DE3922137A1

DE3922137A1 - Dna-sequenz, die ein polypeptid mit nitrilhydratase-aktivitaet codiert, und verfahren zur herstellung von amiden aus nitrilen mit einer transformante, die die dna-sequenz enthaelt

Info

Publication number: DE3922137A1
Application number: DE3922137A
Authority: DE
Inventors: Teruhiko Beppu; Sueharu Horinouchi; Osamu Ikehata; Takakazu Endo
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 1988-07-06
Filing date: 1989-07-05
Publication date: 1990-04-05
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: FR2633938A1; JPH02119778A; FR2633938B1; DE3922137C2; JP2840253B2; US5130235A

Description

Die Erfindung betrifft eine von Rhodococcus sp. N-774 abgeleitete DNA-Sequenz, die ein als Nitrilhydratase wirksames Polypeptid codiert, das Nitrile in ihre entsprechenden Amide umzusetzen vermag. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen mit einer Transformante, die DNA-Sequenzen enthält.

Ein Nitrile hydratisierendes Enzym, das die entsprechenden Amide bildet, ist als Nitrilase oder Nitrilhydratase bekannt. Beispiele von Mikroorganismen, die das Enzym herstellen, sind Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium (vgl. US-PS 40 01 081), Corynebacterium und Nocardia (vgl. US-PS 42 48 968), Pseudomonas (vgl. US-PS 46 37 982) und Rhodococcus, Arthrobacter und Microbacterium, vgl. EP-A 01 88 316).

Bei der Hydratisierung von Nitrilen unter Mitwirkung eines Nitrilhydratase-Gens, das durch gentechnologische Clonierung hergestellt wurde, können in einem Mikroorganismus viele Kopien des Nitrilhydratase-Gens hergestellt werden. Somit sollten die katalytischen Fähigkeiten eines Mikroorganismus gegenüber üblichen Verfahren erheblich gesteigert werden können.

Deshalb wurde erfindungsgemäß eine DNA-Sequenz aus einem Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus isoliert, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert. Außerdem wurde durch Einbau der DNA-Sequenz in einem Vektor ein rekombinantes DNA-Molekül sowie entsprechende transformierte Mikroorganismen hergestellt. Damit wurde eine Transformante mit höherer Nitrilhydratase-Aktivität hergestellt, mit der sich Amide in hohen Ausbeuten herstellen lassen.

Der vorliegenden Erfindung liegt also das technische Problem zugrunde, eine DNA-Sequenz bereitzustellen, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert. Ferner liegt ihr das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen bereitzustellen, bei dem Transformanten verwendet werden, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Somit wird erfindungsgemäß eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein Polypeptid mit den nachstehend beschriebenen Aminosäure- Sequenzen der α- und β-Untereinheit codiert, das Nitrilhydratase- Aktivität aufweist. Ferner wird ein Expressions- Plasmid bereitgestellt, das diese DNA-Sequenz enthält sowie eine Transformante, die mit dem Expressionsplasmid transformiert ist. Schließlich wird ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase mit der erfindungsgemäßen Transformante bereitgestellt, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Amiden aus den entsprechenden Nitrilen durch Einwirkung der Transformante auf die Nitrile.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 (1) Ergebnisse der Aminosäure-Sequenzierung bei der Herstellung von DNA-Sondenmolekülen und die bei der Sondenmolekül-Synthese verwendeten Aminosäure-Sequenzen (unterstrichener Teil). (2) DNA-Sequenzen der Sondenmoleküle.

Fig. 2 Restriktions-Karte des rekombinanten Plasmids pYUK120.

Fig. 3 DNA-Sequenz des von N-774 abgeleiteten DNA-Fragments, das im rekombinanten Plasmid pYUK121 enthalten ist und entsprechende Aminosäure-Sequenz.

Fig. 4 schematische Darstellung der Herstellung des Expressionsplasmids pYUK121.

Erfindungsgemäß wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein Polypeptid mit den folgenden Aminosäure-Sequenzen der α- und β-Untereinheit und mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert:

α-Untereinheit

β-Untereinheit

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die die α- und β- Untereinheit codierenden DNA-Sequenzen die folgenden:

α-Untereinheit

β-Untereinheit

Ferner wird erfindungsgemäß ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, in das die vorstehend genannte DNA-Sequenz oder die DNA-Sequenzen integriert sind.

