KR870001811B1

KR870001811B1 - 미생물을 이용한 아미드의 제조방법

Info

Publication number: KR870001811B1
Application number: KR1019860004450A
Authority: KR
Inventors: 기요시 가와까미; 도요지 다나베; 오사무 나가노
Original assignee: 아사히가세이고오교 가부시끼가이샤; 요미야마 아끼라
Priority date: 1985-06-04
Filing date: 1986-06-04
Publication date: 1987-10-13
Also published as: EP0204555A2; DE3685371D1; ATE76432T1; EP0204555B1; KR870000430A; EP0204555A3; JPH0740948B2; JPS6291189A

Abstract

내용 없음.

Description

미생물을 이용한 아미드의 제조방법

본 발명은 미생물을 이용한 아미드의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 로도코쿠스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물의 작용에 의해 니트릴을 수화하여 상응하는 아미드를 수득하고, 아미드를 분리해 내는 아미드의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법은 각종 아미드를 상응하는 니트릴로부터 제조할 수 있다는 점에서 유리하다.

공업적 분야에서 가장 중요한 아미드로는 아크릴아미드 및 메타크릴아미드가 공지이다. 아크릴아미드는 중합체응고제, 종이강화제, 섬유개량물질등으로 이용된다. 더우기, 석유제품 회수의 분야에서 중요한 용도가 개발되고 있다. 한편, 메타크릴아미드는 우수한 내열성 및 광가교성 뿐만 아니라 소수성 및 친수성의 균형잡힌 특정으로 인해, 피복조성물, 접착제, 광가교성조성물 등으로 널리 이용되고 있다.

촉매로 환원구리를 사용하여 니트릴을 수화시키는 아미드의 제조방법이 공지되어 있다. 이 방법은 특매의 재생이 어렵고, 생성된 아미드의 분리 및 정제에 여러가지 공정이 필요한 단점이 있다. 그러므로, 공업분야에서 유리하게 사용될 수 있는 신규 방법의 개발이 요청되고 있다.

이런 신규의 유리한 방법을 개발하기 위해, 최근 미생물을 사용하는 방법에 관한 몇가지 보고가 있었다. 예를 들면, 미합중국 특허 제4001081호(영국 특허 제1535307호 및 일본국 특허공개 제86186/1976호에 상응)에는, 니트릴을 바실루스(Bacillus), 박테리디움(Bacteridium), 미크로코쿠스(Micrococcus) 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속의 군에서 선택된 속에 속하는 미생물로 처리함으로써 아미드를 제조하는 것이 제안되었다. 미합중국 특허 제4248968호(영국 특허 제2018240호 및 일본국 특허공개 제17918/1981호에 상응)에는, 니트릴을 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 노카르디아(Nocardia)속에 속하는 미생물로 처리함으로써 아미드를 제조하는 것이 제안되었다. 유럽 특허공개 제0093782호(일본국 특허공개 제37951/1984호에 상응)에는 니트릴을 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 미생물로 처리함으로써 아미드를 제조하는 것이 제안되었다. 그러나, 상술한 모든 미생물은 니트릴을 상응하는 아미드로 전환시키는데 바람직하게 높은 활성을 갖지는 않는다. 더우기, 상술한 미생물을 사용한 방법들은 대부분의 경우 부산물로 형성된 유기상의 양이 공업적 관점에서 허용되는 것보다 많다. 그러므로, 종래 기술의 상술한 결점이 해소된 신규 아미드의 제조방법을 개발하는 것이 강력히 요망되고 있다.

본 발명자들은 특히 니트릴을 상응하는 아미드로 전환시키는데 바람직하게 높은 활성을 갖는 미생물을 발견 및 분리하는데 광범위한 연구를 계속하였다. 그 결과, 예기치 않게, 로도코쿠스 속에 속하는 미생물이 이런 목적에 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 이런 예기치 않은 발견을 기초로, 본 발명이 완성되었다.

그러므로, 본 발명의 목적은 부산물을 생성하지 않고 고수율로 효과적으로 니트릴로부터 아미드를 제조하는 신규의 생물적 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적, 태양 및 이점은 하기의 상세한 설명에 의해 더욱 명백해질 것이다.

