を含む養素ブイヨン上において、菌の生育
および培養状況は、養素ブイヨンについて述
べたと同じである。トリプチカーゼ大豆ブイ
ヨンとペプトンおよび0.2％（重量／容量）
のグルコースを含む水とにおいては、菌の生
育はわずかに薄弱である。 ２ 形態学 ａ 染色を行なわない顕微鏡検査 液体媒質中37℃において24時間培養後、シ
ヤトル形クラスター（shuttle―shaped
cluster）における長さが0.5〜5μである細胞
が得られる。 この微生物は可動性（mobile）であり、
接種を24〜30℃で行なうとき、その可動性が
より顕著である。 ｂ 染色後の顕微鏡検査 この微生物はグラム陰性（Gram
negative）であり、しばしば細胞体の中心部
の着色がより薄弱なことがある。 ３ 菌の生育に最適な温度： 24℃：良好な生育 30℃：非常に良好な生育 37℃：中等度の生育 42℃：薄弱な生育 ４ 培養および生化学に関する特性： ａ 呼吸型：絶対的好気性（obligate aerobe） ｂ オキシターゼ：陽性（positive） ｃ カタラーゼ：陽性 ｄ 「マツコンキー（Mac Conkey）寒天」：
充分な培養（abundant culture）。 ｅ 「サルモネラ シゲラ（Salmonella
Shigella）寒天：非常に充分な培養ではな
い。 ｆ 「セトリミド寒天」：菌の生育なし ｇ ウレアーゼ（Fergusonの媒質中）：陽性 ｈ インドール生産：陰性（negative） ｉ メチルレツド試験：陰性 ｊ フオゲス―プロスカウエル（Voges―
Proskauer）試験：陰性 ｋ クエン酸塩の使用（Simmons）：48時間後
に陽性、アルカリ性化 １ ゼラチンの液化：陰性 ｍ 酸化―発酵試験（HughおよびLeifson）：
酸化性 ｎ 炭水化物からの酸形成： グルコース：陽性 ラクトース：陽性 アラビノース：陽性 マルトース：陽性 マンニトール：陽性 スクロース：陽性 キシロース：陽性 ｏ 硝酸塩の還元：陽性 ｐ 亜硝酸塩の還元：陰性 ｑ 脱窒：陰性 ｒ ピグメントの形成：陰性 ｓ H2Sの形成： 「トリツプル砂糖鉄寒天（Triple Sugar
Iron Agar）」媒質上：きわめてわずかに陽
性 亜酢酸鉛紙：H2Sの痕跡 ｔ 溶血（haemolysis）（馬の血）：陰性 ｕ リトマスミルク：変化なし ｖ β―ガラクトシダーゼ：陽性 ｗ アルギニン ジヒドロラーゼ （dihydrolase）：陰性 ｘ リジン デカルボキシラーゼ （decarboxylase）：陰性 ｙ オルニチン デカルボキシラーゼ：陰性 シユードモナスsp.HM―40の菌株を慣用の培
養基中で培養すると、ヒダントインを相当するＤ
―α―アミノ酸に転化することのできる酸素が微
生物の細胞内と、それより低い程度ながら培養基
中とに生成される。 シユードモナスsp.HM―40は、任意の好気培
養法によつて培養できる。培養基は、HM―40菌
株の生育に必要な同化し得る炭素、窒素および無
機物質、例えば鉱物性塩類の源泉物質を含んでい
ることが必要である。窒素源として５―置換ヒダ
ントインが培養基中に含まれると、酵素の生産を
促進させることができる。この目的には、メチオ
ニンのヒダントインを一般に用いるが、他のヒダ
ントイン、例えばバリンのヒダントイン、ロイシ
ンのヒダントイン、イソロイシンのヒダントイン
または５―（３―シアノプロピル）ヒダントイン
を用いるのが有利である。 利用できる同化可能な炭素源は、グルコース、
スクロース、ラクトースまたはマルトースのよう
な炭水化物であつて、それらは純粋な形で用いら
れ、または糖蜜や乳清（milk serum）のような
複合的残滓として供される。また、アルコールま
