KR810001443B1 - 시렆의 제조방법 - Google Patents

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KR810001443B1
KR810001443B1 KR7803775A KR780003775A KR810001443B1 KR 810001443 B1 KR810001443 B1 KR 810001443B1 KR 7803775 A KR7803775 A KR 7803775A KR 780003775 A KR780003775 A KR 780003775A KR 810001443 B1 KR810001443 B1 KR 810001443B1
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KR
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fructose
sucrose
enzyme
glucose
transferase
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KR7803775A
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이이 헷디 로버어트
Original Assignee
죤피이 후로이드
시이피이시이 인터내쇼날 인코포레이팃드
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    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K9/10Dispersions; Emulsions

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Abstract

내용 없음.

Description

시럽의 제조방법
본 발명은 대체로 자당(蔗糖)의 효소에 의한 전이 과당화에 관한 것이다. 더욱 상세히 말하면 본 발명은 함-과당중합체 기제에 의하여 자당으로부터 과당을 제조하는 독특한 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 생성물인 과당 최종 생성물을 물리적으로 분리할 필요가 없이, 전분 가수분해물의 포도당 이성화에 의하여 현재 얻을 수 있는 것보다 상당히 높은 과당함량을 갖는 고과당 시럽을 제조하는, 효소에 의한 새로운 접근책을 제공한다. 본 방법은 특히 55% 및 그 이상의 과당을 함유하는 과당시럽을 제조하는데 적당하다. 본 발명은 또한 상기와 같은 제조에서 유용한 것으로 발견된 효모, 풀루랄리아 풀루란즈의 배양으로부터 새로운 전이과당화 효소를 제공하는 것이다.
본 발명은 다수의 생성물을 제조케 한다. 이들 생성물에는 최종적인 과당 또는 고과당 시럽, 또한 과당 중합체와 같은 여러 가지 중간생성물과, 기제를 함유하는 최초의 과당중합체(또는 다당류), 중합체가 제거된 기제 및 이성화후의 기제(중합체를 포함하거나 포함하지 않는 것)등이 포함된다. 이들 생성물의 각각은 그것 자체로도 직접 유용하다.
이들 생성물의 각각은 통상의 설탕과 시럽의 성질을 갖고 있으며, 이들의 관습적인 용도에 이용될 수 있다.
예컨대 이들 용도에는 식품당화제와 약품제조에서 원료물질로서의 용도 등이 포함한다. 그 외에도 이들 생성물은 설탕과 시럽의 일반적인 공업용도에 이용될 수 있다.
따라서 이들은 접착제, 습윤증진제, 투명강지(透明强紙), 탄닌화제, 전기 절연제, 주조심접착제, 살충제, 염료 등과 또한 일반적으로 가소제의 농밀화제 등의 제조에서 사용될 수 있다. 요컨대 이들은 유사생성물이 이미 이용되어 온 광범위한 용도를 통하여 유용하다.
본 분야에서 일반적인 것으로 되어 있는 여러 용어 때문에, 본 명세서에서 사용된 이들 용어의 뜻을 정의하기 위하여 다음과 같은 정의를 기술하는 바이다.
포도당 및 우선당(右旋糖)(Glucose와 Dextrose)
"포도당"과 "우선당"이란 용어는 용액이건 건조형태이건 간에 단당류를 포괄하는 용도에 있어서는 상호교환적으로 이용된다.
자 당(Sucrose)
"자당"이란 용어는 용액이건 건조형태이건간에, 사탕 무우의 줄기나 첨채 등과 같은 자당 원료물질원으로부터 나온 정제되였거나 원료형태의 2당류(二糖類)를 뜻한다.
본 발명을 실시함에 있어서 자당 출발물질은 대체로 수용성 매제로 사용된다.
과당과 레뷸로스(Frucrose 및 Levulose)
"과당"각 "레뷸로스"는 일반적으로 우선당보다 더욱단 우선당이 이성체를 표시하는 것으로, 본 분야에서 상호 교환성있게 이용된다. 과당은 포도당과 함께 꿀각 전화설탕에서 발견되며 그의 감도 때문에 가치가 있다. 레뷸로스와 과당은 용액이건 건조상태이건 모든 형태에서 이와 같은 단당류를 표시하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.
효소제제
"효소제제"란 용어는, 본 명세서에서, 원하는 효소활성을 나타내는 물질의 조성물을 나타내는 것으로 이용된다. 이 용어는 예컨대 온전한 세포, 건조세포, 세포추출물, 또한 세포로 부터와 배양액으로부터 유도된 정제 및 농축된 제제를 존속케 하는 것을 표시한다. 효소제제는 본 발명을 실시함에 있어서 용액이나 유동정지된 형태로 이용될 수 있다.
