DE3640382C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Restriktionsenzym sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.

Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die dazu in der Lage sind, spezifische Grundsequenzen an einem Desoxyribro­ nukleinsäure (DNA)-Molekül zu erkennen und die doppelstran­ gige DNA-Kette an spezifischen Stellen zu spalten. Als Ergebnis der neueren Fortschritte in der Molekulargenetik, der Biochemie sowie verwandter Wissenschaften ist es nun­ mehr klar, daß DNA der Träger für genetische Informationen ist, wobei Restriktionsendonukleasen in breitem Umfange für verschiedene Zwecke verwendet wurden, beispielsweise für die Klärung von genetischen Krankheiten, für die Massenproduktion von genetischen Materialien auf der Grund­ lage von genetischem Engineering etc. Ungefähr 100 Arten von Endonukleasen wurden bisher aus vielen Mikroorganis­ men isoliert, wobei jede durch das Erkennungsvermögen einer spezifischen Grundsequenz und durch das Spaltungs­ muster identifiziert worden ist. R. J. Roberts vermutet eine weitere Endonuklease (Acc III) bei Acinetobacter calcoaceticus, ohne Details dazu anzugeben (Nucleic Acids Research, Vol. 12 (1984), Supplement, r 167 ff). Eine große Anzahl von Restriktionsenzymen mit verschiedenen enzymatischen Eigenschaften ist für eine erfolgreiche Gen­ manipulation noch erforderlich.

Soweit bekannt, wurde bisher noch kein Restriktionsenzym festgestellt, welches dazu in der Lage ist, die Grund­ sequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nach­ stehend gezeigt, zu erkennen und an den mit Pfeil markier­ ten Stellen zu spalten

(worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin bzw. Cyctidin stehen).

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Restriktionsenzyms, das dazu in der Lage ist, die Grund­ sequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie vor­ stehend gezeigt, zu erkennen und sie an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten.

Diese Aufgabe wird durch das neue Restriktionsenzym des Anspruchs 1 gelöst.

Demgemäß besteht ein Merkmal der Erfindung in einem neuen Restriktionsenzym aus folgenden Eigenschaften:

• (a) Wirkung und Substratspezifität
• Erkennt die Grundsequenz in einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nacchstehend gezeigt, und spaltet es an den mit Pfeil markierten Stellen worin A, G, T und C für Adenosin, Guanosin, Thymidin bzw. Cytidin stehen.
• (b) Optimaler pH: ungefähr 8,5
• (c) stabiler pH-Bereich: 6,0 bis 9,5
• (d) optimale Arbeitstemperatur: 60 bis 65°C.

Das neue Restriktionsenzym gemäß vorliegender Erfindung spaltet doppelstrangige λ-DNA an 24 Stellen, pBR322-DNA an einer Stelle und Adenovirus-Typ 2-DNA an 8 Stellen, zeigt jedoch keine Spaltwirkung auf ⌀X174 RF-DNA und SV40-DNA.

Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des neuen Restriktionsenzyms, welches darin besteht, den Mikroorganismus Acinetobacter calcoaceticus, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-935 hinterlegt worden ist, zu züchten und das dabei gebildete Enzym aus den Mikrobenzellen zu extrahieren und zu reinigen. Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes werden auf S. 437 von "Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology" (8. Auflage), beschrieben. Glucose und andere Substanzen können dabei als Kohlen­ stoffquelle eingesetzt werden, während Hefeextrakt, Pepton, Brainheart-Infusion sowie andere Materialien als Stickstoffquelle geeignet sind.

Die Ausbeute an dem Restriktionsenzym schwankt in erheb­ lichem Ausmaße von den Züchtungsbedingungen. Gute Ergebnisse werden im allgemeinen bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 40°C und bei einem pH im Bereich von 4 bis 8 erhalten. Die höchste Ausbeute wird nach einem 1- oder 2-tägigen Züchten unter Belüftung und Rühren erzielt. Das nach dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren erzeugte Restriktionsenzym wird hauptsächlich inner­ halb der Mikrobenzellen angereichert.

Die Mikrobenzellen, welche das Restriktionsenzym enthalten, können von der Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt, werden.