Ferner werden erfindungsgemäß Transformatoren bereitgestellt, die das erfindungsgemäße rekombinante DNA-Molekül enthalten.

Außerdem wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase durch Züchtung der erfindungsgemäßen Transformanten bereitgestellt.

Darüber hinaus wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Amiden aus den entsprechenden Nitrilen durch Züchtung einer erfindungsgemäßen Transformante bereitgestellt, bei dem die erhaltene Nitrilhydratase auf die Nitrile zur Herstellung der entsprechenden Amide einwirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens werden aus der gezüchteten Transformante Kulturlösungen, Isolate, behandelte Zellen oder immobilisierte Derivate davon zur Umsetzung der Nitrile zu den entsprechenden Aminen hergestellt.

Erfindungsgemäß werden die folgenden Schritte (1) bis (8) durchgeführt; vgl. auch nachfolgende Beispiele.

(1) Partielle Bestimmung der Aminosäure-Sequenz einer Nitrilhydratase und Herstellung von DNA-Sondenmolekülen

Rhodococcus sp. N-774 wird inkubiert und geerntet. Sodann wird Nitrilhydratase daraus extrahiert und gereinigt. Anschließend wird sie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in zwei Untereinheiten zerlegt. Sodann wird ein Teil der Aminosäure-Sequenz jeder Untereinheit bestimmt. Anhand dieser Aminosäure-Sequenz werden DNA-Sequenzen als Sondenmoleküle hergestellt (Fig. 1).

(2) Herstellung von das Nitrilhydratase-Gen enthaltenden DNA-Fragmenten

Chromosomale DNA wird aus Rhodococcus sp. N-774 hergestellt. Die isolierte chromosomale DNA wird mit einem Restriktionsenzym gespalten. Sodann werden DNA-Fragmente, die das gewünschte Gen enthalten, mit den vorstehend gemäß (1) erhaltenen Sondenmolekülen durch Hybridisierung nach Southern nachgewiesen; vgl. Southern, J. Mol. Biol., 98 (1975), 503.

(3) Insertion chromosomaler DNA-Fragmente in Vektoren

Gemäß (2) hergestellte chromosomale DNA-Fragmente werden in Vektoren eingebaut, um eine Genbank zu erhalten.

(4) Herstellung von Transformanten und Selektion rekombinanter DNA-Moleküle

Mit der gemäß (3) hergestellten Genbank werden Transformanten hergestellt. Aus diesen wird mit den gemäß (1) hergestellten Sondenmolekülen in einer Kolonie-Hybridisierung das gewünschte rekombinante DNA-Molekül selektiert; vgl. Wallace et al., Nucl. Aci. Res., 9 (1981), 879. Sodann wird die Authentizität des isolierten rekombinanten DNA-Moleküls durch eine weitere Hybridisierung nach Southern bestätigt. Das so erhaltene rekombinante DNA-Molekül wird als Plasmid pYUK120 bezeichnet.

(5) Reinigung des rekombinanten DNA-Moleküls und Erstellung einer Restriktionskarte

Nach dem Reinigen des Plasmids pYUK120 aus (4) wird eine Restriktionskarte hergestellt, um die Lage des darin enthaltenen Gens zu ermitteln; vgl. Fig. 2.

(6) Bestimmung der DNA-Sequenz

Aus einem vom Elterstamm pYUK120 abgeleiteten, chromosomalen DNA-Fragment werden die unnötigen Teile mit einem Restriktionsenzym entfernt. Sodann wird die gesamte DNA-Sequenz des erhaltenen DNA-Fragments bestimmt; vgl. Fig. 3. Somit wird bestätigt, daß das DNA-Fragment die ausgehend von der Aminosäure- Sequenz gemäß (1) erwartete DNA-Sequenz aufweist.

(7) Herstellung eines Expressionsplasmids und einer Transformante

Das gemäß (6) hergestellte DNA-Fragment, das das gewünschte Gen enthält, wird in pUC19 (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) stromabwärts vom lac-Promotor ligiert. Somit wird das Expressionsplasmid pYUK121 erhalten; vgl. Fig. 4. Dieses Plasmit wird in E. coli 105 (erhältlich bei Amersham Inc.) eingeführt.

