JPH1017590A

JPH1017590A - 修飾α−マルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα−アミラーゼ活性測定試薬、これを用いたα−アミラーゼ活性の測定方法及び修飾α−マルトオリゴシド誘導体の製造方法

Info

Publication number: JPH1017590A
Application number: JP18688296A
Authority: JP
Inventors: Shoichi Tokutake; 昌一徳武; Nobuyuki Yamatsugu; 信幸山次
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 1998-01-20

Abstract

(57)【要約】【課題】特定の修飾α−マルトオリゴシド誘導体、こ
れを基質として用いてα−アミラーゼ活性を、精度よ
く、短時間に効率よく測定することができる方法、及び
測定試薬を提供する。【解決手段】本発明は、次の一般式（１）【化１】（式中のＲは芳香族発色性基又は水素原子、Ｘはアジド
基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキ
シ基、アリールもしくはアルキルスルホニルオキシ基、
アルキルシリルオキシ基又は水素原子、ｎはニトロ基で
ある）で表される修飾α−マルトオリゴシド誘導体であ
る。該誘導体は、特定の修飾α−マルトオリゴ糖を直接
の原料として製造する。また該誘導体を基質として用い
て、試料中のα−アミラーゼ活性を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−アミラーゼ活
性の測定に有用な修飾α−マルトオリゴシド誘導体、及
び該誘導体を基質として用い、試料中のα−アミラーゼ
活性を精度よく、かつ正確に測定する方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象
とするヒトα−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極
めて重要であり、特に急性や慢性の膵臓炎、膵臓ガン、
流行性耳下腺炎、肺炎、腎不全などの鑑別診断において
は、従来必須の測定項目となっている。このα−アミラ
ーゼ活性の測定方法については従来より、マルトオリゴ
糖またはその還元末端に発色基を導入した誘導体を基質
に用いる方法など、種々の方法が知られている。近年各
種の芳香族発色性基を還元末端に配糖体として有するマ
ルトオリゴシド類（グルコースの重合度が４〜７）の非
還元末端が各種の置換基で修飾された物質（ブロック
体；共役酵素系に耐性すなわち安定性を有する特徴を持
つ）を基質として利用し、α−アミラーゼにより切断し
た後、共役酵素系すなわちα−及び／又はβ−グルコシ
ダーゼやグルコアミラーゼを作用させ、生成する発色性
物質をそのまま、あるいは必要に応じてｐＨを変化させ
たり、縮合させた後に比色定量する方法が、広く用いら
れるようになってきた（特開平７−１３５９９８号、特
開平６−９６７６号、特開平６−４６８９５号など参
照）。

【０００３】また基質にα−マルトシド誘導体（グルコ
ース重合度が２）やα−マルトトリオシド誘導体（グル
コース重合度が３）を用い、共役酵素系を使用しない方
法も用いられ、又は報告されている（例えば「クリニカ
ル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．）」第２３
巻、２２７９ページ（１９７７年）、「クリニカル・ケ
ミストリー（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．）」第３４巻、７５
４ページ（１９８８年）、特開昭６３−１８３５９５
号、特開平６−３１５３９９号、特開平８−２９１号な
どを参照）。

【０００４】しかしこれらの方法においては、α−アミ
ラーゼによる切断速度が極めて低いこと、糖転移反応が
起こるためにα−アミラーゼ水解反応の一部しか測定で
きないこと、ヒトα−アミラーゼの２種のアイソザイム
（唾液腺由来（ＨＳＡ）及び膵臓由来（ＨＰＡ））の切
断速度が異なること、あるいはこれを克服するために毒
性化合物であるアジ化物を添加しなければならないこ
と、などの欠点が指摘されている。中でも決定的な欠点
は、α−マルトシド類やα−マルトトリオシド類がα−
アミラーゼの本来の基質であるデンプンに比べ、著しく
糖鎖が短いため、酵素−基質間の親和性が低い、すなわ
ちミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ値）が大きいことで
ある。この欠点を克服するためには、α−マルトトリオ
シド類の非還元末端グルコースの６位を疎水性基で修飾
し（あるいは置換し）かつ、４位に数個のα−グルコー
ス残基が導入された物質が理想と考えられた。しかるに
このような物質、およびその効率的な製造法はこれまで
知られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来用いられ
ているあるいは報告されている、α−アミラーゼ活性測
定のための基質が有する欠点を克服し、ヒトα−アミラ
ーゼ活性を精度よく、かつ短時間に測定し得る基質、お
よびこれを基質として用いたα−アミラーゼ活性の測定
方法を広く提供することを目的としてなされたものであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々研究を重ねた結果、特定の修飾基を
もつα−マルトオリゴシド誘導体を基質に用いると、α
−アミラーゼが高い親和性を示し、共役酵素を用いるこ
となしに、速やかに還元末端の発色性基のα−グルコシ
ド結合を切断することを見い出した。そして、該修飾α
−マルトオリゴシド誘導体を基質に用いてα−アミラー
ゼ活性を測定すれば、生成した所定の発色性化合物をそ
のまま比色などの定量系に、高感度・高正確度で導くこ
とができることを見い出した。またこの特定の修飾基を
もつα−マルトオリゴシド誘導体は、６位修飾シクロデ
キストリンを出発原料として、シクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼ又はシクロデキストリナーゼを
作用させたのち、α−アミラーゼを作用させると、直接
の原料である修飾マルトオリゴ糖が、効率よく得られる
ことを見い出し、これらの知見に基づいて本発明を完成
するに至った。すなわち本発明は、次の一般式（５）

【０００７】

【化５】

【０００８】（式中のＲは芳香族発色性基又は水素原
子、Ｘはアジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカ
ルバモイルオキシ基、アリールもしくはアルキルスルホ
ニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又は水素原子、
ｎは１又は２の整数である）で表される修飾α−マルト
オリゴシド誘導体であり、また、該修飾α−マルトオリ
ゴシド誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定
試薬であり、さらに該修飾α−マルトオリゴシド誘導体
を基質として用いて試料中のα−アミラーゼ活性を測定
することを特徴とする、α−アミラーゼ活性の測定方法
であり、さらにまた、該修飾α−マルトオリゴシド誘導
体を製造するにあたり、次の一般式（６）

【０００９】

【化６】

【００１０】（式中のＹはアジド基、ハロゲン原子、ア
リールスルホニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又
は水素原子、ｍは５又は６の整数である）で表される６
位修飾シクロデキストリンに、シクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼ又はシクロデキストリナーゼを
作用させたのち、α−アミラーゼを作用させて得られる
次の一般式（７）

【００１１】

【化７】

【００１２】（式中のＹはアジド基、ハロゲン原子、ア
リールスルホニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又
は水素原子、ｎは１又は２の整数である）で表される修
飾α−マルトオリゴ糖を直接の原料として用いることを
特徴とする、修飾α−マルトオリゴシド誘導体の製造方
法である。

【００１３】

【発明の実施の態様】以下、本発明を詳細に説明する。
前記一般式（５）で表される修飾α−マルトオリゴシド
誘導体（以下、単に本導体ということもある）におい
て、Ｘはアジド基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカ
ルバモイルオキシ基、アリールもしくはアルキルスルホ
ニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又は水素原子で
ある。ＸのＮ−モノアルキルカルバモイルオキシ基、ア
ルキルスルホニルオキシ基及びアルキルシリルオキシ基
のアルキル部は、例えばメチル基、トリフルオロメチル
基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル
基、シクロヘキシルなどの直鎖状、分枝状、環状又は置
換のアルキル基である。またＸのアリールスルホニルオ
キシ基の例としては、トルエンスルホニルオキシ基、ベ
ンゼンスルホニルオキシ基、ナフタレンスルホニルオキ
シ基、４−フルオロベンゼンスルホニルオキシ基などが
挙げられる。前記の本誘導体において、ｎは１又は２の
整数であるが、ｎが１の方がヒトα−アミラーゼにより
速く加水分解されるので好ましい。また製造法が簡単で
あるという観点からは、Ｘがアジド基、ハロゲン原子、
水素原子又はアリールスルホニルオキシ基であり、しか
もｎが１のものが好ましい。

【００１４】次に前記の本誘導体において、還元末端グ
ルコ−スの１位の水酸基に置換されるＲの芳香族発色性
基としては、分光学的に検出できればどのようなものを
用いてもよいが、例えば次の一般式（８）