본 발명에 따라, (1) 수성 매질 중에서 니트릴을 로도코쿠스 속에 속하며 니트릴 수화능을 갖는 미생물과 작용시켜 니트릴 상응하는 아미드로 전환시키고, (2) 수성 매질로부터 아미드를 분리함을 특징으로 하는 아미드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법에서, 니트릴을 로도코쿠스속에 속하며 니트릴수화능을 갖는 미생물과 작용시킨다. 상술한 미생물은 저온, 예를 들면 약 10℃에서 조차도 하기에 설명하는 각종 니트릴에 대해 높은 활성을 나타낸다. 미생물의 저온에서의 높은 활성으로 인해, 본 발명의 방법은 저온에서 수행될 수 있어, 미생물이 오랜 기간동안 사용될 수 있다.

로도코쿠스 에리토로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 특히 로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132로 명명된 균주가 본 발명의 목적을 성취하기 위한 상술한 미생물로 유용하며, 또한 로도코쿠스 sp. AK-32 및 로도코쿠스 sp. AK-33으로 명명된 균주가 본 발명의 목적을 성취하기 위한 상술한 미생물로 유용하다는 것이 발견되었다.

본 발명에 이용되는 미생물 균주 로도코쿠스 sp. AK-32, 로도코쿠스 sp. AK-33 및 로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132는 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소(FRI)에 각각 FERM BP-1046, FERM BP-1047 및 FERM BP-1040의 수탁번호로 기탁되어 있다. 또한 이들 미생물은 한국종균협회(KFCC)에 1986년 5월 19일자로 각각 KFCC-10200, KFCC-10201 및 KFCC-10202의 수탁번호로 기탁되어 있다. 이들 미생물 균주는 하기의 미생물학적 및 화학분류적 특성을 갖는다.

A : 로도코쿠스 sp. AK-32

(I) 미생물학적 특성

(a) 형태학

(b) 각종 배양 배지에서의 성장상태

(c) 생리적 특성

(II) 화학분류적 특성

B : 로도코쿠스 sp. AK-33

(I) 미생물학적 특성

(a) 형태학

(b) 각종 배양배지에서의 성장상태

(c) 생리적 특성

(II) 화학분류적 특성

C : 로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132

(I) 미생물학적 특성

(a) 형태

(b) 각종 배양배지에서의 성장상태

(c) 생리적 특성

(II) 화학분류적 특성

상기의 미생물학적 및 화학분류적 특성을 버기즈 매뉴얼어브 디터미네이티브 박테리올로지(8판, 1974) 및 프로캐리오트, 어핸드북은 해비테츠, 아이솔레이션, 앤드 아이댄디 피케이션 어브 박테리아(1981)의 설명과 비교한 결과, 균주 로도코쿠스 sp. AK-32, 로도코쿠스 sp. AK-33 및 로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132는 운동성을 갖지 않는 호기성의 그램 양성 막대형이라는 것을 알 수 있다. 더우기, 이들 미생물은 균사형이 아니라 막대형의 간상균이며, 파생 및 분열하면서 성장하고, 후에 구형 또는 짧은 막대형으로 분할 및 쪼개진다는 것을 알 수 있다. 그의 세포벽의 펩티도글리칸은 메소-디아미노피멜산을 가지며, 그의 N-아실기는 글리콜릴형이다. 그의 체내 지방산의 GC 분석은 직쇄 지방산의 우세 및 10-메틸옥타데칸산을 특징적으로 갖는 미콜산의 존재를 나타낸다. 그러므로, 이들 균주는 로도코쿠스 속에 속하는 것이 명백하다. 이들 균주의 성장조건 및 당으로부터 산 형성에서 차이가 관찰된다.

미생물을 작용시키는 적당한 니트릴로는, 예를 들면, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 숙시노니트릴 및 아디포니트릴과 같은 포화지방족 니트릴, 아크릴로니트릴 및 메타크릴로니트릴과 같은 에틸렌성 불포화니트릴, 벤조니트릴 및 프탈로디니트릴과 같은 방향족 니트릴 및 니코티노니트릴과 같은 헤테로고리니트릴이 있다.

