JPH04346994A - 非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な非還元末端カル
バモイルマルトオリゴシド誘導体、該誘導体を有効成分
とするα−アミラーゼ活性測定用試薬、及び該誘導体を
用いてα−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定
する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液
を対象とするα−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上
極めて重要であり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓ガン、
流行性耳下腺炎などの鑑別診断においては必須の測定項
目となっている。

【０００３】このα−アミラーゼ活性の測定方法につい
ては従来より種々の方法が知られているが、近年、各種
置換フェニルマルトオリゴシド類の非還元末端グルコー
スが各種の置換基で修飾された物質［共役酵素系に耐性
（安定性）を有する特徴をもつ］を基質として利用し、
α−アミラーゼにより切断を行い、次いで共役酵素系を
作用させ、生成する置換フェノール類をそのまま、ある
いは必要に応じてｐＨを変化させたのち、あるいは縮合
させたのちに比色定量する方法が、広く用いられるよう
になってきた。

【０００４】ところで、このように利用される基質につ
いては、一般に加水分解部位が１か所であること、アイ
ソザイムにより加水分解部位及び加水分解率が変らない
こと、加水分解生成物がα−アミラーゼの作用を受けな
いものであること、α−アミラーゼに対する親和性が強
くすなわちＫｍ値が小さく、加水分解速度が高いこと、
水溶性がすぐれていることなどの特性が要求されるにも
かかわらず、従来知られている非還元末端を修飾した基
質で、これらの要求特性を完全に満たしたものはない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のα−アミラーゼ活性の測定試薬及びそれを用いる
測定方法が有する欠点を克服し、α−アミラーゼ活性を
効率よく、かつ正確に測定しうる試薬として好適な新規
化合物を提供するとともに、これを試薬とした新規なα
−アミラーゼ活性の測定方法を提供することを目的とし
てなされたものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々研究を重ねた結果、α−アミラーゼ
活性測定用試薬として、特定の新規非還元末端カルバモ
イルマルトオリゴシド誘導体が極めて好適であり、これ
を用いてα−アミラーゼ活性を測定することにより、そ
の目的を達成しうることを見出し、この知見に基づいて
本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、一般式

【化２】 （式中のｎは２〜６の整数、Ｒは芳香族発色性基、Ｘは
水素原子又は置換若しくは非置換の炭化水素基であり、
Ｙは水素原子、置換若しくは非置換の炭化水素基、アル
キル若しくはアリールスルホニル基又はアルキル若しく
はアリールカルバモイル基である）で表わされる非還元
末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体、一般式（Ｉ
）の化合物を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用
試薬、α−アミラーゼ含有試料に、一般式（Ｉ）の化合
物のα−アノマーと、α−グルコシダーゼ及び／又はグ
ルコアミラーゼを添加して酵素反応を行わせ、遊離する
芳香族発色性化合物を定量することを特徴とするα−ア
ミラーゼ活性の測定方法、及びα−アミラーゼ含有試料
に、一般式（Ｉ）の化合物のβ−アノマー又はα−アノ
マーとβ−アノマーとの混合物と、α−グルコシダーゼ
及び／又はグルコアミラーゼ並びにβ−グルコシダーゼ
を添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化
合物を定量することを特徴とするα−アミラーゼ活性の
測定方法を提供するものである。

【０００８】本発明の前記一般式（Ｉ）の非還元末端カ
ルバモイルマルトオリゴシド誘導体におけるマルトオリ
ゴ糖部としては、α−及びβ−Ｄ−マルトテトラオース
からα−及びβ−Ｄ−マルトオクタオースに対応するも
のがすべて使用できる。これらの中でもＤ−マルトペン
タオース、Ｄ−マルトヘキサオース、Ｄ−マルトヘプタ
オースが最終的な基質の性質の点から好適である。

【０００９】また、前記一般式（Ｉ）におけるＸは水素
原子、又は置換若しくは非置換の炭化水素基であって、
例えばメチル、エチル、イソプロビル、ブチル、シクロ
ヘキシルなどの直鎖状、分枝状若しくは環状のアルキル
基、又は例えばベンジル、フェネチルなどのアラルキル
基、又は例えばフェニル、トルイル、ナフチルなどのア
リール基であり、これらのアルキル基、アラルキル基及
びアリール基は例えばアシル、アルキルオキシカルボニ
ル、カルボキシル、ニトロ、ハロゲノ、アルキルシリル
、スルホニルなどの官能基で置換されていてもよく、ア
ルキル基はビニル、アリルのような不飽和のものでもよ
い。

【００１０】一方、Ｙは水素原子、又は置換若しくは非
置換の炭化水素基、例えばメチル、エチル、イソプロピ
ル、ブチル、シクロヘキシルなどの直鎖状、分枝状若し
くは環状のアルキル基、例えばベンジルなどのアラルキ
ル基、例えばフェニル、トルイル、ナフチルなどのアリ
ール基、又は例えばメシル、トシル、キノリンスルホニ
ルなどのアルキル若しくはアリールスルホニル基、又は
例えばカルバモイル、Ｎ−エチルカルバモイル、Ｎ−イ
ソプロピルカルバモイル、Ｎ−フェニルカルバモイルな
どのアルキル若しくはアリールカルバモイル基であり、
前記のアルキル基、アラルキル基及びアリール基は先の
説明において例示した官能基で置換されていてもよい。

【００１１】そして、前記一般式（Ｉ）において、４位
のＹについては、それが水素原子以外の基である場合、
すなわち４，６位のジ置換体である場合が加水分解部位
、親和性、長期間安定性などの基質特性の点で好ましく
、特にＹが−ＣＯＮＨＸの場合すなわち４位と６位の置
換基が同じ場合は、さらに製造しやすいという点で有利
である。

【００１２】さらに、前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体において
、還元末端グルコースの１位の水酸基に置換されるＲの
芳香族発色性基としては、分光学的に検出できればどの
ようなものを用いてもよいが、例えば次のものが挙げら
れる。

【化３】 （式中のＲ１ないしＲ５は水素原子、ハロゲン原子、ニ
トロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アミ
ノ基、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それぞ
れ同一であってもよいし、異なっていてもよく、またＲ
１とＲ２、Ｒ２とＲ３とがそれぞれたがいに結合して、
縮合芳香環を形成してもよい）

【化４】 （式中のＲ６は水素原子又はアルキル基である）

【化５
】 （式中のＲ７は水素原子又はハロゲン原子である）

【化
６】 （式中のＲ８ないしＲ１５は水素原子、ハロゲン原子、
ニトロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、ア
ミノ基、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それ
ぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよく、また
Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１とがそれぞれたがいに結合
して、縮合芳香環を形成してもよく、さらにＲ９とＲ１
０及び／又はＲ１３とＲ１４が共通の酸素原子となって
縮合エーテル環を形成してもよく、Ｚは窒素原子又はＮ
→Ｏである）

【００１３】そして、前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体はα−ア
ノマー（α−配糖体）又はβ−アノマー（β−配糖体）
のいずれであってもよい。