【００１５】

【化８】（式中のＲ¹〜Ｒ⁵は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ
基、アルキル基、アリール基、アリル基、アミノ基、ス
ルホン酸基、又はカルボキシル基であり、それぞれ同一
であってもよいし、また異なっていてもよく、又Ｒ¹と
Ｒ²、又はＲ²とＲ³が結合して、縮合芳香環を形成して
もよい）で表されるものが挙げられる。中でも一般式
（８）において、ベンゼン環の４位がニトロ基で置換さ
れた４−ニトロフェニル誘導体は、遊離される４−ニト
ロフェノールの分子吸光係数（ε）が大きいこと、合成
原料が入手しやすいことなどから好ましい。さらにその
４−ニトロフェニル基の２位がハロゲン原子やニトロ基
などの電子吸引性基で置換された、次の一般式（９）

【００１６】

【化９】

【００１７】（式中のＷは水素原子、ハロゲン原子、又
はニトロ基である）で表される２−置換−４−ニトロフ
ェニル誘導体は、前記した４−ニトロフェニル誘導体の
利点に加えて、遊離される２−置換−４−ニトロフェノ
ールの、ｐＫａ値が小さいことから、液性が弱酸性領域
でもよく解離するため、高感度が得られるという優位性
を有している。このほか、前記一般式（５）で表される
本誘導体において、還元末端グルコースの１位の水酸基
に置換されるＲの芳香族発色性基の例としては、ウンベ
リフェロン誘導体、インドール誘導体、インドフェノー
ル誘導体、フルクトース残基などが挙げられ、必要に応
じてこれらの発色性基を用いることができる。

【００１８】したがって、前記一般式（５）で表される
具体的な化合物としては、例えば２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝６³−Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−アジド−
６³−デオキシ−α−マルトテトラオシド、４−ニトロ
フェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトテ
トラオシド、２−ブロモ−４−ニトロフェニル＝６³−
デオキシ−６³−ヨード−α−マルテトラオシド、２，
４−ジニトロフェニル＝６³−デオキシ−６³−フルオロ
−α−マルトペンタオシド、２−フルオロ−４−ニトロ
フェニル＝６³−Ｏ−（ｔ−ブチル）ジメチルシリル−
α−マルトテトラオシド、２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝６³−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−
α−マルトテトラオシド、４−メチルウンベリフェロニ
ル＝６³−Ｏ−メタンスルホニル−α−マルトテトラオ
シド、フェノールインド−３’−クロロフェニル＝６³
−デオキシ−６³−ヨード−α−マルトペンタオシドな
どが挙げられる。これらのうち、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝６³−Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−アジド−
６³−デオキシ−α−マルトテトラオシド、４−ニトロ
フェニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトテ
トラオシドなどが特に好ましい。なお、上記において使
用している記号の６³−は、マルトオリゴシドを構成す
るグルコ−ス鎖の還元末端側から３番めのグルコ−スの
６位水酸基の位置が置換されていることを示す。

【００１９】本発明の前記一般式（５）で表される本誘
導体を製造する方法としては、例えば先ず前記一般式
（７）で表される修飾α−マルトオリゴ糖を製造し、こ
れを直接の原料とし、これに公知の方法で前記一般式
（５）で表される本誘導体のＲに相当する発色性基を導
入する方法が挙げられる。

【００２０】本誘導体の製造において直接原料として用
いられる前記一般式（７）で表される修飾α−マルトオ
リゴ糖を製造する方法は以下の通りである。先ず、出発
原料となる前記一般式（６）で表される６位修飾シクロ
デキストリンに、シクロデキストリナーゼ又はシクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを作用させてシ
クロデキストリン環を開環する。この６位修飾シクロデ
キストリンはいかなる方法で入手してもよいが、例えば
市販のα−又はβ−シクロデキストリン（グルコース残
基はそれぞれ６、７である）から公知の方法によって製
造することができる。

【００２１】その製造法の好適な実施態様について説明
すると、前記一般式（６）におけるＹがアリールスルホ
ニルオキシ基又はアルキルシリルオキシ基である場合に
は、まずシクロデキストリンをピリジンなどの溶媒に溶
解し、このシクロデキストリンに対して２〜７倍モルの
アリールスルホニルクロライド又はアルキルシリルクラ
ライドを添加し、通常１５〜３０℃の範囲の温度で４〜
６時間程度反応させて６位ヒドロキシル基の内の１個の
みをアリールスルホニル化又はアルキルシリル化し、必
要に応じ常法に従って精製し、６−Ｏ−アリールスルホ
ニル又はアルキルシリルシクロデキストリンを得る。

【００２２】また、前記一般式（６）におけるＹがハロ
ゲン原子又はアジド基である場合には、６−Ｏ−アリー
ルスルホニルシクロデキストリンを極性溶媒中で６−Ｏ
−アリールスルホニルシクロデキストリンに対し、２〜
５０倍モル量のハロゲン化ナトリウム（カリウム、リチ
ウムでも良い）又はアジ化ナトリウムを添加し、通常７
０〜９０℃の範囲の温度で３〜１０時間程度反応させて
アリールスルホニルオキシ基をハロゲン原子又はアジド
基に置換し、必要に応じ常法に従って精製して６−デオ
キシ−６−ハロゲノ又は６−アジド−６−デオキシシク
ロデキストリンを得る。置換反応に用いる極性溶媒とし
ては、例えば水、アセトン、１，４−ジオキサン、アセ
トニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
などが挙げられ、これらは単独で又は２種以上を混合し
て用いてもよい。

【００２３】さらにまた、前記一般式（６）におけるＹ
が水素原子である場合には、６−Ｏ−アリールスルホニ
ル又は６−デオキシ−６−ヨードシクロデキストリンを
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性溶媒に溶解し、６−
Ｏ−アリールスルホニル又は６−デオキシ−６−ヨード
シクロデキストリンに対し、１０〜３０倍モル量の水素
化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を添加し、通常４０〜
６０℃の範囲の温度で１０〜２０時間程度反応させてア
リールスルホニルオキシ基またはヨード原子を還元的に
除去して、必要に応じ常法に従って不溶物を除去して、
６−デオキシシクロデキストリンを得る（「Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ］第１８巻、第２９
〜３７ページ（１９７１年）を参照）。また必要に応じ
て行われる前記一般式（６）で表される６位修飾シクロ
デキストリンの精製法としては、カラムクロマトグラフ
ィ法、テトラクロロエタンやトルエン包接体を水溶液か
らろ別する方法、晶析法などが挙げられる。

【００２４】このようにして前記一般式（６）で表わさ
れる出発物質物としての６位修飾α−シクロデキストリ
ン（ｍ＝５）、６位修飾β−シクロデキストリン（ｍ＝
６）などを容易に製造することができるが、後続の工程
における酵素反応速度、水溶性などを考慮すると、ｍ＝
５の場合はＹがトシルオキシ基又は水素原子、ｍ＝６の
場合はＹがハロゲン原子、アジド基又は水素原子である
ものが好適である。

【００２５】次に前記の６位修飾シクロデキストリンに
作用させるシクロデキストリナーゼについては、（イ）
シクロデキストリンを解裂し、シクロデキストリンのグ
ルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖を生成する作
用を有し、かつ（ロ）シクロデキストリンに対する水解
速度又は親和性が、多糖類あるいはシクロデキストリン
と同じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい特異性を有す
るものであればどのようなものでもよく、特に制限され
ず、またその起源についても特に制限はない。なお、こ
のシクロデキストリナーゼ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ
ａｓｅ、以下ＣＤａｓｅという）は加水分解酵素であっ
て、シクロマルトデキストリナーゼ（ｃｙｃｌｏｍａｌ
ｔｏｄｅｘｔｒｉｎａｓｅ）とも呼称され、ＥＣ３．
２．１．５４に属するものである（「ＡｐｐｌＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」第３９巻、第７
１４〜７１９ページ（１９９３年）を参照）。このよう
な酵素の中で好適なものとしては、次の理化学的性質を
有する公知のＣＤａｓｅを挙げることができる。

