JP2840253B2 - ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はロドコッカスsp.（Rhodococcus sp.）Ｎ−77
4株由来であり、ニトリル類を対応するアミド類に変換
する能力を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子DNA、これを含有する形
質転換体によりニトリル類からアミド類を製造する方法
に関する。
4株由来であり、ニトリル類を対応するアミド類に変換
する能力を有するニトリルヒドラターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子DNA、これを含有する形
質転換体によりニトリル類からアミド類を製造する方法
に関する。
ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成させる
酵素はニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼとして
知られており、該酵素を産生する微生物として、例えば
バチルス属、バクテリジューム属、マイクロコカス属及
びブレビバクテリウム属（特公昭62−21519号公報参
照）、コリネバクテリウム属及びノカルジア属（特公昭
56−17918号公報参照）、シュードモナス属（特公昭59
−37951号公報参照）及びロドコッカス属、アルスロバ
クター属及びミクロバクテリウム属等の微生物を挙げる
ことができる。
酵素はニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼとして
知られており、該酵素を産生する微生物として、例えば
バチルス属、バクテリジューム属、マイクロコカス属及
びブレビバクテリウム属（特公昭62−21519号公報参
照）、コリネバクテリウム属及びノカルジア属（特公昭
56−17918号公報参照）、シュードモナス属（特公昭59
−37951号公報参照）及びロドコッカス属、アルスロバ
クター属及びミクロバクテリウム属等の微生物を挙げる
ことができる。
遺伝子組換えの方法でクローン化されたニトリルヒド
ラターゼ遺伝子によるニトリル類の水和では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させる
ことが期待できる。
ラターゼ遺伝子によるニトリル類の水和では、菌体内に
同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生
物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させる
ことが期待できる。
そこで、本願発明者らは鋭意研究を行い、ロドコッカ
ス属の微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするDNA配列を取り出し、これをベ
クターに組み込んで組換え体DNAとし、さらに微生物に
形質転換して、より高ニトリルヒドラターゼ活性を有す
る形質転換体を調製し、これを使用してアミド類を効率
的に製造することを試み本発明を完成するに至った。
ス属の微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするDNA配列を取り出し、これをベ
クターに組み込んで組換え体DNAとし、さらに微生物に
形質転換して、より高ニトリルヒドラターゼ活性を有す
る形質転換体を調製し、これを使用してアミド類を効率
的に製造することを試み本発明を完成するに至った。
本発明は、（１）次のサブユニットα及びサブユニッ
トβのアミノ酸配列を有するニトリルヒドラーゼ活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA、 （２）サブユニットαをコードするDNA配列及びサブユ
ニットβをコードするDNA配列がそれぞれ次に示される
ものである上記（１）の遺伝子DNA、 （３）上記（１）又は（２）の遺伝子DNAをベクターに
組み込んだ組換え体DNA、（４）上記（３）の組換え体D
NAで形質転換された形質転換体、（５）上記（４）の形
質転換体からニトリルヒドラターゼの製造法、及び
（６）上記（４）の形質転換体を培養し、得られるニト
リルヒドラターゼの作用によりニトリル類をアミド類に
転換するアミド類の製造法及び（７）上記（４）記載の
形質転換体を培養し、得られる形質転換体の培養液、分
離菌体、菌体処理物又はこれらの固定化物をニトリル類
に作用させ対応するアミド類を製造するアミド類の製造
法に関する。
トβのアミノ酸配列を有するニトリルヒドラーゼ活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子DNA、 （２）サブユニットαをコードするDNA配列及びサブユ
ニットβをコードするDNA配列がそれぞれ次に示される
ものである上記（１）の遺伝子DNA、 （３）上記（１）又は（２）の遺伝子DNAをベクターに
組み込んだ組換え体DNA、（４）上記（３）の組換え体D
NAで形質転換された形質転換体、（５）上記（４）の形
質転換体からニトリルヒドラターゼの製造法、及び
（６）上記（４）の形質転換体を培養し、得られるニト
リルヒドラターゼの作用によりニトリル類をアミド類に
転換するアミド類の製造法及び（７）上記（４）記載の
形質転換体を培養し、得られる形質転換体の培養液、分