(8) Herstellung von Nitrilhydratase mit der Transformante und Umsetzung von Nitrilen in Amide

Die gemäß (7), oben, erhaltene Transformante mit dem Plasmid pYUK121 wird inkubiert. Aus der Kultur wird ein Enzym-Rohpräparat gewonnen. Dieses Rohprodukt wird mit einer Nitrile enthaltenden Substratlösung zur Herstellung von Amiden vermischt.

Rhodococcus sp. N-774 wurde in der 8. Auflage von Bergy's "Manual of Determinative Bacteriology" (1974) als Mitglied der Gattung Corynebacterium bestimmt. Es ist beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nummer FERM- P 4446 hinterlegt; vgl. US-PS 42 48 968. Ferner ist Rhodococcus sp. N-774 und die Transformante E. coli JM105/pYUK121 beim Fermentation Research Institute nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages unter den Hinterlegungs-Nummern FERM BP-1936 bzw. FERM BP-1937 hinterlegt.

Zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle nach den vorstehend beschriebenen Schritten ist jeder beliebige Plasmid- Vektor, wie pACYC177 oder pSC101 geeignet. Ferner sind Phagen-Vektoren, wie λgt11 (erhältlich bei Toyobo Co., Ltd.) oder Charon4A (erhältlich bei Amersham Inc.) geeignet. Außerdem lassen sich außer dem lax-Promotor auch andere steuerbare Promotoren verwenden. Der Wirtsstamm ist natürlich nicht auf E. coli JM105 beschränkt. Dem Fachmann sind andere erfindungsgemäß verwendbare Wirts-Mikroorganismen bekannt.

Bei der Umsetzung von Nitrilen in Amide lassen sich neben Enzym-Rohpräparaten nicht nur gereinigte Enzyme aus den erfindungsgemäßen Transformanten, sondern auch Kulturlösungen, Isolate, behandelte Zellen oder immobilisierte Derivate davon verwenden.

Nitrile werden im allgemeinen durch die Formel R-(CN)_n dargestellt und lassen sich entsprechend des Wertes von n in Mononitrile (n=1) und Polynitrile (n2) gliedern. Außerdem kann der Rest R in der Formel ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen gesättigten oder nicht-gesättigten Kohlenwasserstoffrest mit unterschiedlichen Anzahlen von Kohlenstoffatomen, einen Kohlenwasserstoffrest mit einem Substituenten, wie einer Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Halogengruppe oder Carboxylgruppe bedeuten, so daß eine große Anzahl von Verbindungen unter die vorstehend genannte allgemeine Formel fällt.

Spezielle Beispiele der genannten Nitrile sind Acetonitril, Propionitril, n-Butylnitril, 1-Butylnitril, n-Valeronitril, Acrylnitril, Methacrylnitril, Benzonitril, Cyanopyridin, Malonsäurenitril, Bernsteinsäurenitril, Fumarsäurenitril, Chloracetonitril, β-Hydroxypropionsäurenitril, Aminoacetonitril oder β-Aminopropionsäurenitril.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Dabei werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

TE:
Tris-HCl (10 mMol, pH 7,8),
	EDTA (1 mMol, pH 8,0)
TNE:	Tris-HCl (50 mMol, pH 8,0),
	EDTA (1 mMol, pH 8,0)
	NaCl (50 mMol)
STE:	Tris-HCl (50 mMol, pH 8,0),
	EDTA (5 mMol, pH 8,0)
	Saccharose (35 mMol)
2xYT-Medium:	1,6% Trypton, 1,0% Hefeextrakt, 0,5% NaCl

Beispiel 1 Partielle Bestimmung der Aminosäure-Sequenz einer Nitrilhydratase und Synthese entsprechender DNA-Sondenmoleküle