로도코쿠스 속에 속하며, 니트릴을 수화할 수 있는 미생물을 예를들면 탄소 및 질소원으로 피로피오니트릴, 이소부티로니트릴, 메타크릴로니트릴 등과 같은 니트릴을 함유한 배양 배지에서 배양한다. 그러나, 이 미생물은 탄소 및 질소원으로서의 니트릴 이외에도 글루코즈, 알도즈 등과 같은 탄소원, 황산암모늄, 질산암모늄 등과 같은 질소원 및 이스트 추출물, 맥아추출물, 펩톤, 육추출물 등과 같은 유기 영양원을 함유하는 배양배지에서 바람직하게 배양될 수 있다. 이 배지에 인산염, 소듐, 포타슘, 철, 마그네슘, 망간, 아연 등과 같은 무기영양원을 임의로 가할 수 있다. 배양배지의 pH값은 일반적으로 5∼9, 바람직하게는 6∼8이다. 배양온도는 일반적으로 20∼35℃, 바람직하게는 27-32℃이다. 이런 조건하에 공기를 통과시키면서 2∼5일간 배양을 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 수성 매질에서 니트릴에 로도코쿠스 속에 속하며 니트릴 수화능을 갖는 미생물을 작용시킨다. 본 발명의 방법을 실시하는데 각종의 방법이 가능하다. 예를 들면, 미생물을 수화될 니트릴 존재하에 배양하는 방법 및 니트릴을 미생물의 배양된 세포를 함유한 배양액 또는 배양액으로부터 수거된 미생물 세포와 접촉시키는 방법이 있다. 또한, 니트릴을 수거된 미생물을 파쇄하여 얻은 세포와 접촉시키는 방법이 있다. 더우기, 미생물의 세포를 담체에 고정시키고, 이들을 니트릴과 접촉시키는 방법도 있다. 상술한 세포의 수기는 공지 방법에 의해 원심 분리함으로써 수행될 수 있으며, 세포의 파쇄는 기계적으로, 예를 들면 균질화기를 사용하거나 초음파 진동에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에서, 배양된 세포 그 자체를 함유하는 배양액을 상술한 바와같이 니트릴과 접촉시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 배양액으로부터 수거된 세포를 물 또는 인산 완충액(예를들면, pH7∼9)과 같은 완충액에 분산시키고, 니트릴과 접촉시킴으로써 니트릴을 급속하게 수화시켜 상응하는 아미드를 형성할 수 있다.

본 발명에서, 니트릴을 수화하는 조건은 제한되지 않는다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 하기와 같이 실시될 수 있다. 0.1∼5중량%의 미생물 세포 및 0.2∼10중량%의 니트릴을 함유한 pH5∼10의 현탁액을 제조하고, 현탁액을 0∼30℃에서 약 2분∼8시간 동안 유지하여 니트릴을 수화한다. 이와 관련하여, 본 발명에 사용된 니트릴은 일반적으로 생물체에 높은 독성을 나타낸다는 것을 주지해야 한다. 이런 관점에서, 반응 배지에서의 니트릴의 농도는 수화 반응에 역효과를 미치지 않는 농도, 예를 들면 2중량%이하로 조절되는 것이 바람직하다. 그러므로, 바람직한 방법으로는 니트릴을 수화반응도중 점차로 계속적으로 또는 간헐적으로 가하여 미생물을 불활성화를 방지하는 방법이 있다. 이때, 반응 배지의 온도를 낮추는 것이 오랜 기간 동안 미생물의 활성을 유지시키는데 효과적이다.

생성된 반응 혼합물로 부터, 원심분리, 막분리, 진공농축, 결정화 등의 통상적 방법에 의해 생성된 아미드를 분리함으로써 정제된 아미드를 수득할 수 있다. 필요에 따라, 진공농축, 결정화 전에 활성 목탄, 이온 교완 수지등으로 처리함으로써 착색물질, 불순물 등을 제거할 수 있다.

로도코쿠스 속에 속하며 니트릴을 수화하는 능력을 갖는 미생물을 사용한 본 발명의 방법에 따라, 상업적 규모로 저가로 아미드를 제조할 수 있다. 상술한 미생물의 높은 활성 및 니트릴이 상응하는 아미드로 전환되는 수화반응의 높은 선택성으로 인해, 각종 아미드가 거의 100%전환비율로 제조될 수 있다. 즉, 소량의 또는 전혀 부산물이 생성되지 않는다. 더우기, 저온에서조차도 미생물이 높은 활성을 나타내기 때문에, 니트릴의 수화를 저온에서 수행하여, 미생물을 오랜기간동안 사용할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명되나, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

(1) 배양 로도코쿠스 sp. AK-32를 하기의 조건하에 배양한다.