離菌体、菌体処理物又はこれらの固定化物をニトリル類
に作用させ対応するアミド類を製造するアミド類の製造
法に関する。
以下に本発明の詳細に説明する。
本発明は、下記（１）〜（８）の工程により実施され
るものである。
るものである。
（１）ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の部分的決
定とそれによるDNAプローブの作成： 培養集菌したロドコッカスsp.N−774株からニトリル
ヒドラターゼを抽出精製し、これを高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて二つのサブユニットに分離する。そし
てこのサブユニットのアミノ酸配列の一部を決定し、そ
のアミノ酸配列から予想される塩基配列をもったプロー
ブを作製する（第１図）。
定とそれによるDNAプローブの作成： 培養集菌したロドコッカスsp.N−774株からニトリル
ヒドラターゼを抽出精製し、これを高速液体クロマトグ
ラフィーを用いて二つのサブユニットに分離する。そし
てこのサブユニットのアミノ酸配列の一部を決定し、そ
のアミノ酸配列から予想される塩基配列をもったプロー
ブを作製する（第１図）。
（２）ニトリルヒドラターゼ染色体DNAを含むDNA断片の
調製： ロドコッカスsp.N−774株から染色体DNAを分離し、こ
れを制限酵素で切断後、サザンハイブリダイゼーション
法〔Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98,503（1975）、以下
同様〕により目的遺伝子を含有するDNA断片を上記
（１）のプローブを用いて検出する。
調製： ロドコッカスsp.N−774株から染色体DNAを分離し、こ
れを制限酵素で切断後、サザンハイブリダイゼーション
法〔Southern,E.M.,J.Mol.Biol.98,503（1975）、以下
同様〕により目的遺伝子を含有するDNA断片を上記
（１）のプローブを用いて検出する。
（３）染色体DNA断片のベクターへの挿入： 工程（２）で調製した染色体DNA断片をベクターに挿
入し、組換え体DNAのライブラリーを作製する。
入し、組換え体DNAのライブラリーを作製する。
（４）形質転換体の作製及び組換え体DNAの選別： 工程（３）で調製した組換え体DNAライブラリーによ
る形質転換体を作製し、その中から工程（１）で作製し
たプローブを用いてコロニーハイブリダイゼイション法
〔R.Bruce Wallace,et al.,Nuc.Aci.Res.9,879（198
1）、以下同様〕により目的の組換え体DNAを含む形質転
換体を選別する。更にサザンハイブリダイゼーションに
より、目的組換え体DNAの再確認を行う。この工程で選
別された組換え体DNAはpYUK120と称する。
る形質転換体を作製し、その中から工程（１）で作製し
たプローブを用いてコロニーハイブリダイゼイション法
〔R.Bruce Wallace,et al.,Nuc.Aci.Res.9,879（198
1）、以下同様〕により目的の組換え体DNAを含む形質転
換体を選別する。更にサザンハイブリダイゼーションに
より、目的組換え体DNAの再確認を行う。この工程で選
別された組換え体DNAはpYUK120と称する。
（５）組換え体DNAの精製と制限酵素地図の作成： 工程（４）で得られたpYUK120を精製した後、それを
用いて制限酵素地図（第２図）を作成し、目的遺伝子の
含まれている箇所を決める。
用いて制限酵素地図（第２図）を作成し、目的遺伝子の
含まれている箇所を決める。
（６）塩基配列の決定： pYUK120の親株由来の染色体DNA断片から不要部分を制
限酵素を用いて除去し、得られたDNA断片の全塩基配列
（第３図）を決定し、工程（１）で決定したアミノ酸配
列から予想される塩基配列を含むことを再確認する。
限酵素を用いて除去し、得られたDNA断片の全塩基配列
（第３図）を決定し、工程（１）で決定したアミノ酸配
列から予想される塩基配列を含むことを再確認する。
（７）発現プラスミドの調製と形質転換体の作製： 工程（６）で作製した目的遺伝子を含有するDNA断片
をlacプロモーターを有するpUC19（宝酒造（株）製）上
のプロロモーター下流に連結して発現プラスミドを作製
し、これをpYUK121と称する（第４図）。このプラスミ
ドをE.coli JM105株（Amersham社製）に形質転換させ
る。
をlacプロモーターを有するpUC19（宝酒造（株）製）上
のプロロモーター下流に連結して発現プラスミドを作製
し、これをpYUK121と称する（第４図）。このプラスミ
ドをE.coli JM105株（Amersham社製）に形質転換させ
る。
（８）形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼ生産と
ニトリル類のアミド類への変換： 工程（６）で作製したpYUK121を含有する形質転換体
を培養し、その培養菌体から粗酵素標品を調製し、この
粗酵素標品をニトリル類を含有する基質溶液と混合し、
アミド類を生成させる。
ニトリル類のアミド類への変換： 工程（６）で作製したpYUK121を含有する形質転換体
を培養し、その培養菌体から粗酵素標品を調製し、この
粗酵素標品をニトリル類を含有する基質溶液と混合し、
アミド類を生成させる。
なお、ロドコッカスsp.N−774株〔本菌株は、バージ
ーの細菌分類書（Bergy's Manual of Determinative Ba
