DE2930922C2

DE2930922C2 -

Info

Publication number: DE2930922C2
Application number: DE2930922A
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Ando; Takehiko Tokio/Tokyo Jp Shibata; Eiji Niiza Saitama Jp Hayase; Shukuko Wako Saitama Jp Ikawa
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1978-07-28
Filing date: 1979-07-30
Publication date: 1988-04-14
Also published as: JPS5749195B2; DE2930922A1; DK157562C; US4259446A; DK157562B; JPS5519058A; DK318779A

Description

DNasen, die Desoxyribonucleinsäuren (DNS) spalten, kommen in verschiedenen Lebewesen vor und beteiligen sich an wichtigen Vorgängen des Lebes, wie Stoffwechsel, Abbau, Synthese und Rekombination. Dementsprechend haben die Eigenschaften von Enzymen, insbesondere auf dem Gebiet der Protein-Chemie und der biologischen Funktionen, seit kurzem besonderes Interesse erregt.

Beim Studium der Struktur und der Funktionen von Genen ist es von Bedeutung, Enzyme mit spezifischen Wirkungen herzustellen und zu isolieren. Dabei sind Desoxyribonucleinsäuren spaltende Enzyme als biochemische Reaktionspartner zum Klonieren von Genen im molekularen Bereich und zur Verbesserung von Züchtungen besonders wertvoll.

DNasen werden entsprechend ihrer Wirkung grob in zwei Arten, nämlich Exonucleasen und Endonucleasen, eingeteilt. Die Exonucleasen wirken auf ein Polynucleotid von dessen Ende her und setzen der Reihe nach Nucleotide oder Oligonucleotide frei. Die Endonucleasen spalten Phosphorsäurediesterbindungen im DNS-Molekül.

Auf dem Gebiet der Endonucleasen ergaben sich kürzlich große Erfolge bei Untersuchungen an Enzymen, die spezifische Eigenschaften bezüglich der DNS-Struktur, insbesondere bezüglich der Konfiguration von Nucleotiden oder bezüglich natürlicher oder künstlicher Strukturänderungen, aufweisen, Enzymen, die eine Molekülstruktur erkennen können und darauf einwirken, und Enzymen mit biologisch wichtigen Funktionen (vgl. T. Ando, Chemistry and Life, Bd. 13 (1975), 6, S. 342).

Auf dem einschlägigen Gebiet wurden bereits folgende Verfahren gefunden:

Ein von einer Kulturbrühe von Aspergillus oryzae ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das nicht auf doppelsträngige DNS einwirkt, sondern spezifisch einsträngige DNS abbaut (vgl. JP-PS 5 93 368);
ein von Zellen von Aspergillus oryzae ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das vorzugsweise eine Purin- Purin-Bindung im DNS-Molekül spaltet (vgl. JP-PS 6 21 205);
ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms aus Bacteriophagen- infizierten Zellen von Escherichia coli, das in DNS Einzelstrangbrüche bewirkt (vgl. JP-PS 7 64 919);
ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms aus Escherichia coli-Zellen, in denen Bakteriophagen durch Infektion oder Induktion zur Vermehrung gebracht wurden. Das Enzym wirkt auf RNS ein und bildet cyclische Nucleosidphosphate (vgl. JP-PS 8 29 334);
ein von einer Kulturbrühe von alkalophilen Bakterien ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das vorzugsweise eine Guanin-Guanin-Bindung im DNS-Molekül spaltet (vgl. JP-PS 8 31 171);
ein von Bacillus subtilis ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das spezifisch den RNS-Anteil eines DNS-RNS- Hybrids abbaut (vgl. JP-PS 8 77 668);
ein von Bacillus subtilis oder verwandten Stämmen der Gattung Bacillus ausgehendes Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit derartigen substratspezifischen Eigenschaften gegenüber DNS, daß das Enzym eine spezielle Nucleotidsequenz erkennt und spaltet (vgl. JP-OS 47 980/77 und 15 491/78).

Mikroorganismen sind in der Lage, fremde DNS in der Zelle spezifisch zu erkennen und abzubauen (Restriktionssystem) und sie haben die Fähigkeit, eine solche DNS zu modifizieren, so daß diese eine Resistenz gegenüber ihrem eigenen Restriktionssystem aufweist (Modifikationssystem).