【００２６】ＣＤａｓｅの理化学的性質（イ）作用：シクロデキストリンを解裂し、シクロデキ
ストリンのグルコース重合度に由来するマルトオリゴ糖
を生成する作用を有する（ロ）基質特異性：シクロデキストリンに対する水解速
度又は親和性が多糖類あるいはシクロデキストリンと同
じ重合度の直鎖オリゴ糖よりも大きい基質特異性を有す
る。（ハ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：β−シクロデキスト
リンを基質とした場合、ｐＨ８．０近傍に至適ｐＨを有
し、かつ安定ｐＨ範囲が５．５〜９．５である。（ニ）作用適温：４０℃近傍に作用適温を有する。（ホ）失活性：５０℃以上の温度で１５分間の処理によ
り、ほぼ失活する性質を有する。（ヘ）阻害及び活性化：Ｈｇ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ
²⁺及びＦｅ²⁺により９０％以上阻害され、Ｃａ²⁺及びＭ
ｇ²⁺により１０〜３０％活性化される性質を有する。（ト）分子量：ゲルろ過法による分子量が１４４，００
０でＳＤＳＰＡＧＥ法による分子量が７２，０００で
ある。すなわちこの酵素は分子量７２，０００のサブユ
ニットから成る２量体である。なお、この酵素の力価
は、２％（ｗ／ｖ）濃度のβ−シクロデキストリン溶液
５００μｌ及び適当量の酵素を含有する１００ｍＭ濃度
のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５００μｌを混和し、温
度４０℃で適当時間反応させた後、１０分間煮沸するこ
とにより反応を停止し、高速液体クロマトグラフィによ
って、生成したマルトヘプタオースを定量することによ
って求めた。また酵素量が少量の場合には、グルコース
を標準としたソモギネルソン法により還元力を測定する
ことにより求めた。また、この酵素の酵素単位について
は、１分間に１μｍｏｌのマルトヘプタオースを生成す
る酵素量を１単位とした。

【００２７】前記のような性質を有する酵素は、例えば
バチルス属に属し、ＣＤａｓｅを生産する微生物、例え
ばバチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈ
ａｅｒｉｃｕｓ）Ｅ−２４４菌株［工業技術院微生物工
業技術研究所（現工業技術院生命工学工業技術研究所）
に微工研条寄第２４５８（ＦＥＲＭＢＰ−２４５８）
として寄託されている］などを培地に培養し、得た培養
物から採取することにより得られる。なお前記ＣＤａｓ
ｅの理化学的性質、その産生菌バチルス・スフェリカス
Ｅ−２４４菌株（ＦＥＲＭＢＰ−２４５８）の菌学的
性質及びそれを用いて該酵素を製造する方法は公知であ
る（特開平３−１５３８４号公報及び特開平３−８６７
０１号公報を参照）。

【００２８】前記一般式（６）で表わされる６位修飾シ
クロデキストリンに、グルコースの存在下、ＣＤａｓｅ
を作用させると、該酵素の糖転位活性により環状糖鎖の
不特定の位置に１回のみグルコースの転位が起こり、次
の一般式（１０）

【００２９】

【化１０】

【００３０】（式中のｍは５又は６の整数であり、Ｙは
アジド基、ハロゲン原子、アリールスルホニルオキシ
基、アルキルシリルオキシ基又は水素原子であり、ｐは
ｍが５のとき０〜５の整数、ｍが６のとき０〜６の整数
である）で表わされる、種々の位置に６位修飾グルコー
ス残基を有する６位修飾マルトオリゴ糖の混合物を主成
分とする反応液が得られる。この反応において、グルコ
ースを存在させることによって、不存在のときに比べて
理論値として、目的化合物の生成が約３０％増加する。

【００３１】前記の酵素反応における６位修飾シクロデ
キストリン（出発物質）の濃度は特に制限されないが、
ＣＤａｓｅの基質に対するＫｍ値以上の濃度になるよう
に調整することが好ましい。共存させるグルコース量に
ついても特に制限はなく、通常は６位修飾シクロデキス
トリンの３〜２０倍モル量の範囲から選ばれる。また酵
素量についても特に制限はないが、反応時間内に生成物
量が最大となるように、適宜必要量を添加すればよく、
通常原料１ｇに対して０．５〜１０単位の範囲で選ばれ
る。

【００３２】酵素反応条件については、ＣＤａｓｅの作
用ｐＨ及び作用温度の範囲であればよく特に制限はない
が、通常ｐＨ６．５〜９．０、温度３５〜４５℃の条件
で反応が行われ、反応時間は通常３０分〜４８時間であ
る。さらにこの反応において、必要に応じて１，４−ジ
オキサン、アセトン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどの水溶性有
機溶媒を添加してもよい。またＣＤａｓｅによる酵素反
応の終了後には、例えば塩酸、酢酸などを用いた酸処
理、７５〜１００℃で３０〜１８０分間の熱処理などに
よる酵素の失活処理を行うのが望ましい。

【００３３】次に前記の６位修飾シクロデキストリン
に、グルコースの存在下ＣＤａｓｅを作用させる代わり
に、α−グルコシル受容体の存在下、シクロデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼ（以下ＣＧＴａｓｅと略
す）を作用させるシクロデキストリン環を開環する方法
について説明する。前記一般式（６）で表わされる６位
修飾シクロデキストリンに、α−グルコシル受容体の存
在下でＣＧＴａｓｅを作用させると、カップリング反応
としてよく知られている転位反応が起こり、次の一般式
（１１）

【００３４】

【化１１】

【００３５】（式中のＹはアジド基、ハロゲン原子、ア
リールスルホニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又
は水素原子であり、ｍは５又は６の整数、Ｚはα−グル
コシル受容体、ｑはｍが５のとき０〜５の整数、ｍが６
のとき０〜６の整数である）で表わされる各種６位修飾
マルトオリゴ糖誘導体を主成分とした混合物が得られ
る。

【００３６】本発明において用いられるＣＧＴａｓｅは
シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ
とも呼称され、ＥＣ２．４．１．１９に属するもので
あって、ＣＧＴａｓｅの由来には特に制限はなく、例え
ばバチルス属（例えばＢａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅｒａ
ｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなど）
由来のもの、クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなど）由来のものなどが用いられ
る。

【００３７】また、共存させるα−グルコシル受容体と
しては、Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロ
ースなどの単糖類、６−デオキシグルコース、６−デオ
キシ−６−ハロゲノグルコースなどの６位修飾グルコー
ス、メチル＝α−Ｄ−グルコシド、マルトース、マルト
トリオース、セロビオース、シュークロースなどの１位
修飾グルコース（すなわちグルコシド）などが例として
挙げられる。形式的には、６位修飾マルトオリゴ糖の還
元末端側に、ＣＧＴａｓｅによってα−グルコシル受容
体が導入されることになるが、導入されたα−グルコシ
ル受容体は続く工程でα−アミラーゼの作用により切断
・除去されるため、本質的にα−グルコシル受容体は前
述した例に挙げるようにカップリング反応が可能なもの
であればどのようなものでもよい。しかし、カップリン
グ反応及び後記のα−アミラーゼ酵素反応の収率が高い
こと、工業規模における原料として安価であること、精
製が簡単であることなどからα−グルコシル受容体とし
ては、マルトースが好ましい。

【００３８】ＣＧＴａｓｅを作用させる際の反応条件
は、通常の酵素反応と同様の条件が用いられ、特に制限
されないが、ｐＨ５．５〜８．０、温度３５〜５０℃、
反応時間は０．５〜４８時間程度が好ましい。ＣＧＴａ
ｓｅの使用量も通常の酵素反応の場合に用いられる範囲
内であれば特に制限はないが、前記の６位修飾シクロデ
キストリンの重量１ｇに対し、５０〜１０００単位の範
囲で選ぶのがよい。また共存させるα−グルコシル受容
体の量についても特に制限はなく、通常、出発原料であ
る６位修飾シクロデキストリンの３〜２０倍モル量の範
囲から選ばれる。さらにこの反応において、必要に応じ
て１，４−ジオキサン、アセトン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、
イソプロパノールなどの水溶性有機溶媒を添加してもよ
い。またＣＧＴａｓｅによる酵素反応の終了後には、例
えば塩酸、酢酸などを用いた酸処理、７５〜１００℃で
３０〜１８０分間の熱処理などによる酵素の失活処理を
行う。このようにして前記一般式（１０）又は（１１）
で表される各種６位修飾マルトオリゴ糖の混合物を主成
分とする反応液が得られるが、用いる出発物質及び開環
方法によって得られる反応液の主な成分は表１のように
なる。

【００３９】

【表１】

【００４０】これらの各種６位修飾マルトオリゴ糖の中
で、本発明の目的を達成するために有利なものは、後記
するα−アミラーゼ反応の特異性から、６位修飾グルコ
ース残基から還元末端方向及び非還元末端方向に結合し
たグルコース残基数（前記一般式（１０）又は（１１）
において、ｍ−ｐ，ｐ，ｍ−ｑ，ｑ）が何れも２以上の
ものである。

【００４１】次にこのようにして得られた各種６位修飾
マルトオリゴ糖を主成分とする反応液にα−アミラーゼ
を作用させると、６位修飾グルコース残基から還元末端
方向の２番目と３番目のグルコース残基の間が選択的に
加水分解され、また６位修飾グルコース残基から非還元
末端方向の１番目と２番目又は２番目と３番目のグルコ
ース残基の間が選択的に加水分解され、６位修飾グルコ
ース残基から還元末端方向にグルコース残基が２個、６
位修飾グルコース残基から非還元末端方向にグルコース
残基が１個又は２個重合した前記一般式（７）で表され
る６³位修飾マルトテトラオース及び６³位修飾マルトペ
ンタオースを主成分とする反応液が得られる。

