Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rozpuszczalnego w wodzie, trwalego enzymatyczne¬ go koncentratu izomerazy glikozowej, wykazujace¬ go wysoka altotywnosc wlasciwa i trwalosc w cza¬ sie przechowywania.Stosujac dekstroze, która jest monosacharydem w 70%, tak slodkim^ jak sacharoza lub cukier inwe¬ rtowany, przeksztalca sie ja w polowije do cukru, okolo 140% tak slodkiego, jak sacharoza lub cukier inwertowany. Uzyskanie dodatkowej wlasciwosci slodzenia ma znaczenie praktyczne w produkcji slo¬ du z ziarnem kukurydzy, syropu kukurydzianego, zawierajacego lewuloze (znanym powszechnie jako syrop kukurydziany o duzej zawartosci fruktozy -HFCa) . iZ opisu patentowego 'Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 2 950 2218 i z publikacji Marshalla i Kooi (Science, li25„ 648, 1957) znane sa badania nad en¬ zymatycznymi procesami izomeryzacji. Wyniki prac Marshalla i Kooi inspirowaly od tego czasu badania tego problemu, w wyniku którego ukazalo sie wiele opisów patentowych i publikacji Wyniki badan o duzym znaczeniu zos/taly przed¬ stawione 20 li|pca 1964 r. przez Sato i Tsamiura z Japonskiego Instytutu Zywienia, na Zjezdzie Towa¬ rzystwa Chemii Rolniczej w Japonii, w Saporm W publikacji tej i w japonskim opisie patentowym nr 17 640 z 7 pazdziernika 1966 r., Siato i Tsamura podaja, ze wiele szczepów drobnoustrojów z rodza¬ ju Sfcreptomyces, podczas wzrostu na podlozu, za- 10 15 20 25 30 wierajacym ksyloze wytwarzaja izomeraze glikozo- wa, która wykazywala aktywnosc przeksztalcania glikozy do fruktozy.Tasaki i wspólpracownicy z Japonskiego Instytu¬ tu Fermentacji, stwiterdzili, ze szczepy drobnoustro¬ jów z rodzajiu Sitreptomyces, przyswajajace ksylan (polimer ksylozy), podczas wzrostu w podlozu z ksylanem wytwarzaja izomeraze glikozowa. Wyniki badan TakaJsaki i wspólpracowników zawarte sa w japonskim opisie patentowym nr 27 5i25 i ,w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 610 231.Producenci syropu z kukurydzyt bogatego we fruktoze, stwierdzili, ze enzymatyczna izomeryza¬ cje glikozy powinno sie prowadzic w sposób ciagly, co uzasadniaja wzgledy ekonomiczne. W tym przy¬ padku syrop z glikozy poddaje sie dzialaniu pre¬ paratu izomerazy glikozowej, osadzonej na obojet¬ nym nosniku, to jest preparatu imimobiliizowanego izomeraizy o duzej aktywnosci izomerazy na jedno¬ stke objetosci preparatu, co pozwala na zastosowa¬ nie procesu ciaglego.Izomeraza glikozowa jest enzymem wewnatrzko¬ mórkowym, to znaczy wieksza czesc izomerazy znajduje sie wewnatrz i/lub na scianie komórkowej drobnoustroju wytwarzajacego. W niektórych ciag¬ lych procesach izomeryzacji stosuje sie cale komór¬ ki, zawderajace izomeraze glikozowa. W takich pro¬ cesach konieczne jest speiejalne przygotowanie ko¬ mórek, zapewniajace przenikanie izomerazy gliko- lll 980111 980 zowej z komórek. W tym przepadku wystepuje iim- mobiiiizacja enzymu wewnatrz komórek i/lub konie¬ czne jest stosowanie pewnych urzadzen, ulatwia¬ jacych przenikanie roztworu glikozy przez mase ko¬ mórek, zawierajacych ilzomeraze glikozowa. ce izomeraze glikoizowa, a nastepnie dializuje sie i oczyszcza metoda chromatografii na DEAE-Sepha- dex A-50, uzyskujac G04krotne zatezenie aktywnej frakcji.Inny sposób oczyszczania izomerazy glikozowej W opisach patentowych IStanów Zjednoczonych w skali laboratoryjnej opisany jest przez Takasaki Ameryki nr nr 3 604 314, 3 753 858, 3 779 869, 3 817 832, 3 821086 oraz w opisach patentowych wyloze- niowych RFN nr 2 3H7 &80 i nr 2 3(45 ld6 podane sa- sposoby, w których stosuje sie cale komórki, zawie¬ rajace izomeraze glikozowa; maja cne jednak wiele niedogodnosci. Mozna wsród nich wymienic zagad¬ nienia przenikania roztworów, powstawanie zanie¬ czyszczen w wynik^^innych procesów enzymatycz¬ nych niz izomeryzacji, wystepowanie kwasów nu¬ kleinowych i innych zwiazków w komórce, oraz przedluzony czas konWatu roztworu glikozy z en¬ zymem, zawartym w calych komórkach (w tym os¬ tatnim przypadku, w srodowisku alkalicznym pow¬ staja z fruktozy niepozadane produkty, jak psykoza f hydroiksymetylofurfural).Koniecznosc rafinacji w celu usuniecia zanie- czyszezerL i/Huto porrotawinie gorszego produktu, wplywaja na zwiekszenie kosztów wytwarzania.Rozwiazanie trudnosci, zwiazanych ze stoccwa- niem nienaruszonych komóriek z izomeraza glikozo¬ wa, zmierzaly do opracowania takiego sposobu, w którym izomeraza gKkozowa usuwana jest z komó¬ rek i nastepnie w postaci rozpuszczalnej jest immo- biliizowana na nosnikach obojetnych, nierozpuszczal¬ nych w wodzie. Immobiilizowany enzym stosuje sie nastepnie w ciaglych procesach przeksztalcania gli¬ kozy do syropu o duzej zawartosci fruktozy. Przy¬ klady zawarte sa w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 708 30.7, 3 758 945, 3 8(5(0 7l5|li, 3 809.304, w opisie patentowym beLgiijskdim nr-819 859 i nr 810 480.Sifcosowanie