JPS6356800B2

JPS6356800B2 -

Info

Publication number: JPS6356800B2
Application number: JP59162863A
Authority: JP
Inventors: Kyoshi Kawakami; Hidemaro Iwashita; Morio Mimura
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1984-08-03
Filing date: 1984-08-03
Publication date: 1988-11-09
Also published as: JPS6140795A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、微生物の作用により、アセトニトリ
ル、プロピオニトリル、ノルマルブチロニトリ
ル、イソブチロニトリル、アクリロニトリルまた
はメタクリロニトリルから対応する有機酸および
その塩の製造法に関するものである。生成した有
機酸とアンモニアは、通常、有機酸アンモニウム
塩の形で存在しているが、有機酸アンモニウム塩
は、ほぼ理論量の強酸処理または熱分解処理等に
より、有機酸として回収することが可能である。
炭素数２〜４の有機酸のうち、特にアクリル酸お
よびメタクリル酸は、アクリル酸メチルおよびメ
タクリル酸メチルの合成原料としてばかりでな
く、種々の高級エステルの原料としても有用であ
る。（従来の技術）従来、ニトリル化合物を、強酸を用い加水分解
すれば、有機酸となることはよく知られている
が、同時に生成する廃酸の処理が大きな問題であ
つた。アクリル酸またはメタクリル酸の製造法に
関しては、アクリロニトリルまたはメタクリロニ
トリルを強酸で加水分解した場合のこうした問題
点を解決すべく、プロピレンまたはイソブチレン
の２段階の気相酸化反応により、アクロレインお
よびメタクロレインを経由して製造する方法が既
に開発されている。しかし、この方法においても
高温反応があり、触媒の劣化と共に反応生成物の
重合が大きな問題点として残されており、さらに
新規で工業的に有利な製造方法の開発が望まれて
いる。一方、ニトリル化合物が微生物により資化ない
しは分解されることは、アセトニトリル等〔ジヤ
ーナルオブフアーメンテーシヨンテクノロ
ジー（J.Ferment.Technol.）47巻，631頁，1969
年，同誌49巻，1011頁，1971年〕、α―ヒドロキ
シイソバレロニトリル（ジヤーナルオブフア
ーメンテーシヨンテクノロジー51巻，393頁，
1973年）、ベンゾニトリル〔バイオケミカルジ
ヤーナル（Biochemical Journal）165巻，309
頁，1977年）等が知られている。また、ニトリル
化合物の微生物学的加水分解による有機酸類の製
造法として、バチルス属、バクテリジウム属、ミ
クロコツカス属およびブレビバクテリウム属等の
微生物を用いる方法（特公昭58−15120）や、ア
クリロニトリルからアクリル酸とアンモニアへ、
アルスロバクタースペシースＩ―９を用いる反
応（ジヤーナルオブフアーメンテーシヨン
テクノロジー57巻，８頁，1979年）が知られてい
る。（発明が解決しようとする問題点）しかし、バチルス属、バクテリジウム属、ミク
ロコツカス属およびブレビバクテリウム属等の微
生物を用いる方法は、α―ヒドロキシニトリル類
やアミノニトリル類に対しては充分な加水分解活
性を示すが、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、ノルマブチロニトリル、イソブチロニトリ
ル、アクリロニトリルおよびメタクリロニトリル
に対しては、工業的な反応活性が認められていな
かつた。また、アルスロバクター属の微生物を用
いた場合には、培養時に使用したニトリル化合物
と同一のニトリル化合物で加水分解を行なうとき
には、生成した有機酸が、さらに分解、資化され
て、消滅してしまうことがあり、反応生成物の収
率の低下が考えられた。（問題点を解決するための手段）本発明者らは、このような工業的な問題点の解
