DE1767153C3 - Das als Chondroitinase-AC bezeichnete Enzym aus den Zellen von Flavobacterium heparinum ATCC 13125 und Verfahren zur Herstellung eines Enzymproduktes mit diesem Enzym - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung eines Enzymprodukts mit dem Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen von Flavobacterium heparinum ATCC 13 125 mit einem wäßrigen Lösungsmittel mit einem pH-Wert von 5 bis 8, oder einsr Phosphatpuffer-, Tris-HCI-Puffer-, Tris-maleatpuffer- oder Barbitalpufferlösung, die jeweils einen pH-Wert von 5 bis 8 besitzt, bei einer Temperatur oberhalb des Gefrierpunktes des wäßrigen Lösungsmittels und unterhalb 40° C extrahiert, daß man den erhaltenen Extrakt nach Trennung von den Zellen einer Säulenchromatographic mit Phosphocellulose, Carboxymethylcellulose, Sulfoäthylcellulose oder Sulfomethylcellulose unterwirft, wobei man aus der Säule ein das Enzym enthaltendes Eluat durch Elution mit einer Pufferlösung mit einer Eluiersalzkonzentration von 0,2 bis 0,5 Mol gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den erhaltenen Extrakt vor der Aufgabe auf die Säule einer Vorbehandlung durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und Filtration mit einem Gelfiltermittel unterwirft.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluat konzentriert und dann einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule von vernetzten! Dextran -interwirft, wobei man die Säule zur Gewinnung eines das Enzym enthaltenden Eiuats mit einer verdünnten wäßrigen Lösung eines Eluierungssalzes mit einem pH-Wert von 5 bis 8 eluieri.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Eluat ein Salz für das Aussalzen des Enzyms zusetzt, die erhaltene Ausfällung mit dem Enzym auflöst, und diese Lösung dann einer Säulenchromatographie unter Verwendung einer Säule von vernetziem Dextran unterwirft, wobei man die Säule zur Gewinnung eines das Enzym enthaltenden Eiuats mit einer verdünnten wäßrigen Lösung eines Eluierungssalzes mit einem pH-Wert von 5 bis 8 eluiert.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Das bekannte Enzym Chondroitinase-ABC, das aus den Zellen des bekannten Bakteriums Flavobacterium heparinum extrahiert wird, bewirkt eine Spaltung oder Zersetzung von Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B und Chondroitinsulfat C. Das neue Enzym gemäß der Erfindung, das als Chondroitinase-AC bezeichnet wird, kann eindeutig von der bekannten Chondroitinase ABC hinsichtlich der folgenden Eigenschaften unterschieden werden. Das neuartige Enzym gemäb der Erfindung bewirkt

1. einen Abbau von Chondroitinsulfat-ABC,

2. keinen Abbau von Chondroitinsulfat B und

3. einen Abbau von Chondroitinsulfat C.

Es ist außerdem deutlich von dem bekannten Enzym dadurch verschieden, daß

4. Chondroitinsulfat B ein konkurrierender Inhibitor gegen das Enzym gemäß der Erfindung ist.

Es war bekannt, daß Chondroitinase-ABC aus den Zellen von Flavobacterium heparinum extrahiert wird (vgl. The journal of Biological Chemistry, Bd. 235, Nr. II. November I960, Seiten 3066 bis 3069) und daß Chondroitinase-ABC auch aus den Zellen von Proteus vulgaris extrahiert wird (vgl. The Journal of Biological Chemistry, Bd. 235, Nr. 12, November 1960, Seiten 3580 bis 3588). Das auf Seite 3585 angegebene adaptive Enzym aus Flavobacetrium baut Chondroitinsulfat A und Chondroitinsulfat C ab. Ferner wird darin festgestellt, daß sämtliche nichtadaptierte und adaptierte Stämme Chondroitinsulfat B abbauen. Die Anwesenheit von Chondroitinase AC mit den vorstehend angegebenen Enzymaktivitäten war jedoch völlig unbekannt und es war auch kein Verfahren zur Herstellung derselben bekannt.

Es war bisher bekannt, daß die bekannte Enzymchondroitinase, die 2-Acetamid-2-desoxy-3-O-(/3-D-gluco-4-enpyranosyluronsäure)-4-0-sulfo-D-ga!actose (die vereinfacht als JDi45> bezeichnet werden kann)

und/oder 2-Acetamid-2-desoRy-3-O-(/3- D-gluco-4-enpyranosyluronsäure)-6-O-sulfo-D-galactose (die vereinfacht als 4Di6S bezeichnet werden kann) durch Abbau von Chondroitinsulfat in Übereinstimmung mit einer Ausscheidungs- oder Entfernungsreaktion bildet, Chondroitinsulfat A (abgekürzt als ChS A bezeichnet), Chondroitinsulfat B (abgekürzt als ChS B bezeichnet) und Chondroitinsulfat C (abgekürzt als ChS C bezeichnet) abbaut. Andererseits wird von Linker u. a. in den obenbezeichneten Veröffentlichungen angegeben, daß ι ein Enzymsystem, das Chondroitinsulfat abbaut oder zersetz!, in den Zellen von Flavobacterium heparinum vorhanden ist, und daß dieses Enzymsystem ein Enzym (Chondroitinase-ABC) ist, das jeden der Stoffe ChS A, ChS B und ChS C abbaut.

Es wurde nunmehr eine gründliche Untersuchung der aus den Zellen von Flavobacterium heparinum zu extrahierenden Enzyme ausgeführt, die zu einer Trennung und Gewinnung eines neuen Enzyms mit einer hohen Aktivität, nämlich Chondroitinase-AC mit neuen Substratspezifitäten (1.. 2.. 3.). aas diesen Zellen zusätzlich zu Chondroitinase-ABC, die jeden d'-r Stoffe ChSA, ChSB und ChSC unter Bildung von zlDi4S und/oder zlDiöS abbaut, führte. Die erhaltene neue Enzymchondroitinase-AC besitzt eine Brauchbarkeit, die nachstehend näher erläutert wird.

