JPH01199592A - イソマルツロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグルコース及びフラグ（・−スを原料とする酵
素反応によるイソマルツロース（α−Ｄ−グルコピラノ
シドー１．６−フラグ１−フラノース）の製造方法に関
する。原料となるグルコース及びフラクトースは２、例
えば異性化糖の形で工業的原料として有利に入手するこ
とができる。イソマルツロースはそれ自体抗う蝕性住味
料として用いられるほか、低カロリー甘味料であるイソ
マルターゼの製造のだめの原料としても有用である。

〔従来の技術〕

イソマルツロースの製造方法として、蔗糖を微生物又は
酵素により転換して製造する方法が知られている。すな
わち、特公昭５７−１０７．２０にはプロタミノバクタ
−（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）又はセラチア（
Ｓｅｒｒａｔｉａ）属微生物を蔗糖の水溶液中で培養し
てイソマルツロースを製造する方法が記載されており、
また特公昭５８−３８１５６にはプロタミノバクタ−属
微生物を用いる連続発酵法により蔗糖からイソマルツロ
ースを製造する方法が記載されている。

さらに、特公昭６０−９７９７、特開昭５７−９４２９
８、特開昭５９−２６９５、及び特開昭６１−２４９３
７６には微生物菌体又は酵素を固定化し、これを蔗糖水
溶液と接触せしめることによるイソマルツロースの製造
方法が記載されている。

これらはいずれもグルコースとフラクトースとがα−１
，２結合して成る蔗糖をα−１，６結合に転換する酵素
的転移反応に基礎を置くものであり、反応エネルギー収
支、すなわち原料である蔗糖と生成物であるイソマルツ
ロースとの間の平衡は、イソマルツロースの製造のため
に必ずしも不利なものではない。これに対して、単Ｉ！
類であるグルコース及びフラクトースからイソマルツロ
ースを生成する反応は新たなエーテル結合を形成する反
応であって、化学平衡の観点からイソマルツロースの製
造のためには極めて不利であると信じられ、グルコース
とフラクトースとからイソマルツロースを製造する方法
は知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしなから、グルコースとフラクトースとを主成分と
する異性化糖は、極めて安定に人手できる工業原料であ
り、グルコースとフラクトースとからイソマルツロース
を製造することができれば、工業的に非常に有利である
。従って、本発明はグルコースとフラクトース、例えば
異性化糖を原料としてイソマルツロースを製造するため
の新規な方法を提供しようとするものである。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明者等は前記の課題を解決すべく、糖鎖の分解に関
与する種々の酵素について検討した結果、多糖又はオリ
ゴ糖のα−１，４結合及び／又はα−１，６グルコシド
結合をエキソ（ｅ　ｘ　ｏ）型で加水分解することがで
きるという条件を満たした酵素を用いることによりグル
コース及びフラグ］・−スを効率よくイソマルツロース
に転換することができるという、全く新しい知見を得、
これに基いて本発明を完成した。

従って、本発明は多糖類又はオリゴ糖のα−１゜４又は
α−１，６グリコシド結合をエキソ型で加水分解する酵
素の存在下でグルコースとフラクトースとを縮合せしめ
ることを特徴とするイソマルツロースの製造方法を提供
するものである。

〔具体的な説明〕

圃−素 糖加水分解酵素は、例えば次の様な酵素特性により分類
することができる。

（１）加水分解を受けるエーテル結合に係る糖残基によ
る分類：例えばグルコースを認識するグルコシダーゼ、
ガラクト−スを認識するガラクトシダーゼ等； （２）加水分解を受けるエーテル結合のアノマー配向に
よる分類：α−結合を分解する酵素、及びβ−結合を分
解する酵素の別； （３）！！鎖の途中からエーテル結合を分解するエンド
（ｅｎｄｏ）型と糖鎖の末端から順次切断するエキソ（
ｅ　ｘ　ｏ）型との分類； （４）糖分子牛のエーテル結合に関与するヒドロキシル
基の位置による分類：例えば１．４−結合、１．６−結
合、１，３−結合等。