Dieses Enzym kann unter Anwendung bekannter Methoden, wie sie in herkömmlicher Weise für die Reinigung von Restriktionsendonukleasen eingesetzt werden, extrahiert und gereinigt werden. Beispielsweise werden die gesammel­ ten Mikrobenzellen in einem geeigneten Puffer verteilt und dann durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, um eine Extraktion des Enzyms durch die Pufferlösung zu ermög­ lichen. Nach einer Entfernung der Zellreste durch Ultra­ zentrifugieren wird Ammoniumsulfat der überstehenden Flüssigkeit zum Aussalzen zugesetzt und der Niederschlag, der sich abscheidet, wird in einem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und gegen einen Puffer der gleichen Zu­ sammensetzung dialysiert. Das Dialysat wird durch Ionen­ austauscherchromatographie, Molekularsiebchromatographie sowie Affinitätschromatographie gereinigt, wobei das er­ findungsgemäße Restriktionsenzym erhalten wird. Gemäß einer Ausführungsform wird das Dialysat an Phosphorzellu­ lose P11, eingepackt in eine Säule, adsorbiert und der adsorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchlorid­ lösungen eluiert. Die aktiven Fraktionen werden wiederum an einer DEAE-Zellulose DE 52 Säule adsorbiert, worauf sich eine Eluierung mit 0 bis 1,0 M Kaliumchlorid­ lösungen anschließt. Die gesammelten aktiven Fraktionen werden dann an Heparin/Sepharose CL-6B adsorbiert, worauf sich ein Auswaschen mit 0,7 M Kaliumchloridlösung und eine Eluierung mit 1,0 M Kaliumchloridlösung anschließt. Die aktive Fraktion wird weiter durch Adsorption an einer Aminohexylagarose-Säule und Eluierung mit 0 bis 1,5 M Kaliumchloridlösungen gereinigt, wobei eine Standard­ probe des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms erhalten wird.

Die Aktivität dieses Enzyms wird nach der nachfolgend beschriebenen Methode bestimmt.

Eine Substratlösung mit der in Tabelle 1 angegebenen Zu­ sammensetzung wird hergestellt:

Tabelle 1

10 mM Tris-HCl, pH: 7,5
 7 mM MgCl₂
 7 mM 2-Mercaptoethanol
60 mM NaCl
0,01% Rinderserumalbumin
1,0 µg λ-DNA

Die Substratlösung (50 µl) wird auf 37°C vorgewärmt. Eine Probe des zu testenden Restriktionsenzyms wird zugesetzt, damit die enzymatische Reaktion bei dieser Temperatur abläuft, und die Reaktion wird 10 Minuten später durch Zugabe von 5 µl einer Abstopplösung (1% SDS, 50% Glyzerin, 0,02% Bromphenolblau) abgestoppt. Die Reaktionsmischung wird dann auf ein 1% Agaroseplattengel aufgebracht und eine Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 10 V/cm während 1 bis 2 Stunden durchgeführt. Die Puffer­ lösung, die für die Elektrophorese verwendet wird, ist ein 90 mM Trisboratpuffer, der 2,5 mM EDTA (pH: 8,3) ent­ hält.

DNA-Banden können durch UV-Bestrahlung festgestellt wer­ den, wenn 0,5 µg/ml Ethidiumbromid zuvor dem Gel zuge­ setzt werden. Die Elektrophorese wird als beendet ange­ sehen, wenn die Anzahl und die Intensität der Banden für die DNA-Fragmente sich nicht mehr verändern.

Die Enzymaktivität, die eine vollständige Zersetzung von 1 µg/λ-DNA nach einstündiger Reaktion bei 37°C gewähr­ leisten, wird als 1 Einheit bezeichnet.

Das neue Restriktionsenzym, das nach dem erfindungsge­ mäßen Verfahren erhalten wird , besitzt die nachfolgend beschriebenen Eigenschaften:

(1) Wirkung und Substratspezifität

Dieses Enzym ist dazu in der Lage, die Grundsequenz an einem doppelstrangigen DNA-Molekül, wie nach­ stehend gezeigt, zu erkennen und es an den mit Pfeil markierten Stellen aufzuspalten

worin A, T, C und G die vorstehend angegebenen Bedeu­ tungen besitzen.

Die Erkennungsgrundsequenz dieses Enzyms wurde wie nachfolgend beschrieben ermittelt.

Das Enzym spaltete Adenovirus-Typ 2 DNA an 8 Stellen, vermochte jedoch nicht ⌀X 174 RF-DNA und SV 40-DNA zu spalten. Ferner spaltete es Dam⁺ λ-DNA und Dam^- λ-DNA an mehr als 20 Stellen, wobei die Anzahl der erhaltenen Frag­ mente im ersteren um 3 geringer war als im letzteren.

