DE2712007A1 - Stabilisiertes glucoseisomerase- enzymkonzentrat und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Stabilisiertes glucoseisomerase- enzymkonzentrat und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein verhältnismäßig reines und stabiles
Glucosaisomerase-Enzymkonzentrat in einer wasserlöslichen Form,
das eine hohe spezifische Aktivität und verbesserte Lagerun^sstabilität
aufweist und insbesondere ein stabilisiertes Glucoseisomerase—
Enzymkonzentrat, das
1) zellfreie Glucoseisomerase, die im wesentlichen nucleinsäurefrei
ist,
und
2) Mg++
enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzymkonzentrates.
Die als Isomerisierung bekannte Umwandlung von Dextrose in Lävulose liefert ein Produkt, das in der Praxis einen vollwertigen
Ersatz für handelsüblichen Invertzucker darstellt. Bei der Isomerisierung geht man von Dextrose aus, einem Monosaccharid,
das nur etwa 70 % der Süßkraft von Saccharose besitzt, und wandelt
bis zu etwa 50 i» davon ±n einen Zucker um, der etwa 1^0 ^o
der Süßkraft von Saccharose oder Invertzucker besitzt. Dieses besondere Süßungsvermögen ist es, «las die Stärkeindustrie an
lavulοsehaltigern Maissirup (der heute üblicherweise als fructosereicher
Maissirup /VFSCj bezeichnet wird) und dem Verfahren
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zur Herstellung derartiger Sirupe so stark interessiert.
Die Erforschung des enzymatischen Isomerisierungsverfahrens
begann 1955. Diese Arbeiten haben ihren Niederschlag im US-Patent
Nr. 2 950 228 und einer Veröffentlichung von Marshall und Kooi
in Science, T25, 648 (1957) gefunden. Seit dieser Zeit sind
die Veröffentlichungen über Arbeiten von Forschern, die durch die grundlegenden Arbeiten von Marshall und Kooi angeregt
wurden, in Fachliteratur und Patenten buchstäblich explosionsartig angeschwollen.
Eine der wichtigeren Veröffentlichungen auf diesem Gebiet stellt
der Vorabdruck des Manuskripts eines Berichts von Dr. Sato und Dr. Tsumura vom Japanese Food Research Institute auf der Jahrestagung
der Agricultural Chemical Society of Japan in Sapporo am 20. Juli 1964 dar. In diesem 196k erschienenen Vorabdruck
und dem am 7· Okt. 1966 veröffentlichten japanischen Patent
Nr. 17 640 offenbarten Dr. Sato und Dr. Tsuraura, daß mehrere
Stämme ^on Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, wenn sie
auf Xylose kultiviert werden, das Enzym Glucoseisomerase erzeugen, sowie, daß dieses Enzym die Isomerisierung von Glucose zu
Fructose bewirkt. Im Zuge nachfolgender Entwicklungsarbeiten
stellte eine andere Gruppe von Wissenschaftlern unter der Leitung
von Dr. Takasaki vom Japanese Fermentation Research Institute, einem Organ des Ministry of International Trade and
Industry (MIT!), fest, daß bestimmte Stämme von Mikroorganismen
der Gattung Streptomyces, die Xylan, ein Polymer der Xylose,
assimilieren, auf Xylan kultiviert werden können und dabei Glucoseisomerase erzeugen (jap. Patentschrift Nr. 27 525 und
US-Patentschrift 3 616 221).
Die Hersteller von hochfructosehaltigem Maissirup haben festgestellt,
daß die enzymatische Isomerisierung von Glucose vorzugsweise kontinuierlich durchgeführt werden sollte, um ein
kommerziell annehmbares fructosereichcs ^aissirupprodukt wirtschaftlich
herzustellen. In der Regel wird bei derartigen Verfahren ein Glucosesirup mit einer großen Menge eines auf einer
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inerten Trägersubstanz aufgebrachten Glucoseisomerase-Enzympräparats
in Berührung gebracht, d.h. einem immobilisierten Glucoseisomerase-Enzympräparat. Ein wesentlicher Punkt eines derartigen
Verfahrens ist es, daß man ein immobilisierbes GIucoseisomerase-Enzympräparat
verwendet, das pro Volumeneinheit eine hohe Isomeraseaktivitätskonzentration aufweist, so daß es
sich für den Einsatz in einem kontinuierlichen enzymatischen Isomerisierungsverfahren eignet.
Glucoseisomerase wird in der Regel intrazellular erzeugt, d.h., daß der größte Teil des Glucoseisomerase-Enzyms innerhalb der
und/oder an den Zellwänden der Mikroorganismen sitzt, von denen
es erzeugt wird. Bei einigen kontinuierlichen Isomerisierungsverfahren
verwendet man die ganzen, die Glucoseisomerase enthaltenden Zellen. Bei derartigen Verfahren ist es in der Regel
erforderlich, die Zellen einer speziellen Behandlung zu unterverfen, durch die verhindert wird, daß die Glucoseisomerase
aus den Zellen extrahiert wird, so daß bei dieser Behandlung somit im Endeffekt das Enzym in den Zellen selbst immobilisiert
wird, und/oder spezielle Vorrichtungen zu verwenden, um die hydraulischen
Probleme lösen zu können, die· damit verbunden sind,
die glucosehaltige Lösung durch das Bett aus das Glucoseisomerase—Enzym
enthaltenden Zellen zu treiben. Verfahren, bei denen ganze Glucoseisomerase enthaltende Zellen verwendet
werden, sind beispielsweise in den US-Patentschriften 3 69^ 31^t
3 753 858, 3 779 869, 3 817 832 und 3 8.21 086 sowie den deutschen
Offenlegungsschriften 2 317 680 und 2 3'*5 186 beschrieben.
Diese Verfahren, bei denen ganze, GlucosRJsoracrase enthaltende
Zellen verwendet werden, sind mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. Nachteilig sind dabei u.a. das Auftreten hydraulischer
Probleme, die Bildung von Verunreinigungen aufgrund der Anwesenheit anderer Enzyme als Isomerase, von Nucleinsäuren
und anderen Stoffen in den Zellwänden sowie längerer notwendiger Kontaktzeiten zwischen der Glucoselösung und dem
Ze11-Enzympräparat, wobei letztere unter alkalischen Bedingungen
zur Bildung unerwünschter, durch alkalikatalysierte Reaktion
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aus Fructose entstehender Produkte, wie Psicose und Hydroxymethylfurfural
(!IMF) führen.Die vorstehenden Probleme führen zu höheren Herstellungskosten aufgrund der zur Entfernung
der erzeugten Verunreinigungen erforderlichen Reinigung und/oder zur Erzeugung eines minderwertigen Produkts.
der erzeugten Verunreinigungen erforderlichen Reinigung und/oder zur Erzeugung eines minderwertigen Produkts.
Um die bei der Verwendung ganzer, intrazellulare Glucoseiso—
merase enthaltender Zellen auftretenden Probleme zu lösen, wurden nach dem Stand der Technik bereits Verfahren vorgeschlagen, bei
denen die Glucoseisomerase aus den Zellen abgetrennt wird,
um sie in eine lösliche Form zu bringen, worauf man sie an
einem nicht-wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert. Das immobilisierte Enzym eignet sich dann zur Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in einen hochfructosehaltigen Maissirup. Beispiele derartiger Verfahren sind in
den US-Patentschriften 3 708 397, 3 788 9^5, 3 S5O 751 und
3 868 3O4, der belgischen Patentschrift 819 859 und der US-Patentanmeldung 505 823 bzw. der belgischen Patentschrift
810'^80 beschrieben.
um sie in eine lösliche Form zu bringen, worauf man sie an
einem nicht-wasserlöslichen inerten Träger immobilisiert. Das immobilisierte Enzym eignet sich dann zur Verwendung bei der kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in einen hochfructosehaltigen Maissirup. Beispiele derartiger Verfahren sind in
den US-Patentschriften 3 708 397, 3 788 9^5, 3 S5O 751 und
3 868 3O4, der belgischen Patentschrift 819 859 und der US-Patentanmeldung 505 823 bzw. der belgischen Patentschrift
810'^80 beschrieben.
Diese Verfahren, bei denen zellfreie immobilisierte Glucoseisomerase
verwendet wird, lösen zwar einige der mit der Verwendung ganzer Zellen verbundenen Probleme, erfordern jedoch
die Solubilisierung der Glucoseisomerase, d.h. die Abtrennung der Glucoseisomerase von bzw. aus den ganzen Zellen. Verfahren
zur Solubilisierung der Glucoseisomerase sind zwar
bekannt, jedoch ist es wünschenswert, zellfreie und lösliche Glucoseisomerase in hochreiner Form zu erhalten, die eine
hohe Isomeraseaktivität pro Volumeneinheit aufweist. Die Verwendung eines hoch-gereinigten und-konzentrierten Enzyms erhöht nämlich die Effizienz, mit der das Enzym auf den unlöslichen Träger aufgebracht werden kann.
bekannt, jedoch ist es wünschenswert, zellfreie und lösliche Glucoseisomerase in hochreiner Form zu erhalten, die eine
hohe Isomeraseaktivität pro Volumeneinheit aufweist. Die Verwendung eines hoch-gereinigten und-konzentrierten Enzyms erhöht nämlich die Effizienz, mit der das Enzym auf den unlöslichen Träger aufgebracht werden kann.
Verfahren zum Extrahieren und Reinigen von Glucoseisomerase
aus Mikroorganismenzellen in konzentrierter und gereinigter
Form machten bislang die Anwendung teurer und komplizierter Arbeitsgänge erforderlich, die nur für Versuchsarbeiten im kleinen
aus Mikroorganismenzellen in konzentrierter und gereinigter
Form machten bislang die Anwendung teurer und komplizierter Arbeitsgänge erforderlich, die nur für Versuchsarbeiten im kleinen
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Laborniaßstab geeignet waren.
Ein derartiges Laborverfahren zum Extrahieren und Reinigen solubilisierter Glucoseisomerase ist von Danno und Mitarbeitern
in Agr. Biol. Chem., Band 31, Seiten 284 bis 292 (1967) beschrieben
worden. Danno und Mitarbeiter beschrieben ein Verfahren zum Reinigen von aus Bacillus coagulans Stamm HN-68 stammender
Glucoseisomerase, bei dem man mit Äthylendiamintetracssigsäure
(EuTA) behandelte Zellen der Einwirkung von Lysozym aussetzt, um einen zellfreien Extrakt herzustellen, aus dem man
dann durch Behandeln mit Mangansulfat unerwünschte Stoffe ausfällt. Die überstehende Flüssigkeit vird dann mehrmals mit
Ammoniumsulfat behandelt, um eine x^roteinhaltige Glucoseisomerasefralttion
auszufällen, die durch Dialyse und Chromatographie an DEAE-Sephadax A-50 (eingetragenes Warenzeichen) weiter gereinigt
wird. Auf diese Weise wird angeblich eine Xonzentrationssteige—
rung auf das 6O—fache erreicht.
Eine ancfere Labormethode zum Reinigen von Glucoseisomerase wurde
von Takasaki und Mitarbeitern beschrieben (Agri. Biol. Chem., Band 33, Seiten 1527 bis 1534 (1969) und "Fermentation Advances",
Seiten 561 bis 589 O969)» Academic Press, Inc., New York,
New York). Takasaki und Mitarbeiter offenbarten, daß intrazellulare Glucoseisomerase von Streptomyces albus aus den
Zellen durch Behandlung mit einem katioriischen Netzmittel,
Cetj'lpyridiniumchlorid, freigesetzt und dann fraktioniert werden
kann, indem man den zellfreien Extrakt mit Aceton behandelt, dialysiert, anschließend nacheinander in einer mit DEAE-Cellulose
gefüllten und einer mit DEAE-Sephadex gefüllten chromatographischen
Säule chromatographiert und schließlich einer weiteren Dialyse unterwirft. Der gereinigte zellfreie Extrakt
wurde dann weiter durch Dialyse in einer pro 1 0,005 Mol Magnesiumsulfat
und 0,0002 Mol CoCl_ enthaltenden Lösung gereinigt. Zu der dabei erhaltenen Lösung wurde allmählich Aceton bis zu
einer Konzentration von 40, 45 und schließlich 50 fo zugegeben,
um das Glucoseisomerase-Enzym zu kristallisieren. Dieses Verfahren
ist zu kompliziert und zeitraubend, um beim Arbeiten
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• /M.
in großem Maßstab angewendet werden zu können.
Aus der US-Patentschrift 3 70S 397 ist ein weiteres derartiges
Verfahren bekannt, bei dem Glucoseisomerase aus mit EDTA behandelten
Zellen von auf Weizenkleie kultivierten Mikroorganismen der Spezies Streptomyces phaeochromogenes durch Behandeln mit
einer Lysozym, Toluol, Magnesiumchlorid, einen Puffer und Wasser enthaltenden Lösung abgetrennt werden. Die lysierte Aufschlärnnmng
wird dann mit Magnesiumchlorid behandelt, worauf man das Enzym schließlich durch allmähliche Zugabe von kaltem
Aceton ausfällt. Die so erhaltene Enzymfällung wird in Wasser
gelöst und an DEAE-Cellulose immobilisiert, wodurch man einen
zur Umwandlung von Glucose in einen fructosereichen Maissirup
verwendbaren Biokatalysator erhält. Bei einem weiteren, aus der US-Patentschrift 3 788 9't5 bekannten Verfahren wird von
auf Xylose und Xylanhydrolysat kultivierten Mikroorganismen vom Stamm Streptomyces sp ATCC 21 175 stammende intrazelluläre
Glucoseisomerase mit einem kationischen Netzmittel (Arquad
»
18-50) und dann mit DEAE-Cellulose behandelt, um Nicht-Isomerasematerial abzutrennen. Das Glucoseisomerase enthaltende Filtrat wird dann an DEAE-Cellulose oder einem synthetischen Anionaustauscherharz immobilisiert, wodurch man einen Biokatalysator für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup erhält.
18-50) und dann mit DEAE-Cellulose behandelt, um Nicht-Isomerasematerial abzutrennen. Das Glucoseisomerase enthaltende Filtrat wird dann an DEAE-Cellulose oder einem synthetischen Anionaustauscherharz immobilisiert, wodurch man einen Biokatalysator für die kontinuierliche Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup erhält.
Auch in den US-Patentschriften 3 847 7^0 und 3 8^7 7^1 ist
ein derartiges Verfahren beschrieben, bei dem intrazellulare Glucosoisomerase enthaltende Zellen mit einer kleinen Menge
eines Netzmittels, Tween 80 (eingetragenes Warenzeichen), in einer gepufferten Glycinlösung behandelt werden. Nach innigem
Durchmischen werden die Zelltrümmer entfernt, wobei man ein 17j5 Isomeraseaktivitätseinheiten pro ml enthaltendes Filtrat
erhält.
Aus der US-Patentschrift 3 8>47 7^0 ist ein Verfahren zum Immobilisieren
gereinigter Glucoseisomerase-Präparate an einem
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basischen Magnesiumcarbonat-Träger und aus den US-Patentschriften
3 850 751 und 3 868 304 ein Verfahren zum Immobilisieren von
Glucoseisomerase-Präparaten an Aluminiumoxyd-Trägern mit geregelter Porosität bekannt. Die Verwendung auf diese ¥eise
erhaltener immobilisierter Enzympräparate ergibt zwar überlegene
Verfahren zur Erzeugung hochfructosehaltiger Maissirupe,
erfordert jedoch hochgereinigte und-konzentrierte Glucoseisomerase,
um sie effizient und wirtschaftlich industriell nutzen zu können.
Trotz der vorstehend beschriebenen Verfahren besteht somit immer noch ein Bedarf an einem wirtschaftlichen Verfahren, nach dem
in großem Maßstab im wesentlichen lösliche und gereinigte Glucoseisomerase—Präparate hergestellt werden können, die eine
hohe Aktivität pro Volumeneinheit und eine hohe Stabilität besitzen und sich zur Herstellung von bei kontinuierlichen
Verfahren zum Herstellen hochfructosehaltiger Maissirupe verwendbaren Biokatalysatoren durch Binden bzw. Immobilisieren
des'Glucoseisomerase—Präparats an einen wasserunlöslichen
Träger eignen, aber auch an sich wertvoll und nützlich, sowie in anderen Immobilisierungsverfahren brauchbar sind.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, derartige G.lu—
coseisomerase-Enzymkonzentrate zur Verfügung zu stellen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein zell- und im wesentlichen
nucleinsäurefreic Glucoseisomerase sowie ein im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz enthaltendes, stabilisiertes
Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat der eingangs bezeichneten Art gelöst, das durch
a) einen Proteingehalt von etwa 50 bis 80 Gew.-^, bezogen auf
Trockensubstanz,
b) einen Mg -Gehalt von etwa 3 bis 45 mg/ml Enzymkonzentrat,
c) ein Mg++/Protain-Verhältnis von etwa 0,02 bis 0,75,
d) eine spezifische Isomerascaktivität von mindestens etwa
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• 43,
10 IGIU (international-Glucose-Isomerase-Units = Internationale
Glucoseisomeraseeinheiten)/mg Protein und
e) eine so hohe Stabilität, daß es bei bis zu 30-tägiger Lagerung
bei 26 C bis zu 95 °/o seiner anfänglichen Isomeraseaktivität
behalten kann, gekennzeichnet ist.
Die Glue ο sei soraerase-Enzymkonz entrat e der Erfindung sind
so stabil, daß sie bei Lagerung unter den angegebenen Bedingungen CuTCfrsctnittl.etwa 95 # ihrer anfänglichen Aktivität behalten,
und vorzugsweise sogar so stabil, daß sie bis zu 80-10 $ ihrer
anfänglichen Isomeraseaktivität behalten, wenn sie bis zu
12 Monate lang bei 18 C gelagert werden.
Die Enzymkonzentrate der Erfindung enthalten vorzugsweise etwa 5 bis 25 Gew.-J» eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels,
wie Propan-2-ol, und besitzen vorzugsweise eine Isomeraseaktivität
von mindestens etwa 5000 und insbesondere mindest-ens
etwa 8.000 IGIU/g Trockensubstanz.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Konzentrieren, Reinigen und Stabilisieren von Glucoseisomerase.
