DE3827168C2 - DNA mit genetischer Information von Sarcosinoxidase - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Polydesoxyribo­ nucleinsäure mit einer genetischen Information einer neuen Sarcosinoxidase.

Die Erfindung betrifft ferner einen Transformanten, der diese Polydesoxyribonucleinsäure aufweist, sowie die Sar­ cosinoxidase und ein Verfahren zur Herstellung derselben durch Expression mittels des Transformanten der geneti­ schen Information der genannten Polydesoxyribonuclein­ säure.

Aus der GB-A-2 005 689 ist ein Rohenzym bekannt, das wie eine Sarcosinoxidase wirkt und aus einem Mikroorganismus der Gat­ tung Bacillus sp. gewonnen wird.

Sarcosinoxidase ist ein Enzym, welches eine enzymatische Reaktion katalysiert, bei der jeweils ein Mol Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid erzeugt werden aus jeweils einem Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema:

Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂

Von Sarcosinoxidase ist es seit langem bekannt, daß sie natürlich vorkommt, speziell in tierischen Organen. Es wurde auch berichtet, daß diese Substanz in Mikroorganis­ men existiert, welche zur Gattung Penicillium [Frisell, W.R. & Mackenzie, C.G. (1970) Meth. Enzymol. 17A, 976- 981], Pseudomonas (ibd.), Artherobactor (JP-OS 28893/1979), Bacillus (JP-OSen 52789/1979 und 162174/1986), Cylindro­ carpon (JP-OS 92790/1981), Pseudomonas (JP-OS 43379/1985) und dem Stamm von Streptomyscetaceae (JP-OS 280271/1986) gehören.

Da es sich bei Sarcosinoxidase um eine Oxidase handelt, welche Sarcosin als ihr Substrat aufweist, kann sie für die quantitative Bestimmung des Sarcosins verwendet wer­ den, welches in einer Körperflüssigkeit, wie im Serum, vorliegt. Zusätzlich ist das Enzym in einem Creatinin- oder Cholin-Metabolismus involviert. Speziell führt die Konjugationsreaktion von Sarcosinoxidase mit Creatininase oder Creatinase, die im Kreatinin-Metabolismussystem an­ wesend ist, zur Bildung von Formaldehyd und Wasserstoff­ peroxid und ermöglicht somit eine quantitative Bestim­ mung von Creatinin oder Creatin in spezifischer Weise mit großer Leichtigkeit. Mit Sarcosinoxidase wird somit ein biologisches Verfahren zur quantitativen Analyse ei­ nes Creatinins und/oder Creatins zur Verfügung gestellt. Die Substanz ist somit nicht nur bei Laborexperimenten von Bedeutung, sondern auch bei klinischen Diagnosever­ fahren.

Sarcosinoxidase erzeugende Mikroorganismen, über die früher berichtet wurde, haben nur eine geringe Effizienz bei der Sarcosinoxidase-Erzeugung. Daher war die Verwen­ dung einer Substanz, welche dazu beitragen kann, die Bil­ dung von Sarcosinoxidase zu induzieren, wie Cholin, Sar­ cosin, Creatin oder dergl., unverzichtbar. Diese Maßnahme führt jedoch zu einer Kostensteigerung bei der Sarcosin­ oxidase-Erzeugung. Ferner gestaltet sich bei diesem Ver­ fahren die Entfernung von anderen Enzymtypen, welche zu­ sammen mit Sarcosinoxidase in dem kultivierten Gemisch vorliegen können, als äußerst schwierig. Es war somit ein kostenintensives Reinigungsverfahren erforderlich, um eine hochreine Sarcosinoxidase zu erhalten. Die Verwendung die­ ser Sarcosinoxidase erzeugenden Mikroorganismen hat sich somit nicht immer als effektiver und bequemer Weg zur Bereitstellung von Sarcosinoxidase als Reagens für den unbeschränkten Einsatz bei Laborexperimenten oder bei klinischen Diagnoseverfahren herausgestellt.

In einer kürzlich erschienenen Literaturstelle wird be­ richtet, daß kontaminierende Enzyme, wie Catalase und Uricase, welche in einer thermisch resistenten Sarcosin­ oxidase vorliegen, welche von einem thermisch resistenten Mikroorganismus stammt, vollständig desaktiviert werden können durch eine Hitzebehandlung der Sarcosinoxidase (JP-OS 162174/1986). Derartige kontaminierende Enzyme, wie Catalase und Uricase, die aus thermisch resistenten Mikro­ organismen stammen, sind jedoch mehr oder weniger ther­ misch resistent, und es ist in der Tat äußerst schwierig, diese kontaminierenden Enzyme vollständig zu eliminieren.

Von den Erfindern wurden umfangreiche Studien mit dem Ziel durchgeführt, die Produktivität der Sarcosinoxidase zu verbessern, ein Verfahren zu finden, mit dem fremde, kontaminierende Enzyme eliminiert werden können, und die Produktionskosten zu reduzieren. Als Ergebnis dieser Un­ tersuchungen ist es den Erfindern gelungen, ein neues Sarcosinoxidase-Gen aus einem Mikroorganismus zu erhalten und ferner dessen Primärstrukturanalyse aufzuklären. Dar­ über hinaus haben die Erfinder unter Anwendung von Genetic Engineering Techniken ein Verfahren entwickelt, mit dem die Sarcosinoxidase mit hoher Produktivität hergestellt werden kann, ohne daß die Verwendung einer induzierenden Substanz in dem Kulturmedium erforderlich ist.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfin­ dung, eine Polydesoxyribonucleinsäure zu schaffen, die ei­ ne Basensequenz gemäß Anspruch 1 umfaßt, die für eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids codiert, welches eine Sarcosinoxidase darstellt, die folgende physikochemische Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasserstoff­ peroxid gebildet wird aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauer­ stoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifi­ tät gegenüber Sarcosin.
• (c) Optimaler pH: 8,0 bis 9,5.
• (d) Isoelektrischer Punkt: 4,7 ± 0,1.
• (e) Molekulargewicht (bestimmt nach dem Gelfiltrations­ verfahren): 40 000 ± 4000.
• (f) Thermische Stabilität: stabil bei Behandlung bei 40°C während 10 min.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaf­ fung eines Transformanten, dessen Wirts-Mikroorganismen die erwähnte, spezifische Polydesoxyribonucleinsäure be­ sitzen.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, eine Sarcosinoxidase zu schaffen, die von diesem Transformanten gebildet wurde.

Erfindungsgemäß wird ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Sarcosinoxidase geschaffen, umfassend die Kultivie­ rung des Transformanten unter Bewirkung des Transforman­ ten, die genetische Information der erwähnten Polydesoxy­ ribonucleinsäure weiterzugeben, und Sammlung des Polypep­ tids, welches einen Bestandteil der Sarcosinoxidase dar­ stellt.

Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung wer­ den aus der folgenden Beschreibung deutlich. In den Figuren zeigen:

Fig. 1 eine schematische Zeichnung, in der der Auf­ bau des pOXI101-Vektors dargestellt ist;

Fig. 2 eine ähnliche Zeichnung für den pOXI103- Vektor;

Fig. 3-1 und 3-2 die Basensequenz der Sarcosinoxi­ dase-Gen-DNA (von 5′ bis 3′) und

Fig. 4-1 und 4-2 die Aminosäuresequenz des daraus gebildeten Translationsprodukts.

Die Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung besitzt als weitere enzymatische Aktivität eine Catalaseaktivität von unter 0,05 Einheiten, eine Creatinaseaktivität von un­ ter 0,0004 Einheiten und eine N-Ethylglycinoxidaseaktivi­ tät von unter 0,03 Einheiten pro Einheit Aktivität der Sarcosinoxidase. Das Polypeptid, welches diese Sarcosin­ oxidase aufbaut, hat eine Aminosäuresequenz, welche, be­ ginnend vom N-terminalen Ende, die folgende Formel (I) aufweist.

wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoff­ atom steht und B einen Aminosäurerest oder -OH bedeutet.

In dem Polypeptid der Formel (I) kann der Aminosäurerest, der durch A dargestellt wird, ein oder mehrere Aminosäu­ rereste sein. Bevorzugte Beispiele für A sind ein Wasser­ stoffatom, ein Methionin oder ein Signal-Polypeptid. Die durch B repräsentierte Gruppe kann entweder ein Säure­ amid oder ein oder mehrere Aminosäurereste sein.

Eine Polydesoxyribonucleinsäure, die ein Sarcosinoxidase- Gen darstellt, das die oben erwähnten physikochemischen Eigenschaften aufweist, kann eine beliebige Polydesoxy­ ribonucleinsäure sein, solange dieselbe nur das Sarcosin­ oxidase-Gen per se enthält, welches die oben erwähnten physikochemischen Charakteristika besitzt. Als Beispiel dieses Sarcosinoxidase-Gens per se sei eine Polydesoxy­ ribonucleinsäure erwähnt mit einer Basensequenz, die für die Aminosäuresequenz der folgenden Formel (II) codiert, beginnend von dem N-terminalen Ende:

Unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz des Polypep­ tids, das die Sarcosinoxidase der Formel (II) aufbaut, kann es sich bei der Polydesoxyribonucleinsäure um eine beliebige Polydesoxyribonucleinsäure handeln, solange die­ se nur ein beliebiges Codon unter einer Serie von Codons besitzt, das der jeweiligen der Aminosäuren entspricht, welche die Aminosäuresequenz der Formel (II) darstellen. Es kann sich auch um eine Polydesoxyribonucleinsäure han­ deln, welche an ihrem 5′-Ende ein oder mehrere Codons mit Ausnahme eines Nonsenscodons und/oder an ihrem 3′-Ende ein oder mehrere Codons aufweist. Ein typisches Beispiel einer solchen Polydesoxyribonucleinsäure ist eine solche mit einer Basensequenz, welche, beginnend vom 5′-Ende, die folgende Formel (III) hat:

wobei X für ein Codon mit Ausnahme von TAA, TAG und TGA oder ein für ein Wasserstoffatom steht und Y ein Codon oder ein Wasserstoffatom darstellt.

Bei der Basensequenz der Formel (III) kann es sich bei dem durch X dargestellten Codon um ein beliebiges Codon handeln, solange dasselbe nur für eine Aminosäure codiert. Zusätzlich kann X an seinem 5′-Ende ein oder mehrere Co­ dons besitzen, welche für Aminosäuren codieren. Bevorzugte Beispiele für X sind ATG oder eine Polydesoxyribonuclein­ säure, welche einem Signal-Peptid entspricht.

Das durch Y dargestellte Codon kann ein beliebiges Codon sein, ausgewählt unter Translationsstopp-Codons und Co­ dons, welche für eine Aminosäure codieren. Y kann an sei­ nem 3′-Ende ein oder mehrere Codons besitzen, welche für Aminosäuren codieren, wobei es in diesem Fall wünschens­ wert ist, daß am 3′-Ende dieser Codons ein Translations­ stopp-Codon vorgesehen ist.

Eine Polydesoxyribonucleinsäure mit einem Sarcosinoxidase- Gen als ihrem Bestandteil, eine Polydesoxyribonuclein­ säure, welche ein Gen mit einer Basensequenz aufweist, die für eine Aminosäuresequenz der Formel (II) codiert, oder eine Polydesoxyribonucleinsäure der Formel (III) kann man leicht herstellen mittels eines Mikroorganismus, welcher einen Donor des Sarcosinoxidase erzeugenden Gens darstellt. Speziell umfaßt dieses Verfahren die folgenden Verfahrensstufen. Eine DNA dieses Mikroorganismus wird zunächst abgetrennt und gereinigt. Anschließend erfolgt eine Behandlung mit Ultraschallwellen oder mit einer Re­ striktionsendonuclease. Diese DNA und eine lineare Ex­ pressionsvektor-DNA, welche in ähnlicher Weise verdaut wurde, z. B. durch eine Restriktionsendonuclease, werden mit einer DNA-Ligase oder dergl. verbunden (an den abge­ stumpften oder kohäsiven Enden der beiden DNAs), um ei­ nen geschlossenen Kreis zu bilden. Der auf diese Weise erhaltene, rekombinante DNA-Vektor wird in einen reprodu­ zierbaren Wirts-Mikroorganismus eingeführt. Die Mikro­ organismen, welche diesen rekombinanten DNA-Vektor auf­ weisen und die mittels eines Screening-Verfahrens unter Verwendung des Vektormarkers und der Sarcosinoxidase-Ak­ tivität als Indikatoren gesammelt wurden, werden kulti­ viert. Der rekombinante DNA-Vektor wird dann von den kul­ tivierten Mikroorganismen abgetrennt und gereinigt. Dar­ aus wird die Sarcosinoxidase-Gen-Polydesoxyribonuclein­ säure gesammelt.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung können beliebi­ ge Sarcosinoxidase erzeugende Mikroorganismen verwendet werden, welche in der Lage sind, Sarcosinoxidase mit den vorstehend erwähnten physikochemischen Eigenschaften zu erzeugen. Als Beispiel sei Bacillus sp. B-0618-Stamm genannt, der in JP-OS 28893/1979 beschrieben wurde.

Ein transformierter Mikroorganismus, dem sie Sarcosin­ oxidase erzeugende Fähigkeit unter Verwendung von Genetic Engineering Techniken verliehen wurde, kann ebenfalls als ein Sarcosinoxidase-Gen-Donator-Mikroorganismus verwendet werden.

