JP3070709B2 - マルトオリゴ糖誘導体の製造法 - Google Patents
マルトオリゴ糖誘導体の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼの活性測
定試薬の基質として用いることができるマルトオリゴ糖
の製造法に関する。
定試薬の基質として用いることができるマルトオリゴ糖
の製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】従来から膵液や尿などの含有されるα−ア
ミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断
が行われている。α−アミラーゼの活性測定には、例え
ばマルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトオペン
タオース、マルトヘキサオーズなど）を基質とする方法
がある。この方法でα−アミラーゼ含有試料に該マルト
オリゴ糖とα−グルコシダーゼとを作用させて基質から
グルコースを遊離させ、グルコースの量を測定すること
により、α−アミラーゼの活性値を知る。生成したグル
コースは例えばグルコースオキシダーゼ／パーオキシダ
ーゼ／色素系を利用する定量法；ヘキソキナーゼ／ホス
ホグルコムターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する定量法などによ
り、測定される。
ミラーゼの活性を測定することにより、各種疾患の診断
が行われている。α−アミラーゼの活性測定には、例え
ばマルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトオペン
タオース、マルトヘキサオーズなど）を基質とする方法
がある。この方法でα−アミラーゼ含有試料に該マルト
オリゴ糖とα−グルコシダーゼとを作用させて基質から
グルコースを遊離させ、グルコースの量を測定すること
により、α−アミラーゼの活性値を知る。生成したグル
コースは例えばグルコースオキシダーゼ／パーオキシダ
ーゼ／色素系を利用する定量法；ヘキソキナーゼ／ホス
ホグルコムターゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系を利用する定量法などによ
り、測定される。
【０００３】α−グルコシダーゼはマルトペンタオース
などの四糖以上のオリゴ糖に作用しにくく、マルトース
やマルトトリオースなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に
作用するため、上記基質を使用してグルコースを測定す
ることにより、α−アミラーゼの活性を測定することが
できる。しかしα−グルコシダーゼは僅かではあるが、
基質であるマルトぺンタオースに作用するため、測定の
ブランク値が上昇し、その結果、測定値の誤差が大きく
なるという欠点がある。またα−グルコシダーゼの基質
分解作用のため、α−グルコシダーゼと基質を一液化す
ることは、試薬としての安定性が損なわれるため、好ま
しくない。
などの四糖以上のオリゴ糖に作用しにくく、マルトース
やマルトトリオースなどの三糖以下のオリゴ糖に良好に
作用するため、上記基質を使用してグルコースを測定す
ることにより、α−アミラーゼの活性を測定することが
できる。しかしα−グルコシダーゼは僅かではあるが、
基質であるマルトぺンタオースに作用するため、測定の
ブランク値が上昇し、その結果、測定値の誤差が大きく
なるという欠点がある。またα−グルコシダーゼの基質
分解作用のため、α−グルコシダーゼと基質を一液化す
ることは、試薬としての安定性が損なわれるため、好ま
しくない。
【０００４】マルトオリゴ糖の還元性末端にフェニル
基、ナフチル基またはそれらの誘導体をアグリコンとし
て結合させた基質を用いる方法がある。例えば基質とし
てｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド（特公昭57-5
3079号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド
（特公昭57-53079号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルト
ヘプタオシド（特公昭62-50119号公報）、２，４−ジク
ロロフェニルマルトペンタオシド（特公告昭59-13199号
公報）などが利用されている。これらの基質を用いると
アグリコンが遊離し、遊離したアグリコン、例えばｐ-
ニトロフェノールを光学的に測定することにより、α-
アミラーゼの活性を容易に測定することができる。上記
方法においてもα- グルコシダーゼが僅かではあるが、
基質に作用するため、ブランク値が上昇する欠点があ
る。前記グルコースを測定する方法と同様にα- グルコ
ースと基質を一液化することは難しい。
基、ナフチル基またはそれらの誘導体をアグリコンとし
て結合させた基質を用いる方法がある。例えば基質とし
てｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド（特公昭57-5
3079号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトヘキサオシド
（特公昭57-53079号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルト
ヘプタオシド（特公昭62-50119号公報）、２，４−ジク
ロロフェニルマルトペンタオシド（特公告昭59-13199号
公報）などが利用されている。これらの基質を用いると
アグリコンが遊離し、遊離したアグリコン、例えばｐ-
ニトロフェノールを光学的に測定することにより、α-
アミラーゼの活性を容易に測定することができる。上記
方法においてもα- グルコシダーゼが僅かではあるが、
基質に作用するため、ブランク値が上昇する欠点があ
る。前記グルコースを測定する方法と同様にα- グルコ