이성화 효소
우선당을 레뷸로스로 이성화시키는 효소제제는 본 명세서에서 "이성화효소"로서 표시된다. 이들 효소는 본 분야에서 잘 알려져 있으며, 우선당 이성화제, 키실로즈 이성화제, 포도당 이성화제 등으로 표시된다. 이와 같은 효소는 여러 가지 적당한 미생물로부터 유도될 수 있다. 이와 같은 미생물의 실예에는 스트럽 토마이세스유, 바실루스유, 알트로박텔유, 악티노플란네스유, 콜토박테리움유 등이 포함된다.
근래에 본 분야는 이성화 효소가 수-불용성의 비활성담체상에서 이동정지되는 공정을 인지하기에 이르렀다.
이동정지된 효소는 포도당의 고과당시럽으로의 연속전환에 사용하기 적당하다.
이성화 효소단위
"이성화 효소단위"는 "이성화 효소활성의 분석"이란 제목하에 다음에 기술하는 이성화 조건하에서 매분 1마이크로몰의 레뷸로스를 생성시킴에 요구되는 효소활성의 양으로서 정의된다.
이성화 효소 활성의 분석
본 명세서에서 사용된 이 용어는 표준화된 일련의 조건하에서 포도당 용액으로부터 생성된 케토즈를 분광 광도계로 측정하는 조각을 포함하는 분석과정을 표시하는 것이다.
분석용 저장용액
Figure kpo00001
여기에 증류수를 가하여 총 용액이 7.5㎖가 되게 한다.
분석된 효소제제는 처음에 1㎖당 1~6 이성화효소 단위를 함유하도록 희석시킨다.
효소이성화 반응은 3㎖의 저장용액에 1㎖의 효소제제를 가하고, 60℃에서 30분간 보육함으로써 수행된다. 보육기간 종단에 1㎖의 용액을 취하여 0.5N 과염소산 9㎖내에서 급냉시킨다. 급냉된 용액을 다음에 총용적이 250㎖ 되게 희석시킨다. 비교할 목적으로 사조규준으로서 보육기간 시초에 용액상의 효소제제 1㎖에 1㎖의 물을 대치시킴으로서 포도당 공시험을 행한다.
다음에 시스타인 황산방법에 의하여 게토즈를 측정한다. 이와 같은 분석을 목적으로, 상술한 이성화 조건하에서 1분당 1마이크로몰의 레뷸로스를 생성시키는데 요구되는 효소활성의 양으로서 1이성화 효소단위를 정의한다.
전이 과당한 반응
이 용어는 공여체 즉 자당으로부터 수납체 즉 다당류에 과당기를 전이시키는 것을 표시한다.
과당 건이화 효소
본 명세서에서 사용된 이 용어는 전이 과당화 반응을 촉매화하는 효소를 뜻하며, (아우레오바시디움 플루란스와 동일한)풀루랄리아 풀루란스 ATCC 9348로부터 유도된 효소체제를 포함한다.
과당 전이화 효소단위
본 명세서에서 사용된 1과당 전이화 효소단위는 다음 (a)~(c)의 조건하에서 매분, 포도당으로 계산하여, 환원당 1마이크로몰을 생성시키는데 요구되는 효소활성의 양으로서 정의된다.
(a) pH 5.5
(b) 온도 55℃
(c) 수용성 반응혼합물 100㎖당 60g의 식품등급의 자당이 있는 기제 농도.
환원당의 측정(포도당으로 계산하여)은 "Technicon Autoanalyzer Ⅱ"를 (Technicon, Inc., Tarrytown, N.Y.) 사용하여 수행한다. 분석은 "Autoanalyzer Ⅱ"에 사용하기 적당한 통상의 알카리성 페리시아나이드 방법(Analytical Biochemistry 45, No.2, 517-524페이지, 1972년도판 참조)에 의하여 수행한다. 달리 표시하지 않는 한 효소활성측정은 다음의 조성으로 구성되는 반응혼합물을 연속 감시함으로서 수행된다.
·식품등급의 자당 80%(W/V) 수용액 7.5㎖
·pH 5.5인 0.1M 구연산 완충액 2.3㎖
·반응혼합물 1㎖당 매분 5~25마이크로 gr의 환원당(포도당으로 계산하여)을 생성시키는 양의 과당 전이화 효소를 함유하는 효소시료 0.2㎖
1차 기제
본 명세서에서 사용된 "1차 기재"란 용어는 예컨대 자당 수용액과 같은 전이과당화에 참여하기 적당한 과당기를 가지며 이에 적당한 형태의 다당류를 뜻한다.
2차 기제
"2차 기제"란 용어는 1차 기제로 하여금 상기한 과당 전이화 효소의 작용을 받게 함으로써 생성되는 반응 생성물을 말한다.
부와 백분율
본 명세서에서는 강조하여 달리 지시하지 않는 한 모든 부는 중량에 의한 것이며, 모든 백분율은 중량/용적(W/V)이다.