たは有機酸も用いることができる。ある種の動植
物油、例えばラード油または大豆油をこれらの種
種の炭素源に変えること、またはそれらに加える
ことが可能である。 同化可能な窒素源として適当なものは、きわめ
て多岐にわたつている。それらは無機または有機
のアンモニウム塩または尿素のような非常に簡単
な化学物質であつてよい。また、主として蛋白の
形で窒素を含有する複雑な物質によつて、それら
が与えられてもよい。 添加される無機成分の中には、例えばアルカリ
またはアルカリ土類金属の燐酸塩または炭酸カル
シウムもしくは炭酸マグネシウムのように、緩衝
または中和効果を有し得るものが若干ある。それ
以外のものは、例えばアルカリまたはアルカリ土
類金属の塩化物および硫酸塩、または亜鉛、コバ
ルト、鉄、銅およびマンガンの塩のように、HM
―40菌株の生育に必要なイオン均衡（ionic
equilibrium）に貢献する。 培養を開始する際の発酵媒質のPHは、４と９、
好ましくは６と８との間とすべきである。発酵に
最適な温度は、25℃と35℃との間であるが、20な
いし37℃の温度でも満足すべき生産が得られる。 発酵の通気量に関する限界は、かなり広い範囲
に変化し得る。しかしながら、毎分ブイヨン１
当り0.3〜３の空気を通気させることが特に好
適であると認められた。10〜72時間培養した後に
最高収量を得るが、この時間は使用する媒質によ
つて変わる。 本発明の加水分解工程に利用する酵素が主とし
て細胞内に生産されるので、Ｄ―α―アミノ酸を
製造する本発明の方法は、微生物の培養に用いた
媒質中に含まれる微生物の細胞を用いるか、また
は例えば遠心分離により培養基から単離した細胞
を用いて行なうことができ、この単離した細胞
は、その水性懸濁液として、またはアセトンによ
る沈殿または凍結乾燥を行なつた後に用いること
ができる。また、それらは摩砕（grinding）また
は超音波処理によつて得られる酵素性細胞抽出物
の形で用いることもできる。 本発明によるＤ―α―アミノ酸の製造方法は、
一般にPHが６〜９、好ましくは約7.8の水性媒質
中において行なわれる。もし適切と認めれば、ア
ルカリ性水溶液、好ましくは水酸化ナトリウム溶
液を加えることにより、この値の範囲にPHを保
つ。 加水分解用の反応媒質の温度は、一般に20〜55
℃であり、37℃附近であるのが好ましい。 反応媒質中に含まれるヒダントインの初期濃度
は、その溶解度に依存する。一般的には約５％
（重量／容量）であるが、10％（重量／容量）を
超えることもできる。 加水分解用の反応媒質に、表面活性剤、酸化防
止剤および（または）補酵素（coenzyme）を含
ませることができ、これらはＤ―α―アミノ酸の
形成を助け、従つて収率をよくすることができ
る。 反応の継続時間は、一般に２時間ないし４日で
ある。実際には、Ｄ―α―アミノ酸の生産が終わ
るまで反応を続けるのが一般的である。 Ｄ―α―アミノ酸へのヒダントインの転化にお
いては、中間生成物として相当するＤ―ヒダント
イン酸が形成され、そのものは、酵素系の作用を
受けてＤ―α―アミノ酸に転化する。従つて、本
発明の方法は、ヒダントイン、またはヒダントイ
ン酸、またはそれらの混合物のうちのいずれを用
いても実施可能である。 本発明の方法を用いてアミノ酸Ｄ―フエニルア
ラニン、Ｄ―メチオニン、Ｄ―フエニルグリシン
またはＤ―ｐ―ヒドロキシフエニルグリシンを製
造するのが好ましい。本発明の方法で製造できる
他のα―アミノ酸は、Ｄ―ロイシン、Ｄ―バリ
ン、Ｄ―トリプトフアンおよびＤ―２―アミノ―
５―シアノ吉草酸である。 ラセミ体の５―置換ヒダントインが、一般に本
発明の方法における出発物質として用いられ、そ