【００１４】このような前記一般式（Ｉ）で表わされる
化合物としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝６５−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β
−Ｄ−マルトペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−フェニル）カルバモイル−β
−Ｄ−マルトペンタオシド、フェノールインド−３′−
クロロフェニル＝６５−Ｏ−カルバモイル−４５−Ｏ−
メシル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、２−クロロ−４
−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−ｔ−ブチル）カル
バモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、２−クロロ−
４−ニトロフェニル＝４５，６５−ジ−Ｏ−（Ｎ−エチ
ル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−
ニトロフェニル＝４７−Ｏ−ベンジル−６７−Ｏ−（Ｎ
−メチル）カルバモイル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド
、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−
エチル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、
２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６７−Ｏ−（Ｎ−イ
ソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトヘプタオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，６５−ジ
−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド、４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（
Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−４５−Ｏ−メチル−
α−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル＝４
７，６７−ジ−Ｏ−（Ｎ−メチル）カルバモイル−β−
Ｄ−マルトヘプタオシド、４−メチルウンベリフェロニ
ル＝６５−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β
−Ｄ−マルトペンタオシド、レザズリニル＝６５−Ｏ−
（Ｎ−ｔ−ブチル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペン
タオシド、ルシフェニル＝６７−Ｏ−（Ｎ−エチル）カ
ルバモイル−α−Ｄ−マルトヘプタオシドなどが挙げら
れる。

【００１５】なお、上記において、記号６５−、６７−
、４５−、４７−などは、マルトオリゴ糖を構成するグ
リコース単位の還元末端側から、５番目、７番目のグル
コースの６位、４位の水酸基が置換されていることを示
す。

【００１６】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる非
還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体は文献未
載の新規な化合物であって、その製造方法については特
に制限はなく、任意の方法を用いることができるが、例
えば次の方法によって製造することができる。

【００１７】すなわち、出発原料として、市販品や公知
の製造方法で得ることのできる、一般式

【化７】 （式中のＲ及びｎは前記と同じ意味をもつ）で表わされ
るＤ−マルトオリゴシド、例えば２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロ
フェニル＝α−Ｄ−マルトヘプタオシド、フェノールイ
ンド−３′−クロロフェニル＝β−Ｄ−マルトペンタオ
シドなどを用い、これに、一般式

【００１８】

【化８】 （式中のＲ１６は水素原子、メトキシ基、エトキシ基、
アルキル基又はアリール基、Ｒ１７はメトキシ基又はエ
トキシ基である）で表わされるカルボニル化合物又はそ
のアセタール若しくはケタールを作用させて、一般式

【
００１９】

【化９】 （式中のＲ１６、Ｒ１７、Ｒ及びｎは前記と同じ意味を
もつ）で表わされる４，６−Ｏ−アルコキシメチリデン
化マルトオリゴシド誘導体、例えば２−クロロ−４−ニ
トロフェニル＝４５，６５−Ｏ−ジメトキシメチリデン
−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル＝
４７，６７−Ｏ−（１−メトキシ）エチリデン−α−Ｄ
−マルトヘプタオシド、フェノールインド−３′−クロ
ロフェニル＝４５，６５−Ｏ−（１−エトキシ）エチリ
デン−β−Ｄ−マルトペンタオシドなどを製造する。

【００２０】前記一般式（ＩＩＩ）で表わされるカルボ
ニル化合物としては、例えばテトラメトキシメタン、オ
ルト酢酸トリエチル、オルト酢酸トリメチルなどが挙げ
られる。

【００２１】前記一般式（ＩＶ）で表わされる４，６−
Ｏ−アルコキシメチリデン化マルトオリゴシド誘導体を
得るこの反応は、通常例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭ
Ａ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメ
チルホスホリックトリアミド（ＨＭＰＡ）などの非プロ
トン性極性溶媒中において、ｐ−トルエンスルホン酸、
塩化水素、硫酸、無水塩化亜鉛、強酸性イオン交換樹脂
などの触媒の存在下で行われる。

【００２２】このようにして得られた前記一般式（ＩＶ
）で表わされる、４，６−Ｏ−アルコキシメチリデン化
マルトオリゴシド誘導体をアシル化して、４，６−Ｏ−
アルコキシメチリデン化アシルマルトオリゴシド誘導体
、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル＝テトラデカ
−Ｏ−アセチル−４５，６５−Ｏ−ジメトキシメチリデ
ン−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル
＝エイコサ−Ｏ−ベンゾイル−４７，６７−Ｏ−（１−
メトキシ）エチリデン−α−Ｄ−マルトヘプタオシド、
フェノールインド−３′−クロロフェニル＝テトラデカ
−Ｏ−ブチリル−４５，６５−Ｏ−（１−エトキシ）エ
チリデン−β−Ｄ−マルトペンタオシドなどとする。こ
の際、アシル化剤としては例えば酢酸、モノクロロ酢酸
、プロピオン酸、ｎ−酪酸、安息香酸などやこれらの酸
無水物、酸クロリド、エステルなどの反応性誘導体が用
いられる。アシル化反応の条件については特に制限はな
く、従来アシル化反応において慣用されている条件を用
いることができる。

【００２３】次いで、このようにして得た４，６−Ｏ−
アルコキシメチリデン化アシルマルトオリゴシド誘導体
に、脱アルコキシメチリデン化反応を行い、一般式

【化
１０】 （式中のＲ１８はアシル基、Ｒ及びｎは前記と同じ意味
をもつ）で表わされる部分アシル化マルトオリゴシド誘
導体、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｏ−（
２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル
）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
ピラノシド、４−ニトロフェニル−Ｏ−（２，３−ジ−
Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→
４）−ペンタキス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ベン
ゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−
２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシドなどを製造する。上記脱アルコキシメチリデン
化反応の条件については特に制限はなく、公知の方法、
例えば酢酸又はギ酸を作用させる方法［例えば「ジャー
ナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、第８４巻、第４３
０ページ（１９６２）参照〕を用いて行うことができる
。

【００２４】次に、このようにして得られた前記一般式
（Ｖ）で表わされる部分アシル化マルトオリゴシド誘導
体に、一般式

【化１１】 （式中のＸは前記と同じ意味をもち、Ｗはハロゲン原子
である）で表わされるイソシアネート、又はカルバモイ
ルハライドを反応させて、前記一般式（Ｖ）における非
還元末端グルコースの６位水酸基をカルバモイル化して
、アシルカルバモイルマルトオリゴシド誘導体、例えば
２−クロロ−４−ニトロフェニル＝テトラデカ−Ｏ−ア
セチル−６５−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル
−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル＝
テトラデカ−Ｏ−ブチリル−６５−Ｏ−（Ｎ−フェニル
）カルバモイル−α−Ｄ−マルトペンタオシド、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル＝テトラデカ−Ｏ−ベンゾイ
ル−６５−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−β−Ｄ−
マルトペンタオシド、フェノールインド−３′−クロロ
フェニル＝テトラデカ−Ｏ−クロロアセチル−６５−Ｏ
−カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシド、２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル＝テトラデカ−Ｏ−アセチル
−６５−Ｏ−（Ｎ−ｔ−ブチル）カルバモイル−β−Ｄ
−マルトペンタオシドなどを製造する。

【００２５】前記一般式（ＶＩ）で表わされるイソシア
ネート、又はカルバモイルハライドとしては、例えばエ
チルイソシアネート、イソプロピルイソシアネート、ｔ
−ブチルイソシアネート、フェニルイソシアネート、（
Ｎ−メチル）カルバモイルクロリドなどが挙げられる。 これらカルバモイル化反応の条件について特に制限はな
いが、通常はピリジンあるいはＤＭＳＯなどの非プロト
ン性極性溶媒中において、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−
ジメチルピリジンなどの塩基存在下で、加温するか又は
加温しないで、イソシアネート、又はカルバモイルハラ
イドを３〜３０倍モル作用させることによって行われる
。