1) 배양배지 :

트립톤 1.7중량% NaCl 0.5중량%

소이펩톤 0.3중량% K₂HPO₄0.25중량%

글루코오즈 0.25중량% pH 7.3

이소부티로니트릴 0.5중량%

2) 배양 조건 : 30℃/4일

(2) 메타크릴로니트릴의 수화

이렇게 수득된 배양브로스의 세포를 원심분리에 의해 수거하여 생리식염수로 세척하고, 다음과 같이 수화하는데 사용한다. 0.2중량부(건조중량기준)의 세포 2.0중량부의 메타크릴로니트릴 및 97.8중량부의 0.05M인 산완충액(pH7.0)을 혼합하여 반응 혼합물을 제조한다. 반응 혼합물의 온도를 30℃에서 유지한다. 5분후, 반응 혼합물을 기체크로마토그래피에 의해 분석한다. 그 결과, 2.5중량부의 메타크릴아미드가 반응혼합물에 포함되어 있으며, 반응되지 않고 남아 있는 메타크릴니트릴 및 메타크릴산 등과 같은 부산물이 반응 혼합물에서 발견되지 않는다는 것이 나타난다. 이것은 메타크릴로니트릴이 거의 정량적으로 메타크릴아미드로 수화되어 반응이 완결되었다는 것을 나타낸다.

[비교예 1]

(1) 배양

코리네박테리움 sp. N-774(FRI의 수탁번호 4446)을 하기의 조건하에 배양한다.

1) 배양배지 : 글루코오즈 1.0중량%

펩톤 0.5중량% 이스트추출물 0.3중량%

맥아추출물 0.3중량% pH 7.2

2) 배양 조건 : 28℃/3일

(2) 메타크릴로니트릴의 수화

배양 후, 배양브로스를 원심분리하여 배양 브로스로부터 세포를 분리한다. 이렇게 수득된 세포를 물로 세척하고, 건조시킨다. 3부의 건조 세포를 97부의 물과 혼합한다. 메타크릴로니트릴을 30℃에서 유지된 생성혼합물에 수산화칼륨을 사용하여 pH를 8.5로 조절하면서 교반하 시간당 3부의 속도로 적가하여 수화 반응을 수행한다. 4시간 동안 반응시킨 후, 메타크릴로니트릴의 첨가를 중단하고, 30분간 더 교반하여 반응을 완결한다. 반응 완결후, 반응 혼합물을 원심분리하여 세포를 제거한다. 이렇게 하여 맑은 용액을 수득한다. 용액중의 메타크릴아미드의 함량을 액체크로마토그래피에 의해 결정하면 13.0중량%이며, 수율은 95몰%이다.

[실시예 2]

(1) 배양

로도코쿠스 sp. AK-23를 하기의 조건하에 배양한다.

1) 배양배지 :

글루코오즈 1.0중량% FeSO₄·7H₂O 0.005중량%

육류추출물 1.0중량% MnSO₄·4∼5H₂O 0.005중량%

펩톤 1.0중량% (NH₄)₂SO₄0.1중량%

이소부티로니트릴 0.25중량% KNO₃0.1중량%

NaCl 0.1중량% pH 7.0

KH₂PO₄0.1중량% MgSO₄·7H₂O 0.05중량%

2) 배양조건 : 30℃/3일

(2) 니트릴의 수화

실시예 1과 실제로 같은 방법에 의해 미생물의 세포를 수거한다.

각종 니트릴을 사용하여 하기의 조건하에 니트릴의 수화를 수행한다.

세포(건조중량) 0.2중량%

기질니트릴 2.0중량%

0.05M인산완충액(pH7.0) 97.8중량%

온도 10℃

반응시간 5분

수득된 결과는 하기에 나타낸다.

