JPS6320520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アミノ酸のＮ−カルバミル誘導体ま
たは相当するヒダントイン化合物のラセミ混合物
を原料とし、アグロバクテリウム属
（Agrobacterium）に属する特定の微生物の菌体
またはそれから得られる立体特異性酵素調製物を
使用してＤ−アミノ酸を生成する方法に係わる。 いくつかのＤ−アミノ酸、特にフエニルグリシ
ンおよびパラ−ヒドロキシフエニルグリシンは薬
品工業で広く使用される化合物の製造用の重要な
中間体である。 光学対掌体の分離のために現在使用されている
化学的な方法はカンフアスルホン酸の使用に基く
ものであり、コストが非常に高くなり、しかも収
率も低い。 他の方法はＤ−アシルアミノ酸をＤ−アシラ−
ゼ酵素によつて加水分解するものである。しかし
ながら、このような酵素は不純物としてＬ−アシ
ラーゼを常時含有するものであり、光学純度が低
い生成物を生成する結果になる。 DL−アミノ酸またはこれらの誘導体の酵素的
分割法については、本願出願人はイタリー国特許
第987278号（1975年１月20日出願）、特願昭53−
28781号（昭和53年３月15日出願）および特開昭
52−10484号においてすでに開示している。 これらの方法は、器官または微生物から抽出さ
れるヒドロピリミジンセドロラーゼ（Ｅ、Ｃ、
３、５、２、２、）により一般式 （式中、Ｘ＝−Ｈ，−OHまたは−OCH₃）で表
わされる化合物のラセミ体を酵素的に加水分解す
ることに基くものである。この加水分解は次式の
如く進行する。 つづいて、Ｎ−カルバミル誘導体を本願出願人
に係わる特開昭51−127003号の方法に従つて亜硝
酸塩によつてＤ−アミノ酸へと酸化する。 本発明の方法は、相当するヒダントイン化合物
を原料とし、次式に従つて酵素により触媒作用を
受ける加水分解反応を行なうことにより、Ｄ−ア
ミノ酸を生成することを特徴とする。 ここでＲは置換または未置換の脂肪族または芳
香族基である。 さらに本発明による方法は、一般式 （ここでＲは置換または未置換の脂肪族または
芳香族基である）を有するラセミ混合物を原料と
してＤ−アミノ酸が得られ、この際使用する酵素
（カルバミラーゼ）はＤ形に対して立体特異性
を示すものであることを特徴とする。 本発明による酵素的加水分解は次式に従つて進
行し、その結果、ラセミ化合物を原料としてアミ
ノ酸またはその誘導体のうち一方の立体異性体形
状のもののみが生成する。 本発明で使用する微生物菌体またはそれから得
られる酵素調製物は、Ｄ−アシラーゼを含有する
ものとは異なり、Ｌ−対掌体に対する活性は全く
示さないものである。このため、完全な光学純度
をもつＤ−アミノ酸を得ることが可能である。 本発明による酵素は農耕土から単離されたアグ
ロバクテリウム属（Agrobacterium）に属する
微生物（それぞれ1302、1303、1304の付号を付し
た）によつて生産される。 これらの微生物は以下の形態的特性および生化
学的特性を有する。 顕微鏡的形態 桿状（時おり対をなす）、グラム陰性、0.8×
1.5〜2.0ミクロン、莱膜および胞子なし、可動
性、周毛形の鞭毛あり（４〜６） 巨視的形態 寒天栄養培地（Difco）におけるコロニー：隆
起性、全縁性、クリーム色、透明、直径0.5〜１
mm、平滑表面 グリセルスルホン酸カルシウム−硝酸マンニト
ール−寒天培地で非常に活発に生育し、褐色とな
り、光輝を生成する。 生化学的特性 いずれの実験培地においても、他の栄養源およ
びアミノ酸を使用することなく、さらに唯一の窒
素源としてNH₄ ⁺，NO₃ ^-またはアミノ酸を使用
して、４ないし39℃で生育する。オキシダーゼ：
陰性（N.Kovacs，“ネーチヤー（Nature）”178，
703，1956） カタラーゼ： 陰性（M.Levine，D.Q.Anderson“ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（J.Bact.）”23，
337−347，1932） 硝酸塩からの亜硝酸塩の生成： 陽性（C.E.Zobell，“ジヤーナル・オブ・バク
テリオロジー”24，273，1932） トウイーン80の加水分解： 陰性（C.Sierra，“Antonie Van