決を目標にして、アセトニトリル、プロピオニト
リル、ノルマルブチロニトリル、イソブチロニト
リル、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリ
ルを加水分解し、生成した有機酸が分解、資化さ
れて消滅しないようなニトリル化合物加水分解活
性を有する微生物の探索と培養および反応条件の
研究を鋭意行つた結果、コリネバクテリウム属に
属する微生物の中から選ばれたニトリル化合物加
水分解活性を有する微生物を発見し、本発明を完
成した。すなわち、これらの微生物は、炭素数２
〜４のニトリル化合物に強い加水分解活性を示す
と共に、反応生成物である有機酸が分解、資化さ
れて消滅しない性質を持つものである。本発明に用いられる微生物は、コリネバクテリ
ウムニトリロフイラス（Corynebacterium
nitrilophylus ATCC 21419）、コリネバクテリウ
ムスペシースＢ―96菌株およびコリネバクテ
リウムスペシースＣ―99菌株は、それぞれア
メリカンタイプカルチヤーコレクシヨン
（American Type Cultute Collection ATCC）
ならびに微工研菌寄第7733号および第7734号とし
て寄託されており、菌学的性質は以下に示すとお
りである。なお、コリネバクテリウムニトリロ
フイラス ATCC21419は、アセトニトリル等の
ニトリル化合物を資化分解する微生物として分離
されたもので、その性質はジヤーナルオブフ
アーメンテーシヨンテクノロジー47巻，631頁，
1969年に詳しく記載されている。コリネバクテリウムスペシースＢ―96菌株ａ形態細胞の形および大きさ桿菌 2.1〜2.4×3.6〜5.5μｍ細胞の多形性の有無
分技状および球状で顕著な多形性を示す。運動性の有無無胞子の有無無グラム染色性陽性抗酸性無ｂ各培地における生育状態肉汁寒天平板培養円形、表面粗、全縁、中
心突状、ピンク色、表面平滑、バター状、不透
明。肉汁寒天斜面培養生育中程度、糸状、表面
は皺が多い、ピンク色、隆起状、波状。肉汁液体培養厚いがもろい菌膜形状、透明
またはわずかに混濁、沈渣あり。肉汁ゼラチン穿刺培養液化せず、上部で生
育最も良好。リトマスミルク変化しない。ｃ生理学的性質硝酸塩の還元陰性 MRテスト陰性 VPテスト陰性インドールの生成陰性硫化水素の生成陰性デンプンの加水分解陰性無機窒素源の利用陽性可溶性色素の生成陰性ただし、菌はピンク色になる。ウレアーゼ陽性カタラーゼ陽性セルロースの加水分解陰性生育の範囲PH５〜９、好ましくは６〜８、温
度18〜39℃、好ましくは23〜36℃ 酸素に対する態度好気性糖から酸およびガスの生成酸の生成ガスの生成ブドウ糖＋ − 麦芽糖＋ − シヨ糖 − − 乳糖 − − コリネバクテリウムスペシースＣ−99菌株ａ形態細胞の形および大きさ桿菌 0.7〜1.2×1.2〜1.7μｍ細胞の多形性の有無分技状で多形性を示す。運動性の有無無胞子の有無無グラム染色性陽性抗酸性無ｂ各培地における生育状態肉汁寒天平板培養円形、表面粗、全縁、中
心突状、うすいピンク色、表面平滑、バター
状、不透明。肉汁寒天斜面培養生育、糸状、表面は皺が
多い、ピンク色、隆起状、波状。肉汁液体培養厚いがもろい菌膜形成、透明
またはわずかに混濁、沈渣。肉汁ゼラチン穿刺培養液化せず、上部で生
育最も良好。リトマスミルク変化しない。ｃ生理学的性質硝酸塩の還元陰性 MRテスト陰性 VPテスト陰性インドールの生成陰性硫化水素の生成陰性デンプンの加水分解陰性無機窒素源の利用陽性可溶性色素の生成陰性
ただし、菌はピンク色になる。ウレアーゼ陽性カタラーゼ陽性セルロースの加水分解陰性生育の範囲PH５〜10、好ましくは６〜８温度
10〜40℃、好ましくは25〜35℃ 酸素に対する態度好気性糖から酸およびガスの生成酸の生成ガスの生成ブドウ糖＋ − 麦芽糖＋ − シヨ糖 − − 乳糖 − − 以上の菌学的性質をバージーの細菌分類書
（Bergy′s Manual of Determinative
Bacteriolgy）第８版（1974）に基いて分類する
と、Ｂ―96菌株およびＣ―99菌株は、グラム陽