Das Verfahren der Sammlung einer DNA, welche durch den Gen-Donator-Mikroorganismus induziert wurde, wird im fol­ genden beispielhaft erläutert. Ein beliebiger der oben erwähnten Gen-Donator-Mikroorganismen wird zunächst in einem flüssigen Kulturmedium unter Belüftung 1 bis 3 Tage kultiviert. Die kultivierte Brühe wird zentrifugiert, um die Mikroorganismen zu sammeln. Diese werden dann zur Er­ zeugung einer Bacteriolyse lysiert, enthaltend ein Sarco­ sinoxidase-Gen. Für die Bacteriolyse wird eine Behandlung mit einem die Zellwand lysierenden Enzym, wie Lysozym oder β-Glucanase, durchgeführt. Gegebenenfalls erfolgt diese Behandlung in Kombination mit einem anderen Enzym, wie Protease, oder einem oberflächenaktiven Mittel, wie Natriumlaurylsulfat. Zusätzlich kann neben der Bacterio­ lyse eine physikalische Verdauung der Zellwände durchge­ führt werden, z. B. durch Einfrieren-Auftauen oder mittels einer französischen Presse.

Herkömmliche Verfahren der Reinigung umfassen beispiels­ weise eine Deproteinbehandlung durch Phenolextraktion, Proteasebehandlung, Ribonucleasebehandlung, Präzipitation aus Alkohol und Zentrifugieren und können entweder unab­ hängig oder in Kombination angewandt werden, um eine Ab­ trennung und Reinigung der DNA aus der Bacteriolyse zu erreichen.

Die Verdauung der auf diese Weise abgetrennten und gerei­ nigten DNA des Mikroorganismus kann beispielsweise durch­ geführt werden mittels einer Behandlung mit Ultraschall­ wellen oder eine Restriktionsendonuclease. Um eine leichte Verbindung der DNA-Fragmente und der Vektor-DNA zu ge­ währleisten, ist jedoch die Verwendung einer Restriktions­ endonuclease bevorzugt, speziell einer solchen mit einer Aktivität für eine spezifische Nucleotidsequenz, wie EcoR I, Hind III, BamH I oder BamH II.

Geeignete Vektoren für den Einsatz bei der Erfindung sind solche, welche für die Verwendung als genetische, rekombi­ nante DNA durch künstliche Behandlung eines Phagen oder einer Plasmid-DNA rekonstruiert wurden und in der Lage sind, autonom in Wirtsbakterienzellen zu wachsen.

Falls Escherichia coli als Wirts-Mikroorganismus verwen­ det wird, werden beispielsweise γgt.γC, γgt.γB oder dergl. als Phagen verwendet.

Als Plasmid werden pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19 oder dergl. verwendet, falls Escherichia coli der Wirts-Mikroorganismus ist, und pUB110, pC194 oder dergl. werden verwendet, falls Bacillus subtilis der Wirts-Mikroorganismus ist. Zusätzlich kann man Shuttle­ vektoren einsetzen, welche autonom in Wirtsbakterienzel­ len wachsen können, und zwar in grampositiven oder gram­ negativen Mikroorganismen oder in beiden, z. B. bei Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae. Diese Vektoren werden vorteilhafterweise zu Vektorfragmenten verdaut unter Verwendung der gleichen Restriktionsendo­ nuclease wie derjenigen, die zum Aufbrechen der oben er­ wähnten Sarcosinoxidase-Gen-Donator-Mikroorganismus-DNA verwendet wurde.

Herkömmliche Verfahren der Verwendung von DNA-Ligase kön­ nen eingesetzt werden, um die bakterielle DNA und das Vektorfragment zu vereinigen. Beispielsweise kann das ko­ häsive Ende der bakteriellen DNA und das des Vektorfrag­ ments zunächst getempert (annealed) werden und nachfol­ gend kann eine rekombinante DNA aus dem bakteriellen DNA- Fragment und dem Vektorfragment durch die Wirkung einer geeigneten DNA-Ligase hergestellt werden. Falls erforder­ lich, kann das getemperte bakterielle DNA-Vektor-Fragment in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt werden, um die rekombinante DNA mit Hilfe einer in vivo-DNA-Ligase zu erzeugen.

Als Wirtsbakterien kann man beliebige Mikroorganismen ver­ wenden, welche ein autonomes und stabiles Wachstum der rekombinanten DNA erlauben und die Fähigkeit zur Expressi­ on des Charakters der fremden DNA besitzen. Beispiele der­ artiger Mikroorganismen umfassen Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escheri­ chia coli C600 und dergl., falls Escherichia coli als Wirtsbakterium verwendet wird.

Die Einführung der rekombinanten DNA in den Wirts-Mikro­ organismus kann in Gegenwart von Calciumionen durchge­ führt werden, wenn der Wirts-Mikroorganismus ein Bakteri­ um der Gattung Escherichia ist. Falls man ein Bakterium der Gattung Bacillus als Wirts-Mikroorganismus einsetzt, so kann man entweder die kompetente Zellmethode, ein Ver­ fahren zur elektrischen Einführung der Ribosom-Rekombi­ nant-DNA in die Protoplast-Wirtsbakterienzellen oder die Mikroinjektionsmethode verwenden. Es wurde festgestellt, daß die auf diese Weise hergestellten Transformant-Bak­ terien bei Kultivierung in einem Nährmedium in stabiler Weise große Mengen Sarcosinoxidase erzeugen.

Die Einführung der zweckdienlichen DNA in den Wirts-Mikro­ organismus kann verfolgt werden, indem man den Mikroorga­ nismus ermittelt, der zur Expression eines Drogenresi­ stenzmarkers des Vektors, auf dem die zweckdienliche, rekombinante DNA gehalten wird, in der Lage ist sowie gleichzeitig zur Expression von Sarcosinoxidase. Man kann beispielsweise diejenigen Bakterien selektieren, welche in einem selektiven Kulturmedium des chemischen Toleranz­ markers wachsen und Sarcosinoxidase erzeugen.

Die rekombinante DNA, welche das Sarcosinoxidase-Gen be­ sitzt und einmal auf diese Weise ausgewählt wurde, kann leicht von dem Transformant-Mikroorganismus extrahiert werden für die Einführung in ein weiteres Wirtsbakterium. Alternativ kann man die Sarcosinoxidase-Gen-DNA unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease oder dergl. aus einer rekombinanten DNA, welche ein Sarcosinoxidase- Gen besitzt, verdauen und mit einem Ende eines anderen geöffneten Vektors vereinigen, der auf ähnliche Weise er­ halten wurde. Die rekombinante DNA mit neuen Eigenschaf­ ten, welche auf diese Weise hergestellt wurde, wird an­ schließend in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt.

Eine Sarcosinoxidase-Mutein-DNA, die eine wesentliche Sarcosinoxidase-Aktivität besitzt, ist eine Genvariante, die durch Genetic Engineering Techniken erfindungsgemäß aus einem Sarcosinoxidase-Gen erzeugt wurde. Dieses Mute­ in kann mittels verschiedener Genetic Engineering Tech­ niken hergestellt werden, wie der ortsspezifischen Basen­ konversionsmethode, der Substitution eines spezifischen DNA-Fragments mit einem künstlichen Variant-Gen und dergl. Unter den so hergestellten Sarcosinoxidase-Mutein-DNAs werden diejenigen, welche besonders ausgezeichnete Eigen­ schaften aufweisen, schließlich in einen Vektor einge­ setzt zur Erzeugung einer rekombinanten DNA, welche dann in den Wirts-Mikroorganismus eingeführt wird. Nachfolgend kann das Sarcosinoxidase-Mutein hergestellt werden.