ースと基質を一液化することは難しい。
【０００５】このような欠点を解消するために、マルト
オリゴ糖の非還元末端グルコースの６位のヒドロキシ基
が修飾されたタイプの基質を用いる方法が提案されてい
る。例えば特開昭60-237998 号公報には、非還元性末端
のグルコースの６位のＯＨ基を例えば、−ＯＲ，−ＯＣ
ＯＲ，−ＯＳＯ2 Ｒ，−ＮＨＲ（式中、Ｒはアルキル
基、フェニル基またはピリジル基を示す。）で置換し、
還元性末端のグルコースに置換または未置換のフェニル
基がアグリコンとして結合したマルトオリゴ糖誘導体が
基質として記載されている。このタイプの基質ではα−
グルコシダーゼによる基質の分解が生じない。しかしこ
のように６位のみに置換基が導入された基質は、化学合
成が困難であり、収率が悪い欠点があった。
オリゴ糖の非還元末端グルコースの６位のヒドロキシ基
が修飾されたタイプの基質を用いる方法が提案されてい
る。例えば特開昭60-237998 号公報には、非還元性末端
のグルコースの６位のＯＨ基を例えば、−ＯＲ，−ＯＣ
ＯＲ，−ＯＳＯ2 Ｒ，−ＮＨＲ（式中、Ｒはアルキル
基、フェニル基またはピリジル基を示す。）で置換し、
還元性末端のグルコースに置換または未置換のフェニル
基がアグリコンとして結合したマルトオリゴ糖誘導体が
基質として記載されている。このタイプの基質ではα−
グルコシダーゼによる基質の分解が生じない。しかしこ
のように６位のみに置換基が導入された基質は、化学合
成が困難であり、収率が悪い欠点があった。
【０００６】また特開昭60-54395号公報には非還元性末
端のグルコースの４位および６位のＯＨ基の水素原子を
アルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換し、
還元性末端のグルコースにアグリコンを結合させたマル
トオリゴ糖を基質として用いることが記載されている。
このタイプの基質もα−グルコシダーゼにより分解され
ない。しかし該基質を使用しても、澱粉やアミロースな
どのグルコース鎖を認識して、その結合を切断するα−
アミラーゼの作用機構を正確に反映していない。これら
の欠点を解消する基質として、ｐ−ニトロフェニル α
−マルトペンタオシドの非還元性末端グルコースの４位
または６位に、ガラクトースをβ−結合させたものを用
いる方法が報告されている（日本農芸化学会誌、講演要
旨集第65巻第 3号第 117頁、1991年及び特開平3-264596
号公報) 。しかしこれらの基質では発色基として用いる
ｐ−ニトロフェノールがα−アミラーゼの活性測定領域
ｐＨ７．０付近で最大モル吸光係数（以下εと表現す
る）の約半分のεでかつ、僅かなｐＨ変動でε変化が大
きい。また温度上昇、塩化ナトリウム濃度上昇、アルブ
ミン濃度上昇でもεが上昇するという問題がある。
端のグルコースの４位および６位のＯＨ基の水素原子を
アルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換し、
還元性末端のグルコースにアグリコンを結合させたマル
トオリゴ糖を基質として用いることが記載されている。
このタイプの基質もα−グルコシダーゼにより分解され
ない。しかし該基質を使用しても、澱粉やアミロースな
どのグルコース鎖を認識して、その結合を切断するα−
アミラーゼの作用機構を正確に反映していない。これら
の欠点を解消する基質として、ｐ−ニトロフェニル α
−マルトペンタオシドの非還元性末端グルコースの４位
または６位に、ガラクトースをβ−結合させたものを用
いる方法が報告されている（日本農芸化学会誌、講演要
旨集第65巻第 3号第 117頁、1991年及び特開平3-264596
号公報) 。しかしこれらの基質では発色基として用いる
ｐ−ニトロフェノールがα−アミラーゼの活性測定領域
ｐＨ７．０付近で最大モル吸光係数（以下εと表現す
る）の約半分のεでかつ、僅かなｐＨ変動でε変化が大
きい。また温度上昇、塩化ナトリウム濃度上昇、アルブ
ミン濃度上昇でもεが上昇するという問題がある。
【０００７】また製造法としては、原料として不安定な
ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドを用いて、β−
ガラクトシダーゼにより原料の非還元性末端にガラクト
ースを導入する方法のため、収率が悪く、また未反応の
ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドと生成物である
ｐ−ニトロフェニル４−Ｏ−β−ガラクトピラノシルα
−マルトペンタオシドの極性が似ているため、分離が困
難である。また原料としてｐ−ニトロフェニルマルトペ
ンタオシドを使用したβ−ガラクトシダーゼによる酵素
反応において、ガラクトシル基が４位および６位に２個
導入される副反応が生じる傾向がある。本発明者らは非
還元末端グルコースの４位または６位にβ−ガラクトー
スが結合し、還元末端に２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル基がα結合あるいはβ結合した、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル ４（または６）−Ｏ−β─Ｄ−ガラクト
ピラノシル−α（またはβ）マルトオリゴ糖を見い出
し、既に出願している（特願平3-240576号) 。
ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドを用いて、β−
ガラクトシダーゼにより原料の非還元性末端にガラクト
ースを導入する方法のため、収率が悪く、また未反応の
ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドと生成物である
ｐ−ニトロフェニル４−Ｏ−β−ガラクトピラノシルα
−マルトペンタオシドの極性が似ているため、分離が困
難である。また原料としてｐ−ニトロフェニルマルトペ
ンタオシドを使用したβ−ガラクトシダーゼによる酵素
反応において、ガラクトシル基が４位および６位に２個