cteriology）第８版（1974）ではコリネバクテリウム属
に分類されていたものであり、微工研に微工研菌寄第44
46号（FERM−P No.4446）として寄託されている（特公
昭56−17918号公報参照）は微工研に微工研条寄第1936
号（FERM BP−1936）として、及び工程（７）で作製し
たpYUK121を含有する形質転換体JM105/pYUK121は微工研
に微工研条寄第1937号（FERM BP−1937）として寄託さ
れている。
ーの細菌分類書（Bergy's Manual of Determinative Ba
cteriology）第８版（1974）ではコリネバクテリウム属
に分類されていたものであり、微工研に微工研菌寄第44
46号（FERM−P No.4446）として寄託されている（特公
昭56−17918号公報参照）は微工研に微工研条寄第1936
号（FERM BP−1936）として、及び工程（７）で作製し
たpYUK121を含有する形質転換体JM105/pYUK121は微工研
に微工研条寄第1937号（FERM BP−1937）として寄託さ
れている。
また、上記工程では、ベクターとしてはプラスミドベ
クター（例えばpACYC177,pSC101等）、ファージベクタ
ー（例えばλgt11（東洋紡績（株）製）,Charon4A（Ame
rsham社製）等）のいずれでも良く、またlac以外の制御
可能なプロモーターを使用することができる。形質転換
に用いる宿主もE.coli JM105株に特に限定されるもので
はない。
クター（例えばpACYC177,pSC101等）、ファージベクタ
ー（例えばλgt11（東洋紡績（株）製）,Charon4A（Ame
rsham社製）等）のいずれでも良く、またlac以外の制御
可能なプロモーターを使用することができる。形質転換
に用いる宿主もE.coli JM105株に特に限定されるもので
はない。
ニトリル類のアミド類への変換には、粗酵素標品以外
に、精製酵素は勿論のこと、形質転換の培養液、分離菌
体、菌体処理物、さらにこれらの固定化物等も使用でき
る。
に、精製酵素は勿論のこと、形質転換の培養液、分離菌
体、菌体処理物、さらにこれらの固定化物等も使用でき
る。
ニトリル類は一般に式Ｒ−（CN）nで表わされ、ｎの
値によってモノニトリル（ｎ＝１）およびポリニトリル
（ｎ≧２）があるうえ、Ｒは水素あるいは種々の炭素数
の、直鎖状、分岐鎖状、または環状の飽和または不飽和
の炭化水素残基、およびアミノ基、ヒドロキシル基、ハ
ロゲン基、カルボキシルキ基、その他の置換基を有する
炭化水素残基であって、広範囲の化合物が包含される。
値によってモノニトリル（ｎ＝１）およびポリニトリル
（ｎ≧２）があるうえ、Ｒは水素あるいは種々の炭素数
の、直鎖状、分岐鎖状、または環状の飽和または不飽和
の炭化水素残基、およびアミノ基、ヒドロキシル基、ハ
ロゲン基、カルボキシルキ基、その他の置換基を有する
炭化水素残基であって、広範囲の化合物が包含される。
具体的には、例えばアセトニトリル、プロヒオニトリ
ル、ｎ−ブチロニトリル、１−ブチロニトリル、ｎ−バ
レロニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、ベンゾニトリル、シアノピリジン、マロノニトリ
ル、サクシノニトリル、フマロニトリル、クロロアセト
ニトリル、β−ヒドロキシプロピオニトリル、アミノア
セトニトリルおよびβ−アミノプロピオニトリル等が挙
げられる。
ル、ｎ−ブチロニトリル、１−ブチロニトリル、ｎ−バ
レロニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリ
ル、ベンゾニトリル、シアノピリジン、マロノニトリ
ル、サクシノニトリル、フマロニトリル、クロロアセト
ニトリル、β−ヒドロキシプロピオニトリル、アミノア
セトニトリルおよびβ−アミノプロピオニトリル等が挙
げられる。
以下に本発明の実施例を挙げる。
なお、実施例において下記の略語を用いた。
TE:Tris−HCl（10mM,pH7.8）,EDTA（1mM,pH8.0） TNE:Tris−HCl（50mM,pH8.0）,EDTA（1mM,pH8.0）NaCl
（50mM） STE:Tris−HCl（50mM,pH8.0）,EDTA（5mM,pH8.0）Sucro
se（35mM） 2xYT培地:1.6％トリプトン、1.0％酵母エキス0.5％NaCl 〔実施例〕 （１）ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の部分的決
定とそれによるDNAプローブの合成： ロドコッカスsp.N−774株を培地（グルコース10g/l、
ペプトン5g/l、酵母エキス3g/l、麦芽エキス3g/l、硫酸
第１鉄0.01g/l、水１、pH7.2）に30℃で48時間培養し
た後、集菌し、細胞を破砕し、硫安分画し、透析後遠心
して上清みをとり、DEAE・セルロファインクロマトグラ
フィー、フェニル・セファロースクロマトグラフィー、
セファデックスＧ−150クロマトグラフィー、オクチル
・セファロース・クロマトグラフィーにかけ、活性画分
を得、これを透析して酵素液を得た。この酵素液を高速
液体クロマトグラフィーで逆相カラム（Senshu Pak VP
−304−1251）〔（株）センシュウ科学製〕を用いて二
つのサブユニット（α，β）に分離した。このサブユニ
ットのＮ末端からのアミノ酸配列（α1，β1）及びリジ