bezkomónkowych immoifedlizowanych preparatów izomerazy glikozowej w czesci rozwia¬ zalo trudnosci stosowania calych komórek. Pozostal jednajk etap przygotowania nierozpuszczalnej izo- merazy, to jest wydobycie enzymu z komórek. Spo¬ sób wytwarzania nierozpuszczalnych form izomera- zy glikozowej sa dobrze znane. Konieczne jest uzys¬ kanie preparatu bezkomórkowego z rozpuszczona izomeraza o wysokim stopniu oczyszczenia, oraz du¬ zej aktywnosci w przeliczeniu na jednostke objeto¬ sci Wysoki stopien czystosci i duze stezenie enzy¬ mu zwieksza efektywnosc osadzania enzymu na nie¬ rozpuszczalnym nosniku.Sposób ekstrahowania izomerazy glikozewej z ko¬ mórek drobnoustroju, jej oczyszczanie i zatezanie sa skomplikowane i móiga byc jedynie stosowane w skali laboratoryjnej..Danno i wspólpracownicy opisuja w Agr. Biol.Chem., tom 31, str. 2S4—203 (1967),- sposób ekstra¬ howania i oczyszczania rozpuszczalnej izomerazy gla'ko2)ojwlej- która uzyskiwano ze szczepu Bacillus eoagulans HN-l6i8, poddajac komórki dzialaniu kwa¬ su etylenodwuaminoczterooctowiego (EDTA) i lizozy- mu. Z bezkomórkowego ekstraktu enzymatycznego, uzyskanego w ten sposób, wytraca sie niepozadane skladniki siarczanem magnezowym. Z uzyskanego klarownego roztworu wytraca sie sia-rczanem amo¬ nowym w sposób frakcjonowany bialko, zawieraja- i wspólpracowników (Agr. Biol. Chem. tom 33f str. 1527—1534 (1969)) i w publikacji wydanej przez D.Perlmana „Fermentation Advanceis" str. 561—589, 10 Academic Press, Inc., New York, (19i69). iStwierdzo- no w niej, ze wewnatrz komórkowa izomeraze gli¬ kozowa uwalnia sie ze Streptomyces albus, dziala¬ jac kationowymi czynnikami powierzchniowo-czyn- nymi, ja|k chlorek cenitylopirydyniowy i nastepnie 15 przez frakcjonowanie enzymatycznego ekstraktu bezkomórkowego acetonem, dialize, oczyszczanie metoda chromatografii na kolumnach Sephadex i DEAE-celulozie i ponowna dialize. Niastepnie bez- komórkowy ekstrakt enzymatyczny oczyszcza sie 20 przez dialize w roztworze 0,005 M siarczanu magne¬ zu i 0,0002 M CoCl2. Izomeraza glikozowa krystali¬ zuje po1 stoipniiowym dodawaniu acetonu do steze¬ nia 40, 4i5 i w koncu 50%. Sposób ten jest zlozony i pracochlonny i dlatego nie znajduje zastosowania 25 w skali produkcyjnej. rw opisce patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 70i8 397 Sipos podaje sposób wytwa¬ rzania izomerazy glikozowej z komórek drobnous¬ troju Streptomyces phasochromogenes, hodowanego na podlozu z otrebami pszennymi, poddajac dziala¬ niu EDTA, roztworem lizozymu, toluenem, chlor¬ kiem magnezu, buforem i woda. Na papkowata ma¬ se komórek po lizie dziala sie chlorkiiem magnezu i enzym wytraca sie przez stopniowe dodawanie acetonu. Wytracony preparat enzymatyczny roz¬ puszcza sie w wodzie i osadza na DEAE-celulozie, a tak przygotowany stosuje sie jako biokatalizator w przeksztalceniu glikozy do syropu o duzej zawar¬ tosci fruktozy.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 7S8&45 Thompson i wspólpracownicy donosza o sposobie, w którym wewnatrzkomórkowa izomeraze glikozowa wytwarza sie ze Streptomyces sp. ATCC 2)1175, hodowanym na ksylozie i hydroli¬ zacie ksylanu, dzialajac kationowym detergentem (Arauad 18^50), i usuniecie na DEAE-celulozie in¬ nych skladników komórkowych niz izomeraza. Prze¬ sacz zawierajacy izomeraze glikozowa osadza sie na DEAE-celulozie lub syntetycznym wymieniaczu jo¬ nowym i tak przygotowany stosuje sie jako bioka¬ talizator w ciaglym procesie przeiksztalcania glikozy do syropu, zawierajacego duze stezenie fruktozy.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Amerylki nr 3 847 740 i nr 3 847 741 Head i wspól¬ pracownicy donosza o sposobie j wktórym wewnatrz¬ komórkowa izomeraze glikozowa wytwarza sie, dzialajac mala iloscia srodka powierzchniowo-czyn- nego Tween 80 w buforze glicynowym. Po doklad¬ nym wymieszaniu fragmenty komórkowe oddziela, sie. Uzyskany przesacz wykazuje aktywnosc izome^ razy glikozowej 17,5 jednositki/ml.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 847740 podany jest sposób irnrnobili- zowania oczyszczonych preparatów izomerazy gHko- ?5 zowej na zasadowym weglanie magnezowym, a t$- 30 35 40 45 50 55 60t 5 opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr nr 3 850 751 i 3 868 304 podany jest sposób wytwarzania imcmobilizowanej izomerazy glikozowej na tlenku glinowym o'okreslonych piórach. Tak im- mobiiizowany preparat enzymatyczny pozwala na uzyskiwanie syropów o wysokim stopniu zawartosci fruktozy. Stosujac enzym izomeraze oczyszczona zwieksza sie oplacalnosc procesu.Chociaz znane sa liczne sposoby wytwarzania izo¬ merazy to jednak potrzebne sa inne metody, które mozna stosowac w skald produkcyjnej przy wytwa¬ rzaniu tego enzymu w postaci rozpuszczalnej o du¬ zej aktywnosci na jednostka objetosci i wysokim stopniu trwalosci. Warunek ten jest niezbedny do wiazania sie enzymu z