【００２６】さらに４位水酸基に水素原子以外の置換基
Ｙを導入する場合、すなわち前記一般式（Ｉ）で表わさ
れる非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体の
Ｙが水素原子以外の物質を得るには、常法を用いてエー
テル化［「新実験化学講座」第１４巻、有機化合物の合
成と反応［Ｉ］、第５６８〜６１１ページ、１９７７年
、丸善、参照］、カルバモイル化［「新実験化学講座」
第１４巻、有機化合物の合成と反応［ＩＩＩ］、第１６
５２〜１６５９ページ、１９７７年、丸善、参照］、ス
ルホニル化反応［「新実験化学講座」第１４巻、有機化
合物の合成と反応［ＩＩＩ］、第１７９３〜１７９８ペ
ージ、１９７７年、丸善、参照］などを行えばよい。

【００２７】なお、４位と６位の水酸基に同じカルバモ
イル基を導入する場合は、例えば反応時間を長くしたり
、反応温度を高くして、ジ置換を完了させればよい。 最後に、上記アシルカルバモイルマルトオリゴシド誘導
体を脱アシル化して、目的の前記一般式（Ｉ）で表わさ
れる非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体が
得られる。この脱アシル化反応の条件について特に制限
はないが、例えばアシルカルバモイルマルトオリゴシド
誘導体に、メタノールなどのアルコール類中でアンモニ
ア水を１００〜２００倍モル添加し、通常２０〜５０℃
の温度で５〜５０時間程度反応させる方法などが用いら
れる［「カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミストリ
ー（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．）」、第４９巻、第４９３
ページ（１９７１）参照］。

【００２８】また、前記一般式（Ｉ）で表わされる非還
元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体を製造する
別の方法としては、例えば前記一般式（ＩＩ）で表わさ
れるマルトオリゴシド誘導に、前記一般式（ＶＩ）で表
わされるイソシアネート又はカルバモイルハライドを前
記で例示したカルバモイル化反応の条件で直接作用させ
て、一段階で目的の一般式（Ｉ）で表わされる化合物を
得る方法などが挙げられる。

【００２９】以上のようにして得られた一般式（Ｉ）で
表わされる非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘
導体は、α−アミラーゼ活性の測定に極めて有用であり
、この非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体
を用いてα−アミラーゼ活性を測定することができる。

【００３０】前記したように、一般式（Ｉ）で表わされ
る非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体には
α−アノマーとβ−アノマーが存在するが、α−アミラ
ーゼ活性の測定に際して、α−アノマーのみを用いる場
合には共役酵素系として、α−グルコシダーゼ及び／又
はグルコアミラーゼを用いることが必要であり、β−ア
ノマーのみあるいはα−アノマーとβ−アノマーの混合
物を用いる場合にはα−グルコシダーゼ及び／又はグル
コアミラーゼに加えてさらにβ−グルコシダーゼを併用
することが必要である。なお、必要に応じて、β−アミ
ラーゼを用いることもできる。

【００３１】α−アミラーゼ活性の測定するための有利
な系としては、例えば一般式（Ｉ）で表わされる非還元
末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体０．１〜１０
ｍＭ及び緩衝液２〜３００ｍＭを含有し、かつ共役酵素
としてα−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ
をそれぞれ５〜１０００単位／ｍｌ、さらにβ−グルコ
シダーゼを用いるときは０．５〜３０単位／ｍｌを含有
するｐＨ４〜１０の系が挙げられる。この系に用いられ
る緩衝剤としては例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、ｇ
ｏｏｄ’ｓの緩衝剤、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチル
グルタル酸塩などが挙げられる。

【００３２】α−グルコシダーゼは動物、植物、微生物
などいかなる起源のものを用いてもよいが、例えば酵母
由来のものが好ましい。また、グルコアミラーゼもいか
なる起源のものを用いてもよいが、例えばリゾプス属（
Ｒｉｚｏｐｕｓ　　ｓｐ）などに由来するものが好まし
い。さらに、β−グルコシダーゼもいかなる起源のもの
を用いてもよく、例えばアーモンドの種子から得たもの
が用いられる。

【００３３】β−アミラーゼもいかなる起源のものを用
いてもよいが、例えば細菌や植物由来のものを用いるこ
とができる。

【００３４】このような系に、前記成分以外に、本発明
の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用
の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤として
、グリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ−シクロ
デキストリン、トリトンＸ−１００などを加えることが
できるし、α−アミラーゼ活性化剤として、ＮａＣｌ，
ＭｇＣｌ２，ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２，ＣａＣｌ２・Ｈ
２Ｏなどの形で用いられるＣｌ−イオン、Ｃａ２＋イオ
ン、Ｍｇ２＋イオンなどを加えてもよい。これらの添加
成分は１種用いてもよいし、２種以上組合せて用いても
よく、また前記系調製の適当な段階で加えることができ
る。

【００３５】本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した
形で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート、含
浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような本
発明の試薬を用いることにより、各種の試料に含有され
るα−アミラーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感
度で測定することができる。

【００３６】次に、本発明方法の好適な実施態様を説明
する。まず、α−アミラーゼを含む試料に、共役酵素と
してのα−グルコシダーゼ又はグルコアミラーゼあるい
はその両方をそれぞれ５〜１０００単位／ｍｌ，好まし
くは１０〜５００単位／ｍｌ加え、前記一般式（Ｉ）で
表わされる非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘
導体がβ−アノマーを含むときは、さらにβ−グルコシ
ダーゼを０．５〜３０単位／ｍｌ、好ましくは１〜１５
単位／ｍｌ加え、これと同時又はこれらの後に、該非還
元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体０．１〜１
０ｍＭ、好ましくは０．３〜５ｍＭを緩衝剤とともに添
加したのち、温度２５〜４５℃、好ましくは３５〜４０
℃、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜８の条件下で少なく
とも１分間、好ましくは２〜１０分間酵素反応させ、生
成した芳香族発色性化合物を、常法に従いそのままであ
るいは必要に応じｐＨを調整したのち、又は縮合反応を
行ったのちに、適当な吸光波長で連続的に又は断続的に
吸光度変化量を測定し、あらかじめ測定したα−アミラ
ーゼ標品の吸光度変化量と対比させて試料中のα−アミ
ラーゼ活性を算出する。また、芳香族発色性化合物の分
子吸光係数から算出することもできる。

【００３７】本発明に用いられるα−アミラーゼ含有試
料については、α−アミラーゼ活性を含有するものであ
ればよく、特に制限はないが、具体的には微生物の培養
液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれ
らの抽出液などを用いることができる。α−アミラーゼ
含有試料が固体の場合には、いったん精製水又は前記し
たような緩衝液に溶解又は懸濁させるのがよい。また、
必要により、不溶物をろ過などの操作で除去してもよい
。

【００３８】

【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる
非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体は基質
としての要求特性をすべて備えた新規な化合物であって
、α−アミラーゼ活性測定用試薬として極めて有用であ
り、このものを用いることにより、試料中に含まれるグ
ルコース、マルトース、ビリルビン、ヘモグロビンなど
の影響を受けることなく、α−アミラーゼ活性を自動分
析法、用手法などにより、精度よく短時間で容易に測定
することができる。

【００３９】

【実施例】次に実施例により、本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。なお、各例中の吸収極大波長は特に示
されていない限り、メタノール中で測定した値であり、
比旋光度は２５℃においてＤ線で測定した値である。