ルエンドペプチダーゼ消化により得たペプチド断片のＮ
末端からのアミノ酸配列（α2，β2）をアミノ酸シーケ
ンサー〔アプライドバイオシステム社製470A〕を用いて
決定した。次いで、このアミノ酸配列から予想される塩
基配列をもったプローブ４種（α1，α2，β1，β2）を
DNA自動合成装置〔ベックマン社製System 1 plus〕を用
いて合成した。
（50mM） STE:Tris−HCl（50mM,pH8.0）,EDTA（5mM,pH8.0）Sucro
se（35mM） 2xYT培地:1.6％トリプトン、1.0％酵母エキス0.5％NaCl 〔実施例〕 （１）ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列の部分的決
定とそれによるDNAプローブの合成： ロドコッカスsp.N−774株を培地（グルコース10g/l、
ペプトン5g/l、酵母エキス3g/l、麦芽エキス3g/l、硫酸
第１鉄0.01g/l、水１、pH7.2）に30℃で48時間培養し
た後、集菌し、細胞を破砕し、硫安分画し、透析後遠心
して上清みをとり、DEAE・セルロファインクロマトグラ
フィー、フェニル・セファロースクロマトグラフィー、
セファデックスＧ−150クロマトグラフィー、オクチル
・セファロース・クロマトグラフィーにかけ、活性画分
を得、これを透析して酵素液を得た。この酵素液を高速
液体クロマトグラフィーで逆相カラム（Senshu Pak VP
−304−1251）〔（株）センシュウ科学製〕を用いて二
つのサブユニット（α，β）に分離した。このサブユニ
ットのＮ末端からのアミノ酸配列（α1，β1）及びリジ
ルエンドペプチダーゼ消化により得たペプチド断片のＮ
末端からのアミノ酸配列（α2，β2）をアミノ酸シーケ
ンサー〔アプライドバイオシステム社製470A〕を用いて
決定した。次いで、このアミノ酸配列から予想される塩
基配列をもったプローブ４種（α1，α2，β1，β2）を
DNA自動合成装置〔ベックマン社製System 1 plus〕を用
いて合成した。
このアミノ酸配列の結果とプローブ合成に用いて配列
及びプローブのDNA配列は第１図に示した通りである。
及びプローブのDNA配列は第１図に示した通りである。
（２）ニトリルヒドラターゼ染色体DNAを含むDNA断片の
調製： ロドコッカスsp.N−774株を培地（MY培地にグリシン
１％又はアンピシリン0.2μg/mlを添加）100mlに植菌し
て培養後、集菌し、TNEで洗浄後、TE10mlに懸濁し、0.2
5M EDTA4ml、リゾチーム10〜20mg、アクロモプロテアー
ゼ10〜20mg及び10％SDS10mlを加え、37℃で３時間放置
した。次にフェノール（60℃）を15ml加え、60℃で15分
間放置し、遠心し、その上層を採った。そして2.5M酢酸
ナトリウム溶液0.7ml、ジエチルエーテルを加え遠心
し、その上層を捨て、下層に２容量のエタノールを加
え、棒でDNAを巻き取った。これをTE:エタノールの2:8,
1:9及び0:10の各溶液に５分間づつひたし、２〜4mlのTE
（37℃）に溶かし、37℃でRNase AとT1の混合物を10μ
ｌ加えた。次にフェノールを等量加え、遠心後その上層
を採り、エーテルを等量以上加え、また遠心し上層を捨
て、下層をクロロホルムを少量添加した2lのTEで一晩透
析した。更に２回目の透析を３〜４時間かけて行い、粗
染色体DNA標品約4mlを得た。
調製： ロドコッカスsp.N−774株を培地（MY培地にグリシン
１％又はアンピシリン0.2μg/mlを添加）100mlに植菌し
て培養後、集菌し、TNEで洗浄後、TE10mlに懸濁し、0.2
5M EDTA4ml、リゾチーム10〜20mg、アクロモプロテアー
ゼ10〜20mg及び10％SDS10mlを加え、37℃で３時間放置
した。次にフェノール（60℃）を15ml加え、60℃で15分
間放置し、遠心し、その上層を採った。そして2.5M酢酸
ナトリウム溶液0.7ml、ジエチルエーテルを加え遠心
し、その上層を捨て、下層に２容量のエタノールを加
え、棒でDNAを巻き取った。これをTE:エタノールの2:8,
1:9及び0:10の各溶液に５分間づつひたし、２〜4mlのTE
（37℃）に溶かし、37℃でRNase AとT1の混合物を10μ
ｌ加えた。次にフェノールを等量加え、遠心後その上層
を採り、エーテルを等量以上加え、また遠心し上層を捨
て、下層をクロロホルムを少量添加した2lのTEで一晩透
析した。更に２回目の透析を３〜４時間かけて行い、粗
染色体DNA標品約4mlを得た。
次に、粗染色体DNA標品15μｌに制限酵素Sph I2μ
ｌ、該酵素用緩衝液（10倍濃度）３μｌ及びTE10μｌを
加え37℃で１時間反応させた後、アガロースゲル電気泳
動（60V,3時間）に供した。そして工程（１）で合成し
たDNAプローブを32Ｐで放射能ラベルしたものを用いて
サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果約4.
4Kbの位置に上記合成プローブα1、α2及びβ2が強くハ
イブリダイズするDNA断片があることが見出された。
ｌ、該酵素用緩衝液（10倍濃度）３μｌ及びTE10μｌを
加え37℃で１時間反応させた後、アガロースゲル電気泳
動（60V,3時間）に供した。そして工程（１）で合成し
たDNAプローブを32Ｐで放射能ラベルしたものを用いて
サザンハイブリダイゼーションを行った。その結果約4.