nosnikami nierozpuszczalny¬ mi w wodzie i stosowania w procesach ciaglych przy wytwarzaniu syropów z kukurydzy o duzej zawar¬ tosci fruktozy, jak równiez w innych procesach im- mobilizacji enzymów.Przedmiotem wynalazku jesit sposób wytwarzania rozpuszczalnego w wodzie trwalego enzymatyczne¬ go koncentratu polimerazy gddkozowej z bezkomór- kówej izomerazy glukozowej, polegajacy na tym, ze wodna mieszanine ibezkomórkówego enzymu izome¬ razy glikozowej i mieszajacego sie z woda rozpusz¬ czalnika organicznego poddaje sie dzialaniu roz¬ puszczalnej w wodzie soli magnezowej w ilosci, wy¬ starczajacej do uzyskania mieszaniny o stezeniu 0,0fir-0 3 mola soli- ma^ezu w stosunku do calej objetosci mieszaniny, a nastepnie otrzymany pro- dulct wyodrebnia sie w znany sposób.Jako sól magnezowa rozpuszczalna w wodzie sto¬ suje sie octan magnezowy, chlorek magnezowy i siarczan magnezowy. Jako rozpuszczalnik organicz¬ ny mieszajacy sie z woda stosuje sie metanol, eta¬ nol, 2-propanol, propanol, buianol-IIIrz., aceton i p-dioksan.W pierwszym etapie mieszajacy sie z woda orga¬ niczny rozpuszczalnik stosuje sie w ilosci 30—60"% wagowych. 2-propanol stosuje sie korzystnie w ilos¬ ci 4fiP/» (+ 1%) wagowych. Koncentrat, przechowy¬ wany w temperaturze 26°C w ciagu 30 dni, zacho¬ wuje przynajmniej 95°/o poczatkowej aktywnosci i przechowywany w temperaturze 13?C w ciagu jednego roku zachowuje 80 (± 101%) poczatkowej aktywnosci izomerazy.Enzymatyczny preparat zawiera przynajmniej 5000 miedzynarodowych jednostek izomerazy gliko- zowej/gram, korzystnie 8000 miedzynarodowych jednostek izomerazy giakozowej/gram suchej masy, oraz rozpuszczalnik organiczny mieszajacy sie z woda, na przyklad 2-propanol.Przedmiotem wynalazku jest równiez trwaly en¬ zymatyczny koncentrat izomerazy glikozowej z bez- komórkowej izomerazy glikozowej zawierajacy bez- komórkcwy preparat izomerazy gfldkozowej, pozba¬ wionej kwasów nukleinowych o aktywnosci wlasci¬ wej izomerazy wynoszacej co najmniej 10 miedzy¬ narodowych jednostek izomerazy gldkozowej/mg bialka, sól magnezowa, rozpuszczalnik organiczny mieszajacy sie z woda i wode, przy czym zawartosc bialka wynosi 50^-80,% wagowych, w stosunku do suchej masy, zawartosc Mg++ wynosi 3—45 mg na ml koncentratu enzymu, stosunek Mg++/bialko wynosi 0,021—0/75. 11 980 6 Koncentrat zawiera bialko w ilosci 60—T50/* wa¬ gowych suchej masy i Mg++ w ilosci 5—B5 mg/ml koncentratu przy stosunku Mg++/bialko 0,03—0,5, jako rozpuszczalnik organiczny mieszajacy sie. z wo- 5 da korzystnie zawiera 2^propanol, izomeraze gliko- zowa pochodzaca z drobnoustrojów, nalezacych do rodzaju Streptomyces, korzystnie z drobnoustrojów Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr 21713, ATCC Nr 21714 lub ATCCNr 21715. Korzystnie zawie- 10 ra bezkomórkowy preparat izomerazy glikozowej, po¬ zbawionej kwasów nukleinowych, pochodzacy korzy¬ stnie z drobnoustrojów Streptomyces olivochromo- genes ATCC Nr 21713, ATCC Nr 2171,4 lub ATCC Nr 21715, bialko w ilosci GQ—lQPfa wagowych w od- 15 niesieniu do suchej masy, Mg++ w ilosci 5—18 mg/mi koncentratu enzymatycznego, przy stosunku Mg++/bialko 0,03—0,5, aktywnosci wlasciwej wyno¬ szacej co najmniej 1|2 miedzynarodowych jednostek izomerazy glikozowej/mg bialka, 2-protpanol w ilosci 20 20^30?/* wagowych, wilgotnosci w ilosci „ 55^-708/«! wagowych, przy calkowitej aktywnosci izomerazy, wynoszacej co najmniej 8000 miedzynarodowych jednostek izomeraizy glikozowej/g suchej masy..Kompleks ten wyodrebnia sie metodami konwencjo- 25 nalnymi, na przyklad przez wirowanie. Stabilizowa¬ ny koncentrat enzymatyczny (w postaci gestej pap- kowatej zawiesiny) rozciencza sie mala iloscia wo¬ dy, w celu ulatwienia sorpcji na nosnikach nieroz¬ puszczalnych w wodizde i uzyskanie biokatatizaltora 30 immobilizowanej izomerazy glikozowej o wysokiej aktywnosci w przeliczeniu na jednostke objetoscio¬ wa nosnika.W wyniku procesu zatezenia, oczyszczania i sta¬ bilizacji uzyskuje sie 70-krotne zatezenie enzymu 35 w stosunku do wyjsciowego plynu hodowlanego, a nawet 100-krotny wzrost stezenia enzymu. Koncen¬ trat enzymatyczny wykazuje 10—^15 razy wieksza czystosc niz enzym w plynie wyjsciowym.Okreslenie ,AE." jest skrótem-,,równowaznik de- 40 kstrozy", które to termdny wymieniaja sie nawza- jem i odnosza sie do zawartosci redukcyjnego cuk¬ ru, przeliczonego na dekstroze która to zawartosc wyrazona jest w procentach wszystkich czesci sta¬ lych. , 45 Okreslenie „hydrolizat skrobi" uzywa sie w sto¬ sunku do syropu i suchego produktu, uzyskanego w wyniku hydrolizy skrobi, kwasnej lub enzyma¬ tycznej lub lacznie tymi dwiema metodami.Korzystnym sposobem hydrolizy skrobi do celów 50 izomeryzacji jest dzialanie kwasem lub enzymem do uzyskania D.E. 10 lub nizszego, a nastepnie scu- krzenie enzymatyczne do uzyskania D„E. powyzej 90, korzystnie 05. Okreslenie dekstroza uzywane jest powszechnie w odniesieniu do rafinowanego krysta- 55 licznego cukru (monosacharydu), który otrzymuje sie ze skrobi po daleko posunietej hydrolizie.Okreslenie „gdikoza" uzywa sie w znaczeniu za¬ równo handlowym, jak równiez w postaci roztworu, suchej substancji, skladnika syropu otrzymanego 60 w wyniku hydrolizy sjkrobi lub czesci stalych syro¬ pu, badz produktu gliikOzy oczyszczonej w postaci krystalicznej.Okreslenie „fruitaLo** i kwiilc-za" sa wymienne i odnosza sie do izonftffu tewoskrejtnej glikozy o 65 wiekszej slodyczy niz dekstroza* Izomer ten w na-111 980 * tubalnych warunkach wystepuje w miodzie i w in¬ wertowanym cukrze lacznie z glikoza.