Bekanntlich sind ChS A, ChS B und ChS C Isomere, die einander hinsichtlich ihrer chemischen Struktur und ihres physikochemischen Verhaltens stark ähnlich sind, und es war nicht möglich, eine sehr kleine Menge jedes ι einzelnen davon zu bestimmen. Die neue aus Flavobacterium heparinum extrahierte Enzymchondroitinase-AC ermöglicht jedoch in Verbindung mit der bekannten Enzymchondroitinase-ABC und mit den bekannten Chondrosulfatasen die Bestimmung einer :. sehr geringen Menge von jedem der drei Isomeren ChS A, ChS B und ChS C. Dies stellt ein sehr wirksames Mittel zur Forschung auf derartigen Gebieten, wie Biochemie, Pathologie und Physiologie dar. Somit wird gemäß der Er^findung ein neues wirksames Mittel für die i> Untersuchung der Verteilung, des Metabolismus oder der Biosynthese von Muccopolysacchariden, die im lebenden Organismus vorhanden sind, oder für die Untersuchung von erkrankten Geweben mit Bezug auf die Muccopolysaccharide geschaffen. ι·-

Aufgabe der Erfindung ist daher dL· Schaffung eines neuen und brauchbaren Enzyms, bezeichnet als Chondroitinase-AC, das aus Flavobacterium heparinum ATCC 13 125 extrahiert wird, sowie die Schaffung eines Verfahrens zum Extrahiere;! und Gewinnen eines dieses * neue Enzym Chondroitinase-AC enthaltenden Enzymprodukts.

Nachstehend sind die Grundeigenschaften der neuen Enzymchondroitinase-AC, die aus den Zellen von Flavobacterium heparinum extrahiert ist, durch welche i-. das Enzym gemäß der Erfindung von der bekannten Chondroitinase sich unterscheidet, sowie andere Eigenschaften aufgeführt:

I) es baut Chondroitinsulfat A ab, ■

II) es baut Chondroitinsulfat B nicht ab,

III) es baut Chondroitinsulfat C ab,

IV) Chondroitinsulfat B ist ein konkurrierender Inhibitor gegenüber diesem Enzym, wie in F i g. 2 dargestellt,

V) es baut Chondroitinsulfat Dab,

VI) es wird nach seiner säulenchromatographischen Adsorption an einer Kationen-Austauscher-Cellulose mit einer Pufferlösung für Eluierungszwecke mit einer 0,2- bis 0,5molareri Salzkonzentration eluieri, wie in F i g, 3 dargestellt,

VII) es weist bei der Scheibenelektrophorese auf einem Acrylamidgel das in F i g. 4 gezeigte Muster auf,

VIII) es zeigt die Geschwindigkeit und das Ausmaß beim Abbau von Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B, von Chondroitinsulfat C, von Chondroitinsulfat D aus I laifiSL'hknorpt-'l und von Hyaluronsäure, wie in Fig. 1-1 dargestellt,

IX) es besitzt die in F i g. 5 anhand der ausgezogenen Linien gezeigte Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit beim Abbau von Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B und Chondroitinsulfat C vom pH-Wert,

X) seine Aktivität wird durch die zweiwertigen Ionen Mn^f Mvlg^{h f},Ca^ und Ba^{f f} bei einer 0,001 molaren Konzentration dieser Metalle um das 1,3- bis l,5fache erhöht, wohingegen Zn^+f, Fe^ft und Cu^{f f} eine Hemmwirkung au^r seine Aktivität ausüben,

XI) Heparin, Heparitinsulfat und Keratosulfat hemmen die Chondroitinase-AC-Reaktion,

XII) das Enzym, welches in einer Proteinkonzentration von 0,24 mg/ml, wobei die spezifische Aktivität 4,7 Chondroitinase-AC-Einheiten/mg Protein beträgt, indem 0,02molarenTris-HCl-Puffer mit dem pH-Wert von 7,2 gelöst ist. wird in 3 Minuten um etwa 20% und in 11 Minuten i'm etwa 50% desaktiviert.

Die vorstehend angegebenen Eigenschaften der Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung werden nachstehend anhand der Zeichnung näher erläutert, wobei zunächst die Prüfverfahren, gemäß welchen die in der Zeichnung dargestellten Ergebnisse erhalten wurden, beschrieben werden.

Versuch 1

Dieser Versuch beruht auf der Bildung von ^4,3-ungesättip'en Disacchariden, die eine beachtliche Absorption im ultravioletten Bereich besitzen. Reihenmäßigc Inkubationsgemische enthielten die folgenden Verbindungen in Endvolumina von 50 μΙ: 0,1 μΜοΙ Muccopolysaccharidsubstrat als Uronsäure oder Hexosamin; 2,5 μΜοΙ Tris-HCI (pH 7,9 für Chondroitinase-ABC, pH 7,3 für Chondroitinase-AC); 3 μΜοΙ Natriumacetat (für Chondroitinase-ABC allein); 5 μg Rinderserumsalbumin und 0,001 bis 0,005 Enzymeinheiten. Kontrollproben enthielten ein durch Hitze inaktiviertes Enzym. Nach der Inkubation bei 3/⁰C wahrend 10 Minuten wurden die Reaktionen durch Verdünnen der Gemische mit 0,45 ml eines 0,05molaren KCI-HCI-Puffers (pH 1,8) unterbrochen. Danach wurde bei 10 800 · g während 10 Minuten zentrifugiert und die Absorption der überstehenden Flüssigkeit von jeder Probe wurde bei 232 Γπμ gegen eine entsprechende Leermischung oder Leerprobe gemessen. Die Menge an ungesättigten Disaccharidprodukt ;n wurde aus der Änderung im Absorptionsvermögen unter Anwendung von 5,7, 5,1 und 5,5 als millimolare Absorptionskoeffizienten von Δ Di-OSf 2- Acetamid-2-desoxy-3-O-(j3-D-glLco-4-enpyranosyluronsäure)-D-galactose], zlDi-4S bzw. <dDi-6S errechnet.