Leeuwenhoek”23，15〜22，1957） ガゼイン、ゼラチン、セルロース、デンプン、寒
天の加水分解： 陰性（V.B.D.Skermann“細菌の属の同定のため
のガイド（Ａ Guide to the Identification of
the Genera of Bacteria）”第２版、1967）３−
ケトグリコシドの生成： 陽性（M.J.Bernaerts，J.DeLey“ネーチヤー”
197，406，1963） アニリンブルー−マンニトール−寒天培地におけ
る生育： 染料を吸収して生育する（A.A.Hendrickson，
J.L.Baldwin，A.J.Riker）“ジヤーナル・オブ・
バクテリオロジー”28，597〜618，1934） リトマスミルク：灰褐色 炭水化物の利用性： 酸化性（R.Hugh，E.Leifson，“ジヤーナル・
オブ・バクテリオロジー”66，24−26，1953） R.Y.Stanierによる目的のための培地中で唯一
の炭素源として使用される化合物（R.Y.Stanier
等“ジヤーナル・オブ・ジーナス・ミクロバイオ
ロジー（J.Gen.Microbiol）”43，159−271，
1966）： Ｄ（＋）グルコース、Ｌ（＋）アラビノース、Ｄ
（＋）キシロース、Ｄ（＋）トレオース、Ｄ（＋）
トレハロース、Ｄ（−）リボース、Ｌ（＋）ラムノ
ース、ラクトース、セロビオース、マルトース、
クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸塩、Ｌ
−ヒスチジン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン 上記の特性を“バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネーテイブ・バクテリオロジー
（Ber−gey's Manual of Determinative
Bacteriology）”第８版の記載と比較して、本発
明で使用する微生物はリゾビウム科
（Rhizobiaceae）アグロバクテリウム属
（Agrobacterium）のものであると決定した。 なお1302と付号した菌株については、米国
Narthen Reginonal Research Centerに寄託し
てあり、寄託番号はNRRLB11291である。 本発明によれば、アグロバクテリウム属の微生
物を窒素源、炭素源、リン源および無機塩を含有
する培養基中に好気的条件下、温度20ないし40
℃、好ましくは25ないし35℃、PH6.0ないし8.0、
好ましくは７ないし7.5において10ないし48時間、
好ましくは20ないし30時間培養する。炭素源とし
てはグルコース、乳酸塩、酢酸塩、コーンスチー
プリカーおよびラクトースが使用できる。また窒
素源としては、肉加水分解生成物、ガゼインおよ
び大豆の加水分解生成物、アンモニウム塩および
尿素、ヒダントイン化合物およびアミノ酸のＮ−
カルバミル誘導体が使用できる。 好適な培養基は、たとえば次の組成を有するも
のである。 肉ペプトン ５ｇ 肉エキス ５ｇ グルコース ５ｇ 蒸留水 1000ml PH 7.0〜7.2 Ｄ（−）アミノ酸は、単独であるいは他の通常
の窒素源と混合した窒素源としてDL−ヒダント
イン化合物またはアミノ酸のDL−Ｎ−カルバミ
ル誘導体を含有する発酵培養基中で直接生成され
る。 さらに、休止細胞として菌体スラリを直接使用
してあるいは抽出物を使用してもＤ（−）アミノ
酸を生成できる。 本発明の酵素調製物の菌体スラリからの抽出は
酵素化学の分野で通常使用される方法によつて実
施できる。この目的のために、菌体を適当な装
置、たとえばフレンチ・プレツシヤー・セル・プ
レス（French Pressure Cell Press）、マント
ン・ガウリング・ホモゲナイザ（Manton
Gauling Homo−genizer）、回転粉砕機または超
音波振動機等によつて破壊する。 さらに、ヒダントイン化合物の加水分野または
アミノ酸のＮ−カルバミル誘導体の加水分解を、
反応混合物に各種形状、たとえば新鮮な菌体、凍
結乾燥した菌体、トルエン化菌体、アセトンパウ
ダまたは粗製または精製抽出物として添加するこ