導入される副反応が生じる傾向がある。本発明者らは非
還元末端グルコースの４位または６位にβ−ガラクトー
スが結合し、還元末端に２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル基がα結合あるいはβ結合した、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル ４（または６）−Ｏ−β─Ｄ−ガラクト
ピラノシル−α（またはβ）マルトオリゴ糖を見い出
し、既に出願している（特願平3-240576号) 。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、α−
アミラーゼ測定用基質である２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル α（またはβ）−マルトペンタオシドの非還元
性末端グルコースの４位あるいは６位に、ガラクトース
をβ−結合させた基質を製造する新規な方法を提供する
ことにある。
アミラーゼ測定用基質である２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル α（またはβ）−マルトペンタオシドの非還元
性末端グルコースの４位あるいは６位に、ガラクトース
をβ−結合させた基質を製造する新規な方法を提供する
ことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般式（Ｉ）
または（II）
または（II）
【００１０】
【化１３】
【００１１】
【化１４】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるマルト
オリゴ糖誘導体の製造法において、一般式(III) または
（IV）
オリゴ糖誘導体の製造法において、一般式(III) または
（IV）
【００１２】
【化１５】
【００１３】
【化１６】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるガラク
トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
溶媒の下に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱して
アセチル化する工程、得られた一般式（Ｖ）または（V
I）
トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
溶媒の下に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱して
アセチル化する工程、得られた一般式（Ｖ）または（V
I）
【００１４】
【化１７】
【００１５】
【化１８】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。Ａｃはアセチル基を
示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
するマルトオリゴ糖誘導体の製造法である。
示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
するマルトオリゴ糖誘導体の製造法である。
【００１６】また本発明は、一般式（Ｉ）または（II）
【化１９】
【００１７】
【化２０】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるマルト
オリゴ糖誘導体の製造法において、マルトオリゴ糖およ
び乳糖をβ−ガラクトシダーゼの存在下に反応させて得
られた一般式(III) または（IV）
オリゴ糖誘導体の製造法において、マルトオリゴ糖およ
び乳糖をβ−ガラクトシダーゼの存在下に反応させて得
られた一般式(III) または（IV）
【００１８】
【化２１】
【００１９】
【化２２】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるガラク
トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
溶媒の下に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱して
アセチル化する工程、得られた一般式（Ｖ）または（V
I）
トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
溶媒の下に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱して
アセチル化する工程、得られた一般式（Ｖ）または（V
I）
【００２０】
【化２３】
【００２１】
【化２４】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。Ａｃはアセチル基を
示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
するマルトオリゴ糖誘導体の製造法である。
示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
するマルトオリゴ糖誘導体の製造法である。
【００２２】本発明で使用する一般式（III ）または
（IV）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体
は、例えばマルトテトラオース、マルトペンタオースな
どのグルコース数２〜９個のマルトオリゴ糖を原料とし
て、β−ガラクトシダーゼの存在下、基質として乳糖を
用い、ガラクトシル基をマルトオリゴ糖の非還元性末端
グルコースの４位あるいは６位に導入して得られる。β
−ガラクトシダーゼを使用する条件は、ｐＨ５〜９の緩
衝液、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液中、温度１５〜６
０℃、反応時間約１０分〜１００時間である。反応条件
により４位あるいは６位に選択的にβ−ガラクトシル基