Die stabilisierten Enzymkonzentrate der Erfindung können hergestellt
werden, indem man ein wäßriges, zellfreie Glucoseisomerase und ein wassermischbares organisches Lösungsmittel enthaltendes
Gemisch mit einer kleinen, jedoch wirksamen Menge eines im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalzes behandelt,
so daß die Glucoseisomerase und das Magnesiumsalz ausgefällt werden. Die Behandlung mit dem Magnesiumsalz führt also zur
Bildung eines Glucoseisomerase-Magnesium-Niederschlags, der anschließend nach beliebigen an sich bekannten Methoden, z.B.
durch Zentrifugieren, abgetrennt und gewonnen werden kann. Das stabilisierte Enzymkonzentrat der Erfindung kann dazu verwendet
werden, auf die meisten wasserunlöslichen Träger, z.B. DEAE-Cellulose, synthetische Anionenaustauscherharze, poröse,
wasserunlösliche Materialien, wie basisches Magnesiumcarbonat
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und poröse Aluminiumoxydniaterialien, hohe Enzymaktivitäten pro
Volumeneinheit aufzubringen und dadurch Biokatalysatoren herzustellen, die zur kontinuierlichen Umwandlung von Glucose
in Fructose geeignet sind. Das abgetrennte Enzyinkonzeritrat,
das in Form eines dicken Breies bzw. einer dicken Aufschlämmung vorliegt, wird vorzugsweise mit einer kleinen Menge Wasser
verdünnt, um es leichter auf wasserunlöslichen Trägern unter Bildung außerordentlich stabiler, immobilisierter
Glucoseisomeraso-Biokatalysatoren mit hoher Isoraoraseaktivität
pro Trägervolumeneinheit sorbierbar zu machen. Das Konzentrations-, Reinigungs- und Stabilisierungsverfahren
ergibt eine Steigerung der Enzynkonz en trat i on auf mehr als das 70-fache und insbesondere mehr als das 100-fache dor in
der ursprünglichen ICulturbrühe vorliegenden Konzentration. Das Enzymkonzentrat ist außerdem 10-bis 1 5-mal reiner als
das ursprüngliche Enzym.
Gemäß ej_ner weiteren Ausführungsform der Erfindun- ist vorgesehen,
ein'zellfreie Glucoseisomerase enthaltendes wässriges Gemisch
mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel in einer
Menge zu behandeln, die ausreicht, um einen wesentlichen Teil der vorhandenen Nucleinsäuren auszufällen, jedoch geringer als
diejenige Menge ist, die zu einer Ausfällung des Enzyms führen würde. Dieses konzentrierte und gereinigte Enzymzwischenprodukt
ist als solches bereits wertvoll und verwertbar, obwohl es nicht ganz so stabil und konzentriert ist, wie das erfindungsgemäße
mit Magnesium behandelte Enzymkonzentrat.
Wegen der Vielfalt und oftmals fehlenden Eindeutigkeit der im gegebenen Zusammenhang allgemein gebräuchlichen Fachausdrücke
werden nachfolgend einige Definitionen gegeben, die das Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche erleichtern und
exakte und eindeutige Angaben ermöglichen sollen.
"DE" ist eine gebräuchliche Abkürzung für die Bezeichnung "Dextroseäquivalent",
die den Gehalt einer Substanz an reduzierenden Zuckern, berechnet als Dextrose und angegeben in Prozent
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des gesamten Feststoffgehalts bedeubet.
Der Ausdruck "Stärkehydrolysat" wird als allgemeiner Begriff zur Bezeichnung eines Sirup- oder Trockenprodukts benutzt, das
durch Hydrolyse von Stärke hergestellt ist. Ein derartiges Produkt kann durch saure und/oder enzymatische Hydrolyse hergestellt
werden. Für die erfindungsgemäße Isomerisierung bevorzugt
verwendbare Stärkehydrolysate erhält man durch Verflüssigung bzw. Verdünnung von Stärke mit Säure oder Enzym bis
zu einem DE von 10 oder weniger und anschließende enzymatische Verzuckerung bis zu einem DE von über 90 und vorzugsweise über
95· Die Bezeichnung "Dextrose" ist im wirtschaftlichen Sprachgebrauch
üblicherweise dem raffinierten, kristallinen Zucker
(einem Monosaccharid) vorbehalten, der aus einem hochgradig
konvertierten Stärkehydrolysat gewonnen wird. Die Bezeichnung "Glucose" wird in der Beschreibung und den Ansprüchen sowohl
in ihrer im wirtschaftliehen Sprachgebrauch üblichen Bedeutung
als .auch zur Bezeichnung des Monosaccharide Dextrose in belie—
biger Form, gleich ob in Lösung oder trocken, als Bestandteil eines Stärkehydrolysatsirups oder von Stärkehydrolysatfeststoffen,
oder aber in raffinierter kristalliner Form gebraucht.
Die Ausdrücke "Fructose" und"Lävulose" werden vom Fachmann in der
Regel gegeneinander austauschbar zur Bezeichnung des linksdrehenden Isomeren der Glucose gebraucht, das süßer als Dextrose
ist. Dieses Isomere kommt in der Natur im Honig und in Invertzucker zusammen mit Glucose vor und wird wegen seiner hohen
Süßkraft geschätzt. Nachfolgend wird dieses Monosaccharid als "Fructose" bezeichnet.
"Glue ο sei s oraerase" ist ein Enzym oder Enzympräparat, das Xylose
zu Xylulose und Glucose zu Fructose isomerisieren kann. Die vorherrschende Aktivität dieses Enzyms ist die Umwandlung
von Xylose in Xylulose, so daß die Bezeichnung "Xyloseisomerase" dio wissenschaftlich exakteste Benennung darstellt (EC 5·3·1·5·)·
Dieses Enzym ist fachsprachlich auch schon als "Dextroseisomerase".
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46.
"Xylose- (Dextrose-)lsomerase" und "Glucosexsomerase11 bezeichnet
worden. Die gebräuchlichste Bezeichnung ist "Gliicoseisomerase", so daß nachstehend dieser Ausdruck der Einfachheit und leichteren
Verständlichkeit wegen benutzt wird.
In der Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich Angaben in Teilen und Prozenten stets auf das Gewicht des jeweiligen
Produkts, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
Die Angabe "IGIU" ist eine Abkürzung der englischen Bezeichnung International Glucose Isomerase Unit (internationale Glucoseisomeraseeinheit)
. Eine IGIU ist diejenige Glucoseisomeraseinengo, die in einer 0,8-molaren Glucosslösunj box pH 7»5 und 60 C,
sowie unter Anwendung der nachstehend beschriebenen Testmethode ein Mikromol Fructose pro Minute erzeugt.
Bei der zur Bestimmung der Isomeraseaktivität benutzten Testmethode
wird die in einer Glueöselösung unter standardisierten
Bedingungen erzeugte Ketose spektrophotometrisch bestimmt.
Zur Durchführung der Isomeraseaktivitätsbestimmung wird zunächst
jeweils eine Probestammlösung nach folgender Rezeptur angesetzt:
Probe-Stammlösung
0,1 m MgSO4^H2O
0,01 in CoCl2*6H2O
1,0 m Phosphatpuffer (pH 7,5) Wasserfreie D-Glucose
Destilliertes Wasser
Rest zum Auffüllen auf ein Gesamtvolumen von 7»5 ml.
Das Enzympräparat, dessen Aktivität bestimmt werden soll, wird zunächst so weit verdünnt, daß es 1 bis 6 IGIU/ml enthält.
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Dann führt man eine enzymatische Isomerisierung durch, indem
man 3 ml der Probe—Stammlösung mit 1 ml des verdünnten Enzyropräparats
versetzt und das Gemisch 30 Minuten bei 60 C bebrütet.
Am Ende der Inkubationsperiode wird eine 1 ml-Probe gezogen
und in 9«al 0,5-normaler Perchlorsäure "abgeschreckt". Die abgeschreckte
Probe wird dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zu Vergleichszwecken wird jeweils auf analoge Weise
ein Blindversuch durchgeführt, wobei statt 1 ml der zu
untersuchenden Enzympräparatlösung 1 ml Wasser am Beginn der Bebrütungszeit zugegeben wird. Der Ketosegehalt \,rird dann nach
der Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Wie vorstehend bereits
erv;ähnt, wird die nach dieser Methode bestimmte Aktivität in IGIU angegeben, wobei eine IGIU als diejenige Enzymaktivität
definiert ist, die erforderlich ist, um unter den vorstehend beschriebenen Isomerisierungsbedingungen ein Mikromol
Fructose pro Minute zu erzeugen.
"Lysozym" (EC 3.2.1.17) ist ein Enzym, das ß-1,4-Bindungen
zwischen N-Acetylmuraminsäure (oder 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucose)
und 2-Acetamido-2-desoxy-D-glucoseresten in Hucopolysacchariden,
Mucopolypeptiden oder in Chitin hydrolysiert. Lysozym wird in der Regel aus Eiweiß erzeugt. Es katalysiert
die Hydrolyse (Lyse) der Zellwände vieler Mikroorganismen.
Die erfindungsgemäßen, im wesentlichen wasserlöslichen,stabilisierten
Enzymkonzentrate sind Enzymkonzentrate aus
1) einer zellfreien Glucoseisomerase, die im wesentlichen frei
von Nucleinsäure ist, und
2) einem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz. Die Enzymkonzentrate sind dadurch gekennzeichnet, daß sie
a) einen Proteingehalt von etwa 50 bis 80 und vorzugsweise
60 bis etwa 75 Gew.—^i, bezogen auf Trockensubstanz,
b) einen Mg -Gehalt von etwa 3 bis k5 und vorzugsweise etwa
5 bis 25 mg Mg pro inl Enzymkonzentrat,
c) ein Mg++/Protein-Verhältnis von etwa 0,02 bis 0,75 und
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vorzugsweise etwa 0,03 bis 0,5»
d) eine spezifische Isomeraaeaktivität von mindestens etwa 10,
vorzugsweise mindestens etwa 12 und insbesondere mindestens et v/a 13 IGIU/mg Protein,
e) einen Gehalt an einem wassermischbaren Lösungsmittel von etwa 5 bis 25 und vorzugsweise 10 bis etwa 20 Gew.-% und
f) eine Stabilität besitzen, die so hoch ist, daß bei bis zu
30-tägiger Lagerung bei 26 C bis zu 95 /^ und bei bis zu
einjähriger Lagerung bei 18 C bis zu 80-10 "/>
der anfänglichen Isomeraseaktivität erhalten bleiben.
Die stabilisierten Enzymkonzentrate besitzen eine Aktivität von mindestens etwa 5000, vorzugsweise mindestens etwa 8000und insbesondere
mindestens etwa 10 COO IGIU pro g Trockensubstanz.
Die erfindungsgemäßen stabilisierten Snzymkonzentrate sind aufgrund
des Verfahrens, nach dem sie erfindungsgemäß hergestellt werden, im wesentlichen frei von Nucleinsäuren, wie Ribonucleinsäure
(RNA) und Desoxyribonucleinsäure (DNA).
Die stabilisierten Enzymkonzentrate weisen, wenn sie in flüssiger
Form vorliegen, in der Regel eine Magnesiummolarität in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 2 und vorzugsweise etwa 0,2 bis
1,0 Mol Magnesium pro Liter auf.
Die Enzymkonzentrate liegen zwar in der Regel in flüssiger Form vor, können jedoch zu einem Feststoff getrocknet oder mit
Fasser und anderen Materialien verdünnt werden. Die bevorzugten Enzymkonzentrate weisen einen Feuchtigkeits- bzw. Wassergehalt
von etwa 50 bis SO und insbesondere etwa 55 bis 70 r/o auf.
Der Trockonsubstanzgehalt der Enzymkonzentrate liegt vorzugsweise
in einem Bereich von etwa 5 bis 30 und insbesondere etwa 20 bis 30 Ggw.-Jö.
Besonders bevorzugte stabilisierte erflndungsgemäße Enzymkonzentrate
enthalten keinerlei zugesetztes Kobalt. Die darin enthaltene Glucoseisomerase stammt vorzugsweise von einem Mikroorganismus
der Genus Streptomyces und insbesondere von Mikro-
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--rf.
Organismen der zur Spezies Streptomyces olivochromo^enes gehörenden
^_trep_tomyces_-Stümme ATCC Nr. 21 713» ATCC Nr. 21 71U
und ATCC Nr. 21 715 oder deren Varianten und Submutanten.
Die erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrate werden
vorzugsweise nach einem Verfahren hergestellt, bei dem
a) ein wäßriges, zellfreie Glucoseisomerase und ein wassermischbares
organisches Lösungsmittel enthaltendes Gemisch mit einem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz
in einer Menge behandelt wird, die ausreicht, um einen auf das Gesamtvolumen des Gemisches bezogenen Magnesiumsalzgehalt
von etwa 0,02 bis 0,3 Mol/Liter zu ergeben, wobei sich in dem Gemisch ein stabilisiertes Enzymkonzentrat
bildet, das aus einer Enzym/Magnesium-Fällung besteht, und
b) das ein Glucoseisomeraseenzym enthaltende stabilisierte Enzymkonzentrat gewonnen wird, das Magnesium in einer etwa
0,1 bis 2 Mol Mg entsprechenden Menge, Wasser und das wassermischbare organische Lösungsmittel enthält.
Das stabilisierte Enzymkonzentrat wird vorzugsweise hergestellt, indem man zuerst intrazellulare Glwcoseisomerase enthaltende
Zellen ausreichend lange mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel und einem lytischen Enzympräparat, z.B. einem
aus Eiweiß stammenden Lysozympräparat, behandelt, damit ein Abbau des Zellmaterials erreicht wird und die Glucoseisomerase
aus den Zellen in Lösung übergehen kann» Dann werden die ZeIltrümmcr
und Nucleinsäuren, beispielsweise durch Zentrifugieren, abgetrennt, wobei eine die zellfreie Glucoseisomerase, das
wassermischbare organische Lösungsmittel und Wasser enthaltende Lösung zurückbleibt.
Als wassermischbares organisches Lösungsmittel wird in der Praxis vorzugsweise eine organische Flüssigkeit oder ein Gemisch
organischer Flüssigkeiten mit einer Wassorlöslichkeit bei Raumtemperatur von mindestens 30 und insbesondere mindestens
etwa hO rJa verwendet. Das wassermischbare organische Lösungsmittel
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sollte so gewählt werden, daß es die Löslichkeit von Proteinen
und Nucleinsäuren in wäßrigen Lösungen senkt. Typische Tür die Zwecke der Erfindung geeignete wassermischbare organische
Lösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol,
Propan-2-ol, t-Butylalkohol, Aceton und p-Dioxan.
Besonders bevorzugt ist Propan-2-ol.
Das wasscrmischbare organische Lösungsmittel wird beim Verfahren
der Erfindung in der Regel in einer Menge verwendet, die ausreicht,
um einen Lösungsmittelgehalt von mindestens etwa 3O und vorzugsweise mindestens etwa ^O Gew.— °//>
im wäßrigen Gemisch zu erreichen. Die verwendete Lösungsmittelinengs sollte
jedoch so gewählt werden, daß dadurch oin wesentlicher Teil der Nicht-Isomeraseproteinmaterialien und der Nucleinsäuren,
wie Eibonuclcinsüure (RNA) und Desoxyribonukleinsäure (DNA)
vor der Salzzugabe aus der Lösung ausgefällt wird. Der Höchstgehalt an Lösungsmittel schwankt natürlich in Abhängigkeit
davon, welches Lösungsmittel im Einzelfall angewendet wird. Allgemein gesagt, stellen 6O % für die meisten Lösungsmittel,
die für die Zwecke der Erfindung in Betracht kommen, die obere Grenze dar. Wenn Propan-2-ol als wassermischbarcs organisches
Lösungsmittel vorwendet wird, enthält die wäßrige Lösung der
zellfreien Glucoseisomerase typischerweise etwa 40 bis k? und
vorzugsweise ^2-1 Gew.-$ Lösungsmittel.
Das wassermischbare organische Lösungsmittel dient mehreren
verschiedenen Zwecken. Es dient nämlich als Schutz- bzw. Konservierungsmittel für das Enzym während der Verarbeitung (und,
wenn es nicht vollständig abgetrennt wird, auch während der Lagerung) und vermindert außerdem die Löslichkeit des
Enzyms während der Salzzugabe. Weiterhin bewirkt es eine Ausfällung der Nucleinsäuren und anderer Nicht-Isomoraseproteinmaterialien
aus der solubilisierten Glucoseisomerase voider Behandlung mit den im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz.
Man kann somit schon durch die Vorwendung dos wassermischbaren
organischen Lösungsmittels allein eine konücntricrtera
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und reinere Isomerase erhalten.
Hinsichtlich Zeitpunkt und Art der Zugabe des wassermischbaren
organischen Lösungsmittels zur zellfreie Glucoseisoinerasc enthaltenden
Lösung gibt es verschiedene Möglichkeiten. Gsmäß
einer Ausführungsform des erfindungsgemüßen Verfahrens wird
zunächst eine zentrifugierte Paste aus intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden Zellen mit einem Teil des zu verwendenden
wassermischbaren Lösungsmittels behandelt. Die wäßrige Aufschlämmung aus Zellen und Lösungsmittel wird dann so behandelt,
daß die Isomerase aus den Zellen freigesetzt wird. Hierzu kann man die Zsllauf scblämmung beispielsweise beschallen, einer
Gefrier-Auftau-Behandlung oder einer Behandlung mit Netzmitteln
und/oder lytischen Enzympräparaten, wie Lysozym, unterwerfen.
Wenn das Enzym aus den Zellen freigesetzt worden ist, wird der Lösung weiteres Lösungsmittel zugesetzt, und zwai" so lange bzw.
so viel, bis bzw. daß Nucleinsäuren und andere Proteine ausfallen,
das Isomeraseenzym jedoch löslich bzw, gelöst bleibt.
Danfi werden die Zelltriimmer und die ausgefällten Ballaststoffe
abgetrennt. Hierauf τ/ird das im wesentlichen wasserlösliche
Magnesiumsalz zugegeben, um einen Niederschlag des stabilisierten Enzyndconzentrats zu erzeugen.
Bei einer anderen Arbeitsweise bzw. Ausführungsform wird praktisch
die gesamte einzusetzende Lösungsmittelmenge der glucoseisomerasehaltigen
Zellpaste zugesetzt. Nach dieser Arbeitsweise wird also die durch Zentrifugieren einer intrazellulare GIucoseisomorasc
enthaltende Zellen enthaltenden Kulturbrühe
erhaltene Zellpaste mit Wasser und der Gesamtmenge des einzusetzenden, wassermischbaren organischen Lösungsmittels behandelt,
so daß man eine Zellaufschlämmung in einem Lösungsmittel/
Wasser-Gemisch erhält. Die das wassermischbare organische Lösungsmittel enthaltende Aufschlämmung wird dann einer Behandlung
unterworfen, durch die die Glucoseisomerase aus den Zollen freigesetzt wird. Nach der Abtrennung des unlöslichen
Materials, das die Zelltrümmcr und Nucleinsäuren umfaßt, wird die zellfroio Glucoseisomerase, Lösungsmittel und Wasser ent-
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haltende geklärte Lösung mit dem im wesentlichen wasserlöslichen
Magncsiumsalz behandelt, um das stabilisierte Enzymkonzentrat
auszufällen,
Die Temperatur- und pH-Wcrtbodingungcn sollten während des Verfahrens
selbstverständlich so gewählt werden, daß das Enzym
nicht inaktiviert wird. In der Regel sollte der pH-Wert während aller Verfahrensstufon in einem Bereich von etwa 6 bis 9 und
insbesondere zwischen 7 und J,5 liegen. Die Temperatur kann
zweckmäßigerveise in einem Boreich von etwa 5 bis 55* vorzugsweise
15 bis etwa 35 und insbesondere 25 bis 30 C liegen.