【００４２】その際に用いられるα−アミラーゼの種類
（由来）としては、例えばヒト唾液腺、ヒト膵臓、ブタ
膵臓など動物の消化腺、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの細
菌、放線菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などのかび類、
イネ科及びマメ科植物の種子などが挙げられるが、水解
位置の選択性が高いことからヒト消化腺由来α−アミラ
ーゼが好ましい。これらのα−アミラーゼは単独で用い
てもよいし、組み合わせて用いてもよい。α−アミラー
ゼを作用させる場合の反応条件としては、用いる酵素の
作用ｐＨ及び作用温度範囲で適宜選べばよいが、通常ｐ
Ｈ５．５〜８．５、温度３５〜５０℃において、０．５
〜４８時間程度で反応が行われる。さらに、α−アミラ
ーゼの使用量については、通常の酵素反応に使用される
範囲内であれば特に制限はないが、通常前記一般式（１
０）又は（１１）で表わされる各種６位修飾マルトオリ
ゴ糖の混合物の合計量１ｇに対し１００〜２００００単
位／ｇの範囲で選ばれる。またこの酵素反応は前記ＣＤ
ａｓｅの場合と同様に、酸処理や熱処理などにより停止
させることができる。

【００４３】得られた酵素反応液から、所望の前記一般
式（７）で表される６³位修飾マルトテトラオース又は
６³位修飾マルトペンタオースを分離精製するが、この
分離精製方法については特に制限はなく、従来オリゴ糖
の分離精製に慣用されている方法を用いることができ
る。例えば活性炭カラムクロマトグラフィ、ＯＤＳカラ
ムクロマトグラフィ、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィ、薄層クロマトグラフィなどを用いて分画採取する方
法などを採用することができる。このようにして得られ
る前記一般式（７）で表わされる６位修飾マルトオリゴ
糖の例としては、６³−Ｏ−トシルマルトテトラオー
ス、６³−クロロ−６³−デオキシマルトペンタオース、
６³−ブロモ−６³−デオキシマルトテトラオース、６³
−デオキシ−６³−ヨードマルトペンタオース、６³−Ｏ
−（ｔ−ブチル）ジメチルシリルマルトテトラオース、
６³−デオキシマルトペンタオース、６³−アジド−６³
−デオキシマルトテトラオースなどが挙げられる。こう
して得られた前記６位修飾マルトオリゴ糖は、これ自体
α−アミラーゼの基質としても使用できるし、また阻害
剤としても使用できる（Ｙが水素原子、ヨウ素などのも
の）。しかし前記したように、このものは前記一般式
（５）で表される修飾α−マルトオリゴシド誘導体の極
めて重要な原料となる。本誘導体の製造方法については
特に限定はしないが、以下前記の６位修飾マルトオリゴ
糖を原料とした本誘導体の製造方法の例について簡単に
述べる。

【００４４】（１）前記一般式（５）において、Ｘが
アジド基、ハロゲン原子、アリールスルホニルオキシ
基、アルキルシリルオキシ基又は水素原子である場合；
例えば前記の６位修飾マルトオリゴ糖をピリジン中、無
水酢酸などを作用させてパーアセチル化し、これを例え
ばベンゼンなどの無極性溶媒中、フェノール性発色化合
物と塩化亜鉛などの酸触媒存在下に加熱してα−グリコ
シドとする。ここで必要に応じて６³−トシルオキシ基
や６³−ハロゲン基を置換反応や還元反応によって、原
料とは違う種類の６³−ハロゲン基、６³−アジド基ある
いは６³−デオキシ基に変換してもよい。最後に例えば
メタノール中、ＮａＯＭｅあるいは塩酸などを作用させ
て脱アセチル化反応を行う（「単糖類の化学」、第１７
６〜１７７ページ、（後藤良造他著、１９８８年、丸善
株式会社、「プロテクティブグループス・イン・オーガ
ニックシンセシス（ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐ
ｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、
第５０〜６４ページ、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、１９８
１年、ＪＯＨＮＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）などを参照）。

【００４５】（２）前記一般式（５）において、ＸがＮ
−アルキルカルバモイルオキシ基又はアルキルスルホニ
ルオキシ基である場合；例えば前記一般式（７）で表さ
れる６位修飾マルトオリゴ糖であって、式中のＹがアル
キルシリルオキシ基のもの（６³−Ｏ−アルキルシリル
マルトオリゴ糖）を原料に用い、これをピリジン中、無
水酢酸などを作用させてパーアセチル化し、次いで酢酸
中水を作用させるなどして脱アルキルシリル化し、６³
−ＯＨ誘導体とする。これにＮ−アルキルイソシアネー
トなど及び／又はアルキルスルホニルクロライドなどを
作用させて６³−Ｏ修飾反応を行う。これを例えばベン
ゼンなどの無極性溶媒中、フェノール性発色化合物と塩
化亜鉛などの酸触媒存在下に加熱してα−グリコシドと
し、最後に例えばメタノール中、ＮａＯＭｅ、塩酸など
を作用させて脱アセチル化反応を行う（「プロテクティ
ブグループス・イン・オーガニックシンセシス（Ｐｒｏ
ｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３９〜６４ページ、Ｔ．
Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ著、１９８１年、ＪＯＨＮＷＩＬＥ
Ｙ＆ＳＯＮＳ、ＮｅｗＹｏｒｋ、特開平４−３４
６９９４号、「単糖類の化学」、第１７６〜１７７ペー
ジ、（後藤良造他著、１９８８年、丸善株式会社）など
を参照）。以上のようにして得られた一般式（５）で表
される本誘導体は、α−アミラーゼ活性の測定に極めて
有用であり、本誘導体を基質として用いてα−アミラー
ゼの活性を測定することができる。

【００４６】α−アミラーゼ活性を測定するための有利
な系としては、例えば前記本誘導体０．２〜１０ｍＭ及
び緩衝液２〜３００ｍＭを含有するｐＨ４〜８の系が挙
げられる。この系に用いられる緩衝剤としては例えばグ
ッド緩衝液、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、ク
エン酸塩、β−グリセロリン酸塩、ジメチルグルタル酸
塩などが挙げられる。このような系に、前記成分以外
に、本発明の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に
応じて慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定
化剤として、グリセリン、牛血清アルブミン、α−又は
β−シクロデキストリン、トリトンＸ−１００などを加
えることができるし、追加的な酵素活性化剤として、Ｎ
ａＯＣＮ、ＮａＮ₃、またＮａＣｌ，ＭｇＣｌ₂、Ｃａ
（ＣＨ₃ＣＯＯ）₂、ＣａＣｌ₂などの形で用いられるＣ
ｌ^-イオン、Ｃａ²⁺イオン、Ｍｇ²⁺イオンなども加えて
もよい。これらの添加成分は１種用いてもよいし、２種
以上組合せて用いてもよく、また前記系調製の適当な段
階で加えることができる。

【００４７】本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した
形で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシ−ト、含
浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような本
発明の試薬を用いることにより、各種の試料中のヒトα
−アミラーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度で
測定することができる。

【００４８】次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定
方法の好適な実施態様を説明する。先ず、α−アミラー
ゼを含む試料に、前記の修飾α−マルトオリゴシド誘導
体を０．２〜１０ｍＭ、好ましくは２．０〜８．０ｍＭ
を緩衝剤とともに添加した後、温度２５〜４５℃、好ま
しくは３５〜４０℃、ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ５〜
７の条件下で少なくとも１分間、好ましくは２〜１０分
間酵素反応させ、生成した発色性化合物を、常法に従い
そのままであるいは必要に応じｐＨを調整したのち、又
は縮合反応を行ったのちに、適当な吸光波長で連続的に
又は断続的に吸光度変化量を測定し、あらかじめ測定し
たα−アミラーゼ標品の吸光度変化量と対比させて試料
中のα−アミラーゼ活性を算出する。また芳香族発色性
化合物の分子吸光係数から算出することもできる。本発
明に用いられるα−アミラーゼ含有試料については、α
−アミラーゼ活性を含有するものであればよく、特に制
限はないが動植物の体液や組織及びそれらの抽出液など
を用いることができる。