を導入することができる。
（IV）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体
は、例えばマルトテトラオース、マルトペンタオースな
どのグルコース数２〜９個のマルトオリゴ糖を原料とし
て、β−ガラクトシダーゼの存在下、基質として乳糖を
用い、ガラクトシル基をマルトオリゴ糖の非還元性末端
グルコースの４位あるいは６位に導入して得られる。β
−ガラクトシダーゼを使用する条件は、ｐＨ５〜９の緩
衝液、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液中、温度１５〜６
０℃、反応時間約１０分〜１００時間である。反応条件
により４位あるいは６位に選択的にβ−ガラクトシル基
を導入することができる。
【００２３】本発明では、次いで一般式(III) または
（IV）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖を有機媒
体の存在下、もしくは無溶媒の下に、アルカリおよび無
水酢酸とともに加熱してアセチル化する。該反応によ
り、一般式（Ｖ）または（VI）で表されるアセチル化ガ
ラクトシルマルトオリゴ糖を得る。有機媒体としては、
塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、エ
ーテル、酢酸エチルエステル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどを
使用する。アルカリとしては、酢酸ナトリウム、トリエ
チルアミン、ピリジンなどを使用する。アセチル化反応
の条件は、室温〜１５０℃で、好ましくは酢酸ナトリウ
ムを用いた場合、９０〜１２０℃、ピリジンを用いた場
合、室温〜６０℃である。
（IV）で表されるガラクトシルマルトオリゴ糖を有機媒
体の存在下、もしくは無溶媒の下に、アルカリおよび無
水酢酸とともに加熱してアセチル化する。該反応によ
り、一般式（Ｖ）または（VI）で表されるアセチル化ガ
ラクトシルマルトオリゴ糖を得る。有機媒体としては、
塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、エ
ーテル、酢酸エチルエステル、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどを
使用する。アルカリとしては、酢酸ナトリウム、トリエ
チルアミン、ピリジンなどを使用する。アセチル化反応
の条件は、室温〜１５０℃で、好ましくは酢酸ナトリウ
ムを用いた場合、９０〜１２０℃、ピリジンを用いた場
合、室温〜６０℃である。
【００２４】本発明では、次いで得られた一般式（Ｖ）
または（VI）で表されるアセチル化ガラクトシルマルト
オリゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶
媒中、酸触媒とともに加熱する。該反応により、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル基が還元末端グルコースにα
結合あるいはβ結合した反応生成物 (2-クロロ-4- ニト
ロフェニル(CNP化) ガラクトシルマルトオリゴ糖保護体
ともいう) を得る。有機溶媒としては、塩化メチレン、
クロロホルム、ベンゼン、トルエン、エーテル、酢酸エ
チルエステルなどを使用する。酸触媒としては、ＺｎＣ
ｌ2 、ＳｎＣｌ4 、ＴｉＣｌ4 などのルイス酸もしく
は、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などの
有機スルホン酸などを使用する。上記反応条件は、室温
〜２００℃、好ましくは３０℃〜１２０℃である。２−
クロロ−４−ニトロフェニル基は、反応条件によりα結
合あるいはβ結合させることができる。
または（VI）で表されるアセチル化ガラクトシルマルト
オリゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶
媒中、酸触媒とともに加熱する。該反応により、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル基が還元末端グルコースにα
結合あるいはβ結合した反応生成物 (2-クロロ-4- ニト
ロフェニル(CNP化) ガラクトシルマルトオリゴ糖保護体
ともいう) を得る。有機溶媒としては、塩化メチレン、
クロロホルム、ベンゼン、トルエン、エーテル、酢酸エ
チルエステルなどを使用する。酸触媒としては、ＺｎＣ
ｌ2 、ＳｎＣｌ4 、ＴｉＣｌ4 などのルイス酸もしく
は、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などの
有機スルホン酸などを使用する。上記反応条件は、室温
〜２００℃、好ましくは３０℃〜１２０℃である。２−
クロロ−４−ニトロフェニル基は、反応条件によりα結
合あるいはβ結合させることができる。
【００２５】本発明では、さらに上記工程で得られた反
応生成物のアセチル基をメタノール中で触媒量のナトリ
ウムメチラートによる公知の脱保護反応により脱離し
て、一般式（Ｉ）または（II）で表されるマルトオリゴ
糖誘導体を得る。他の脱離反応としては、無水メタノー
ル中、陰イオン交換樹脂あるいは無水メタノール中、ト
リエチルアミンを使用して行う。
応生成物のアセチル基をメタノール中で触媒量のナトリ
ウムメチラートによる公知の脱保護反応により脱離し
て、一般式（Ｉ）または（II）で表されるマルトオリゴ
糖誘導体を得る。他の脱離反応としては、無水メタノー
ル中、陰イオン交換樹脂あるいは無水メタノール中、ト
リエチルアミンを使用して行う。
【００２６】
【発明の効果】本発明のβ−ガラクトシダーゼによる酵
素反応は、マルトオリゴ糖と乳糖を反応させるものであ
って、ｐ−ニトロフェニルマルトペンダオシドを原料と
して用いた従来の反応と比べて、ガラクトシル基が２個
導入される副反応が、はるかに少ない。また、収率も大