Als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiunisalz wird beir.i
Verfahren der Erfindung vorzugsweise ein Salz verwendet, das bei Raumtemperatur in Wasser in einer Konzentration von etwa. 0,02
bis 2 Mol/Liter im v/e sent liehen löslich ist. Typische geeignete
Magnesiumsalze sind beispielsweise Magnesiumchlorid, -bromid, —nitrat, —sulfatheptahydrat, —acetat und —Iac tat. Vorzugsweise
verwendet man Magnesiumchlorid und insbesondere Magnesiumsulfat (wenn in dieser Beschreibung Magnesiumsulfat erwähnt wird, so
ist damit stets die Heptahydratform gemeint).
Die beim Verfahren der Erfindung verwendete Menge an im wesentlichen
wasserlöslichen Magnesiumsalz sollte zumindest so hoch gewählt werden, daß die die wäßrige Aufschlämmung des wasserlöslichen
organischen Lösungsmittels und der zellfreien Glucoseisomerase enthaltende Flüssigkeit bezüglich ihres Magnesiumionengohalts
mindestens etwa 0,02-molar ist. Die obere Grenze der Magnesiumsalzkonzentration schwankt in Abhängigkeit von
dem jeweils verwendeten Salz. Man sollte nicht so viel Magnesiumsalz zusetzen, daß ein totaler "Aussalzeffekt" oder eine
Salz-Wasser-Phasentrennung auftritt. Allgemein gesagt liegt die Höchstmenge an Magnesiumsalz in der Lösung bei etwa 0,3 Mol/
Liter. Vorzugsweise sollte die Magncsiumsalzkonzentration in
der Lösung in einem Bereich von etwa 0,02 bis etwa 0,2 Mol Magnesium!
orien/Li tor liegen. Die besten Ergebnisse erzielt man, wie gefunden wurde, wenn man das Magnesiumsalz in einer Menge
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zusetzt, dio eine Magnesiumioncnkonzentration in der Lösung
von etwa 0,05 Mol/Liter ergibt.
Die intrazellulare Glucoseisomerase, aus der die stabilisierten
Enzymkonzenträte der Erfindung hergestellt werden, kann aus
jedem geeigneten Mikroorganismus gewonnen werden, der Glucoseisomerase
erzeugen kann. Beispiele geeigneterMikroorganismen sind Mikroorganismenstümrne der Gattungen Streptomyces, Bacillus,
Arthrobacter, Actinoplancs , C u.r t ob ac t er i um und, andere. Spezielle,
besonders zur Herstellung bzw. Erzeugung des intrazellularen Glucoseisomerase—Enzymausgangsrnaterials geeignete
Hikroorganismenstümmo bzw. -arten sind u.a. Streptomyces
fradiao, Strcptoniyces pliaeocliromogenes, Streptomyces albu.3
ATCC Nr. 21 132, Streptomyces wedmorensis ATCC Nr. 21 230
(die beiden letztgenannten Stämme sind in der US—Patentschrift
3 6i6 221 beschrieben), Streptomyces rubiginosus ATCC Nr. 21
und ATCC Nr. 21 176 (vgl. die US-Patentschriften 3 666 628 und
3 788 9k5) j Streptomyces olivaceus NRRL 3583 (vgl. US-Patentschrift
*3 625 828), Streptomyces olivaceus NIiRL 3916 (vgl.
GB-Pat ent schrift 1 376 787), Streptomyces olivochromo genes
ATCC Nr. 21 11U (vgl. die US-Patentschriften 3 622 h6j und
3 77O 589), Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr. 21 713,
21 71U und 21 715 (vgl. US-Patentschrift 3 8I8 318), Streptomyces venezuelae
ATCC Nr. 21 113 (vgl. US-Patentschrift
3 622 ^63)t Streptomyces glaucescens (vgl. GB-Patentschrift
1 -'HO 579)» Streptomyces violaceoniger (vgl. DT-OS 2 fH 7 6^2),
Arthrobacter noν s£ NRRL B-372^,NRRLB-3725, NRRL B-3726,
NRRL B-3727 und NRRL B-3728 (vgl. US-Patentschrift 3 6^5 848),
Bacillus Stearothermophilus ATCC Nr. 21 365, NRRL B-368O,
NRRL B-3681 und NRRL B-3682 (vgl. US-Patentschrift 3 826 71k),
Lac tobaci1Ius brevis, Bacillus coagulans t NRRL Nrn. 56Ί9 bis
5666 und insbesondere NRRL Nr. 565Ο (vgl. DT-OS 2 4θΟ 323),
Actinoplanes missouriensis NRRL B-33^2, Actinoplanes philippinesis
ATCC Nr. 12 ^27, Actinoplanes armen!acus ATCC Nr. 15 676 und
Actinoplanes sp ATCC 23 3^2 (vgl. US-Patentschrift 3 83*1 988),
Aerobacter lcvanicum NRRL B-1678 (vgl. US-Patentschrift
3 813 32Ό), Nocardia asteroides ATCC Nr. 21 S1O t Nocardia dasson-
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• a«.
vi 11 ei ATGC 21 9'lzl·, Micromonospora coerula ATCC Nr. 21 9^5,
Micobispora rosoa ATCC Nr. 21 9't6 und Microellobospora flavea
ATCC Nr. 21 9'47 (vgl. US-Patentschrift 3 829 362), sowie
Curtobac torümi (vgl. japanische Patentanmeldung 50/132176 (i975))·
Als Ausgangsmaterialien für das Verfahren der Erfindung bzw.
die erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate besonders zweckmäßig und bevorzugt sind die Glucoseiscmerase-Enzyme, die von Mikroorganismen
der Streptomyces olivochromo^enes ATCC Nr. 21 713»
ATCC Nr. 21 71*1 und ATCC Nr. 21 715, wobei der letztgenannte Stamm
ein Einzelkolonioisolat aus dem Stamm ATCC Nr. 21 713 ist (vgl. US-Patentschrift 3 813 318 und die US-Patentanmeldung Nr.
5S9 115 vom 23. Juni 1975 )·>
stammen, und zwar insbesondere dann, wenn sie nach dem in der US-Patentschrift 3 770 539 beschriebenen
und beanspruchten Weise hergestellt worden sind.
Das intrazellulare Glucoseisomerass enthaltende Enzym wird vorzugsweise
hergestellt, indem man einen Glucoseisomerase erzeugenden Mikroorganismus, wie einen dsr vorstehend erwähnten
Mikroorganismenstämme, in einem ge-eigneten Kulturmedium, das
eine geeignete Kohlenstoffquelle und andere entsprechende Nährstoffe
enthält, kultiviert und das Enzym sich dabei bilden läßt.
Beispielsweise stellt man zunächst eine Impfkultur eines Glucoseisomerase
erzeugenden Stammes, z.B. auf einer Agar-Platte, her und beimpft damit ein geeignetes Kulturmedium. Dann läßt man
den Mikroorganismus wachsen und das intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Enzym (nachstehend kurz "infcracellulare
Glucoseisomerase") erzeugen. Die Inkubationsdauer kann je nachdem, welcher spezielle Mikroorganismus auf welchem Kulturmedium
jeweils gerade verwendet wird, innerhalb eines breiten Bereiches schwanken und liegt vorzugsweise zwischen k und hS Stunden.
Dann wird eine Teilmenge der auf diese Weise erhaltenen Impfkultu.r
dazu verwendet, ein, geeignetes Kulturmedium in einer oder mehreren Entwicklungsstufen zu beimpfen, worauf das Inoculum
aus der letzten Entwicklungsstufe zum Beimpfen eines geeigneten
Kulturmediums in einem (Produktions-)Fermentor verwendet wird.
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Die die intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Kultur—
brühe kann nach jeder beliebigen geeigneten Methode gewonnen und konzentriert werden, z.B. durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren«
Die Zallpaste aus intrazellulare Glucoseisomeraso enthaltenden
Zellen liegt dann in zur weiteren Aufarbeitung nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren geeigneter Form vor.
Dio Beispiele erläutern die Erfindung und sind keinesfalls als
BesciirLinkung zu verstehen. Es sei darauf hingewiesen, daß sich
Angaben in Teilen jeweils auf das Gewicht beziehen, wenn nichts anderes angegeben ist. Die in den Beispielen angegebenen Glucoseisomeraseaktivitäten
wurden nach der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt und sind jeweils in IGIU angegeben.
Beispiel 1
a) Herstellung intracellularer Glucoseisomerase
Die zur Herstellung des stabilisierten Enzyrnkonzentrats verwendete
intrazellulare Glucoseisomerase wurde in vier mit 1 Liter fassenden
Schuttel-Kolben beginnenden und bis zu 3785,4 Liter fassenden
Impfkultur-Tanks führenden Impfkuibur-Entwicklungsstuf en, sowie
einer abschließenden Produktionsstufe in 75 703 Liter fassenden
Fermentoren hergestellt. Jede der aufeinanderfolgenden Entwicklungsstufen
und die Fermentoren der Produktionsstufe wurden jeweils mit einer 5 VoI.-^ des Fassungsvermögens des beimpften
Fermentationsgefäßes entsprechenden Impfkulturmenge angeimpft.
Die Zusammensetzung der Kulturmedien für die Impfkultur-Entwicklung und die Produktionsstufe sind aus der nachfolgenden
Tabelle I zu ersehen. Die Kulturmedien für alle Stufen wurden jeweils 30 Minuten bei 120 C sterilisiert. Die Fermentations- bzw.
Bebrütungszeiten bei der Itnpfkul tür -Ent wick lung betrugen 48 Std.
für die erste Stufe, 2** Std. für die zweite Stufe, 22 Std. für
die dritte Stufe und 15 bis 17 Std. für die vierte Stufe. In der ersten Stufe wurde das Kulturmedium mit Zellen eines Sporen
bildenden Mikroorganismcnmutantenstamms, der als Streptomyces
olivochromo^onos ATCC Nr. 21 715 (ein Einzelkolonieisolat aus
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dem Stamm ATCC Nr. 21 713, vgl. die US-Patentschrift 3 813 318,
auf deren Inhalt hiermit Bezug genommen wird) versetzt bzw. angeimpft. Die vier Impfkultur-Entwicklungsstufen wurden jeweils
bei einer Temperatur von 28 C und einem pH-lv'ort von
7,0 durchgeführt, der vor dem Sterilisieren mit 10-normaler
Natronlauge eingestellt wurde.
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I | 2712007 | Inoculum-Entwicklung/Medium-ZusammensetzunK | Entwick | Kulturmedium | Gew | 0' | 6 | Menge | Arbeitsvo | |
lungsstufe | 0 | lumen | ||||||||
1. Stufe | Mai squellwas s er | 05 | ||||||||
- QSi - | (Drei 1-Li | (Code E801) | 3, | 7,2 | g 200 ml | |||||
ter Schüt— lelkolben) |
Mai s s irup-Fe ststoffe mit DE 15 |
1» | 2,0 | S " " | ||||||
Tabelle | Magnesiumsulfat · 7H_0 | o, | —— | 0,7 | g " " | |||||
Antischaummittel | ||||||||||
("HODAG 2000" = PoIy- | ||||||||||
propylenglyc öl) | —— | 0,07 | ml " " |
Stufe
(14 Liter
fassender
J3erich-Fermentator)
(14 Liter
fassender
J3erich-Fermentator)
Maisquellwasser
(Code E801) 3,6
Maissirup-Feststoffe
mit DE 15 .2,0
Magnesiumsulfat · 7HpO 0,05
Antischaummittel ("HODAG 2000" = PoIypropylenglycol)
-—-271 S 9 Liter
180 g 4;5 ε
1,3ml "
3. Stufe Maisquellwasser (ca.190 Ltr.(Code E 801)
fassender _... , f„ . o„„_\
_ n Starke (Code 3005) Inoculum- v ^ J'
Tank)
Magnesiumsulfat · 7H„C
Antischaummittel ("HODAG 2000" = PoIypropylenglycol)
3,6 5,V
2,0 3,04 " "
0,05 75,75 e "
51 ml »
151 ,ZH-Ltr.
Ί . Stufe Maisquolli/asser
(ca. 3äX>Li-(Code E801)
tor fassen- _. . /„ , ~nn-, \
, T _. . Dextrose (Code 2001 )
der Impfkul- v ' tur-Tank) Magnesiumsulfat · 7H_0
Antischaummittel ("HODAG 2000" = PoIypropylenglyc
öl)
3,6 108,86kg 3028,25 Ltr.
2,0 60,33 " " "
0,05 1,^97" " "
1 Liter " "
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In der zweiten, dritten und vierten Impfkultur-Entwicklungsstufe
wurde der Inhalt der Kolben bzw. Tanks während der Fermentation jeweils belüftet und gerührt.
ζ Die aböcJbließende Produktionsfermentation wurde in ca. 75 m
fassenden Fermentatoren durchgeführt. Die Kulturmediuiningro—
dienzien (außer der Xylose und der Dextrose) wurden in 52 996
Litern Kondensat angesetzt. Dann wurde das Kulturmedium auf
etwa 60 C erhitzt und sein pH-Wert mit Natriumcarbonatlösung mit einer Dichte von 16 Baume auf 5f6 bis 5»8 eingestellt.
Vor der Einstellung wurde die Kulturbrühe erhitzt, um das bei der Natriumcarbonatzugabe en.tvicko.lte Kohlendioxyd abzutreiben.
TsTach der Einstellung des ρΚ-1/erts wurde dom Kulturmedium
das Antischaummittel zugesetzt und der Fermentorinhalt dann 30 Minuten bei 12O°C sterilisiert, worauf es wieder auf
60 C abgekühlt wurde. Die Zucker, Xylose und Dextrose, wurden
in dem ca. 3300Litor fassenden Impfkulturtank in 151^ Litern
Kondensat angesetzt. Die Zuckerlösung wurde 30 Minuten bei
120 C sterilisiert und nach dem Herunterkühlen mittels eines Inoculunischlauchs in den Produktionsfermentor überführt. Nach
der Zugabe der Zucker wurde die Temperatur des Fermentors beim Betriebswort von 32 C stabilisiert, worauf der Fermentor
mit der Impfkultur angeimpft wurde. Ab der 20. Stunde nach dem Animpfen wurden alle zwei Stunden Proben aus der Fermentorkulturbrühe
gezogen und auf ihre Isomeraseaktivität, das Zellengewicht, den Gehalt an reduzierenden Zuckern und den Gesamtkohlenhydratgehalt
analysiert. Die Fermentation wurde als vollendet angesehen, wenn die Erzeugung von Isomsraseenzym das
Maximum überschritten hatte. Während der Fermentation wurde der pH-Wert durch automatische oder manuelle Zufuhr von vorsterilisiertem
Ammonialegas durch die Fermentorlufteinblasleitungen
so eingestellt, daß er nicht unter 5 »4 bis 5,6 fiel. Die Mediumzusammensetzung
und die Betriebsparameter bzw. -bedingungen für die Fermentation im ca. 75m Produktions-Fermentor, die bereits
in den US-Patentschriften 3 770 589 und 3 813 318 beschrieben
worden sind, sind in der nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.
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Menge in | 2 600,44 | |
Gew.-:£ | 1 625,22 | |
4,0 | 130,18 | |
2,5 | 649,99 | |
0,2 | 64,86 | |
1,0 | 130,18 | |
0,1 | 32,66 | |
0,2 | ||
0,05 |
7.
Mediumansatzrezeptur für 75 m fassende Fermentoren
Mediumansatzrezeptur für 75 m fassende Fermentoren
Mediumansatzvolumen - 64 352 Liter
Mediumkoraponenten
Maisquellwasser (Code E801) Stärke (Code 3OO5)
Dextrose (Code 2001) Xylose Glycin Ammoniumni trat
Magnesiumsulfat Antischaummittel ("HODAG 2000" =
Polypropylenglycol) 20,82 bis 22,71 Ltr.
Natriumbicarbonat
(vor dem Sterilisieren zugesetzt, um den pH-Wert auf 5,8 bis
6,0 einzustellen)
Endvolumen: 68 137,4 Liter
Betriebstemperatur: 31°C
Weder während der Impfkultur-Entwicklungsstufen noch während
der Produktions-Fermentation wurde Kobalt zugesetzt.
Die aus der Kulturbrühe gewonnene intrazellulare Glucoseisomerase
besr.ß eine Aktivität von 19,5 IGIU/ml. Zur Herstellung des
stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats wurde eine
Teilmenge von 8 857,9 Litern der Kulturbrühe verwendet. Ein anderer Teil der Kulturbrühe wurde in Form ganzer Zellen unter Verwendung von Mg(0H)o, Filterhilfe (Sil-Flo 332) und Propan-2-ol gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen ganzen Zellen wurden dann zur enzymatisehen Umwandlung von Glucose in Fructose in einem Chargenkonvertor verwendet.
stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrats wurde eine
Teilmenge von 8 857,9 Litern der Kulturbrühe verwendet. Ein anderer Teil der Kulturbrühe wurde in Form ganzer Zellen unter Verwendung von Mg(0H)o, Filterhilfe (Sil-Flo 332) und Propan-2-ol gewonnen. Die auf diese Weise gewonnenen ganzen Zellen wurden dann zur enzymatisehen Umwandlung von Glucose in Fructose in einem Chargenkonvertor verwendet.