고압 액상 크로마토그라피 분석
본 명세서에서 사용된 이 용어는 다음 방법에 따라 고압 액상 크로마토그라피를 이용하에 본 발명의 시럽을 분석하는 과정을 정의하는 것이다. 각 성분들은 칼슘 형태의 양이온 교환수지로부터 물로 용리시켜 크로마토그라피를 행한다. 용리된 성분은 차동 굴절계를 사용하여 검지한다. 비-우선당의 탄수화물은 전자적분기를 사용하여 정량 분석을 행하고, 우선당은 2차에 의하여 얻는다. 일반적인 과정은 "Analysis of Carbohyddrate Mixtures by Liquid Chromatography"(Am. Soc, Brew. Chem. Proc., 1973, 43~46페이지에 기술되어 있다. 사용된 수지는 칼슘 형태의 "Aminex Q" 15~5(Bio Rad Lab., Richmond, Calit)이다.
본 발명을 요약하면 다음과 같다.
본 발명에 따르면 과당 시럽의 제조방법이 제공되는 바, 이 방법은 1차 기제 즉 자당으로 하여금 이자당을 대량의 포도당과 소량의 과당을 함유하는 단당류 부분과 적어도 66%(중량으로)의 과당기를 갖는 다당류 부분으로 구성되는 생성물로 전환시킬 수 있는 과당 전이화 효소의 작용을 받게 하는 것이다. 이와 같은 생성물은 본 발명의 2차 기제를 함유한다. 2차 기제의 이들 다당류는 둘 또는 그 이상의 단당류기를 갖는 모든 함-과당 중합체(자당 이외의 것)를 함유한다. 이들 중합체는(2→1) ―β결합으로 연결된 과당기를 함유하는 다당류를 포함하는 것이 그 특징이다. 후술하는 바와 같이, 주어진 전이과당한 조건으로부터 생성된 다당류는 주로 예정가능한 범위내에 있다. 따라서 예컨대 2차 기제는 대부분(즉 적어도 60%몰 비)의 다당류가 2~10(즉 중합도 2~10), 더욱 일반적인 것으로는 3~6(즉 중합도 3~6)개의 다당류기를 갖는 올리고머인 것으로 생성될 수 있다. 다음에 상기 포도당은 상기 다당류의 존재하에 과당으로 이성화되고(이성화 효소의 작용으로) 그 후 활성 이성화 효소는 부존재하에 상기 다당류가 가수분해 된다. 가수분해는 전화효소를 사용하여 효소적으로 수행되거나 또는 완만한 조건하에 산 가수분해될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서는, 다당류가 상기 포도당으로부터와 과당으로부터 분리될 수 있으며, 다음에 상기한 바와 같이 가수분해되어 상기 기제내에서 우선당을 이성화 시킬 필요없이, 본 발명의 2차 기재로부터 직접 초-고 함량의 과당 시럽, 즉 66중량% 이상의 과당, 더욱 바람직한게는 90중량%이상의 과당 함량을 갖는 시럽을 생성케 한다. 이와 같은 분리는 분자크기에 근거를 둔 통상의 물리적 분리방법, 예컨대 통상의 박막 방법(즉 초여과, 투석), 용제침전법, 탄소흡착법 등에 의하여 용이하게 수행될 수 있다. 이와 같은 박막 방법의 실예로는 바람직하기로는 ATCC 9348, ATCC 12535, NRRL 1673, NRRL Y 2311, NRRL YB 3892, 및 NRRL YB 3861, NRRL 3937 및 ATCC 15223과 같은 플루랄리아 플루란즈로부터 유도된 것과 같은 과당 전이화 효소의 작용을 자당으로 하여금 받게 하는 방법인, 고과당시럽의 제조방법이다. 생성물 즉 2차 기제는 이성화 효소의 작용을 받게 한다. 다음에 활성이성화 효소는 부존재하에 이성화된 생성물을 가수분해시킨다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 2차 기제는 신규한 것으로 간주된다. 이 기제는 이성화와 후차적인 가수분해에 독특하게 적당하여 55% 이상의 과당을 함유하는 시럽을 제공하며, 자당을 과당 전이화 효소제제의 작용을 받게 함으로써 생성된다. 따라서 본 발명의 또 다른 구체예에는 효소이성화와 55% 이상의 과당 시럽을 함유하는 시럽으로의 후차적인 가수분해에 적당하며, 이 시럽은(1) 주부분의 포도당과 소부분의 과당을 함유하는 약 20~60중량%의 단당류와 (2) 66중량% 이상의 과당기를 갖는 약 70~40%의 다당류로 구성되는 것이다.