Der Versuch war hir.sichtlich der Zeitdauer und der Enzymmenge unter den Bedingungen für eine Reihenuntersuchung linear. Die Enzymeinheit wurde als die Menge definiert, die die Freigabe von 1 uMol (als

ungesättigtes Disaccharid) an Produkt je Minute unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen katalysierte.

Versuch 2

Bei diesem Versuch wurde die Umwandlung eines Chondroitinsulfats, das bei der Morgan-Elson-Reaktion inaktiv is!, in eine Form, die bei der Farbreaktion aktiv ist. gemessen. Die Inkubationsgemische für Reihenuntersuchungen enthielten die folgenden Verbindungen in l'.ndvolumina von 50 μΙ: 0.05 μΜοΙ von ChSA. CIhSB oder ChSC als Uronsäure; 2,5 μΜοΙ Tris-IICI (pH 8.0 für Chondroitinase· A BC, pH 7.3 für Chnndroitinasc-At); 3 μΜοΙ Natriumacetat (für Chondroilinase-ABC allein): 5 μg Rinderserumsalbumin und 0.0005 bis 0.0025 F.n/ymcinheiten. Bei Verwendung von ChS A oder ChS B als Substrat wurden ferner 0,01 F.inhcilcn von Chondro-4-sulfatase den Gemischen zugegeben. Die Kontrollprobcn enthielten ein durch ilitze inakiivieries Enzym. Nach einer Inkubation während 10 Min. bei 37' C wurden die Reaktionsgemische auf 100 C I Minute lang erhitzt und die Probe wurde nach dem mit Borat katalysierten Morgan-F.lson-Vcrfahren analysiert.

Dieser Versuch war mit Bezug auf Zeitdauer und Fnz.ymmenge unter den Bedingungen für eine Reihenuntersuchung linear. F.ine F.n/.ymcinhcit wurde als die Menge definiert, die die Freigabe von 1 μΜοΙ Produkt (als /IDi-OS oder zlDi-6S) je Minute unter den vorstehend angegebenen Bedingungen katalysierte.

Fig. 1-1 zeigt in graphischer Darstellung ein Beispiel der Geschwindigkeit und des Ausmaßes der Abbaureaktion von Chondroitinase-AC gegenüber ChS A, ChS B. ChS C, ChSD und Hyaluronsäure, die jeweils als Substrate verwendet wurden. Diese graphische Darstellung zeigt die Ergebnisse der Prüfung, die gemäß der vorstehend unter Versuch 1 angegebenen Arbeitsweise unter Verwendung von 0.003 F.nzymeinheilen ausgeführt wurde.

Die Kurven in der graphischen Darstellung entsprechen den folgenden Substraten:

O-O	C	hS	A.	Haifischknorpel.	B
· —·	C	hS	C.	Hyaluronsäure.
AL·	C	hS	D aus	ChS
X-X
Δ-Δ

Zu dem mit dem Pfeil »a« bezeichneten Zeitpunkt wurden 0.05 Enzymeinheiten zu jeder 50-μΙ-Probe der Inkubationsgemische mit Hyaluronsäure Uronsäure

Es ist aus den in Fig. 1-1 gezeigten Ergebnissen ersichtlich, daß die neue Chondroitinase gemäß der Erfindung ChS A und ChS C abbaut, jedoch nicht ChS B. Außerdem ist es ersichtlich, daß sie eine Abbaureaktion gegenüber ChS D aufweist. Obgleich in der Zeichnung nicht dargestellt, besitzt das neue Enzym gemäß der Erfindung eine Abbaureaktion gegenüber ChS E und ChSF.

Für Vergleichszwecke sind in F i g. 1 -2 die Ergebnisse von ähnlichen Versuchen zu denjenigen von Fig. 1-1 mit Bezug auf die bekannte ChondroitinaseABC gezeigt. Es ist aus Fig. 1-2 ersichtlich, daß Chondroi'.inase-ABC eine Abbauwirkung gegen jeden der Stoffe ChS A. ChS B und ChS C besitzt.

F i g. 2 zeigt die Geschwindigkeit des Abbaus von ChS C bei gleichzeitiger Anwesenheit von ChS B. Der Versuch wurde ausgeführt, wobei die Konzentration von ChS C mit Bezug auf die Konzentration von ChS B win 2.0 IO ⁴HKiIaI-, und 1.0 10 ⁴ molar und 0.5 10 «molar variiert wurde. Die Gerade »m« in der graphischen Darstellung zeigt die Abbaugeschwindigkeit von ChS C in Abwesenheit von ChS B. Die Geschwindigkeit »v« ist in F i g. 2 als Millimikromol von /4Di-6S, gebildet in 10 Minuten, ausgedrückt. Fig. 2 ergibt ein typisches Muster oder Beispiel, das anzeigt, daß ChS B ein konkurrierender Inhibitor gegenüber Chondroitinase-AC ist.

Die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung kann durch Säulenchromatographie mit einer kationischen Aiistauschcellulosesäule bei einer Konzentration einer Fliiicrungssalzlösung, die von der Konzentralion für die aus den Zellen des gleichen F. heparinum extrahierten Chondroitinase-ABC verschieden ist, eluicrt und extrahiert werden.

F i g. 3 zeigt in graphischer Darstellung die Ergcbnisse der Trennung von Chondroitinasen aus F. heparinum /\ I ^ ^- ι ) t £. ι iVlutC'iS r tiOSpiii/CCiiüiGSC-^jäUiCnCiirC/iTiatogrnphie.