시험니트릴 아미드형성활성^*1(몰/g·시) 산형성비^*2(%)

아세토니트릴 0.29 0.10

프로피오니트릴 1.99 0.12

아크릴로니트릴 1.98 0.05

이소부티로니트릴 1.22 0.10

메타크릴로니트릴 0.95 0.02

숙시노니트릴 1.50 0.1이하

아디포니트릴 0.84 0.1이하

벤조니트릴 0.10 0.1이하

테레프탈로니트릴 0.96 0.1이하

니코티노니트릴 0.02 0.1이하

상술한 양들은 숙시노니트릴, 아디포니트릴, 벤조니트릴, 테레프탈로니트릴 및 니코티노니트릴로부터 수득된 것과 같은 높은 비점을 갖는 아미드의 양을 제외하고는 기체크로마토그래피에 의해 결정된다. 이들 아미드의 양은 액체크로마토그래피에 의해 결정된다.

[실시예 3]

(1) 배양

로도코쿠스 sp. AK-33을 실시예 2와 실제로 같은 조건하에 배양한다.

(2) 아크릴로니트릴의 수화

실시예 1과 실제로 같은 방법에 의해 수득된 배양 브로스로부터 미생물의 세포를 수거한다.

0.05M인산완충액(pH7.0) 1ι에 10g(건조중량)양의 세포를 가하여 휴지기 세포 분산액을 제조한다. 20분 간격으로, 2∼3℃에서 20g량의 아크릴로니트릴을 분산액에 가한다. 매번 아크릴로니트릴을 가하기 직전에, 반응혼합물에서의 아크릴로니트릴과 아크릴아미드의 농도를 기체크로마토그래피에 의해 결정한다. 이 결과로 부터, 생성된 아크릴 아미드의 양이 수화반응개시로부터 5시간이 될때까지 반응시간이 경과함에 따라 계속 증가하며, 450g/ι-완충액의 아크릴아미드가 제조된다는 것을 알 수 있다. 이때, 수화반응은 더 진행되나 반응속도가 저하되므로 반응을 증결시킨다.

아크릴아미드의 수율은 약 100몰%이며, 부산물로 형성된 아크릴산의 양은 가해진 아크릴로니트릴을 기작한다. 메타크릴로니트릴의 첨가를 더 계속한다. 메타크릴로니트릴의 첨가개시로부터 18시간 후, 대량의

[비교예 2]

(1) 배양

슈도모나스 클로로라피스 B-23(FRI 수탁번호 187)를 하기의 조건하에 배양한다.

1) 배양배지 :

덱스트린 0.5중량% K₂HPO₄0.2중량%

MgSO₄·7H₂O 0.02중량% 이소부티로니트릴 0.2중량%

NaCl 0.1중량% pH 7.0

2) 배양조건 28℃/3일

(2) 아크릴로 니트릴의 수화

미생물의 세포를 배양 브로스로부터 분리하고, 물로 세척한다. 수득된 세포를 20g(건조중량)/ι-완충액의 농도로 인산완충액(pH 7.0)에 분산시켜 휴지기세포 분산액을 제조한다. 분산액에 0∼4℃의 온도에서 아크릴로니트릴을 간헐적으로 가하여 아크릴로니트릴의 농도를 0.4M로 유지한다. 생성된 아크릴 아미드의 양은 반응 시간이 경과함에 따라 계속 증가하며, 반응 개시로부터 7.5시간 후에 400g/ι-완충액의 아크릴아미드가 제조된다. 반응은 더 진행되나, 반응 혼합물이 점성으로 되기 때문에 이 단계에서 반응을 종결한다.

아크릴아미드의 수율은 약 99몰%이며, 부산물로 형성된 아크릴산의 양은 가해진 아크릴로니트릴을 기준으로 약 0.7%이다.

[실시예 4]

(1) 배양

로도코쿠스 sp. AK-32를 실시예 2와 실제로 같은 방법에 의해 배양한다.