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b) Herstellung von stabilisiertem Glucosexsomerase— Enzyrokonzentrat
8857,9 Liter wie vorstehend .beschrieben im Produktionsfermentor
hergestellter intrazellularer Glucoseisomerase-Kulturbrühe mit
einer- spezifischen Aktivität von 19»5 IGIU/ml, entsprechend
einer Gesamtisomeraseaktivität von 173 X 10 IGIU, wurden in
einer Feststoffe ausstoßenden Zentrifuge (DeLaval BRPX-2O7)
verarbeitet. Die Zentrifuge wurde mit einer Zufuhrgeschwindigkeit von 18,93 Litern/Minute und einem 2-Minuten-Schußzyklus
gespeist. Unmittelbar vor und nach dem Schüsselschuß wurde jeweils eine Sekunde Wasch- und Spülwasser (wash and prime
water) zugeführt. Die Zellpaste aus dem Schußauslaß der Zentrifuge, insgesamt 917»6 kg mit einer Xsomoraseaktivität von
187 IGIU/g, wurde mit 75,7 Litern Wasser in einen ca. 850 Liter
fassenden Tank mit rundern Boden gegeben. Wenn 29^,8 bis "}17,5 kg
Zellpaste gesammelt waren, wurde diese jeweils mit 3 g eines
Lysozym-Enzympräparats, ein von der Fa. Miles-Sera vac hergestelltes,
aus Eiweiß stammendes, zweimal kristallines, gefriergetrocknetes Pulver mit einer Aktivität von 23 300 Einheiten/mg,
behandelt bzw. versetzt, um den Abbau der Zellwände und damit die Freisetzung der intrazellularen Glucosexsomerase
in löslicher Form in Gang zu setzen. Der Zellpaste wurde eine 85 Vol.-^-ige, wäßrige Propan-2-ol-Lösung in einer Menge von
21,2 Litern Lösung auf h^>t"}6 kg Zellpaste, zugesetzt. Dann
wurde das Gemisch mit weiteren 4i,64 Litern der wäßrigen
Propan-2-ol-Lösung versetzt, um den Alkoholgehalt der Flüssigkeit auf 30 YoI.-fo zu bringen. Das so erhaltene Zsllpaste-Propan-2-ol-Wasser-Gemisch
wurde dann in einen ca. 3800 Liter fassenden Abbautank gepumpt, worauf man den Zellwandabbau
2k Std. ablaufen ließ. Die Temperatur der Flüssigkeit im Zellabbautank wurde bei etwa 26°C gehalten. Nach Zh Std. wurde
dem Gemisch soviel 85 Vol-^ige Propan-2-ol-Lösung zugesetzt,
daß sein Propan-2-ol-Gehalt auf 52 Vol.-°/o gebracht wurde,
d.h. auf eine Propan-2-ol-Koiizentration, bei der die Nucleinsäuren,
wie Ribonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure, im wesentlichen unlöslich sind, während das Enzyrnproteinmaterial
löslich ist. Auf einem Vakuumrotationsfiltor wurden zur Vorbe—
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schichtung 90,7 kg Filterhilfg (Dicalite '420O) angeschwemmt.
Nach der Vorbeschichtung wurde dem in der angeschwemmten Filterhilfoschicht
enthaltenen Wasser soviel Propan-2-ol zugesetzt,
daß der Alkoholgehalt auf etwa $2 Vol.-"a gebracht wurde, um
die Nucleinsäuren in unlöslicher Form zu halten bzw., anders
gesagt, um eine Lösung der Nucleinsäuren zu verhindern. Bei diesem Rotationsfilter wurde kein Waschwasser verwendet,
sondern nach beendeter Filtration des Zellpastenbreies das Vorbeschichtungsanschwemm-Tiasser/Alkohol-Gemisch durch den
Filter geschickt. Der im Vorbsschichtungsfilterbett verbleibende Zeilpastenbrei wurde zu einem Nutschenfilter gepumpt,
um den Enzymverlust so gering wie möglich zu halten. Beim Filtrieren auf dem Nutschenfilter wurde Dicalite 4.200 zugesatzt.
Die Filtrate aus dem Anschwemm-Rotationsfilter und dem Nutschenfilter
wurden jeweils in einen als Lager- bzw. Vorratstank für die Beschickung eines Beschickungstanks dienenden ca. 3800 Liter
fassenden Tank gepumpt, in dem 56,8 Liter 1,0-molare Magnosiumsulfat-(MgSO2
·TH-O)-Lösung und ^9,2 Liter 85 Vol.-?i-iger Propan-2-ol
zugesetzt -wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde mit einer Geechwindigkeit von 62,8 Litern/Minute in einem 5-Minuten-Schußzyklus
einer Zentrifuge (DeLaval BRPX-207) zugeführt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Schüssel durch fünf aufeinanderfolgende,
jeweils eine Sekunde dauernde Spülwasserzufuhren und Schüsse gespült. Der in der Schüssel und der Schuflkammer
verbleibende, das stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende Rückstand wurde ausgekratzt, worauf die Schüssel und
die Kammer mit etwas leichter Ablaufphase aus der Zentrifuge
gewaschen wurden. Sowohl der Rückstand als auch das Waschwasser gingen in das stabilisierte Enzymkonzentratprodukt. Das Produkt
wurde mit einem Laborroischer gerührt und in ca. 3,8 Liter fassende
Plastikbehälter zur Auswertung und zum weiteren Gebrauch zur
enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose abgefüllt. Die Gesamtausbeutc an stabilisiertem Glucoseisomerase-Enzymkonzentrat
(Ansatz 1) betrug 'H,6h Liter konzentrierte Flüssigkeit,
die eine Aktivität von insgesamt 109 X 10 IGIU, entsprechend einer Isomoraseaktivitüt von etwa 11 2Ö1 IGIU/g Trockensubstanz
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enthielt. Dies entsprach einer Aktivitätsausboute von 63 f0 der
in der als Aus^angsinaterial verwendeten, ganze Zellen enthaltenden
Kulturbrühe enthaltenen Gesamtalctivitüt. Eine vollständigere
Übersicht über die Analyscnkermvorte dos stabilisierten
Enzymkonzentrats ist der nachstehenden Tabelle III zu entnehmen.
Analysenkennwerte des stabilisierten Glucoseisomcrase-Enzym
konzentrats
Ansatz Nr. 1
Isomerasealctivität
(TGTU/S T.S.) 11 26l
Spezifische Aktivität
TlGIU/mg Protein) 15,1
Trockensubstanzgehalt (Gev.-fn) 22,2
Wassergehalt nach Karl Fischer (Gew. -?ί) 63,8
Froteingehalt nach Kjeldahl (Gew.-Jo,
bezogen auf T. S.) 74,7
Aschegehalt als (Gew.-^, bez. auf T.S.) 11,4
Oxid
Unlösliche Trockensubstanz (Gew.-r/o,
Unlösliche Trockensubstanz (Gew.-r/o,
bez. auf T.S.) 5,3
Mg++-Gehalt (mg/ml) 5,8
Ilg++-Gehalt (Mol/Liter) 0,24
Mg++/Protein-Vorhältnis 0,035
Propan-2-olgehalt (Differenz) (Gev.-fo) 14
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Beispiel 2
Analog Beispiel 1 a) wurden unter Verwendung von 7»5 Liter,
^O Liter und ^OO Liter fassender Fermentatoren für die Impfkulturentwicklung
und eines 'tOOO Liter fassenden. Fermsntors
für die abschließende Produktionsstufe mehrere Chargen bzw.
Ansätze intrazellularer Glucoseisomerase aus Streptomyces
olivochromogenes ATCC Nr. 21 715 hergestellt. Nach der Fermentation
wurde die Temperatur der ganze Zellen intrazellularer Glucoseisoraerase enthaltenden Chargen bzw. Ansätze jeweils
von 32 auf 22 C herabgesetzt, um das weitere Hikrobenvachstum
und eventuelle Zellautolyse zu verzögern. Die Ansätze wurden dann zentrifugiert, um die Zellen zu einer Zcllpaste
zu konzentrieren. Die schwere Zeilpastenphase wurde in ca. 33 Liter
fassenden Eimern aufgefangen, gewogen und dann zum Zellabbau in einen ca.5300 Liter fassenden Abbautank gepumpt. Dort
wurde die Zellpaste unter Rühren mit dem auch in Beispiel 1 verwendeten Lysozym-Enzymprüparat versetzt, um'die Zellwcinde
abzubauen und die intrazellulare Glucoseisomerase in löslicher Form freizusetzen. Das Lysozym wurde den Ansätzen jeweils
in einer 6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden
Menge zugesetzt. Das in der Zellpaste enthaltene Gesamtzelitrockensubstanzgcwicht
wurde aus dem Zelltrockensubstanzgehalt der Fermentorkulturbrühe und dem Fermentorkulturbrühenvolumen
berechnet. Dieser Berechnung lag somit die Annahme zugrunde, daß die Zelltrockensubstanzausbeute bei der ersten Konzentrationsstufe
100 $ betragen hatte. Das Lysozym wurde der ZeIlpastc
nach dem Zentrifugieren der Gesamt-Kulturbrühe und vor der Zugabe von Alkohol zugesetzt. Nach der Zugabe des
Lysozyms wurde eine azcotrope, wäßrige Propan-2-ol-Lösung
in einer eine Propan-2-ol-Konzentration von ^2^1 Gew.-5* ergebenden
Menge zugesetzt. Die anfängliche Zugabe von Propan-2-ol wurde auf der Basis des Zellpastengewichts minus 8
</o für Unlösliches (t.S.) und der Qualität des zugesetzten Alkohols errechnet.
Nach der Sinstollung der Alkoholkonzentration wurde der
pll-¥ert des Lysats, d.h., der Zellpasten/Alkohol-Auf schlämmung
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mit vas s erfrei em Mononatriumphospliat (zur Verringerung des
pH) auf 7»O eingestellt. Das Mononatriumphosphat wurde in
2.50-g-Anteilen nach Bedarf zugesetzt. Um örtliche "Hitzenester"
zu vermeiden, vurde das Reagens vor der Zugabe in Wasser gelöst. Die Lysate wurden dann unter turbulentem Rühren b^i
einer Temperatur von 28 bis 30 C gehalten, bis das Enzym
1OO?'ig solubilisiert war. Der SolufeLlisierungsgrad vurde durch
eine Vergleichsenzymanalyse einer ganzen Lysatprobe und eines Teils der gleichen Probe, aus dem die Zellfeststoffe durch
Zentrifugieren abgetrennt worden waren, bestimmt.
Am Ende der Abbauperiode vurde dia Alkoholkonzentration im Lysat
nachgeprüft und auf den Sollwert von h2 - 1 c/o eingestellt. Dann
vurden die Zelltrümmer aus dem Lysat unter Verwendung eines Anschwemmfilters abgetrennt, der mit einer in 44-bis 46-^igen
wäßrigen Propan—2—öl—Lösung aufgeschlämmten Diatomeenerde—Filterhilfe
(wahlweise Dicalite 4200 und Dicalite Speedflov, wie weiter unten angegeben) beschichtet bzw. angeschwemmt worden war.
Beim Anschwemmen wurde also mit einem etwas über 42 - 1 fj liegenden
Alkoholgehalt gearbeitet, um den infolge von Entspannungsverdampfung im Inneren des Vakuum-Anschwemmfilters auftretenden
Alkoholverlusten Rechnung zu tragen. Das abgebaute Lysat wurde wie es war, d.h. mit einem pH-Wert von 7»0 - 0,3 und
bei einer Temperatur von 28 bis 30 filtriert. Dia vom Anschwemmfilter
abgezogenen Filtrate wurden einem ca.1 3800 Liter
fassenden Tank zugeführt, der als Vorratstank für die Ausfällungsstufe verwendet wurde.
Bei vier Ansätzen wurde die Ausfällung chargenweise unter Verwendung
eines Vorratstanks als Ausfällgefäß durchgeführt. Die geklärten Filtrate wurden jeweils in Chargen von etwa
643» 5 Litern im Tank vorgelegt. Dann wurden pro Liter geklärtem
Lysat jeweils 0,05 Liter 1,0-molare Magnesiumsulfatlösung und
so viel a-iootrope Propan-2-ol-Lösung zugesetzt, daß der Gesamtgehalt
an Propan-2-ol bei etwa 42 Gew.-^ gehalten wurde.
Während der Zugabe wurde die Lösung jeweils gerührt und mittels
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einer Einspeisnumpe umgepumpt, um die Durchini se hung zu erleichtern.
Der Enzymniederschlag wurde 10 bis 15 Minuten ruhengelassen,
damit er sich zu größeren Flocken agglomerieren konnte, und dann mittels einer Zentrifuge (DoLaval BRPX-2O7) abgetrennt.
Die Lösung wurde der Zentrifuge mit einer Goschwindigkeit von
6 bis 10 g/Minute zugeführt und die Schale während jeder Charge zweimal geschossen (entleert).
Bei einem Ansatz (Ansatz 1O) wurde die Fällung kontinuierlich
durchgeführt, wobei der Vorratstank als kontinuierlich arbeitender
Rührkesselreaktor (CSTR) benutzt wurde. Das geklärte Lysat
und die Magnesiumsulfatlösung wurden dabei in d3n Vorratstanlc
kontinuierlich durch ein Misch-T-Iiohr eindosiert. Der
Propan-2-ol-Gehalt des geklärten Lysats wurde auf kh bis kj Gew.-?£
eingestellt, um die Verdünnung durch die Magnesiumsulfatlösung
auszugleichen und so einen Alkoholgehalt von h2 ■- 1 c/o während
der Fällung einzuhalten. Der Zufluß von geklärtem Lysat wurde mittels eines DurchfluOreglers geregelt. Die 1,6-molare Magnesiumsulfatlösung
wurde mittels einer kleinen Membranpumpe in einer Menge von 0,05 Litern/Liter geklärtem Lysat zudosiert,
Zunächst wurden beide Lösungen so lange ohne Entnahme in den Vorratstank eingespeist, bis sich darin ein Volumen angesammelt
hatte, das bei den gegebenen Zuflußgeschwindigkeiten des geklärten
Lysats und der Magnesiumsulfatlösung einer Verweilzeit von 15 Minuten entsprach. Dann wurde damit begonnen, aus dem
Vorratstank das Gemisch mit der gleichen Geschwindigkeit abzuziehen und der Zentrifuge zuzuführen, mit der der Vorratstank
gespeist wurde. Die Zufuhrgeschwindigkeit zur Zentrifuge wurde
also, anders gesagt, so eingestellt, daß das Flüssigkeitsniveau im Vorratstank konstant blieb. Der Schale wurde alle
10 Minuten ein "Teilschuß·' verpaßt, indem der Schalenbetriebswasserdruck
vermindert wurde.
Nachdem die jeweiligen Ansätze vollständig zentrifugiert waren, wurde der Snzymräckstand von der Oberfläche der Zentrifuge
mit destilliertem Wasser entfernt und jeweils mit dem stabili-
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siorten Enzymkonzentratprodukt vereinigt. Die auf diese Weise gewonnenen stabilisierten En^ymkonzentrate wurden jeweils
gerührt, bis sie homogen waren, in Flaschen abgefüllt und bei ^0C gelagert.
gerührt, bis sie homogen waren, in Flaschen abgefüllt und bei ^0C gelagert.
Die Tabellen IV und V geben eine Zusammenfassung der in den
verschiedenen Verfahrensschritten jeweils erzielten Enzymausbeuten wieder. Tabelle V zeigt insbesondere eine vollständige Analyse der stabilisierten Enzymkonzentrate.
verschiedenen Verfahrensschritten jeweils erzielten Enzymausbeuten wieder. Tabelle V zeigt insbesondere eine vollständige Analyse der stabilisierten Enzymkonzentrate.
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T a. b e 1 1 ο
IV
Gesamte. | Analysenwerte | zur Gewinnung | Menge | (ic | s) Aktivität | ,3 | von stabilisiertem Enzym | Ly s at | Aktivität | Filtrat | Alct i vi tat | ,4 | |
Volumen | Kulturbrühe | Zollpaste | (IGIU Ar) | ,7 | (kff) | (IGIU/k) | Volumen | (IGIU/ml) | ,2 | ||||
Ansatz | (Liter) | Aktivität | 584, | 3 | 75 | ,7 | Menge | 40,8 | (Liter) | 32 | ,6 | ||
Nr. | 3190 | (IGIU /ff) | 578, | 4 | 79 | ,9 | ,2 | 42,8 | 1173,4(b | 29 | ,9 | ||
3065 | 15,1 | 602, | 7 | 84 | ,1 | 1167 | ,2 | 47,3 | 1362,6*b | • 24 | ,9 | ||
3125 | 18,8 | 658, | 1 | 89 | 1123 | ,8 | 40,4 | 1627,6^c | 24 | ||||
«*> 8 Crt |
3220 | 18,0 | 587, | 9 | 89 | 1124 | ,2 | 42,4 | 1618,1(c | 18 | |||
** 9 | 3200 | 18,5 | 1419 | ,8 | 1627,6vC | ||||||||
° (a α>ΐθ v |
16,Ο | 1105 | |||||||||||
IO _ Λ |
|||||||||||||
' Kontinuierliche Fällung
b^!lDicalite 4200" Filterhilfe verwendet
c)
'"Dicalite Speedflow" veriiendet
'"Dicalite Speedflow" veriiendet
trato
Ansatz Nr.
6 1 8 9 iO
Isomeraseaktivitat
(iGIu/g f.S.) 8 012,5 9 089,3 9 532,1 6 680,6 8 963,6
Spezifische Aktivität (iGIU/mg Protein) 12,3 14,9 14,7 13,6 15,0
Trockensubstanzgehalt
(Gew.-^) 25,61
Wassergehalt nach Karl Fischer (Gew.-^) 61,9
Protcingehalt nach Kjel-
dahl (Gew.-Jo, bez. auf
T.S.) 64,9
Oxydaschegehalt (Gew.-J^,
bez. auf T.S.) 37,6
Unlösliche Trockensubst.
(Gew.-#, bez. auf T.S.) 9,7
Mg++-Gehalt (mg/ml) 3,8 Mg++-Gehalt (Mol/Liter) O,16
Mg++/Protein-Verhältnis 0,023
Propan-2-olgehalt
(Differenz) (Gew.-^) 12,5
Pho sphorgehal t ( Ge w. -c/o,
bezogen auf T.S.) —
Endgewichtsmenge gewonnenes,
stabilisiertes
Enzymkonzentrat (g T.S.)i8 278 14 939 16 453 24 649 12 939
Enzymkonzentrat (g T.S.)i8 278 14 939 16 453 24 649 12 939
28, | 0 | 21 ,8 | 21 ,4 | 24 | ,7 |
60, | 9 | 59,4 | 61,4 | 66 | O |
61, | 0 | 64,8 | 49,4 | 59 | ,9 |
13, | 5 | 13,6^ | 35,5 | 13 | |
6 | 3,7 | 31 ,6 | 3 | ,3 | |
11, | 6 | 3,3 | 6,73 | 18 | ,6 |
ο, | 48 | 0,i4 | 0,28 | 0, | 77 |
ο, | 068 | 0,023 | 0,11 | 0, | 125 |
11, | 1 | 18,8 | 17,0 | 9, | 1 |
2, | 33 | 1 ,80 | 8,1 | 2, | 10 |
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Analog Beispiel 1 a) wurde ein weiterer großer Ansatz intrazellularer
Glucoseisomerase aus Streptonyces olivochromogenes
ATCC Nr. 21 715 hergestellt. Nach beendeter Fermentation wurde
die Kulturbrühe im ca. 75 O fassenden Fermentor auf etwa
20°C abgekühlt und vor dem Konzentrieren der Zellfeststoffe
eine kurze Zeit ohne Belüftung und Rühren ruhengelassen. Die fertige Kulturbrülle (60 5£>5»6 Liter) besaß eine Isomeraseaktivität
von 21,0 IGIU/g Kulturbrühe, eine maximale Zelltrockensubstanzkonzentration
von i6,5g/Ltr. und eine Gesamtaktivität
von 1270,7 X 10 IGIU.