4Kbの位置に上記合成プローブα1、α2及びβ2が強くハ
イブリダイズするDNA断片があることが見出された。
そこで、粗染色体DNA標品15μｌを前述と同様の方法
で制限酵素Sph I（宝酒造（株）製）で切断した後、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、4.4KbのDNA断片を含むゲ
ルを切り出した。これを、３倍容量の8M NaClO4溶液を
加えて可溶化した後、6mm径のGF/C濾紙（Whatman製）の
上にDNAを吸着させ、次いで6M NaClO4含有TE100μｌを1
0回、更に95％エタノール100μｌを10回滴下し、３分間
風乾させた。そして、これを0.5mlエッペンドルフのチ
ューブに移しTE40μｌを添加し、37℃,30分間放置した
後、遠心してその上澄み約40μｌを分取した。この溶液
の中に目的のニトリルヒドラターゼ染色体DNAを含む4.4
KbDNA断片が回収されたことになる。
で制限酵素Sph I（宝酒造（株）製）で切断した後、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、4.4KbのDNA断片を含むゲ
ルを切り出した。これを、３倍容量の8M NaClO4溶液を
加えて可溶化した後、6mm径のGF/C濾紙（Whatman製）の
上にDNAを吸着させ、次いで6M NaClO4含有TE100μｌを1
0回、更に95％エタノール100μｌを10回滴下し、３分間
風乾させた。そして、これを0.5mlエッペンドルフのチ
ューブに移しTE40μｌを添加し、37℃,30分間放置した
後、遠心してその上澄み約40μｌを分取した。この溶液
の中に目的のニトリルヒドラターゼ染色体DNAを含む4.4
KbDNA断片が回収されたことになる。
（３）染色体DNA断片のベクターへの挿入： プラスミドpBR322（宝酒造（株）製）10μｌに対し、
制限酵素Sph I2μｌ、該酵素用緩衝液（10倍濃度）３μ
ｌ及びTE10μｌを加え30℃で１時間反応させ、次に0.25
M EDTA2μｌを添加して反応をとめ、更に1M Tris−HCl
（pH9）を７μｌ、BAP（細菌性アルカリホスファター
ゼ）３μｌ加えて65℃で１時間反応させた。これにTEを
加えて全体を100μｌとし、等量のフェノールで３回抽
出し、これにエーテルを等量加えて、下層を採り、これ
に3M酢酸ナトリウム溶液10μｌとエタノール250μｌを
加え、−80℃で30分放置後遠心し、乾燥してTEに溶解し
た。
制限酵素Sph I2μｌ、該酵素用緩衝液（10倍濃度）３μ
ｌ及びTE10μｌを加え30℃で１時間反応させ、次に0.25
M EDTA2μｌを添加して反応をとめ、更に1M Tris−HCl
（pH9）を７μｌ、BAP（細菌性アルカリホスファター
ゼ）３μｌ加えて65℃で１時間反応させた。これにTEを
加えて全体を100μｌとし、等量のフェノールで３回抽
出し、これにエーテルを等量加えて、下層を採り、これ
に3M酢酸ナトリウム溶液10μｌとエタノール250μｌを
加え、−80℃で30分放置後遠心し、乾燥してTEに溶解し
た。
この様にSph Iで切断し、BAP処理したpBR3225μｌと
工程（２）で回収した4.4KbDNA断片の溶液40μｌとを混
合し、連結緩衝液６μｌ、6mg/mlATP溶液６μｌ及びT4
−DNAリガーゼ（宝酒造（株）製）３μｌとを加え、４
℃で一夜（12時間）反応させることによって目的遺伝子
を含有する4.4KbDNA断片をpBR322に挿入した組換え体プ
ラスミド約60μｌを作製してDNAライブラリーとした。
工程（２）で回収した4.4KbDNA断片の溶液40μｌとを混
合し、連結緩衝液６μｌ、6mg/mlATP溶液６μｌ及びT4
−DNAリガーゼ（宝酒造（株）製）３μｌとを加え、４
℃で一夜（12時間）反応させることによって目的遺伝子
を含有する4.4KbDNA断片をpBR322に挿入した組換え体プ
ラスミド約60μｌを作製してDNAライブラリーとした。
（４）形質転換体の作製及び組換え体DNAの選別： E.coli TG1株（Amersham社製）を2xYT培地10mlに37℃
で植菌して12時間培養後、それを新規な2xYT培地に１％
植菌し、37℃で２時間培養した。そして遠心集菌後、冷
50mM CaCl2溶液を5ml加え、０℃で40分放置後、再度遠
心して、冷50mM CaCl2溶液0.25ml及び工程（３）で調製
した組換え体プラスミドを含有する溶液60μｌを加え、
０℃で40分放置後、42℃で２分間ヒートショックを与え
０℃で５分放置して、2xYT培地10mlを加え、37℃で90分
間浸振とう培養した後、遠心集菌した。これに2xYT培地
1ml添加し菌体を充分懸濁させた後、その懸濁液を10μ
ｌずつアンピシリン50μg/ml含有2xYT培地寒天２プレー
トに分注し、37℃で培養した。そして、プレート上に生
育した形質転換体コロニーをコロニーハイブリダイゼー
ション法にてニトリルヒドラターゼ遺伝子を持つ形質転
換体を選抜した。すなわちプレート中に培養した形質転
換体をニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶
かしてDNAを固定した後、これに合成プローブで処理
し、オートラジオグラフ法で目的の組換え体DNAを含む
コロニーを選択した。更にこの選択したコロニーから組
換え体プラスミドを抽出し、サザンハイブリダイゼーシ
ョンによって４種類の合成プローブの全てとハイブリダ
イズさせ、選抜したコロニーが目的遺伝子を含む形質転
換体であることを再確認した。
で植菌して12時間培養後、それを新規な2xYT培地に１％
植菌し、37℃で２時間培養した。そして遠心集菌後、冷
50mM CaCl2溶液を5ml加え、０℃で40分放置後、再度遠
心して、冷50mM CaCl2溶液0.25ml及び工程（３）で調製
した組換え体プラスミドを含有する溶液60μｌを加え、
０℃で40分放置後、42℃で２分間ヒートショックを与え
０℃で５分放置して、2xYT培地10mlを加え、37℃で90分
間浸振とう培養した後、遠心集菌した。これに2xYT培地
1ml添加し菌体を充分懸濁させた後、その懸濁液を10μ
ｌずつアンピシリン50μg/ml含有2xYT培地寒天２プレー
トに分注し、37℃で培養した。そして、プレート上に生
育した形質転換体コロニーをコロニーハイブリダイゼー
ション法にてニトリルヒドラターゼ遺伝子を持つ形質転
換体を選抜した。すなわちプレート中に培養した形質転
換体をニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶
かしてDNAを固定した後、これに合成プローブで処理
し、オートラジオグラフ法で目的の組換え体DNAを含む
コロニーを選択した。更にこの選択したコロニーから組
換え体プラスミドを抽出し、サザンハイブリダイゼーシ
ョンによって４種類の合成プローブの全てとハイブリダ
イズさせ、選抜したコロニーが目的遺伝子を含む形質転
換体であることを再確認した。