幅に上昇し、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドを
原料に用いた場合と異なり、副生物との分離精製も容易
である。また本発明で得られた２−クロロ−４−ニトロ
フェニル（ＣＮＰ化）ガラクトシルマルトオリゴ糖保護
体は、副反応が少なく、未反応の原料と極性が離れてい
るため、精製が容易で１回のシリカゲルカラムクロマト
グラフィーによる精製で十分である。さらに本発明では
ガラクトシル基を非還元末端グルコースの４位あるいは
６位にβ結合したマルトオリゴ糖（III）または（IV）
を原料にすることにより、収率が上昇し、副生物もしく
は未反応の原料の混入による精製の困難さが解消され
た。すなわち本発明により得られるマルトオリゴ糖誘導
体は、マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの４位
または６位にガラクトシル基をβ−ガラクトシダーゼに
より導入した原料（III）または（IV）を使用し、第一
工程でアセチル基によりヒドロキシル基を保護し、第二
工程で２−クロロ−４−ニトロフェノールを作用させた
後、アセチル基を脱離して目的物が得られる方法であっ
て、従来法で、問題となっていた精製除去が困難な副生
物が少なく、収率が良い製造法である。なお、本発明の
基質から遊離する発色基は、２−クロロ−４−ニトロ−
フェノール（以下ＣＮＰと表現）であり、従来の基質か
ら生じるｐ−ニトロフェノールで問題となったα−アミ
ラーゼ測定域、ｐＨ７．０付近での感度、ｐＨ、塩化ナ
トリウム濃度、アルブミン濃度などの変動でのその変動
などの問題が解消される。
素反応は、マルトオリゴ糖と乳糖を反応させるものであ
って、ｐ−ニトロフェニルマルトペンダオシドを原料と
して用いた従来の反応と比べて、ガラクトシル基が２個
導入される副反応が、はるかに少ない。また、収率も大
幅に上昇し、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシドを
原料に用いた場合と異なり、副生物との分離精製も容易
である。また本発明で得られた２−クロロ−４−ニトロ
フェニル（ＣＮＰ化）ガラクトシルマルトオリゴ糖保護
体は、副反応が少なく、未反応の原料と極性が離れてい
るため、精製が容易で１回のシリカゲルカラムクロマト
グラフィーによる精製で十分である。さらに本発明では
ガラクトシル基を非還元末端グルコースの４位あるいは
６位にβ結合したマルトオリゴ糖（III）または（IV）
を原料にすることにより、収率が上昇し、副生物もしく
は未反応の原料の混入による精製の困難さが解消され
た。すなわち本発明により得られるマルトオリゴ糖誘導
体は、マルトオリゴ糖の非還元性末端グルコースの４位
または６位にガラクトシル基をβ−ガラクトシダーゼに
より導入した原料（III）または（IV）を使用し、第一
工程でアセチル基によりヒドロキシル基を保護し、第二
工程で２−クロロ−４−ニトロフェノールを作用させた
後、アセチル基を脱離して目的物が得られる方法であっ
て、従来法で、問題となっていた精製除去が困難な副生
物が少なく、収率が良い製造法である。なお、本発明の
基質から遊離する発色基は、２−クロロ−４−ニトロ−
フェノール（以下ＣＮＰと表現）であり、従来の基質か
ら生じるｐ−ニトロフェノールで問題となったα−アミ
ラーゼ測定域、ｐＨ７．０付近での感度、ｐＨ、塩化ナ
トリウム濃度、アルブミン濃度などの変動でのその変動
などの問題が解消される。
【００２７】
【実施例】以下に本発明を実施例を用いて説明する。実
施例１において、β−ガラクトースが、１，４−結合さ
れた化合物を示したが、反応条件により１，６−結合し
た化合物も得られる。 実施例１β−（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオースの製
造 マルトテトラオース１ｇおよび乳糖１ｇを５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６．０）５ｍｌに溶解した。バチルス・サ
ーキュランス（Basillus circulans）由来のβ−ガラク
トシダーゼ溶液（６５単位／ｍｌ）２５０μｌを加え
て、４０℃、９０分インキュベートした。１００℃で１
０分間処理し酵素反応を止めた。この酵素反応液を、ト
ヨパールＨＷ−４０Ｓカラムで精製した後（溶離液：
水、流速１．４ｍｌ／分）凍結乾燥し、２５０ｍｇの白
色粉末を得た。得られた反応生成物は、β（１，４）−
ガラクトシルマルトテトラオース（一般式IV,n=2, 100
%) であった。得られたβ（１，４）−ガラクトシルマ
ルトテトラオースのＨＰＬＣ分析の結果を図１に示す。
図１には還元末端グルコースがα−Ｄ−グルコピラノー
スである化合物とβ−Ｄ−グルコピラノースである化合
物が示され、２個のガラクトシル基が入っていないこと
が明らかである。なお、分析条件はカラム：純水、流
速：１．０ｍｌ／分、温度：室温、検出器：ＲＩであ
る。
施例１において、β−ガラクトースが、１，４−結合さ
れた化合物を示したが、反応条件により１，６−結合し
た化合物も得られる。 実施例１β−（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオースの製
造 マルトテトラオース１ｇおよび乳糖１ｇを５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ６．０）５ｍｌに溶解した。バチルス・サ
ーキュランス（Basillus circulans）由来のβ−ガラク
トシダーゼ溶液（６５単位／ｍｌ）２５０μｌを加え
て、４０℃、９０分インキュベートした。１００℃で１
０分間処理し酵素反応を止めた。この酵素反応液を、ト
ヨパールＨＷ−４０Ｓカラムで精製した後（溶離液：
水、流速１．４ｍｌ／分）凍結乾燥し、２５０ｍｇの白
色粉末を得た。得られた反応生成物は、β（１，４）−
ガラクトシルマルトテトラオース（一般式IV,n=2, 100
%) であった。得られたβ（１，４）−ガラクトシルマ