Die die intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende ganze Kulturbrühe
wurde dann durch Zentrifugieren in einer Zentrifuge (DeLaval BRPX-207) bei einer Einspeisrate von etwa 18,93 Liter/
Minute mit einer Schalon-Schuß-Zeit von 1,75 Minuten konzentriert.
Der Leichtphasenüberlauf wurde in regelmäßigen Abständen
„analysiert und dann verworfen. Die Schverphasen-Zellpasten— Schüsse wurden in einem Aufnahmekanister gesammelt und dann
kontinuierlich zu einem der drei Tanks gepumpt, in denen der Zellabbau durchgeführt wurde. Die Konzentrationsstufe führte
zu einer etwa 6,fl-fachen Erhöhung der Zellfeststoffkonzentration
(auf Volumenbasis). Es wurden insgesamt 9^63,5 Liter Zellpaste
mit einem Gewicht von 9393tΊ kg und einem Gesamttrockensubstanzgehalt
von 1102,6 kg gewonnen. Die Analyse der Zellpaste ergab einen Aschegehalt von 131»09 kg, einen Proteingehalt von 6^9*99 kg»
einen Wassergehalt von 8290,76 kg, eine Isomeraseaktivität von
132 IGIU/g und eine Gesamtaktivität von 12^0,0 X 10 IGIU
(98 c/o der Theorie).
Wenn das in einem Abbautank vorgelegte Zeilpastenvolumen 757 Liter erreicht hatte, wurden jeweils 757 bis 870,6 Liter
91»5-?£iger Propan-2-ol zugesetzt, bis der Abbautank voll war.
Nach jedem Alkoholzusatz wurde der pH-Wert der dabei erhaltenen Aufschlämmung in den betreffenden Abbautank geprüft und erforderlichenfalls
mit -wasserfreiem Mononatriumphosphat auf 7»0 bis 7»2
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gesenkt.. Nach dem Beginn der Alkoholzugabe in den jeweiligen
Abbautanlcs wurde während des Rests der Auffüllperiode jeweils
portionsweise Lysozym-Enzym (wie in Beispiel 1) in einer ungefähr
6,8 Einheiten/mg Zelltrockensubstanz entsprechenden Menge zugegeben. Wenn der Tank gefüllt war, wurde jeweils eine
Endcinstellung der Alkoholkonzentration in der Aufschlänniung
auf h2 - 1 Gew.-^o vorgenommen. Das Lysat (Alkohol/Zellpaste/
Lysoz3TTi-Aufschlämmung) wurde ständig gerührt, sowie durch aus —
senliegendo Wärmeaustauscher umgepumpt, um die Temperatur beim Sollwert zu halten. Der Mantel der Wärmeaustauscher wurde jeweils
mit temperiertem Wasser gespeist, um die Temperatur des Lysats in einem Bereich von 23 bis 30 C zu halten. Der Grad
der Enzymsolubilisierung wurde mittels Enzyr.rvcrgleichsonalysen
überwacht und verfolgt, wobei der analytisch ermittelte Enzymgehalt
einer ganzen Lysatprobe und einer Vergleichsprobe, aus der die Zellfeststoffe durch Zentrifugieren abgetrennt worden
waren, miteinander verglichen wurden. Wenn der Abbau in einem Abbautank so weit fortgeschritten war, daß die Solubilisierung
in etwa *1 OO Jj betrug, war die Lysat-Aufschlumraung jeweils für
die Klärung zum Entfernen der Zelltrümmer bereit. Die hierfür erforderlichen Abbauzeiten lagen in einem Bereich von etwa
52 bis 73 Stunden, vom Beginn des Auffüllens an gerechnet.
Die Gesamtmenge der Lysat-Aufschlämmungen aus den drei Abbautanks
betrug 19 9^^»9^ Liter und hatte ein Gesamtgewicht von
17 957»72 kg, sowie einen Gesamttrockonsubstanzgehalt von
1019,2 kg. Die Analyse der Lysat-Aufschlämmung ergab einen Aschegehalt
von 187,78 kg, einen Proteingehalt von 6^9»09 kg, einen
Propan-,?-olgehalt von 7221,2 kg und einen Wassergehalt von
9717»3 kg· Das Lysat hatte eine Isomeraseaktivität von 66,6 IGXU/
g und eine Gesamtaktivität von 1178,9 X 10 IGIU, entsprechend
93 io der Theorie, d.h. der ursprünglich in der als Ausgangsmaterial
verwendeten FermentationsbrühQ enthaltenen Gesamtaktivität
.
Die Lysat-Aufschlämmung wurde mit einem Anschwemmfilter, der mit
Filterhilfe (Dicalite Speedflow der Fa, Grefe ο Inc.) 5,72 bis
6,35 cm dick vorbeschichtet worden war, geklärt. Zur Klärung
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Ή/ι.
der Lysat-Aufschlämmung wurden insgesamt 272,16 kg Filterhilfe
verwendet. Die Vorbe schichtungsauf schllimmung, deren Filterhilfegehalt
5 i~> betrug, wurde mit 5O-/'i£cr Propan-2-oI-Lösung angerührt.
Um die Vorbeschichtungs-Ansetz-Lösung üu erhalten, ließ
man den Vorbeschichtungsablauf in den Vorbeschichtungsabsetztank
zurücktropfen bzw.-fließen, sobald die Vorbeschichtung
aufgetragen war. Unmittelbar nach dem Austropfen des Vorbeschichtungsablauf s wurde die abgebaute Lysat-Aufschlämmung in
don Filter gebracht. Die Filtrationsgeschwindigkeiten bei der Klärung schwankten zwischen 1,06 und 1,59 Liter/Stunde und
dm Filterfläche, wobei der durchschnittliche Durchsatz 1,18 Liter/ Stunde und dm betrug. N30J1 c|en Filtrieren wurde das geklärte
Filtrat in. ca. 3QOO Liter .fassende Lagertanlcs gepumpt. Die vota
Filter abgenommenen Filterkuchen-Schnittstücke \mrden in regelmäßigen
Zeitabständen geprüft und verworfen. Das Lysat hatte
ein Gesamtvolumen von 17 556,7 Litern, wog 16 200,5 kg und
enthielt insgesamt 351,08 kg Trockensubstanz. Die Analyse des geklärten Lysats ergab einen Aschegehalt von 48",08 kg, einen
♦
Proteingehalt von 223*17 kg, einen Propan—2-ol-Gehalt von 7165,9 kg und einen Ifassergehalt von 8673,59 kg. Die Isomeraseaktivität des geklärten Lysats betrug 5^»O IGIU/g, und seine Gesamtaktivität 875,7 X 10 IGIU, entsprechend 69 56 der Theorie, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität der Fermentationsbrühe.
Proteingehalt von 223*17 kg, einen Propan—2-ol-Gehalt von 7165,9 kg und einen Ifassergehalt von 8673,59 kg. Die Isomeraseaktivität des geklärten Lysats betrug 5^»O IGIU/g, und seine Gesamtaktivität 875,7 X 10 IGIU, entsprechend 69 56 der Theorie, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität der Fermentationsbrühe.
Nach dem Klären wurde die Alkoholkonzentration in den einzelnen, das geklärte Lysat enthaltenden Lagertanks jeweils auf hh bis
*15 Gc\:,~$ (bestimmt durch Dichtemessung) erhöht. Danach wurde
die Ausfällung und Stabilisierung der in der geklärten Lysut-Lösung
enthaltenen Glucoseisomerase durchgeführt, indem das geklärte Lysat und 439*1 Liter einer 2-molaren wäßrigen Magnesium
sulf atneptahydrat-Lösung aus 105,23 kg MgSO^ und ^26,8 kg Wasser
kontinuierlich durch, ein Misch-T-Rohr in einen mit einer Zentrifuge
(DoLaval BRTX-207) verbundenen Versorgungstank eingespeist,
wobei pro Liter geklärten Lysats 0,025 Liter 2,0-molare
MacnosiumsuIfatlösung zugeführt wurden, um eine Endlösung mit
einem Magnesiumsulfatgohalt von 0,05 Mol/Liter zu erhalten.
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Dabei U7Ur el cn zunächst nur die Magnesiumsulfat- und die gokl'lrte
Lysat-Lösung solange in den Vcrsorgungctank eingespeist, bis
darin ein Volumen vorgelegt war, das box den gegebenen Fließgesclivindigksitcn
einer Vervcilzeit von 15 Minuten entsprach. Wenn dieses Volumen erreicht war, vurdo damit begonnen, kontinuierlich
das im Versorgungstank enthaltene Gemisch abzuziehen
und in eine Zentrifuge einzuspeisen, -wobei die Entnahmegeschvindigkeit
der Zuflußgeschwindigkeit zum Tank entsprach, d.h. so gewühlt wurde, daß das Füllniveau im Versorgungstank und
damit die Verweilzeit konstant blieb.
Der Überlauf aus der Zentrifuge wurde einem ca. 30 m
fassenden Tank zugeführt und nachfolgend in ciincr Destillationsanlage zur Wiedergewinnung dos darin enthaltenen Propan-2-ols
aufgearbeitet, der wiederverwendet wurde. Das stabilisierte
Enzymkonzentrat wurde in 75»7 Liter fassenden Eimern aus
nicht—rostendem Stahl gesammelt und dann in einem ca. 380 Liter
fassenden Kessel vereinigt. Das stabilisierte Snzymkonzentrat wxeö eine schlammartige Konsistenz auf und war mittelbraun gefärbt.
Zum stabilisierten Enzymkonzentrat wurde intermittierend
destilliertes Wasser zugesetzt, um das Enzym in der erforderlichen
Weise zu resolubilisieren (die Wiederauflösung wurde visuell bestimmt).
Wenn das destillierte Wasser zugesetzt war und das stabilisierte Enzymkonzentrat sich löste, schlug die Farbe
in ein verhältnismäßig klares kaffeebraun bzw. -schwarz um, und das Produkt wies eine derjenigen einos leichten Öls gleichende
Konsistenz auf.
Auf diese Weise wurden 276,3 Liter (287,57 kg) stabilisiertes
Enzymkonzontrat in resolubilisierter Form gewonnen, deren Trockensubstanzgehalt
76,66 kg betrug. Die Analyse des stabilisierten Enzymkonzentrats ergab einen Aschegehalt von 8,6 kg , einen Pro—
teingehalt von 57»15 kg, einen Propan-2-ol-Gehalt von 47,17 kg
und einen Wassergehalt von 163,29 kg. Das stabilisierte Enzymkonzentrat
besaß eine Isomeraseaktivität von 11 65h IGIU/g Trockensubstanz
und eine Gesamtaktivitüt von 892,8 X 10 IGIU, entsprechend
einer Aktivitätsausbeute von 70,3 /o der Theorie, wobei
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der größte Teil des Alctivitätsverlus tcs (23 bis 2!-\ fo) beim Klären
des Lysats auftrat. Von diesem Teil des eingetretenen Aktivitiitsverlusts
ging rd· die Hälfte (etwa 11,8 p/i) mit den abgeschälten
Filtcrkuchenstücken verloren. Dor Rest der Verluste
var auf Inaktivierung zurückzuführen.
Die nachfolgenden Tabellen VI und VTI geben einen zusammenfassenden
Überblick über die in den einzelnen Vcrfahrcnsschritten erzielten
2nzymgowinnungsausbeuten. Die Tabelle VII gibt insbesondere
eine vollständige Aufstellung aller vasentlichen Analysenkennwerte
des stabilisierten Enzymkonzentrats wieder.
VI·
Analysenwertο
zur
Gewinnung von stabilisiertem Enzymkonzentrat
(Ansatz 11)
Verfahransstufe
Ganze Fermentor-KuIturbrühe
(a.
Zellpaste v Rohes Lysat
Geklärtes Lysat
Stabilisiertes Enzymkonzentrat
Gewichtsmenge Aktivität je Gesamtaktivl-(kg) Gewichtseinheit tat (iGIU)
(iGIU/g)
60 | 393, | 79 | 21 ,0 | 1270,7 | X | 106 | (c |
9 | 698, | hh | 132,0 | 12^0,0 | X | 106 | (c |
17 | 200, | 72 | 66,6 | 1178,9 | X | 106 | |
16 | 287, | 51 | 5'+,0 | 875,7 | X | 106 | |
58 | 11 65'+ (b | 892,8 | X | 106 | |||
Durch Differenzrechnung oder Schätzung erhaltener Wert.
Wert bezieht sich auf Trockensubstanz.
v Die Gesamtaktivität des geklärten Lysats wurde aus der geschätzten
Gewichtsmenge und dem gemessenen Wert der darin je Gewichtseinheit vorhandenen Aktivität errechnet. Offensichtlich
lag jedoch die tatsächliche Gewichtsmenge über dem Schätzwert, denn die gewonnene Menge an stabilisiertem
Enzymkonzentrat war größer als die sich aus den Werten des geklärten Lysats rechnerisch ergebende.
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Tabelle VII
Analysenwerto des stabilisierten Glucosoisoinerase-Enzymkonzsn-
trats
Ansatz Nr. 11-336
IsomerasealctivitUt
(iGIU/g T.S.) 11 G5h
Spezifische Aktivität
(iGIU/mg Protein) ; 15,5
Trockensubstanzgohalt (Ggw.-$) 26,6
Vassergehalt nach Karl Fischer (Gcw.-vs) 56,9
Proteingelialt nach Xjeldahl (Gew.-Jö, bez.
auf T.S.) 75,0
Oxydaschegehalt (Gew,-^, bez. auf T.S.) 11,3
Unlösliche Trockensubstanz
(Gck.-^, hex. auf TvS.) 0,53
Mg++-Gehalt (mg/ml) * 5,99
Mg+^-GeIIaIt (Mol/Liter) 0,25
Mg++/Prο t cin-Verhältni s 0,032
Propan-2-olgehalt (Gew.-°/o) 16,5
(Differenz)
Endmenge an gewonnenem Enzym (kg T.S.) 287,58
Mehrere Proben der nach den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen stabilisierten Glucoscisomorase-Enzymkonzentrate und andere
gleichartige Proben unterschiedlicher Aktivität wurden bezüglich ihrer Lagcrungsstabilität bei verschiedenen Temperaturen
untersucht. Die Proben wurden bei ht 18, 26 bzw. 37°C gelagert
und nach h, 8 und 12 Monaten jeweils hinsichtlich ihrer Glucoseisoraoraseaktivitüt
untersucht. Die nachfolgende Tabelle gibt die Ergebnisse dieser Untersuchung wieder,
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VIII
Untersuchung
der Temperaturstabilitiit von stabilisierten Enzym-
konzentratcn
Prozent der anfänglichen Isomeraseaktivitatv
Anfängl!a Aktivit. |
Monate | k | 8 | 12 | La^erunffstemperatur und -dauer | 18°C Monate |
12 | 4 | 260C Monate |
12 | l· | 4 | 37°C lonate |
12 | |
An | (IGIU/ K T.S.) |
101 | 101 | 105 | 8 | 98 | 92 | 8 | 96 | 43 | 8 | 6 | |||
satz Nr. |
10 162 | 100 | 102 | 105 | 4 | 97 | 107 | 96 | 96 | IO6 | 77 | 10 | Ί0 | ||
1 | 10 289,S | J 94 | 100 | 101 | — | 103 | 81 | 76 | 103 | 80 | 39 | 46 | 6 | ||
2 | 3 910,7^1 | > 100 |
105 | 102 | — | 80 | 82 | 84 | 80 | 61 | 1 | 2S | — | ||
3 | (t 2 441,47 |
96 | 103 | 107 | — | 89 | 91 | 86 | 80 | 86 | 3 | 0 | 0 | ||
4 | 5 823,7 | 95 | 100 | 105 | 88 | 91 | 100 | 91 | 90 | 97 | 44 | 1 | 0 | ||
5 | 7,960,9 | 95 | 100 | 107 | — | 99 | 97 | 89 | 9S | 101 | 62 | 5 | 21 | ||
6 | 9 228,57 | 101 | 93 | 82<c | — | 98 | 82 | 83 | 96 | 78 | 5 | 23 | — | ||
7 | 10 215,59 | 100 | 95 | 91 | — | 88 | 82 | 83 | 88 | 69 | 5 | 3 | — | ||
8 | 7 504,6 | 90' | C96 | 90 | : S5 | 89 | 81 | S6 | 84 | 80 | 58 | 1 | 42 | ||
9 | 9 113,36 | 88^ | C93 | — | 88 | 87 | — | 83 | 86 | — | 33 | 48 | — | ||
10 | 11 654,0 | 96 | 99 | 100 | 86 | 90 | 90 | 86 | 88 | 85 | 34 | 26 | 13 | ||
11 | Durchschnitt | 85 | 92 | 90 | 17 | ||||||||||
86 | |||||||||||||||
* Dies ist der am Beginn der Stabilitätsprüfung und nicht etwa
der in den vorhergehenden Beispielen angegebene ursprüngliche, gleich nach der Enzymherstellung bestimmte Aktivitätswert.
Diese Proben besaßen infolge fehlerhafter Arbeitsbedingungen
nur eine ungewöhnlich niedrige anfängliche Aktivität.
v Die niedrigen Werte sind auf Kristallisation von Proteinmaterial während der Enzymherstellung zurückzuführen, die nicht
in die Gesamtanalyse einbezogen wurde.
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* Die Bestimmung der Isorneraseaktivität war auf etwa 10 c/o
der anfänglichen Isomeraseaktivität genau, worauf die über
100 c/o der anfänglichen Aktivität liegenden Werte zurückzuführen
sind.
Dio in der Tabelle VIII angegebenen Werte lassen erkennen, daß
die erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrate bei
bis zu 12-monatigGr Lagerung bei Ί und bei 18 C mehr als 80 und
im allgemeinen sogar mehr als 90 - 10 $ ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität, d.h. ihrer Isomeraseaktivität am Beginn
des Stabilitätstest bzw. der Lagerung behalten, sowie daß sie, selbst wenn )n.o.x\ r-ie bei 26 C lagert, immer noch bis zu
8 Monate lang etwa 30 - 10 0Jo ihrer anfänglichen Isomeraseaktivität
behalten können. Anders gesagt, verloren die stabilisierten
Snzymkonzentrate im Durchschnitt weniger als 5 $ ihrer
anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei h C gelagert
wurden, durchschnittlich weniger als etwa 15 $ ihrer
anfänglichen Isomeraseaktivität, wenn sie 12 Monate bei 18 oder bei 26 C gelagert wurden.
Beispiel 5
6^ »35 Liter einer analog Beispiel 1 a) hergestellten, intrazellulare
Glucoseisomerase enthaltenden Kulturbrühe wurden zur Herstellung einer Zellpaste zunächst mit Wasser verdürnt und
dann zentrifugiert (die Ausgangsmaterialchargo stammte aus zwei Fermentoransätzen von je 37»85 Litern, von denen die eine
eine spezifische Isomeraseaktivität von T8,0 IGIU/ml und die
andere eine spezifische Isomeraseaktivität von 16,8 IGIU/ml
aufwies; die beiden Permentoransätze wurden für die Vervendung als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Zellpaste vereinigt).