（５）組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作
成： 工程（４）で選択した形質転換体を2xYT（50μg/mlア
ンピシリン含有）培地100mlに植菌し、37℃で一夜（12
時間）培養後、集菌し、TNEを加え再度集菌し、STEを8m
l、リゾチームを10mg加え、０℃で５分間反応させ、0.2
5M EDTA4ml加えて、更に室温で10％SDS2ml、5M NaCl5ml
を加え、０〜４℃で３時間放置した。それを超遠心し、
その上澄みに30％のPEG6000を1/2当量加え、０〜４℃で
一夜（12時間）放置し、再度遠心した後TNEに溶解して
7.5mlとし、CsClを加えて遠心して除蛋白後、臭化エチ
ジウム溶液を300〜500mg/ml加えシールチューブに移
し、熱シールし超遠心した。そして、ペリスタポンプで
cccDNAを取り出し水飽和イソプロピルアルコールを等量
以上加えて臭化エチジウムを除き、TEで透析し、精製し
た組換え体プラスミド約3mlを得た。これをpYUK120と命
名した。
成： 工程（４）で選択した形質転換体を2xYT（50μg/mlア
ンピシリン含有）培地100mlに植菌し、37℃で一夜（12
時間）培養後、集菌し、TNEを加え再度集菌し、STEを8m
l、リゾチームを10mg加え、０℃で５分間反応させ、0.2
5M EDTA4ml加えて、更に室温で10％SDS2ml、5M NaCl5ml
を加え、０〜４℃で３時間放置した。それを超遠心し、
その上澄みに30％のPEG6000を1/2当量加え、０〜４℃で
一夜（12時間）放置し、再度遠心した後TNEに溶解して
7.5mlとし、CsClを加えて遠心して除蛋白後、臭化エチ
ジウム溶液を300〜500mg/ml加えシールチューブに移
し、熱シールし超遠心した。そして、ペリスタポンプで
cccDNAを取り出し水飽和イソプロピルアルコールを等量
以上加えて臭化エチジウムを除き、TEで透析し、精製し
た組換え体プラスミド約3mlを得た。これをpYUK120と命
名した。
この組換え体プラスミドを、制限酵素EcoRI、HindII
I、KpnI,PstI、SalI及びSphI（いずれも宝酒造（株）
製）等を用いて切断し、第２図に示される制限酵素地図
を作成した。
I、KpnI,PstI、SalI及びSphI（いずれも宝酒造（株）
製）等を用いて切断し、第２図に示される制限酵素地図
を作成した。
（６）塩基配列の決定： pYUK120の親株由来のDNA断片のどの部分に目的遺伝子
が位置しているかを工程（５）で作成した制限酵素地図
とサザンハイブリダイゼーションによって決め、不要部
分を制限酵素SphIとSplIにて切り縮め、4.4Kbの鎖長を
2.07Kbとした。そしてこの得られたDNA断片の全塩基配
列をM13ファージベクターを用いたサンガー法［Sanger,
F.Science214,1205−1210（1981）］により決定した。
その結果、この親株由来の2.07KbのDNA断片の塩基配列
は第３図に示す通りであった。
が位置しているかを工程（５）で作成した制限酵素地図
とサザンハイブリダイゼーションによって決め、不要部
分を制限酵素SphIとSplIにて切り縮め、4.4Kbの鎖長を
2.07Kbとした。そしてこの得られたDNA断片の全塩基配
列をM13ファージベクターを用いたサンガー法［Sanger,
F.Science214,1205−1210（1981）］により決定した。
その結果、この親株由来の2.07KbのDNA断片の塩基配列
は第３図に示す通りであった。
なお、この塩基配列の中には、工程（１）で決定した
アミノ酸配列から予想される塩基配列の全てが含まれる
ことが確認され、このDNA断片にα，βサブユニット遺
伝子の両方が存在することが明らかとなった。
アミノ酸配列から予想される塩基配列の全てが含まれる
ことが確認され、このDNA断片にα，βサブユニット遺
伝子の両方が存在することが明らかとなった。
（７）発現プラスミドの調製と形質転換体の作製： 工程（６）で作製した2.07KbのDNA断片を制限酵素Sph
IとSalIで切断したプラスミドpUC19と連結してpYUK121
と称する発現プラスミド約3mlを作成した（第４図）。
IとSalIで切断したプラスミドpUC19と連結してpYUK121
と称する発現プラスミド約3mlを作成した（第４図）。
このプラスミドpYUK121を用いて工程（４）と同様な
方法でE.coli JM105株を宿主とする形質転換体JM105/pY
UK121〔微工研条寄第1937号（FERM BP−1937）〕を作製
した。
方法でE.coli JM105株を宿主とする形質転換体JM105/pY
UK121〔微工研条寄第1937号（FERM BP−1937）〕を作製
した。
（８）形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼ生産と
ニトリル類のアミド類への変換： pYUK121を含有するE.coli JM105株を2xYT（50μg/ml
アンピシリン含有）培地10mlで30℃で一夜（12時間）培
養し、この培養物を2xYT（50μg/mlアンピシリン、10mg
/lFeSO4・７H2O、ピロロキロリンキノン含有）培地100m
lに１％宛接種し、30℃で２時間培養し、これに終濃度
が2mMとなるようにIPTGを添加し、更に30℃で15時間培
養した。
ニトリル類のアミド類への変換： pYUK121を含有するE.coli JM105株を2xYT（50μg/ml
アンピシリン含有）培地10mlで30℃で一夜（12時間）培
養し、この培養物を2xYT（50μg/mlアンピシリン、10mg
/lFeSO4・７H2O、ピロロキロリンキノン含有）培地100m
lに１％宛接種し、30℃で２時間培養し、これに終濃度
が2mMとなるようにIPTGを添加し、更に30℃で15時間培
養した。
集菌後1/20Mリン酸緩衝液（0.35％ｎ−酪酸ナトリウ
ム含有,pH7.7）3mlに懸濁し、超音波処理した後遠心し
て沈渣を8M尿素を含む上記リン酸緩衝溶液20mlに溶解
し、塩化ナトリウム0.585gを添加した。そして、これを
pH10.0にし、50mM Tris−HCl緩衝溶液（pH10.0）3lで３
時間透析した後、1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）3lで一晩
透析し、粗酵素標品約35mlとした。
ム含有,pH7.7）3mlに懸濁し、超音波処理した後遠心し
て沈渣を8M尿素を含む上記リン酸緩衝溶液20mlに溶解
し、塩化ナトリウム0.585gを添加した。そして、これを
pH10.0にし、50mM Tris−HCl緩衝溶液（pH10.0）3lで３
時間透析した後、1/20Mリン酸緩衝液（pH7.7）3lで一晩
透析し、粗酵素標品約35mlとした。
粗酵素標品2mlを基質溶液（アクリロニトリル５％,n
−酪酸ナトリウム0.35％，FeSO4・７H2O10mg/l,PQQ1μg
/l及び50mMリン酸緩衝液,pH7.7）2mlと混合し、光照射