Das Restriktionsenzym ist eine Endonuclease, die Bestandteil dieses Restriktions-Modifikations-Systems ist. Sie ist beispielsweise ein Enzym, das eine spezifische Sequenz von 4 bis 6 Nucleotiden im Molekül einer doppelsträngigen DNS erkennen kann und die Sequenz oder deren benachbarten Bereich spaltet.

Durch derartige substratspezifische Eigenschaften können diese Restriktionsenzyme vorteilhaft zu Untersuchungen der Primärstruktur von DNS (Nucleotidsequenz) und ihrer Funktion sowie bei der in vitro Rekombinationen heterogener DNS eingesetzt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technisch durchführbares Verfahren zur Herstellung von mindestens zwei Restriktionsenzymen mit jeweils verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften zu entwickeln, die wertvolle biochemische Reaktionspartner darstellen. Die Enzyme haben die Eigenschaft, eine spezifische Nucleotidsequenz von Desoxyribonucleinsäuren zu erkennen und ihre Bindungen unter Bildung einheitlicher Bruchstücke der Desoxyribonucleinsäure zu spalten.

Die Erfindung betrifft somit den im Anspruch 1 gekennzeichneten Gegenstand. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen bevorzugte Ausführungsformen. Anspruch 4 betrifft die zur Durchführung des Verfahrens benötigten Transformanten.

Es wurden spezielle Untersuchungen bezüglich Herstellung, Trennung und substratspezifischen Eigenschaften von Restriktionsenzymen unter Einsatz von Mikroorganismen der Gattung Bacillus durchgeführt. Dabei wurde ein Verfahren gefunden, bei dem Bacillus subtilis Marburg 168 (GSY 1026) als Empfänger bei einer Transformation mit DNS von Bacillus subtilis R verwendet wird, um das Restriktions-Modifikations-System des Stammes R in den Empfänger einzuführen. Die erhaltene Transformante ISMR 4 wird selektioniert und dann als Empfänger bei einer Transformation mit DNS von Bacillus subtilis IAM 1247 verwendet, um das Restriktions-Modifikations-System des letztgenannten Stammes in den Empfänger einzuführen. Die erhaltene Transformante ISMRB 9 wird selektioniert und in ähnlicher Weise als Empfänger bei einer Transformation mit DNS von Bacillus subtilis IAM 1231 verwendet, um das Restriktions- Modifikations-System des letztgenannten Stammes einzuführen. Die erhaltenen Transformanten ISMRBE 17 und ISMBF 21 werden selektioniert.

Die vorgenannte Transformante ISMRB 9 weist eine Kombination der Restriktions-Modifikations-Systeme der Stämme GSY 1026, R und IAM 1247 auf.

Weiterhin wurde ein Verfahren gefunden, bei dem die Transformante ISMRB 9 vermehrt und aus den erhaltenen Zellen ein im Stamm R vorliegendes Restriktionsenzym Bsu R und ein im Stamm IAM 1247 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 1247 I gleichzeitig gewonnen werden.

Auf ähnliche Weise wurde bestätigt, daß die Transformante ISMRBE 17 eine Kombination der Restriktions-Modifikations- Systeme der Stämme GSY 1026, R und IAM 1247 sowie ein zweites Restriktions-Modifikations-System des Stamms IAM 1231 aufweist.

Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse ist es gelungen, gleichzeitig drei Enzyme, nämlich die Restriktionsenzyme Bsu R, Bsu 1247 I und Bsu 1231 I, die in den Stämmen R, 1247 und 1231 vorliegen, herzustellen, was durch Vermehrung der vorgenannten Transformante ISMRBE 17 geschieht.

Es ist auch gelungen, gleichzeitig die Restriktionsenzyme Bsu 1247 I und Bsu 1231 II, die in den Stämmen IAM 1247 und IAM 1231 vorliegen, herzustellen; dies erfolgt durch Vermehrung der vorgenannten Transformante ISMBF 21.

In ähnlicher Weise konnte ein Verfahren gefunden werden, bei dem der vom vorgenannten Stamm GSY 1026 abgeleitete Stamm GSY 1012 als Empfänger eingesetzt und mit DNS des Stammes IAM 1231 transformiert wird, um das Restriktions-Modifikations-System des Stammes IAM 1231 einzuführen, und anschließend die erhaltenen Transformanten ISE 15 und ISF 18 selektioniert werden.

Die Transformante ISE 15 weist ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes erstes Restriktions-Modifikations-System auf. Aus der Transformante ISE 15 konnte ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 1231 I isoliert werden.