Die Basensequenz des nach dem oben beschriebenen Verfah­ ren hergestellten Sarcosinoxidase-Gens wurde mit der Des­ oxy-Methode entschlüsselt [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Die Aminosäuresequenz von Sarcosinoxidase wurde basie­ rend auf der Basensequenz bestimmt.

Im folgenden wird die Methode erläutert, welche zur Be­ stimmung der Aminosäuresequenz des Abschnitts angewandt wurde, der das N-Ende des Sarcosinoxidase-Peptids dar­ stellt. Der Sarcosinoxidase-Gen-Donator-Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Erzeugung von Sarcosinoxidase wird zunächst in einem Nährmedium kultiviert, um Sarcosin­ oxidase in den Bakterien zu bilden und anzureichern. Die kultivierten Bakterien werden von der Brühe durch Filtra­ tion, Zentrifugieren oder ähnliche Verfahren gesammelt. Die gesammelten Bakterien werden dann verdaut, und zwar entweder mechanisch oder enzymatisch unter Verwendung von Lysozym oder dergl., und zu den verdauten Bakterien gibt man EDTA und/oder ein geeignetes oberflächenaktives Mittel, sofern erforderlich, um Sarcosinoxidase zu solu­ bilisieren. Diese wird anschließend als wäßrige Lösung abgetrennt. Diese wäßrige Lösung der Sarcosinoxidase wird eingeengt oder ohne Einengung der Ammoniumsulfat-Frakti­ onierung, Gelfiltration, Adsorptionschromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen, um hochreine Sarcosinoxidase zu erhalten. Die Aminosäuresequenz des Abschnitts, welcher das N-Ende des Sarcosinoxidase- Peptids darstellt, wird an dieser hochreinen Sarcosin­ oxidase bestimmt unter Verwendung eines Flüssigphasen- Proteinsequenz-Analysegeräts (Beckman System 890ME, her­ gestellt von Beckman, Inc.). Auf diese Weise wird fest­ gestellt, daß die Aminosäuresequenz dieses Abschnitts identisch ist mit der N-terminalen Aminosäure-Sequenz von der Sarcosinoxidase, die durch eine Genetic Engineering Technik erhalten wurde.

Die Kultivierung des Transformant-Wirts-Mikroorganismus wird unter geeigneten Bedingungen durchgeführt, wobei die Nährstoffcharakteristika und die physiologischen Charakteristika des Wirts-Mikroorganismus berücksichtigt werden. In den meisten Fällen wird eine Flüssigkultivie­ rung durchgeführt. Bei einer Produktion im industriellen Maßstab hat sich jedoch eine Kultivierung unter tiefen aeroben Rührbedingungen als vorteilhafter erwiesen. Eine breite Vielfalt von Nährstoffen, wie sie herkömmlicher­ weise für die Kultivierung von Bakterien verwendet wer­ den, kann für die Kultivierung des Wirts-Mikroorganismus verwendet werden. Speziell kann man beliebige Nährstoff- Kohlenstoffverbindungen als Kohlenstoffquellen einsetzen, einschließlich beispielsweise Glucose, Saccharose, Lacto­ se, Maltose, Fructose, Melassen und dergl. Als Stickstoff­ quellen kann man beliebige, verfügbare Stickstoffverbin­ dungen einsetzen, einschließlich Peptone, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Caseinhydrolysate und dergl. Andere Be­ standteile einschließlich Salze, wie Phosphate, Carbonate und Sulfate, sowie Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan, Zink und dergl. und bestimmte Typen von Aminosäuren oder Vitamine können verwendet werden, falls ihr Einsatz zweckmäßig ist. Bei dem Verfahren ist die Verwendung von Sarcosinoxidase-induzierenden Substanzen, wie Cholin, Sarcosin, Creatin und dergl., welche bei dem herkömmlichen Verfahren der Erzeugung von Sarcosinoxida­ se durch Sarcosinoxidase erzeugende Mikroorganismen er­ forderlich waren, nicht nötig.

Die Kultivierungstemperatur kann in einem Bereich variiert werden, in dem die Bakterien wachsen können und Sarcosin­ oxidase produzieren können. Der bevorzugte Temperaturbe­ reich beträgt 20 bis 42°C für Escherichia coli. Die Kul­ tivierungsdauer kann in einem gewissen Ausmaß in Abhän­ gigkeit von den Kultivierungsbedingungen variiert werden. Grundsätzlich wird die Kultivierung zu einem Zeitpunkt beendet, wenn die Ausbeute an Sarcosinoxidase ein Maximum erreicht. Bei der gewöhnlichen Praxis dauert das etwa 12 bis 48 Stunden. Es ist möglich, den pH dieser Kultur­ media in einem Bereich zu ändern, in dem die Bakterien wachsen und Sarcosinoxidase erzeugen können. Der spezi­ ell bevorzugte pH-Bereich ist etwa 6 bis 8.

Sarcosinoxidase kann für die Verwendung in Form der Kul­ turbrühe mit einem Gehalt der Bakterien aufbewahrt wer­ den. Im allgemeinen wird jedoch die in der Kulturbrühe enthaltene Sarcosinoxidase verwendet, nachdem man die Bakterien durch Filtration, Zentrifugieren oder ähnliche Verfahren abgetrennt hat. Falls Sarcosinoxidase in den Bakterienkörpern enthalten ist, werden die Bakterien zu­ nächst mittels Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Die gesammelten Bakterien werden anschließend verdaut, und zwar entweder durch mechanische Mittel oder durch en­ zymatische Mittel unter Verwendung von Lysozym oder dergl. Zu den verdauten Bakterien wird ein Chelatisie­ rungsmittel, wie EDTA und/oder ein geeignetes oberflä­ chenaktives Mittel, sofern erforderlich, gegeben, um Sarcosinoxidase zu solubilisieren. Sarcosinoxidase wird dann als wäßrige Lösung gesammelt.

Die so erhaltenen, Sarcosinoxidase enthaltenden Lösun­ gen werden anschließend durch Eindampfen im Vakuum oder unter Verwendung eines Filters eingeengt und einer Aus­ salzbehandlung mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder dergl. oder einer fraktionierten Fällung unter Verwendung eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels, wie Me­ thanol, Ethanol, Aceton oder dergl., unterworfen. Das Präzipitat wird in Wasser aufgelöst und die Lösung wird durch eine semipermeable Membran dialysiert, um nieder­ molekulargewichtige Verunreinigungen zu eliminieren. Als alternatives Verfahren kann man das Präzipitat mittels Gelfiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustausch- Chromatographie oder dergl. unter Verwendung eines Ad­ sorptionsmittels oder eines Gelfiltrationsmittels, raffi­ nieren. Gereinigte Sarcosinoxidase wird aus der Sarcosin­ oxidase enthaltenden Lösung, welche unter Verwendung der verschiedenen Maßnahmen erhalten wurde, durch Verdampfung im Vakuum, Gefriergetrocknung oder dergl. hergestellt.