•Okreslenie „frukltOza" odnosi sie do tego monosa-- charydu.„Enzym izomeraza glikozowa" jest ¦enzymem lub preparatem enzymatycznym, wykazujacym aktyw¬ nosc izomeryzacji ksylozy do ksyluilozy i gldkozy ao fruktozy. Podstawowa aktywnosc tego enzymu wiaze sie z przeksztalceniem ksylozy do ksylulozy, stad okreslenie izomeraza ksyiozowa jest nazwa na¬ ukowa (EC 5.3.1.5.). Enzym ten nazywany jest równiez izomeraza destrozowa, izomeraza ksylo¬ zowa (dekstrozowa) i izomeraza gilikozjowa. Najczes¬ ciej stosuje sie okreslenie izomeraza glikozowa* W ogpLsie niniejszym wszyisitkie czesci i procenty wyrazone sa w jednostkach wagowych, jezeli nie podano innych jednostek.(Miedzynarodowa jednostka izomerazy glikozowej M.JjG..J. (w jezyku angielskim International Glu- kose Isomerase Unit-IGiU) jest taka iloscia enzy¬ mu izomerazy, która katalizuje powstanie jednego mikromoila fruktozy w ciagu jednej minuty z 0,8 molarnego roztworu giikoizy, pH o wartosci 7,5 w temperaturze 60°C, w warunkach oznaczenia poda¬ nych ponizej.Spocób oznaczenia polega na spektrotfotcmetrycz- Tiym pomiarze powstajacej ketozy w wyniku izo¬ meryzacji roztworu gldkozy, w ustalonych warun¬ kach. Rloztwór podstawowy przygotowuje sie w na¬ stepujacy sposób: 0,lMMgSO4-7H2O 1 ml 00,lMCoCl2-6H2O 1 ml 1,0 M bufor fosforanowy, pH=7,5 0,5 ml P-glikoza bezwodna ' 1,44 g Woda destylowana do objetosci 7,5 ml Roztwór oznaczanego enzymu rozciencza sie do stezenia 1 do 6 miedzynarodowych jednostek izo¬ merazy glikozoweji/ml. .Izomeracje przeprowadza sie w ten sposób, ze do 3 ml roztworu podstawowego dodaje sie 1 ml pre¬ paratu enzymatycznego i inkubuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze 60°C. Po zakonczeniu inku¬ bacji 1 ml mieszaniny reagujacej dodaje sie do 9 ml 0,5 N kwasu nadchlorowego, a nastepnie roz¬ ciencza sie do 250 ml. Jako odnosnik przygotowuje sie próbe z glikoza, dodajac do mceszandny reaguja¬ cej w chwili rozpoczecia inkubacji 1 ml wody za¬ miast enzymu.Zawartosc ketozy oznacza sie metoda z cysteina i- kwasem siarkowym. Miedzynarodowa jednostke izomerazy glikozowej (M.JXG) stanowi ilosc enzy¬ mu, która jest potrzebna do utworzenia jednego mikromola fruktozy w ciagu minuty, w opisanych powyzej warunkach.Dizozym (EC 3j2ul.il7.) jest enzymem katalizuja¬ cym hydrolize wiazan ^-1,4-glikozydowych, wyste¬ pujacych w scianie drobnoustrojów, pomiedzy kwa¬ sem N-acetylomuraminowym (lufo 2-acetamido- 2-dezoiksy-D-glikoza) i druga czasteczka 2-acetami- do-2-dezcksy-iD-glikozy, które sa skladnikami mu- kopolisacharydu, mukopolipepitydu i chityny. Lizo- zym wytwarzany jeat z bialka jaja kurzego i jest enzymem, wykajzujacym zdolnosci hydrolizy sciany komórkowej wiciu dl^bnouisitrojów.(Rozpuszczalny w wodzie, trwaly koncentrat en¬ zymatyczny wedlug wynalazku, zawiera bezkomór- kowy enzymatyczny preparat izomerazy glikozowej, pozbawiony kwasów nukLeiinowyoh, rozpuszczalna 5 w wodzie sól magnezowa, przy czym w koncentra¬ cie tym wystepuje 50—80°/oi wagowych bialka, ko¬ rzystnie 60^75% w przeliczeniu na sucha mase, 3 mg — 45 mg, korzystanie 5—215 mg Mg++ na mili- llitr enzymatycznego koncentratu, przy stosunku 10 Mlg++/bialko 0,0^—0,75, korzystnie 0,03^-0,5, aktyw-. nosc wlasciwa izomerazy wynosi przynajmniej 10 miedzynarodowych jednostek izomerazy glikozo¬ wej/mg, korzystnie li2 jednostek a szczególnie ko¬ rzystnie 15 miedzynarodowych jednostek izomerazy 15 gliikoizowej/mg bialka. Koncentrat, przechowywany w temperaturze 26°C w ciagu 30 dni, zachowuje przynajmniej 95% poczatkowej aktywnosci i prze¬ chowywany w temperaturze 18°C w ciagu jednego roku zachowuje 80M (± 110%)) poczatkowej aktywno- 20 sci izomerazy.Stafodlizcwany enzymatyczny koncentrat zawiera przynajmniej 5000 miedzynarodowych-jednostek izo¬ merazy glikozowej/gram, korzystnie 8000 jednostek/ /gram, a szczególnie korzystnie 10000 miedzynarodo- 25 wych jednostek izomerazy glikozowej/gram suchej masy. W koncentracie tym nie wystepuja kwasy nukleinowe, jak kwas rybonukUeinowy (RNA) i kwas dezoksyrybcnukileinowy (DNA).Stezenie maginezu w stabilizowanych koncentra- 30 tach enzymatycznych wynosi 0,1—2 mola, korzy¬ stnie 0,1—1 mola w przeliczeniu na magnez.Koncentraty enzymatyczne na ogól sa plynne, mozna je rozcienczyc woda lub innymi plynami, lub suszyc do stanu stalego. W tym przypadku zawar- 35 tosc wilgoci w kancicoitratach enzymatycznych wy¬ nosi 50—80%, korzystnie 55^70%|. Sucha masa kon¬ centratów enzymatycznych wynosi 5—30%|, korzyst¬ nie 20^3G% wagowych. jStabilizowane koncentraty enzymatyczne wedlug 40 wynalazku nie powinny zawierac kobaltu, a enzym izomeraze glikozowa uzyskuje sie z drobnoustro¬ jów, nalezacych do rodzaju Streptomyces, korzyst¬ nie z drobnoustrojów Streptomyces olivaceus ATCC Nr 21713, ATCC Nr 21714, ATCC Nr 21715. 