ルトテトラオースのＨＰＬＣ分析の結果を図１に示す。
図１には還元末端グルコースがα−Ｄ−グルコピラノー
スである化合物とβ−Ｄ−グルコピラノースである化合
物が示され、２個のガラクトシル基が入っていないこと
が明らかである。なお、分析条件はカラム：純水、流
速：１．０ｍｌ／分、温度：室温、検出器：ＲＩであ
る。
【００２８】β（１，４）−ガラクトシルマルトテトラ
オース保護体の製造上記工程で得られたβ−（１，４）
−ガラクトシルマルトテトラオシド１ｇおよび酢酸ナト
リウム２００ｍｇを酢酸無水物に懸濁し、１００℃〜１
１０℃で５時間加熱してアセチル化した。冷却後、冷水
に注ぎ、一夜放置した。析出する結晶を吸引濾取し、真
空下でよく乾燥させた。収率約１００％ ２００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲ：δCDCl3 （分裂型、相
対プロトン数） １．９５〜２．３５（多重線、５１Ｈ） 注：アセチル
基 ３．６８〜５．５（多重線、３４Ｈ） ５．７６（二重線、１Ｈ） 注：Ｊ＝８．
１Ｈｚ 非還元性末端のアノマー水素 該反応により得られた反応生成物は、β（１，４）−ガ
ラクトシルマルトテトラオース保護体 (一般式VI,n=2,
100%) であった。
オース保護体の製造上記工程で得られたβ−（１，４）
−ガラクトシルマルトテトラオシド１ｇおよび酢酸ナト
リウム２００ｍｇを酢酸無水物に懸濁し、１００℃〜１
１０℃で５時間加熱してアセチル化した。冷却後、冷水
に注ぎ、一夜放置した。析出する結晶を吸引濾取し、真
空下でよく乾燥させた。収率約１００％ ２００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲ：δCDCl3 （分裂型、相
対プロトン数） １．９５〜２．３５（多重線、５１Ｈ） 注：アセチル
基 ３．６８〜５．５（多重線、３４Ｈ） ５．７６（二重線、１Ｈ） 注：Ｊ＝８．
１Ｈｚ 非還元性末端のアノマー水素 該反応により得られた反応生成物は、β（１，４）−ガ
ラクトシルマルトテトラオース保護体 (一般式VI,n=2,
100%) であった。
【００２９】２−クロロ−４−ニトロフェニルβ（１，
４）−ガラクトシルマルトテトラオース保護体の製造 上記工程で得られたβ−（１，４）−ガラクトシルマル
トテトラオース保護体１ｇを塩化メチレン５ｍｌに溶解
し、ＳｎＣｌ4 ６００ｍｇを加えた。２−クロロ−４−
ニトロフェノール（ＣＮＰ）５００ｍｇを加え、６０℃
の油浴で１０時間還流させた。冷却後、トリクロロメタ
ンで抽出し濃縮乾固後、ヘキサン／酢酸エチル（６：
４）を溶離液としてシリカゲルカラムクロマトにより精
製し、白色粉末３５０ｍｇを得た。 ２００ＭＨｚ Ｈ−ＮＭＲ：δ（分裂型、相対プロトン数） １．９５〜２．２０（多重線、４８Ｈ）注：アセチル基 ３．６８〜５．５０（多重線、３５Ｈ） ７．２９（二重線、１Ｈ）注：Ｊ＝８．１Ｈｚ ＣＮＰの環プロトン ８．１７（ダブル二重線、１Ｈ） 同 上 ８．３１（二重線、１Ｈ） 同 上 該反応により得られた生成物は、２−クロロ−４−ニト
ロフェニルβ（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオ
ース保護体（ＣＮＰ化ガラクトシルマルトオリゴ糖保護
体、ＣＮＰ基がβ結合したもの,100%)である。該ＣＮＰ
化ガラクトシルマルトオリゴ糖保護体は、副反応が少な
く、未反応の原料と極性が離れているため、精製が容易
で１回のシリカゲルカラムクロマトによる精製で十分で
あった。
４）−ガラクトシルマルトテトラオース保護体の製造 上記工程で得られたβ−（１，４）−ガラクトシルマル
トテトラオース保護体１ｇを塩化メチレン５ｍｌに溶解
し、ＳｎＣｌ4 ６００ｍｇを加えた。２−クロロ−４−
ニトロフェノール（ＣＮＰ）５００ｍｇを加え、６０℃
の油浴で１０時間還流させた。冷却後、トリクロロメタ
ンで抽出し濃縮乾固後、ヘキサン／酢酸エチル（６：
４）を溶離液としてシリカゲルカラムクロマトにより精
製し、白色粉末３５０ｍｇを得た。 ２００ＭＨｚ Ｈ−ＮＭＲ：δ（分裂型、相対プロトン数） １．９５〜２．２０（多重線、４８Ｈ）注：アセチル基 ３．６８〜５．５０（多重線、３５Ｈ） ７．２９（二重線、１Ｈ）注：Ｊ＝８．１Ｈｚ ＣＮＰの環プロトン ８．１７（ダブル二重線、１Ｈ） 同 上 ８．３１（二重線、１Ｈ） 同 上 該反応により得られた生成物は、２−クロロ−４−ニト
ロフェニルβ（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオ
ース保護体（ＣＮＰ化ガラクトシルマルトオリゴ糖保護
体、ＣＮＰ基がβ結合したもの,100%)である。該ＣＮＰ
化ガラクトシルマルトオリゴ糖保護体は、副反応が少な
く、未反応の原料と極性が離れているため、精製が容易
で１回のシリカゲルカラムクロマトによる精製で十分で
あった。
【００３０】２−クロロ−４−ニトロフェニル β
（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオースの製造 上記工程で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル
β（１，４）ガラクトシルマルトテトラオース保護体１
ｇを無水メタノール１０ｍｌに溶解した。ナトリウムメ
チラート５ｍｇを添加し、一夜放置した。酢酸１ｍｌを
加え中和し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。シ
リカゲルカラムクロマト（溶離液：酢エチ／メタノール
／みず８：２：１）で精製し、凍結乾燥することにより