Die Transformante ISF 18 weist ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes zweites Restriktions-Modifikations-System auf. Aus der Transformante ISF 18 konnte ein im Stamm IAM 1231 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 1231 II isoliert werden.

Auf ähnliche Weise war es möglich, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem der vom Stamm GSY 1026 abgeleitete Stamm GSY 1012 als Empfänger eingesetzt und mit DNS des Stammes IAM 1247 transformiert wird, um das Restriktions-Modifikations-System des Stammes IAM 1247 in den Empfänger einzuführen. Die erhaltene Transformante ISB 8 wird selektioniert. Sie weist ein Restriktions- Modifikations-System des Stammes IAM 1247 auf.

Es ist gelungen, aus Zellen, die durch Züchten der vorgenannten Transformante ISB 8 erhalten worden sind, ein im Stamm IAM 1247 vorliegendes Restriktionsenzym Bsu 1247 I herzustellen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können aus den neuen Transformanten zwei oder mehr Restriktionsenzyme hergestellt werden, die sich in den substratspezifischen Eigenschaften unterscheiden.

Der erfindungsgemäß eingesetzte Mikroorganismus ist eine neue Transformante der Gattung Bacillus, der durch Transformation die Fähigkeit zur Bildung mindestens einer weiteren Restriktionsendonuclease erhalten hat (vgl. Anspruch 4).

Der Ausdruck "Transformation" bedeutet hier eine Methode, bei der ein genetisch definierter Mikroorganismus als Empfänger eingesetzt und mit DNS in Berührung gebracht wird, die aus einem Mikroorganismus mit einem Restriktions-Modifikations-System stammt, das von dem des Empfängers verschieden ist. Dadurch wird ein neues Restriktions-Modifikations-System in den Empfänger eingeführt. Vgl. in diesem Zusammenhang auch Molec. Gen. Genet., Bd. 143 (1975), S. 13 bis 23.

Erfindungsgemäß werden als Transformanten vorzugsweise Bacillus subtilis ISMRB 9, Bacillus subtilis ISMRBE 17, Bacillus subtilis ISMBF 21, Bacillus subtilis ISE 15, Bacillus subtilis ISF 18 und Bacillus subtilis ISB 8 eingesetzt.

Diese Transformanten sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter den nachfolgenden FERM-P-Nummern hinterlegt worden; diese FERM-P-Hinterlegungen wurden später in die nachstehenden FERM-BP-Hinterlegungen umgewandelt.

Der Öffentlichkeit sind die vorgenannten Mikroorganismen entsprechend lange frei zugänglich.

Ergebnisse von Untersuchungen bezüglich der Restriktions- Modifikations-Systeme der vorgenannten Transformanten (i) bis (vi) unter Einsatz von Phagen Φ 105 C sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

Die Vermehrung der Transformanten (i) bis (vi) kann nach den üblichen Methoden erfolgen. Eine typische Züchtungsmethode wird nachfolgend beispielhaft beschrieben.

Ein Nährmedium, das beispielsweise eine Aminosäure, ein Casein-Hydrolysat, Glucose, ein Phosphat, ein Sulfat und Hefeextrakt enthält, wird mit den Transformanten beimpft. Die Züchtung erfolgt bei 30 bis 37°C unter Belüftung und Rühren. Während der logarithmischen Phase bis zum Beginn der stationären Phase gebildete Zellen werden gesammelt. Diese werden entweder durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen und die Zelltrümmer durch Zentrifugieren abgetrennt, oder sie werden zunächst mit Lysozym behandelt und die erhaltenen Protoplasten werden mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Es wird ein zellfreier Extrakt erhalten. Dieser Extrakt wird fraktioniert und einer Streptomycinsulfat-Behandlung unterworfen. Nach entsprechender Reinigung, z. B. durch Gelfiltration unter Einsatz von Ultragel ACA 44 oder Sephadex G-100, Ionenaustauscherchromatographie unter Einsatz von DEAE-Cellulose oder Phosphocellulose oder durch eine Kombination dieser Reinigungs-Methoden, werden gleichzeitig mindestens zwei DNS abbauende Enzyme aus der Reihe Bsu R, Bsu 1247 I, Bsu 1231 I und Bsu 1231 II mit verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften erhalten.

Jedes der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Enzyme ist ein bekanntes Restriktionsenzym.