45 Sposobem wedlug wynalazku stabilizowane kon¬ centraty enzymatyczne wytiwarza sie nastepujaco: wcdna mieszanine bezkomórkcwego preparatu en¬ zymatycznego izomerazy glikozowej i rozpuszczal¬ nika organicznego, mieszajacego sie z woda, podda- so je sie dzialaniu rozpuszczalnej w wodzie soli ma¬ gnezowej, .dodawanej w ilosci takiej, aby stezenie w mieszaninie wynosilo 0,2 mola — 0,3 mola w przeliczeniu na sól magnezowa, co powoduje wytra¬ cenie sie kompleksu enzymnmagnez. Nastepnie wy- 55 dziela sie koncentrat enzymatyczny lacznie z mag¬ nezem, który wystepuje w stezeniu 0,1—2 moli w przeliczeniu na Mg++ lacznie z rozpuszczalnikiem organicznym i woda.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie trwa- 60 ly koncentrat enzymatyczny, poddajac komórki drobnoustroju, zawierajacego wewnatrzkomórkowa izomeraze glikozowa dzialaniu rozpuszczalnika or¬ ganicznego mieszajacego sie z woda oraz lizozymu, który to enzym otrzymuje sie z bialka jaj kurzych.; 55 Enzym ten hydrolizuje sciane komórkowa, uwalnia^111 980 9 10 jac izomeraze glikozowa z komórki do roztworu.Czesci stale komórlki oraz kwasy nukleinowe od¬ dziela sie przez wirowanie. Plyn po odwirowaniu zawiera bezkomórkowy ekstrakt enzymatyczny izo¬ merazy glkozowej, wode oraz rozpuszczalnik orga¬ niczny. Rozpuszczalnik ten powinien tworzyc z wo¬ da w temperaturze otoczenia roztwór 30°/oi, korzy¬ stnie 40%i, co zmniejsza rozpuszczalnosc bialek i kwasów nukleinowych w roztworach wodnych.Rozpuszczalniki stosowane w sposobie wedlug wy¬ nalazku, to takie jak metanol, etanol, propanol, 2- propanol, alkohol butylowy IH-rz,, aceton, octan metylu, p-dioksan, w szczególnosci korzystny jest 2-propanOl. Ilosc rozpuszczalnika wynosi 30°/o — 40*/oj wagowych i powinna tak byc dobrana:, aby bialkowe zwiazki, nie bedace izoimeraza glikozowa, oraz kwasy nukleinowe, jak kwas rybonukleinowy (RNA) i kwas dezoksyrybonukleinowy tracily sie z roztworu przed dodaniem soli.Stezenie rozpuszczalnika waha sie w zaleznosci od rodzaju. Najwyzsze stezenie w sposobie wedlug wynalazku wynosi 60°/oi wagowych. W przypadku uzycia 2-propanolu, roztwór bezkomórkowego enzy¬ mu izomerazy powinien zawierac 40—45% rozpusz¬ czalnika, korzystnie 42P/a (± l^/oj wagowych.Rozpuszczalnik, mieszajacy sie z woda, spelnia kilka funkcji: zabezpiecza enzym przed inaktywac- ja w czasie wytwarzania (oraz w czasie przechowy¬ wania, jezeli rozpuszczalnik nie zostal usuniety cal¬ kowicie), jak równiez zniniejisza rozpuszczalnosc enzymu podczas dodawania soli. Rozpuszczalnik wy¬ traca równiez kwasy nukleinowe i inne zwiazki bialkowe, nie bedace izomeraza, zanim zostanie dodana sól magnezowa, rozpuszczalna w wodzie, wplywajac na czystosc uzyskiwanej izomerazy.{Sposób i czajs dodawania rozpuszczalnika orga¬ nicznego do bezkomórkowego ekstraktu moga byc rózne. Znany jest sposób, w którym rozpuszczalnik dodaje sie do odwirowanej papkowatej zawiesiny komórek, zawierajacych wewnatrzkomórkowa izo¬ meraze, a enzym uwalnia sie, stosujac rozbicie ul¬ tradzwiekami, zamrazanie i rozmrazanie komórek, dzialanie zwiazkami powierzchniowo-czynnymi i/lub litycznymi preparatami enzymatycznymi, jak lizo- zym.Stosowanie enzymów litycznych korzystne jest z uwagi na mozliwosc ich uzycia w skali produkcyj¬ nej. Po 'wydzieleniu enzymu z komórek, dodaje sie kolejna porcje rozpuszczalnika do takiego stezenia, w którym, wytracaja sie kwasy nukleinowe i nie¬ pozadane bialka, a izomeraza pozostaje w roztwo¬ rze. Fragmenty nierozpuszczalne komórek i wytra¬ cone zwiazki oddziela sie. Nastepnie dodaje sie roz¬ puszczalna w wodzie sól magnezowa i wytraca sie stabilizowany koncentrat enzymatyczny.Znany jest inny sposób, w któryni do zawiesiny komórek w postaci pasty uzyskanych przez odwiro¬ wanie hodowli, dodaje sie calkowita ilosc rozpusz¬ czalnika (ilosc te okresla sie wczesniej) oraz wode i uzyskuje sie papkowata zawiesine komórek; z której wydziela sie enzym. Po oddzieleniu nieroz¬ puszczalnych kwasów nukleinowych i pozostalosci komórkowych, plyn zawierajacy bezkomórkowy eks¬ trakt enzymatyczny, rozpuszczalnik i wode poddaje sie dzialaniu soli magnezu, wytracajac stabilizowa¬ ny koncentrat.Proces prowadzi sie w takich warunkach pH i temperatury, w których nie inaktywuje sie enzym: 5 wartosci pH w kazdym etapie izolacji wynosi 6—9, korzystnie pH = 7—7,5, a zakres