【００４０】実施例１ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，６
５−Ｏ−ジメトキシメチリデン−β−Ｄ−マルトペンタ
オシドの製造 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝β−Ｄ−マル
トペンタオシド１５．０ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）を無水
ＤＭＦ７５ｍｌに溶解し、テトラメトキシメタン１５．
０ｍｌ（１１３ｍｍｏｌ）及びアンバーリスト（１５Ｅ
）７．５ｇを加え、３５℃で４時間かきまぜながら反応
させた。次いでこの反応液を氷冷下１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０）２．０ｌ中へ、かきまぜながらゆ
っくりと滴下した。この混合液をＯＤＳ（オクタデシル
シリカゲル）カラムクロマトグラフィーにより精製し、
アセトニトリル−水混液（容量比３：７）で溶出した目
的区分を濃縮し、イソプロパノール−メタノールから再
結晶すると、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，
６５−Ｏ−ジメトキシメチリデン−β−Ｄ−マルトペン
タオシドが１０．７ｇ（１０．１ｍｍｏｌ、収率６６．
５％）得られた。 融点（℃）：９３．０〜９５．０（ｄｅｃ．）紫外部・
可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］（ｎ
ｍ）＝２９５（ｌｏｇε＝３．９５）、２９５（ｓｈ）
，２０９（ｌｏｇε＝４．１７）赤外吸収スペクトル（
ｃｍ−１）：３４２０，２９４０，１６４８，１５８８
，１５２４，１４９０，１３５２，１２７６，１２４６
，１１５４，１０８２，１０５０，１０２６，９３０，
８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：３．２５〜３．８５（ｍ），３．２３（３
Ｈ，ｓ），３．３０（３Ｈ，ｓ），３．８９（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝３．９Ｈｚ），４．３０〜４．７０（ｍ），５．
０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．
４Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５
．２５〜５．７０（ｍ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９
．３Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，
２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５
０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリ
ル／水＝１：４ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：
Ｒｔ＝１０．２ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５０，５０ｍＭリン酸ｂ
ｕｆｆｅｒ）；＋８６．７°　　元素分析：Ｃ３９Ｈ５
８ＣｌＮＯ３０として 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃ　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４４．３５　
　　　５．５３　　　　１．３３　　　　　　実測値（
％）　　　　　　４４．５５　　　　５．４３　　　　
１．３４

【００４１】（２）　　２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２
，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノ
シル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造 実施例１の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝４５，６５−Ｏ−ジメトキシメチリデン−β−Ｄ−
マルトペンタオシド１．５０ｇ（１．４２ｍｍｏｌ）を
ピリジン３０ｍｌに溶解し、無水酢酸１５ｍｌ（１９２
ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間かきまぜながら反応さ
せた。次いで反応液を減圧下濃縮し、ここに含まれるピ
リジン、無水酢酸、酢酸を留去した。得られたオイル状
のアセチル体を精製しないで酢酸５０ｍｌに溶解し、水
１２．５ｍｌを加え、３０℃で３日間かきまぜながら反
応させた。次いでこの反応液を氷水３００ｍｌ中へ、か
きまぜながらゆっくりと滴下したのち、この混合液をジ
クロロメタン３００ｍｌで３回抽出した。次いでジクロ
ロメタン層を水３００ｍｌで３回洗浄し、ジクロロメタ
ン層部を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別したのち、ろ
液を減圧下濃縮し、ジクロロメタンを留去した。この残
渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し
、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液（容量
比６６：２．５：３３）で溶出した目的区分を濃縮して
、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→
４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３
，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
１．０４ｇ（０．６６１ｍｍｏｌ，２工程通算収率４６
．５％）を得た。 融点（℃）：１２６．０〜１３０．０ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（アセトニトリル中）（ｎｍ）＝２８２（ｌｏｇε
＝３．９４） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４８０，２９７０
，１７５２，１５８８，１５３０，１４８６，１４３２
，１３７２，１３５０，１２３６，１０３０，９４４，
８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．８１〜２．１２（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ
　　ｓ），３．５０〜４．７４（ｍ），５．０５（ｍ）
，７．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．０９（
１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２２
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
１５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝７：３ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝４．２ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．２５，１，４−ジオキサ
ン）；＋８８．０°

【００４２】（３）　　２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−
フェニル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシドの製造 実施例１の（２）と同様の操作で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシド２．９０ｇ（１．８
４ｍｍｏｌ）をピリジン３００ｍｌに溶解し、フェニル
イソシアネート３．３ｍｌ（３０．５ｍｍｏｌ、及びモ
レキュラーシーブス６．０ｇを加え、室温下で５時間か
きまぜながら反応させた。次いでこの反応液をセライト
ベットでろ過し、ろ液中のピリジンを減圧下留去し、こ
の残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精
製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液（
容量比１００：１：２００）で溶出した目的区分を濃縮
すると、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−フェニル）カル
バモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−
トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが２．
６１ｇ（１．５４ｍｍｏｌ，収率８３．７％）得られた
。 融点（℃）：１２３．０〜１２５．０ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８１（ｌｏｇε＝４．０１），２３１
（ｌｏｇε＝４．４２），２０３（ｌｏｇε＝４．５５
） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４５０，２９６０
，１７４８，１５９８，１５３２，１４４２，１３７０
，１３５０，１２３６，１０４０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．８２〜２．１８（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ
　　ｓ），３．３０〜３．５５（１Ｈ，ｍ），３．８２
〜４．１５（ｃａ．９Ｈ，ｍ），４．２４〜４．５５（
ｃａ．１０Ｈ．ｍ），４．６１（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ），
４．６８〜４．８５（ｃａ．４Ｈ，ｍ），５．１５〜５
．４５（ｃａ．１２Ｈ，ｍ），７．０６（１Ｈ，ｔ，Ｊ
＝７．３Ｈｚ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ
），７．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４６
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６３（１Ｈ，ｂｒ
　　ｓ），８．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２
．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高
速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製　
　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×２
５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニト
リル／水＝３：１ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］
：Ｒｔ＝７．４ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．４２４，１，４−ジオキ
サン）；＋８１．５° 元素分析：Ｃ７１Ｈ８７ＣｌＮ２Ｏ４３として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　５０．４０　
　　　　　５．１８　　　　　　１．６６　　　　　　
実測値（％）　　　　　　５０．４０　　　　　　５．
２３　　　　　　１．６５

【００４３】（４）　　２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−フェニ
ル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製造 実施例１の（３）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−
フェニル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド２．６１ｇ（１．５４ｍｍｏｌ）にメタノール
２５０ｍｌ及び無水炭酸カリウム２５１ｍｇ（１．８２
ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間かきまぜながら反
応させた。次いで反応液を減圧濃縮し、ここに含まれる
メタノールを留去した。次いでその残渣をＯＤＳカラム
クロマトグラフィーにより精製し、アセトニトリル−水
混液（容量比３：７）で溶出した目的区分を濃縮し、凍
結乾燥して、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−
Ｏ−（Ｎ−フェニル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペ
ンタオシド９９６ｍｇ（０．９０２ｍｍｏｌ、収率５８
．６％）が得られた。 融点（℃）：１８６．０〜１８８．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８９（ｓｈ），２８３（ｌｏｇε＝３．９
８），２３３（ｌｏｇε＝４．３４），２８３（ｌｏｇ
ε＝４．４７） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４１０，２９３０
，１７１６，１６００，１５２２，１４８６，１４４４
，１３５０，１２７４，１２３８，１１５２，１０８０
，１０４２，１０２４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：３．１５〜５．９０（ｍ），４．１５〜４
．６０（ｍ），４．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ）
，４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．０６（
３Ｈ，ｂｒ　　ｓ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９
Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．
５０〜５．５５（ｍ），６．９８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．
３Ｈｚ），７．２６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７
．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４７（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ），９．３１（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ）高速液体
クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ　　
Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ
），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル／水
＝３：１ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒｔ＝
４．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，メタノール）；
＋６８．２° 元素分析：Ｃ４３Ｈ６２ＣｌＮ２Ｏ２９として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４６．６８　
　　　　　５．６５　　　　　　２．５３　　　　　　
実測値（％）　　　　　　４６．７０　　　　　　５．
６６　　　　　　２．５３