Eine Säule von Phosphocellulose (2,5 χ 30 cm) wurde mit 2 Liter eines 0,02molarcn Tris-HCI-Puffers mit einem pll-Wert von 7,2 ins Gleichgewicht gebracht. Die dialysierte Ammoniumsulfatfraktion (vgl. Beispiel 4) wurde auf die Säule mit einem Ausmaß von 60 ml je Stunde aufgebracht und das Adsorbens wurde mit 400 ml eines 0.02molarcn Tris-HCI-Puffers mit einem pH-Wer! von 7,2 gewaschen. Die Säule wurde durch eine Eluierung mit linearem Gradienten mit 400 ml einer 0.02molaren Tris-HCl-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7.2 im Mischgcfflß und mit 400 ml von 0,5molarem NaCI im gleichen Puffer im Vorravsbchälter entwickelt. Das Strömungsausmaß betrug 60 ml je Stunde und es wurden Fraktionen von 8 ml gesammelt.

Die Chondroitinase wurde mittels der Bildung von Disacchariden (Versuch 2) unter Verwendung der Substrate ChS A.ChS B bzw. ChS C untersucht.

Die Kurven in F i g. 3 entsprechen den folgenden Substraten:

T)-O ChSA
Δ- Δ ChS B
O-O ChSC

Die Enzymaktivität ist in Einheilen ausgedrückt. In F i g. 3 wird die bekannte Chondroitinase-ABC in einer Eluierungslösung mit einer NaCI-Konzentration in Nähe der Probeglasnummern 30 bis 45 beobachtet, während die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung in einer Eluierungslösung mit einer davon verschiedenen NaCI-Konzentration in Nähe der Probeglasiiammern 50 bis 80 beobachtet wird, wobei letztere eine hohe Aktivität aufweist. Die Konzentration an NaCI ist etwa 0.2- bis 0.5molar.

F i g. 4 zeigt ein Scheibenelektrophoresediagramm. das durch Elektrophorese auf Acrylamidgel der Chondroitinase-AC (etwa 10 μg Anteile der höchstgereinigten Fraktion) und der bekannten Chondroitinase-ABC (etwa 10 μg Anteile der Fraktion von höchster Reinheit) erhalten wurde. Die Elektrophorese wurde gemäß der Methode von Ornstein (Ornstein, L, Ann. N. Y. Acad. Sei, 121, S. 321 [1964]) ausgeführt. Der Anfangspunkt ist in F i g. 4 durch den Pfeil dargestellt. In dem Diagramm bezieht sich das Bezugszeichen 1 auf Chondroitinase-ABC und das Bezugszeichen 2 auf die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung.

F i g. 5 zeigt den Einfluß des pH-Werts auf die Geschwindigkeit des Abbaus von ChS A, ChS B und

ChS C durch die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung und die bekannte Chondroitinase-ABC. Die Untersuchung wurde gemäß der vorstehend unter Versuch 1 beschriebenen Arbeitsweise ausgeführt. In dem Diagramm /eigen die ausgezogenen Linien die ί Versuchsergebnisse mit Bezug auf Chondroitinase-AC und die gestrichelten Linien die Ergebnisse mit Bezug auf ChoriHroitinase-ABC. Darin bezeichnen die Kurven:

O-O ChSA ίο

Δ-Δ ChSB O-O ChSC

Aus F i g. 5 ist ersichtlich, daß die bekannte Chondroitinase-ABC jeden der Stoffe ChS A, ChS B und ChS C abbaut, während die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung ChS A und ChS C, jedoch nicht ChS B, abbaut. Es ist auch ersichtlich, daß der Einfluß des pH-Wertes für beide dieser Enzyme verschieden ist.

Wie vorstehend ausführlich erläutert, ist die neue Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung von der bekannten Chondroitinase hinsichtlich der Grundeigenschaften 1, 2 und 3 eindeutig verschieden und sie stellt ein neues Enzym dar, das auch hinsichtlich verschiedener anderer Eigenschaften Unterschiede aufweist.

Bei einer Ausführungsform des Verfahrens zum Extrahieren von Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung werden die Zellen von Flavobacterium heparinum ATCC13125 mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert, worauf man den erhaltenen Extrakt einer Säulenchromatographie mit einer kationischen Austauschcellulosesäule unterwirft und aus dem Säuleneluat, das mit einer Pufferlösung eines Eluientngssalzes mit einer Salzkonzentration von 0,2 bis 0,5 Mol eluiert wird, gewinnt.

Das Verfahren zum Extrahieren und Reinigen der Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung wird nachstehend näher erläutert.

Das Bodenbakterium, Flavobacterium heparinum, aus welchem die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung extrahiert wird, ist ein bekanntes Bakterium und die Zusammensetzung von dessen Kulturmedium, die geeigneten Züchtungsbedingungen u. dgl. sind bekannt Es wird gewöhnlich in einem eine Kohlenstoffquelle und Stickstoffquelle enthaltenden Medium während etwa 8 bis 24 Std. bei einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,0 und bei einer Temperatur von etwa 30±3°C gezüchtet Die Züchtung kann entweder nach einem Verfahren mit flüssiger Kultur oder nach einem Verfahren mit fester Kultur, wobei technisch eine Behälterkulturmethode ν empfohlen wird, ausgeführt werden. Üblicherweise wird die Züchtung unter aeroben Bedingungen ausgeführt Ein Beispiel für das Kulturmedium ist ein mit HCl auf einen pH-Wert von etwa 7 eingestelltes Medium, das 7 g eines Produktes, das durch Zersetzung von Casein mit Pankreatin erhalten wurde, 6 g eines Produktes, das durch Zersetzung von Sojamehl mit Papain erhalten wurde, 1 g Glucose, 3 g NaCl, 1 g K₂HPO₄ und 1 g ChS C je Liter enthält Zusätzlich zu den vorstehend angegebenen Stoffen können Polypepton, Fleischex- ⁶Q trakt Hefeextrakt oder Maisextrakt verwendet werden.