して所望のＤ―α―アミノ酸の生産に加えて、Ｄ
―５―置換ヒダントインに対する選択的加水分解
の結果、Ｌ―５―置換ヒダントインが反応媒質中
に残される。しかしながら、HM―40菌株はＬ―
ヒダントインの現場ラセミ化を助長し、その結果
用いたラセミ体のヒダントインは、完全にＤ―α
―アミノ酸に転化される。 本発明の方法で得られるＤ―α―アミノ酸は、
一般に遠心分離およびイオン交換樹脂を用いた
過操作によつて反応媒質の清澄化を行なつた後、
公知のアミノ酸分離法によつて反応媒質から単離
できる。一般的には、アミノ酸をその等電点にお
いて沈殿させる。特許請求の範囲を含めて本明細
書中に用いられる「公知の方法」という表現は、
以前から用いられた方法、または化学文献に記載
された方法を意味する。 以下、例をあげて本発明を説明する。 例 １ ａ 酵素組成物の調製 下記の組成を有する培養基を調製する。 グルコース 20ｇ／ 燐酸一カリウム ３ｇ／ 燐酸二カリウム ７ｇ／ 硫酸マグネシウム 0.7ｇ／ 硫酸マンガン 0.02ｇ／ 硫酸第一鉄 0.02ｇ／ 塩化ナトリウム １ｇ／ Ｄ，Ｌ―メチオニンのヒダントイン ３ｇ／ 250c.c.、容のフラスコに、この媒質を50c.c.づつ
分割して入れ、120℃に15分間加熱して殺菌を行
なう。選択的寒天媒質上に保たれたシユードモナ
スsp.HM―40の菌株を接種した後、30℃におい
て48時間フラスコを撹拌（250rpm）する。 上記培養基（１）と消泡剤（１c.c.）とを入れ
た２の発酵容器中で生産培養基を作る。前記フ
ラスコのうちの１個の内容物を用いて接種を行な
う。500rpmで回転する撹拌機を用いて撹拌し、
かつ、殺菌空気を用いて１／分の割合で通気し
ながら、この培養菌を30℃で48時間生育させる。 培養菌生育の完了時点において、遠心分離によ
つて細胞物質を分離し、次いで蒸留水（50c.c.）中
に懸濁させる。得られた懸濁液は、100c.c.当り7.6
ｇの固形分を含む。 ｂ Ｄ，Ｌ―フエニルアラニンのヒダントインの
加水分解 Ｄ，Ｌ―フエニルアラニンのヒダントイン（５
ｇ）を蒸留水（200c.c.）に加える。ヒダントイン
を一部溶解させるための加熱を行なつた後、混合
物を37℃に冷却する。水酸化ナトリウムの1N水
溶液を加えてPHを7.8に調節する。上記に得られ
た細胞懸濁液（25c.c.）を次に加える。反応混合物
の容量を250c.c.に調節し、PHを7.8に調節する。 反応混合物を窒素雰囲気下に置き、その温度を
37℃とする。水酸化ナトリウムの1N水溶液を
徐々に加えてPHを7.8に保つ。24時間適度に撹拌
した後、ヒダントインが全部可溶化された。 遠心分離によつて反応混合物を清澄化し、次に
イオン交換樹脂（DOWEX50樹脂、H+−形）を
通過させ、アンモニアの2N溶液を用いて溶出を
行なう。アルカリ性の画分を濃縮乾固させる。こ
のようにしてＤ―フエニルアラニン（3.98ｇ）が
得られ（収率92.5％）、その特性は次のとおりで
ある。 〔α〕20 D＝29.2゜±2゜（ｃ＝１、水） Ｎ＝8.63％（理論値8.48％） 電位差測定力価（potentiometric titre）＝93.3
％ 得られたＤ―フエニルアラニンの光学的純度は
93％より高い。 例 ２ Ｄ，Ｌ―メチオニンのヒダントイン（４ｇ）と
0.6ｇの固形分を含む細胞懸濁液（８c.c.）（例１記
載の条件下に調製）とを蒸留水（150c.c.）に加え
る。 水酸化ナトリウムの1N水溶液を加えてPHを7.8
に調節する。蒸留水を加えて反応混合物の容量を
200c.c.に調節する。37℃で24時間反応を続け、水
酸化ナトリウムの1N水溶液を徐々に加えてPHを