Der Zentrifugenkuchen bzw. die Zellpaste wurde in einen 7»5 Liter
fassenden Fermentorkolben gegeben und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 4,5 Litern verdünnt. Die dabei erhaltene Aufschlämmung
wurde 2 Tage bei einer Raumtemperatur von h C stehengelassen
und dann 77 mg eines aus Eiweiß stammenden Lysozym-Enzympräparats
mit etwa 8OOO Lysozymeinheiten/mg und 193O ml Propan-
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2-ol versetzt. Die Aufschlämmung wurde h Stunden gerührt, worauf
weitere 500 mg Lysozym-Snzyinpräparat zugesetzt wurden. Nachdem
hierauf zunächst seine Temperatur auf 20 bis 30 C eingestellt
worden war (die Temperatur weir nach der zweiten Lysozymzugabe
auf etwa 35 bis ^O C gestiegen, was vermutlich zu einer gewissen Enzymdosaktivierung führen dürfte), wurde die
Aufschlämmung über Nacht gerührt. Nach dem Abbau wurde eine
500-ml-Probe des rohen Lysats mit 500 ml Wasser verdünnt.
Proben von jeweils 123 ml des verdünnten Lysats wurden dann
mit so viel Propan-2-ol versetzt, daß ihr Propan-2-ol-Gehalt
etwa 50 Vol.-/5 (v/v) betrug. Eino Lysatprobe wurde für einen
Blindversuch verwendet. Die Lysatproben wurden dann mit den in der nachstehenden Tabelle IX angegebenen Mengen Natriumchlorid
(zum Vergleich) bzw. Magnesiumsulfatheptahydrat
(llgSO^ ·7Η_θ) versetzt. Nach der Salzzugabe wurden die Suspensionen,
cinschlief31icli der Blindprobe, zentrifugiert und
auf ihre Glucoseisonieraseaktivität und ihren Proteingehalt,
der anhand dos Verhältnisses der optischen Dichte bei 260
und'280 nm unter Verwendung des Nomographcn von E. Adams auf
der Basis dsr von Warburg und Christian in Biochem. Z. 310,
(19^2) angegebenen Extinlctionskoeffizienten für Enolase und
Nucleinsäuren bestimmt wurde, analysiert. Die weiteren Einzelheiten bezüglich der Durchführung und Ergebnisse dieser Versuche
sind aus der nachstehenden Tabelle IX zu ersehen.
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Salz-Blind
versuch
versuch
NaCl
NaCl
NaCl
NaCl
NaCl
Scilzmen-
(s)
M-SO,
1,0
2,0
5,09
2,0
5,09
0,25
0,50
0,50
1,0
2,0
optische Dichte (faj
bei
260
1,5
1,53
1,55
1 ,82
1,53
1,55
1 ,82
1 ,50
1 ,48
1 ,48
1,65
1,68
280 nm
1,19 1 ,06 1 ,08 1,30
1,03 0,995
1,12 1,11
IX
6,5
6,40
6,3S
6,35
6,3S
6,35
6,30
6,25
6,25
Aktivität in überstehender Flüssigkeit
(iGIU/ml)
2,79 3,33 3,14 2,76
2,87 2,36
1,17 0,20
Dor pH-Vert war bei diesen Versuchen relativ niedrig, was der Grund für die verhältnismäßig geringe Isomeraseaktivität
sein könnte. Er war jedoch nicht so niedrig, als daß er die Ursache für das fast völlige Fehlen der Isomerasealctivität
in der überstehenden Flüssigkeit beim Versuch mit 2 g MgSO. sein könnte. Es wird angenommen, daß die Enzymdesaktivierung
bei diesem Versuch größtenteils durch den Temperaturanstieg auf 35 bis 40°C nach der zweiten Lysozymzugabe verursacht
wurde.
Die in Tabelle IX angegebenen Versuchsergebnisse zeigen, daß die Zugabe des Magnesiumsulfats zu dem alkoholisch-wäßrigen
Lysat zu einer Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden
Flüssigkeit führt, ohne den in der überstehenden Flüssigkeit
vorhandenen Nucleinsäuregehalt (Nucleinsäuren absorbieren Licht
einer Wellenlänge von 260 nm) wesentlich zu verringern. Dieser Effekt trat box der Zugabe von Natriumchlorid nicht auf. Der
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•"f.
Zusatz des Magnesiumsulfats zum alkoholisch-vlißrigon Lysat
bewirkt somit oine Trennung der Glucoseisomoraso von den löslichen
Nucleinsäuren. Dieser Effekt war offensichtlich, kein
typischer "Aussalzeffekt", da die Magnesiumsulfatkonzentration hierfür zu niedrig war und mit Natriumchlorid eine derartige
Trennung nicht erreicht wurde. Die unter Verwendung von Natriumchlorid durchgeführten Versuche ergaben nümlich keinerlei
nennenswerte Abnahme der Isomeraseaktivität in der überstehenden Flüssigkeit.
Dem Rest des 4,5 Liter rohen, solubilisierte Glucoseisomerase
enthaltenden Lysats von Beispiel 5 wurden Filterhilfe und so viel Propan-2-ol zugesetzt, daß die Aufschlämmung einen
Propan-2-ol-Gehalt von 50 Vol.-Jo (v/v) besaß. Die Aufschlämmung
wurde langsam filtriert, um die solubilisierte Glucoseisoinerase
zu klären. Sine Probe von 335 ^l dieses Filtrats mit einer
analytisch bestimmten Isomeraseaktivität von 65,2 IGIU/ml,
entsprechend einem Gesamtaktivitätsgehalt der Probe von 21 842 IGIU, wurde bei einem pH-Tiert von S mit je 16,5 ml
Propan-2-ol und 1-molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung
versetzt. Der Magnesiumsulfatgehalt des Gemisches betrug somit 1 $, bezogen auf das ganze Gemisch, . bzw. 2 </ot bezogen auf
das darin enthaltene Wasser. Nach der Zugabe des Magnesiumsalzes bildete sich sofort ein öliger Niederschlag. Die den
Niederschlag enthaltende Lösung wurde zentrifugiert und der Niederschlag dadurch abgetrennt. Der Niederschlag wurde mit
Wasser in einer ein Volumen von insgesamt 10,5 ml ergebenden
Menge wieder aufgelöst. Diese Probe wurde mit Wasser im Verhältnis (zu Probe) von 402 : 1 verdünnt, worauf die
optische Dichte der verdünnten Lösung bei 26O und 280 mn bestimmt
wurde, die 0,284 bzw. 0,350 betrug. Aus diesen Werten
wurde der Proteingehalt der verdünnten Lösung zu 0,33 mg/ml ermittelt, entsprechend einem Proteingehalt der unverdünnten
Probe (10,5 ml-Lösung) von 133 mg/ml. Die Bestimmung der Isomeraseaktivität
der Lösung ergab einen Wert von ZOhO IGIU/ml,
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so daß die Gesamtaktivität der Probe 21 'KX) IGIU betrug, entsprechend
einer Ausbeute von 9S $, bezogen auf die anfängliche
Aktivität des geklärten Lysats. Das stabilisierte Glukoseisomerase-Enzymkonzeiitrat
besaß eine spezifische Isomeraseaktivität von 15,3 IG.TU/mg Protein. Diese Werte zeigen in Verbindung
mit den in der Tabelle IX aufgeführten Ergebnissen, daß das Magnesiumsulfat die Isomerase selektiv ausfällt und
reinigt.
Eine Probe (67 ml) resolubilisierten Alkoholfralttionats, die
solubilisierte, zellfreie Glucoseisomerase enthielt, wurde mit 67 ml der Propan-2-ol-Lösung verrührt. Dabei konnte keine
Niederschlagsbildung beobachtet werden. Hierauf wurden der geklärten, Isomerase enthaltenden Alkohol/Wasser-Lösung je
2 ml einer 1-molaren Magnesiumsulfatheptahydrat—Lösung und
der Propan—2-ol-LÖsung zugesetzt, worauf sich sofort eine grau-weiße, feste Fällung bildete, die anschließend abgetrennt
und in Wasser zu einem Volumen von 13»0 ml gelöst wurde. Das
stabilisierte Snzymkonzentrat wurde erneut zentrifugiert und
im Verhältnis 101 : 1 (Wasser : Enzymlconzentrat) mit Wasser verdünnt, um dann analysiert zu werden. Die Lichtdurchlässig—
keit der verdünnten Lösung bei 26O nm betrug 0,288 und diejenige bei 280 nm Wellenlänge 0,^37· Hieraus wurde der Proteingehalt
der verdünnten Lösung zu 0th6 mg/ml ermittelt. Die das
solubilisierte, stabilisierte Enzymkonzentrat enthaltende unverdünnte Losung, deren Isomeraseaktivität mit ^82 IGIU/ml
ermittelt wurde, besaß somit einen Proteingehalt von k6t5 mg/ml
und eine spezifische Isomeraseaktivität von 10,** IGIU/mg Protein.
Die in den 13»0 ml stabilisierten Snzymkonzentrats vorhandene
Gesamtaktivität betrug 6266 IGIU. Das Zentrifugat enthielt dagegen
nur 150 IGIU.
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Eine Probe von 3250 ml des geklärten, solubilisicrte Glucoseisomerase
enthaltenden Lysats der ursprünglich 4,5 Liter großen Charge von Beispiel 5 mit einer Isomerasealctivität von 109 IGIU/
ml, imrde mit je 162 ml der Propan-2-ol-Lösung und der 1-molaren
Magnesiumsulfatheptahydrat-Lösung versetzt. Dabei bildete
sich sofort ein öliger Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt und gewonnen wurde, Der Niederschlag hatte
ein Volumen von 69 ml und wies, wie die Analyse ergab, eine Isomerasealctivität von 4θ4θ IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtalctivität
von 278 7βθ IGIU auf. Zur Durchführung der Proben
bzw. Analysen wurde ein kleiner Tsil des stabilisierten Enzymkonzentrats
in einem Verhältnis von 1 : 1000 verdünnt. Die bei einer Wellenlänge von 260 bzw. 280 nm gemessene Licht—
durchlässigkeit betrug 0,315 bzw. 0,345· Daraus wurde der
Protcingehalt zu 0,299 mg/ml und die spezifische Aktivität zu 13,5 IGIU/mg Protein bestimmt. Der Rest des.stabilisierten
Enz,ymlco*nzentrats wurde 48 Stunden lang stehengelassen, worauf
sich drei Schichten gebildet hatten. Die dreischichtige Aufschlämmung wurde zentrifugiert und analysiert, wobei sich zeigte,
daß die oberste, lipidhaltige Schicht (18,2 ml) eine Isomeraseaktivität
von 565 IGIU/ml, die mittlere (39 ml) eine Isomerasealctivität
von 1970 IGIU/ml und die unterste Schicht (36 ml)
eine Isomeraseaktivitüt von 50,80 IGIU/ml besaß. Die Bodenschicht bzw. unterste Schicht wies den niedrigsten LichtdurchlässiglceitsmeOwert
bei 26O nm und den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmaßwert
bei 280 nm auf. Die oberste Schicht wies den höchsten Lichtdurchlässigkeitsmeßwert bei 26O nm auf.
104,096 Liter analog Beispiel 1 a) hergestellter, intrazellulare
Glucoseisomarase enthaltender Kultvirbrühe mit einer Isomeraseaktivität
von 17»5 IGIU/ml wurden mit der gleichen Volumenmenge
Wasser vermischt und dann zu einem festen Kuchen zentrifugiert. Der Xuchen wurde box pH 7|45 mit so viel Wasser vcr-
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-)yf-
mischt, daO das sicli ergebende Volumen 26 Liter betrug· Dioso
Aufschlämmung wurde mit 0,250 g Lysozym und 11,5 Liter Propan-2-σΙ
bei einer Temperatur von 27 C vermischt. Außerdem ivurdc eine
kleine Menge eines Antischaummittel^ zujeactzt und die Aufschlämmung
dann gerührt. Die wäßrige Suspension (37t5 Liter) enthielt 37 bis hh IGIU/ml. Nach 20,5 Stunden wurden zwei
Proben von ja S Litern entnommen, worauf Propan-2-ol in einer
Menge zugesetzt wurde, die einen Alkoholgehalt von 50 Vol.-"S
(V/v) ergab. Dann wurden die Aufschlämmungcn zünlichst mit FiItarhilfe
(Sil-Flo) in einer Menge von 3 s/s Zellen versetzt und
dann filtriert, sowie anschließend mit 2 Litei'n 5O-i5iger
Propan-2-ol-Lösung gewaschen. Die Analyse des Filtrats ergab
siuc Isoineraseakti vitLlt von 15 IGIU/ml. In die restlichen
21,5 Liter des rohen Lysats wurde ein weiteres Gramm Lysozym
eingerührt, wodurch man eine Isomeraseaktivität von 2^,3 IGIU/ml
im Filtrat erhielt. Das im Filtrat enthaltene Enzym wurde durch Zugabe von je 1,1 Liter Propan-2-ol-Lösung und 1-molarer
Magnesiumsulfatlösung sofort ausgefällt. Die das stabilisierte
Enzyiukonzentrat enthaltende Fällung wurde abzentrifugiert und in einer kleinen Menge l/asser zu einem Volumen von 200 ml gelöst.
Die dabei erhaltene Lösung besaß eine IsomeraseaJktivi tat
von 3^50 IGIU/ml, entsprechend einer Gesamtaktivität von 690
IGIU, und eine spezifische Aktivität von etwa 12,5 IGIU/mg Protein.
Zwei Proben des so erhaltenen stabilisierten Enzymkonzentrats
(200 ml), von denen eine mit Propanol "parasept" als Konservierungsmittel
versetzt wurde, die andere dagegen nicht, wurden einem Lagerungsstabilitätstest bei Raumtemperatur (etwa 26°c)
unterworfen, Am Beginn des Lagerungsstabilitätste3ts wiesen beide Proben eine Isomerasealctivität von 3300 IGIU/ml auf. Die
Proben wurden in regelmäßigen Zeitabständen geprüft. Nach 31-tägiger Lagerung wies die Probe mit dem Konservierungsmittelzusatz
eine Isomeraseaktivität von 3165 IGIU/ml und die andere
Probe (ohne Konservierungsmittel) eine Isomeraseaktivität von 31-fO IGIU/ml auf. Dieses Versuchsergebnis zeigt, daß die
stabilisierten Enzymkorizentrate der Erfindung (mit oder ohne
Konservierungsmittel) ziemlich lagerungsstabil sind und, wenn
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X)PY
sie bei Raumtemperatur über 30 Tage lang gelagert werden, bis
zu 95 $ oder mehr ihrer Anfangsaktiv!tat behalten können.
Beispiel 10 (Vergleichöversuche)
Der Zweck der in diesem Beispiel beschriebenen Versuchs ist es, die Wirksamkeit und Sffektivitiit verschiedener erSiidungsgemllß
zu verwendender wasserlöslicher Magnesiumsulze ita Vergleich
zur Verwendung anderer für ihre Fähigkeit, Proteine auszufällen bekannter Salze, wie Ammoniurasulfab, Natriumsulfat und Natriumchlorid,
aufzuzeigen. In den Vergleich wurden auch andere Salsa z'coivortiger Metalle oinbcsogsn.
Eine große Probe des Lysats (Alkohol/Wasscr/Glucoseisomerasc-Lüsung)
von Ansatz 6 (vgl. Baispiel 2 und Tabelle IV) wurde in einer Laborzentrifuge mit 18 000 UpM vor ihrer Verwendung
10 Minuten zentrifugiert. Der Alkoholgehalt wurde zu 4i,6 Gew.~j£
bzw. *»9,t3 Vol.-# (V/V) bestimmt. Jeder der jeweils aus 30 ml
geklürtem Lysat (bei Raumtemperatur) bestehenden Proben wurde
eine 1-molare Lösung eines der in der nachfolgenden Tabelle X aufgeführten Salze in der weiter unten angegebenen Menge sowie
die gleichhohe Volumenmenge an Propan-2-ol zugesetzt. Nach dem Zusatz von Salz und Alkohol wurden die Proben durchgemischt und
dann jeweils 10 Minuten bei 18 000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde jeweils entfernt und der Niederschlag
aus den Zentrifugengläsern ausgewaschen und auf ein Gesamtvolumen von 25 ml mit einem Kobaltphosphatpuffor (1O m Co ;
pH 7»5i 0,05 mI>0/, ) verdünnt, worauf die Glucoseisoraeraseaktivitüt
und dor Protoingohalt bestimmt wurden. Die Wirkung der Verwendung verschiedener Salze und Konzentrationen bezüglich
der Selektivität der Fällung und der Reinigung der solubilisierten
Glucoselsomerase 1st aus der nachfolgenden Tabelle X zu ersehen.
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COPY
- ItS -
Einfluß der Anwendung verschiedener Salze und | auf | die Enzymfüllung | .-£ | zugesetzte | Salzkonzentrationen | 5 | m | a) Salzlösung |
1C | > | 6 | 2C | > |
Gewon | VoI | 2,5 | 4 | ||||||||||
nenes Enzym |
1 | 1 | OO 15 |
00 13, |
3 | 11, | 0 | ||||||
Salze | Λ | 97 1 15,7 |
03 15 |
,8 | 1 | 03 16, |
105 I6, |
9 | |||||
Magnesiumsalze | /° Sp. Alct. |
,5 | 100 1 15,'» |
00 15 |
,6 | 1 | 99 15, |
6 | 98 15, |
9 | |||
MeS0„.7H20 | Sp. Alct. | 15 9, |
,7 | 94 1 15,1 |
6 | ||||||||
MgCl2 | Sp. Alct. | 3 3, |
0 | 1 2, |
8 | 16 8, |
4 | ||||||
Mg (C2H3O2) | O O |
0 0 |
1 2, |
1 2, |
9 | ||||||||
Salze einwertiger Kationen |
c/o Sp. Alct. |
O O |
O O |
0 0 |
1 1, |
1 1, |
9 | ||||||
2 4 | Sp. Akt. | O O |
O O |
||||||||||
Sp. Akt. | O O |
||||||||||||
NaCl | Salze anderer zwei wertiger Kationen |
||||||||||||
BaCl.
SrCl.
CaCl, CoCl.
MnCl.
Sp. Akt.
fo Sp. Alct.
Sp. Akt.
io
Sp. Akt.