Physikochemische Eigenschaften dieser Enzyme werden nachfolgend angegeben.

(1) Bestimmung der Aktivität

Der Phage Φ 105 C wird in einem Wirtsstamm vermehrt und die Phagen Φ 105 C DNS, welche dabei wirtsabhängig modifiziert wurde, wird isoliert. Die Phagen-DNS wird als Substrat zur Messung der enzymatischen Aktivität eingesetzt. Im speziellen Fall werden die Phagen Φ 105 C DNS, gebildet unter Einsatz von Bacillus subtilis Marburg 168 GSY 1026 als Wirtsstamm, und die Phagen Φ 105 C DNS, gebildet unter Einsatz der Transformante ISMRB 9 als Wirtsstamm, als Substrate verwendet.

Ein Reaktionsansatz, enthaltend 0,1 µg der Substrat-DNS, 50 mMol tris-HCl-Pufferlösung (ph = 7,5), 10 mMol Magnesiumchlorid, 1 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1% Gelatine und eine Enzymprobe, wird 50 Minuten auf 37°C erwärmt. 30 µl des erhaltenen flüssigen Reaktionsgemisches wird 1½ bis 2 Stunden einer Elektrophorese bei 110 V unterworfen, wobei eine 1prozentige Agarose-Gelplatte verwendet wird. Sodann wird die Platte in eine Lösung getaucht, die 0,5 µg/ml Ethidiumbromid enthält. Die Fluoreszenz im UV-Licht wird photographiert. Die enzymatische Restriktionsaktivität wird auf der Basis der Stellung und der Anzahl der DNS-Fragmente bestimmt, die in dem erhaltenen Photo gefunden werden.

(2) Merkmale der Enzyme (Substratspezifische Eigenschaften) (a) Restriktionsenzym Bsu R

Es erkennt die folgende Nucleotidsequenz im Molekül der DNS:

und spaltet die Sequenz an den mit Pfeilen gekennzeichneten Stellen. Dieses Enzym spaltet außerdem SV 40 DNS (Simian Virus 40) an 18 Stellen, λPhagen DNS an mehr als 200 Stellen, λdv DNS an 14 Stellen und Phagen SPP1 DNS an mehr als 80 Stellen (vgl. Mol. Gen. Genet., Band 143 (1975), S. 13; Mol. Gen. Genet., Band 143 (1975), S. 25; Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Bd. 22 (1977), 8, S. 1012).

(b) Restriktionsenzym Bsu 1247 I

Es erkennt die folgende Nucleotidsequenz im Molekül der DNS

und spaltet die Sequenz an den mit Pfeilen gekennzeichneten Stellen.

Dieses Enzym spaltet auch λPhagen DNS an 18 Stellen, SV40 DNS an 3 Stellen und Phagen Φ 105 C DNS (vgl. J. Bacteriol., Bd. 128 (1976), S. 473; Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Bd. 22 (1977), 8, S. 1012; JP-OS 15 491/78).

(c) Restriktionsenzym Bsu 1231 I

Die durch dieses Enzym im DNS-Molekül spaltbare Nucleotidsequenz ist noch unbekannt. Jedoch wurde festgestellt, daß dieses Enzym λPhagen DNS, Phagen Φ105 C DNS und Phagen SPP1 DNS spaltet (vgl. J. Bacteriol., Bd. 128 (1976), S. 473; Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, Bd. 22 (1977), 8, S. 1012; JP-OS 15 491/78).