【００４４】実施例２ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２
，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル
）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→
４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３
，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
の製造 実施例１の（２）と同様の操作で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシド２．５０ｇ（１．５
９ｍｍｏｌ）をピリジン２００ｍｌに溶解し、イソプロ
ピルイソシアネート４．７ｍｌ（４７．８ｍｍｏｌ）、
モレキュラーシーブス５．０ｇ及びジメチルアミノピリ
ジン５００ｍｇ（４．１０ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で
６時間かきまぜながら反応させた。次いでこの反応液を
セライトベットでろ過し、ろ液中のピリジンを減圧下留
去し、この残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
により精製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタ
ン混液（容量比５０：１：５０）で溶出した目的区分を
濃縮すると、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（
２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピ
ル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドが２．６２ｇ（１．５８ｍｍｏｌ，収率９９．４％）
得られた。 融点（℃）：１１４．０〜１１６．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８３（ｌｏｇε＝３．９３），２２７（ｓ
ｈ），２０５（ｌｏｇε＝４．２８）赤外吸収スペクト
ル（ｃｍ−１）：３３６０，２９７０，１７５４，１６
２０，１５８６，１５３０，１４８６，１４６２，１４
４０，１３７０，１３５０，１２３８，１１６４，１１
２８，９４４，８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．
１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．００〜２．１
９（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），３．４５（１Ｈ
，ｂｒ　　ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ），３．７５〜４．８５
（ｍ），５．０５〜５．５０（ｍ），７．２９（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９
．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２
．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝３：１ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝６．５ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，１，４−ジオキ
サン）；＋７３．９° 元素分析：Ｃ６８Ｈ８９ＣｌＮ２Ｏ４３として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４９．２６　
　　　　　５．４１　　　　　　２．１４　　　　　　
実測値（％）　　　　　　４９．６８　　　　　　５．
５５　　　　　　２．１１

【００４５】（２）　　２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−イソプ
ロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの
製造 実施例２の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−
イソプロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−
Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４
）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グル
コピラノシド２．６２ｇ（１．５８ｍｍｏｌ）にメタノ
ール２５０ｍｌ及び無水炭酸カリウム２６８ｍｇ（１．
９４ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間かきまぜなが
ら反応させた。次いで反応液を減圧濃縮し、ここに含ま
れるメタノールを留去した。次いでその残渣をＯＤＳカ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、アセトニトリル
−水混液（容量比３：７）で溶出した目的区分を濃縮し
、凍結乾燥して、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６
５−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−
マルトペンタオシド１．０８ｇ（１．０４ｍｍｏｌ、収
率６５．７％）が得られた。 融点（℃）：１７７．０〜１７９．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝３．９９），２２７（ｓ
ｈ），２０９（４．１９） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４００，２９３０
，１６９６，１５８４，１５２２，１４８６，１３５０
，１２７４，１１５０，１０７８，１０３６，９３６，
８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），
３．０５〜３．８５（ｍ），４．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝１１．５Ｈｚ，５．９Ｈｚ），４．１９（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝１１．５Ｈｚ），４．２０〜４．５５（ｍ），４．
２２（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ），４．８７（１Ｈ，ｂｒ　　
ｓ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．０
４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６
Ｈｚ），５．３０〜５．６０（ｍ），６．６１（１Ｈ，
ｂｒｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
９．２Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ
，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ
）　　高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製Ｔ
ＳＫｇｅｌ　　Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩ
Ｄ×２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセ
トニトリル／水＝３：１ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍ
ｉｎ］：Ｒｔ＝７．３ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５０２，メタノール）；
＋８１．２° 元素分析：Ｃ４０Ｈ６１ＣｌＮ２Ｏ２９として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４４．９３　
　　　　　５．７５　　　　　　３．３２　　　　　　
実測値（％）　　　　　　４５．０１　　　　　　５．
７８　　　　　　３．２９

【００４６】実施例３ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２
，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−ｔ−ブチル）
カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４
）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの
製造 イソプロピルイソシアネートの代わりにｔ−ブチルイソ
シアネートを用いること以外実施例２の（１）と同一の
操作を行い、目的の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−ｔ−
ブチル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−
（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシドを２．２８ｇ（１．３６ｍｍｏｌ，収率８５．５
％）を得た。 融点（℃）：１２４．０〜１２６．０ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８４（ｌｏｇε＝３．９７）、２２８
（ｓｈ），２０７（ｌｏｇε＝４．２５）赤外吸収スペ
クトル（ｃｍ−１）：３３７０，２９７０，１７５４，
１６４０，１５８６，１５３０，１４８６，１３７０，
１３５２，１２３８，１０４０，９４６，８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．３２（９Ｈ，ｓ），２．００〜２．１９（
ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），３．４３（１Ｈ，ｂ
ｒ　　ｔ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），３．６０〜４．８２（ｍ
），５．１０〜５．５０（ｍ），７．２９（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０
Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７
Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝３：１ｖ／ｖ、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝８．３ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，１，４−ジオキ
サン）；＋７７．４° 元素分析：Ｃ６９Ｈ９１ＣｌＮ２Ｏ４３として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４９．５７　
　　　　　５．４９　　　　　　１．６８　　　　　　
実測値（％）　　　　　　４９．５０　　　　　　５．
６４　　　　　　１．７８

【００４７】（２）　　２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−ｔ−ブ
チル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製
造 実施例２の（２）と同様の操作を行い、実施例３の（１
）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−ｔ−ブチル）カ
ルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６
−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド２．
２２ｇ（１．３２ｍｍｏｌ）から、目的の２−クロロ−
４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−ｔ−ブチル）カ
ルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシド８８９ｍｇ（
０．８２１ｍｍｏｌ，収率６２．２％）を得た。 融点（℃）：１８１．０〜１８３．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝３．９９）、２２８（ｌ
ｏｇε＝３．９９），２０９（ｌｏｇε＝４．２０） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４３０，２９４０
，１７０４，１５８６，１５２２，１４８６，１４３８
，１２７６，１１５０，１０８０，１０２６，９３６，
８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．２３（９Ｈ，ｓ），３．０５〜３．８
５（ｍ），３．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，
６．１Ｈｚ），４．１８（１Ｈ，ｂｒ　　ｄ，Ｊ＝１０
．５Ｈｚ），４．２５〜４．６０（ｍ），４．９９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）
，５．２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．３０〜
５．６０（ｍ），６．４２（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ），７．
４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．１７（１Ｈ，
ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　　Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２
５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニト
リル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］
：Ｒｔ＝６．１ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，メタノール）；
＋７９．３° 元素分析：Ｃ４１Ｈ６３ＣｌＮ２Ｏ２９として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　
　　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　　　
　　４５．４５　　　　　　５．８６　　　　　　２．
５９　　　　　　実測値（％）　　　　　　　　　　４
５．６９　　　　　　５．７７　　　　　　２．５６