とによつても実施できる。 また酵素をマトリツクスとの間で化学結合を形
成させあるいはイオン結合を形成させることによ
り高分子化合物に結合させて不動化させることに
より、あるいは物理的に不動化させることによ
り、さらに技術的にかつ経済的に改良できる。 本発明方法をさらに詳述するためにいくつかの
実施例を示すが、本発明はこれに限定されない。 実施例 １ 肉ペプトン ５ｇ 肉エキス ３ｇ グルコース ５ｇ 蒸留水 1000ml 上記組成を有する培養ブイヨンを調製した。こ
の培養基をソーダによりPH7.2に調整し、500mlフ
ラスコに100mlずつ分注した。 110℃で30分間殺菌したのち、同じ組成に寒天
（DIFCO）２％を加えた斜面培地で培養した菌株
1302を接種し、30℃で24時間振盪培養した
（220r.p.m.）。 この予培養基（550nmにおけるD.O.：0.250、
希釈１：10）から、前記と同じ培養基100mlずつ
を収容する５個のフラスコ（容積500ml）にその
１mlを接種し、30℃で24時間振盪培養（220rpm）
した（550nmにおけるD.O.：250、希釈１：10）。 つづいて菌体を集め、生理食塩水で洗浄し、最
後にDL−５−フエニルヒダントイン10ｇを含有
するピロリン酸塩緩衝液（0.1M，PH7.7）100ml
中に温度40℃においてUPP窒素ブランケツトの
もとで分散させた。 このような条件下で200時間培養したところ、
ヒダントインは完全にアミノ酸（Ｄ−フエニルグ
リシン）に加水分解されていた。これは反応混合
物の偏光分析およびSuzuki氏法（ジヤーナル・
オブ・クロマトグラフイー（J.of
Chromatogrophy）80，199〜204，1973）による
薄層クロマトグラフにより確認した。 トリクロロ酢酸により沈殿させたのち遠心分離
することによりたんぱく質を除去し、つづいてPH
を等電点（5.8）に調整することによりアミノ酸
を反応混合物から単離した。 単離した物質を水洗し、減圧下で乾燥した。
IRスペクトルおよびNMRスペクトルによつてＤ
（−）フエニルグリシンであることを確認した。 旋光能は〔α〕²⁵ _D＝−154゜（Ｃ＝１％HCl1N）で
あつた。なお文献によれば純粋なアミノ酸（Ｄ
（−）フエニルグリシン）の旋光能は−157.8゜で
ある。 実施例 ２ 培養ブイヨン100mlから得られた実施例１の微
生物の菌体をピロリン酸塩緩衝液（0.1M，PH
7.7）10ml中に分散させ、５℃で10分間超音波で
あてた。超音波破壊物を、ピロリン酸塩緩衝液
（0.1M，PH7.7）中にDL−Ｎ−カルバミルフエニ
ルグリシン20mMを含有する溶液500mlに添加し、
65℃で培養した。 反応の速度をＮ−カルバミルの加水分解の間に
遊離したアンモニアをフエノール−次亜塩素酸塩
法により測定して監視した。 40時間培養したのちでは、NH₄ ^-イオンは10ミ
リモル／の濃度となつたが、その後は何ら濃度
の上昇は観察されなかつた。 反応混合物を50℃で減圧濃縮し、容量を100ml
とした。ついでPHを濃塩酸で5.8に調整し、沈殿
物を取した。このようにして得られた沈殿物を
1NHClに溶解し、NaOHによりPHを5.8に調整し
て再び沈殿させた。乾燥後、その旋光能を測定し
たところ、−153゜であつた。またIRスペクトルに
よりアミノ酸の同定を行なつた。 液について氷浴中で3NHOlによりそのPHを
注意深く2.5に調整して沈殿物を取し、蒸発乾
固し、ついで無水の沸騰アルコールで抽出した。
冷却させたところ、このアルコール溶液から結晶
性沈殿物が得られ、乾燥したのち、薄層クロマト
グラフおよびIRスペクトルにより検索した。 これらの分析により、化学的に純粋なＮ−カル
バミルフエニルグリシンが存在することが確認さ
れた。 文献によればＬ形鏡像体については旋光能が＋
137゜であるのに対して、上記化合物の旋光能は
〔α〕²⁵ _D＝134゜（Ｃ＝１％1NNaOH）であつた。 実施例 ３ 実施例１の方法に従つて、コーンスチープリカ
ーの５％溶液でなり、NaOHでPHを7.8に調整し
かつ121℃で30分間殺菌した培養基100mlを収容す
る５個のフラスコ（容積500ml）中で培養を行な
つた。 培養基を30℃で24時間振盪培養した（220r.p.
