JPH0338836B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、微生物の作用により、α−ヒドロキ
シルニトリル化合物から対応するα−オキシ酸お
よびその塩の製造法に関するものである。生成し
たα−オキシ酸とアンモニアは、通常、α−オキ
シ酸アンモニウム塩の形で存在しているが、α−
オキシ酸アンモニウム塩は、ほぼ論理量の強酸処
理または熱分解処理等により、α−オキシ酸とし
て回収することが可能である。α−オキシ酸のう
ち、乳酸は食品用、醸造用、工業用として、グリ
コール酸は農薬、医薬原料として、α−オキシイ
ソ酪酸は有機合成原料として有用な化学物質であ
る。 （従来の技術） ニトリル化合物が微生物により資化ないし分解
されることは、アセトニトリル等〔ジヤーナル
オブ フアーメンテーシヨン テクノロジー（J.
Ferment.Technol.）47巻、631頁、1969年〕、α
−アミノニトリル（ジヤーナル オブ フアーメ
ンテーシヨン テクノロジー49巻、1011頁、1971
年）、ベンゾニトリル〔バイオケミカル ジヤー
ナル（Biochemical Journal）165巻、309頁、
1977年〕等が知られている。また、α−ヒドロキ
シルニトリル化合物の微生物学的加水分解による
α−オキシ酸の製造法として、バチルス属、バク
テリジウム属、ミクロコツカス属およびブレビバ
クテリウム属等の微生物を用いる方法（特公昭58
−15120号）や、トルロプシス キヤンデイダ
GN405菌株を用いる方法（ジヤーナル オブ
フアーメンテーシヨン テクノロジー51巻、393
頁、1973年）が知られている。 （発明が解決しようとする問題点） しかし、バチルス属、バクテリジウム属、ミク
ロコツカス属およびブレビバクテリウム属等の微
生物を用いる方法は、ラクトニトリルに対し充分
な加水分解活性を示すが、微生物の寿命という点
で、工業的に利用可能な寿命が認められていなか
つた。また、トルロプシス キヤンデイダ
GN405菌株を用いた場合は、α−ヒドロキシイ
ソカプロニトリルに対する加水分解活性はごく僅
かであり、また、α−ヒドロキシイソバレロニト
リルに対する加水分解活性も低く、工業的な反応
活性が認められていなかつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような工業的な問題点の解
決を目標にして、α−ヒドロキシルニトリル化合
物を加水分解し、生成したα−オキシ酸が分解、
資化されて消滅せず、さらに、長期間にわたつて
α−ヒドロキシルニトリル化合物加水分解活性を
失わない微生物の探索と培養および反応条件の研
究を鋭意行つた結果、コリネバクテリウム属に属
する微生物の中から選ばれたα−ヒドロキシルニ
トリル化合物加水分解活性を有する微生物を見い
出し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、コリネバクテリウム属に
属し、α−ヒドロキシルニトリル化合物加水分解
活性を有する微生物の作用により、α−ヒドロキ
シルニトリル化合物からα−オキシ酸およびその
塩を生成させることを特徴とする微生物によるα
−オキシ酸およびその塩の製造法である。 本発明で使用されるα−ヒドロキシルニトリル
としては、グリコロニトリル、ラクトニトリルお
よびアセトンシアンヒドリンなどである。また、
対応するα−オキシ酸としては、それぞれグリコ
ール酸、乳酸およびα−オキシイソ酪酸などであ
る。 また、本発明で使用される微生物は、コリネバ
クテリウム属に属する微生物で、α−ヒドロキシ
ルニトリルからα−オキシ酸を生産する能力を有
するものであり、コリネバクテリウム ニトリロ
フイラス菌株（Corynebacterium nitrilophylus
ATCC 21419）、コリネバクテリウム スペシー
ス Ｂ−96菌株（Corynebacterium sp.B−96）
およびコリネバクテリウム スペシース Ｃ−99
菌株（Corynebacterium sp.C−99）などを好適