【
００４８】実施例４ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２
，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−エチル）カル
バモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−
トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造
イソプロピルイソシアネートの代わりにエチルイソシア
ネートを用いること以外実施例２の（１）と同一の操作
を行い、目的の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−
（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−ｔ−エチ
ル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドを２．２６ｇ（１．３８ｍｍｏｌ，収率８６．８％）
を得た。 融点（℃）：１１５．０〜１１７．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８３（ｌｏｇε＝３．９８），２２７（ｓ
ｈ），２０９（４．２４） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４５０，２９７０
，１７５２，１５８８，１５３２，１４８６，１４３４
，１３７２，１３５２，１２４０，１０３８，９４４，
９００ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．
８８〜２．１９（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），３
．２３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．４５（１Ｈ
，ｂｒ　　ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），３．７５〜４．８５
（ｍ），５．２０〜５．５０（ｍ），７．２９（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９
．１Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２
．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝５．７ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．６９０，１，４−ジオキ
サン）；＋８２．５° 元素分析：Ｃ６７Ｈ８７ＣｌＮ２Ｏ４３として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ　　
　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　Ｎ　
　　　　　理論値（％）　　　　４８．９５　　　　　
　５．３３　　　　　　２．１６　　　　　　実測値（
％）　　　　４９．０３　　　　　　５．３４　　　　
　　２．１６

【００４９】（２）　　２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイ
ル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製造 実施例２の（２）と同様の操作を行い、実施例４の（１
）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバ
モイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−ト
リス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−ト
リ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド１．５８
ｇ（０．９６２ｍｍｏｌ）から、目的の２−クロロ−４
−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモ
イル−β−Ｄ−マルトペンタオシド７２７ｍｇ（０．６
８９ｍｍｏｌ，収率７１．６％）を得た。 融点（℃）：１８０．０〜１８２．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝３．９９），２２７（ｌ
ｏｇε＝４．００），２０９（ｌｏｇε＝４．２０） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４１０，２９３０
，１６９６，１５８４，１５２４，１４８６，１３５０
，１２７４，１１５０，１０７８，１０２４，９３６，
８９４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
３．０２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．０５〜３
．９０（ｍ），４．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．７Ｈ
ｚ，６．１Ｈｚ），４．２１（１Ｈ，ｂｒ　　ｄ，Ｊ＝
１０．０Ｈｚ），４．３０〜４．５５（ｍ），４．７３
（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ），４．８７（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ）
，５．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），５．０４（
２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝３．９Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ
），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１８
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２
９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　　Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２
５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニト
リル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］
：Ｒｔ＝８．６ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，メタノール）；
＋８３．７° 元素分析：Ｃ３９Ｈ５９ＣｌＮ２Ｏ２９として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　
　　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　　　
　　４４．３９　　　　　　５．６３　　　　　　３．
３６　　　　　　実測値（％）　　　　　　　　　　４
４．４４　　　　　　５．６３　　　　　　３．３８

【
００５０】実施例５ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４７，６
７−Ｏ−ジメトキシメチリデン−β−Ｄ−マルトヘプタ
オシドの製造 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝β−Ｄ−マル
トヘプタオシド１５．０ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）を無水
ＤＭＦ７５ｍｌに溶解し、テトラメトキシメタン１５．
０ｍｌ（１１３ｍｍｏｌ），アンバーリスト（１５Ｅ）
７．５ｇを加え、３５℃で４時間かきまぜながら反応さ
せた。次いでこの反応液を氷冷下１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ＝７．０）２．０ｌ中へ、かきまぜながらゆっ
くりと滴下した。この混合液をＯＤＳ（オクタデシルシ
リカゲル）カラムクロマトグラフィーにより精製し、ア
セトニトリル−水混液（容量比３５：６５）で溶出した
目的区分を濃縮すると、オイル状の２−クロロ−４−ニ
トロフェニル＝４７，６７−Ｏ−ジメトキシメチリデン
−β−Ｄ−マルトヘプタオシドが１０．０ｇ（７．２５
ｍｍｏｌ，収率６３．０％）が得られた。 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２９５（ｌｏｇε＝３．９６）、２９５
（ｓｈ），２０９（ｌｏｇε＝４．２０），赤外吸収ス
ペクトル（ｃｍ−１）：３４２０，２９４０，１６４６
，１５８６，１５２６，１４８８，１３５２，１２７４
，１２４８，１１５４，１０８０，１０４８，１０２４
，９３０，８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：３．３０〜３．８５（ｍ），３．２４（３
Ｈ，ｓ），３．３０（３Ｈ，ｓ），３．９０（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝３．９Ｈｚ），４．３５〜４．７０（ｍ），５．
０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．１１（４Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．
６Ｈｚ），５．２５〜５．７０（ｍ），７．４７（１Ｈ
，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．２Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝１：４ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝１１．９ｍｉｎ 元素分析：Ｃ５１Ｈ７８ＣｌＮＯ４０として　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　
　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　　　　
　４４．３７　　　　　　５．６９　　　　　　１．０
１　　　　　　実測値（％）　　　　　　　　　　４４
．５５　　　　　　５．５３　　　　　　１．００

【０
０５１】（２）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
−ペンタキス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３
，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
の製造 実施例５の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝４７，６７−Ｏ−ジメトキシメチリデン−β−Ｄ−
マルトヘプタオシド３．００ｇ（２．１７ｍｍｏｌ）を
原料に使用すること以外実施例１の（２）と同様の操作
を行い、続いて実施例２の（１）と同様の操作を行い、
目的の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３
−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−ペンタキス
［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−
Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが２．３２ｇ
（１．０４ｍｍｏｌ，３工程通算収率４７．９％）得ら
れた。 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８３（ｌｏｇε＝３．９８），２２７
（ｓｈ），２０５（ｌｏｇε＝４．３３）赤外吸収スペ
クトル（ｃｍ−１）：３３６０，２９７０，１７５６，
１６２０，１５８８，１５２８，１４８６，１４６０，
１４４０，１３６８，１３５０，１２４０，１１６４，
１１２８，９４８，８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．
１７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．００〜２．１
９（ｃａ．６０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），３．５５〜４．
８５（ｍ），５．０５〜５．５０（ｍ），７．２９（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝９．１Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝９．０ｍｉｎ 元素分析：Ｃ９２Ｈ１２１ＣｌＮ２Ｏ５９として　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　
　　　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　　
　　　４９．４５　　　　　　５．４６　　　　　　１
．２５　　　　　　実測値（％）　　　　　　　　　　
４９．５８　　　　　　５．３５　　　　　　１．２２