Die Aktivität der so hergestellten Sarcosinoxidase wird nach dem folgenden Verfahren gemessen.

Zunächst wird eine Reaktionsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

ml
0,2 Mol Tris-Chlorwasserstoff-Puffer (pH 8,0)
0,5
15 mMol 4-Aminoantipyrin	0,5
0,2% (Gew./Vol.) Phenol	0,5
Peroxidase (0,5 E/ml)	0,5
0,1 Mol Sarcosin-wäßrige Lösung	1,0
Wasser	2,0

In ein Reagenzglas gibt man 0,5 ml der obigen Reaktions­ flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird 3 min bei 37°C erhitzt und mit 10 µl einer Lösung mit einem Gehalt an Sarcosin­ oxidase (SOX) versetzt. Nachdem das Gemisch genau 5 min bei 37°C gehalten wurde, gibt man 2,5 ml Ethanol zu, um die Reaktion zu beenden. Das Gemisch wird dann einer colorimetrischen Analyse bei einer Wellenlänge von 480 nm unterworfen und der erhaltene Wert wird als A genommen. Wenn man die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid/min als 1 Einheit (E) annimmt, errechnet sich der Wert für die Sarcosinoxidase-Aktivität (SOX-Aktivitätswert: E/ml) aus der folgenden Gleichung:

wobei A_o den colorimetrischen Wert bezeichnet, der bei 480 nm erhalten wird, wenn die Pufferlösung ohne die En­ zymlösung verwendet wird.

Die Aktivitäten der anderen Enzyme werden gemäß den fol­ genden Verfahren bestimmt.

(1) Messung der Catalase-Aktivität

In ein Reagenzglas gibt man 0,5 ml der mit 0,1 Mol Phos­ phatpuffer (pH 7,0) verdünnten Enzymlösung. Nach Erhitzen der Lösung während 5 min bei 30°C gibt man 0,5 ml 0,4%ige Wasserstoffperoxid-Lösung zu und hält das Ganze genau 5 min bei 30°C. Nach Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 2,5 ml 0,1 Mol Perchlorsäurelösung wird das Gemisch einer colorimetrischen Analyse unterworfen. Der erhalte­ ne Wert wird als B bezeichnet. Gesondert werden 0,5 ml der 0,4%igen Wasserstoffperoxidlösung in ein Reagenz­ glas gefüllt und 5 min bei 30 °C erhitzt. Dazu gibt man 2,5 ml 0,1 Mol Perchlorsäurelösung und dann 0,5 ml der mit 0,1 Mol Phosphatpuffer (pH 7,0) verdünnten Enzymlö­ sung. Das Gemisch wird bei 240 nm der colorimetrischen Analyse unterworfen und der erhaltene Wert wird als B_o bezeichnet. Wenn man die Fähigkeit der Substanz zur Er­ zeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid/min als 1 Einheit (E) annimmt, errechnet sich der Wert für die Catalase- Aktivität (CL-Aktivitätswert: E/ml) aus der folgenden Gleichung:

(2) Messung der Creatinase-Aktivität

Es werden zunächst drei Lösungen hergestellt.

ml
Erste Lösung:
0,2 Mol Phosphatpuffer (pH 7,5)	0,5
50 mMol Creatin-wäßrige Lösung	4,5
Zweite Lösung: @	0,2 Mol Tris-Chlorwasserstoffsäurepuffer (pH 8)	0,5
15 mMol 4-Aminoantipyrin-wäßrige Lösung	0,5
0,2% Phenol	0,5
Peroxidase (50 E/ml)	1,0
Sarcosinoxidase (30 E/ml)	0,5
0,5 mMol p-Chlorquecksilberbenzol	2,0
Dritte Lösung: @	0,5 mMol p-Chlorquecksilberbenzol	0,5

Die erste Lösung wird in ein Reagenzglas gefüllt und 3 min bei 37°C erhitzt. Dazu gibt man 10 µl einer Enzym­ lösung und hält das Ganze genau 5 min bei 37°C. Zu dem Gemisch gibt man 0,5 ml der dritten Lösung und danach 0,5 ml der zweiten Lösung. Nachdem dieses Gemisch weite­ re 20 min bei 37°C gehalten wurde, um die Reaktion zu bewirken, werden 1,5 ml destilliertes Wasser zugesetzt und die Lösung wird bei einer Wellenlänge von 500 nm der colorimetrischen Analyse unterworfen. Die Fähigkeit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoffperoxid in 1 min wird als die Aktivität von 1 Einheit (E) ange­ nommen.

(3) Messung der N-Ethylglycinoxidase-Aktivität

Zunächst wird eine Reaktionsflüssigkeit der folgenden Zusammensetzung hergestellt

ml
0,2 Mol Tris-Chlorwasserstoff-Puffer (pH 8,0)
0,5
15 mMol 4-Aminoantipyrin	0,5
0,2% (Gew./Vol.) Phenol	0,5
Peroxidase (50 E/ml)	0,5
1,0 Mol N-Ethylglycin-wäßrige Lösung	1,0
Wasser	2,0

In ein Reagenzglas gibt man 0,5 ml der obigen Reaktions­ flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird 3 min bei 37°C erhitzt und mit 10 µl einer das Enzym enthaltenden Lösung ver­ setzt. Nachdem man das Gemisch genau 5 min bei 37°C ge­ halten hat, gibt man 2,5 ml Ethanol zur Beendigung der Reaktion zu. Das Gemisch wird dann der colorimetrischen Analyse bei einer Wellenlänge von 480 nm unterworfen, und der dabei erhaltene Wert wird als A bezeichnet. Die Fähig­ keit der Substanz zur Erzeugung von 1 µMol Wasserstoff­ peroxid/min wird als die Einheit (E) der Aktivität des Enzyms angenommen.

Basierend auf den obigen Verfahren zur Bestimmung der Enzymaktivität findet man bei der Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung eine Catalase-Aktivität von unter 0,05 Einheiten, eine Creatinase-Aktivität von unter 0,0004 Einheiten und eine N-Ethylglycinoxidase-Aktivität von unter 0,03 Einheiten pro Einheit der Aktivität von Sarcosinoxidase. Es wird somit deutlich, daß die Sarcosin­ oxidase ein Enzym mit einer äußerst hohen Spezifität ist und als Reagens für klinische Diagnoseverfahren brauch­ bar ist.