【００４９】

【発明の効果】本発明の前記一般式（５）で表わされる
修飾α−マルトオリゴシド誘導体は、α−アミラーゼ活
性測定用の基質としての要求特性をすべて備えた新規な
化合物であり、本発明の方法及び本誘導体を有効成分と
した本発明の試薬は、共役酵素を用いないα−アミラー
ゼ活性測定に極めて有用である。本誘導体を基質として
用いることにより、試料中に含まれるグルコース、マル
トース、ビリルビン、ヘモグロビン、グルコシダーゼ
類、グルコアミラーゼなどの影響を受けることなく、α
−アミラーゼ活性を自動分析法、用手法などにより、精
度よく短時間で容易に測定することができる。さらに本
発明の化合物のヒトα−アミラーゼ酵素反応におけるミ
カエリス−メンテン定数（Ｋｍ値）が小さいので、酵素
−基質間の親和性が高いことから、低い基質濃度で最大
加水分解速度が得られという利点がある。

【００５０】

【実施例】次に実施例又は試験例により、本発明をさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなん
ら限定されるものではない。なお、各実施例中の高速液
体高速液体クロマトグラフィは、ＹＭＣ（株）製ＯＤＳ
ＡＱ−３１２カラム（６．０ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ）
（以下ＯＤＳと略す）又は東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ
Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍ
ｍ）（以下単にアミドと略す）を用いた。また、クロマ
トグラフィの溶離液は、アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）
の混合液を用い、流速は１．０ｍｌ／分で行った。以下
の各例中には用いたカラム、検出法、溶離液の混合比及
びリテンションタイム（ｔ_R）を示す。また、紫外部・
可視部吸収スペクトルの測定は、メタノール中で行っ
た。各実施例中の比旋光度は、２５℃においてナトリウ
ムのＤ線で測定した値である。さらにまた、基質のα−
アミラーゼに対するＫｍ値の測定は、５０ｍＭリン酸緩
衝液中、４０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂存在下で
行った。

【００５１】実施例１（２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトテトラ
オシド及び２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−ブ
ロモ−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシドの製
造）（１）６−Ｏ−トシル−β−シクロデキストリンの製
造市販のβ−シクロデキストリン（塩水港精糖（株）製）
１００ｇ（８８．２ｍｍｏｌ）をピリジン２００ｍｌに
溶解し、３０分間隔でトシルクロライド２２ｇ、２２
ｇ、２３ｇ（合計６７ｇ，３５０ｍｍｏｌ）を加え、最
後にトシルクロライドを加えてから室温下で１．５時
間、攪拌しながら反応させた。次いでこの反応液に水１
０ｍｌを加えた後、減圧下溶媒を留去し、得られた濃縮
液に水１００ｍｌを加え、再度減圧下溶媒を留去した。
得られた残渣に水１０００ｍｌを加えかき混ぜた後、結
晶種を少量加えて室温下に放置し、結晶化を行った。こ
の結晶をグラスフィルタ−でろ別し、水２００ｍｌ、３
００ｍｌ及びメチルエチルケトン３００ｍｌで洗浄した
後、乾燥して６−Ｏ−トシル−β−シクロデキストリン
を３７．２ｇ（２８．９ｍｍｏｌ，収率３２．８％）得
た。融点（℃）：１７２．０〜１７４．０（分解）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３４００，２９３０，
１６４２，１６３２，１６００，１４２４，１３６０，
１３００，１１７８，１１５６，１０７８，１０２８核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ：（ＤＭ
ＳＯ−ｄ₆）２．４４（３Ｈ，ｓ），３．１５〜４．４
５（ｍ），４．７６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ），４．８５（５
Ｈ，ｂｒ．ｓ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈ
ｚ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［アミド，ＲＩ検出，３：
２］：５．５ｍｉｎ

【００５２】（２）６−デオキシ−６−ヨード−β−
シクロデキストリンの製造前記（１）で得られた６−Ｏ−トシル−β−シクロデキ
ストリン３５ｇ（２７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１００ｍｌに
溶解し、ヨウ化ナトリウム１２．２ｇ（８１ｍｍｏｌ）
を加え、７０℃で４時間反応させた。次いで反応液を減
圧下濃縮乾固し、得られた残渣に水１５０ｍｌを加えて
溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィに供して精製
し、アセトニトリル−水混液（容量比０％→２０％グラ
ジェント）で溶出し、目的物が含まれる区分を濃縮乾固
して６−デオキシ−６−ヨード−β−シクロデキストリ
ンを３２ｇ（２６ｍｍｏｌ，収率９６％）得た。融点（℃）：２０７．０〜２０９．０（分解）紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２１９（ｌｏｇε＝
３．２６），２５３（ｌｏｇε＝２．６３）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３９９，２９３０，
１６８６，１６５５，１６３７，１４２０，１１５５，
１０３０高速液体クロマトグラフィ［アミド，ＲＩ検出，３：
２］：７．７ｍｉｎ比旋光度（ｃ０．５１０，Ｈ₂Ｏ）；＋１３０°

【００５３】（３）６³−デオキシ−６³−ヨードマル
トテトラオース及び６³−デオキシ−６³−ヨードマルト
ペンタオースの製造前記（２）と同様の操作で得た６−デオキシ−６−ヨー
ド−β−シクロデキストリン３２１ｇ（２５７ｍｍｏ
ｌ）を、あらかじめ５０℃に加温しておいた１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）８ｌ中に攪拌しながら投入
し、完全に溶解した。そこへ市販のマルトース（和光純
薬（株）製）１．６ｋｇ（４．６８ｍｏｌ）及び市販の
シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ１２０
ｋＵ相当のコンチザイム（天野製薬（株）製酵素液）を
加え、５０℃で３．５時間攪拌しながら反応を行った。
反応終了後、反応液を９０℃で４時間攪拌しながら加熱
した。次いで反応液にＮａＣｌ２．３４ｇ（４０ｍｍ
ｏｌ）、ＭｇＣｌ₂ ｌ０．７６ｇ（８．０ｍｍｏｌ）
を加えて溶解し、０．１Ｎ−ＮａＯＨ水を加えてｐＨを
７．０とした。さらに蒸発減少分の水を加えて全量８ｌ
としたのち、ヒト唾液α−アミラーゼ５００ｋＵを加
え、４０℃で２４時間攪拌しながら反応を行った。反応
終了後、反応液を９０℃で４時間攪拌しながら加熱し
た。これを室温まで冷却し、スタンダードスーパーセル
（セライト（株）製）でろ過を行った後、水洗し、ろ液
と洗液を合わせてＯＤＳカラムクロマトグラフィに供し
て精製し、アセトニトリル−水混液（容量比０％→４％
グラジェント）で溶出し、目的区分を濃縮後、凍結乾燥
して６³−デオキシ−６³−ヨードマルトテトラオースを
４６．３ｇ（６０ｍｍｏｌ，収率２３％）及び６³−デ
オキシ−６³−ヨードマルトペンタオースを４２．５ｇ
（４５ｍｍｏｌ，収率１８％）得た。６³−デオキシ−６³−ヨードマルトテトラオース；高速
液体クロマトグラフィ［アミド，ＲＩ検出，６５：３
５］：７．９ｍｉｎ６³−デオキシ−６³−ヨードマルトペンタオース；高速
液体クロマトグラフィ［アミド，ＲＩ検出，６５：３
５］：１０．２ｍｉｎ

【００５４】（４）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝ドデカＯ−アセチル−６³−ブロモ−６³−デオキシ−
α−マルトテトラオシドの製造前記（３）で得た６³−デオキシ−６³−ヨードマルトテ
トラオース１０ｇ（１２．９ｍｍｏｌ）をピリジン１５
０ｍｌに溶解し、無水酢酸７５ｍｌ（７８９ｍｍｏｌ）
を加え、室温で２日間かきまぜながら反応させた。次い
で反応液を減圧下濃縮し、ここに含まれるピリジン、無
水酢酸、酢酸を留去した。得られたオイル状のアセチル
体をクロマトグラフィなどによる精製を行わずに、酢酸
２８ｍｌに溶解し、無水酢酸２．０ｍｌ、２−クロロ−
４−ニトロフェノール８９ｇ（５１３ｍｍｏｌ）、Ｚｎ
Ｃｌ₂ ７．０ｇ（５１．５ｍｍｏｌ）を加え、減圧下
（２０ｍｍＨｇ）１１０℃で溶融してから１０分間反応
させた。次いでこの反応液に加熱したままＤＭＳＯ１
０ｍｌを加え、攪拌して反応物を混合した。この混合液
をジクロロメタン２ｌで溶解し、０．１Ｎ−ＮａＯＨ水
２ｌで３回、飽和食塩水２ｌで３回洗浄し、ジクロロメ
タン層部を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別した後、ろ
液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを留去した。この２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝ドデカＯ−アセチル−
６³−デオキシ−６³−ヨード−α−マルトテトラオシド
が含まれる残査をＤＭＳＯ２００ｍｌに溶解し、Ｎａ
Ｂｒ７７．２ｇ（７５０ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で３
時間かきまぜながら反応させた。反応液にトルエンを２
ｌ加え、３％ＮａＣｌ水５００ｍｌで３回洗浄し、トル
エン層部を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別した後、ろ
液を減圧下濃縮し、トルエンを留去した。得られた残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−により精製し、
酢酸エチル−１％メタノ−ル含有ジクロロメタン混液
（容量比１：８）で溶出した目的区分を濃縮し、次いで
ＯＤＳカラムクロマトグラフィ−により精製し、アセト
ニトリル−水（容量比３：２）で溶出した目的区分を濃
縮して、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝ドデカＯ−
アセチル−６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトテ
トラオシド８．６ｇ（６．２ｍｍｏｌ，３工程通算収率
４８％）が得られた。融点(℃)：１１３〜１１６赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３４７２，２９６０，
１７５２，１５２３，１４８２，１４３１，１３７１，
１２３５，１０３９，９４７，８９９比旋光度［α］：（ｃ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１６６° 高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，ＲＩ検出，３：
１］：７．７ｍｉｎ元素分析：Ｃ₅₄Ｈ₆₇ＢｒＣｌＮＯ₃₄としてＣＨＮ理論値（％）４６．６８４．８６１．０１実測値（％）４６．２８４．９４０．９４