【００５２】（３）　　２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝６７−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β
−Ｄ−マルトヘプタオシドの製造 実施例５の（２）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−
フェニル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−ペンタキス［Ｏ−（２，３，６−トリ−
Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４
）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グル
コピラノシド２．３２ｇ（１．０４ｍｍｏｌ）を原料に
用いること以外実施例１の（５）と同様の操作を行い、
目的の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６７−Ｏ−（
Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトヘプ
タオシド９９７ｍｇ（０．７１６ｍｍｏｌ，収率６８．
８％）が得られた。 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８８（ｌｏｇε＝３．９８），２２７
（ｓｈ），２０９（４．１８） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４００，２９３０
，１６９４，１５８２，１５２０，１４８６，１３５０
，１２７４，１１４８，１０８０，１０４０，９３６，
８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），
３．１０〜３．８５（ｍ），４．００〜４．６５（ｍ）
，４．８５（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ），５．００（１Ｈ，ｄ
，Ｊ＝５．０Ｈｚ），５．０４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０
Ｈｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），５．
２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），５．３０〜５．６
０（ｍ），６．６０（１Ｈ，ｂｒ　　ｄ，Ｊ＝７．６Ｈ
ｚ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．１
８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．
３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグ
ラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ　　Ａｍｉｄｅ
−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ），ＵＶ２
８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル／水＝３：１ｖ
／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒｔ＝８．６ｍｉ
ｎ 元素分析：Ｃ５２Ｈ８１ＣｌＮ２Ｏ３９として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　
　　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　　　
　　４４．８１　　　　　　５．８６　　　　　　２．
０１　　　　　　実測値（％）　　　　　　　　　　４
４．９９　　　　　　５．７９　　　　　　２．１５

【
００５３】実施例６ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２
，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジ−Ｏ−（Ｎ−イソ
プロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシドの製造 実施例２の（１）と同様の操作で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６
−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グ
ルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３
，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル
）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−
β−Ｄ−グルコピラノシド６．３３ｇ（３．８２ｍｍｏ
ｌ）をピリジン５００ｍｌに溶解し、イソプロピルイソ
シアネート１１．３ｍｌ（１１５ｍｍｏｌ）、モレキュ
ラーシーブス１２．０ｇ及びジメチルアミノピリジン１
．２０ｇ（９．８４ｍｍｏｌ）を加え、９０℃で１６時
間かきまぜながら反応させた。次いでこの反応液をセラ
イトベットでろ過し、ろ液中のピリジンを減圧下留去し
、この残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによ
り精製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混
液（容量比５０：１：５０）で溶出した目的区分を濃縮
すると、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，
３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジ−Ｏ−（Ｎ−イソプ
ロピル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−
（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−
２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラ
ノシドが５．１６ｇ（２．９６ｍｍｏｌ，収率７７．５
％）得られた。 融点（℃）：１３０．０〜１３１．０ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８２（ｌｏｇε＝４．０１）、２０８
（ｌｏｇε＝４．３２） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３９０，２９７０
，１７４２，１５８６，１５２８，１４３２，１３７２
，１３５０，１２３４，１０３２，９４４，８９８　　
核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．
１３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），１．１５（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．１６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．
４Ｈｚ），２．００〜２．１９（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃ
ｈ　　ｓ），３．６５〜４．８５（ｍ），５．１０〜５
．５０（ｍ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ）
，８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２．７Ｈｚ
），８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体ク
ロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製　　ＣＯＳ
ＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ
），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル／水
＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒｔ＝
９．０ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，メタノール）；
＋８１．６° 元素分析：Ｃ７２Ｈ９７ＣｌＮ３Ｏ４４として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　
　　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　　　
　　４９．５９　　　　　　５．６１　　　　　　２．
４１　　　　　　実測値（％）　　　　　　　　　　４
９．７８　　　　　　５．５５　　　　　　２．３１

【
００５４】（２）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４５，６５−ジ−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモ
イル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製造前記（１）で
得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−
ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジ−Ｏ−（Ｎ−イソプロピ
ル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド１．６３ｇ（０．９３７ｍｍｏｌ）にメタノール１６
０ｍｌ及び無水炭酸カリウム１４２ｍｇ（１．０３ｍｍ
ｏｌ）を加え、２５℃で６時間かきまぜながら反応させ
た。次いで反応液を減圧濃縮し、ここに含まれるメタノ
ールを留去した。次いでその残渣をＯＤＳカラムクロマ
トグラフィーにより精製し、アセトニトリル−水混液（
容量比４：６）で溶出した目的区分を濃縮し、凍結乾燥
して、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，６５−
ジ−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−
マルトペンタオシド８９７ｍｇ（０．７７６ｍｍｏｌ，
収率８２．８％）が得られた。 融点（℃）：１７７．０〜１７８．０ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝４．００），２２７
（ｓｈ），２０９（ｌｏｇε＝４．２６）赤外吸収スペ
クトル（ｃｍ−１）：３４００，２９４０，１７０２，
１５８４，１５２２，１４８６，１４５６，１３４８，
１２７２，１２５２，１１５２，１０７８，１０３６，
９３４，８９４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０５（１２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）
，３．１５〜４．０５（ｍ），４．２０〜４．６０（ｍ
），５．０２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．１０
（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝７．３Ｈｚ），５．３０〜５．６５（ｍ），７．４
６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．１８（１Ｈ，ｄ
ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．６Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　　Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２
５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニト
リル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］
：Ｒｔ＝４．２ｍｉｎ 　　比旋光度［α］：（ｃ　　０．５００，水）：＋８
７．４°元素分析：Ｃ４４Ｈ６８ＣｌＮ３Ｏ３０として
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　
　　　　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４５
．７７　　　　　　５．９４　　　　　　３．６４　　
　　　　実測値（％）　　　　　　４５．８１　　　　
　　５．９８　　　　　　３．４９

【００５５】実施例
７ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２
，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジ−Ｏ−（Ｎ−エチ
ル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１
→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，
３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドの製造 実施例１の（２）と同様の操作で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−α
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−
（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコピラノシド２．５０ｇ（１．５
９ｍｍｏｌ）をピリジン１５０ｍｌに溶解し、エチルイ
ソシアネート６．３ｍｌ（７９．６ｍｍｏｌ）、ジメチ
ルアミノピリジン２９１ｍｇ（２．３８ｍｍｏｌ）及び
モレキュラーシーブス４Ａ５．０ｇを加え、９０℃で８
時間、かきまぜながら反応させた。次いでこの反応液に
トルエン１．５ｌ加え、３％食塩水５００ｍｌで３回洗
浄した。トルエン層を無水硫酸ナトリウムで乾燥したの
ち、綿栓ろ過で硫酸ナトリウムを除き、ろ液中のトルエ
ンを減圧下留去した。この残渣をシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、酢酸エチル−メタノール
−ジクロロメタン混液（容量比１００：１：１００）で
溶出した目的区分を濃縮すると、２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６
−ジ−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−α−Ｄ−グル
コピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，
６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）
−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β
−Ｄ−グルコピラノシド２．２８ｇ（１．３３ｍｍｏｌ
，収率８３．６％）が得られた。 融点（℃）：８３．５〜８５．５ 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８３（ｌｏｇε＝３．９３），２２７
（ｓｈ），２０９（ｌｏｇε＝４．４６）赤外吸収スペ
クトル（ｃｍ−１）：３４８０，２９７０，１７５２，
１６９０，１６４０，１５２６，１４８０，１４５０，
１３７２，１３５０，１２３８，１０３４，８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．
１８（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．００〜２．１
９（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），３．１０〜３．
３０（ｍ），３．２９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
３．３２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．７５〜４
．９０（ｍ），５．１５〜５．５０（ｍ），７．０５（
２Ｈ，ｂｒｓ），７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ
），８．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７Ｈ
ｚ），８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体
クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製　　ＣＯ
ＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍ
ｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル／
水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒｔ
＝６．５ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５８４，１，４−ジオキ
サン）；＋７９．８° 元素分析：Ｃ７０Ｈ９３ＣｌＮ３Ｏ４４として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４９．００　
　　　　　５．４６　　　　　　２．４５　　　　　　
実測値（％）　　　　　　４８．７７　　　　　　５．
５０　　　　　　２．６９なお、６位を置換後、４位を
置換する方法の場合、すなわち実施例４の（１）で得た
化合物を出発原料とし、次いで実施例６の（１）に準じ
た操作を行って、上記と同一の化合物を製造した場合の
通算収率は６５．９％であった。