白色粉末６２０ｍｇを得た。 ５００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲ：δCDCl3 PPM （分裂型、相対プロトン数） ３．５〜４．０（多重線、２８Ｈ) ４．４５（二重線、１Ｈ）注：β−ガラクトシル基のアノマー水素 ５．３４（二重線、１Ｈ）注：β−グルコシル基のアノマー水素 ５．３８（二重線、１Ｈ）注：α−グルコシル基のアノマー水素 ５．３９（二重線、１Ｈ）注：α−グルコシル基のアノマー水素 ５．４５（二重線、１Ｈ）注：α−グルコシル基のアノマー水素 ７．４２（二重線、１Ｈ） ＣＮＰの環プロトン ８．２４（ダブル二重線、１Ｈ） 同 上 ８．４３（二重線、１Ｈ） 同 上 得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル β（１，
４）ガラクトシルマルトテトラオース （一般式(II) n
=2, ＣＮＰ基がβ結合したもの,100%)のＨＰＬＣ分析を
図２に示す。なお、分析条件はカラム：ＴＳＫ−ＧＥ
Ｌ、ＮＨ2 −６０、溶媒：アセトニトリル−水（７：
３）、流速：１ｍｌ／分、検出器：ＵＶ２８０ｎｍであ
る。他のマルトオリゴ糖誘導体との比較を図３に示す。
図３中、（ａ）は２−クロロ−４−ニトロフェニルマル
トテトラオース、（ｂ）は２−クロロ−４−ニトロフェ
ニルマルトペンタオースを示す。
（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオースの製造 上記工程で得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル
β（１，４）ガラクトシルマルトテトラオース保護体１
ｇを無水メタノール１０ｍｌに溶解した。ナトリウムメ
チラート５ｍｇを添加し、一夜放置した。酢酸１ｍｌを
加え中和し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。シ
リカゲルカラムクロマト（溶離液：酢エチ／メタノール
／みず８：２：１）で精製し、凍結乾燥することにより
白色粉末６２０ｍｇを得た。 ５００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲ：δCDCl3 PPM （分裂型、相対プロトン数） ３．５〜４．０（多重線、２８Ｈ) ４．４５（二重線、１Ｈ）注：β−ガラクトシル基のアノマー水素 ５．３４（二重線、１Ｈ）注：β−グルコシル基のアノマー水素 ５．３８（二重線、１Ｈ）注：α−グルコシル基のアノマー水素 ５．３９（二重線、１Ｈ）注：α−グルコシル基のアノマー水素 ５．４５（二重線、１Ｈ）注：α−グルコシル基のアノマー水素 ７．４２（二重線、１Ｈ） ＣＮＰの環プロトン ８．２４（ダブル二重線、１Ｈ） 同 上 ８．４３（二重線、１Ｈ） 同 上 得られた２−クロロ−４−ニトロフェニル β（１，
４）ガラクトシルマルトテトラオース （一般式(II) n
=2, ＣＮＰ基がβ結合したもの,100%)のＨＰＬＣ分析を
図２に示す。なお、分析条件はカラム：ＴＳＫ−ＧＥ
Ｌ、ＮＨ2 −６０、溶媒：アセトニトリル−水（７：
３）、流速：１ｍｌ／分、検出器：ＵＶ２８０ｎｍであ
る。他のマルトオリゴ糖誘導体との比較を図３に示す。
図３中、（ａ）は２−クロロ−４−ニトロフェニルマル
トテトラオース、（ｂ）は２−クロロ−４−ニトロフェ
ニルマルトペンタオースを示す。
【００３１】上記の結果より、本発明の製法によると、
各工程の副反応が少なく、精製が容易であり、収率よ
く、ガラクトシルマルトオリゴ糖が製造できた。
各工程の副反応が少なく、精製が容易であり、収率よ
く、ガラクトシルマルトオリゴ糖が製造できた。
【００３２】参考例１および２２−クロロ−４−ニトロフェニルβ（１，４）−ガラク
トシルマルトテトラオースを用いたα−アミラーゼの測
定例 試薬組成Ａ（参考例１） ５０ｍＭ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０μ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２μ／ｍｌ ＣａＣｌ2 １ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル β（１，４）ガラク
トシル−マルトテトラオース（以下β（１，４）−Ｇａ
ｌ−Ｇ４−ＣＮＰと略記） ２ｍＭ 試薬組成Ｂ（参考例２） ５０ｍＭ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０μ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２μ／ｍｌ ＣａＣｌ2 １ｍＭ ３−ケトブチリデン ２−クロロ−４−ニトロフェニル
β−マルトペンタオシド（以下３−ＫＢ−Ｇ５−ＣＮＰ
と略記） ２ｍＭ 上記各試薬３ｍＭにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３
７℃において３分間放置した後、４１５ｎｍにおける吸
光度の変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化量から
α−アミラーゼ活性を算出した。また唾液由来のアミラ
ーゼ（以下Ｐ型アミラーゼと表現）および膵液由来のア
ミラーゼ（以下Ｓ型アミラーゼと表現）の標準品を用い
てその両者の測定値の比であるＰ／Ｓ（Ｐ型アミラーゼ
／Ｓ型アミラーゼの比）を求めた。
トシルマルトテトラオースを用いたα−アミラーゼの測
定例 試薬組成Ａ（参考例１） ５０ｍＭ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０μ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２μ／ｍｌ ＣａＣｌ2 １ｍＭ ２−クロロ−４−ニトロフェニル β（１，４）ガラク
トシル−マルトテトラオース（以下β（１，４）−Ｇａ
ｌ−Ｇ４−ＣＮＰと略記） ２ｍＭ 試薬組成Ｂ（参考例２） ５０ｍＭ グッド緩衝液（ｐＨ７．０） α−グルコシダーゼ ９０μ／ｍｌ β−グルコシダーゼ １２μ／ｍｌ ＣａＣｌ2 １ｍＭ ３−ケトブチリデン ２−クロロ−４−ニトロフェニル
β−マルトペンタオシド（以下３−ＫＢ−Ｇ５−ＣＮＰ
と略記） ２ｍＭ 上記各試薬３ｍＭにサンプル０．２５ｍｌを添加し、３
７℃において３分間放置した後、４１５ｎｍにおける吸