上記のごとき、糖分解酵素の分類基準においていかなる
酵素が本発明の方法において使用し得るかを決定するた
め、次の酵素について検討した。

■　インベルターゼ（β−Ｄ−フラクトフラノシド・フ
ラクトヒドロラーゼ、　ＥＣ３，２，１，２６；エキソ
型；酵母由来） ■　β−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシド・グルコ
ヒドロラーゼ、　ＥＣ３，２，１，２１ｉエキソ型；ア
ーモンド由来） ■　α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン４−グルカ
ノヒドロラーゼ、　ＥＣ３，２，１，１ｉエンド型；バ
シルス由来） ■　デキストラナーゼ（α−１，６−グルカン６−グル
カノヒドロラーゼ；　ＥＣ３，２，１，１１；エンド型
；ペニシリウム由来） ■　イソマルターゼ（オリゴα−１，６−グルコシダー
ゼ；　ＥＣ３，２，１，１０；エキソ型；酵母由来）■
　マルターゼ（α−Ｄ　−グルコシド・グルコヒドロラ
ーゼｉ　ＥＣ３，２，１，２０；エキソ型；酵母由来）
■　β−アミラーゼ（α−１，４−グルカン・マルトヒ
ドロラーセ゛、ＥＣ３，２，１，２：大麦由来）■　グ
ルコアミラーゼ（α−１，４−グルカン・グルコヒドロ
ラーゼ、　ＥＣ３，２，１，３；エキソ型；アスペルギ
ルス・ニガー由来） ■　グルコアミラーゼ（α−１，４−グルカン・グルコ
ヒドロラーゼ、　ＥＣ３，２，１，３；エキソ型；リゾ
プス由来） 上記の酵素をグルコース及びフラクトースに作用せしめ
ることによりイソマルツロースが生成するか否かを見た
。次の結果が得られた。

以下余Ｅ ■インへルターゼ　　　４．５　　５５°Ｃ−■β−グ
ルコシダーゼ　５．０　　３７℃　　　　　−■α−ア
ミラーゼ　　　６．９　　２０℃　　　　　−■デキス
トラナーゼ　　６．０　　３７℃　　　　　−■イソマ
ルターゼ　　　６．８　　２７℃　　　　　十〇マルタ
ーゼ　　　　　６．０　　２５℃　　　　　＋■β−ア
ミラーゼ　　　４．８　　２０°Ｃ＋■グルコアミラー
ゼ　　４．５　　５５℃　　　　　十〇グルコアミラー
ゼ　　４．５　　５５℃　　　　　十以上の結果から、
本発明の方法において使用できる酵素は、多糖類又はオ
リゴ糖のα−，１，４又はα−１，６グルコシド結合を
エキソ型で加水分解する酵素であることが明らかになっ
た。

さらに、使用し得る酵素の種類を検討した結果、α−１
，４グルコシド結合をエキソ型で加水分解する酵素とし
てグルコアミラーゼ（ＥＣ３，２，１，３）、β−アミ
ラーゼ（ＥＣ３，２，１，２）、α−グルコシダーゼ（
ＥＣ３，２，１，２０）　、エキソ−マルトテトラヒド
ロラーゼ（ＥＣ３，２，１，６０）　、及びエキソ−マ
ルトへキサヒドロラーゼ（ＥＣ３，２，１，９８）が使
用可能であり、そしてα−１，６−グルコシド結合をエ
キソ型で分解する酵素としてグルコデキストラナーゼ（
ＩＥＣ３，２，１，７０）　、イソマルターゼ（ＥＣ３
，２，１，１０）、エキソ−イソマルトヒドロラーゼ（
ＥＣ３，２，１、９４）、及びエキソ−イソマルトトリ
ヒドロラーゼ（ＥＣ３，２，１，９５）が使用可能であ
ることが明らかになった。

上記の酵素を本発明の方法に使用するに当っては、精製
酵素として使用することもでき、また種々の程度に精製
された部分精製酵素、又は粗酵素等、酵素含有物の形で
使用することもできる。微生物由来の酵素にあっては、
さらに、培養液の形で使用することができ、又培養液か
ら菌体を分離して生菌体の形で使用することもできる。

さらに酵素を含有する菌体を常法に従って乾燥したもの
、溶剤、例えばアセトン、エタノール等で脱水処理して
乾燥したもの、菌体破砕物等使用することもできる。さ
らに、上記の種々の形態の酵素又は酵素含有物は、常法
、例えばキャリヤー結合法、架橋法、包理法等に従って
固定化した固定化酵素又は固定化菌体の形で使用するこ
ともできる。本発明において単に酵素と言う場合、上記
のごとき種々の形態の酵素含有物をも意味する。

廠料捜 本発明の方法において使用される基質すなわち原料はグ
ルコースとフラクトースとの混合物である。グルコース
とフラクトースの混合物については、フラクトースの重
量比率に対するグルコースのそれが著しく上回ると、合
成反応で生じるオリゴ糖はマルトースやイソマルト−ス
などのマルトオリゴ糖が多くなり、逆にフラクトースの
重量比率がグルコースのそれを著しく上回ると、合成さ
れるオリゴ糖全体の収量が低下する。したがってグルコ
ースとフラクトースとの反応を本発明に従って行わしめ
る場合、グルコースとフラクトースの重量比は１：１０
０〜１００：１の範囲、より望ましくは１：１０〜１０
：１であり、最も望ましくは１：２〜２：１の範囲であ
り、１：１が理想的である。