Die auf diese Weise hergestellte Sarcosinoxidase besitzt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:

• (a) Wirkung:
  Das Enzym katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauer­ stoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema er­ zeugt wird: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.
• (b) Substratspezifität:
  Die Sarcosinoxidase wird in einer Menge von 0,5 E zu 0,5 ml der Reaktionslösung ge­ geben, die 0,05 ml 0,2 M Tris-Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 8,0), 0,05 ml 0,2%iges Phenol, 0,05 ml von 0,5 mg/ml Peroxidase, 0,2 ml destilliertes Wasser und 0,20 ml einer Substratlösung der folgenden Verbindung mit 0,5 Mol Konzentration umfaßt. Man läßt die Lösung 5 min bei 37°C reagieren. Anschließend werden 2,5 ml Ethanol zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Die resul­ tierende Lösung wird bei 480 nm einer colorimetrischen Analyse unterzogen. Die Ergebnisse, ausgedrückt als re­ lative Aktivität des jeweiligen Substrats, sind nach­ stehend angegeben:

  Substrat
  Relative Aktivität (%)
  Sarcosin
  100,0
  Cholin	0
  Serin	0
  Threonin	0
  Alanin	0
  Valin	0
  N-Methylethanolamin	0
  N-Dimethylethanolamin	0

• (c) Optimaler pH:
  Um den Einfluß des Enzyms auf das 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase-Chromophorsystem zu vermeiden, wird das erzeugte Formaldehyd quantitativ be­ stimmt durch die Acetyl-Aceton-Methode. Dabei wurde fest­ gestellt, daß der optimale pH-Bereich der Sarcosinoxidase in der Nähe von 8,0 bis 9,5 liegt. Die verwendeten Puf­ fer waren Dimethylglutarsäure-Puffer (pH 4 bis 7), Phos­ phatpuffer (pH 6 bis 8), Tris-Chlorwasserstoffsäure- Puffer (pH 7,5 bis 9), Glycin-Natriumhydroxid-Puffer (pH 9 bis 10) und Natriumcarbonat-Natriumborat-Puffer (pH 10 bis 11).
• (d) Isoelektrischer Punkt:
  4,7 + 0,1 (Elektrophorese unter Verwendung von Träger-Ampholin).
• (e) Molekulargewicht (bestimmt mit der Gelfiltrations­ methode):
  40 000 ± 4000.
• (f) Thermische Stabilität:
  0,5 ml 10 mMol Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 8,0), enthaltend 20 µg/ml des enzymatischen Proteins, werden bei einer konstanten Temperatur stehengelassen. Dann wird die enzymatische Aktivität der Lösung gegenüber Sarcosin gemessen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren. Man stellt fest, daß die Lösung 100% Aktivität erhalten hat, selbst nach Be­ handlung bei 40°C.
• (g) Optimale Temperatur:
  Die enzymatische Aktivität gegenüber Sarcosin wurde bei verschiedenen Temperaturen gemäß der oben beschriebenen Methode zur Bestimmung der Sarcosinoxidase-Aktivität gemessen. Dabei findet man, daß die optimale Temperatur in der Nähe von 50°C liegt.
• (h) pH-Stabilität:
  Pufferlösungen des Enzyms mit un­ terschiedlichen pH-Werten werden hergestellt. Die ver­ wendeten Puffer sind Dimethylglutarsäure-Puffer (pH 4 bis 7), Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), Tris-Chlorwasser­ stoffsäure-Puffer (pH 7,5 bis 9), Glycin-Natriumhydroxid- Puffer (pH 9 bis 10), Natriumcarbonat-Natriumborat-Puf­ fer (pH 10 bis 11). Zu 0,1 ml des jeweiligen Puffers gibt man 100 µl der Enzymlösung (die enzymatische Prote­ inkonzentration beträgt 100 µg/ml) und läßt die Mischung 60 min bei 37°C stehen. Dann setzt man 0,3 ml 1,0 mMol Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH 8,0) zur Einstel­ lung des pH-Wertes zu. 20 µl eines Aliquots dieser Lö­ sung gibt man zu der Reaktionsflüssigkeit, um deren en­ zymatische Aktivität gegenüber Sarcosin nach der oben beschriebenen Methode zu bestimmen. Dabei stellt man fest, daß in der Nähe von 6,0 bis 10,0 pH-Stabilität vorliegt.

In der vorliegenden Beschreibung werden Aminosäuren, Peptide, Nucleinsäuren und Nucleinsäure-verwandte Verbin­ dungen gemäß den herkömmlichen Standards auf diesem Ge­ biet abgekürzt. Einige Beispiele der Abkürzungen sind nachstehend angegeben. Ferner beziehen sich alle Be­ zeichnungen der Aminosäuren auf die L-Isomeren.

DNA = Desoxyribonucleinsäure
RNA = Ribonucleinsäure
A = Adenin
T = Thymin
G = Guanin
C = Cytosin
Ala = Alanin
Arg = Arginin
Asn = Asparagin
Asp = Aspartat
Cys = Cystein
Gln = Glutamin
Glu = Glutamat
Gly = Glycin
His = Histidin
Ile = Isoleucin
Leu = Leucin
Lys = Lysin
Met = Methionin
Phe = Phenylalanin
Pro = Prolin
Ser = Serin
Thr = Threonin
Trp = Tryptophan
Tyr = Tyrosin
Val = Valin.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiele Beispiel 1 [Herstellung von Chromosom-DNA]

Chromosom-DNA wird aus Bacillus sp. B-0618 (FERM BP-0750) nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Der Stamm wird über Nacht in einem normalen Bouillon-Medium, enthaltend 0,5% Natriumthiosulfat, bei 37°C unter Schütteln kulti­ viert. Die kultivierte Brühe wird 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Bakterien zu sammeln. Diese werden in 5 ml einer Lösung suspendiert, die 10% Saccharose, 50 mMol Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 8,0) und 50 mMol EDTA enthält. Zu der Suspension gibt man 1 ml Lysozym­ lösung (10 mg/ml) und hält die Mischung 15 min bei 37°C. Anschließend erfolgt die Zugabe von 1 ml 10%igem SDS (Natriumdodecylsulfat). Ein gleiches Volumen einer Lö­ sungsmittelmischung von Chloroform und Phenol (1 : 1) wird zu der Suspension gegeben und das Gemisch wird gerührt und 3 min bei 10 000 U/min zentrifugiert, um Wasser und Lösungsmittelschichten abzutrennen. Zu der zurückgewon­ nenen Wasserschicht gibt man vorsichtig das zweifache Volumen Ethanol und rührt das Gemisch langsam mit einem Glasstab, um zu bewirken, daß sich die DNA um den Stab wickelt. Die auf diese Weise abgetrennte DNA wird in 10 ml einer Lösung aufgelöst, die 10 mMol Tris-chlor­ wasserstoffsäure (pH 8,0) und 1 mMol EDTA enthält (eine derartige Lösung wird im folgenden als "TE" bezeichnet). Diese Lösung wird mit einem gleichen Volumen des Chloro­ form-Phenol (1 : 1)-Lösungsmittelgemisches behandelt und erneut zentrifugiert, um die Wasserschicht zu isolieren. Zu dieser gibt man das zweifache Volumen Ethanol, und die DNA wird wiederum auf die oben beschriebene Weise abgetrennt. Diese schließlich erhaltene DNA wird in 2 ml TE aufgelöst.