7.8に保つ。 得られたＤ―メチオニンを、Steinおよび
Mooreの方法に従つて反応混合物中で測定する。
その濃度は17ｇ／であつて、用いたＤ，Ｌ―メ
チオニンのヒダントインに対比して100％の転化
度に相当する。 遠心分離によつて反応混合物を清澄化し、次に
イオン交換樹脂（DOWEX50樹脂、H+−形）を
通過させる。このようにしてＤ―メチオニン
（2.7ｇ）が得られ（反応混合物中で測定したＤ―
メチオニンに対しての収率80％）、下記の特性を
有する。 〔α〕20 D＝−19.3゜（ｃ＝１，5N塩酸） Ｎ＝9.36〜9.42％（理論値9.39％） 得られたＤ―メチオニンの光学的純度は90％の
程度である。 例 ３ ａ 酵素組成物の調製 下記の組成を有する培養基を調製する。 グルコース 20ｇ／ 酵母抽出物（DIFCO） 10ｇ／ バクトペプトン（Bacto peptone）（DIFCO）
10ｇ／ この媒質を250c.c.のフラスコに50c.c.づつ分けて
入れ、120℃において15分加熱して殺菌を行なう。
シユードモナスsp.HM―40菌株で接種した後、
フラスコを30℃で24時間撹拌（250rpm）する。 １個のフラスコの内容物を用いて、前掲の培養
基（１）を入れた２容の発酵容器に接種す
る。30℃において24時間培養菌を生育させ、その
間回転数500rpmの撹拌機で攪拌し、かつ、殺菌
空気を１／分の割合で通気する。 培養菌の生育が完了した時点で、遠心分離によ
つて細胞物質を分離し、蒸留水（100c.c.）中に懸
濁させる。この懸濁液は8.9ｇの細胞固形物を含
有する。 ｂ メチオニンのヒダントインに対する酵素によ
る加水分解 Ｄ，Ｌ―メチオニンのヒダントイン（５ｇ）を
蒸留水（200c.c.）に溶解する。水酸化ナトリウム
の0.1N水溶液を加えてPHを7.5に調節し、上記の
細胞懸濁液（20c.c.）を次に加える。容量を250c.c.
に調節し、反応混合物を窒素雰囲気下に置き37℃
に保つ。 反応時間５時間後、SteinおよびMooreの方法
により、媒質中に含まれるメチオニンをクロマト
グラフイーで測定する。細胞懸濁液のヒダントイ
ン分解酵素の活性度（hydantoinase activity）
（酵素による反応１時間について、細胞固形物mg
当りの生成メチオニンのμモル数）を計算したと
ころ4.5である。 22時間の反応時間の後、遠心分離によつて反応
媒質を清澄化する。混合物をイオン交換樹脂
（DOWEX50、H+−形）に通し、アンモニアの
2N溶液で溶出を行なつて、生成したメチオニン
を単離する。 溶出液を蒸発乾固させ、さらに残滓を乾燥して
Ｄ―メチオニン（3.9ｇ）を得るが（収率91％）、
その特性は次のとおりである。 Ｎ＝9.4％（理論値9.39％） 〔α〕20 D＝−23゜（ｃ＝１，5N塩酸） 電位差測定力価＝98％ 例 ４ ｐ―ヒドロキシフエニルグリシンのヒダントイ
ンに対する酵素による加水分解 細胞固形物8.9ｇを含む水性懸濁液（100c.c.）を
例３(a)に記載した条件で調製する。 ｐ―ヒドロキシフエニルグリシンのヒダントイ
ン（５ｇ）を蒸留水（250c.c.）に溶解する。水酸
化ナトリウムの0.1N水溶液を加えてPHを7.5に調
節し、細胞懸濁液（20c.c.）を加える。容量を250
c.c.に調節し、反応混合物を窒素雰囲気下に置き37
℃に保つ。 ５時間の反応時間の後でｐ―ヒドロキシフエニ
ルグリシンを測定する。ヒダントイン分解酵素活
性度は、１時間の反応時間に対して細胞固形物mg
当り生成アミノ酸1.8μモルである。 22時間の反応時間の後、混合物をイオン交換樹
脂（DOWEX50、H+−形）に通してｐ―ヒドロ
キシフエニルグリシンを単離する。クロマトグラ