Zum Extrahieren von Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung werden zuerst die Zellen von Flavobacterium heparinum mit einer wäßrigen Lösung extrahiert Vorzugsweise besteht ein derartiges Lösungsmittel aus ' -■ Wasser oder einer Pufferlösung. Die Zellen werden von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und vorzugsweise mit Wasser oder einer Pufferlösung gewaschen. Gewöhnlich werden die Zellen in Wasser oder in der Pufferlösung suspendiert und mit einer im allgemeinen für die Pulverisierung von derartigen Zellen verwendeten Einrichtung, beispielsweise einem Schalloszillator, pulverisiert, wobei auch eine französiche Presse und Seesand zur Anwendung gelangen können, wodurch das Extrahieren des gewünschten Enzyms aus den Zellen leicht gemacht wird. Am Ende der Extraktion wird der Extrakt von dem Zellenrest mit Hilfe einer geeigneten Trenneinrichtung, beispielsweise einer gekühlten Zentrifuge, abgetrennt. Als Pufferlösung wird Tris-HCl [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-salzsäure] besonders bevorzugt, wobei jedoch auch andere Pufferlösungen, z. B. Phosphatpufferlösungen, wie Natriumphosphat- und Kaliumphosphatpuffer, Trismaleatpuffer und Barbitalpuffer, ebenfalls verwendet werden können. Der pH-Wert der Pufferlösung liegt im Bereich von etwa 5 bis 8, vorzugsweise bei 6,5 ±1,0. Vorzugsweise wird ein derartiges Extrahierverfahren, wie Pulverisieren und Trennen, bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise einer Temperatur oberhalb des Gefrierpunktes des Lösungsmittels und unterhalb 40⁰C, vorzugsweise bei —5°C bis Raumtemperatur, U'.J insbesondere bevorzugt bei —2° C bis 10⁰C, ausgeführt, wobei eine Temperatur von 3 bis ±3°C besonders vorteilhaft ist. Der Zellenrückstand kann als solcher oder zusammen mit frischen Zellen erneut für eine Extraktion verwendet werden.

Der so erhaltene Extrakt kann erwünschtenfalls bei niedrigen Temperaturen gewöhnlich unterhalb 0⁰C, beispielsweise bei Temperaturen bis herab zu —10 bis — 20⁰C, gelagert werden. Der Extrakt wird nach der Trennung von den Zellen dann einer Säulenchromatographie mit einer kationischen Austauschcellulosesäule unterworfen. Vorzugsweise wird der zu behandelnde Extrakt in Form einer Pufferlösung mit einem im voraus auf 73 ±03 eingestellten pH-Wert verwendet. Erwünschtenfalls wird der erhaltene Extrakt der durch Extraktion mit einem wäßrigen Lösungsmittel erhalten wurde, unter Anwendung einer Pufferlösung als Aufnahmelösungsmittel dialysiert, wobei das sich ergebende Dialysat verwendet werden kann. In diesem Fall werden die Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht, beispielsweise anorganische Materialien, die in dem Extrakt vorhanden sind, in das Aufnahmelösungsmittel übergeführt wobei dies für die Reinigung des Extraktes dient

Als kationische Austauschcellulose ist Phosphocellulose besonders empfehlenswert Carboxymethylcellulose kann ebenfalls verwendet werden. Erwünschtenfalls körnen andere kationische Austauschcellulosen, beispielsweise Suifoäthylcellulose und Sulfomethylcellulose, verwendet werden.

Die Konzentration des Puffers in der Pufferlösung kann innerhalb eines Bereiches üblicherweise von 0,005-bis 0,1 molar, vorzugsweise 0,01- bis 0,05molar variieren. Die Konzentration ändert sich außerdem in Abhängigkeit von der Art des zu verwendenden Puffers. Bei Verwendung von Tris-HCl-Puffer ist eine Konzentration von etwa 0,02 ± 0,01 molar zweckmäßig.

Bei einem praktischen Verfahren wird vorzugsweise die kationische Austauschcellulosesäule vor der Inbetriebnahme mit einer Pufferlösung mit einem ähnlichen pH-Wert und einer ähnlichen Konzentration wie die zu behandelnde Flüssigkeit ins Gleichgewicht gebracht Dabei ist es jedoch nicht notwendig, den pH-Wert und die Konzentration der Säule vollständig in Obereinstimmung mit den entsprechenden Werten der zu

behandelnden Flüssigkeit zu bringen.

Danach wird das Adsorbens gewaschen, wobei eine Pufferlösung von ähnlicher Zusammensetzung durch die Säule geführt wird und mit einer Pufferlösung, die ein geeignetes Eluierungssalz gelöst enthält, eluiert, wobei 5 die Konzentration des Salzes in der Pufferlösung geändert wird. Die Salzkonzentration kann entweder fortlaufend oder jtufenweise geändert werden. Das Endprodukt wird aus der Säule als Eluat gewonnen, das eluiert wird, wenn die Salzkonzentration in der Pufferlösung 0,2- bis 0,5molar ist. Besonders bevorzugte Eluierungssalze sind Natriumchlorid und Kaliumchlorid. Es können auch neutrale Salze, wie Lithiumchlorid, Magnesiumchlorid und Ammoniumsulfat verwendet werden.

In dem Eluat, das durch Eluierung mit einer Pufferlösung mit einer Salzkonzentration von unterhalb 0,2molar erhalten wird, ist ein Enzym vorhanden, das ähnlich wie die bekannte Chondroitinase-ABC jeden der Stoffe ChS A, ChS B und ChS C abbaut. Erwünsch-(enfalls kann dadurch Chondroitinase-ABC als Nebenprodukt aus einem derartigen Eluat gewonnen werden.