Rhodococcus sp. N-774 wird in einem Medium (Glucose 10 g/l; Pepton 5 g/l; Hefeextrakt 3 g/l, Malzextrakt 3 g/l, Eisen(II)-sulfat 0,01 g/l, Wasser 1 l; pH 7,2) 48 Stunden bei 30°C inkubiert, und die Zellen werden geerntet. Sodann werden die Zellen pulverisiert, einer fraktionierten Ammoniumsulfat- Fällung unterzogen und dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert, und der Überstand wird abpipettiert und nacheinander einer DEAE-Cellulofine-Chromatographie, Phenyl- Sepharose-Chromatographie, Sephadex-G-150-Chromatographie und einer Octyl-Sepharose-Chromatographie unterzogen, um aktive Fraktionen zu erhalten. Sodann werden die aktiven Fraktionen dialysiert, um eine Enzym-Lösung zu erhalten. Das Enzym wird in die beiden Untereinheiten (α und β) durch Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie in einer Reversphasen- Säule getrennt (Senshu Pak VP-304-1251, hergestellt von Senshu Scientific Co., Ltd.). Anschließend werden mit einem Aminosäure-Sequenziergerät (470A, Applied Bio Systems, Inc.) die Aminosäuresequenzen α₁ und β₁ der N-Termini der Untereinheiten und die Aminosäuresequenzen α₂ und β₂ der N-Termini von Peptidfragmenten bestimmt, die durch Lysyl-Endopeptidase- Spaltung erhalten wurden. Sodann werden vier Arten von Sondenmolekülen (α₁, α₂, β₁ und β₂) synthetisiert, die DNA-Sequenzen aufweisen, die anhand der vorstehend genannten Aminosäuresequenz zu erwarten sind. Dazu wird ein automatisches DNA-Synthesegerät verwendet (System 1 plus, Beckmann Instruments, Inc.).

Die Ergebnisse dieser Aminosäure-Sequenzierung, die zur Sondenmolekül- Synthese verwendeten Aminosäure-Sequenzen und die DNA-Sequenzen der Sondenmoleküle sind in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2 Herstellung von das Nitrilhydratase-Gen enthaltenden DNA- Fragmenten

Rhodococcus sp. N-774 wird in 100 ml Medium (hergestellt durch Zugabe von 1% Glycin oder 0,2 µg/ml Ampicillin zu MY- Medium) überimpft und inkubiert. Sodann werden die Zellen geerntet. Sie werden mit TNE gewaschen und in 10 ml TE suspendiert. Es werden 4 ml 0,25 M EDTA, 10 bis 20 mg Lysozym, 10 bis 20 mg Achromoprotease und 10 ml 10%iges SDS zugegeben. Die Suspension wird 3 Stunden bei 37°C stehengelassen. Sodann werden 15 ml Phenol (60°C) zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 15 Minuten bei 60°C stehengelassen und abzentrifugiert. Die obere Phase wird entnommen und mit 0,7 ml 2,5 M Natriumacetat-Lösung und Diäthyläther versetzt. Nach dem Zentrifugieren dieser Lösung wird die obere Phase der erhaltenen Lösung entfernt. Sodann wird die noch vorhandene untere Phase mit 2 Volumina Äthnaol versetzt, und DNA wird daraus mit einem Glasstab aufgewickelt. Die erhaltene DNA wird nacheinander jeweils 5 Minuten mit 2 : 8, 1 : 9 und 0 : 10 TE : Äthanol-Lösung getränkt und sodann bei 37°C in 2 bis 4 ml TE gelöst. Diese Lösung wird mit 10 µl eines Gemisches der RNAsen A und T₁ bei 37°C versetzt und sodann mit einem gleichen Volumen Phenol. Nach dem Zentrifugieren der erhaltenen Lösung wird die obere Phase gesammelt und mit mindestens einem gleichen Volumen Diäthyläther versetzt. Sodann wird die erhaltene Lösung zentrifugiert, die obere Phase wird entfernt, und die verbleibende untere Phase wird über Nacht gegen 2 Liter TE, das ein kleines Volumen Chloroform enthält, dialysiert. Sodann wird ein zweites Mal 3 bis 4 Stunden dialysiert. Es werden etwa 4 ml eines Präparates roher, chromosomaler DNA erhalten.

15 µl der rohen, chromosomalen DNA-Präparation werden mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms Sph I, 3 µl Sph I-Restriktionspuffer (10fach konzentriert) und 10 µl TE versetzt und 1 Stunde bei 37°C gespalten. Ds Reaktionsgemisch wird einer Agarose-Gelelektrophorese (3 Stunden, 60 Vol.) unterzogen. Anschließend wird eine Hybridisierung nach Southern mit den gemäß (1), oben, hergestellten DNA-Sondenmolekülen durchgeführt. Es wurde gefunden, daß mit den vorstehend genannten, synthetischen Sondenmolekülen stark hybridisierende DNA-Fragmente eine Größe von etwa 4,4 kb aufweisen.