특히 바람직한 것은 약 25~65℃, 바람직하게는 약 50~60℃에서와 pH 약 4.5~6.5, 바람직하게는 약 5.4~5.6에서 플루랄리아 플루란스 ATCC 9348계로부터 유도된 과당 전이화 효소제제의 유효량이 존재하는 조건하의 전이과당화에 의하여 자당으로부터 유도된 2차 기제이다. 이용된 출발 자당농도는 10g/100㎖ 물인 정도로 낮을 수 있다. 그러나 바람직하게는 약 30~60g/100㎖(최대의 반응속도에 대하여), 가능하게는 자당의 포화점까지(더욱 상세히 후술하는 바와 같이, 더욱 높게 가능한한 높은 건조농도를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 새로운 기제를 생성시키기 위하여는 1gr의 자당에 대하여 최초 0.5 단위의 과당 전이화 효소를 이용할 수 있다. 일반적으로 경제적인 고려에 의하여 자당 1gr당 50단위를 초과하지 않는 양의 효소가 이용된다. 상업적으로 적당한 시간내에 상기한 공정 변수 범위내에서 원하는 2차 기제를 얻는데 바람직한 것은 1gr의 자당에 대하여 약 2~30단위의 범위에 있는 것이다.
전술한 것 및 그 외의 본 발명 구체예를 다음에 충분히 설명하고져 한다.
본 발명의 새로운 과당 전이화 효소를 생성방법은 통상의 발효기술을 이용할 수 있다.
다음에 더욱 상세히 설명할 새로운 분리 또는 정제특징을 이용하는 것이 바람직하다. 다음의 실시예는 플루랄리아 플루란즈 ATCC 9348로부터 효소를 생성시키는 전형적인 발효과정이다.
[실시예 1]
과당 전이화 효소 제제의 제조-셀라이드 담체
A. 효소생성에 사용된 발효과정
효소를 생성케 하기 위하여 접종물 전개와 발효에 이용된 매제는 다음과 같다.
Figure kpo00002
매제의 pH는 6.8로 조정된다.
100㎖의 살균매제를 함유하는 500㎖ 엘렌마이어 플래스크인 주플래스크를 흑색효모 플루랄리아 플루란즈를 경사 배양함으로써 접종시킨다. 사용된 특정계의 효모는 미국형 배양체 수집(Rockville, Maryland)의 목록에서 ATCC 9348로서 표시되어 있다. 주플래스크는 32℃에서 48시간 동안 왕복진탕시킨후 각각 200㎖의 미리 정한 매제를 함유하는 1ℓ의 엘렌마이어 발효플래스크를 접종시키는데 사용한다. 사용된 접종물 농도는 0.5% w/v이다. 발효는 32℃에서 7일간 왕복 진탕기상에서 수행한다.
B. 발효액으로부터 효소의 회수
40개의 1ℓ 진탕 플래스크로부터 발효액을 취하고, 이 플래스크를 물로 세척하여 위에서 취한 배양액에 가한다. 희석 후 배양액의 최종용적은 12ℓ이다. 배양액의 원래용적은 약 8ℓ이다. 발효액 12ℓ를 Sharples 연속 원심분리기를 통과시켜 효모세포와 세포파편을 제거한다. 검은색 점성용액인 상등액에 염화칼슘을 가하여 0.5% w/v 농도가 되게 하고, 생성된 용액의 pH는 수산화나트륨에 의하여 7.0으로 조정한다.
Sharples 원심분리기에 두 번째로 통과시켜 색이 엷은 점성의 상등액을 얻는다. 염산으로, 탈색된 상등액의 pH를 5.5에 조정한 다음 플룰라나제 100 단위로 적량으로 만든다. 생성된 액을 톨루엔(포화점까지 가한다)과 함께 보존하고, 플루라나제는 실온에서 하룻밤 동안 반응시킨다.
하룻밤 동안 플루라나제와 함께 온침시킨 후 1% 농도의 Grefco #503 셀라이트(Johns-Manville Products Corporation, Lompoc, Calif) 1개를 배양액 내에서 슬러리와 시킨 다음 2용적(24ℓ)의 아세톤을 가한다. 침전이 형성되면, 이것을 여과로 수집하고, 여과 케이크는 아세톤으로 세척하고 실온에서 건조시킨다. 수집된 여과케이크는 불용성화된 과당 전이화 효소를 함유한다.