本発明の方法の原料としては、グルコースとフラクトー
スとを混合して使用するごともできるが、−１二記のご
とき望ましい比率でクルコースとフラクトースを含有す
る安価な工業原料として異性化糖又は高フラクトース含
有異性化糖を用いるのが好ましい。

酵素反応における基質（原料）濃度と酵素濃度とは相互
に関連する。反応の平衡を合成反応（イソマルツロース
生成反応）の方向に傾むけるためには、原料濃度は比較
的高いことが好ましく、例えばグルコース及びフラクト
ースの内生なくとも１方が５〜１００Ｗ／Ｖ％であるこ
とが好ましい。

この様な原料濃度において、反応液中の酵素濃度は反応
液１　ｍｌ当り１０ユニット以上、好ましくは１００ユ
ニット以上とする。用いる酵素濃度を高くすれば必要な
反応時間をより短（する事が可能である。実際の反応に
際しては反応に要する基質量と反応時間を考慮し用いる
酵素量を決定すべきである。グルコースの異性化による
フラクトースの製法のごとく、固定化酵素として用いれ
ば、酵素の再利用・反応時間の短縮の点で有利となる。

う」便祥ｄ生 本発明の方法における反応条件としては、使用する酵素
が分解反応を行う場合と同様の通常の条件を用いればよ
い。すなわち、ｐＨは使用する酵素が加水分解反応を行
うだめの通常のｐｌ＋を用いればよく、その範囲は酵素
により異なる。例えば、グルコアミラーゼではＰＨ３，
５〜８．０付近、β−アミラーゼではｐｌ＋４．０〜７
．０付近か望ましく、その範囲外では収量は低下する。

温度は、使用する酵素が作用する通常の範囲でよいが、
酵素の活性を損なわない範囲内で高温である方が有利で
ある。例えばグルコアミラーゼでは室温〜８０°Ｃ、イ
ソマルターセでは２０°Ｃ〜４０°Ｃ程度が望しい。一
般に酵素はその起源により熱安定性、至適ｐＨが異り、
用いる酵素毎に最適の反応条件を設定すべきであり、上
記の条件は単なる例示であり、これらの範囲に限定され
るものではない。

反応ｐＨを安定に維持するため、反応媒体としては緩衝
液を用いるのが好ましい。緩衝液としては、例えばクエ
ン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝
液等通常の緩衝液を用いることができる。反応媒体とし
ては通常水性媒体が用いられるが、本発明の方法は加水
分解の逆反応を利用するものであるから、有機溶媒中で
有利に反応を行うごともできる。この様な有機溶媒とし
て例えばエタノール、ＤＭＳＯ、メタノール、アセトン
等が挙げられる。

Ｆ応−式　びイソマルツロースの回収 本発明の方法における反応は回分式に行うこともでき、
また固定化酵素又は固定化菌体を用いる場合には、これ
らを充填したカラムを用いて連続的に有利に行うことが
できる。反応時間は、基質濃度、酵素濃度、反応方式等
により異るが、回分式反応においては通常５〜２００時
間であり、連続式反応においてはさらに短縮される。

反応液からのイソマルツロースの回収・精製は、オリゴ
糖の工業的な分離・精製に一般に用いられている方法、
例えば、濾過や遠心分離による固形物の除去、イオン交
換樹脂法による精製、濃縮結晶化による採取、等により
行うことができる。

本発明の方法の酵素反応においては添加した基質のすべ
てがイソマルツロースに転換することばできないから、
反応液からイソマルツロースを採取した後、残液を再度
基質溶液として使用することが好ましい。この場合、再
使用する残液にはグルコースもしくばフック１〜−ス、
又はその両者を補充することができる。

本発明の方法における反応液中に生成した生成物を分析
するためには次の方法を用いることができる。得られた
反応物を門、Ｇｈｅｂｒｅｇｚａｂｈｅｒなど（Ｊ、Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｖｏｌ、　　１８０．　
１〜１６（１９７９））の方法を基に薄層クロマトグラ
フィー法で分析を行う。すなわちメルク社製薄層キーセ
ルゲル６０Ｆ２．．４に１μｌの反応物をスボソ１〜し
、メチルエチルエチルケトン、２−プロパツール、アセ
Ｉ−二Ｉ−リル、０．５Ｍホウ酸および酢酸に溶解した
０、２５Ｍ−イソプロピルアミンからなる展開溶媒（２
：　３　：　１　：１）と、メチルエチルケトン、ジプ
ロピルエーテル、２−プロパツール、ピリジン、水およ
びフェニルボウ酸から成る展開溶媒（２：　１　：　３
　：　１　：Ｉ　計８　ｍｔにフェニル硼酸２．４ｇ）
を用いて二次元薄層クロマトグラフィーを行い、２％ジ
フェニルアミン、２％アニリン（アセＩ・ンに？容角０
および８５％リン酸の混合液（１：　１　：　８．５）
で発色させる。この条件でイソマルツロースはクルコー
ス、フラクトースおよびそれらの縮合物であるマルトー
ス、イソマルトース、ｌ−レバロース、スクロース、マ
ルヂュロース等と明確に分離検出される。

