DK148360B - Fremgangsmaade til fremstilling af uricase - Google Patents

Description

148360

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af enzymet uricase (EC 1.7.3.3.) med høj aktivitet, hvilket enzym kan udnyttes i klinisk diagnostik til bestemmelse af urinsyre i blodserummet eller 5 urinen.

Uricase er et enzym, der katalyserer oxidationen af urinsyre til allantoin, og det er ikke til stede i vævene hos højerestående pattedyr, såsom mennesker, men det er derimod til stede i vævene og navnlig i de indre 10 organer hos laverestående pattedyr og i en større eller mindre mængde i nogle få mikroorganismer. Det har nu vist sig, at uricase kan produceres af en hidtil ukendt stamme af Micrococcus roseus, en mikroorganisme, der ikke tidligere har været kendt som danner af nævnte 15 enzym. Sammenlignet med de kendte uricaseproducerende mikroorganismer har den nye organisme den fordel, at den producerer store mængder af uricase i dyrkningsmedier, der indeholder lave koncentrationer af urinsyre. Det har desuden ganske overraskende vist sig, at den optima-20 le aktivitet af den af den nye organisme Micrococcus roseus NRRL B-12196 producerede uricase til forskel fra den af andre bakterier producerede uricase optræder tæt ved pH-værdierne i de fysiologiske væsker, og dette er en fordel, for så vidt som det ikke er nødvendigt at 25 ændre pH-værdien i den biologiske prøve, hvori urinsyren skal bestemmes, således at en mulig risiko for kemiske ændringer af den til afprøvning foreliggende prøve elimineres .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overens-30 stemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker mikroorganismen Micrococcus roseus NRRL B-12196 under aerobe betingelser i nærværelse af et dyrkningsmedium, der indeholder en assimilerbar carbonkilde, en nitrogenkilde, en phosphorkilde og mineralsalte.

35 Den anvendte mikroorganisme er isoleret fra op dyrket jord i nærheden af Monterotondo (Rom) og har følgende morfologiske og biologiske egenskaber.

2 148360

Mikroskopisk morfologi.

Kugler med en diameter på fra 1 til 2,5 mikron, ubevægelig og gram-positiv form, ved spaltning i mere end ét plan, kubiske pakker eller uregelmæssige gruppe-5 ringer, og undertiden optræder de parvis eller isolerede.

Makroskopisk morfologi.

Kolonier på næringsagar: ophøjet, uafbrudt rand, rosenrød farve, glat overflade, 1-2 mm i diameter.

Skråkultur på næringsagar: belægning med et lyse-^ rødt skær, glat og skinnende.

Biokemiske egenskaber.

Vækst i glucosenæringsvæskes svag uklarhed med slimagtig aflejring, svagt rosenrød, pH = 6,5.

Den vokser ved 10°C frem for ved 45°C, optimum mellem 25°C og 35°C.

Den vokser i glucosenæringsvæske, der indeholder NaCl, ved koncentrationen 5% og 10%, men ikke ved 15%.

Den vokser ikke på Simmons citrat-agar.

2Q Aerob dannelse af syre ud fra sukkerarter i "Purple Broth base" (DIPCO) med: xylose,glycerol, mannitol, lactose, maltose, sorbose, ribose, arabinose og raffinose; negativ med cellobiose, let forsinket syredannelse med? glucose, saccharose og fructose (7-10 dage).

25 Argininhydrolyse: negativ

Stivelseshydrolyse: positiv Gelatinehydrolyse: negativ

Urease: positiv H2S: negativ 30 Catalase: positiv

Nitratase: positiv

Indol: negativ

Acetoin: negativ

Methylrødt: negativ 35 Lecithinase: negativ

Lipase (smør og olivenolie): negativ.

' 3 148360

Ved sammenligning af disse data med beskrivelserne i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, VIII Ed., fremgår det, at den ifølge opfindelsen anvendte mikroorganisme tilhører familien Micrococcaceae, slægten 5 Micrococcus, arten roseus. Den er blevet deponeret ved Northern Regional Research Center i Peoria, 111., U.S.A., hvor den har fået tildelt betegnelsen NRRL B-12196.

Dyrkningen af Micrococcus roseus NRRL B-12196 kan udføres aerobt ved hjælp af en vilkårlig konventionel 10 frangangsmåde, såsom i overfladekulturer eller bedre i submerse kulturer under anvendelse af fermenteringsbeholdere med omrøring. Dyrkningsmediet, der kan være enten fast eller flydende, indeholder en assimilerbar car-bonkilde, en nitrogenkilde, en phosphorkilde, samt mine-15 ralsalte og vitaminer.