실시예 1에 있어서는 발효액의 pH를 조정하면서 여기에 염화칼슘을 가하여 존재하는 검은색 안료와 산성 다당류를 제거하게 되는 결과를 초래하였음에 주의하여야 한다.(상기 산성 다당류에 대한 논의를 위하여는 Acta. Chem. Scand. 16, 615-622, 1962년도를 참조) 최종 효소생성물은 이에 의하여 비교적 순수한 무색제제의 형태로 부여된다. 이 정제과정은 본 발명의 바람직한 구체예를 구성하며, 원심분리 여과 또는 침전 등의 단순한 재생 과정을 허용하여 최종 생성물을 얻게 한다. 이와 같이 본 구체예에 의하면 흑색 효모 플루랄리아 플루란즈의 최종 발효액으로부터 산성 다당류와 흑색 안료 부산물을 분리시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 발효공정 중에 형성되는 부적당한 안료와 산성 다당류 부산물을 함유하지 않는 최종 효소제제를 부여한다. 이들 부산물은 제거하지 않으면 발효액에 용제를 가할 때 효소와 공침하게 된다.
본 발명의 정제된 효소제제를 회수하기 위한 그 이상의 정제조작으로서는, 발효액에 계속 존재하는 플루란 다당류를 제거하는 것이 바람직하다. 왜냐하면 발효액에 용제를 가할 때 이것도 역시 과당 전이화 효소와 함께 공침하기 때문이다. 따라서 염화칼슘처리와 조정으로부터 얻은 상등액은 잘 공지된 가수분해 효소인 플루라나제로 더욱 처리될 수 있다. 플루라나제 효소는 풀루란을 불규칙적으로 가수분해시켜서 저분자량의 중합체를 생성시키며, 따라서 용제처리(즉 아세톤, 알콜 등) 중 과당 전이하 효소제제의 공침과 필연적인 오염을 피할 수 있게 한다. 이와 같은 방법으로의 원하는 과당 전이화 효소의 정제는 본 발명의 또 다른 새로운 구체예를 이루는 것이다.
본 발명의 과당 전이화 효소제제는 플루란을 제거하지 않고 이용할 수 있다. 따라서 본 발명은 풀룰라나제에 의한 플루란의 가수분해를 행하지 않고 실시할 수 있으며, 이 경우 플루란은 과당 전이화 효소에 대한 담체로서의 역할을 한다.
다음의 실시예는 담체로서의 플루란의 용도를 설명하는 것이다.
[실시예 2]
플루란 담체상에 과당 전이화 효소를 사용함에 의한 2차 기제의 생성
pH 5.5인 0.05M 구연산염 완충액으로 완충시킨 20% 자당 용액을, 플루란을 플룰라나제로 가수분해시키지 않고 따라서 담체로서의 역할을 하게 하고 셀라이트를 이용하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1의 과정에 따라 생성된 1% 농도의 건조 플루란과 함께 적량으로 하였다. 과당 전이화 효소 활성은 677 단위/1gr의 플루란이다. 이 반응은 반응혼합물이 엷게 흐려질 때까지 실온에서 행한다. 이 물질의 시료 1개를 고압액상 크로마토그라피로 분석하여 다음 결과를 얻었다.
고압 액상 크로마토그라피에 의한 당류 분포
과당 우선당 DP2DP3DP4+
6.9 40.6 6.2 11.1 35.2
다음의 실시예는 실시예 1에서 생성된 효소의 특징을 더욱 잘 나타내는 것이다.
[실시예 3]
효소작용 생성물과 효소의 열 안정성
나사 덮개가 장비된 반응용기에 60g의 식품등급 자당과 과당 전이화 효소제제를 가한다. 정량의 물에 고체 셀라이트-효소 생성물의 적당한 액체를 분산시켜 적당한 농도의 효소용액을 얻음으로서, 실시예 1에서의 효소 생성물로부터 효소제제를 얻는다. 다음에 셀라이트를 여과로 제거한다. 여액을 사용하여 자당 기제 1gr당, 10,20 및 30 단위의 효소가 함유되도록 반응혼합물을 적량화 한다. 다음에 이들 반응혼합물은 물로 각각 희석시켜 최종 용적이 100㎖가 되게 한다. 전환 반응을 pH 5.5와 각각 55℃와 60℃에서 66시간 동안 수했한다. 환원당의 측정을 위하여 24, 43 및 66시간에서 시료를 취하여 효소활성의 존재를 확인한다. 시료에 대하여 환원당의 측정을 행한 후에 잔유하는 반응혼합물을 동결시켜 효소작용을 정지시키고, 이들 시료를 고압액상 크로마토그라피에 의하여 탄수화물 조성의 측정을 받게 한다. 다음의 결과가 얻어졌다.
[환원당 분석1)]
Figure kpo00003
1) : 사용된 방법은 과당 전이화 효소단위의 정의에서 기술된 것임.
2) : 효소단위는 1g의 자당에 대한 것임.