(2) 메타크릴로니트릴의 수화

실시예 3과 실제로 같은 방법에 의해 세포를 수거한다. 1ι의 0.05M인산완충액(pH7.0)에 5g(건조중량)의 세포를 가하여 휴지기 세포분산액을 제조한다. 분산액에 2∼3℃의 온도에서 1시간 간격으로 20g량의 메타크릴로 니트릴을 가한다. 매번 메타크릴로니트릴을 가하기 직전에, 반응혼합물에 반응하지 않고 남아있는 메타크릴로니트릴의 농도를 기체크로마토그래피에 의해 결정한다. 첨가 개시로부터 약 5시간 후에, 메타크릴아미드가 결정으로 분리되기 시작한다. 그 후, 반응하지 않고 남아있는 메타크릴로니트릴로 인해 반응 속도가 저하되기 때문에 2시간당 20g의 감소된 속도로 메타크릴로니트릴의 첨가를 계속한다. 수화반응을 25시간 동안 계속한다. 그 결과, 245g의 메타크릴아미드 결정이 수득된다. 반응혼합물을 4℃에서 1,600시간 동안 냉장 보관한다. 이 혼합물에 20g의 메타크릴로니트릴을 가하여 2∼3℃에서 더 수화반응시킨다. 2시간 후, 어떤 미반응 메타크릴로니트릴도 검출되지 않는다. 메타크릴아미드의 수율은 약 100몰%이며, 부산물로 형성된 메타크릴산의 양은 가해진 메타크릴로니트릴을 기준으로 약 0.1%밖에 안된다.

[실시예 5]

(1) 배양

(2) 메타크릴로니트릴의 수화

세포를 실시예 3과 실제로 같은 방법에 의해 수거한다. 세포를 칼슘 알기네이트겔에 고정시켜 고정된 세포를 수득한다. 25g의 고정된 세포(0.5g 세포, 건조중량)을 75g의 0.5중량%염화칼슘수용액(pH7.0)에 가하여 고정된 휴지기 세포의 분산액을 제조한다. 2g량의 메타크릴로니트릴을 2∼3℃의 온도에서 1시간 간격으로 분산액에 가한다. 매번 메타크릴크로니트릴을 가하기 직전에, 반응 혼합물에 반응하지 않고 남아있는 메타크릴로니트릴의 농도를 기체크로마토그래피에 의해 결정한다. 첨가 개시로부터 약 5시간 후에, 메타크릴아미드가 결정으로 분리되기 시작한다. 그 후, 반응하지 않고 남아있는 메타크릴로니트릴로 인해 반응속도가 저하되기 때문에 2시간당 2g의 감소된 속도로 메타크릴로니트릴의 첨가를 계속한다. 그 결과 10.8g의 메타크릴아미드 결정이 수득된다. 부산물로 형성된 메타크릴산의 양은 가해진 메타크릴로니트릴을 기준으로 약 0.3%정도 밖에 안된다.

[실시예 6]

(1) 배양

로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132를 하기의 조건하에 배양한다.

1) 배양배지 :

이소부티로니트릴 0.5중량% KH₂PO₄0.1중량%

MgSO₄·7H₂O 0.05중량% FeSO₄·7H₂O 0.005중량%

MnSO₄·4∼5H₂O 0.005중량% (NH₄)₂SO₄0.1중량%

KNO₃0.1중량% pH 7.0

2) 배양조건 : 30℃/5일

(2) 메타크릴로니트릴의 수화

실시예 1과 실제로 같은 방법에 의해 수득된 배양브로스로부터 세포를 수거한다. 1.0중량부(건조중량)의 세포, 1.0중량부의 메타크릴로니트릴 및 98.0 중량부의 0.05M인산완충액(pH7.0)을 혼합하여 반응 혼합물을 제조한다. 반응 혼합물을 30℃의 온도에서 유지한다. 30분 후, 반응 혼합물을 기체크로마토그래피에 의해 분석한다. 그 결과, 30분간 반응시킴으로써 반응 혼합물을 기준으로 0.1중량%량의 메타크릴아미드가 형성되며, 메타크릴아미드로 전환되지 않은 모든 메타크릴로니트릴은 반응 혼합물로 반응하지 않고 남아 있다는 것을 알 수 있다.

[실시예 7]

실시예 2에서 설명한 배양배지 200g을 2개의 500ml들이 원추 플라스크에 각각 넣는다. 이 배지에 회전진탕기를 사용하여 220rpm으로 30℃에서 24시간 동안 진탕하면서 로도코쿠스 sp. AK-33균주를 배양한다. 2플라스크중 하나의 배양을 중단하여 세포 농도를 결정한다. 그 결과, 세포가 1050ppm농도로 존재한다는 것이 발견된다. 다른 플라스크에는 시간당 0.25g의 비율로 메타크릴로니트릴을 가하고, 상술한 조건하에 배양을 수행한다. 배양개시로부터 72시간후 배양을 중단하여 세포의 농도 및 플라스크에서 제조된 메타크릴아미드의 양을 결정한다. 메타크릴아미드의 양은 기체크로마토그래피에 의해 결정한다. 세포 농도가 5100ppm으로 증가하며, 플라스크에 제조된 메타크릴 아미드는 11.2g이라는 것을 알 수 있다. 배양배지에는 메타크릴산이 검출되지 않고, 500ppm의 메타크릴로니트릴이 반응하지 않고 남아있다는 것이 발견된다.