Beispiel 2 [Herstellung von pACYC 184-Plasmid-DNA]

Escherichia coli pM191, welches pACYC 184 trägt [J. Bacteriol, 134, 1141 (1981); ATCC 37033], wird in 1 l BHI-Medium (hergestellt von Difco Co.) unter Schütteln kultiviert. Wenn die Trübung der Brühe den Wert OD₆₆₀ = 1,0 erreicht hat, wird Spectinomycin zugesetzt, so daß eine Endkonzentration der Brühe 300 µg/ml beträgt. Das Schütteln der Brühe bei 37°C wird mindestens 16 h fort­ gesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung wird die Brühe 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert, um Bakterienzellen zu sammeln. Daraus wird die Plasmid-DNA nach der Lysozym- SDS-Methode und der Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Metho­ de [Maniatis et al., Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)] hergestellt.

Beispiel 3 [Aufbau von Plasmid p0XI101 mit Sarcosinoxi­ dase(SOX)-Gen]

• (1) Es wird eine Mischung hergestellt aus 2 µl (etwa 0,5 µg) Bacillus sp.B-0618-chromosomaler DNA, hergestellt in Beispiel 1), 1 µl einer 10fachen Konzentration EcoRI- Verdauungspuffer [500 mMol Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 7,5), 70 mMol MgCl₂, 1 Mol NaCl und 70 mMol Mercapto­ ethanol], 1 µl EcoRI (10 Einheiten/µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und 6 µl Wasser. Die DNA wird 1 h bei 37°C verdaut. Gesondert wird Plasmid pACYC 184- DNA (etwa 0,3 µg) mit EcoRI auf ähnliche Weise verdaut. Dazu gibt man 0,6 Einheiten alkalische Phosphase (herge­ stellt von Takara Shuzo Co., Ltd.; im folgenden als "BAP" bezeichnet) und inkubiert das Gemisch 1 h bei 65°C. Die beiden Lösungen der EcoRI-verdauten DNAs, die auf diese Weise hergestellt wurden, werden miteinander ver­ mischt und zu dem Gemisch gibt man 0,1 Vol. 3M Natrium­ acetat. Anschließend wird die Lösung mit einem gleichen Volumen einer Chloroform-Phenol-Lösungsmittelmischung be­ handelt und zentrifugiert, um die Wasserschicht zurück­ zugewinnen. Dazu gibt man das zweifache Volumen Ethanol. Die DNA wird durch Zentrifugieren gefällt und im Vakuum getrocknet. Die getrocknete DNA wird in 89 µl Wasser aufgelöst. Dazu gibt man 10 µl der 10fachen Konzentration Ligationspuffer [0,5 Mol Tris-Chlorwasserstoffsäure (pH 7,6), 0,1 Mol MgCl₂, 0,1 Mol Dithiothreit, 10 mMol Spermidin, 10 mMol ATP) und 1 µl T4 DNA-Ligase (175 Ein­ heiten/ µl; hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und vermischt das Ganze. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen. Diese DNA-Lösung wird mit einer Chloro­ form-Phenol-Mischung behandelt und die DNA wird durch Ethanol ausgefällt, im Vakuum getrocknet und in 10 µl TE aufgelöst.
• (2) Escherichia coli DH1 (Stamm Nr. ME8569; zur Ver­ fügung gestellt von National Gene Research Institute) wird in 100 ml BHI-Medium (Brain Heart Infusion, herge­ stellt von Difco Co.) kultiviert, und die Zellen werden in der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugie­ ren (10 000 U/min, 2 min) gesammelt. Die Zellen werden in 40 ml einer eiskalten Lösung suspendiert, die 30 mMol Kaliumacetat, 100 mMol RbCl, 10 mMol CaCl₂, 50 mMol MnCl₂ und 15% Glycerin (pH 5,8) enthält. Nach 5minütigem Stehenlassen bei 0°C wird die Suspension zur Entfernung des Überstands zentrifugiert. Die Zellen werden in 4 ml einer eiskalten Lösung suspendiert, die 10 mMol MOPS- Puffer (hergestellt von Dotite Co.), 75 mMol CaCl₂, 10 mMol RbCl und 15% Glycerin (pH 6,5) enthält. Die Sus­ pension wird 15 min bei 0°C stehengelassen, um kompeten­ te Zellen zu erhalten.
• (3) Zu 200 µl der obigen Escherichia coli-Suspension gibt man 10 µl der in der obigen Stufe (1) hergestellten DNA-Lösung. Die Mischung wird 30 min bei 0°C stehenge­ lassen und dann mit 1 ml BHI-Medium versetzt. Dieses Ge­ misch wird 90 min bei 37°C gehalten, 100 µl Aliquot der Mischung wird auf einer BHI-Agarplatte mit einem Gehalt an Tetracyclin (15 µg/ml) ausgebreitet und über Nacht bei 37°C kultiviert, um Transformanten zu erzeugen. Die­ se Transformanten werden auf einer SOX-Detektormedium- Platte repliziert (Zusammensetzung: 5 g Pepton, 2 g Fleischextrakt, 5 g Hefeextrakt, 1 g NaCl, 1 g K₂HPO₄, 0,5 g MgSO₄, 500 IE Peroxidase, 0,1 g Dianisidin, 9 g Sarcosin, 15 g Agar, 1 l destilliertes Wasser; pH 7,0), und es erfolgt eine weitere Kultivierung über Nacht bei 37°C.

Peripherien von vier Kolonien unter etwa 6000 Transforman­ ten hatten sich schwarz(charcoal)gefärbt. Einer der vier Stämme wurde als Escherichia coli DH1 pOX1101 bezeichnet. Nach Reinigung wird dieser Stamm in einem BHI-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert und Plasmid-DNA wird auf glei­ che Weise wie in Beispiel 2 hergestellt. Das Plasmid, welches das Sarcosinoxidase-Gen und das pACYC 184-Gen enthält, wird als pOXI101 bezeichnet.

Beispiel 4 [Kartierung von pOXI101 und Subklonung]

Ein pOXI101-DNA-Spaltungsplan wird hergestellt unter Verwendung der Restriktionsendonucleasen ClaI, HpaI, SalI, SmaI und XhoI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Ein EcoRI-ClaI 5,3 kb-Fragment, enthaltend zwei XhoI-Stellen, das aus dem pOXI101 erhalten wurde, und ein EcoRI-ClaI 4,3 kb- Fragment, das aus pBR 322 erhalten wurde, werden auf gleiche Weise wie in Beispiel 3(1) hergestellt. Es wur­ de eine Subklonung durchgeführt einschließlich Kohäsi­ on, Escherichia coli DH1-Transformation und Screening nach Transformation, um einen Sarcosinoxidase erzeugen­ den Klon zu erhalten. Der Klon wird als Escherichia coli DHI pOXI103 (FERM P-9494) bezeichnet. Eine Plasmid-DNA wird aus diesem Stamm auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 hergestellt und mit pOXI103 bezeichnet. Der Spal­ tungsplan wird an diesem Plasmid unter Verwendung der Re­ striktionsendonucleasen ClaI, HpaI, SalI, SmaI und XhoI (alle von Takara Shuzo Co., Ltd.) hergestellt. Dieser Plan ist in Fig. 2 dargestellt. Man stellt fest, daß gemäß diesem Plan ein Abschnitt von EcoRI durch die Nach­ barschaft von XhoI, enthaltend eine SmaI-Stelle, fehlt. Dieser Escherichia coli DHI pOXI103 wird über Nacht in einem BHI-Medium bei 37°C kultiviert und die Sarcosin­ oxidase-Produktivität wird gemäß der oben erwähnten Sarcosinoxidase-Aktivität-Meßverfahren bestimmt. Man stellt fest, daß der Stamm 2 E/ml Sarcosinoxidase er­ zeugt. Die Basensequenz der DNA mit einem Gehalt an Sar­ cosinoxidase wird gemäß der Didesoxy-Methode bestimmt un­ ter Verwendung des M13-Phagen [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. Fig. 3 zeigt die Basensequenz des Sarcosinoxi­ dase-Gens und die Aminosäuresequenz der Sarcosinoxidase.