【００５５】（５）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトテトラオシ
ドの製造前記（４）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝ド
デカＯ−アセチル−６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−
マルトテトラオシド４．３ｇ（３．１ｍｍｏｌ）を無水
メタノール４３０ｍｌに溶かし、０．１Ｎ−ＮａＯＭｅ
／ＭｅＯＨを３．１ｍｌを加え、２０℃でかきまぜなが
ら４時間反応させた。次いで反応液を１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に冷却下かきまぜながら滴加し、
この混合液を減圧下１／１０量まで濃縮した。得られた
濃縮液をＯＤＳカラムクロマトグラフィにより精製し、
１５％アセトニトリル／水で溶出した目的区分を濃縮し
て、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−ブロモ−
６³−デオキシ−α−マルトテトラオシド２．１ｇ
（２．４ｍｍｏｌ，収率７７％）が得られた。融点(℃)：１６７〜１６９（分解）吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２０９（ｌｏｇε＝
４．１１），２２７（ｌｏｇε＝３．９２），２９０
（ｌｏｇε＝３．９１）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８６，２９２９，
１５８６，１５２３，１４８３，１３４８，１２７２，
１１５０，１０８３，１０２９，９３４比旋光度［α］：（ｃ０．５００，メタンール）；＋
１６１° 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ）：５．０１（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．９Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈ
ｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），７．５
４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），８．２０（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２．９Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２．９Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，２８０ｎｍ検出，
１：３］：４．２ｍｉｎ元素分析：Ｃ₃₀Ｈ₄₃ＢｒＣｌＮＯ₂₂としてＣＨＮ理論値（％）４０．７１４．９０１．５８実測値（％）４０．５９４．９９１．４８Ｋｍ値：対ＨＰＡ；０．０９８ｍＭＫｍ値：対ＨＳＡ；０．１４ｍＭ

【００５６】（６）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝ペンタデカＯ−アセチル−６³−ブロモ−６³−デオキ
シ−α−マルトペンタオシドの製造前記の（３）で得た６³−デオキシ−６³−ヨードマルト
ペンタオース５．０ｇ（５．３３ｍｍｏｌ）を原料に用
いること以外は、前記（４）と同様の操作を行い、２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝ペンタデカＯ−アセチル
−６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシ
ド４．０２ｇ（２．４ｍｍｏｌ，３工程通算収率４５
％）を得た。融点(℃)：１２０〜１２２赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９６０，１７５２，
１５８７，１５２３，１４８２，１４３８，１３７１，
１２３６，１０３９，９４８，８９９比旋光度［α］：（ｃ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１６５° 高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，ＲＩ検出，３：
１］：９．０ｍｉｎ元素分析：Ｃ₆₆Ｈ₈₃ＢｒＣｌＮＯ₄₂としてＣＨＮ理論値（％）４７．２５４．９９０．８３実測値（％）４７．０１５．０９０．７４

【００５７】（７）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシ
ドの製造前記（６）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝ペ
ンタデカＯ−アセチル−６³−ブロモ−６³−デオキシ−
α−マルトペンタオシド４．０２ｇ（２．４ｍｍｏｌ）
を原料に用いること以外は、前記（５）と同様の操作を
行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−ブロモ
−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシド１．３４ｇ
（１．３ｍｍｏｌ，収率５３％）を得た。融点(℃)：１７８〜１８０（分解）吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２０９（ｌｏｇε＝
４．１０），２２７（ｌｏｇε＝３．９１），２９１
（ｌｏｇε＝３．９１）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８０，２９２９，
１５８７，１５２３，１４５９，１３４７，１２７３，
１１５３，１０８２，１０２９，１０２９比旋光度［α］：（ｃ０．５００，水）；＋１７５° 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ）：５．０７（２
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈ
ｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），７．５
４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，２８０ｎｍ検出，
１：３］：４．０ｍｉｎ元素分析：Ｃ₃₆Ｈ₅₃ＢｒＣｌＮＯ₂₇としてＣＨＮ理論値（％）４０．４９５．２０１．３１実測値（％）４０．２８５．３５１．２４Ｋｍ値：対ＨＰＡ；０．００６７ｍＭＫｍ値：対ＨＳＡ；０．０１７ｍＭ

【００５８】実施例２（２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝６³−Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシド及び
２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−Ｏ−トシル−
α−マルトペンタオシドの製造）（１）６−Ｏ−トシル−α−シクロデキストリンの製
造市販のα−シクロデキストリン（塩水港精糖（株）製）
１５０ｇ（１５４ｍｍｏｌ）及びテトラエチルアンモニ
ウムブロマイド１９ｇをピリジン１．５０ｌに溶解し、
３０分間隔でトシルクロライド４９．１ｇを３回（合計
１４７．３ｇ，７７１ｍｍｏｌ）を加え、最後にトシル
クロライドを加えてから室温下で１．０時間、攪拌しな
がら反応させた。次いでこの反応液にＥｔＯＨを４５０
ｍｌ加えて３０分間攪拌後、減圧下溶媒を留去し、得ら
れた濃縮液に水１．２ｌを加え、再度減圧下溶媒を留去
した。得られた濃縮液に水１．２ｌを加え、ジクロロメ
タン０．８ｌで３回洗浄した後水層をさらに濃縮し、得
られた濃縮液に水を加えて全量を３．０ｌとした。この
水溶液をＯＤＳカラムクロマトグラフィにより精製し、
アセトニトリル−水混液（容量比２５：７５）で溶出し
た目的区分を濃縮し、凍結乾燥を行って、６−Ｏ−トシ
ル−α−シクロデキストリンを３７．８ｇ（３３．６ｍ
ｍｏｌ，収率２１．８％）得た。融点（℃）：１７２．０〜１７４．０（分解）高速液体クロマトグラフィ［アミド，ＲＩ検出，３：
２］：５．５ｍｉｎ

【００５９】（２）６³−Ｏ−トシルマルトテトラオ
ース及び６³−Ｏ−トシルマルトペンタオースの製造前記の（１）と同様の操作で得た６−Ｏ−トシル−α−
シクロデキストリン１８７ｇ（１６８ｍｍｏｌ）を原料
に用いること以外は、実施例１の（３）と同様の操作を
行い、６³−Ｏ−トシルマルトテトラオースを４４．４
ｇ（５５．１ｍｍｏｌ，収率３３％）及び６³−Ｏ−ト
シルマルトペンタオースを３８．２ｇ（３９．５ｍｍｏ
ｌ，収率２４％）得た。６³−Ｏ−トシルマルトテトラオース；高速液体クロマ
トグラフィ［アミド，ＲＩ検出，３：２］：４．５ｍｉ
ｎ６³−Ｏ−トシルマルトペンタオース；高速液体クロマ
トグラフィ［アミド，ＲＩ検出，３：２］：５．４ｍｉ
ｎ

【００６０】（３）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝ドデカＯ−アセチル−６³−Ｏ−トシル−α−マルト
テトラオシドの製造前記（２）で得た６³−Ｏ−トシルマルトテトラオース
０．９８３ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）を原料に用いるこ
と、及び６³位のＮａＢｒによるＢｒ化反応を行わない
こと以外は、実施例１の（４）と同様の操作を行い、２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝ドデカＯ−アセチル−
６³−Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシド１．５７ｇ
（１．０６ｍｍｏｌ，収率８７％）を得た。融点(℃)：１１７〜１１９赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：２９５８，１７５１，
１５８７，１５２６，１４８３，１４３８，１３７１，
１２３６，１１７９，１０３９，９４６比旋光度［α］：（ｃ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５７° 高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，ＲＩ検出，３：
１］：９．７ｍｉｎ元素分析：Ｃ₆₁Ｈ₇₄ＣｌＮＯ₃₇ＳとしてＣＨＮ理論値（％）４９．４８５．０４０．９５実測値（％）４９．２７５．１５０．８４