Es werden weitere 15 µl rohe, chromosomale DNA mit dem Restriktionsenzym Sph I (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) wie vorstehend beschrieben, gespalten. Die gespaltene DNA wird sodann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, und die 4,4-kb-Bande wird ausgeschnitten. Das Gel wird sodann durch Zugabe eines 3fachen Volumens einer 8 M NaClO₄- Lösung zersetzt. Die DNA wird an ein GF/C-Filterpapier (hergestellt von Whatman Corp.) mit einem Durchmesser von 6 mm adsorbiert. Auf dieses Filterpapier mit der adsorbierten DNA werden je zehnmal 100 µl TE enthaltend 6 M NaClO₄ und 100 µl 95%iges Äthanol tropfenweise gegeben. Die so behandelten Filter werden 3 Minuten luftgetrocknet und sodann in ein 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Sie werden mit 40 µl TE versetzt. Es wird 30 Minuten bei 37°C stehengelassen. Das Röhrchen wird zentrifugiert, und sodann werden etwa 40 µl des Überstandes entnommen. In diesem Überstand sind DNA-Fragmente einer Größe von 4,4 kb enthalten, die die gewünschte chromosomale Nitrilhydratase-DNA enthalten.

Beispiel 3 Insertion chromosomaler DNA-Fragmente in Vektoren

10 µl DNA des Plasmids pBR322 (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) werden mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms Sph I, 3 µl Sph I-Restriktionspuffer (10fach konzentriert) und 10 µl TE versetzt. Die erhaltene Lösung wird 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Sodann wird die Spaltung durch Zugabe von 2 µl 0,25 EDTA abgebrochen. Sodann werden 7 µl 1 M Tris-HCl (pH 9) und 3 µl BAP (bakterielle, alkalische Phosphatase) zugegeben, und die Lösung wird 1 Stunde bei 65°C inkubiert. Sodann wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von TE auf ein Gesamtvolumen von 100 µl gebracht und dreimal mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert. Anschließend wird ein gleiches Volumen Diäthyläther zugegeben, um die untere Phase zu sammeln und sodann 10 µl 3 M Natriumacetat-Lösung und 250 µl Äthanol. Es wird 30 Minuten bei -80°C stehengelassen, und die Lösung wird zentrifugiert. Das Pellet wird getrocknet und in TE gelöst.

5 µl des vorstehend beschriebenen, mit Sph I gespaltenen und BAP behandelten pBR322 und 40 µl der Lösung des 4,4 kb DNA- Fragments aus (2), oben, werden gemischt. Sodann werden 6 µl Ligierungspuffer, 6 µl einer Lösung von 6 mg/ml ATP und 3 µl (1050 Einheiten) T4-DNA-Ligase (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) zum Gemisch zugegeben, und es wird über Nacht (12 Stunden) bei 4°C inkubiert. Somit werden 60 µl rekombinantes Plasmid, in dem 4,4 kb DNA-Fragmente im Vektor pBR322 inseriert sind, erhalten. Dieses rekombinante Plasmit wird als DNA-Bank oder Genbank betrachtet.

Beispiel 4 Herstellung von Transformanten und Selektion rekombinanter DNA-Moleküle

10 ml 2xYT-Medium werden bei 37°C mit E. coli TG1 (Amersham Corp.) beimpft. Nach 12stündiger Inkubation wird 1% der Kultur in ein neues 2xYT-Medium überimpft und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und mit 5 ml kalter 50 mMol CaCl₂-Lösung versetzt. Es wird 40 Minuten bei 0°C stehengelassen, und die erhaltene Zell-Suspension wird erneut zentrifugiert. Dann wird das Pellet mit 0,25 ml kalter 50 mMol CaCl₂-Lösung und 60 µl der Lösung des rekombinanten Plasmids gemäß (3) versetzt. Es wird 40 Minuten bei 0°C stehengelassen. Dann wird 2 Minuten bei 42°C ein Hitzeschock durchgeführt und nochmals 5 Minuten bei 0°C stehengelassen. Es werden 10 ml 2xYT-Medium zugegeben, und die erhaltene Lösung wird 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Sodann werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Die geernteten Zellen werden homogen in 1 ml 2xYT-Medium suspendiert, die Suspension wird in 10-µl-Portionen auf Agarplatten (50 µg/ml Ampicillin enthaltendes 2xYT-Medium) ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Aus den auf den Platten wachsenden Transformanten werden solche, die ein Nitrilhydratase- Gen tragen, durch Koloniehybridisierung ausgewählt. Dazu werden die auf den Platten gezüchteten Transformanten auf Nitrocellulosefilter überführt, und die Zellen werden zur Immobilisierung der DNA lysiert. Sodann wird die immobilisierte DNA mit den synthetischen Sondenmolekülen behandelt und Kolonien, die die gewünschte rekombinante DNA enthalten, werden durch Autoradiographie ausgewählt. Aus den ausgewählten Kolonien werden rekombinante Plasmide hergestellt und mit allen vier Formen der synthetischen Sondenmoleküle in einer Hybridisierung nach Southern hybridisiert. Dadurch wird bestätigt, daß die ausgewählten Kolonien Transformanten sind, die das gewünschte Gen tragen.