Ferner spaltet das Enzym Dam^-pBR322-DNA an einer Stelle, zeigt jedoch keine Wirkung an Dam⁺pBR322-DNA. Diese Tatsachen legen die Vermutung nahe, daß dieses Enzym dazu in der Lage ist, ein Teil von 5′-GATC-3′- zu erkennen, eine Sequenz, die von E. coli dam Gen erkannt werden kann, und eine Methylierung bei A er­ fährt. Doppelte Diggerierungstests von Dam^-pBR322 unter Verwendung des Restriktionsenzyms gemäß vor­ liegender Erfindung zusammen mit Hind III, Sal I, Hinc II und Pst I ergaben jeweils, daß das erfin­ dungsgemäß Enzym eine Stelle nach 1700 bp an dem pBR322-DNA-Molekül erkennt. Die Sequenz GATC in der Nähe von 1700 bp wurde untersucht, wobei die Sequenz TCCGGATC in der Gegend von 1664 bis 1671 bp gefunden wurde. Dies zeigt, daß das erfindungsgemäße Enzym die Sequenz TCCGGA erkennt. Die Anzahl der Sequenzen TCCGGA in Adenovirus-Typ 2 DNA, ⌀X174 RF-DNA, SV40- DNA und γ-DNA wurde zu 8, 0, 0 bzw. 24 ermittelt. Dies steht in guter Übereinstimmung mit den vorstehend erhaltenen experimentellen Daten.

Die Spaltungsstellen durch das erfindungsgemäße Restriktionsenzym wurden, wie nachstehend beschrieben, ermittelt.

Rückfall-Oligonukleotid d (GTTCCGGAAC), das die Erkennungsstelle durch das erfindungsgemäße Enzym in der Mitte aufweist, wurde nach dem Festphasen­ verfahren synthetisiert und einem 5′-endständigen Ende mit Polynukleotidkinase und [γ-³²p]-Adenosin­ triphosphat phosphoryliert. Das auf diese Weise erhal­ tene ³²P-markierte Molekül wurde dann zur Gewinnung einer doppelstrangigen DNA verschmolzen, die dann mit dem erfindungsgemäßen Enzym diggeriert wurde. Die Reaktionsmischung wurde an einer DEAE-Zellulose­ dünnschichtplatte analysiert, wobei ein markierter Flecken des Trinukleotids (5′-pGTT) festgestellt wurde. Es wurde daher ge­ schlossen, daß dieses Enzym dazu in der Lage ist, die nachfolgend gezeigte Grundsequenz zu erkennen und sie an den mit Pfeil markierten Stellen zu spalten

(2) Optimale Bedingungen für die enzymatische Aktivität

• (a) Optimale Arbeitstemperatur:
  die optimale Arbeitstemperatur dieses Restriktions­ enzyms beträgt 60 bis 65°C.
• (b) Optimaler pH:
  Der optimale pH dieses Restriktionsenzyms be­ trägt ungefähr 8,5.
• (c) KCl- und NaCl-Konzentration:
  Die optimale Salzkonzentration für dieses Re­ striktionsenzym beträgt 150 mM für sowohl KCl als auch NaCl.
• (d) Stabiler pH-Bereich:
  Der stabile pH-Bereich für dieses Restriktions­ enzym beträgt 6,0 bis 9,5.

(3) Molekulargewicht 300 000±150 000 (durch die Gelfiltrationsmethode mit Sephadex G-200)

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel 1

Acinetobacter calcoaceticus (FERM BP-935) wird in 160 l eines Mediums mit der nachfolgend angegebenen Zusammen­ setzung bei 32°C während 10 Stunden unter Belüftung und Rühren gezüchtet und die gewachsenen Bakterienzellen (ungefähr 1280 g Feuchtbasis) werden aus der Kulturbrühe (160 l) mit einer gekühlten Zentrifuge gesammelt.

Medium
Polypepton|10 g
Hefeextrakt	5 g
Glukose	1 g
NaCl	5 g
entionisiertes Wasser	1 l
pH-Wert	7,2

350 g der in der vorstehenden Weise erhaltenen Bakterien­ zellen werden in 700 ml einer extraktiven Pufferlösung (10 mM Kaliumphosphatpuffer, 10 mM 2-Mercaptoethanol, pH 7,5) suspendiert, die Suspension wird in einem Ultraschallzerstörungstank zum Aufbrechen der Zellwände behandelt und die erhaltene Mischung wird zentrifugiert (100 000×g, 1 Stunde), um den Rückstand zu entfernen.