Natürlich können die Säulenadsorptions- und Säuleneluierungsverfahren wiederholt werden. Erwünschtenfalls können auch andere verschiedene Arbeitsweisen _J5 bei dem Verfahren gemäß der Erfindung wiederholt werden.

Das erhaltene Eluat kann als solches aufbewahrt werden oder es kann nach Trocknung unter niedrigen ■Temperaturbedingungen beispielsweise Gefriertrock- _Jo nung und Vakuumtrocknung bei niedriger Temperatur gelagert werden.

Obgleich nicht notwendig, kann der Extrakt vor der Säulenchromatographie mit einer kationischen Austauschcellulosesäule derartigen Vorbehandlungen wie ,5 Entfernen von Nucleinsäure, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Dialyse und Filtration mit einem Gelfiltermittel unterworfen werden.

Beispielsweise werden die Zellen von Flavobacterium heparinum mit Wasser oder einer Pufferlösung extrahiert; der Extrakt wird ausgesalzen und fraktioniert durch den Zusatz eines derartigen Aussalzmittels wie Ammoniumsulfat in einer Menge von 80% Sättigung; das Aussalzmittel wird durch Dialyse oder durch Behandlung mit einem Gelfiltermittel aus der Wasser- oder Pufferlösung von dem ausgefällten Teil entfernt; danach wird der von dem Aussalzmittel befreite Extrakt einer Säulenchromatographie mit einer kationischen Austauschcellulosesäule unterworfen.

Das vorstehend geschilderte Aussalzen wird ausgeführt, indem man ein Aussalzmittel in einer Menge von 50% Sättigung dem Extrakt zugibt, den abgeschiedenen Anteil entfernt und der verbleibenden Flüssigkeit ein Aussalzmittel in einer Menge von 80% Sättigung zusetzt und von der Wasser- oder Pufferlösung den ausgefallenen Anteil entfernt

Es kann auch die nachstehende Arbeitsweise zur Anwendung gelangen: Vor dem Aussalzen wird eine Lösung in Wasser oder eine Pufferlösung von etwa 5% eines Nucleinsäure entfernenden Mittels, beispielsweise von Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat, das mit Nucleinsäure sich verbindet und dieselbe ausfällt, vorzugsweise unter Rühren in der Weise zugegeben, daß am Ende der Zugabe die Menge an Streptomycinsulfat etwa 1% (Gewicht/Volumen) der Extraktion betragen kann; die erhaltene Ausfällung wird abgetrennt und entfernt, worauf das vorstehend beschriebene Aussalzen ausgeführt wird. Man kann auch die von Nucleinsäure befreite Flüssigkeit der Säulenchromatographiebehandlung unterwerfen.

Wenn das Aussalzen in der vorstehend geschilderten Weise ausgeführt worden ist, wird der erhaltene ausgefällte Anteil einer Behandlung zur Entfernung des Aussalzmittels in Form einer Lösung desselben in einer Pufferlösung, vorzugsweise einer Tris-HCl-Pufferlösung, unterworfen. Dieses Verfahren kann nach einer bekannten Dialysemethode unter den gleichen pH-Wert- und Temperaturbedingungen wie bei der Extraktion aus den Zellen ausgeführt werden. Dabei wird ein vorbehandelter Extrakt als Dialysat erhalten, der sich nach der Entfernung des Aussalzmittels durch Dialyse einer Lösung des ausgesalzenen und fraktionierten Ausfällungsanteils in einer Pufferlösung ergibt.

Die Entfernung des Aussalzmittels kann auch durch Behandlung mit einem bekannten Gelfiltermittel, beispielsweise einem vernetzten Dextran, bewirkt werden. Bei dieser Behandlung wird gewöhnlich die zu behandelnde Flüssigkeit abwärts durch eine Säule des Filtriermittels gegossen. Erwünschtenfalls wird das Filtriermittel auch der zu behandelnden Flüssigkeit zugegeben, worauf nach gründlicher Benetzung desselben filtriert wird. Diese verschiedenen Arbeitsweisen zur Entfernung des Aussalzmittels können auch gemeinsam zur Anwendung gelangen.

Der so von dem Aussalzmittel befreite Extrakt kann bei niedriger Temperatur als flüssiges Medium oder nach Trocknung mit Hilfe von derartigen Tieftemperaturtrocknungseinrichtungen, wie für Gefriertrocknung und Vakuumtrocknung, bei tiefer Temperatur aufbewahrt werden.

Eine Reinigungsmethode zur Reinigung von Chondroitinase-AC auf einen höheren Reinheitsgrad kann mit dem Verfahren gemäß der Erfindung für die nachfolgende praktische Ausführung der Säulenchromatographie mit einer kationischen Austauschcellulosesäule verbunden werden. Beispielsweise wird ein Salz für das Aussalzen, z. B. Ammoniumsulfat, der erhaltenen Flüssigkeit vorzugsweise bis zur Sättigung zugegeben, die erhaltene Ausfällung in der genannten Pufferlösung, beispielsweise Tris-HCI-Pufferlösung, gelöst oder das Eluat wird unter verringertem Druck beispielsweise bei einer Temperatur unterhalb 40° C, vorzugsweise bei der tiefstmöglichen Temperatur, wie vorstehend mit Bezug auf die Extraktion angegeben, unter den pH-Wertbedingungen ebenfalls, wie vorstehend mit Bezug auf die Extraktion angegeben, konzentriert Entweder diese Lösung oder die Flüssigkeit wird der Säulenchromatographie mit einer Säule eines derartigen Gelfiltermittels, wie eines vernetzten Dextrans, unterworfen. Die Säule wird mit einer verdünnten wäßrigen Lösung des Eluierungssalzes. vorzugsweise Natriumchlorid oder Kaliumchlorid (wobei auch Lithiumchlorid, Magnesiumchlorid oder Ammoniumsulfat brauchbar sind), eluierL Dabei wird eine Fraktion, die Chondroitinase-Aktivitäten aufweist, gewonnen.