光度の変化を測定し、１分間当りの吸光度の変化量から
α−アミラーゼ活性を算出した。また唾液由来のアミラ
ーゼ（以下Ｐ型アミラーゼと表現）および膵液由来のア
ミラーゼ（以下Ｓ型アミラーゼと表現）の標準品を用い
てその両者の測定値の比であるＰ／Ｓ（Ｐ型アミラーゼ
／Ｓ型アミラーゼの比）を求めた。
【００３３】
【表１】 初期吸光度から見て３ＫＢ−Ｇ５−ＣＮＰよりも純度の
高いものが製造でき、かつブランクの上昇も低いことか
ら、安定性もよいことが明らかである。また血清測定値
の感度もよく、Ｐ／Ｓ比が３ＫＢ−Ｇ５−ＣＮＰを用い
て測定した値が０．８６なのに対し、β８１，４）Ｇａ
ｌ−Ｇ４−ＣＮＰを用いた場合は、０．９２と１に近
く、よりα−アミラーゼの作用様式を純粋に反映してい
ると考えられる。
高いものが製造でき、かつブランクの上昇も低いことか
ら、安定性もよいことが明らかである。また血清測定値
の感度もよく、Ｐ／Ｓ比が３ＫＢ−Ｇ５−ＣＮＰを用い
て測定した値が０．８６なのに対し、β８１，４）Ｇａ
ｌ−Ｇ４−ＣＮＰを用いた場合は、０．９２と１に近
く、よりα−アミラーゼの作用様式を純粋に反映してい
ると考えられる。
【図１】β（１，４）−ガラクトシルマルトテトラオー
スのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
スのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図２】２−クロロ−４−ニトロフェニル β（１，
４）ガラクトシルマルトテトラオースのＨＰＬＣ分析を
示す。
４）ガラクトシルマルトテトラオースのＨＰＬＣ分析を
示す。
【図３】ＨＬＰ分析における他のマルトオリゴ糖誘導体
の結果を示す。
の結果を示す。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 15/203 C08B 37/00 C12P 19/04,19/12 C12Q 1/40 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ）または（II） 【化１】 【化２】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるマルト
オリゴ糖誘導体の製造法において、一般式(III) または
（IV） 【化３】 【化４】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるガラク
トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
溶媒の下に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱して
アセチル化する工程、得られた一般式（Ｖ）または（V
I） 【化５】 【化６】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。Ａｃはアセチル基を
示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
するマルトオリゴ糖誘導体の製造法。 - 【請求項２】 一般式（Ｉ）または（II） 【化７】 【化８】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるマルト
オリゴ糖誘導体の製造法において、マルトオリゴ糖およ
び乳糖をβ−ガラクトシダーゼの存在下に反応させて得
られた一般式(III) または（IV） 【化９】 【化１０】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。）で表されるガラク
トシルマルトオリゴ糖を有機媒体の存在下、もしくは無
溶媒の下に、アルカリおよび無水酢酸とともに加熱して
アセチル化する工程、得られた一般式（Ｖ）または（V
I） 【化１１】 【化１２】 （式中、ｎは０〜７の整数を示す。Ａｃはアセチル基を
示す。）で表されるアセチル化ガラクトシルマルトオリ
ゴ糖と２−クロロ−４−ニトロフェノールを有機溶媒
中、酸触媒とともに加熱する工程、次いで得られた反応
生成物のアセチル基を脱離する工程を含むことを特徴と
するマルトオリゴ糖誘導体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4209277A JP3070709B2 (ja) | 1992-08-05 | 1992-08-05 | マルトオリゴ糖誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4209277A JP3070709B2 (ja) | 1992-08-05 | 1992-08-05 | マルトオリゴ糖誘導体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0656870A JPH0656870A (ja) | 1994-03-01 |
| JP3070709B2 true JP3070709B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=16570284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4209277A Expired - Fee Related JP3070709B2 (ja) | 1992-08-05 | 1992-08-05 | マルトオリゴ糖誘導体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3070709B2 (ja) |
-
1992
- 1992-08-05 JP JP4209277A patent/JP3070709B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0656870A (ja) | 1994-03-01 |
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