Beispiel 5 [Herstellung der Sarcosinoxidase]

Escherichia coli DHI pOXI103 wird 18 h in 20 ml BHI-Me­ dium unter Belüftung/Rühren bei 37°C unter Verwendung eines 30 l Tankfermenters kultiviert. Die kultivierten Bakterien werden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 5000 U/min gesammelt. Die Sarcosinoxidase-Produktivität erreicht 4,6 E/ml. Die Bakterien werden mit 2 l physio­ logischer Salzlösung gewaschen und in 2 l 10 mMol Phos­ phatpuffer (pH 7,5) suspendiert. Zu der so hergestellten Suspension gibt man Lysozymchlorid und EDTA-2Na mit ei­ ner Endkonzentration von 0,1% bzw. 2 mMol. Nach 60minü­ tiger Inkubation bei 37°C unter Rühren wird das Gemisch 10 min bei 15 000 U/min zentrifugiert und 1,8 l des re­ sultierenden Überstands werden gesammelt.

Zu dem Überstand gibt man 1,8 l gesättigte Ammoniumsul­ fatlösung, um ein Präzipitat zu bilden. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren bei 1200 U/min während 10 min gesammelt, in 300 ml 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgelöst und dann auf eine Sephadex G-25(Warenbezeich­ nung)-Säule gegeben, die mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert wurde. Es wird eine Entsalzung durchgeführt. Anschließend wird die entsalzte Lösung einer DEAE-Cephallose CL-6B-Ionenaustauschchromatographie unterworfen, wobei die aktive Fraktion gesammelt wird. Diese Fraktion wird entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,807 g eines pulverförmigen Produkts. Die Aus­ beute erreicht 36%, wobei die spezifische Aktivität des Produkts 41 E/mg beträgt.

Das Molekulargewicht der Sarcosinoxidase, die hergestellt wurde, wird durch die Gelfiltrationsmethode bestimmt. Da­ bei findet man ein Molekulargewicht von etwa 40 000. Die­ ses Molekulargewicht ist fast das gleiche wie das aus der Aminosäuresequenz der Substanz berechnete.

Mit der vorliegenden Erfindung wurde das Sarcosinoxidase- Gen aufgeklärt sowie die Basen- und die Aminosäure­ sequenz der Sarcosinoxidase. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein effizientes Verfahren zur Her­ stellung von Sarcosinoxidase zur Verfügung, und zwar unter Verwendung des Sarcosinoxidase-Gens und basierend auf verschiedenen Genetic Engineering Techniken.

Claims (7)

1. Polydesoxyribonucleinsäure mit einer Basensequenz, welche eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids codiert, welches eine Sarcosinoxidase darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß die Polydesoxyribonucleinsäure die folgende Formel, beginnend vom 5′-Ende, aufweist: wobei X für ein Codon mit Ausnahme von TAA, TAG oder TGA oder für ein Wasserstoffatom steht und Y ein Codon oder ein Wasserstoff­ atom bedeutet, und die Sarcosinoxidase die folgenden physiko­ chemischen Eigenschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasser­ stoffperoxid aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema gebildet wird: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂;
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifität gegenüber Sarcosin;
• (c) optimaler pH: 8,0 bis 9,5;
• (d) isoelektrischer Punkt: 4,7 ± 0,1;
• (e) Molekulargewicht (bestimmt nach der Gelfiltra­ tions-Methode: 40 000 ± 4000;
• (f) thermische Stabilität: stabil nach Behandlung bei 40°C während 10 Minuten.

2. Transformant, umfassend eine Polydesoxyribo­ nucleinsäure, die bezüglich des Wirts-Mikroorganismus fremd ist und die in Anspruch 1 angegebene Definition hat.

3. Transformant gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeich­ net, daß der Wirts-Mikroorganismus ein Mikroorganismus ist, der zu Escherichia coli gehört.

4. Transformant gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeich­ net, daß der Transformant Escherichia coli DHI pOXI103 ist (hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; Hinterle­ gungsnr. 1828, FERN BP-1828).

5. Sarcosinoxidase, dadurch gekennzeichnete daß sie folgende Sequenz aufweist: wobei A für einen Aminosäurerest oder ein Wasserstoffatom steht und B einen Aminosäurerest oder -OH bedeutet, und daß sie eine Catalase-Aktivität von unter 0,05 Einheiten, eine Creatinase-Aktivität von unter 0,0004 Einheiten und eine N-Ethylglycinoxidase-Aktivität von unter 0,03 Einheiten pro Einheit Aktivität der Sarcosinoxidase aufweist, wobei die Sarcosinoxidase durch die Eigenschaften (a)-(f) gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet ist.

6. Verfahren zur Herstellung einer Sarcosinoxidase, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:
Einführung einer rekombinanten DNA, welche erzeugt wurde durch Einsetzen der in Anspruch 1 definierten Poly­ desoxyribonucleinsäure in einen Expressionsvektor, in einen Wirts-Mikroorganismus, um so einen Transformanten zu erzeugen,
Kultivierung des Transformanten, um zu bewirken, daß der Transformant die genetische Information der Polydesoxyribonucleinsäure weitergibt, und
Sammlung des Polypeptids, welches einen Bestand­ teil der Sarcosinoxidase darstellt;
wobei die Sarcosinoxidase folgende physikochemische Ei­ genschaften aufweist:

• (a) Wirkung: katalysiert eine enzymatische Reaktion, bei der jeweils 1 Mol Glycin, Formaldehyd und Wasser­ stoffperoxid aus jeweils 1 Mol Sarcosin, Sauerstoff und Wasser gemäß dem folgenden Reaktionsschema gebildet wird: Sarcosin + O₂ + H₂O → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂;
• (b) Substratspezifität: zeigt eine Substratspezifität gegenüber Sarcosin;
• (c) optimaler pH: 8,0 bis 9,5;
• (d) isoelektrischer Punkt 4,7 ± 0,1;
• (e) Molekulargewicht (bestimmt nach der Gelfiltra­ tions-Methode): 40 000 ± 4000;
• (f) thermische Stabilität: stabil nach Behandlung bei 40°C während 10 Minuten.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6 wobei der Transfor­ mant Escherichia coli FERM BP-1828 ist.