m.）。遠心分離によつて集めた菌体をピロリン酸
塩緩衝液（0.1M，PH7.7）で洗浄し、ついで５−
パラーヒドロキシ−DL−フエニルヒダントイン
10ｇを含有する前記と同じ緩衝液100ml中に分散
させ、UPP窒素ブランケツト下で40℃で培養し
た。これらの条件下で160時間培養を行なつたと
ころ、原料は完全にアミノ酸（Ｄ（−）−パラ−ヒ
ドロキシフエニルグリシン）に加水分解されてお
り、反応混合物の偏光測定およびSuzuki氏法に
よる薄層クロマトグラフによつて確認した。 トリクロロ酢酸によりたんぱく質を沈殿させ、
これを遠心分離して除去したのち、PHを等電点
（5.2）に調整して反応混合物からアミノ酸を単離
した。得られた沈殿物を水洗し、減圧乾燥した。
IRスペクトルおよびNMRスペクトルに基いてア
ミノ酸の同一性を確認した。文献によれば純粋な
アミノ酸についての旋光能が−161.2゜であるのに
対して、得られたアミノ酸の旋光能は〔α〕²⁵ _D＝
−156.5゜（Ｃ＝１％1N HCl）であつた。 実施例 ４ 実施例１の如くして調製したコーンスチープリ
カーを含有する培養ブイヨン100mlから得られた
アグロバクテリウム属の菌株の菌体を使用した。 洗浄した菌体をピロリン酸塩緩衝液（0.1M，
PH7.7）10ml中に分散させ、室温で撹拌しながら
15分間トルエン化（toluenization）した。 トルエン化した混合物を、ピロリン酸塩緩衝液
（0.1M，PH7.7）中にＮ−カルバミル−DL−パラ
−ヒドロキシフエニルグリシン20mMを含有する
溶液500mlに添加し、UPP窒素ブランケツト下で
65℃で培養した。 実施例１で記載したフエノール−次亜塩素酸塩
法に従つてＮ−カルバミル誘導体の加水分解中に
遊離したアンモニアを測定することにより反応速
度を監視した。 培養18時間後には、NH₄ ⁺イオンは濃度10ミリ
モル／に達し、その後は全く増加しなかつた。 この段階で反応混合物を50℃において容量100
mlとなるまで減圧濃縮した。ついで濃塩酸により
PHを5.2に調整して沈殿を形成させ、取した。 実施例２と全く同様にして、Ｄ−アミノ酸およ
びＬ−Ｎ−カルバミル誘導体を単離し、同定し
た。旋光能は、文献によれば純粋なものがそれぞ
れ−161.2゜および＋175.4゜であるのに対して、−
157.2゜および＋171゜であつた。 実施例 ５ 実施例１の如くしてアグロバクテリウム属の菌
株の菌体を培養した。湿潤した菌体スラリ数ｇを
ピロリン酸塩緩衝液（0.1M，PH7.7）に分散し
て、冷時アセトン処理した。 過によりアセトンを除去したのち、得られた
アセトン調製物を35℃で減圧下で恒量となるまで
乾燥した。乾燥物質をホモゲナイズし、得られた
粉末を酵素活性試験のために使用した。 このアセトン処理粉末を次の各基質について検
定した。Ｎ−カルバミル−Ｄ（−）−アラニン、Ｎ
−カルバミル−Ｄ（−）−バリン、Ｎ−カルバミル
−Ｄ（−）−グルタミン酸、Ｎ−カルバミル−Ｄ
（−）−パラ−ヒドロキシフエニルグリシン、Ｎ−
カルバミル−Ｄ（−）−パラ−メトキシフエニルグ
リシン、Ｎ−カルバミル−Ｄ（−）−フエニルグリ
シン、Ｎ−カルバミル−Ｌ（＋）−フエニルグリシ
ン、Ｎ−カルバミル−Ｄ（−）−フエニルアラニ
ン、Ｎ−カルバミル−Ｌ（＋）−グルタミン酸およ
びＮ−カルバミル−Ｄ（−）−（２−チエニル）グ
リシン。 上記基質について濃度20mMのピロリン酸塩緩
衝液（0.1M，PH7.7）溶液を調製し、各溶液10ml
にアセトン処理粉末の適量（ただし各基質につい
て同量）を添加した。 温度40℃において撹拌しながらUPP窒素ブラ
ンケツト下で培養を行なつた。１時間培養を行な