temperatury wa¬ ha sie od 5°€ do 55°C, korzystnie 15^C do 35°C, w szczególnosci od 25° do 30°C. iW sposobie wedlug wynalazku stezenie soli mag¬ io nezowej wynosi 0,02—12 moli.Jako typowe sole stosuje sie chlorek magnezowy, bromek magnezowy, siarczan magnezowy siedmio- wodny, octan magnezowy i mleczan magnezowy, korzystnie siarczan magnezowy i chlorek magnezo- 15 wy, w szczególnosci siarczan magnezowy siedmio- wodny.ISól magnezowa dodaje sie w takiej ilosci, aby uzyskac 0,0i2 molarne steznie w przeliczeniu na Mg++, co zapewnia powstawanie plynnej papkowa- 20 tej zawiesiny bezkomórkowego ekstraktu izomerazy i rozpuszczalnika organicznego. Sól magnezowa nie powinna byc dodawana w duzym stezeniu, w celu zapobiegania calkowitemu wysoleniu lub oddziele¬ niu sie fazy sólnwoda. 25 Na ogól sól magnezowa dodaje sie w takiej ilosci, aby osiagnac 0,3 molarne stezenie koncowe, korzy¬ stnie 0^02 mola — 0^2 moli, w przeliczeniu na Mjg++,. Najlepsze wyniki uzyskuje sie przy stezeniu 0,015 mola soli magnezowej. 30 Drobnoustroje, zawierajace wewnatrzkomórkowa izomeraze glikozowa, stosowane do wytwarzania stabilizowanych koncentratów naleza do rodzaju 'Streptomyces, Bacillius, Arthrobacter, Actinopflanes, CurtObacterium. 35 'Szczególnie uzetycznymi sa Streptomyces fradiae, -Streptomyces phaeochromogeneis, Streptomyces al- bus ATCC Nr 2111132, Streptomyces wedmorensis ATCC Nr 211230.Owa ostatnie drobnoustroje znane sa z opisu pa- 40 tentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3 61(6 221,, Streptomyces rubdginosus ATCC Nr 21175 i ATCC Nr 21176 znane z opisu patentowego Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryjki Nr 3 666 628 i 3788 845, Streptomyces olivaceus NRiRL 3583 znany z opisu 45 patentowego Nr 3 6258(28, Streptomyces oiivaceus NRRL 30.16 znany z opisu patentowego Wielkiej Brytanii Nr 1(376 787, Streptomyces oliyochromoge- nes ATCC Nr 21(lil|4 znany z opisu patentowego Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki Nr 3622463 i 3 770 589, 50 Streptomyces olivochromogenes ATCC Nr 21713/ 21171(4, 2)17115 znane z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki.Nr 3 8J331i8; Streptomyces venezuelae ATCC Nr 2OT3 znany z opisu patento¬ wego 'Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3 683463; 55 Streptomyces glaucescems znany z opisu patentowe¬ go Wielkiej Brytanii Nr 1 410 570; Strepitomyceis vio- laceoniger znany z opisu patentowego RFN Nr 2 4)17 642; ATthrobacter nov sp. B^37i24, NRRL B-3ff2|5i, NiRRL B-13706, NRRL B-37127 i NRRL B-3723 60 znane z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3645848; Bacillus istearothermophilus ATCC Nr 2jli36|5, NRRL, B-3080, MRRL B-3681 i NRRL B-3fiS£ m&ne z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki Ntr 3 8(26 714; Lacto- 65 bacillus brevis, Bacillus coagulans NRRL Nr 5049-111 980 11 12 5666 i w szczególnosci NRRL Nr 5650 znane z opi¬ su patentowego RFN Nr 3 400 323; Actinoplanes mi- ssouriensis NRRL B-3342, Actinoplanes philippinen- sis ATCC Nr 12I4J27, Actinoplanes armeniacus ATCC Nr 16*676 i Actinoplanes sp. ATCC 23342 znane z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych..Ameryki Nr 3 834 983; Aerobacter levanicum NRRL B-d678 znany z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3 81/3 320; Nocardia acteroides ATCC Nr 2U943, Nocardia dassonvillei Nr 21944, Micromo- nospora coerula ATCC Nr 21945, Microbispora ro- sca ATCC Nr 2|1946 i Microeililoibosipora flava ATCC Nr 211947 znane z opisu patentowego Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki Nr 3 829 3tei2; oraz Curtobacte- rium znany z japonskiego opisu patentowego Sho 50rfli3j2|176 (1975).W sposobie wedlug niniejszego wynalazku najko¬ rzystniejsze jest wytwarzanie izomerazy glikozowej z Streptomyces olwoctamogenes ATCC Nr 21713, ATCC Nr 2I17)1<4, ATCC Nr 20.-711(5 (iten ostatni jest izolowany z pojedynczej kolonii szczepu ATOC Nr 2U7il|3), znanego z opisu patentowego Sitanów Zjed¬ noczonych Ameryki Nr 3 313 313 oraz Nr 3 770 589.Wewnatrzkomórkowa izcmeraza glukozowa wy¬ twarzana jeeit przez odpcwiednie drobnoustroje, jak te które wymieniono nowyzejl w hcdowld na pod¬ lozu, zawierajacym odpowiednie zródlo wegla i in¬ ne skladniki, silosowane przy wytwarzaniu enzymu.Hodowle posdewcwa szczepu, wytwarzajacego izo- meraze glukozowa, otrzymuje sie na przyklad przez posianie drobnoustroju na stos agarowy i przesia¬ nie na wlasciwa pozywke, w której drobnoustrój rozwija sie i wytwarza enzym. Czas inkubacji za¬ lezy od drobnoustroju, skladu pozywki i waha sie od 4 do 48 godzin.' Czesc lub cala hodowle stosuje sie do posiewania pozywki, a nastepnie poj kilku posiewach hodowle stosuje sie do saczepcenia wlasciwej pozywki w fer- memtorze produkcyjnym.Plyn hodowlany, zawierajacy izomeraze glikozo- wa, wiruje sie i/luto saczy. Z papkowatej masy ko¬ mórkowej wydziela sie" enzym sposobem wedlug wynalazku.Nasitejpujace przyklady wyjasniaja w szczególno¬ sci istote wynalazku, bez ograniczania jego zakresu. 