フイーにかけた時に均質であるＤ―ｐ―ヒドロキ
シフエニルグリシン（3.78ｇ）がこのようにして
得られ（収率87％）、その特性は次のとおりであ
る。 Ｎ＝7.6％（理論値8.4％） 〔α〕20 D＝−135゜（ｃ＝１，5N塩酸） 電位差測定力価＝110％ 例 ５ 下記の条件下にシユードモナスsp.HM―40菌
株を培養する。 培養基の組成 グルコース 20ｇ／ 燐酸二カリウム ７ｇ／ 燐酸一カリウム ３ｇ／ 硫酸マグネシウム 0.7ｇ／ 硫酸マンガン 0.02ｇ／ 硫酸第一鉄 0.02ｇ／ 塩化ナトリウム １ｇ／ Ｄ，Ｌ―メチオニンのヒダントイン ３ｇ／ 酵母抽出物 ２ｇ／ 予備培養 培養基（50c.c.）を含む250c.c.のフラスコ中で24
時間かけて最初の予備培養（preculture）を行な
う。培養基（１）を含む２の発酵容器中にお
いて、最初の予備培養フラスコの内容物で接種を
行なつた第二の予備培養を、やはり24時間かけて
行なう。 生産培養 ２容の発酵容器の内容物を用いて、培養基
（５）を入れた7.5の発酵容器への接種を行な
う。１分間に５の割合で殺菌空気を通気し、か
つ、500rpmで回転する撹拌機で撹拌しながら、
37℃で24時間培養菌を生育させる。これらの条件
下で得られる生物量（biomass）は、培養基１
に対して固形分3.8ｇである。 酵素反応 培養菌生育が完了した時点において、遠心分離
によつて細胞物質を単離し、蒸留水（250c.c.）中
に懸濁させる。 Ｄ，Ｌ―フエニルグリシンのヒダントイン（10
ｇ）を蒸留水（400c.c.）中に懸濁させ、水酸化ナ
トリウムの0.1N水溶液を加えてPHを7.5に調節す
る。前掲のように得られた細胞懸濁液（50c.c.）を
加え、水を加えて混合物の容量を500c.c.にする。
次に混合物を37℃において17時間窒素雰囲気下に
置き、PHを7.5に保つ。 17時間の反応時間の後、遠心分離によつて反応
混合物を清澄化し、容量が1/5になるまで蒸発に
より濃縮し、濃塩酸を加えてPH１に酸性化する。 生成した沈殿を過して乾燥する。クロマトグ
ラフイーで分析した結果、この沈殿は、次の特性
を有するフエニルグリシンのヒダントイン酸であ
ることが示される。 Ｎ＝13.9％（理論値14.4％） 〔α〕20 D＝−137゜〔ｃ＝１，１（重量／容量）％
アンモニア溶液〕 得られたＤ―ヒダントイン酸の収率は、使用し
たヒダントインに対して6.3％である。 母液を再び濃縮し、次に水酸化ナトリウム水溶
液を加えてPH５とし、得られるＤ―フエニルグリ
シンの沈殿を別し、水およびエチルアルコール
で洗浄した後乾燥する。Ｄ―フエニルグリシン
（7.6ｇ）がこのようにして得られ（収率88％）、
その特性は次のとおりである。 Ｎ＝9.2％（理論値9.3％） 〔α〕20 D＝−148゜（ｃ＝１，5N塩酸） 例 ６ シユードモナスsp.HM−40の培養を、例５に
記載した条件の下で行なう。遠心分離後、細胞物
質をPH7.8の0.1モル燐酸塩緩衝液中に懸濁させ、
種々のヒダントイン誘導体の加水分解用触媒とし
てこの懸濁液を用いるが、その反応条件は次のと
おりである。 PH7.8の0.1モル燐酸塩緩衝液中におけるヒダン
トインの初期濃度は20ｇ／／であり； 反応混合物１に対して用いた生物量6.5ｇ
（固形分として計算して）であり； 反応温度は37℃であり； 反応時間は５時間である。 生成アミノ酸の測定を反応混合物中において行
ない、細胞抽出物の酵素活性度をその測定値から
計算する。 この方法で求めた活性度を、反応時間１時間に
対する酵素固形物mg当りの生成アミノ酸のμMと
して次の表に示す。
【表】
【表】 例 ７ 例６の記載にならつて、シユードモナスsp.