[고압액상 크로마토그라피에 탄수화물 조성 반응온도 55℃]
Figure kpo00004
실시예 3은 pH 5.5에서 66시간의 기간을 통하여 55℃와 60℃에서 효소의 기제 존재하에서의 열안정성을 나타내는 것으로, 효소의 상업적인 수행능을 나타내고 있다. 더욱이 본 발명의 새로운 과당 전이화 효소제제에 의한 자당의 효소전환으로 생성된 2차기제는 탄수화물 분석에 의하여 자당으로부터 고과당 시럽을 생성시키기에 적당한 가치있는 생성물임이 나타났다. 왜냐하면 대부분의 성분은 무선당과, 또한 후차적인 가수분해에 의하여 주요단당류로서 과당을 생성시키는 중합체로 나타났기 때문이다. 본 실시예는 또한 본 발명의 새로운 효소가 60%(w/v)의 자당 농도에서 유효함을 나타내고 있다. 또한 고포도당 농도의 존재하에서 효소의 기능도 나타났다.
[실시예 4]
효소활성에 대한 온도의 효과
과당 전이화 효소의 반응속도에 대한 온도의 효과는 다음과 같이 "Technicon Autoanalyzer II"를 사용하여 측정된다.
반응혼합물은 80%(w/v) 자당 용액 7.5㎖와 pH 5.5에서 완충된 0.1M 구연산 염 2.3㎖와 2% w/v 플루란 효소용액 0.2㎖(실시예 2의 효소제제)로 구성된다. 최종 자당농도는 60%(w/v)이다. 이 시료를 다음과 같은 온도에 유지시키고 "Technicon Autoanalyzer II" 상에서 10분간 분석한다. 이들 결과는, 40℃에서 효소반응속도는 30℃에서의 속도의 1.89배이고 50℃에서는 40℃에서 보다 1.29배 크며, 60℃에서는 50℃에서보다 1.48배 더 크다는 것을 나타내고 있다. 이 결과는 반응속도가 온도증가와 더불어 증가함을 나타내고 있다.
[실시예 5]
과당 전이화효소의 Michaelis-Menten 항수(km)에 대한 증명
효소의 km은 생성물 형성속도가 Vmax의 반(半)인 기제농도를 나타내는 것이다. 과당 전이화 효소의 km을 얻기 위하여 다음의 과정을 이용하였다.
0.1M의 구연산 완충액으로 pH 5.5로 조정한 90% w/v 자당 저항용액을 사용하에 9.8㎖ 용액내에서 자당의 적당한 농도를 제조하였다. 즉 최종 용적이 10㎖인 5, 10, 30, 40, 50, 60 및 70%의 자당농도를 만들었다.
0.2㎖에서 1.1 단위의 과당 전이화 효소를 함유하는 효소용액을 조절된 시료에 가한다. 다음에 시료를 55℃에서 상기한 바와 같이 "Technicon Autoanalyzer II" 상에서 즉시 분석한다(과당 전이화효소 단위 참조). 표준 과당을 사조규준으로서 포함시킨다(μg/㎖로 눈금을 정한 것).
다음의 것은 실시예 1의 과당 전이화 효소제제의 일정한 용량(1, 1 단위)을 사용하여 여러 기제 농도에서 μg/㎖/분으로 표시한 포도당형 속속도이다.
Figure kpo00005
a) 60% 자당 저장 용액으로부터 다음날 다시 행한 것.
km은 0.27자당 몰 농도이다. 최대 반응속도는 pH 5.5와 55℃에서 1.374의 몰자당 기제 농도에서 얻어졌다.
[실시예 6]
자당으로부터 2차기제의 제제와 이성화 반응
A. 2차 기제의 제조
식품등급의 자당 600g을 물에 용해시켜 800㎖의 용적으로 만들었다. 이 용액의 pH는 희염산으로 5.5로 조정한다. 실시예 1에서 제조하였으며 550 단위/g의 활성을 갖는 11g의 건조 셀라이트-효소제제를 100㎖의 물속에서 슬러리화 시킨다. 이 슬러리를 Buchner 누두내에서의 Whatman NO. 1 여과지상에서 진공여과한다.
여과 케이크는 100㎖의 물을 더 가하여 세척한다. 다음에 200㎖의 여액을 자당 용액에 가하고, 이것을 나사덮개가 장비된 0.5 갈론 병에 넣는다. 다음에 이 병을 58℃의 수욕에 넣고 반응이 20시간 동안 계속되게 한 다음 반응생성물의 시료를 고압 액상 크로마토그라피로 분석하여 탄수화물 조성을 측정하였는 바, 다음 결과를 얻었다.
탄수 화물 조성
Figure kpo00006
염화막네슘을 잔유 반응 생성물(즉 2차 기제)에 가하여 5밀리몰의 농도가 되게 하고, pH를 희석된 수산화나트륨으로 8.4가 되게 조정한다.
B. 2차기제의 연속 이성화 반응
스트렙 토마이세스 올리보크로모게네스 ATCC 21,715로부터 유도된 포도당 이성화제를 다음과 같이 다공성 알루미나(조절된 구공을 갖는 담체로서 Corning Glass Co., Corning, N.Y.,에서 제조된 것)상에서 이동정지시킨다.