なものとしてあげることができる。 コリネバクテリウム ニトリロフイラス菌株は
アメリカン タイプカルチヤー コレクシヨン
（American Type Culture Collection：ATCC）
に、また、コリネバクテリウム スペシース Ｂ
−96菌株およびコリネバクテリウム スペシース
Ｃ−99菌株は、それぞれ微工研菌寄第7733号お
よび7734号として微生物工業技術研究所に寄託さ
れており、これらの菌学的性質は、以下に示すと
おりである。なお、コリネバクテリウム ニトリ
ロフイラス ATCC21419は、アセトニトリル等
のニトリル化合物を資化分解する微生物として分
解されたもので、その性質はジヤーナル オブ
フアーメンテーシヨン テクノロジー47巻、631
頁、1969年に詳しく記載されている。 コリネバクテリウム スペシース Ｂ−96菌株 ａ 形態 細胞の形および大きさ 桿菌 2.1〜2.4×3.6〜5.5μｍ 細胞の多形性の有無 分枝状および球状で
顕著な多形性を示す。 運動性の有無 無 胞子の有無 無 グラム染色性 陽性 抗酸性 無 ｂ 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養 円形、表面粗、全縁、
中心突状、ピンク色、表面平滑、バター状、
不透明。 肉汁寒天斜面培養 生育中程度、糸状、表
面は皺が多い、ピンク色、隆起状、波状。 肉汁液体培養 厚いがもろい菌膜形成、透
明またはわずかに混濁、沈渣あり。 肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず、上部で
生育最も良好。 リトマスミルク 変化しない。 ｃ 生理学的性質 硝酸塩の還元 陰性 MRテスト 陰性 VPテスト 陰性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 デンプンの加水分解 陰性 無機窒素源の利用 陽性 可溶性色素の生成 陰性 ただし、菌はピ
ンク色になる。 ウレアーゼ 陽性 カタラーゼ 陽性 〓〓 セルロースの加水分解 陰性 〓〓 生育の範囲 PH５〜９、好ましくは６〜８ 温度18〜39℃、好ましくは23〜36℃ 〓〓 酸素に対する態度 好気性 〓〓 糖から酸およびガスの生成 酸の生成 ガスの生成 ブドウ糖 ＋ − 麦芽糖 ＋ − シヨ糖 − − 乳 糖 − − コリネバクテリウム スペシース Ｂ−99菌株 ａ 形態 細胞の形および大きさ 桿菌 0.7〜1.2×1.2〜1.7μｍ 細胞の多形性の有無 分枝状で多形性を示
す。 運動性の有無 無 胞子の有無 無 グラム染色性 陽性 抗酸性 無 ｂ 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養 円形、表面粗、全縁、
中心突状、うすいピンク色、表面平滑、バタ
ー状、不透明。 肉汁寒天斜面培養 生育、糸状、表面は皺
が多い、ピンク色、隆起状、波状。 肉汁液体培養 厚いがもろい菌膜形成、透
明またはわずかに混濁、沈渣。 肉汁ゼラチン穿刺培養 液化せず、上部で
生育最も良好。 リトマスミルク 変化しない。 ｃ 生理学的性質 硝酸塩の還元 陰性 MRテスト 陰性 VPテスト 陰性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 デンプンの加水分解 陰性 無機窒素源の利用 陽性 可溶性色素の生成 陰性 ただし、菌はピ
ンク色になる。 ウレアーゼ 陽性 カタラーゼ 陽性 〓〓 セルロースの加水分解 陰性 〓〓 生育の範囲 PH５〜10、好ましくは６〜８ 温度10〜40℃、好ましくは25〜35℃ 〓〓 酸素に対する態度 好気性 〓〓 糖から酸およびガスの生成 酸の生成 ガスの生成 ブドウ糖 ＋ − 麦芽糖 ＋ − シヨ糖 − − 乳 糖 − − 以上の菌学的性質をバージーの細菌分類書
（Bergy's Manual of Determinative
Bacteriology）第８版（1974）に基いて分類す
ると、Ｂ−96菌株およびＣ−99菌株は、グラム陽