つたところで反応混合物中におけるNH₄ ⁺イオン
の濃度を実施例２に記載のフエノール−次亜塩素
酸塩法により測定することにより生成したアミノ
酸の量を測定した。 カルバミル分解酵素の最も高い活性度はＮ−カ
ルバミル−Ｄ（−）−パラ−ヒドロキシフエニルグ
リシンについて観察された。 試験の結果を次表に示す。ただしＮ−カルバミ
ル−Ｄ（−）−パラ−ヒドロキシフエニルグリシン
についての加水分解活性を100として表わしてい
る。 【表】 実施例 ６ MgSO₄・7H₂O 0.2ｇ Na₂HPO₄・12H₂O ６ｇ KH₂PO₄ ３ｇ NH₄Cl ２ｇ NaCl 0.5ｇ グリセリン ５ｇ ５−フエニル−DL−ヒダントイン ２ｇ 酵母抽出物 0.1ｇ 蒸留水 1000ml 上記組成を有する培養ブイヨンを調製した。こ
れを100mlずつ容積500mlのフラスコに分注し、
116℃で30分間殺菌した。またヒダントイン化合
物については過により殺菌した。 実施例１の如く調製した予培養物から１フラス
コ当り５mlを接種し、30℃において220r.p.m.で
撹拌しながら36時間培養した。つづいて遠心分離
によつて菌体を除去し、上澄液を濃縮し、ついで
等電点に調整したのち、アミノ酸をこの上澄液か
ら採取した。このようにして培養ブイヨン10か
ら、文献によれば純粋なアミノ酸については−
157.8゜であるのに対して旋光能〔α〕²⁵ _D＝−156゜
（Ｃ＝１％1N HCl）を有するＤ（−）−フエニル
グリシン11.2ｇが得られた。 実施例 ７ MgSO₄・7H₂O 0.2ｇ Na₂HPO₄・12H₂O ６ｇ KH₂PO₄ ３ｇ ５−メチルヒダントイン ２ｇ NaCl 0.5ｇ グルコース １ｇ 酵母エキス 0.1ｇ 蒸留水 1000ml PH 7.1 上記の組成を有する培養ブイヨンを調製した。
この培養基を100mlずつ容積500mlのフラスコに分
注し、116℃で20分間殺菌した。メチルヒダント
インについては別に殺菌した。 実施例１の如くして調製した予培養基から１フ
ラスコ当り５mlを接種し、30℃において撹拌しな
がら（200r.p.m.）24時間培養した。 ブイヨン1000mlから遠心分離することにより得
られた菌体スラリをリン酸塩緩衝液（PH7.5）中
で洗浄し、同じ緩衝液中にDL−５−（２−チエニ
ル）ヒダントイン４ｇを含有する溶液100mlに再
び分散した。 この反応混合物を40℃においてUPP窒素ブラ
ンケツト下で培養した。反応を30時間行なつたと
ころでアミノ酸（Ｄ（−）−（２−チエニル）グリ
シン）の加水分解が完了した。反応混合物を容量
20mlとなるまで濃縮し、ついでPHを5.6に調整す
ることによりアミノ酸を単離した。このようにし
て得られた沈殿物を減圧乾燥した。このアミノ酸
をIRスペクトルおよびNMRスペクトルにより同
定した。 文献によれば純粋なアミノ酸については−
73.7゜であるのに対して、得られたアミノ酸の旋
光能は〔α〕²⁵ _D＝−72.6゜（Ｃ＝１％1NHCl）であ
つた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アミノ酸のＮ−カルバミル誘導体のラセミ混
   合物または相当するヒダントイン化合物のラセミ
   混合物を原料としてＤ−アミノ酸を製造する方法
   において、反応を、アミノ酸のＮ−カルバミル誘
   導体のラセミ混合物または相当するヒダントイン
   化合物のラセミ混合物からＤ−アミノ酸を生成す
   る能力のあるアグロバクテリウム
   （Agrobacterium）属の菌体またはそれから得ら
   れる酵素調製物の存在下で実施することを特徴と
   する、Ｄ−アミノ酸の製法。