性、胞子形成能無、非抗酸性、好気性で多形性を
示す桿菌であることから、コリネバクテリウム属
に属する細菌であると決定した。コリネバクテリ
ウムニトリロフイラス ATCC21419、Ｂ―96
菌株、Ｃ―99菌株は、スラントの外観や、生育条
件およびニトリル資化能などで差異がある。これらの微生物は、工業技術院微生物工業技術
研究所に下記の番号で寄託されている。菌株寄託番号寄託日Ｂ―96 微工研菌寄第7733号昭和59年７月20日Ｃ―99 同 7734号同上また、特公昭56−17918に記載されているコリ
ネバクテリウムＮ―771およびＮ―774菌株と、本
発明に使用した微生物とは、硝酸塩の還元能にお
いて明らかに異なつており、異なつた種の微生物
と考えられる。本発明に使用される微生物の培養には、アセト
ニトリル、イソブチロニトリル等の飽和ニトリル
化合物を唯一の炭素源、窒素源とするか、もしく
はグルコース、アルドース等の炭素源、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム等の窒素源に、飽和
ニトリルを炭素源、窒素源として共存させたもの
に、リン酸塩、カリウム、鉄、マグネシウム、マ
ンガン、亜鉛等の無機栄養源等を適宜含有した培
地が用いられる。また、飽和ニトリル化合物を全
く添加しない培地を用いて培養し、培養途中に適
宜ニトリル化合物を添加して培養を続けることに
よつて、ニトリル化合物の加水分解活性を持つた
菌体を取得することができる。培地のPHは通常５
〜９、好ましくは６〜８、温度は通常20〜35℃、
好ましくは25〜32℃で、１〜５日間好気的に培養
を行なう。このようにして、得られた菌体培養物、それか
ら分離した菌体およびその酸素抽出物を水または
リン酸バツフアー（たとえばPH７〜８）などの緩
衝液に懸濁し、これに炭素数２〜４のニトリル化
合物を共存させれば、速やかに加水分解反応が進
行し、対応する有機酸とアンモニアを生成する。
すなわち、通常、前記微生物菌体１〜10重量％お
よびニトリル化合物0.2〜10重量％を含む水性懸
濁液を、温度５〜35℃、PH５〜10の条件を用い
て、10分ないしは24時間反応させればよい。ま
た、反応に際して基質として用いるニトリル化合
物は、一般に生物毒性が強いので、反応系内の基
質濃度は反応を阻害しない程度の濃度にコントロ
ールしつつ、逐次添加することができる。かくし
て、アセトニトリル、プロピオニトリル、ノルマ
ルブチロニトリル、イソブチロニトリル、アクリ
ロニトリルまたはメタクリロニトリルは、副生物
であるアミド化合物の生成なしに、ほぼ100％の
モル収率で対応する有機酸とアンモニアに転換
し、有機酸アンモニウム塩の高濃度水溶液として
生成蓄積させることができる。なお、上記反応には、菌体または酸素をたとえ
ばアクリルアミドゲルまたはアルギン酸カルシウ
ム等を用いる通常の固定化法にしたがつて固定化
し、使用することもできる。また、反応器型式に関しては、バツチ式、連続
式または再使用式のいずれの型式を用いて行なう
ことも可能である。（発明の効果）本発明は、ニトリル化合物の加水分解活性を有
するコリネバクテリウム属に属する微生物を用る
ことにより、アセトニトリル、プロピオニトリ
ル、ノルマルブチロニトリル、イソブチロニトリ
ル、アクリロニトリルまたはメタクリロニトリル
をほぼ100％の収率で対応する有機酸とアンモニ
アに転換することを見出したもので、常温、常圧
という温和な条件で反応が進行するため、重合ロ
スのない工業的に有利なニトリル化合物の加水分
解反応に応用できるものである。（実施例）次に、本発明を実施例により説明する。実施例１コリネバクテリウムニトリロフイラス
ATCC21419を下記のＡ培地を用い、24時間30℃
で振盪培養した後、集菌し、さらに、Ｂ培地を用
いて、24時間30℃で振盪培養した。Ａ培地グルコース 1.0％肉エキス 1.0％ペプトン 1.0％食塩 0.1％ PH 7.0 Ｂ培地イソブチロニトリル 0.5％リン酸第一カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％硫酸第一鉄 0.005％硫酸マンガン 0.005％硫酸アンモニウム 0.1％硝酸カリウム 0.1％ PH 7.0 上記培養条件で増殖した菌体を遠心分離により