93 11, |
9 | 76 8,8 |
in 8 |
,4 |
104 14, |
3 | 94 12,7 |
28 12 |
,7 |
65 8, |
9 | 57 7,9 |
19 6 |
,2 |
61 9, |
1 | 18 | 1 0 |
,8 |
21 2, |
8 | 29 3,9 |
00 CV | ,6 |
Sp. Alct.
a) Die sich jeweils ergebenden molaren Konzentrationen sind: 0,01, 0,025,0,048, 0,09 und 0,17-
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b) Protein für spezifische Aktivität (Sp. Akt.): Bestimmt durch
Messung der optischen Dichte bei 280/260 nm; angegeben in IGIU/mg Protein.
Die in Tabelle X wiedergegebenen Versuchsergebnisse zeigen, daß
Natrium- und Ammoniumsulfat Glucoseisomerase nicht so wirksam
und in so niederen Konzentrationen auszufällen vermögen, vie die Magnesiumsalze. Amjnoniumsulfat fällte überhaupt kein
Enzym und Natriumsulfat ergab nur eine Ausbeute von 19 /«. Abgesehen
davon, daß diese Ausbeute sehr gering ist, war sie nicht notwendigerweise auf eine Fällung zurückzuführen, sondern könnte
auch einer Fliasontrertnung in eine Alkohol/Nasser- und eine
Scilzwasserphase zuzuschreiben sein. Das Protein ist in der Salzwassorphase besser löslich als in der Alkohol/Wasser-Phase.
Die Salzwasserphase extrahiert somit (nicht spezifisch) Protein aus der Alkohol/Yassor-Phase. Da die Salzvasserphase eine
höhere Dichte besitzt, wird sie als Produkt gewonnen. Auch das als weiteres Salz eines einwertigen Metalls in die Untersuchung
einbezogene Natriumchlorid fällte die Glucosoisomerase nicht aus.
Die geprüften Salze anderer zweiwertiger Metalle als Magnesium fällten die Glucoseisomerase zwar ebenfalls aus, jedoch waren
bei ihrer Vervendung die Ausbeuten und Reinheiten nicht so hoch wie bei der Verwendung der erfindungsgemäß einzusetzenden Magnesiumsalze.
Die Barium- und Strontiumsalze erwiesen sich von den geprüften Nicht-Magncsiumsalzcn als noch am besten geeignet
bzw. leistungsfähigsten, jedoch sind diese Salze im Hinblick auf eine Verwendung für Lebensmittel unerwünscht.
Von den geprüften Salzen fällten nur die Magnesiumsalze das Enzym wirksam mit hoher spezifischer Aktivität aus. Die angewandte
Magncsiumsalzkonzentration beträgt nur einen Bruchteil
derjenigen, die erforderlich ist, um Proteine aus einer wäßrigen Lösung nach klassischen "Aussalztcchniken", d.h. unter Verwendung
von Ammonium- und Natriumsulfat, auszufüllen. Tatsächlich steht
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diosos Phänomen im Gegensatz zu den einschlägigen Angaben in der
Literatur (vgl. z.B. Advances in Protein Chemistry, Band XI, Seiten hl 6 bis ^1S (195Ö) und Advances in Protein Chemistry,
Band 16, Seite 216 (1961)). Insbesondere die letztgenannte Litcraturstelle behauptet, daß Magnesiumsulfat beim Aussalzen,
von Proteinen weniger effektiv als Natrium- oder Ammoniumsulfat sei.
Aus den in der Tabelle X angegebenen Worten ist auch klar zu
ersehen, daß beim Erhöhen der Magncsiucisulfatilösungskonzentration
(über O,OS-molar) die spezifische Aktivität abnimmt, was darauf
hinweist, daß dann eine weniger selektive Fällung stattfindet, d.h. mehr anderes Protein zusammen mit der Glucoseisorrterase
ausgefällt wird, iOs wurde beobachtet, daß rr.it dem Magnesiumsulfat
Phasentrennung stattfand. Die Abnahme der spezifischen Aktivität entspricht der anscheinend erhöhten Löslichkeit von Protein
in der Salzwasser—Phase. Bei der Verwendung von Magnesiumchlorid
und —acetat trat keine Phasentrennung auf und die spezifischen
Aktivitäten blieben mit steigender Magnesiumsalzkonzentration
konstant, soweit sie nicht, wie bei Magnesiumchlorid, sogar zunahmen.
Beisp.iel 11 Immobilisierung löslicher Glucoseisomerare
Dieses Beispiel zeigt, daß die hochgereinigten und stabilisierten erfindungsgemäßen Enzymkonzentrate eine immobilisierte Glucoseisomerase
mit höherer Bindungskapazität liefern können als auf übliche Weise solubilisierte Glucoseisomerase. Aus gemäß Beispiel
1 a) hergestellten, intrazellulare Glucoseisomerase enthaltenden ganzen Zellen wurde solubilisierte Glucoseisomerase hergestellt.
Um die Gewinnung der ganzen Zellen zu unterstützen, wurden der Kulturbrühe Filterhilfe (Sil-Flo) und Magnesxumhydroxyd zugesetzt
und das Gemisch dann mit Propan-2-ol gewaschen, getrocknet
und in einer Wiloy—Mühle gemahlen, Während der Extraktion der
Glucoseisomerase au3 den Zellen wurde das die Zellen enthaltende
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Gemisch, mit so viel Ilasnesiurasulf athoptahydrat behandelt, daO
die Aufschlämmung 0,01 Mol Kagnesiumsalz/Liter enthielt, und
mit 0,1 ia Kalilauge Jiuf einoxi pH-Wert von 8,0 eingestellt.
Das roho Glucoseisonierase-ISnzyin wurde aus einor 6,5 sPrOue(wie
Material vorlag) trockenem Zellprliparat mit j50 ml j'xtraktionsmittel
extrahiert. Das Gemisch vurde '*5 Minuten bei Raumtemperatur
serührt und dann bei ^0C zentrifugiert. Dabei wurden hZ ml
eines Extraktes mit einer Isoraeraseaktivit"it von 26 bis 27
IGIU/inl erhalten» Die so hergestellte Glueoseisomerasc-Eazyralös*m~
und das orfindungsgemliße stabilisierte Enzymkonzentrat
(hergestellt nach Beispiel 1 b)) wurden nach folgenden Verfahren an eine Vielzahl verschiedener wasserunlöslicher
Träger sorbiort:
In einem 150 ml fassenden Becherglas vurdon jeweils 2 g (Trockensubstanz)
dos wasserunlöslichen Trägexs mit 30 ml einer mit
KOH auf pH 8,0 ein^3stellteiiO,(M-molaren Magnesiumsulfatheptahydratlösung
vermischt. Diesem Gemisch wurde so viel IsomeraSefliiösigköit (entveder die auf herkömniliche Weiso solubilisierte
Isomerase oder das erfindungsgeitviße Enzymkonzentrat)
zugesetzt, dai) der Träger (je nach seiner Kapazität)
mit 1000 bis 2000 IGIU in Kontakt gebracht vurde. Danach wurde durch Zugabe weiterer 0,Oi-molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung
das Flüssi^coitsvolunien auf 50 ml ergänzt. Das
das Enzym und den wasserunlöslichen Träger enthaltende Gemisch wurde dann zunächst 30 Minuten durch Rühren gründlich durchgemischt,
und darauf filtriert und mit der 0,01-molaren Magnesiuiasulfatheptahydratlösung
gewaschen. Die Filtrate und Wascliflüssigkeiten wurden dann vereinigt und in einen 25O-ml—
Moßkolben überführt, wo sie durch Auffüllen bis zur Eichmarke
mit O,01—molarer Magnesiumsulfatheptahydratlösung verdünnt
und danach in Vergleich zum ursprünglichen löslichen Isomeraso-Enzympräparat
mit Hilfe eines automatischen Analysengeräts (Technician Auto Analyzer) auf ihre Isoraerasoaktivität untersuch
t vurd on.
Die "Dindun^skapasitüt" ("BC") der jeweiligen wasserunlöslichen
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durch
Träger vux-de/Differenzrechnung nach folgender Formel berechnet:
Träger vux-de/Differenzrechnung nach folgender Formel berechnet:
Gesaaite vorhandene Gesamte Aktivität in
"BC" /~IGITl/c T.SJ = Aktivität £~TC>:DJ7 ~ Nitrat u. Vo.schwa.ssQr
g Trägertrockensubstanz
In der Tabelle XI sind die Ergebnisse dieser Versuchsreihe
zuscsn^njsfaCt, in der die Bindungskapazitivten! vcrschiedonor
Träger für auf normale bzw. bekannte Weise solubilisierte Glucoscisoraerasc einerseits und das stabilisierte Enzynüconzentrat
der Srfindung andererseits miteinander verglichen
werden.
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sierter Glucoseisomerase
Träger
Ani onsnaus tausch Qx'harz
handluns Verwendete
Isomerase
Isomerase
(a 3indun<rsk» pa-
^ .....
zxtat
zxtat
(IGIu/g T.s.)
Ainberlite IRA-933 Puffer
Amberlite IRA-93S Puffer
Amborlite IRA-93 Puffer
Amberlite IRA-93 Puffer
(c (c
N SSC
!d ^j -^
152
333
37
113
DEAE Cellulose
Selectacel - Type
20 M^SO.
Selectacel - Type
20 Puffer
Sel'ectacol - Type hO
(el | S2C |
(b | N |
(d | |
851
936
N= Normale lösliche Glucoseisomerase;
SEC = Erfindungsgemäßes, stabilisiertes Enzymkonzentrat.
Pufferlösung, enthaltend 0,05 m pH 7t5 Kaliumphosphatpuffer,
0,01 m MgS0/.7Ho0 und 0,001 m ö
'° Tris-Puffer (0,05 m, pH 7,5),enthaltend
0,01 m M-SO4*7H2O.
(d 0,01 m NgSOf|'7H0O, eingestellt auf pH 8,0 mit 0,1 η KOH.
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Die in der Tabelle XI angcgobcnsn Werte zeigen, daß die Bindungskapasitüt
von DSAE-Cellulose für das erfindungsgemäSo
stabilisierte Enzymkonzcntrat nahezu zweimal so hoch vie die für in herkömmlicher T/eise solubilisiortes Enzym ist, sowie
daß auch die synthetisehen Anionenaustauscherharze für die
CTfindungsgemüßen Enzyrnkonzentrate eine zwei- bis dreimal so
hohe Biridungskapazität aufweisen, wie für das zum Vergleich untersuchte, in herkömmlicher T/eise solubilisierto Enzym.
Im Verlauf dieser Versuche wurde außerdem gefunden bzw. festgestellt,
daß die Bindungskapazität von DE-1VE-CeIIuIoSe für
das erfindungsgemäße stabilisierte Enzymkonzentrat beträchtlich gesfccj-gert wird, wenn man den Träger bei einem niedrigeren
pH-Wert vorkonditioniert, Beispielsweise bindet der TrLigcr bei
einem pH-Wert von 6,5 3120 IGTU/g, während der unbehandelte
Träger nur 1ö3'f IGIU/g zu binden vermag. Durch die Verwendung
des erfindungsgemäßen stabilisierten Enzymkonzentrats war es möglich, an DEAE-Cellulose (Type 20) pro dm3 0,386 Mill. ("MM")
IGIU zu binden. Dor so erhaltene Biokatalysator"1 konnte dann
zur,Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigcn Maissirup
durch kontinuierliches Durchleiten einer Glucoselösung durch den Biokatalysator, der in Kolonnen bzw. Säulen oder in Druck-Blattfilter-Elementen
angeordnet werden konnte, verwendet werden.
Aus Tabelle XI ist auch zu ersehen, daß die höchste unter Verwendung
auf herkömmliche Weise solubilisierter Glucoseisomerase erreichte Bindungskapazität 936 IGIU/g betrug und bei
Selectacel Type '+0 erreicht wurde, das eine AustauschkapazitMt
von 0,89 mäq./g besaß. Obwohl Selectacel Type 20, das eine Austauscherkapazität von 0,87 mliq/g hatte, eine etwas
niedrigere Bindungskapazität als die Type ^O aufwies, ist es
für den Einsatz in der industriellen Praxis besser geeignet, weil es eine größere Teilchengröße besitzt und daher bessere
FlieOgeschwindigkeiten zu erzielen sind.
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Beispiel 12
Bei den nachfolgeiiden Vorsuchen wurde das erfindungsgemü-Oe
stabilisierte Enayialcon^cntrat an einer Anzahl verschiedener
wasserunlöslicher Trüger immobilisiert und dann jeweils bezüglich seiner Verwendbarkeit bei der lcontinuierlichen enzyraatischen
Umwandlung von Glucose in hochfructosehaltigen Maissirup srprobt. Zum Vergleich v/urden auch kontinuierliche Umwandlungen
unter Verwendung !!.mobilisierter ganzer Zellen durchgeführt.
Für die Umwandlungen wurde außer in den Fällen, in denen in der Tabelle XII etwas angegeben ist, jeweils eino Kolonne
bzw. Säule mit den Abmessungen 1,5 -- 5 cm verwendet.
Die Kolonnen wurden vorbereitet, indem zunächst am unteren Ende
ein Gl asvol3p.fr opfen eingesetzt und die Kolonne dann teilweise
mit Wasser gefüllt vurde. Bei der "Verwendung wasserunlöslicher
TrcLger wurden diese dann in die Kolonnen gefüllt und mit
einem Glaswollpfropfen abgedeckt. Dann wurde das erfindungsgemüße
stabilisierte Snzymlcoazentrat (Beispiel 1b), Ansatz i) langsam
durch die Kolonne geführt, worauf mit einer kleinen Menge destillierten l/assers nachgewaschen wurde. Die Wasch— und
anderen Kolonnenabläufe wurden vereinigt und auf ihre Glucoseisomcraseaktivität
untersucht. Die in der Kolonne sorbierte Enzymrnenge wurde durch Differenzrechnung ermittelt.
Bei der Verwendung immobilisierter ganzer Zellen (das Sil-Flo—
Filterhilfe enthaltende Produkt von Beispiel 1 a)) wurden 5 g des Enzympräparats mit oder ohne Zusatz von 100 mg Magnesiumhydroxyd
in die Kolonnen gefüllt, worauf ebenfalls Glaswollpfropf
cn aufgesetzt wurden.
Zur Durchführung der kontinuierlichen Umwandlung wurden die Kolonnen jeweils kontinuierlich mit einer durch Auflösen kristalliner
Dextrose erhaltenen, 50 Gew.-jSigen, d.h. 600 g Glucose/
Liter Lösung enthaltenden Glucoselösung beschickt, die pro Liter
0,00'» bis 0,0055 Mol Magnesiumsulfat enthielt und einen pH-Wert
von 8,:>l· bis 8,6 besaß. Die Kolonnen wurden erforderlichenfalls
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ORIGIUAUINSPECTED
ins Gleichgewicht gebracht und die kontinuierliche enzymatische
Isomerisation bei 60 C durchgeführt, indem durch den Mantel
der Kolonnen jeweils 60 C warmes Hasser gepumpt wurde. Der
Durchfluß der den Kolonnen zugeführten Lösung durch die Kolonnen wurdo durch Anlegen eines Vakuums am Kolonnenboden und durch
Aufpressen von Stickstoffgas auf die Beschickung aufrecht erhalten. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde durch Variieren
dos auf der Beschickung lastenden Gasdrucks reguliert. Die anscheinende Knzyinaktivität "KS" irurde nach der Beziehung
Le KE = BVH χ log
fo Le - % L
bestimmt bzw. errechnet, in der
BVII die Säulenfließgeschwindigkeit in 3ettvolumina/h,
f} Le dsn Doxtrose/Fructose-Gleichgewichtswert, der bei
6O°C 51,2 betrügt,
und
i'i L den Kofcosegohalt des Kolonnenablaufs
bedeuten.
Die Süulenflicßgeschwindigkeit in Bettvolurni.ua pro Stunde bei
einem Lävulosogehalt von h5 r/it abgekürzt "BVHr " ist somit
gleich KS/O,916.
Die Halbwertszeit, d.h. diejenige Zeit, die erforderlich ist,
bis die Hälfte der "anscheinenden Aktivität" der Kolonne verloren gegangen ist, wurde bestimmt, indem während einer 2 T/ociien oder
länger dauernden Kolonnenbetriebsperiode Proben gezogen und an ihnen die "KE" gemessen wurde. Die dabei erhaltenen Analysenwerte wurden graphisch ausgewertet, indem in einem Diagramm
InIvS saS°^ die Zeit aufgetragen und aus der Steigung der dabei
erhaltenen Kurve, die nach der Methode der kleinsten Pelderquadrate
bestimmt wurde, die Halbwertszeit erhalten.
Bei dieser Methode wird unterstellt, daß der Abfall der Enzytnaktivit"t
wie eine Reaktion erster Ordnung vorlliuft. Die anfängliche
bzw. ursprüngliche Slmlenfließgeschwindigkeit in
Bettvoluminii/h bei einem Lävulosegchalt von 45 r/as BVH. , wurde
aus dnm Schnittpunkt a.rr Regressionsgeraden (intercept of
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the least square lino) bestimmt. Die Effizienz , "Eff", wurde nach der Beziehung
Eff = BVH;4t, /MM IGIU/dm3
bestimmt.
Die bei diesen kontinuierlichen Umwandlungen erzielten Ergebnisse
sind in der nachfolgenden Tabelle XXI wiedergegeben.
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s i or t or GIu c c s e i s piri er a ξ c -Siizympr up ar at e
Durchsclinit to-
Kontinuicrlichcs Konversions- beladung „ Effizienz
system (MM IGIU/dm"5)
O | |
co | |
OO | |
co | |
co | |
O | CD |
3) | co |
O |
ro
"Aluiniiiiumoxyd mit ^erogeltor
Porosität" ')
Porosität" ')
Easi sehes Magnesiuincarbonat
DEAE-Rois '
DEAE-Ccllulose (selectacel-20)
DEAE-Stärke
DEAS-Holzchips ''
Darco S-51 Carbon
Ar.iberlite IRA - 9O4
Amberlite IRA - 937
Sil-Flo/Zellon (kein Mg (01I)0
Sil-Flo/Zellen + Mg
0,499
0,0689
0,114
0,314
0,0353
0,37·?
0,00566
0,223
0,0138^
0,0676
0,0781
0,61 0,.?9 0,57 0,51 0,39
0,22 0,22 0,49 1,13
0,49 0,44
Halbwer ^eit |
"fc 3 ·— | Aktivität nacli zwei Halbwertszeit on (at 2 Half-Lines) (lGIU/ί-ΐ T. 3.) |
09 |
48 | o, | 26 | |
36 | o, | 35 | |
14 | o, | 42 . | |
12 | o, | 60 | |
11, | O | o, | 65 |
IS, | 3 | o, | 12 |
5, | 6 | — 9 | 15 |
37, | 0 | o, | 5Ί |
4, | 3 | ο, | 38 |
14 | ο, | 36 | |
17 | 0, |
1) Es wurden das in den US-Patentschriften 3 85Ο 751, ..
