JPS6156086A - α−オキシ酸およびその塩の微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、微生物の作用により、α−ヒドロキシルニト
リル化合物から対応するα−オキシ酸およびその塩の製
造法に関するものである。生成したα−オキシ酸とアン
モニアは、通常、α−オキシ酸アンモニウム塩の形で存
在しているが、α−オキシ酸アンモニウム塩は、はぼ理
論量の強酸処理またはτ（−分解処理等により、α−オ
キシ酸として回収することが可能である。α−オキシ酸
のうち、乳酸は食品用、配造用、工業用として、グリコ
ール酸は農薬、医薬原料として、α−オキシイソ酪酸は
有機合成原料としてを用な化学物質である。

（従来の技術） ニトリル化合物が微生物により資化ないし分解されるこ
とは、アセトニトリル等〔ジャーナルオブ　フアーメン
テーシジン　テクノロジー（Ｊ。

Ｆｅｒｍｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、）　４７　＠＋　
　６３１頁、　１９６９年〕、α−アミノニトリル（ジ
ャーナル　オブ　ファーメンテ−ジョン　テクノロジー
　４９Ｓ、　ｌ０ＩＩＩＱ。

１９７１年）　、ベンゾニトリル〔バイオケミカル　ジ
ャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎａり
　　１６５’、Ｑ＋３０９頁。

１９７７年〕等が知られている。また、α−ヒドロキシ
ルニトリル化合物の微生物学的力ｎ水分解によるα−オ
キシ酸の製造法として、バチルス属、バクテリジウム属
、ミクロコツカス属およびブレビバクテリウム属等の微
生物を用いる方法（特公昭５８−１５１２０　号）や、
トルロプシス　ギャンデイダＧＮ４０５菌株を用いる方
法（ジャーナル　オブファーメンテーシコン　テクノロ
ジー　５１巻。

３９３貝、　１９７３年）が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、バチルス属、ハタテリジウム属、ミクロコツカ
ス属およびブレビバクテリウム属等の微生物を用いる方
法は、ラクトニトリルに対し充分な加水分解活性を示す
が、微生物の寿命という点で、工業的に利用可能な寿命
が認められていなかった。また、トルロプシス　キャン
ディダ　ＧＮ４０５菌株を用いた場合は、α−ヒドロキ
シイソカプロニトリルに対する加水分解活性はごく僅が
であり、また、α−ヒドロキシイソバレロニトリルに対
する加水分解活性も低く、工業的な反応活性が認められ
ていなかった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような工業的な問題点の解決を目標
にして、α−ヒドロキシルニトリル化合物を加水分解し
、生成したα−オキシ酸が分解、資化されて消滅せず、
さらに、長期間にわたってα−ヒドロキシルニトリル化
合物加水分解活性を失わない微生物の探索と培養および
反応条件の研究を鋭意行った結果、コリネバクテリウム
属に花する微生物の中から選ばれたα−ビドロキンルニ
トリル化合物ＪＪＩＩ水分解活１１を甘する微生物を見
い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、コリネバクテリウム属に属し、α
−ヒドロキシルニトリル化合物加水分解活性を有する微
生物の作用により、α−ヒドロキシルニトリル化合物か
らα−オキシ酸およびその塩を生成させることを特徴と
する微生物によるα−オキシ酸およびその塩の製造法で
ある。

本発明で使用されるα−ヒドロキシルニトリルとしては
、グリコロニトリル、ラクトニトリルおよびアセトンシ
アンヒドリンなどである。また、対応するα−オキシ酸
としては、それぞれグリコール酸、乳酸およびα−オキ
シイソ酪酸なとである。

また、本発明で使用される微生物は、コリネバクテリウ
ム属に属する微生物で、α−ヒドロキシルニトリルから
α−オキシ酸を生産する能力を存するものであり、コリ
ネバクテリウム　ニトリロフィラス菌株（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋　ｎ１ｔｒｉｌｏｐｈｙｌｕｓＡ
　Ｔ　ＣＣ２１４１９）、コリネバクテリウム　スベシ
ース　Ｂ−９６菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　　ｓｐ、　Ｂ　−９６）およびコリネバクテリウム　
スペシース　Ｃ−９９菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｓ　　ｓｐ、　Ｃ９９）などを好適なものとしてあ
げることができる。