MH―40の燐酸塩緩衝液中の懸濁液を得る。この
懸濁液は100c.c.中6.5ｇの固形分を含み、使用に先
立つて下記の条件下における超音波処理によつて
細胞を破壊させる。 装置：TC4Cプローブ（probe）を備えた
PONS； 超可聴周波数（ultrasonic frequency）：20k
Hz； 処理容量：15c.c.； 温度：０℃の領域に保つ； 処理時間：10分間。 この処理された懸濁液を用いて、例６に記載し
た実験条件下にメチオニン、フエニルアラニンお
よびフエニルグリシンのヒダントインの加水分解
を触媒させる。測定された活性度は次のとおりで
ある。
【表】 例 ８ 100c.c.中に7.3ｇの固形分を含む以外は例５の記
載にならつて得たシユードモナスsp.HM―40の
水中細胞懸濁液を、使用に先立つて次の条件で凍
結乾燥した。 懸濁液（120c.c.）を４個の丸底フラスコに分け、
凍らせ、そして次に16時間減圧（0.5×10-2mm
Hg）にさらす。凍結乾燥した酵素粉末（8.8ｇ）
が得られ、例６に記載した条件でこれを用いる。 測定された活性度は次のとおりである。
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ Pseudomonas sp.HM―40（OBS259.79、
    FRI5614）を培養して作つた酵素を用い、５―置
    換ヒダントイン、相当するヒダントイン酸または
    それらの混合物を加水分解する、Ｄ―α―アミノ
    酸の製造法。 ２ ５―置換ヒダントインは、５位に、アルキル
    部分が直鎖もしくは分枝鎖中１〜４個の炭素原子
    を有するアルキルチオ基、シアノ基、または１個
    以上のヒドロキシ基で置換されてもよいアリール
    基で置換されうる炭素数１〜４の直鎖もしくは分
    枝鎖アルキルで置換されたヒダントイン、または
    ５位で、１個以上のヒドロキシ基で置換されても
    よいアリール基で置換されたヒダントインであ
    る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 炭素、窒素および無機物質の同化可能源を含
    む培養基中で好気的に微生物を培養し、窒素源と
    して５―置換ヒダントインを培養中に含有させて
    酵素を作る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ ５―置換ヒダントインはメチオニンのヒダン
    トインである特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ ５―置換ヒダントインはバリン、ロイシンも
    しくはイソロイシンのヒダントインであるか、ま
    たは５―（３―シアノプロピル）ヒダントインで
    ある、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ６ 微生物の培養に用いた培地中に含まれる微生
    物の細胞を用いて加水分解を行なう、特許請求の
    範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の方
    法。 ７ 微生物の培養基から単離した細胞の水性懸濁
    液中において加水分解を行なう、特許請求の範囲
    第１項から第６項のいずれか１項に記載の方法。 ８ 微生物の細胞を摩砕または超音波処理して得
    た酵素抽出物を用いて加水分解を行なう、特許請
    求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載
    の方法。 ９ PHが６〜９の水性媒質中において加水分解を
    行なう、特許請求の範囲第１項から第８項のいず
    れか１項に記載の方法。 １０ PHが約7.8の水性媒質中において加水分解
    を行なう、特許請求の範囲第１項から第８項のい
    ずれか１項に記載の方法。 １１ 必要に応じて水酸化ナトリウムの水溶液を
    加えて水性媒質のPHを約7.8に維持する、特許請
    求の範囲第１０項記載の方法。 １２ 加水分解用の反応媒質の温度は20〜55℃で
    ある、特許請求の範囲第１項から第１１項のいず
    れか１項に記載の方法。 １３ 加水分解用の反応媒質の温度は約37℃であ
    る特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれか
    １項に記載の方法。 １４ ５―置換ヒダントインの初期濃度は約５％
    （重量／容量）である、特許請求の範囲第１項か
    ら第１３項のいずれか１項に記載の方法。 １５ 加水分解用の反応媒質に界面活性剤、酸化