3 868 304· und 3 982 997 beschriebene "Aluminiumoxyd mit geregelter Porosität" als Enzyintrügor
und - vie bei allen anderen Versuchen dieser Reihe - eine (3,0 χ 18 cm) Mantclkolonne
verwendet, die wie folgt gefüllt und voi-beroitet wurde; In die Kolonne wurde
zuerst eine 3 mm hohe Schicht aus Glasperle!! eingefüllt, die mit einem feinmaschigem
Sieb abgedeckt wurde. Dann wurdo die Kolonne teilweise mit. 0,1 111 Magnosiuiüacetatlösung
gefüllt, worauf 55,6 g Träger eingefüllt wurden und die Kolonne mi t der 0,1 in l.agii« --t lnm
ac et at lösung rüclzge spült v.oirdc, uir» das Bett zu fluidisieren. Dcum wurde der Ti"ägei·
mit einem feinmaschigen Sieb abgedeckt, auf das Glasperlon
gefüllt i/urden. Schließlich wurde auf die Kolonne stabilisiertes
Enzymkonzenfcrat in einor 'fO 000 bis 45 000 TGITJ ent
surechindon Menge aufgegeben und die Kolonne dann mit der
0,1 m Magnosiurnacotatlösung gewaschen.
2) Es wurde eine (3»0 ;: 18 cm) Mantelkolonne wie in Fußnote 1)
beschrieben vorbereitet, wobei jedoch abweichend davon statt der Nagnesiumacetat- eine Magnesiumsulfatlösung verwendet
wurde und das Enzym schon vor dem Tüllen der Kolonne
bzw. Säule auf bzv. an den Träger wie folgt aufgebracht bzw. sorbiert i.-urde :
3S s Reis bzw. Holzchips wurden mit HCl behandelt, mit liasssr
gewaschen und danach in 750 ml 0,1 m Magnesiumsulfatlösung, die S ml des stabilisierten Snzymkonzantrats von
Ansatz 1 enthielt, suspendiert.
Die in der Tabelle XII angegebenen Daten zeigen, daß das stabilisierte
Enzymkonzentrat der Erfindung effizient an einer Vielzahl wasserunlöslicher Trägor sorbiert und zur kontinuierlichen
Umwandlung von Glucose in hoch-fructosehaltige Mais3irupe verwendet
werden kann. Die beste Enzymausnutzung würde beim Sor—
biegen bzw. Immobilisieren dos stabilisierten Enzymkonzentrats
an dem Aluminiumorcydträger mit geregelter Porosität erzielt.
Die dabei erreichte hohe Enzymausnutzung ist das Ergebnis der
dadurch erzielten hohen Effizienz und langen Halbwortszeit. Das basische Magnesiumcarbonat und die synthetischen Anionenaustauscherharζträger
(Amberlito ΙΚΑ-9Ο^) lieferten in Kombination
mit dem erfindungsgemlißen stabilisierten Enzymkonzentrat bei der
kontinuierlichen Umwandlung ebenfalls gute Ergebnisse.
Die verstehend in bezug auf den Aluminiuaiortydträger mit geregelter
Porosität beschriebene Arbeitsweise wurde unter Verwendung des stabilisierten Enzymkonzentrats von Beispiel 3 wiederholt. In
der Tabelle XIII sind die bei diesem Versuch erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt.
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ORIGINAL INSPECTED
Effekt der Enzynibe ladung bei· kontinuierlicher Umwandlung * | Sorbierto Isonoraseak tivität (MM IGIu/dmJ) |
Sorbicrtos Enzym (;S) Effizienz |
Halbwerts zeit (Tage) |
Angebotene Isomerasc- (gesaint )-akti~ vitat „ (*!M IGIU/dmJ |
13,9 | 93 0,5 | 66 |
14,2 | 18,4 | 91 0,45 | 61 |
20,2 | 19,6 | 75 0,43 | 6O+ |
26,3 |
v Dor Alui:tiniumo.:yd träger mit gerojoltor Porosität und einer
spezifischen Oberfläche von 80 rn-/g enthält, bezogen auf
Trockensubstanz, 97 bis 98 °i Al0O0 und 2 bis 2,4 f0 M^O,
wie in der US-PS 3 982 997 be ->J schrieben.
Das stabilisierte Enzjxikonzentrat der Erfindung läßt sich
effizient an dem Aluininiuincxydträger mit geregelter Porosität'unter
Bildung eines Biokatalysators sorbieren, der zur
kontinuierlichen Umwandlung von Glucose in hoch-fructosehaltige
Maissirupe gut geeignet iet. Die hohe Bindungsoffizionz und
die lange Halbwortszeit dieses Biokatalysators ermöglichen seinen wirtschaftlichen Einsatz in großtechnischen Verfahren,
Bei s p. IeI1
11
13
Wenn auch in den vorhergehenden Beispielen nur die Verwendung von Propan-2-ol als vasscrmischbares organisches Lösungsmittel
bei der Herstellung der stabilisierten Enzyrnkonzentrate erlLlutort
ist, so können erfindungsgemäß, wie bereits erwähnt, jedoch auch noch andere wassermischbare organische Lösungsmittel
verwendet werden. Der nachfolgende Versuch wurde durchgeführt,
um die Verwendbarkeit anderer wassermischbarer organischer
Lösungsmittel als Propan-2-ol aufzuzeigen.
Gemäß Beispiel 1 a) wurde eine intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Kulturbrühe mit einer Isomerascaktivitat von
18,1 IGIU/g Kulturbrähe hergestellt. Diese Kulturbrühe wurde
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filtriert, wobei eino Zollpasto mit einer Isomeraseaktivität
von 120 IGIU/g erhalten wurde. Die Zellpastc wurde mit einem
Lysozvm-Enzympröparat behandelt, um die Zollwündo der intrazellularen
Glucoseisomorase abzubauen. Die löslichen Bestandteile des so erhaltenen Lysats besai3en eine Isoinorasoaktivität
von 123 IGITj/g. Das Lysat wurde mit so viel Wasser verdünnt,
daß seine Isoir.oraseaktivität nach dem Verdünnen 110 IGTU/ml
betrug. Proben von jeweils 50-ml dieses Lysats wurden jeweils
allrnlvlilich mit einen der nachstehend angegebenen vassorraischbaren
organischen Lösungsmittel versetzt. Dabei v/urde jeweils
so lange Lösungsmittel zugesetzt, bis das Isomeraseprotciii
gerade auszufallen begann. Das Lösungsrnittel/Lysat-Gemisch
-..-ar el ο Jana jeweils 5 i>±s 10 Minute. ^. o;v'.:.::.rt, vorauf das
unlösliche Material, einschließlich der Zelltrümmer und NucleinsLluren
dui'ch Zentrifugieren abgetrennt vurde. Proben von jeveils
20 ml der flciboi gevonnenon üborstchcndon Flüssigkeiten
■!vxirdcn daiua unter Rühren mit 1 ml einer 1-molaren Kagnesiumsulfathcptahydratlosung
(5 Vol.-"') und so viel Lösungsmittel
versetzt, wie erforderlich war, urn die durch die zugesetzte Magnesiumsulfatlösung bedingte Verdünnung der Probe
in bezug auf den Lösungsmittolgchalt auszugleichen. Die die
zellfreic Glucoseisomerase, das wasserraischbare organische
Lösungsmittel und Magnesiumsulfatheptahydrat enthaltenden
wäßrigen Gemische wurden dann jeweils etva 15 Minuten stehengelassen,
vobci sie zwischendurch gelegentlich gerührt wurden.
Dann lmrdan die Gemische zentrifugiert, wobei die ausgefällten
stabilisierten ISnzymkonzentrate als Produkt gewonnen wurden.
Die F.rgobnisso dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle
XIV wiedergegeben.
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Tabelle XIV
Pro | Volumen Ly- | Aktivitäts | Spezifische tivität ^a (lGIU/πίΤ IJro |
Ak- | |
L ö sung.jnii 11 e 1 | sat mit |
zug. Lösunis- t elvolumina* u |
auabcute | 11 ,8 | toin) |
Propan-2-ol | 1 | 100 | 10,0 | ||
Aceton | 0,8 | op | 12,0 | ||
Methanol | 2,k | 37 | 11,6 | ||
Λ* than öl | 1,3 | 98 ; | 10,5 | ||
Propan-2-ol | 0,8 | 82 | 6,4 | ||
t—Butanol | 0^65 | 95 | 5,7 | ||
fb p-Dioxanv |
0»7 | 25 |
v Privtoi.li für spezische Alctivität liurde anhand der optxschen
Dichte bei 230/2Ö0 inn bestimmt.
g mit 10 Vol.-"» 1 ra MgSO. -Lösung; alle anderen Fällungen
mit jeweils 5 Vol.-^s 1 m MgSO^1 -Lösung.
Das Lysat hatte eine spezifischs Aktivität von etwa
2 ICIU/n-r Protein.
Aus den vorstehenden Versuchsergebnissen bzw, -werten ist zu ersehen, daß eine Reihe verschiedener wassermischbarer organischer
Lösungsmittel wirksam für die Zwecke der Erfindung verwendet werden kann . Die Alkohole und Ketone mit bis zu 3 C-Atomen
erwiesen sich als die bezüglich der selektiven Gewinnung des Isomorascenzyms wirksamsten Lösungsmittel. Ihre Verwendung
stellt daher eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der
Erfindung dar. Aus den vorstehend angegebenen. Werten ist weiterhin
zu ersehen, daß umso mehr Lösungsmittel erforderlich ist,
um die Isomerase wirksam bzw. in hoher Ausbeute und selektiv zu gewinnen, je niedriger das Molekulargewicht des betreffenden
Lösungsoitteils ist. Beispielsweise benötigt man zur selektiven
Abtrennung bzw. Gewinnung pro Volumen Lysat bei der Verwendung von Methanol 2,'l· Volumina (etwa 67 Gew.-;'), bei der Verwendung
von Propan-2-ol diigegen nur 1 Volumen (^2 Gow.-;o),
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ORIGINAL INSPECTED
•»J.
Es sei darauf hingewiesen, daß der Fachmann die in den vorstehenden
Beispielen erlliuterte Erfindung ohne weiteres in vielerlei Hinsicht abwandeln und modifizieren kann, ohne den
Rahmen des in der Beschreibung offenbarten und in den Ansprächen gekennzeichneten Erfindungsgedankens zu verlassen.
Es sei abschließend darauf hingewiesen, daß ein wichtiges Definitionskriterium der erfindungsgemäßen stabilisierten
Glucoseisomeraseenzymkonzentrate neben dem Proteingehalt, dem
Magnesiumgehalt, dem Verhältnis dieser beiden Größen und der spezifischen Isomeraseaktivität eben die Stabilität ist, die
so groß ist, daß das Präparat bei bis zu 30-tägiger Lagerung bei 26°C mindestens 80^-10% seiner ursprünglichen Stabilität
beibehält. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden mehr als 90% der anfänglichen Isomeraseaktivität unter diesen Bedingungen
beibehalten.
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Claims (1)
1. Stabilisiertes Glucoseisomurase—Enzymkonzentrat, dai
1) zellfreie Glucoseisomerase, die im wesentlichen
nucleinsäurefrei ist,
und
2) Mg++
enthält, gekennzeichnet durch
a) einen Proteingehalt von etwa 50 bis 80 Gew.-0Io1 bezogen
auf Trockensubstanz,
b) einen Mg -Gehalt von etwa 3 bis ^5 mg/ml Enzymkonzentrat ,
c) ein Mg /Protein-Verhältnis von etwa 0,02 bis 0,75,
d) eine spezifische Isomeraseaktivität von mindestens
etwa 10 IGIU (international-Glucose-IsomDrase-Units =
t Internationale Glucoseisomeraseeinheiten)/mg Protein
und
e) eine so hohe Stabilität, daß es bei bis zu 30-tägiger
Lagerung bei 2£j C bis zu 95 ~'o seiner anfänglichen
Isomeraseaktivität behalten kann.
2. Enzymkonzentrat nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Proteingehalt von etwa 60 bis 75 Gew.-$, bezogen auf
Trockensubstanz.
3. Enzymkonzentrat nach Anspruch 1 oder 2, gekennzoichnet
duro'i ein Mg /Proteinverhältnis von etwa 0,03 bis 0,5 und
einen Mg —Gehalt von etwa 5 bis 25 mg/ml Enzymkonzentrat.
h. Enzymkonzentrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich etwa 5 bis 25 Gew.-$
eines wassermischbaren organischen Lösungsmittels, insbesondere
Propan-2-ol, enthält.
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ORIGINAL INSPECTED
- 66 -
2712U07 «*· ·
5. Enzymkonzentrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
h, gekennzeichnet durch einen Wassergehalt von etwa 50 bis 80
und einen Trockensubstanzgehalt von etwa 5 bis 30 Gew.-fo.
6. Enzymkonzentrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch eine Aktivität von mindestens etwa
5000, vorzugsweise mindestens etwa 8000, IGIU/g Trockensubstanz,
7. Enzymkonzentrat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine so hohe Stabilität besitzt, daß es bei bis zu einjähriger
Lagerung bei 18 C mindestens etwa 80- 10$ seiner
Anfangs-Isonicraseaktivität behält und vorzugsweise eine spezifischo
Isoineraseaktivität von mindestens etwa 12 IGIU/mg Protein
aufweist.
8. Enzymkonzentrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß die darin enthaltene GIucoseisonierase
von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces,
insbesondere von Mikroorganismen der Stämme Streptomyces
olivochromogenos ATCC Nr. 21 713, ATCC Nr. 21 71^ und/oder
ATCC Nr. 21 715 einschließlich deren Varianten und Submutunton
stammt.
9. Enzymkonzentrat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es kein zugesetztes Kobalt
enthält.
10. Enzymkonzentrat nach mindestens einem der Ansprüche 1
bis 9» insbesondere den Ansprüchen 2, 3» 7 und 8, dadurch gekennzeichnet,
daß es etwa 20 bis 30 Gew.-Jo Propan-2-ol und
etwa 55 bis 70 Gew.-^ Wasser enthält, sowie daß sein Mg Gehalt
aus Magnesiumacetat, -chloride und/oder -sulfat stammt.
11. Verfahren zur Herstellung eines stabilisierten Glucoseisomerase-Enzymkonzentrate,
insbesondere eines Enzymkonzeiitrats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
daß man
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.3.
a) durch Behandeln eines zellfreie Glucoseisomerase und
wassermischbares organisches Lösungsmittel enthaltenden
wäßrigen Gemisches mit einem im wesentlichen wasserlöslichen Magnesiumsalz in einer Menge, die eine Magnesiummolarität
von etwa 0,002 bis 0,3 (Mol Magnesiumsalz/Liter Gemisch) im Gemisch ergibt, im Gemisch
ein stabilisiertes Enzymkonzentrat aus einer Enzym-Magnesium-Fällung erzeugt
und
und
b) das stabilisierte, konzentrierte Glucoseisomerase, Magnesium in einer einer Mg -Molarität von etwa 0,1
bis 2 entsprechenden Menge, Wasser und vassermischbares
organisches Lösungsmittel umfassende Enzymkonzentrat gewinnt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als im wesentlichen wasserlösliches Magnesiumsalz Magnesiumacetat,
»-chlorid und/oder -sulfat verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet,
daß man als wassermischbares organisches Lösungsmittel Methanol, Äthanol, Propanol, tert.-Butanol, Aceton, p-Dioxan
und/oder vorzugsweise Propan-2-ol verwendet.
Tk. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13f
dadurch gekennzeichnet, daß man das organische Lösungsmittel
in der Verfahrensstufe a) in einer einem Gehalt von etwa 30 bis
60 Gew.-Jo, bezogen auf das Gemisch, entsprechenden Mange verwanden.
15· Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 1^,
dadurch gekennzeichnet, daß das zellfreie Glucoseisomerase und
wassermischbares organisches Lösungsmittel enthaltende wäßrige Gemisch hergestellt wird, indem man
intrazellulare Glucoseisomerase enthaltende Zellen in
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Anwesenheit von Wasser mit wassermischbarem organischem
Lösungsmittel und einem Lysozym—Enzympräparat behandelt,
ß) das Lysozym-Enzyin auf das Zellmaterial einwirken läßt,
wodurch dieses unter Bildung von unlöslichen Substanzen aus Zelltrümmern und Nukleinsäuren und löslichen
Substanzen aus zellfreier Glucoseisomerase, wassermischbarem organischem Lösungsmittel und Wasser
abgebaut wird,
.;") die unlöslichen Substanzen abtrennt
und
A) dabei ein wäßriges, zellfreie Glucoseisomerase und
wassermischbares organischnj Lösungsmittel enthaltendes
Gemisch gevinnt,
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß
man dem die Zellen enthaltenden wäßrigen Gemisch so viel was —
sermischbares organisches Lösungsmittel, insbesondere Propan-2-ol,
zumisch^, daß der Lösungsmittelgehalt der erhaltenen wäßrigen Mischung etwa kO bis h3 Gew.-Jo beträgt.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man jeweils so viel Lösungsmittel zusetzt, wie erforderlich ist, um in den Verfahrensstufen λ) , β) und <Γ)
einen Lösungsmittelgehalt von etwa 42-1 Gew.—Ja aufrechtzuerhalten.
18. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 17,
dadurch gekennzeichnet, daß das Lysozym-Enzym vor dem Lösungsmittel,
insbesondere Alkohol, zugesetzt wird.
19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18,
dadurch gekennzeichnet, daß in den Verfahrensstufen Λ), ß) , <f)
und Λ) jeweils so viel Lösungsmittel, vorzugsweise Propan-2-ol,
zugesetzt wird, wie erforderlich ist, um die Lösungsmittelkonzentration
bei etwa ^2-1 Gew.-^o zu halten.
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20. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 19»
dadurch gekennzeichnet, daß Glucoseisoraerase verwendet wird,
die von einen Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, insbesondere
Mikroorganismen der Stämme Stroptoniyces olivochrorrogenss
ATCC Nr. 21 713, ATCC Nr. 21 7 i *» und/oder ATCC Nr. 21
einschließlich ihrer Varianten und Submutanten stammt und vorzugsweise
gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 bis 19 aus
den Zellen abgetrennt und gewonnen vird. ;
21. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, daß das die zellfreie Glucoseisomerase
und das Lösungsmittel, insbesondere Propan-2-ol, enthaltende
wäßrige Gemisch mit Magnesiumsulfatheptaliydrat in einer
Menge behandalt wird, die einer Konzentration von etwa 0,05 Mol
dieses Salzes pro Liter entspricht.
22. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man das in der Verfahrensstufe D
gewonnene stabilisierte Enzymkonzentrat mit einer kleinen Menge Wasser verdünnt.
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US05/668,380 US4077842A (en) | 1976-03-19 | 1976-03-19 | Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2712007A1 true DE2712007A1 (de) | 1977-09-29 |
DE2712007C2 DE2712007C2 (de) | 1987-09-10 |
Family
ID=24682100
Family Applications (1)
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