下20℃で20分反応後1N HCl2ml添加して反応を停止さ
せ、反応液中の生成アクリルアミドと未反応アクリロニ
トリルを高速液体クロマトグラフィーを用いて検出し
た。その結果、宿主E.coli JM105株からの粗抽出液では
アクリルアミドが検出できなかったが、本件pYUK121含
有するE.coli JM105株ではアクリルアミドが検出され、
その比活性は培地１当り13.2Uと計算された。なお、I
Uは１分間に生成するアクリルアミドのμmol数である。
−酪酸ナトリウム0.35％，FeSO4・７H2O10mg/l,PQQ1μg
/l及び50mMリン酸緩衝液,pH7.7）2mlと混合し、光照射
下20℃で20分反応後1N HCl2ml添加して反応を停止さ
せ、反応液中の生成アクリルアミドと未反応アクリロニ
トリルを高速液体クロマトグラフィーを用いて検出し
た。その結果、宿主E.coli JM105株からの粗抽出液では
アクリルアミドが検出できなかったが、本件pYUK121含
有するE.coli JM105株ではアクリルアミドが検出され、
その比活性は培地１当り13.2Uと計算された。なお、I
Uは１分間に生成するアクリルアミドのμmol数である。
本発明により、サブユニットα及びサブユニットβの
アミノ酸配列を有し、ニトリルヒトラターゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするDNA配列が明らかにされ
た。そして、このDNAを含む発現プラスミド及び該プラ
スミドで形質転換された形質転換体が作出された。ま
た、この形質転換体を培養してニトリルヒドラターゼを
製造し、更に該形質転換体をニトリル類に作用させてア
ミド類を製造することができた。
アミノ酸配列を有し、ニトリルヒトラターゼ活性を有す
るポリペプチドをコードするDNA配列が明らかにされ
た。そして、このDNAを含む発現プラスミド及び該プラ
スミドで形質転換された形質転換体が作出された。ま
た、この形質転換体を培養してニトリルヒドラターゼを
製造し、更に該形質転換体をニトリル類に作用させてア
ミド類を製造することができた。
第１図は（１）DNAプローブ作成におけるアミノ酸配列
の結果とプローブの合成に用いた同配列（下線部）なら
びに（２）プローブのDNA配列、第２図は組換え体プラ
スミドpYUK120の制限酵素地図、第３図はpYUK121に含ま
れるＮ−774株由来のDNA断片の塩基配列ならびにそれか
ら予想されるアミノ酸配列、及び第４図は発現プラスミ
ドpYUK121の調製法をそれぞれ示す。
の結果とプローブの合成に用いた同配列（下線部）なら
びに（２）プローブのDNA配列、第２図は組換え体プラ
スミドpYUK120の制限酵素地図、第３図はpYUK121に含ま
れるＮ−774株由来のDNA断片の塩基配列ならびにそれか
ら予想されるアミノ酸配列、及び第４図は発現プラスミ
ドpYUK121の調製法をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 遠藤 隆一 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日東化学工業株式会社内 (56)参考文献 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, 51（12）（1987），ｐ3201−3206 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＳｅｑ
Claims (7)
- 【請求項１】次のサブユニットα及びサブユニットβの
アミノ酸配列を有しニトリルヒドラターゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子DNA。 - 【請求項２】サブユニットαをコードするDNA配列及び
サブユニットβをコードするDNA配列がそれぞれ次に示
されるものである請求項１記載の遺伝子DNA。 - 【請求項３】請求項１又は２記載の遺伝子DNAをベクタ
ーに組み込んだ組換え体DNA。 - 【請求項４】請求項３記載の組換え体DNAで形質転換さ
れた形質転換体。 - 【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培養し、その
培地中に蓄積したニトリルヒドラターゼを採取すること
を特徴とするニトリルヒドラターゼの製造法。 - 【請求項６】請求項４記載の形質転換体を培養し、得ら
れるニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル類を対
応するアミド類に転換することを特徴とするアミド類の
製造法。 - 【請求項７】請求項４記載の形質転換体を培養し、得ら
れる形質転換体の培養液、分離菌体、菌体処理物又はこ
れらの固定化物をニトリル類に作用させ対応するアミド
類を製造することを特徴とするアミド類の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63202779A JP2840253B2 (ja) | 1988-07-06 | 1988-08-16 | ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法 |
| US07/372,449 US5130235A (en) | 1988-07-06 | 1989-06-28 | Dna encoding polypeptide having nitrile hydratase activity and method for producing amides from nitriles with transformant containing the same |
| FR898909056A FR2633938B1 (fr) | 1988-07-06 | 1989-07-05 | Dna de codage de polypeptide presentant une activite de nitrile hydratase et procede de production d'amides a partir de nitriles avec un transformant les contenant |
| DE3922137A DE3922137C2 (de) | 1988-07-06 | 1989-07-05 | DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert, und Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen mit einer Transformante, die die DNA-Sequenz enthält |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-166878 | 1988-07-06 | ||
| JP16687888 | 1988-07-06 | ||