10 zo 25 30 35 40 45 We wszystkich proporcjach stosowano czesci w jed¬ nostkach wagowych. Aktywnosc izomerazy glikozo¬ wej oznaczano sposobem podanym powyzej, przy okreslaniu mdedzynarodowiej jednostki izomerazy glikozowej.Przyklad I. a) Enzymatyczny preparat stabir lizowanej izomerazy glikozowej wytwarza sie w ten sposób, ze prowadzi sie hodowle posiewowa w czterech etapach; w 1-litrowych kolbach, w fermen- torze poisiewowym o pojemnosci 14 litrów, okolo 3785 litrów i w koncu w fermentorze o pojemnosci okolo 75708 Mrów. W kazdym kolejnym etapie po¬ zywke posiewa sie hodowla posiewowa w ilosci 5*/o objetosciowych, w stosunku do objetosci tej pozyw¬ ki. Sklad pozywek do przygotowania hodowli posde- wowych i warunki prowadzenia hodowla podane sa w tablicy 1.Wszystkie pozywki sterylizuje sie w temperaturze li20°C w ciagu 30 minut. Czas hodowli posiewowych w pierwszym etapie wynosi 48 godzin, w drugim etapie 24 godziny, w trzecim etapie 22 godziny i w czwartym etapie 16—H7 godzin. W pierwszym etapie pozywke posiewa sie komórkami zarodnikujacego muitanta, okreslonego jako Streptomyces olwaceus ATCC Nr 21715. Jest on wyizolowany z pojedynczej kolonii szczepu ATCC Nr 2Ui71(3, którego charakte¬ rystyka znajduje sie w opisie patenftowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Nr 3 8J3 318.Wszystkie hodowle posiewowe prowadzi sie w po¬ zywce o wartosci pH=7,0 i w temperaturze 28°C, Wartosc pH nastawia sie przed sterylizacja 10 N wodorotlenkiem sodowym.W drugim, trzecim i czwartym etapie hodowli po- siewowej, pozywke w kolbach i femmentorach na¬ powietrza sie i miesza Wlasciwa hodowle produkcyjna prowadzi sie w fermentorze o pojemnosci okolo 75 708 litrów. Skla¬ dniki pozywki z wyjatkiem ksylozy i dekstrozy rozpuszcza sie w objetosci 52996 litrów, a nastepnie pozywke ogrzewa sie do temperatury 60°C i dopro¬ wadza sie pH do wartosci 5,6M5,8 przy uzyciu sody kalcynowanej o stezeniu 16° Baume. Po ustaleniu wartosci pH dodaje sie czynnik przeciwpienny i pozywke sterylizuje sie w ciagu 30 minut w tempe¬ raturze 120°C.Tablica I Sklad pozywek do hodowli posiewowych Etap hodowli li 1 etap trzy kolby 1 -litrowe , 2 etap fermentor Ii4 litr.Sklad podloza 2 Wyciag namokcwy kukurydzy, Nr kat.E301 15 D.E., syrop kukurydz, stala pozostalosc MgS04-7H20 Czynnik przeciwpianowy, HODAG 2000 (glikol polipropylenowy) Wyciag namokowy kukurydzy, Nr kat. E801 wagowych 3 3, 6 i, o 0,05 3,6 Waga 4 7,2 g 2,0 g 0,7 g 0,07 ml 271 g Wypelnienie 5 1 200 ml 200 ml 200 ml 200 ml 9 litrów13 111 980 ciag dalszy tablicy I 14 1 d 3 etap fermentor IGO litrów 4 etap fermentor 3766 litrów 2 15 D.E., syrop kukurydz, stala pozostalosc MgS04-7H20 Czynnik przeciwfpianowy, HODAG 2000 (glikol polipropylenowy) Wyciag namokowy kukurydzy, Nr kat. E801 Skrobia, Nr kait. 3005 MgS04-7H20 Czynnik przeciwpianowy, HODAG 2000 (gilikol polipropylenowy) Wyciag namokowy kukurydzy, Nr kat. BSOl Dekstroza, Nr kat. 2001 MgS04-7H20 Czynnik przeciwpianowy HODAG 2000 (glikol polipropylenowy) 3 2,0 0,05 — 3,6 2,0 0,05 — 3,6 2,0 0,05 4 130 g 4,5 g 1,3 ml 5,44 kg 3,04 75,75 g 51 ml loaae kg 60,33 kg 1497 kg 5 9 litrów 9 litrów 9 litrów 151,2 litrów 151,9 Mrów 15M litrów 15M Iditrów 3004 liteów 3004 litrów [ 3004 litrów Po sterylizacji pozywke oziebia sie do tempera¬ tury 60°C. Cukry ksyioze i dekstroze rozpuszcza sie w 15|14 litrach, w fermentorze o pojemnosci 3735 li¬ trów. Roztwór cukrowy sterylizuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze H20°C i po oziebieniu prze¬ pompowuje sie przewodem, stosowanym do przeno¬ szenia hodowli posiewowej, do fermentora o pojem¬ nosci 75706 litrów. Po dodaniu cukrów, tempera¬ ture pozywki w fermentorze doprowadza sie do 3J2°C i nastepnie posiewa sie hodowla posiewowa.Po 20 godzinach hodowli, rozpoczyna sie pobiera¬ nie próbek, co 2 godziny, w celu oznaczania aktyw¬ nosci izomerazy, zawartosci masy komórkowej, cu¬ krów redukujacych i cukrów ogóinycih, Po osiagnie¬ ciu maksymalnej aktywnosci izomerazy glukozowej hodowle przerywa sie. W czasie prowadzenia hodo¬ wli wartosc pH kontroluje sie w granicach 5,4^5,6, dodajac przewodem doprowadzajacym powietrze sterylizowany amoniak, sterujac dodawanie automa¬ tycznie lub recznie^ Warunki przygotowania pozywki i prowadzenia hodowli w fermenitorze o pojemnosci 75 708 litrów opisane sa w opisach patentowych Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki Nr 3 770 58© i 3 8113 318 i podane sa w tablicy II.Aktywnosc izomerazy glukozowej w hodowli wy¬ nosi 19,5 miedzynarodowych jednostek izomerazy glukozowejAnl. Do izolacji stabilizowanego koncen¬ tratu enzymatycznego uzylto 8857,9 litrów hodowli.Z czesci hodowli przygotowuje sie preparat enzy¬ matyczny, zawierajacy nienaruszone komórki, sto¬ sujac Mg(OH)2, srodek do saczenia Sil-Flo 332 i 2-propanol. Oddzielone nienaruszone komórki sto¬ suje sSte nastepnie do enzymatycznego przeksztalca¬ nia glukozy do fruktozy w ukladzie periodycznym. 