コリネバクテリウム　ニトリロフィラス菌株はアメリカ
ン　タイプカルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ：ＡＴＣＣ）に、また、コリネバクテリウム　スベシ
ース　Ｂ−９６菌株およびコリネバクテリウム　スベシ
ース　Ｃ−９９菌株は、それぞれ微工研菌寄第７７３３
号および７７３４号として微生物工業技術研究所に寄託
されており、これらの菌学的性質は、以下に示すとおり
である。なお、コリネバクテリウム　ニトリロフィラス
　Ａ　Ｔ　ＣＣ２１４１９は、アセトニトリル等のニト
リル化合物を資化分解する微生物として分離されたもの
で、その性質はジャーナルオブ　ファーメンテ−ジョン
　テクノロジー　４７巻、６３１貝、　１９６９年に詳
しく記載されている。

コリネバクテリウム　スペシース　Ｂ−９６菌株ａ　形
態 ■細胞の形および大きさ　　桿菌 ２．１〜２．４　Ｘ３．６〜５．５μｍ■細胞の多形性
の有無　　分枝状および球状で顕著な多形性を示す。

■運動性の有無　　　　　無 ■胞子の−Ｖ無　　　　　　無 ■ダラム染色性　　　　　陽性 ■抗酸性　　　　　　　　無 ｂ　各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　円形、表面粗、金縁、中心突接
、ピンク色、表面平滑、バク−状、不透明。

■肉汁寒天斜面培養　　生育中程度、糸状、表面は皺が
多い、ピンク色、隆起状、波状。

■肉汁液体培養　　　　厚いがもろい菌膜形成、透明ま
たはわずかに温潤、沈渣あり。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　　液化せず、上部で生育最も
良好。

■リドマスミルク　　　変化しない。

Ｃ生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　陰性 ■ＭＲテスト　　　　　　陰性 ■ｖｐテスト　　　　　　陰性 ■インドールの生成　　　陰性 ■硫化水素の生成　　　　陰性 ■デンプンの加水分解　　陰性 ■無機窒素源の利用　　　ｉ陽性 ■可溶性色素の生成　　　陰性　ただし、菌はピンク色
になる。

■ウレアーゼ　　　　　　陽性 ０カタラーゼ　　　　　　陽性 ■セルロースの加水分解　陰性 ０生育の範囲　ｐ　）１５〜９、好ましくは６〜８温度
１８〜３９℃、好ましくは２３〜３６℃０酸素に対する
態度　　　好気性 ■糖から酸およびガスの生成 酸の生成　　ガスの生成 ブドウ糖　　　　　＋　　　　　　　−麦芽糖　　　　
　＋　　　　　　− シ！Ｉ糖　　　　　−− 乳糖　　　　　　−− コリネバクテリウム　スベシース　Ｂ−９９菌株ａ　形
態 ■細胞の形および大きさ　　桿菌 ０．７〜１．２　Ｘｌ、２〜１．７μ−〇細胞の多形性
の有無　　分枝状で多形性を示す。

■運動性の有無　　　　　無 ■胞子の有無　　　　　　無 ■ダラム染色性　　　　　陽性 ■抗酸性　　　　　　　無 ｂ　各培地における生育状態 ■肉汁寒天平板培養　　円形、表面粗、金縁、中心突状
、うすいピンク色、表面平滑、バター状、不透明。

■肉汁寒天斜面培養　　生育、糸状、表面は皺が多い、
ピンク色、隆起状、波状。

■肉汁液体培養　　　　厚いがもろい菌膜形成、透明ま
たはわずかに混濁、沈渣。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　　液化せず、上部で生育層も
良好。

■リドマスミルク　　　変化しない。

Ｃ生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　陰性 ■ＭＲテスト　　　　　　陰性 ■ＶＰテスト　　　　　　陰性 ■インドールの生成　　　陰性 ■硫化水素の生成　　　　陰性 ■デンプンの加水分解　　陰性 ■無機窒素源の利用　　　陽性 ■可溶性色素の生成　　　陰性　ただし、菌はピンク色
になる。

■ウレアーゼ　　　　　　陽性 ［相］カタラーゼ　　　　　　陽性 ■セルロースの加水分解　陰性 ■生育の範囲　ｐＨ５〜１０、好ましくは６〜８温度１
０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃Ｏ酸素に対する態
度　　　好気性 ■糖から酸およびガスの生成 酸の生成　　ガスの生成 ブドウ糖　　　　　十　　　　　　　−麦芽糖　　　　
　＋　　　　　　− シ！Ｉ垢　　　　　−− 乳糖　　　　　　−− 以上の菌学的性質をバージ−の細菌分類書（Ｂｅｒｇｙ
’ｓ　　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　　Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ　　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版
（１９７４）に基いて分類すると、Ｂ−９６菌株および
Ｃ−９９１１株は、ダラム陽性、胞子形成能無、非抗酸
性、好気性で多形性を示す桿菌であることから、コリネ
バクテリウム属に属する細菌であると決定した。コリネ
バクテリウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２１４１９
、Ｂ−９６Ｗ株、Ｃ−９９Ｗ株は、スラントの外観や、
生育条件およびニトリル資化能などで差異がある。