[실시예 8]

로도코쿠스 sp. AK-32를 실시예 2와 실제로 같은 조건하에 배양한다. 세포를 함유한 배양브로스 20g을 자석회전기가 들어있는 50ml들의 원추 플라스크에 넣는다. 이 플라스크를 4℃로 유지시킨 물 중탕에 넣는다. 배양된 브로스를 2시간 동안 교반한다. 그후, 시간당 0.4g의 속도로 메타크릴로니트릴을 배양브로스에 가한다. 메타크릴로니트릴을 가하기 시작한지 8시간 후, 메타크릴아미드가 결정으로 분리되기 시준으로 단지 약 0.1%이다. 침된된 결정이 플라스크에 축적되기 때문에 자석 회전기를 회전하는 것이 불가능하게 된다. 그래서, 메타크릴로니트릴의 첨가가 중단된다. 플라스크에 생성된 슬러리를 물로 1000g이 되게 희석함으로써 메타크릴아미드 결정을 물에 용해시킨다. 용액의 메타크릴아미드 농도를 기체크로마토그래피에 의해 결정하면 0.91중량%이다. 반응혼합물에 어떤 메타크릴로니트릴 및 메타크릴산도 검출되지 않는다.

[실시예 9]

로도코쿠스 sp. AK-32를 실시예 2와 실제로 같은 방법에 의해 배양한다. 수득된 배양브로스를 원심분리하여 세포를 수거한다. 수거된 세포를 염화칼륨 수용액(0.05M, pH7.0)으로 세척하고, 더 원심분리 한다. 이렇게 수득된 균주 AK-32의 휴지기 세포(수분함량 : 80%)2g에 40g의 0.05M인산완충액(pH7.0)을 가하여 휴지기 세포 분산액을 제조한다. 분산액을 0∼5℃에서 유지하면서 균질화기로 30분간 처리함으로써 세포를 파쇄한다. 파쇄된 세포를 함유한 처리된 분산액 98중량부에 2.0중량부의 메타크릴로니트릴을 가하여 실시예 1과 실제로 같은 방법에 의해 30℃에서, 그의 수화를 수행한다. 수화반응 개시로부터 10분후, 반응 혼합물을 분석한다. 그 결과, 메타크릴아미드의 반응 혼합물(수율 : 100몰%)을 기준으로 2.5중량%의 형성이 확인된다.

Claims

(1) 니트릴을 수성 매질에서 로도코쿠스(Rhodccoccus)속에 속하는 니트릴을 수화하는 능력을 갖는 미생물[로도코쿠스 sp. AK-32(FERM BP-1046, KFCC-10200), 로도코쿠스 sp. AK-33(FERM BP-1047, KFCC-10201) 또는 로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132(FERM BP-1040, KFCC-10202)]과 작용시킴으로써 니트릴을 상응하는 아미드로 전환시키고, (2) 수성매질로부터 아미드를 분리함을 특징으로 하는 아미드의 제조방법.
제1항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 sp. AK-32(FERM BP-1046, KFCC-10200)인 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 sp. AK-33(FERM BP-1047, KFCC-10201)인 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 로도코쿠스 에리트로폴리스 AK-3132(FERM BP-1040, KFCC-10202)인 방법.
제1항에 있어서, 니트릴이 포화지방족니트릴, 에틸렌성불포화지방족니트릴, 방향족니트릴 및 헤테로고리니트릴의 군에서 선택된 니트릴인 방법.
제5항에 있어서, 니트릴이 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 숙시노니트릴 및 아디포니트릴의 군에서 선택된 니트릴인 방법.
제5항에 있어서, 니트릴이 아크릴로니트릴 또는 메타크릴로니트릴인 방법.
제5항에 있어서, 니트릴이 벤조니트릴 또는 테레프탈로니트릴인 방법.
제5항에 있어서, 니트릴이 니코티노니트릴인 방법.