(d) Restriktionsenzym Bsu 1231 II

Die durch dieses Enzym im DNS-Molekül spaltbare Nucleotidsequenz ist noch unbekannt. Jedoch wurde gezeigt, daß dieses Enzym Phagen Φ 105 C DNS an etwa 15 Stellen, λPhagen DNS an etwa 15 Stellen, Phagen Φ X174 DNS an etwa 5 Stellen und ColEI (Plasmid [zelleigener Faktor von Escherichia coli]) an etwa 9 Stellen spaltet.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Enzyme stellen sehr wertvolle biochemische Reaktionspartner zur Aufklärung von Strukturen und Funktionen der DNS von Genen dar und sind sehr nützlich zur molekularen Gen-Klonierung.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Die Transformante ISMRB 9 (= FERM BP-765) wird in 1 Liter Bact-Penassay-Nährmedium (enthaltend 1,5% Rindfleischextrakt, 1,5% Hefeextrakt, 5% Pepton, 1% Glucose, 3,5% Natriumchlorid, 3,68% Dikaliumhydrogenphosphat und 1,32% Kaliumdihydrogenphosphat) 16 bis 18 Stunden bei 37°C vorgezüchtet. Die Kulturbrühe wird dann in 10 Liter eines Trypton-Nährmediums (enthaltend 1% Trypton, 5% Hefeextrakt und 10% Natriumchlorid) überführt. Die Züchtung wird 4 bis 5 Stunden bei 37°C unter Belüften und Rühren fortgesetzt. Durch Zentrifugieren werden Zellen im Anfangsstadium der stationären Wachstumsphase gesammelt. 30 g der Zellen werden in 50 ml einer Pufferlösung A (enthaltend 10 mMol tris-HCl- Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,5, sowie 0,1 mMol MEDTA und 5 mMol Mercaptoäthanol) suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wird mit Glasperlen (Durchmesser 0,1 mm) gemischt und 15 Minuten bei 0°C zertrümmert. Der erhaltene Zellbrei wird 10 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit einer 1prozentigen Lösung von Streptomycinsulfat versetzt. Das Gemisch wird durch Zentrifugieren in den Niederschlag und die überstehende Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird in der vorgenannten Pufferlösung A, der noch 0,2 Mol Magnesiumchlorid zugesetzt worden sind, suspendiert. Es wird eine überstehende Flüssigkeit erhalten, die das Restriktionsenzym Bsu R enthält.

Die überstehende Streptomycinlösung wird mit Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 40 bis 80% der Sättigungskonzentration versetzt. Der gebildete Niederschlag wird in der Pufferlösung A suspendiert und unter Einsatz dieser Pufferlösung dialysiert. Das Dialysat wird durch eine mit AcA 34 beschickte Säule (2,2 cm×58 cm) geschickt, wobei das Eluieren unter Verwendung einer 1% Glycerin und 0,3 Mol Natriumchlorid enthaltenden Pufferlösung erfolgt. Die Aktivität von Bsu 1247 I findet sich in der 150- bis 220-ml-Fraktion des Eluats.

Außerdem wird eine Dialyse unter Einsatz einer 10% Glycerin enthaltenden Pufferlösung durchgeführt. Das Dialysat wird durch eine mit DE 52 gefüllte Adsorptionskolonne geschickt. Man eluiert mit der Pufferlösung A, die 10% Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist.

Bsu 1247 I in gereinigter Form wird in der Fraktion gesammelt, die mit der Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,12 bis 0,2 Mol eluiert worden ist.

Beispiel 2

Die Transformante ISMRBE 17 (= FERM BP-762) wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiterbehandelt. Die das Restriktionsenzym Bsu R enthaltende Fraktion wird aus der Streptomycin-Fällung isoliert.

Die überstehende Streptomycin-Lösung wird gemäß Beispiel 1 behandelt. Die Aktivität der Restriktionsenzyme Bsu 1247 I und Bsu 1231 I werden in der 150- bis 220-ml-Fraktion des Eluats bestimmt. Diese Fraktion wird unter Einsatz der 10% Glycerin enthaltenden Pufferlösung A dialysiert. Das Dialysat wird durch eine mit DEAE-Cellulose und DE 52 gefüllte Adsorptionssäule geschickt. Man eluiert mit einer Pufferlösung A, die 10% Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist. Die mit der Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,12 bis 0,2 Mol eluierte Fraktion wird gesammelt und unter Einsatz einer 10 mMol Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert = 6,8), die 10% Glycerin, 0,1 mMol EDTA und 5 mMol 2-Mercaptoäthanol enthält, dialysiert. Das Dialysat wird an einer mit Phosphocellulose P-11 beschickten Säule adsorbiert. Das Eluieren erfolgt mit einer Kaliumchloridlösung, die einen linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,6 Mol aufweist. In der Fraktion, die durch die Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,22 bis 0,32 Mol eluiert wird, wird Bsu 1247 I gesammelt. Bsu 1231 I wird in der Fraktion gesammelt, die durch die Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,20 bis 0,38 Mol eluiert wird.