1. 담체를 물로 2회 세체한다.
2. 담체를 1시간 동안 0.1M 구연산 나토륨과 함께 교반하면서 배양한다.
3. 세척용액의 전도도가 1000 마이크로모가 될 때까지 구연산나토륨을 담체로부터 세척한다.
4. 담체를 0.05M 염화막네슘과 함께 1시간 동안 배양하고, 염화 막네슘용액을 경사분리한다.
5. 다음에 0.05M 염하막네슘을 가하여 최종 효소농도가 400 단위/㎖가 되게 한다.
6. 14×1616단위/ft3의 수준으로 담체에 이성화효소 농축물을 가한다.
7. 담체와 효소를 22~24시간 동안 접촉시킨 다음, 결합되지 않은 효소는 담체로부터 증류수로 세척한다.
원료공급용기에 연결된 펌프가 장비된 재킵유리주(3㎝×18㎝)에 상기와 같이 제조된 이동정지된 효소를 장입시킨다. 장입후 주의 상(床) 용적은 45㎖이다. 모두가 이성화되도록 주는 60℃에서 조작한다. 장입된 주는 5밀리몰의 염화막네슘과 함께 우선당 시럽(50% W/W 농도)상에서 시작하고 주가 활성임을 나타내기 위하여 pH 8.4에 조정한다. 주의 유동속도는 292㎖/hr로 조정한다. 다음에 주를 상의 수준까지 배출시킨다.
20㎖의 유출물이 수집될 때까지 2차 기제의 도입은 수동으로 수행하고, 2차 기제에 대한 유동속도는 292㎖/hr로 조절한다.
처음에 수집된 100㎖의 시럽은 폐기하여 기제의 변화를 허용한다. 다음에 주를 통하여 잔유하는 2차 기제(약 850㎖)를 넣는다. 1시간 후 유동속도는 570㎖/hr로 증가한다. 유동속도를 조정하여 수행끝까지 300㎖/hr에 유지시킨다.
이성화 효소의 활성이 잔유함을 나타내기 위하여 2차기제에 대한 조작이 완료된 후 주를 우선당으로 액류하도록 스윗치를 돌린다. 다음의 표는 출발 제2기제를 고압액상 크로마토그라피를 분석한 결과 이성화 주로부터 나온 최종 생성물을 비교한 것이다.
Figure kpo00007
이들 결과는 2차 기제에 있는 유리우선당의 42.38%가 주내에서 과당으로 이성화하였음을 나타내고 있다. 또한 2차기제 내에 존재하는 과당 중합체는 우선당의 과당으로의 이성화 반응으로부터 영향을 받지도 않고 영향을 주지도 않는 것으로 나타났다. 전체적인 단당류 분포는 약 45% 과당과 55% 우선당으로 구성된다는 것은 주목할만 하다.
다음의 실시예에서는 2차기제에 존재하는 다당류와 또한 이로부터 나온 이성화반응생성물을 파쇄시킴에 2가지 시도가 이루어진다. 하나의 시도는 효소에 의한 것이고 다른 것은 완만한 산가수분해를 이용하는 것이다.
[실시예 7]
가수분해에 의한 고과당 시럽의 제조
A. 효소가수분해
실시예 6으로부터 나온 생성물 B 100㎖를 칸디다 유틸리스로부터 유도된 정제 전화효소 100mg과 함께 정량화 시킨다. 이 혼합물(톨루엔과 함께 보존한 것)을 실온에서 하룻밤 반응케 한 후 시료를 취하여 고압 액상 크로마토그라피로 분석한다. 잔유하는 생성물 B를 6시간 동안 더 반응을 계속하게 한 다음 동일한 과정으로 제2 시료를 분석하여 다음 결과를 얻었다.
Figure kpo00008
이용된 전화효소는 Siekagaku kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan,에서 제조한 효소제제로서 활성이 123단위/mg이며, 이때 1단위의 전화효소는 자당의 파열을 촉매화시켜 특정 조건하에서 매분 1마이크로몰의 포도당과 1마이크로몰의 과당을 형성케 한다.
B. 생성물 B의 산 가수분해
0.05N의 농도가 될 때까지 황산을 가하고 75~80℃까지 가열하여 실시예 6의 생성물 B로부터의 시료를 산가수분해시킨다. 1시간 및 2시간의 가수분해 후 시료를 취하여 고압 액상 크로마토그라피로 분석한다. 결과는 다음과 같다.
Figure kpo00009
단계 A에서의 상기 결과는 과당이 대량으로 증가하고 포도당이 소량으로 증가하며, 이에 상응하여 DP2, DP3와 DP4+부분이 감소하였음을 나타내고, 따라서 과당 중합체의 존재를 나타내고 있다.