性、胞子形成能無、非抗酸性、好気性で多形性を
示す桿菌であることから、コリネバクテリウム属
に属する細菌であると決定した。コリネバクテリ
ウム ニトリロフイラス ATCC21419、Ｂ−96
菌株、Ｃ−99菌株は、スラントの外観や、生育条
件およびニトリル資化能などで差異がある。 本発明においては、通常、これらの菌株は１種
を用いるが、２種以上の混合菌体を用いてもよ
く、さらに、上記菌株以外の同様な作用をする菌
株を併用してもよい。 次に、本発明の一般的実施態様について説明す
る。本発明に使用される微生物の培養には、アセ
トニトリル、イソブチロニトリル等の飽和ニトリ
ル化合物を唯一の炭素源、窒素源とするか、もし
くはグルコース、アルドース等の炭素源、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム等の窒素源に、飽
和ニトリルを炭素源、窒素源として共存させたも
のに、リン酸塩、カリウム、鉄、マグネシウム、
マンガン、亜鉛等の無機栄養源などを適宜含有し
た培地が用いられる。また、飽和ニトリル化合物
を全く添加しない培地を用いて培養し、培養途中
に適宜ニトリル化合物を添加して培養を続けるこ
とにより、α−ヒドロキシルニトリル化合物の加
水分解活性を持つた菌体を取得することができ
る。培地のPHは通常５〜９、好ましくは６〜８、
温度は通常20〜35℃、好ましくは25〜32℃で、１
〜５日間好気的に培養を行なう。 このようにして得られた菌体培養物、それから
分離した菌体およびその酵素抽出物を水またはリ
ン酸バツフアー（例えばPH７〜８）などの緩衝液
に懸濁し、これにα−ヒドロキシルニトリル化合
物を共存させれば、速やかに加水分解反応が進行
し、対応するα−オキシ酸とアンモニアを生成す
る。すなわち、通常、前記微生物菌体を１〜10重
量％、およびα−ヒドロキシルニトリル化合物を
0.5〜10重量％含む水性懸濁液を、温度５〜35℃、
PH５〜10の条件を用いて、５分ないし24時間反応
させればよい。また、反応に際して基質として用
いるα−ヒドロキシルニトリル化合物は、一般に
生物毒性が強いので、反応系内の基質濃度は、反
応を阻害しない程度の濃度にコントロールしつ
つ、逐次添加することができる。 かくして、α−ヒドロキシルニトリル化合物
は、副生物であるα−オキシ酸アミド化合物の生
成がほとんどなく、ほぼ100％のモル収率で対応
するα−オキシ酸とアンモニアに転換し、α−オ
キシ酸アンモニウム塩の高濃度水溶液として生成
蓄積させることができる。また、反応後、反応液
と微生物菌体とを分離し、得られた微生物菌体を
用い、繰り返しα−ヒドロキシルニトリル化合物
の加水分解反応を行なうことができる。 なお、上記反応には、菌体または酵素を例え
ば、アクリルアミドゲルまたはアルギン酸カルシ
ウムなどを用いる通常の固定化法にしたがつて固
定化し、使用することもできる。また、反応器型
式に関しては、バツチ式、連続式または再使用式
のいずれの型式を用いて行なうことも可能であ
る。 （発明の効果） 本発明は、α−ヒドロキシルニトリル化合物の
加水分解活性を有するコリネバクテリウム属に属
する微生物を用いることにより、α−ヒドロキシ
ルニトリル化合物をほぼ100％の収率で、対応す
るα−オキシ酸とアンモニアに転換することを見
い出したもので、常温、常圧という温和な条件下
で反応が進行し、工業的に有利なα−ヒドロキシ
ルニトリル化合物の加水分解反応に応用できるも
のである。 （実施例） 次に、本発明を実施例により説明する。 実施例 １ コリネバクテリウム ニトリロフイラス
ATCC21419を下記のＡ培地にて、24時間30℃で
振盪培養した。 Ａ培地 グルコース 1.0％ 肉エキス 1.0％ ペプトン 0.3％ 食 塩 0.1％ イソブチロニトリル 0.5％ リン酸第一カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ 硫酸第一鉄 0.005％ 硫酸マンガン 0.005％ 硫酸アンモニウム 0.1％ 硝酸カリウム 0.1％ PH 7.0 上記培養条件にて増殖した菌体を遠心分離によ