Dem auf diese Weise erhaltenen Extrakt wird Ammoniumsul­ fat bis zu einer 70%igen Sättigung zugesetzt; der sich abscheidende Niederschlag wird durch Zentrifugieren ge­ sammelt und in einer Pufferlösung A (10 mM Kaliumphosphat­ puffer, enthaltend 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glyzerin, pH 7,5) aufgelöst, worauf die Lösung über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert wird.

Das Dialysat wird an Phosphorzellulose P11, ein­ gepackt in eine 300 ml-Säule und zuvor mit der Puffer­ lösung A ins Gleichgewicht gebracht, adsorbiert. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A wird der adsorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösung (lineare Konzentra­ tionsgradienmethode) eluiert. Die Restriktionsenzymakti­ vität wird in Fraktionen ermittelt, die 0,65 bis 0,70 KCl- Konzentration entsprechen.

Diese aktiven Fraktionen werden gesammelt und über Nacht gegen die Pufferlösung A dialysiert, das Dialysat wird an DEAE-Zellulose DE52, eingepackt in eine 10 ml-Säule und zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichge­ wicht gebracht, adsorbiert und der adsorbierte Teil mit 0 bis 1,0 M Kaliumchloridlösung (lineare Konzentrations­ gradienmethode) eluiert. Die Restriktionsenzymaktivität wird in Fraktionen ermittelt, die 0,20 bis 0,25 KCl-Konzen­ trationen entsprechen.

Diese aktiven Fraktionen werden gesammelt und gegen die Pufferlösung A dialysiert und das Dialysat wird an Heparin-Sepharose CL-6B, ein­ gepackt in eine 4 ml-Säule und zuvor mit der Pufferlösung A ins Gleichgewicht gebracht, adsorbiert. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A, die 0,7 M Kaliumchlorid enthält, wird der adsorbierte Teil mit der Pufferlösung A eluiert, die 1,0 M Kaliumchloridlösung enthält.

Die auf diese Weise erhaltene aktive Fraktion wird wiederum an Aminohexyl-Agarose, eingefüllt in eine 4 ml-Säule und zuvor mit der Puffer­ lösung A ins Gleichgewicht gebracht, adsorbiert. Nach einem Waschen mit der Pufferlösung A wird der adsorbierte Teil mit 0 bis 1,5 M Kaliumchloridlösungen (lineare Konzen­ trationsgradientmethode) eluiert. Die Restriktionsenzym­ aktivität wird in Fraktionen ermittelt, die 0,32 bis 0,65 M Kaliumchloridlösungen entspricht.

Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und durch die Zugabe von Polyethylenglykol konzentriert, worauf eine gleiche Menge Glyzerin dem Konzentrat zugesetzt wird, um die fertige Standardprobe des erfindungsgemäßen Restriktionsenzyms zu erhalten.

Diese Standardprobe ist frei von jeder nichtspezifischen DNase oder Phosphatase.

Die vorstehend beschriebene Reinigungsmethode ergibt 3000 Einheiten des Enzyms aus 350 g feuchten Mikroben­ zellen.

Wie aus den vorstehenden Ausführungen ersichtlich ist, schafft die Erfindung ein neues Restriktionsenzym mit einer einzigartigen Substratspezifität, die bisher noch nicht bekannt war, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms auf industrielle Weise.

Claims (2)

1. Neues Restriktionsenzym mit folgenden Eigenschaften:

• (a) Wirkung und Substratspezifität.
• Erkennt die Grundsequenz in einem doppelstrangigen Desoxyribonukleinsäuremolekül, wie nachfolgend ge­ zeigt und spaltet es an den mit Pfeil markierten Stellen (worin A, G, T und C Adenosin, Guanosin, Thymidin bzw. Cytidin bedeuten).
• (b) Optimaler pH: ungefähr 8,5
• (c) stabiler ph-Bereich: 6,0 bis 9,5
• (d) optimale Arbeitstemperatur: 60 bis 65°C.

2. Verfahren zur Herstellung des Restriktionsenzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Acinetobacter calcoaceticus, FERM-BP-935, gezüchtet und das dabei gebildete Enzym aus den Mikrozellen extrahiert und gereinigt wird.