Beispiel 3

Die Transformante ISMBF 21 (= FERM BP-771) wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiterbehandelt, wobei eine Streptomycin enthaltende überstehende Flüssigkeit erhalten wird. Die Aktivitäten der Restriktionsenzyme Bsu 1247 I und Bsu 1231 II finden sich in der 150- bis 220-ml-Fraktion, die durch Behandeln der vorgenannten überstehenden Flüssigkeit gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist. Die so erhaltene Fraktion wird gemäß Beispiel 2 behandelt. Insbesondere wird die Fraktion unter Einsatz einer 10% Glycerin enthaltenden Pufferlösung A dialysiert und an einer mit DEAE-Cellulose und DE 52 beschickten Säule adsorbiert. Man eluiert mit einer Pufferlösung A, die 10% Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist. Die durch die Pufferlösung A mit einer Konzentration von 0,12 bis 0,2 eluierte Fraktion wird gesammelt und unter Verwendung einer 10 mMol Kaliumphosphat enthaltenden Pufferlösung (pH-Wert = 6,8), in der 10% Glycerin, 0,1 Mol EDTA und 5 mMol 2-Mercaptoäthanol vorliegen, dialysiert. Die Dialysefraktion wird an einer mit Phosphocellulose P-11 beschickten Säule adsorbiert. Man eluiert mit einer Kaliumchloridlösung, die einen linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,8 Mol aufweist. Bsu 1231 II in gereinigter Form wird in der Fraktion gesammelt, die durch Eluieren mit der Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,65 bis 0,70 Mol erhalten wird. Bsu 1247 I liegt in der Fraktion vor, die durch die Kaliumchloridlösung mit einer Konzentration von 0,22 bis 0,32 Mol eluiert wird.

Beispiel 4

Die Transformante ISE 15 (= FERM BP-761) wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet und weiterbehandelt. Man erhält eine Streptomycin enthaltende überstehende Flüssigkeit. Die Aktivität des Restriktionsenzyms Bsu 1231 I findet sich in der 150- bis 220-ml- Fraktion, die durch Behandeln der vorgenannten, Streptomycin enthaltenden überstehenden Flüssigkeit gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist. Die anfallende Fraktion wird gemäß Beispiel 1 weiterbehandelt. Insbesondere wird die Fraktion unter Einsatz einer 10% Glycerin enthaltenden Pufferlösung A dialysiert und dann an einer mit DE 52 beschickten Säule absorbiert. Man eluiert mit einer Pufferlösung A, die 10% Glycerin enthält und einen linearen Gradienten der Natriumchloridkonzentration von 0 bis 0,5 Mol aufweist. Bsu 1231 I in reiner Form wird in der Fraktion erhalten, die durch die Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,12 bis 0,18 Mol eluiert wird.

Beispiel 5

Die Transformante ISF 18 (= FERM BP-763) wird gemäß Beispiel 4 gezüchtet und weiterbehandelt. Bsu 1231 II in reiner Form wird in der Fraktion erhalten, die durch die Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,20 bis 0,30 Mol eluiert wird.

Beispiel 6

Die Transformante ISB 8 (= FERM BP-764) wird gemäß Beispiel 4 gezüchtet und weiterbehandelt. Bsu 1247 I in reiner Form wird in der Fraktion erhalten, die durch die Pufferlösung A mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,12 bis 0,20 Mol eluiert wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von mindestens zwei Restriktionsenzymen mit jeweils verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Transformante der Gattung Bacillus gemäß Anspruch 4 vermehrt, aus den erhaltenen Zellen einen zellfreien Extrakt abtrennt und diesen mit mindestens einer der Maßnahmen Streptomycin- Behandlung, Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration und Affinitätschromatographie fraktioniert und/oder auftrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei Desoxyribonucleasen aus der Reihe Bsu R, Bsu 1247 I, Bsu 1231 I und Bsu 1231 II mit jeweils verschiedenen substratspezifischen Eigenschaften isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der Transformanten Bacillus subtilis ISMRB 9 (= FERM BP-765), Bacillus subtilis ISMRBE 17 (= FERM BP-762), Bacillus subtilis ISMBF 21 (= FERM BP-771), Bacillus subtilis ISE 15 (= FERM BP-761), Bacillus subtilis ISF 18 (= FERM BP-763) oder Bacillus subtilis ISB 8 (= FERM BP-764) verwendet.

4. Transformante der Gattung Bacillus, erhältlich durch in Berührung bringen eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus als Empfänger mit DNS, die aus einem Mikroorganismus mit einem Restriktions-Modifikationssystem stammt, das von dem des Empfängers verschieden ist, und die bei der Transformation die genetische Information für das zusätzliche Restriktions-Modifikations-System erhalten hat.