本発明においては、通常、これらの菌株は１種を用いる
が、２種以上の混合菌体を用いてもよく、さらに、上記
菌株以外の同様な作用を存する菌株を併用してもよい。

次に、本発明の一般的実施態様について説明する。本発
明に使用される微生物の培養には、アセトニトリル、イ
ソブチロニトリル等の飽和ニトリル化合物を唯一の炭素
源、窒素源とするか、もしくはグルコース、アルドース
等の炭素源、６Ｒｋアンモニウム、硝酸アンモニウム等
の窒素源に、飽和ニトリルを炭素源、窒素源として共存
させたものに、リン酸塩、カリウム、鉄、マグネシウム
、マンガン、亜鉛等の無機栄養源などを適宜含有した培
地が用いられる。また、飽和ニトリル化合物を全（添加
しない培地を用いて培養し、培養途中に適宜ニトリル化
合物を添加して培養を続けることにより、α−ヒドロキ
シルニトリル化合物の加水分解活性を持った菌体を取得
することができる。

培地のｐ　Ｈは通常５〜９、好ましくは６〜８、温度は
通常２０〜３５℃、好ましくは２５〜３２℃で、１〜５
日間好気的に培養を行なう。

このようにして得られた菌体培養物、それから分離した
菌体およびその酵素抽出物を水またはリン酸バッファー
（例えばｐ　ｉ−１７〜８）などの暖ｄｔ液に懸ｌ男し
、これにα−ヒドロキシルニトリル化合物を共存させれ
ば、速やかに加水分；ｂ：反応が進行し、対応するα−
オキシ酸とアンモニアを生成する。すなわち、通常、前
記微生物菌体を１〜１０重世％、およびα−ヒドロキシ
ルニトリル化合物をｏ、ｓ　〜ｉｏ重ｆｆｉ　％　含ｔ
；　水性：’２．　ｉＦ＋　＞（ｌ　ヲ、温度５〜３５
℃、ｐＨ５〜１０の条件を用いて、５分ないし２４時間
反応させればよい。また、反応に際じて基質として用い
るα−ヒドロキシルニトリル化合物は、一般に生物母性
が強いので、反応系内の基質濃度は、反応を阻害しない
程度の４度にコントロールしつつ、逐次添加することが
できる。

カクシて、α−ヒドロキシルニトリル化合物は、副生物
であるα−オキシ酸テアミド化合物生成がほとんどなく
、はぼ１００％のモル収率で対応するα−オキシ酸とア
ンモニアに転換し、α−オキン酸アンモニウム塩の高濃
度水溶液として生成蓄積させることができる。また、反
応後、反応液と微生物菌体とを分離し、得られた微生物
菌体を用い、繰り返しα−ヒドロキシルニトリル化合物
の加水分解反応を行なうことができる。

なお、上記反応には、菌体または酵素を例えば、アクリ
ルアミドゲルまたはアルギン酸カルシウムなどを用いる
通常の固定化法にしたがって固定化し、使用することも
できる。また、反応器型式に関しては、バッチ式、連続
式または再使用式のいずれの型式を用いて行なうことも
可能である。

（発明の効果） 本発明は、α−ヒドロキシルニトリル化合物の加水分解
活性を有するコリネバクテリウム属に属する微生物を用
いることにより、α−ヒドロキシルニトリル化合物をほ
ぼ１００％の収率で、対応するα−オキシ酸とアンモニ
アに転換することを見い出したもので、常温、常圧とい
う温和な条件下で反応が進行し、工業的に有利なα−ヒ
ドロキシルニトリル化合物の加水分解反応に応用できる
ものである。

（実施例） 次に、本発明を実施例により説明する。

実施例１ コリネバクテリウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣ０２１
４１９を下記のＡ培地にて、２４時間３０°Ｃで振盪培
養した。

Ａ培地　　グルコース　　　　　　１．０　　％肉エキ
ス　　　　　　　１゜Ｏ％ ペプトン　　　　　　　０．３　　％ 食塩　　　　　　　　　　０．１　　％イソブチロニト
リル　　０．５　　％ リン酸第−カリウム　　　０．１　　％硫酸マグネシウ
ム　　　０．０５９／。