Beispiel 5 Reinigung von rekombinanten Plasmiden und Erstellung einer Restriktionskarte

Gemäß (4) selektierte Transformanten werden in 100 µl 2xYT- Medium (enthaltend 50 µl/ml Ampicillin) überimpft und über Nacht (12 Stunden) bei 37°C gezüchtet. Die Zellen werden geerntet und mit TNE versetzt. Sodann werden die Zellen nochmals geerntet. Sodann werden sie mit 8 ml STE und 10 mg Lysozym versetzt. Diese Lösung wird 5 Minuten bei 0°C inkubiert. Nach der vollständigen Reaktion werden zunächst 4 ml 0,25 M EDTA und sodann 2 ml 10% SDS und 5 ml 5 M NaCl bei Raumtemperatur zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 0 bis 4°C stehengelassen. Die erhaltene Lösung wird ultrazentrifugiert. Nach Zugabe eines ½ Äquivalentes 30% PEG6000 zum Überstand wird die erhaltene Lösung über Nacht (12 Stunden) bei 0 bis 4°C stehengelassen und sodann nochmals zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wird in TNE gelöst, so daß ein Volumen von 7,5 ml erhalten wird. Nach der Zugabe von CsCl wird die erhaltene Lösung zentrifugiert, um Proteine zu entfernen. Sodann wird eine 300- bis 500-mg/ml- Äthidiumbromid-Lösung zugegeben. Die erhaltene Lösung wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das sodann verschweißt und ultrazentrifugiert wird. Anschließend wird cccDNA mit einer peristaltischen Pumpe entnommen, und das Äthidiumbromid wird von der cccDNA durch Zugabe von mindestens einem gleichen Volumen Wasser-gesättigtem Isopropylalkohol entfernt. Die so behandelte cccDNA wird gegen TE dialysiert. Es werden etwa 3 ml gereinigtes, rekombinantes Plasmid erhalten. Dieses wird als Plasmid pYUK120 bezeichnet.

Das erhaltene rekombinante Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen EcoR I, Hind III, Kpn I, Pst I, Sal I und Sph I (alle erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) und ähnlichen Enzymen zur Erstellung der in Fig. 2 gezeigten Restriktionskarte gespalten.

Beispiel 6 Bestimmung der DNA-Sequenz

Mit Hilfe der Restriktionskarte aus (5), oben, und einer Hybridisierung nach Southern, wird die Lage des gewünschten Gens in einem von pYUK120 abgeleiteten DNA-Fragment bestimmt. Sodann werden die unnötigen Teile mit den Restriktionsenzymen Sph I und Sal I ausgeschnitten. Damit wird das Fragment von 4,4 kb auf 2,07 kb reduziert. Anschließend wird die vollständige DNA-Sequenz des erhaltenen DNA-Fragments nach der Sanger-Methode bestimmt, wobei der Phagenvektor M13 verwendet wird; vgl. Sanger, Science, 214 (1981), 1205-1210. Das Ergebnis ist die DNA-Sequenz dieses 2,07 kb von Rhodococcus sp. N-774 abgeleiteten DNA-Fragments, die in Fig. 3 dargestellt ist.

Es wird ferner bestätigt, daß diese DNA-Sequenz alle anhand der in (1), oben, bestimmten Aminosäure-Sequenz erwarteten DNA-Sequenzen enthält. Damit ist klar, daß dieses DNA-Fragment sowohl die α- als auch die β-Untereinheit codiert.