【００６１】（４）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシドの製造前記（３）と同様の操作で得た２−クロロ−４−ニトロ
フェニル＝ドデカＯ−アセチル−６³−Ｏ−トシル−α
−マルトテトラオシド１．７９ｇ（１．２１ｍｍｏｌ）
を原料に用いること以外は、実施例１の（５）と同様の
操作を行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−
Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシド０．８１ｇ（０．
８３ｍｍｏｌ，収率６９％）得た。融点(℃)：１４８〜１５０（分解）吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２１３（ｌｏｇε＝
４．２４），２２５（ｌｏｇε＝４．２７），２９１
（ｌｏｇε＝３．９１）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８３，２９２９，
１５８７，１５２３，１４８３，１３４８，１２７３，
１１７７，１１５２，１０８０，１０５３比旋光度［α］：（ｃ０．５００，メタノール）；＋
１５１° 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ）：４．９３（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），４．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．４Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈ
ｚ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），７．４
４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
１Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，
２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，２８０ｎｍ検出，
３：７］：６．６ｍｉｎ元素分析：Ｃ₃₇Ｈ₅₀ＣｌＮＯ₂₅ＳとしてＣＨＮ理論値（％）４５．５２５．１６１．４３実測値（％）４５．４８５．２５１．２８Ｋｍ値：対ＨＰＡ；０．１９ｍＭＫｍ値：対ＨＳＡ；０．３７ｍＭ

【００６２】（５）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝ペンタデカＯ−アセチル−６³−Ｏ−トシル−α−マ
ルトペンタオシドの製造本実施例の（２）で得た６³−Ｏ−トシルマルトペンタ
オース１．５０ｇ（１．５４ｍｍｏｌ）を原料に用いる
こと以外は、前記の（３）と同様の操作を行い、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル＝ペンタデカＯ−アセチル−
６³−Ｏ−トシル−α−マルトペンタオシド１．９３ｇ
（１．０９ｍｍｏｌ，収率７１％）を得た。融点(℃)：１１８〜１２０赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９５８，１７５２，
１５８８，１５２４，１４８２，１４３８，１３７０，
１２３６，１１７８，１０３７，９４６比旋光度［α］：（ｃ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１５９° 高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，ＲＩ検出，３：
１］：１０．５ｍｉｎ元素分析：Ｃ₇₃Ｈ₉₀ＣｌＮＯ₄₅ＳとしてＣＨＮ理論値（％）４９．５６５．１３０．７９実測値（％）４９．３１５．４９０．７７

【００６３】（６）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−Ｏ−トシル−α−マルトペンタオシドの製造前記の（５）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
ペンタデカＯ−アセチル−６³−Ｏ−トシル−α−マル
トペンタオシド１．９３ｇ（１．０９ｍｍｏｌ）を原料
に用いること以外は、実施例１の（５）と同様の操作を
行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−Ｏ−ト
シル−α−マルトペンタオシド０．７６３ｇ（０．６７
０ｍｍｏｌ，収率６２％）得た。融点(℃)：１５５〜１５７（分解）吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２１３（ｌｏｇε＝
４．２０），２２５（ｌｏｇε＝４．２３），２８９
（ｌｏｇε＝３．８７）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1）：３３９４，２９２９，
１５８７，１５２２，１４８３，１３４８，１２７３，
１１７６，１１５３，１０８１，１０２９比旋光度［α］：（ｃ０．５００，メタノール）；＋
１５４° 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ）：５．００（２
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈ
ｚ），５．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），７．４
４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．
１Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，
２．７Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，２８０ｎｍ検出，
１：３］：４．５ｍｉｎ元素分析：Ｃ₄₃Ｈ₆₀ＣｌＮＯ₃₀Ｓ・Ｈ₂ＯとしてＣＨＮ理論値（％）４４．６６５．４０１．２１実測値（％）４４．５０５．５８１．１９Ｋｍ値：対ＨＰＡ；０．４０ｍＭＫｍ値：対ＨＳＡ；０．６４ｍＭ

【００６４】実施例３（２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトテトラ
オシドの製造）（１）２−クロロ−４−ニトロフェニル＝ドデカＯ−
アセチル−６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトテ
トラオシドの製造実施例２の（２）で得た６³−Ｏ−トシルマルトテトラ
オース２．５ｇ（３．１０ｍｍｏｌ）を原料に用いるこ
と、及びＮａＢｒの代わりにＮａＮ₃を用いること以外
は、実施例１の（４）と同様の操作を行い、２−クロロ
−４−ニトロフェニル＝ドデカＯ−アセチル−６³−ア
ジド−６³−デオキシ−α−マルトテトラオシド３．４
８ｇ（２．５８ｍｍｏｌ，収率８４％）を得た。融点(℃)：１１４〜１１６赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９６３，２１０７，
１７５２，１５８７，１５２８，１４５９，１３７１，
１２３４，１１３６，１０３５，９４９比旋光度［α］：（ｃ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１８８° 高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，ＲＩ検出，３：
１］：８．５ｍｉｎ元素分析：Ｃ₅₄Ｈ₆₇ＣｌＮ₄Ｏ₃₄としてＣＨＮ理論値（％）４７．９９５．００４．１４実測値（％）４７．７０５．１７３．９８

【００６５】（２）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトテトラオシ
ドの製造前記の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
ドデカＯ−アセチル−６³−アジド−６³−デオキシ−α
−マルトテトラオシド１．６０ｇ（１．１８ｍｍｏｌ）
を原料に用いること以外は、実施例１の（５）と同様の
操作を行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³−
アジド−６³−デオキシ−α−マルトテトラオシド０．
５７ｇ（０．６８ｍｍｏｌ，収率５６％）を得た。融点(℃)：１４８〜１５０（分解）吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２０９（ｌｏｇε＝
４．１２），２２７（ｌｏｇε＝３．９４），２８９
（ｌｏｇε＝３．９３）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３８６，２９２９，
２１０６，１５８６，１５２３，１４８３，１４５９，
１３４８，１２７４，１１５２，１０８０，１０２７比旋光度［α］：（ｃ０．５００，水）；＋１８２° 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ）：４．９９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１１（２Ｈ，ｂｒ．
ｓ），５．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），７．５
４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，２８０ｎｍ検出，
１：３］：４．４ｍｉｎ元素分析：Ｃ₃₀Ｈ₄₃ＣｌＮ₄Ｏ₂₂としてＣＨＮ理論値（％）４５．９９５．８９４．２３実測値（％）４５．５４６．０２４．３０Ｋｍ値：対ＨＰＡ；０．１０ｍＭＫｍ値：対ＨＳＡ；０．１１ｍＭ

【００６６】実施例４（２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトペンタ
オシドの製造）（１）２−クロロ−４−ニトロフェニル＝ペンタデカ
Ｏ−アセチル−６³−アジド−６³−デオキシ−α−マル
トペンタオシドの製造実施例２の（２）で得た６³−Ｏ−トシルマルトペンタ
オース２．５ｇ（２．５８ｍｍｏｌ）を原料に用いるこ
と以外は、実施例３の（１）と同様の操作を行い、２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝ペンタデカＯ−アセチル
−６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシ
ド３．９５ｇ（２．４１ｍｍｏｌ，収率９３％）を得
た。融点(℃)：１１７〜１１９赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：２９５８，２１０５，
１７５２，１５８８，１５２４，１４８２，１４３８，
１３７１，１２３６，１１３６，１０３６比旋光度［α］：（ｃ０．５００，１，４−ジオキサ
ン）；＋１８５° 高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，ＲＩ検出，３：
１］：８．９ｍｉｎ元素分析：Ｃ₆₆Ｈ₈₃ＣｌＮ₄Ｏ₄₂としてＣＨＮ理論値（％）４８．３４５．１０３．４２実測値（％）４８．２２５．１５３．４５