硫酸第一鉄　　　　　　ｏ、ｏｏｓ％ 硫酸マンガン　　　　　ｏ、ｏｏｓ％ 硫酸アンモニウム　　　０．１　　％ 硝酸カリウム　　　　　　０．１　　％ｐ　Ｈ７，０ 上記培養条件にて増殖した菌体を遠心分離により集菌し
、乾燥菌体量として２重量％、ラクトニトリル２重層％
、ｐｉ（７，０に調整したリン酸バッファー液９６重■
％の反応液を調合し、３０°Ｃで反応を開始した。反応
開始後１時間でラクトニトリル：よ加水分１１７シ、モ
ル収率はぼ１００％で乳酸アンモニウム塩が生成してい
た。また、乳酸アミドの生成はほとんど見られなかった
。なお、生成物の分析は、反応終了後、菌体を遠心分＾
１］により除去し、ガスクロマトグラフ法により乳酸お
よび乳酸アミドを、ネスラー法によりアンモニアをそれ
ぞれ定■した。乳酸アンモニウム塩は、ガスクロマトグ
ラフ法では乳酸として検出された。

実施例２ コリネバクテリウム　スペシース　ｃ−９９を下記のＢ
培地にて、２４時間３０℃で振の培養した後、集菌し、
さらにＣ培地にて２４時間３０℃で振盪培養を続けた。

Ｂ培地　　グルコース　　　　　　　１．０　　％肉エ
キス　　　　　　　１．０　　％ ペプトン　　　　　　　０．３　　％ 食塩　　　　　　　　　０．１　　％ ｐＨ７，０ Ｃ培地　　イソブチロニトリル　　０．５　　％リン酸
第−カリウム　　　０．１　　％硫酸マグネンウム　　
　　０．０５％ 硫酸第一鉄　　　　　　ｏ、ｏｏｓ％ 硫酸マンガン　　　　　ｏ、ｏｏｓ％ 硫酸アンモニウム　　　０．１　　％ 硝酸カリウム　　　　　　０．１　　％ｐＨ７，０ 上記培養条件にて増殖した菌体を遠心分離により集菌し
、乾燥菌体量として２重子％、グリコロニトリル１重子
％、９Ｈ７，０に２Ｗ４Ｔｌしたリン酸バッファー液９
７ｍ世％の反応液を調合し、３０°Ｃで反応を開始した
。反応開始後３０分でグリコロニトリルは加水分解し、
モル収率はぼ１００％でグリコール酸アンモニウム塩が
生成していた。また、グリコール酸アミドの生成はほと
んど見られなかった。

生成物の分析は、実施例１と同様にガスクロマトグラフ
法およびネスラー法で行なった。グリコール酸アンモニ
ウム塩は、ガスクロマトグラフ法ではグリコール酸とし
て検出された。

実施例３ コリネバクテリウム　ニトリロフィラス　ＡＴＣＣ２１
４１９を実施例１と同様な培養条件にて増殖した菌体を
遠心分離により集菌し、乾燥菌体量としてＨＪｆｉ％、
α−ヒドロキシルニトリルｉ１％、ｐＨ７，０、リン酸
バッファー液９７重世％の反応液を調合し、３０’Ｃで
反応を行なった。α−ヒドロキシルニトリルとしては、
グリコロニトリル、ラクトニトリルおよびアセトンシア
ンヒドリンを用い、それぞれ対応するα−オ二トシ酸で
あるグリコール酸、乳酸およびα−ヒドロキシイソ酪酸
への加水分解反応活性を比較した。なお、生成物である
α−オキシ酸の分析は、反応液をそのまま用い、ガスク
ロマトグラフ法により行なった。結果を第１表に示した
。なお、生成活性の定義はミリモル−化成物／グラムー
乾燥菌体發・時間である。

第１表 実施例４ 実施例２と同様にして調製したコリネバクテリウム　ス
ベシース　Ｂ−９６を乾燥重但として２重子％となるよ
うに、ｐＨ７，０に！Ｊ！ＩＩしたリン酸ハフファー液
に懸潤した。これにラクトニトリルを１時間に２重量％
の割合で連続的に滴下し、３０′Ｃで反応させた。４時
間反応させた後、遠心分離により菌体を除去し、得られ
たＣ明液を分析したところ、乳酸４度９．８％であった
。

実施例５ 実施例４で得られたコリネバクテリウム　スペシース　
Ｂ−９６を用いた反応液から、遠心分離法により菌体を
回収し、再びｐＨ７，０のリン酸バッファーに乾燥重量
として２重量％となるよう：Ｕ澗して、実施例４と同様
にラクトニトリルを連続的に滴下し、４時間反応させた
。このような操作を合計５回繰り返したところ、第２表
の成績を得た。

第２表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. コリネバクテリウム属に属し、α−ヒドロキシルニトリ
   ル化合物を加水分解する能力を有する微生物の作用によ
   り、α−ヒドロキシルニトリル化合物から対応するα−
   オキシ酸とアンモニアを生成せしめることを特徴とする
   α−オキシ酸およびその塩の微生物学的製造法。