Vorzugsweise soll die für das Auflösen der erhaltenen Ausfällung verwendete Menge an Pufferlösung möglichst klein sein, beispielsweise mehrere Milliliter, und die zu behandelnde Gesamtmenge soll nicht zu groß sein.

Bei der vorstehend geschilderten Eluierung mit einer verdünnten wäßrigen Lösung des genannten Eluierungssalzes wird Chondrotinase-AC eluiert, wenn die Menge des Lösungsmittels etwa das 2fache von dessen Volumen, das die Hohlräume zwischen den Teilchen des Gelfiltermittels füllt, befägt und sie ist nahezu zu 100%

cluicrt, wenn das Lösungsmittel etwa das 3fache des angegebenen Volumens beträgt. Derartige Fremdstoffe, wie Glucuroiiidase, sind wesentlich schwieriger zu v.'iiieren als Chondroitinase-AC und zeigen ihre Aktivität lediglich an einer Stelle oder zu einem Zeitpunkt, bei welchem die Eluierung von Chondroitinase zu Ende geht. Es ist daher möglich, derartige Fremdstoffe ohne Verlust an Chondroitinase-AC zu entfernen.

Einige Ausführungsformen der Extrahierung und Gewinnung von Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung werden nachstehend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel t

Ein durch Vorzüchtung in einem Kolben erhaltenes Flavobacterium heparinum, ATCC 13 125, wurde in 15 Liter eines flüssigen Mediums mit einem pH-Wert von 7.0 eingeimpft, das 1.5% Polypepton. 0.45% Fleischextrakt, 1% Hefeextrakt, 1% Malzextrakt, 0.2% Chondroitinsulfat (Na-SaIz) und 0,15% Natriumchlorid enthielt und während 8 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C gezüchtet. Die Züchtung wurde beendet, wenn die optische Dichte dieser Kulturflüssigkeit 4,0 bis 10,0 bei 650 μ, betrug. Die Flüssigkeit wurde bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die Zellen wurden gesammelt. Die Zellen wurden in dem 2- bis 3fachen ihres Gewichtes von destilliertem Wasser, das auf etwa 4° C gekühlt war, suspendiert, zentrifugiert und gewonnen (Waschbehandlung). Die erhaltenen Zellen wurden erneut in etwa dem 3fachen ihres Gewichts von destilliertem Wasser suspendier· und in einem Schalloszillator 5 bis 10 Minuten lang behandelt. Die sich ergebende Flüssigkeit wurde 30 Minuten lang bei 0 bis 10°C und 17 500 · g zentrifugiert und die ausgefallenen Zellreste wurden entfernt. Der so erhaltene rohe Extrakt wurde bei 0 bis 10⁰C dialysiert, wobei ein Mehrfaches von dessen Gewicht von 0,02molarem Tris-HCI mit einem pH-Wert von 7,3 verwendet wurde, und auf eine Phosphocellulosesäule (5 χ 95 cm), die vorhergehend mit einem Tris-HCI-Puffer eingestellt worden war, aufgebracht. Das Adsorbens wurde mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und dann wurde Chondroitinase unter fortlaufender Steigerung der Konzentration des Kochsalzes von 0- bis 0,5molar eluiert Das Eluat wurde mit einem Fraktionssammler gesammelt. Die Prüfung der Chondroitinase-Aktivität zeigte zwei Aktivitätsspitzen. Das Enzym, das bei einer Stufe niedriger Salzkonzentration (weniger als 0,2molar) eluiert wurde, besteht aus Chondroitinase-A BC und das Enzym, das bei einer Stufe einer hohen Salzkonzentration (0,2- bis OJmolar) gesammelt wurde, ist die Chondroitinase-AC gemäß der Erfindung. Bei einer zwischen Chondroitinasc-ABC und Chondroitinase-AC liegenden Zone wurde Glucuronidase eluiert, die 4Di-Os und 4Di-6s, gebildet unter der Einwirkung von Chondroitinase, zu Monosacchariden abbaut Die so erhaltene Chondroitinase-AC besaß eine Gesamtenzymaktivität von 1050 Einheiten und eine spezifische Aktivität von 45 Einheiten je Milligramm Protein. Das Eluat von Chondroitinase-AC wird gewöhnlich nach Konzentrierung und Dialyse nach einer üblichen Arbeitsweise verwendet

Beispiel 2

Flavobacterium heparinum, ATCC 13 125, wurde in einem Kolben vorgezüchtet Es wurde dann in 15 Liter eines flüssigen Mediums mit einem auf 6,8 eingestellten pH-Wert eingebracht, das 0,7% eines Produktes, das durch Zersetzung von Casein mit Pankreatin erhalten wurde, 0,6% eines Produktes, das durch Zersetzung von Sojamehl mit Papain erhalten wurde, 0,1% Glucose, 0,3% NaCI, 0,1% K₂HPO₄ und 0,1% Chondroitinsulfat (Na-SaIz) enthielt und während etwa 10 Stunden bei 30⁰C gezüchtet Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde; bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die ausgefallenen Zellen wurden gesammelt Die Zellen

ίο wurden in etwa dem 4fachen ihres Gewichts eines 0,02molaren Tris-HCI-Puffers mit einem pH-Wert von 7,3 suspendiert und unter Anwendung einer französischen Presse aufgebrochen. Die erhaltene Suspension wurde während 25 Minuten bei 20 000 χ g bei einer Temperatur von 0 bis 10⁰C zentrifugiert und die ausgefallenen Stoffe, beispielsweise der Zellenrückstand, wurden entfernt. Dieser rohe Extrakt wurde einer Behandlung mit einer Phosphocellulosesäule zur Reinigung von Chnnriroitinase-AC unterworfen. Die Bedingungen für die Säulenchromatographie waren die gleichen, wie vorstehend im Beispiel 1 angegeben. Die sich ergebende Chondroitinase-AC besaß eine Gesamtenzymaktivität von 940 Einheiten und eine spezifische Aktivität von 56 Einheiten je Milligramm Protein.