り集菌し、乾燥菌体量として２重量％、ラクトニ
トリル２重量％、PH7.0に調整したリン酸バツフ
アー液96重量％の反応液を調合し、30℃で反応を
開始した。反応開始後１時間でラクトニトリルは
加水分解し、モル収率ほぼ100％で乳酸アンモニ
ウム塩が生成していた。また、乳酸アミドの生成
はほとんど見られなかつた。なお、生成物の分析
は、反応終了後、菌体を遠心分離により除去し、
ガスクロマトグラフ法により乳酸および乳酸アミ
ドを、ネスラー法によりアンモニアをそれぞれ定
量した。乳酸アンモニウム塩は、ガスクロマトグ
ラフ法では乳酸として検出された。 実施例 ２ コリネバクテリウム スペシース Ｃ−99を下
記のＢ培地にて、24時間30℃で振盪培養した後、
集菌し、さらにＣ培地にて24時間30℃で振盪培養
を続けた。 Ｂ培地 グルコース 1.0％ 肉エキス 1.0％ ペプトン 0.3％ 食 塩 0.1％ PH 7.0 Ｃ培地 イソブチロニトリル 0.5％ リン酸第一カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ 硫酸第一鉄 0.005％ 硫酸マンガン 0.005％ 硫酸アンモニウム 0.1％ 硝酸カリウム 0.1％ PH 7.0 上記培養条件にて増殖した菌体を遠心分離によ
り集菌し、乾燥菌体量として２重量％、グリコロ
ニトリル１重量％、PH7.0に調整したリン酸バツ
フアー液97重量％の反応液を調合し、30℃で反応
を開始した。反応開始後30分でグリコロニトリル
は加水分解し、モル収率ほぼ100％でグリコール
酸アンモニウム塩が生成していた。また、グリコ
ール酸アミドの生成はほとんど見られなかつた。
生成物の分析は、実施例１と同様にガスクロマト
グラフ法およびネスラー法で行なつた。グリコー
ル酸アンモニウム塩は、ガスクロマトグラフ法で
はグリコール酸として検出された。 実施例 ３ コリネバクテリウム ニトリロフイラス
ATCC21419を実施例１と同様な培養条件にて増
殖した菌体を遠心分離により集菌し、乾燥菌体量
として１重量％、α−ヒドロキシルニトリル２重
量％、PH7.0、リン酸バツフアー液97重量％の反
応液を調合し、30℃で反応を行なつた。α−ヒド
ロキシルニトリルとしては、グリコロニトリル、
ラクトニトリルおよびアセトンシアンヒドリンを
用い、それぞれ対応するα−オキシ酸であるグリ
コール酸、乳酸およびα−ヒドロキシイソ酪酸へ
の加水分解反応活性を比較した。なお、生成物で
あるα−オキシ酸の分析は、反応液をそのまま用
い、ガスクロマトグラフ法により行なつた。結果
を第１表に示した。なお、生成活性の定義はミリ
モル−生成物／グラム−乾燥菌体量・時間であ
る。

【表】 実施例 ４ 実施例２と同様にして調整したコリネバクテリ
ウム スペシース Ｂ−96を乾燥重量として２重
量％となるように、PH7.0に調整したリン酸バツ
フアー液に懸濁した。これにラクトニトリルを１
時間に２重量％の割合で連続的に滴下し、30℃で
反応させた。４時間反応させた後、遠心分離によ
り菌体を除去し、得られた透明液を分析したとこ
ろ、乳酸濃度9.8％であつた。 実施例 ５ 実施例４で得られたコリネバクテリウム スペ
シース Ｂ−96を用いた反応液から、遠心分離法
により菌体を回収し、再びPH7.0のリン酸バツフ
アーに乾燥重量として２重量％となるよう懸濁し
て、実施例４と同様にラクトニトリルを連続的に
滴下し、４時間反応させた。このような操作を合
計５回繰り返したところ、第２表の成績を得た。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コリネバクテリウム属に属し、α−ヒドロキ
   シルニトリル化合物を加水分解する能力を有する
   微生物の作用により、α−ヒドロキシルニトリル
   化合物から対応するα−オキシ酸とアンモニアを
   生成せしめることを特徴とするα−オキシ酸およ
   びその塩の微生物学的製造法。