Beispiel 7 Herstellung von Expressionsplasmiden und Transformanten

Das 2,07 kb DNA-Fragment aus (6), oben, wird mit dem mit der Restriktionsendonuclease Sph I und Sal I gespaltenen Plasmid pUC19 liegiert. Es werden etwa 3 ml als pYUK121 bezeichnetes Expressionsplasmid erhalten; vgl. Fig. 4.

Mit diesem Plasmid pYUK121 wird gemäß (6) die Transformante JM105/pYUK121 (hinterlegt nach den Vorschriften des Budapester Vertrages beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-1937) hergestellt.

Beispiel 8 Herstellung von Nitrilhydratase mit Transformation und Umsetzung von Nitrilen in Amide

E. coli JM 105 enthaltend pYUK121 wird über Nacht in 10 ml 2xYT-Medium (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin) bei 30°C über Nacht inkubiert. Sodann werden 1-%-Portionen dieser Kultur in 100 ml 2xYT-Medium (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin), 10 mg/l FeSO₄ · 7 H₂O und Pyrrochinolinchinon (PQQ) überimpft und 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Nach Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 2 mMol wird die erhaltene Kultur weitere 15 Stunden bei 30°C inkubiert.

Nach dem Ernten der Zellen aus der vorstehend beschriebenen Kultur werden diese in 3 ml 1/20 M Phosphatpuffer (enthaltend 0,35% Natrium-n-lactat, pH 7,7) suspendiert. Die Suspension wird beschallt und sodann zentrifugiert. Das Pellet wird in 20 ml des vorstehend genannten Phosphatpuffers, enthaltend 8 M Harnstoff, gelöst. Sodann werden 0,585 g Natriumchlorid zugegeben. Die erhaltene Lösung wird auf einen pH- Wert von 10,0 eingestellt. Sodann wird 3 Stunden gegen 3 Liter 50 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 7,7) dialysiert. Das Dialysat wird weiter über Nacht gegen 3 Liter 1/20 Phosphatpuffer (pH 7,7) dialysiert. Es werden etwa 35 ml des rohen Enzyms erhalten.

2 ml des rohen Enzyms werden mit 2 ml Substratlösung (enthaltend 5% Acrylonitril, 0,35% Natrium-n-lactat, 10 mg/l FeSO₄ · 7 H₂O, 1 µg/ml PQQ und 50 mMol Phosphatpuffer; pH 7,7) vermischt. Sodann wird 20 Minuten bei 20°C unter Belichtung inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 2 ml 1 N HCl abgebrochen. Die Reaktionslösung wird einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen. Damit wird das gebildete Acrylamid und das darin enthaltene, nicht umgesetzte Acrylnitril nachgewiesen. Somit wird gezeigt, daß mit dem Rohextrakt des Wirtes E. coli JM105 kein Acrylamid hergestellt wird, während es mit dem Rohextrakt des erfindungsgemäßen pYUK121 enthaltenden E. coli JM105 hergestellt wird. Die spezifische Aktivität des Acrylamids beträgt 13,2 Einheiten pro Liter Medium. Dabei bedeutet eine Einheit die Menge von pro Minute gebildetem µMol Acrylamid.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit den folgenden Aminosäure- Sequenzen der α- und β-Untereinheiten und mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert:

α-Untereinheit

β-Untereinheit

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die die α- und β- Untereinheiten codierenden DNA-Sequenzen die folgenden sind:

a-Untereinheit

β-Untereinheit

3. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine in einen Vektor inserierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, das das rekombinante DNA-Molekül pYUK121 (FERM BP-1937) ist.

5. Transformierter Mirkoorganismus, der ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4 enthält.

6. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 5, der zur Art Escherichia coli gehört.

7. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 5 oder 6, der die Transformante E. coli JM105-pYUK121 (FERM BP- 1937) ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase, bei dem man eine Transformante nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in einem Medium unter geeigneten Bedingungen züchtet und die Nitrilhydratase aus dem Medium gewinnt.

9. Verfahren zur Herstellung von Amiden, bei dem man eine Transformante nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Bildung von Nitrilhydratase züchtet und mit der erhaltenen Nitrilhydratase Nitrile in die entsprechenden Amide umsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem man aus der gezüchteten Transformante eine Kulturlösung, Isolate, behandelte Zellen oder immobilisierte Derivate davon zur Umsetzung der Nitrile in die entsprechenden Amide herstellt.