Beispiel 3

Ammoniumsulfat wurde zu einem Teil einer Fraktion von Chondroitinase-AC, die aus der Phosphorcellulosesäule im Beispiel 1 eluiert worden war (die Chondroitinase-AC mit einer Gesamteinheit von 450 und einem Gesamtprotein von 10 mg), bei 0 bis 5°C bis zum Erreichen einer Sättigung von 80% zugegeben, wodurch Chondroitinase und andere Stoffe ausgefällt wurden. Diese wurden durch Zentrifugieren gesammelt Die erhaltene Ausfällung wurde in etwa 2 ml einer 0,03molaren Natriumphosphat- Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule von vernetztem Dextran (2,4 χ 88 cm) aufgebracht, die vorhergehend mit einer Lösung eines Puffers mit einer Kochsalzkonzentration von 0,1 molar eingestellt worden war, und wurde mit der gleichen Salzpufferlösung eluiert. Das Eluat wurde mit Hilfe eines Fraktionssammlers gesammelt. Die Prüfung der Aktivität von Chondroitinase-AC zeigte, daß die Aktivität auftrat wenn die Menge der Eluierlösung 200 ml betrug, und nahezu 100% von Chondroitinase-AC waren, zu dem Zeitpunkt eluiert, bei welchem die Eluierlösungsrnenge 300 ml betrug. Wenn bei der Vorstufe der Reinigung eine sehr geringe Menge von Glucuronidase vorhanden war, setzte die Eluierung derselben nach Beendigung der Eluierung von Chondroitinase-AC ein. Sie kann daher nahezu vollständig entfernt werden. Die so erhaltene Chondroitinase-AC besaß eine Gesamtenzymaktivität von 410 Einheiten und eine spezifische Aktivität von 120 Einheiten je Milligramm Protein.

Beispiel 4

250 ml einer 0,02molaren Tris-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 73 und einem Gehalt von 5% Streptomycinsulfat wurde zu 1 1 eines rohen Extraktes der aus den Zellen von Flavobacterium heparinum in gleicher Weise wie im Beispiel 2 extrahiert worden war, zugegeben und anschließend wurde 1 Stunde lang gerührt Die sich ergebende Ausfällung wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und Ammoniumsulfat wurde der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Sättigung von 50% zugegeben. Nach Rühren wurde die

Ausfällung durch Zentrifugieren abgetrennt und weiteres Ammomumsulfat wurde der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Sättigung von 80% zugegeben. Nach Rühren und Zentrifugieren wurde die so erhaltene Ausfällung in 0,02molarer Tris-HCI mit einem pH-Wert von 73 gelöst und die Lösung wurde unter Verwendung der gleichen Pufferlösung gründlich dialysiert. Das

Dialysat wurde einer Säulenchromatographie mit einer Phosphocellulosesäule in gleicher Weise wie im Beispiel 1 unterworfen und das gewünschte Produkt wurde erhalten. Die erhaltene Chondroitinase-AC besaß eine Gesamtenzymaktivität von 780 Einheiten und eine spezifische Aktivität von 76 Einheiten je Milligramm Protein.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Das als Chondroitinase-AC bezeichnete Enzym aus den Zellen von Flavobacterium heparinum ATCC 13 125, welches die folgenden Eigenschaften besitzt:

I) es baut Chondroitinsulfat A ab,

I1) es baut Chondroitinsulfat B nicht ab,

I11) es baut Chondroitinsulfat C ab,

IV) Chondroitinsulfat B ist ein konkurrierender Inhibitor gegenüber diesem Enzym, wie in F i g. 2 dargestellt,

V) es baut Chondroitinsulfat D ab,

VI) es wird nach seiner säulenchromatographischen Adsorption an einer Kationen-Austauscher-CelluIose mit einer Pufferlösung für Eluieningszwecke mit einer 0.2- bis 0,5molaran SalzkoDz^ntration eluiert, wie in F i g. 3 dargestellt.

VII) es weist bei der Scheibenelektrophorese auf einem Acrylamidgel das in Fig.4 gezeigte Muster auf,

VIII) es zeigt die Geschwindigkeit und das Ausmaß beim Abbau von Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B, von Chondroitinsulfat C, Chondroitinsulfat D aus Haifischknorpel und von Hyaluronsäure, wie in Fig. l-l dargestellt,

IX) es besitzt die in F i g. 5 anhand der ausgezogenen Linien gezeigte Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit beim Abbau von Chondroitinsulfat A, Chßndroiti.,sulfat B und Chondroitinsulfat C vom pll-Werl.

X) seine Aktivität wird durch ie zweiwertigen Ionen Mn* ',Mg⁺ *,Ca^{+ f} und Ba^{+ +} bei einer 0,001 molaren Konzentration dieser Metalle um das IJ- bis l,5fache erhöht, wohingegen Zn ^{f f},Fe ^{f f} und Cu * ⁺ eine Hemmwirkung auf seine Aktivität ausüben,

XI) Heparin, Heparitinsulfat und Keratosulfat hemmen aie Chondroitinase-AC-Reaktion,

I11) das Enzym, welches in einer Proteinkonzentration von 0,24 mg/ml, wobei die spezifische Aktivität 4,7 Chondroitinase-AC-Einheilcn/mg Protein beträgt, in dem 0,02molaren Tris-HCI-Puffer mit dem pH-Wert von 7,2 gelöst ist, wird in 3 Minuten um etwa 20% und in 11 Minuten um etwa 50% desaktiviert.