    防止剤および（または）補酵素を加えて、Ｄ―α
    ―アミノ酸の収率を高める、特許請求の範囲第１
    項から第１４項のいずれか１項に記載の方法。 １６ 加水分解反応の継続時間は２時間から４日
    である、特許請求の範囲第１項から第１５項のい
    ずれか１項に記載の方法。 １７ ラセミ体の５―置換ヒダントインを用い、
    そしてＤ―５―置換ヒダントインに対する選択的
    加水分解後に反応媒質中に残されるＬ―５―置換
    ヒダントインを微生物によつて現場ラセミ化し、
    次にそれをＤ―α―アミノ酸に加水分解する、特
    許請求の範囲第１項から第１６項のいずれか１項
    に記載の方法。 １８ 得られるアミノ酸はＤ―フエニルアラニン
    である、特許請求の範囲第１項から第１７項のい
    ずれか１項に記載の方法。 １９ 得られるアミノ酸はＤ―メチオニンであ
    る、特許請求の範囲第１項から第１７項のいずれ
    か１項に記載の方法。 ２０ 得られるアミノ酸はＤ―フエニルグリシン
    である、特許請求の範囲第１項から第１７項のい
    ずれか１項に記載の方法。 ２１ 得られるアミノ酸はＤ―ｐ―ヒドロキシフ
    エニルグリシンである、特許請求の範囲第１項か
    ら第１７項のいずれか１項に記載の方法。 ２２ 得られるアミノ酸はＤ―ロイシン、Ｄ―バ
    リン、Ｄ―トリプトフアンまたはＤ―２―アミノ
    ―５―ジアノ吉草酸である、特許請求の範囲第１
    項から第１７項のいずれか１項に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1209495B (it) * 1984-02-02 1989-08-30 A San Donato Milanese Milano Procedimento per la preparazione di l-alfa-amminoacidi.
JPS6356278A (ja) * 1986-08-27 1988-03-10 Nippon Soda Co Ltd シユウドモナス属ｎｓ２１４菌及びｄ−アミノ酸の製造方法
IT1276163B1 (it) 1995-11-23 1997-10-27 Eniricerche Spa Procedimento migliorato per la preparazione di d-alfa-amminoacidi
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS542398A (en) * 1977-06-08 1979-01-09 Ajinomoto Co Inc Preparation of d-alpha-amino acid

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1039757B (it) * 1975-07-10 1979-12-10 Snam Progetti Complessi enzimatici atti a trasformare idantoine raceme in am minoacidi otticamente attivi e loro applicazione
JPS5344690A (en) * 1976-02-04 1978-04-21 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Preparation of d-n-carbamylphenylglycine and its substituted derivatives
US4211840A (en) * 1977-06-08 1980-07-08 Ajinomoto Company, Incorporated Method for producing D-α-amino acid

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS542398A (en) * 1977-06-08 1979-01-09 Ajinomoto Co Inc Preparation of d-alpha-amino acid

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IT8022089A0 (it) 1980-05-15
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BE883322A (fr) 1980-11-14
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