Dyrkningen kan udføres ved temperaturer på mellem 10°C og 40°C, idet det foretrukne område er 25°C til 35°C, i et tidsrum på fra 10 til 48 timer, fortrinsvis fra 20 til 30 timer, og ved en pH-værdi i området fra 20 6 til 9, fortrinsvis fra 7 til 8.

Som carbonkilder kan der f.eks. anvendes glucose, lactat, acetat, saccharose, fumarat, urinsyre, majsstøbevæske eller glycerol.

Som nitrogenkilder kan der f.eks. anvendes kød-25 hydrolysater, casein- eller sojabønnehydrolysater, ammoniumsalte, urinstof, nitrater eller urinsyre.

Udvindingen, og den eventuelle rensning, af uri-casen fra bakteriepastaen foretages ved inden for enzy-mologien sædvanligvis anvendte fremgangsmåde. Den fra 30 Micrococcus roseus NRRL B-12196 udvundne uricase kan fordelagtigt immobiliseres i polymere matricer ved dannelse af kemiske bindinger med den pågældende matrix, eller bindinger af iontypen, eller ved en ren og skær fysisk immobilisering.

35 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

148360 4

Eksempel 1 - Der fremstilles en dyrkningsvæske med følgende sammensætning: Gærekstrakt 15 g/1 (gram pr. liter).

5 Urinsyre 2 g/1 pH-Værdien indstilledes på. 7,2 med NaOH, og mediet fordeltes i portioner på hver 200 ml i 500-ml kolber. Efter sterilisering ved 116°C i 30 minutter podedes kolberne med en kultur af stammen NRRL B-12196 fra en 10 skråkultur, der indeholdt det samme medium med 2% agar, og inkuberedes i.24 timer ved 30°C under orbital omrøring med 200 o/m. Cellerne opsamledes derefter ved centrifugering, og fra 200 ml næringsvæske opnåedes der 3 g pasta (fugtig vægt). Den således opnåede cellepasta 15 opslemmedes i 60 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH = 8,5) og passeredes gennem en "French Pressure Cell Press", indtil der var opnået fuldstændig cellenedbrydning. Den enzymatiske aktivitet bestemtes i den således opnåede ekstrakt: 1 g fugtige celler indeholdt 100 uricaseenheder.

20 „

Dosering af uncase.

Uricaseaktiviteten bestemtes spektrofotometrisk ved at følge nedbrydningen af urinsyre ved 283 nm (nanometer) efter den metode, der er angivet af Mahler et al., J. Biol. Chem., (1955), 216, 625, modificeret som anført 25 nedenfor. 7 ml af en opløsning indeholdende 20 mg urinsyre i 100 ml phosphatpuffer (0,1 M, pH = 8,5) anbragtes i en lille kolbe med et rumfang på 50 ml og anbragtes til inkubering ved 30°C i et omrørt vandbad. Reaktionen startedes ved tilsætning af en lille mængde enzymekstrakt.

30 Umiddelbart efter tilsætningen af ekstrakten og desuden efter 10 minutters reaktion blev 0,5-ml prøver af reaktionsblandingen udtaget og sat til 4 ml 0,1 M HC1.

Absorptionen for de således opnåede opløsninger aflæstes ved 283 nm.

35 En uricaseenhed defineres som den enzymmængde, der er i stand til at nedbryde et mikromol urinsyre pr. minut under de netop anførte prøvebetingelser.

5 148360

Eksempel 2

En ekstrakt af celler af Micrococcus roseus NRRL B-12196 fremstilledes som nærmere angivet i eksempel 1.

Den rå ekstrakt centrifugeredes, og på den over-5 liggende væske bestemtes uricaseaktiviteten som beskrevet ovenfor under anvendelse af urinsyre opløst i 0,1 M phos-phatopløsninger med forskellige pH-værdier som reaktionsblanding. Samtidig bestemtes aktiviteten af enzymekstrakt, der var opnået ud fra kulturer af Bacillus fastidiosus 10 under de samme dyrkningsbetingelser som for den omhandlede Micrococcus roseus. De opnåede resultater er angivet i tabel 1, hvori aktiviteterne af ekstrakterne af de to mikroorganismer ved en pH-værdi på 9 er blevet forudsat at være 100.

15 Tabel 1

Uricaseaktivitet som funktion af pH i ekstrakter af B. fastidiosus og M. roseus.

pH af reaktions- Ekstrakt af blanding M. roseus B. fastidiosus 20 6,5 71 13,5 7.0 94 35 7.5 103 57 8.0 106 85 8.5 103 95 25 9,0 100 100