| JP63202779A JP2840253B2 (ja) | 1988-07-06 | 1988-08-16 | ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02119778A JPH02119778A (ja) | 1990-05-07 |
| JP2840253B2 true JP2840253B2 (ja) | 1998-12-24 |
Family
ID=26491093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63202779A Expired - Lifetime JP2840253B2 (ja) | 1988-07-06 | 1988-08-16 | ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5130235A (ja) |
| JP (1) | JP2840253B2 (ja) |
| DE (1) | DE3922137C2 (ja) |
| FR (1) | FR2633938B1 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2907479B2 (ja) * | 1990-02-28 | 1999-06-21 | 輝彦 別府 | ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法 |
| AU627648B2 (en) * | 1990-02-28 | 1992-08-27 | Teruhiko Beppu | Dna fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| US5648256A (en) * | 1990-02-28 | 1997-07-15 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| EP0486289B1 (en) * | 1990-11-14 | 1997-07-09 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Biological process for producing alpha-hydroxyamide or alpha-hydroxy acid |
| DE69231939T2 (de) * | 1991-03-04 | 2002-04-04 | Mitsubishi Rayon Co | Hybrid-Plasmid-Vektoren, die für Nitril-abbauende Enzyme kodierende Gene enthalten und Verfahren zur Herstellung von Amiden und Säuren |
| US5753472A (en) * | 1991-05-02 | 1998-05-19 | Nitto Chemical Industry Co. Ltd. | DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant |
| AU3692593A (en) * | 1992-04-28 | 1993-11-04 | Mitsubishi Kasei Corporation | Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene |
| CN1243825C (zh) * | 1996-02-14 | 2006-03-01 | 三井化学株式会社 | 新型腈水合酶 |
| US6153415A (en) * | 1998-04-29 | 2000-11-28 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method for producing amide compounds using a nitrile hydratase from a thermophilic bacillus |
| FR2787121B1 (fr) * | 1998-12-11 | 2003-09-12 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
| JP2002325587A (ja) * | 2001-03-02 | 2002-11-12 | Daicel Chem Ind Ltd | ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法 |
| TWI332953B (en) * | 2002-02-08 | 2010-11-11 | Mitsubishi Rayon Co | Method for preparing lactone |
| WO2004067738A2 (en) * | 2003-01-27 | 2004-08-12 | Degussa Ag | Nitrile hydratases from rhodococcus erythropolis and their application |
| WO2010125829A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 三井化学株式会社 | ３-メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61162193A (ja) * | 1985-01-08 | 1986-07-22 | Nitto Chem Ind Co Ltd | 微生物によるアミド類の製造法 |
| JPH0740948B2 (ja) * | 1985-06-04 | 1995-05-10 | 旭化成工業株式会社 | アミドの微生物学的製造法 |
-
1988
- 1988-08-16 JP JP63202779A patent/JP2840253B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-28 US US07/372,449 patent/US5130235A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-05 FR FR898909056A patent/FR2633938B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-05 DE DE3922137A patent/DE3922137C2/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（１２）（１９８７），ｐ３２０１−３２０６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2633938A1 (fr) | 1990-01-12 |
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