【００６７】（２）２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝６³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシ
ドの製造前記の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
ペンタデカＯ−アセチル−６³−アジド−６³−デオキシ
−α−マルトペンタオシド２．５０ｇ（１．５３ｍｍｏ
ｌ）を原料に用いること以外は、実施例１の（５）と同
様の操作を行い、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６
³−アジド−６³−デオキシ−α−マルトペンタオシド
０．９１ｇ（０．９０ｍｍｏｌ，収率５９％）を得た。融点(℃)：１７４〜１７７（分解）吸収極大波長[λmax ]（ｎｍ）＝２０９（ｌｏｇε＝
４．１２），２２７（ｌｏｇε＝３．９３），２９２
（ｌｏｇε＝３．９２）赤外吸収スペクトル（ｃｍ^-1)：３３９９，２９３１，
２１０６，１５８６，１５２３，１４８３，１４５９，
１３４７，１２７４，１１５２，１０７９，１０２８比旋光度［α］：（ｃ０．５００，水）；＋１８０° 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ₆／Ｄ₂Ｏ＝１０：１，ｖ／ｖ）：５．０３（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），５．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．１２（２Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．８２
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈ
ｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７
Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ［ＯＤＳ，２８０ｎｍ検出，
１：３］：４．０ｍｉｎ元素分析：Ｃ₃₆Ｈ₅₃ＣｌＮ₄Ｏ₂₇・３／２Ｈ₂ＯとしてＣＨＮ理論値（％）４１．７２５．４５５．４１実測値（％）４１．７７５．３５５．４３Ｋｍ値：対ＨＰＡ；０．０６３ｍＭＫｍ値：対ＨＳＡ；０．０８１ｍＭ

【００６８】試験例１（Ｋｍ値（親和性）の比較）下記一般式（１２）

【００６９】

【化１２】

【００７０】で示され、該一般式中のＸ、ｒ、ｓの各
々が表２に示された、本発明の化合物と公知化合物との
ヒトα−アミラーゼ（ＨＰＡ及びＨＳＡ）に対するＫｍ
値を比較した。その結果を表２に示す。

【００７１】

【表２】

【００７２】表２から、６³位の位置に置換基を有
し、かつその非還元末端側にα−グルコース残基を持つ
本発明区分の化合物群は、同種の置換基を還元末端６位
に有する公知化合物よりもＫｍ値が小さいこと、すなわ
ち親和性が高いことが分かる。

【００７３】実施例５（α−アミラーゼ活性の測定方
法）（１）基質液の調製実施例２で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³
−Ｏ−トシル−α−マルトテトラオシドを２．０ｍＭ
（最終濃度がＫｍ値の５倍以上）の濃度になるように、
４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ₂を含有する
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。（２）標品α−アミラーゼ液の調製市販のヒトα−アミラーゼに精製水を加え、０、１４
２、２９６、４３２Ｕ／ｌ（ＨＰＡ：ＨＳＡ＝１：１）
の濃度に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。なお、
この市販のヒトα−アミラーゼは国際試薬（株）製「キ
ャリブザイム・ＡＭＹ」を使用した。また、α−アミラ
ーゼの活性は、３７℃、１分間に１μｍｏｌの２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトペンタオシド（市
販品）を分解する酵素量を１単位（Ｕ）として定義し
た。（３）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とした。固体の場合は、通常、試料５００ｍｇを
正確に秤量し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料
液とした。必要に応じて、不溶物をろ過などの操作で除
去してから用いた。（４）検量線の作成基質液２．０ｍｌを３７℃で１分間加温したのち、標品
α−アミラーゼ液２５０μｌを加えてかきまぜ、３７℃
で２分間加温した後からの２分間の４００ｎｍにおける
吸光度の変化量を測定した。各標品α−アミラーゼ液の
活性と、吸光度の変化量の関係より検量線を作成した。
その結果検量線の式はＵ＝２．１７・△Ａ ×１０³ ＋３．０［Ｕ；酵素活性（Ｕ／ｌ）、 △Ａ；２分間当りの吸光
度の変化量］となった。そのグラフを図１に示す。図１
から、α−アミラーゼ活性と吸光度の変化量との間に
は、極めて高い相関関係があることがわかり、したがっ
て本発明の方法によれば、この検量線に基づき、試料中
のα−アミラーゼ活性を、精度よく、短時間に測定でき
ることがわかる。（５）試料液中のα−アミラーゼ活性の測定基質液２．０ｍｌを３７℃で１分間加温したのち、試料
液２５０μｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温し
た後からの５分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量
を測定した。（４）で作成した検量線から算出して試料
液中のα−アミラーゼ活性の測定を行った。なお、試料
液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（０〜４３２Ｕ
／ｌ）を越えた場合は精製水を用いて相当する倍数の希
釈を行った後、再測定を行う。

【００７４】実施例６（α−アミラーゼ活性の測定方
法）（１）基質液の調製実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６³
−ブロモ−６³−デオキシ−α−マルトテトラオシドを
０．８０ｍＭ（最終濃度がＫｍ値の５倍以上）の濃度に
なるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ
₂を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解した。（２）標品α−アミラーゼ液の調製市販のヒトα−アミラーゼに精製水を加え、０、１４
２、２９６、４３２Ｕ／ｌ（ＨＰＡ：ＨＳＡ＝１：１）
の濃度に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。なお、
この市販のヒトα−アミラーゼは国際試薬（株）製「キ
ャリブザイム・ＡＭＹ」を使用した。また、α−アミラ
ーゼの活性は、３７℃、１分間に１μｍｏｌの２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル＝α−マルトペンタオシド（市
販品）を分解する酵素量を１単位（Ｕ）として定義し
た。（３）試料液の調製実施例５の（３）と同一の操作で試料液の調製を行っ
た。（４）検量線の作成吸光度の測定時間を１０分間とする以外は実施例５の
（４）と同様にして検量線の作成を行った。その結果、
該検量線の式はＵ＝３．６９・△Ａ ×１０³ ＋６．８［Ｕ；酵素活性（Ｕ／ｌ）、 △Ａ；１０分間当りの吸
光度の変化量］となった。そのグラフを図２に示す。図
２から、α−アミラーゼ活性と吸光度の変化量との間に
は、極めて高い相関関係があることがわかり、したがっ
て本発明の方法によれば、この検量線に基づき、試料中
のα−アミラーゼ活性を、精度よく、短時間に測定でき
ることがわかる。（５）試料液中のα−アミラーゼ活性の測定試料添加後の吸光度測定時間が１０分間であること以外
は、実施例５の（５）と同様の操作で試料液中のα−ア
ミラーゼ活性の測定を行った。

【００７５】実施例７（測定試薬）精製水に、表３に示した成分を、該表に示した濃度で溶
解することにより、本発明のα−アミラーゼ活性測定試
薬を調製した。

【００７６】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例５における、α−アミラーゼ活性と吸
光度の変化量との関係を示す検量線のグラフである。

【図２】実施例６における、α−アミラーゼ活性と吸
光度の変化量との関係を示す検量線のグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 23/00 Ｃ０７Ｈ 23/00 Ｃ１２Ｑ 1/40 9452−4ＢＣ１２Ｑ 1/40

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の一般式（１）【化１】（式中のＲは芳香族発色性基又は水素原子、Ｘはアジド
基、ハロゲン原子、Ｎ−モノアルキルカルバモイルオキ
シ基、アリールもしくはアルキルスルホニルオキシ基、
アルキルシリルオキシ基又は水素原子、ｎは１又は２の
整数である）で表される修飾α−マルトオリゴシド誘導
体。
【請求項２】請求項１記載の一般式（１）で表される
修飾α−マルトオリゴシド誘導体が、式中のＲが次の一
般式（２）【化２】（式中のＷは水素原子、ハロゲン原子、又はニトロ基で
ある）で表される芳香族発色性基であり、Ｘがアジド
基、ハロゲン原子、アリールスルホニルオキシ基、アル
キルシリルオキシ基又は水素原子であり、ｎが１であ
る、請求項１記載の修飾α−マルトオリゴシド誘導体。
【請求項３】請求項１又は請求項２記載の修飾α−マ
ルトオリゴシド誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ
活性測定試薬。
【請求項４】請求項１又は請求項２記載の修飾α−マ
ルトオリゴシド誘導体を基質として用いて試料中のα−
アミラーゼ活性を測定することを特徴とする、α−アミ
ラーゼ活性の測定方法。
【請求項５】請求項１又は請求項２記載の修飾α−マ
ルトオリゴシド誘導体を製造するにあたり、次の一般式
（３）【化３】（式中のＹはアジド基、ハロゲン原子、アリールスルホ
ニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又は水素原子、
ｍは５又は６の整数である）で表される６位修飾シクロ
デキストリンに、シクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼ又はシクロデキストリナーゼを作用させたの
ち、α−アミラーゼを作用させて得られる次の一般式
（４）【化４】（式中のＹはアジド基、ハロゲン原子、アリールスルホ
ニルオキシ基、アルキルシリルオキシ基又は水素原子、
ｎは１又は２の整数である）で表される修飾α−マルト
オリゴ糖を直接の原料として用いることを特徴とする、
修飾α−マルトオリゴシド誘導体の製造方法。