30 35 40 45 50 Tablica II Sklad pozywki i warunki hodowli w fermentorze pojemnosci 75 708 litrów Wyjpelnienie fermentora — 64 352 litry Sklad pozywki Wyciag namokowy ku¬ kurydzy Nr katalogowy E801 Skrobia, Nr kat. 3005 Dekstroza, Nr kat. 200J Ksyiloza Glicyna Azotan amonu Siarczan magnezowy •/o wagowych 4,0 2,5 0,2 1,0 0,1 Qj2 0,05 waga kg 2000/14 1625,22 13048 649,99 64,66 130,16 32,66 Czynnik przeciwpianowy HODAG 2000 (glikol poli¬ propylenowy) 20,82—22,71 litrów Weglan sodu (dodaje sie przed sterylizacja do uzys¬ kaniapH) 5,6—^6,0 Objetosc calkowita 08137,4 litrów Temperatura hodowli 31°C W zadnym z etapów hodowli posiewowych i pro¬ dukcyjnych, nie dodaje sie do pozywek zwiazków kobaltu. b) 8657,9 litrów hodowli* uzyskanej z fermentora o pojemnosci 75 708 litrów, o aktywnosci 19,5 mie¬ dzynarodowych jednostek izomerazy glukozowejtail, 95 co stanowi calkowita zawartosc 1(75XHD6 miejeteyna- 55 60111 980 15 rodowych jednostek izomerazy glukozowej, wirowa¬ no w wirówce DeLaval BRPX^207, z szybkoscia 18,9 litrów na minute i 2 minutowym cyklu opróznianiu wirnika, stosujac przemywanie woda. Uzyskuje sie mase komórkowa w ilosci 91i7,€ kg, o aktywnosci 187 miedzynarodowych jednostek izomer azy gluko¬ zowe:j/gram.Po zbiornika o pojemnosci 850 litrów, zawiera¬ jacego 7596 litra wody, wprowadza sie 294,8—3)17,5 kg masy komórkowej i 8 gramów lizozyimu (prepa¬ rat enzymatyczny liofolizowany z bialek jaj ku¬ rzych, 2-krotnie krystalizowany, o aktywnosci 23300 jednoslfeek na miligram, otrzymany wedlug Milesa Seravoc), w celu pireeprowadzenia hydrolizy scian komórkowych i uwolnienia wewnatrzkomórkowej izomerazy glukozowej.. Do masy tej dodaje sie rów¬ niez 85% objetoscicwycih 2-propanolu w ilosci 21,2 litra na 45,36 kg masy komórek i wode. Nastepnie dodaje sie ponownie 41,64 litrów roztworu wodno- -2-propanolowego, do uzyskania 30%; stezenia kon¬ cowego propanolu w mieszaninie,. Mieszanine masy komórkowej^wody-2-propanolu przenosi sie do zbiornika pojecnncs-i 3725,4 litra i pozoztawia sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 26°C (± 2°) w celu hydrolizy enzymatycznej.. Nastepnie dodaje sie 85%; 2-propanol w takiej ilosci,, aby osiagnac steze¬ nie 52% objetosciowych, przy którym wytracaja *ie kwasy nukleinowe (kwas rybonukleiinowy i dezo¬ ksyrybonukleinowy), a rozpuszczalne bialka enzy¬ matyczne pozostaja w roztworze.Obrotowi flilitr prózniowy pokrywa sie 90,7 kg Decallte 4200, a nastepnie warstwe ziemi okrzemo- wej przemywa sie 2-propanolem w takim stezeniu, aby zebrany roztwór przemyiwek zawieral 52% ob¬ jetosciowych alkoholu. Taki sposób przygotowania filtra zapobiega rozpuszczaniu sie kwasów nuklei¬ nowych w czasie saczenia. Po odsaczeniu masy ko¬ mórkowej,, przemywa sie ja zebrana podczas przy¬ gotowywania filtra mieszanina wodno-alkoholowa. jW celu unikniecia strat enzymu mase komórko¬ wa, odsaczona na filtrze obrotowym, saczy sie do¬ datkowo przez filtr Nuitsche. Przesacze z filtra ob¬ rotowego i z filtra Nuitjsche przenosi sie do zbiorni¬ ka o pojemnosci 3765 liltrów i dodaje sie 56,7 litra 1 molarnego roztworu MgS04-7H20 i 49,2 litra 85% 2t-propanolu. Mieszanine wiruje sie w wirówce De- Layal BRPX-207 z szybkoscia 6|2,8 litra na minute i 5 minutowym cyklu oprózniania wirnika. Odwiro¬ wany osad przemywa sie pieciokrotnie woda. Osad z wirnika zbiera sie i czesci aparatu przemywa wo¬ da. Plyn po przemyciu wirnika dolacza sie do osa¬ du, mieszai i przenosi do pojemnika z tworzywa sztucznego. Przeprowadza sie analize zowairtosci en¬ zymatycznej aktywnosci izomerazy i stosuje pre¬ parat do przeksztalcania glukozy do fruktozy. Uzys¬ kuje sie 4(1,64 litra stabilizowanego koncentratu en¬ zymatycznego izomerazy glukozowej, o aktywnosci HJ2i6il miedzynarodowych jednostek izomerazy glu¬ kozowej/gram suchej masy, co stanowi lacznie 109X10* miedzynarodowych jednostek izomerazy glukozowej, z wydajnoscia 63% w odniesieniu do aktywnosci enzymu w hodowli wyjsciowej.W tablicy III podane sa wyniki analizy stabilizo¬ wanego koncentratu enzymatycznego. 16 Tablica III Wyniki analizy stabilizowanego koncentratu izome¬ razy glukozowej 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80 65 Sizarza 1 AJktywnosc izomerazy, Miedzynaro¬ dowe jednostki izomerazy glukozo- 1 wej/g suchej masy Aktywnosc wlasciwa J/mg bialka 1 JSucha masa, %| Wilgotnosc (oznaczona metoda K.Fischera) %j Zawartosc bialka (wig. metody Kjel- dahla) % d.b.Popiól tlenkowy, % d.ib.Zwiazki nierozpuszczalne, sucha masa, % d.b.M!g++, mg/mil Mg++, stezenie molarne Stosunek Mg++/biafl50 2-propanol, wyliczone z róznicy, % 1111291,0 15,1 22,2 63,8 74,7 11,4 5,3 5,8 0,24. 0,035 14,0 iPrzyklad II. Hodowle szczepu Streptomyees PL PL PL PL PL PL PL