단계 B의 산가수분해로부터 나온 결과는 단계 A에서 얻은 결과와 일치하고, 따라서 중합체의 파열을 또한 나타내고 있다.
상기의 기술은 출발자당의 건조물질함량의 주어진 반응조건하에서 포화점을 초과하지 않는 1차 기제를 사용하여 전이과당화를 지향시키는 것이었다. 다음의 실시예는 포화점 이상의 최초 자당 농도를 갖는 1차 기제의 사용을 나타내는 것으로, 이것은 과당 전이화 효소의 작용을 받을 때 DP3물질 수준은 증가하고(즉 과당-자당 증가) DP4+생성물 농도는 감소된 생성물을 생성시킨다. 또한 2차기제의 건조물질농도(W/W)가 과당 전이화 효소의 작용이 없이 얻어진 건조물질농도를 초과하여 증가한다는 것도 나타났다.
더욱이 1차 기제의 건조물질농도가 증가하면 2차 기제내에 있는 과당 중합체의 중합도가 감소하고, DP4+물질은 소량으로 존재한다는 것도 증명되었다.
이점은 포화 이하의 자당기제를 사용한 이전의 실시예에서 얻어진 결과에 반대되는 현저한 점이다. 이들 실시예에서 DP4+물질은 1차 생성물이다.
[실시예 8]
포화점을 초화점을 초과하는 자당 슬러리로 2차 기제의 제조
200g 액상의 식품등극자당을 나사덮개 뚜껑이 달린 1라인트병에 넣는다. 사조규준으로서 500㎖의 물을 병 하나에 넣고, 나머지는 다음 표에 나타낸 바와 같이 증가하는 양의 과당 전이화 효소-셀라이트제제(실시예 1에 따라 제조된 것)를 함유하는 50㎖ 물에 넣는다. 각각 덮개를 넣고, 54~55℃에서 고정시킨 진탕 수욕에 넣는다. 이 플래스크는 가끔 손으로 혼합하면서 24시간 동안 진탕시킨다. 각 병으로부터 상응액 시료를 취하여 비등수욕내에 있는 나사 덮개 시험관에 넣어 효소를 비활성화 시킨다. 다음에 고압 액상 크로마토그라피로 이들 시료를 분석하고 상등액의 건조물질 측정은 K. Fischer 방법으로 행하여 다음 결과를 얻는다.
Figure kpo00010
1) : 50㎖ 물 내의 전체 과당 전이화 효소단위
2) ND=검지되지 않았음
상기 실시예에서, 사조규준을 실은(약 25℃)으로 냉각되었을 때 결정화 하였고 한편 효소에 의하여 생성된 2차 기제는 용액으로 잔유하며, 결정화되지 않고 우수한 안전-수명 안정성을 나타내었음을 주목할 만한 사실이다.
실시예 8이 물 50㎖당 200g의 자당, 즉 80% W/W를 이용하였으나 자당 출발물질의 건조물질농도는 증가될 수 있다. 본 구체예의 새로운 2차 기제는 식품용도에서 결정화되지 않은 시럽으로 대단히 안정하게 이용할 수 있다. 이것은 또한 미생 박테리아 오염과 색체 형성에 내성이 있는 독특하게 높은 건조물질 조성물을 제공하며, 따라서 이것은 선적에 이용될 수 있고 그리고/또는 상기한 성질을 갖는 형태로는 현재까지 얻을 수 없었던 농도로 설탕을 저장할 수 있게 한다. 더욱이 이와 같은 새로운 높은 건조물질의 2차기제는 실시예 7에 나타낸 바와 같이 가수분해를 받을 수 있어서 원하는 당분 수준의 전화당 혼합물을 얻을 수 있게 한다. 본 구체예의 새로운 2차기제는 약 70~82% 범위의 건조물질 함량을 가지며 주로 우선당으로 구성되는 단당류 부분과 대부분이 DP3생성물인 과량의 DP2인 다당류 중합체를 포함하고 있다. 소량의(4.1% 및 2 이하)DP4+중합체도 역시 존재한다.
본 발명의 전이과당화 단계가 불연속 단위조작으로 나타내어졌으나, 본 분야의 숙련자에게는 연속 단위 조작도 역시 유사하게 이용될 수 있음이 명백하다.
이와 같은 연속 전이과당화 반응을 수행함에 있어서, 전이과당화 효소는 이동 정지된 효소의 정의에서 이미 논의된 기술과 역시 그곳에서 기술된 연속 가공방법을 사용하여 용이하게 이동정지된다.

Claims (1)

  1. 본문에 상술한 바와 같이 자당(蔗糖)을 유효량의 과당 전이화 효소 제제의 작용을 받게 하여 과당 다당류와 우선당을 함유하는 반응 생성물을 생성케 하는 조작으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 시럽의 제조 방법.
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