集菌し、乾燥菌体量として２重量％、メタクリロ
ニトリル２重量％、PH7.0リン酸バツフアー液96
重量％の反応液を調合し、30℃で反応を開始し
た。反応開始後３時間でメタクリロニトリルは加
水分解し、モル収率ほぼ100％でメタクリル酸ア
ンモニウム塩が生成していた。また、メタクリル
アミドの生成はほとんど見られなかつた。なお、生成物の分析は、反応終了後、菌体を遠
心分離により除去し、ガスクロマトグラフ法によ
りメタクリル酸、メタクリルアミドを、ネスラー
法によりアンモニアをそれぞれ定量した。メタク
リル酸アンモニウム塩は、ガスクロマトグラフ法
ではメタクリル酸として検出された。実施例２コリネバクテリウムニトリロフイラス
ATCC21419を実施例１と同様な培養条件で培養
した。アクリロニトリル２重量％とする以外は、
実施例１と同様な反応条件で反応を開始したとこ
ろ、反応開始後30分でアクリロニトリルは加水分
解し、モル収率ほぼ100％でアクリル酸アンモニ
ウム塩が生成していた。また、アクリルアミドの
生成はほとんど見られなかつた。なお、生成物の
分析は、実施例１と同様に行つた。実施例３コリネバクテリウムニトリロフイラス
ATCC21419を実施例１と同様な培養条件で培養
した。アセトニトリル、プロピオニトリル、ノル
マルブチロニトリルおよびイソブチロニトリルを
それぞれ２重量％とする以外は、実施例１および
２と同様な反応条件で反応を実施し、単位菌体量
および単位時間当りの反応活性を比較し、結果を
第１表に示した。なお、比活性はミリモル―生成
物／グラム―乾燥菌体量・時間で示した。

【表】実施例４コリネバクテリウムスペシースＢ―96菌株
を下記のＣ培地を用い、24時間30℃で振盪培養し
た。Ｃ培地グルコース 1.0％肉エキス 1.0％ペプトン 1.0％食塩 0.1％アセトニトリル 0.5％リン酸第一カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％硫酸第一鉄 0.005％硫酸マンガン 0.005％硫酸アンモニウム 0.1％硝酸カリウム 0.1％ PH 6.0 上記培養条件で増殖した菌体を遠心分離により
集菌し、メタクリロニトリル、アクリロニトリル
およびアセトニトリルをそれぞれ２重量％とする
以外は、実施例１と同様な反応条件で反応を実施
し、反応活性を比較した。結果を第２表に示し
た。

【表】実施例５コリネバクテリウムスペシースＣ―99菌株
を実施例４と同様な培養条件で培養し、菌体を調
製した。メタクリロニトリル、アクリロニトリルおよび
アセトニトリルを用いて、実施例４と同様の条件
によつて反応を行ない、反応活性を比較した。結
果を第３表に示した。

【表】実施例６実施例１と同様にして調整したコリネバクテリ
ウムニトリロフイラス ATCC21419の菌体を、
乾燥重量として２重量％となるようにPH6.0の蒸
溜水に懸濁した。これにメタクリロニトリルを３
時間に２重量％の割合で連続的に滴下し、30℃で
反応させた。12時間反応させた後、遠心分離によ
り菌体を除去し澄明液を得た。このもののメタク
リル酸濃度を定量したところ、9.7重量％の含有
率であつた。実施例７実施例６で得られた反応液から、遠心分離法に
より菌体を回収し、再びPH6.0の蒸溜水に乾燥菌
体量として２重量％になるように懸濁して、実施
例６と同様にメタクリロニトリルとを連続的に滴
下し、12時間反応させた。このような操作を合計
５回繰り返したところ、第４表の成績を得た。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１コリネバクテリウム属に属し、ニトリル化合
物を加水分解する能力を有する微生物の作用によ
り、アセトニトリル、プロピオニトリル、ノルマ
ルブチロニトリル、イソブチロニトリル、アクリ
ロニトリルまたはメタクリロニトリルから対応す
る有機酸とアンモニアを生成せしめることを特徴
とする炭素数２〜４の有機酸およびその塩の微生
物学的製造法。