また高速液体クロマトグラフィーにおいても、市１坂の
糖分雌用カラＪ１を用いてイソマルツロースを分析する
事が出来る。さらにこのイソマルツロース画分を分取し
たり、その他公知の方法により結晶化または精製する事
も可能である。

次に、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する
。

実画ｌ飢Ｌ アスペルギルスニガー由来のゲルコアミラーセロ１００
ユニツトを、１０％グルコース及び３０％フラクトース
を含むクエン酸・クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５
の反応液５　ｍｌに加え、６５°Ｃで一昼夜反応させた
。この反応によって得られたイソマルツロースの量は用
いたグルコースに対し４６％であった。尚、イソマルツ
ロースの検出は以下の様にして行った。即ち、限外ろ過
膜を用いて除蛋白を行い６〜１０倍に稀釈したろ液１μ
ｌをメルク社製薄層キーセルゲル６０Ｆ２５４にスボソ
１〜し、メチルエチルケトン、２−プロパツールアセ１
−二トリル、０．５Ｍホウ酸及び酢酸に溶解した０、２
５Ｍイソプロピルアミンから成る展開溶媒並びに、メチ
ルエチルケトン、ジプロピルエーテル、２−プロパツー
ルピリジン、水及びフェニルホウ酸から成る展開溶媒を
用いて二次元薄層クロマトグラフィーを行い、ジフェニ
ルアミン、アニリン（アセトンに溶解）及びリン酸の混
合液で発色させイソマルツロースを検出する方法及び、
昭和電工（株）社製シヨウデソクス力ラムＤ（：６１３
及びショウデソクスカラム５Ｚ５５３２を用いた高速液
体クロマトグラフィー法などである。

汰九■避 イースト由来のイソマルターゼ８４０ユニツトを１０％
グルコース及び３０％フラクトースを含むクエン酸リン
酸２すｌ−リウム緩衝液ｐＨ６，０の反応液０．５　ｍ
ｌに加え、３０℃で一晩反応させた。この反応によって
得られたイソマルツロースの量は、用いたグルコースに
対し１７％であった。尚、イソマルツロースの検出は実
施例１）に示した方法と同様にして行った。

実薯り 大麦由来のＢ−アミラーゼ８４００ユニツトを、１０％
グルコース及び３０％フラクトースを含むクエン酸・リ
ン酸２ナトリウム緩衝液ｐＨ４，８の反応液５　ｍｌに
加え２５℃で一晩反応させた。この反応によって得られ
たイソマルツロースの量は、用いたグルコースに対し１
５％であった。尚、イソマルツロースの検出は実施例１
）に示した方法と同様にして行った。

参考炎 酵母由来のインへルターゼ、アーモンド由来のβ−グル
コシダーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来のα−アミラ、−ゼ
およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ由来のデキストラナーゼ
の夫々８４００ユニソ１−を、１０％グルコース及ヒ３
０％フラクトースを含むクエン酸・リン酸２ナトリウム
緩衝液５　ｍｌ加え反応液とした。表１に示した夫々の
酵素の最適ｐｌ（および温度にて一昼夜させた。

実施例１に示した方法と同様に分析を行った。

β−グルコシダーゼは顕著なオリゴ糖の生成を示したが
、イソマルツロースは検出されなかった。

他の３種の酵素もイソマルツロースの生成を示さなかっ
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、多糖類又はオリゴ糖のα−１，４及び／又はα−１
   ，６グルコシド結合をエキソ型で加水分解する酵素の存
   在下でグルコースとフラクトースとを縮合せしめること
   を特徴とするイソマルツロースの製造方法。 ２、前記酵素がグルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、α
   −グルコシダーゼ、エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ
   、エキソ−マルトヘキサヒドロラーゼ、グルコデキスト
   ラナーゼ、イソマルターゼ、エキソ−イソマルトヒドロ
   ラーゼ、又はエキソ−イソマルトトリオヒドロラーゼで
   ある請求項１に記載の方法。 ３、前記グルコース及びフラクトースの給原として異性
   化糖を用いる請求項１又は２に記載の方式。