【００５６】（２）　　２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル＝４５，６５−ジ−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル
−β−Ｄ−マルトペンタオシドの製造 前記の（１）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−４，６−ジ−Ｏ−（
Ｎ−エチル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピラノシル
）−（１→４）−トリス［Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド２．２８ｇ（１．３３ｍｍｏｌ）を原料に用い
ること以外実施例１の（２）と同様の操作を行い、目的
の２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，６５−ジ−
Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペン
タオシド８０３ｍｇ（０．７１３ｍｍｏｌ，収率５３．
６％）が得られた。 融点（℃）：１７６．０〜１７８．０（ｄｅｃ．）紫外
部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａｘ］
（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε＝３．９７），２２７（ｌ
ｏｇε＝３．９７）、２０９（ｌｏｇε＝４．１７） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３３９０，２９５０
，１７１０，１５８６，１５１４，１４８６，１３５０
，１２７４，１２５２，１１５２，１０８２，１０２８
，９３４，８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＭＤＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０１（６Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），
３．０２（４Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）３．１５〜４．
１０（ｍ），４．３０〜４．６０（ｍ），５．０６（２
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．４Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）
，５．３０〜５．７０（ｍ），６．７８（１Ｈ，ｂｒ　
　ｓ），６．９８（１Ｈ，ｂｒ　　ｓ），７．４６（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ
＝９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝２．７Ｈｚ）　　高速液体クロマトグラフィー［東ソ
ー（株）製ＴＳＫｇｅｌ　　Ａｍｉｄｅ−８０カラム（
４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、
溶離液：アセトニトリル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１
．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒｔ＝６．１ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５４２，メタノール）：
＋８０．０° 元素分析：Ｃ４２Ｈ５５ＣｌＮ３Ｏ３０として　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　
Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４４．７４　
　　　　　５．８１　　　　　　３．７３　　　　　　
実測値（％）　　　　　　４４．６６　　　　　　５．
９８　　　　　　３．８９

【００５７】実施例８ （１）　　２−クロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２
，３−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−エチル）カル
バモイル−４−Ｏ−トシル−α−Ｄ−グルコピラノシル
）−（１→４）−トリス［Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］
−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシドの製造 実施例４の（１）と同様の操作で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６
−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−
トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（
１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ
−グルコピラノシド１．５８ｇ（０．９６２ｍｍｏｌ）
をピリジン５０ｍｌに溶解し、トシルクロライド２．１
１ｇ（１１．０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で８時間かき
まぜながら反応させた。次いで反応液中のピリジンを減
圧下留去し、得られたオイル状の残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル−メタ
ノール−ジクロロメタン混液（容量比５０：１：１００
）で溶出した目的区分を濃縮すると、オイル状の２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−ア
セチル−６−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−４−Ｏ
−トシル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−
トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−
トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド１．４
３ｇ（０．７９６ｍｍｏｌ，収率８２．７％）が得られ
た。 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２８３（ｌｏｇε＝４．００）、２２７
（ｓｈ），２０７（ｌｏｇε＝４．２８）赤外吸収スペ
クトル（ｃｍ−１）：３４８０，２９７０，１７５０，
１５８６，１５２８，１４８８，１４３２，１３７２，
１３５０，１２４０，１１７８，１０３４，９４４，８
９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．
９９〜２．１９（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），２
．４５（３Ｈ，ｓ），３．２０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．０
Ｈｚ），３．４５〜４．８５（ｍ），５．２０〜５．５
０（ｍ），７．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７
．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．７９（２Ｈ
，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝７：３ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝８．９ｍｉｎ 元素分析：Ｃ７４Ｈ９３ＣｌＮ２Ｏ４５Ｓとして　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｃ　　　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　
　Ｎ　　　　　　理論値（％）　　　　　　４９．４３
　　　　　　５．２１　　　　　　１．５６　　　　　
　実測値（％）　　　　　　４９．２８　　　　　　５
．１７　　　　　　１．５０

【００５８】（２）　　２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−エチ
ル）カルバモイル−４５−Ｏ−トシル−β−Ｄ−マルト
ペンタオシドの製造前記（１）で得た２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−６
−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−４−Ｏ−トシル−
α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリス［Ｏ
−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ−Ｏ−
アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド１．４３ｇ（０．
７９６ｍｍｏｌ）を原料に用いること以外実施例２の（
２）と同様の操作を行い、目的の２−クロロ−４−ニト
ロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−
４５−Ｏ−トシル−β−Ｄ−マルトペンタオシド７０５
ｍｇ（０．５８３ｍｍｏｌ，収率７３．２％）が得られ
た。 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２９１（ｌｏｇε＝３．９５），２２５
（ｌｏｇε＝４．３１），２１５（ｌｏｇε＝４．２９
） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４１０，２９２０
，１６９６，１５８４，１５２０，１４８４，１３５０
，１２７４，１２４８，１１７６，１１５２，１０７８
，１０２４，９３０，８９２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），
２．４２（３Ｈ，ｓ），３．００〜４．２５（ｍ），４
．４０〜４．６５（ｍ），５．０３（３Ｈ，ｂｒｓ），
５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．２７（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．２５〜５．７０（ｍ）
，７．４６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．７７（
２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，
Ｊ＝９．０Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，
Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　　Ａｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２
５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニト
リル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］
：Ｒｔ＝４．６ｍｉｎ 比旋光度［α］：［ｃ　　０．５０２，Ｈ２Ｏ−１，４
−ジオキサン（１：１ｖ／ｖ）］；＋８７．１°元素分
析：Ｃ４５Ｈ６５ＣｌＮ２Ｏ３１Ｓとして　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ　　
　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　Ｎ　
　　　　　理論値（％）　　　　　　４５．６８　　　
　　　５．４２　　　　　　２．３２　　　　　　実測
値（％）　　　　　　４５．６６　　　　　　５．４８
　　　　　　２．２９

【００５９】実施例９ （１）　　４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−Ｏ
−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイ
ル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（
１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）］−２
，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノ
シドの製造 市販の４−ニトロフェニル＝α−Ｄ−マルトペンタオシ
ド５．０ｇ（５．２７ｍｍｏｌ）を原料とする以外実施
例１の（１）、（２）、実施例２の（１）と同様の操作
を行って得た４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−ジ−
Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモ
イル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−トリ
ス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−
グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３，６−トリ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド２．５０ｇ
（１．５４ｍｍｏｌ，４工程通算収率２９．２％）をＤ
ＭＳＯ５０ｍｌに溶解し、ヨードメタン１．９ｍｌ（３
０．５ｍｍｏｌ）及び水酸化カリウム１．７３ｇ（３０
．８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で７時間かきまぜながら
反応させた。次いでこの反応液にトルエン１．０ｌ加え
、３％食塩水５００ｍｌで３回洗浄した。トルエン層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥したのち、綿栓ろ過で硫酸ナ
トリウムを除き、ろ液中のトルエンを減圧下留去した。 この残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製し、酢酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液
（容量比５０：１：１００）で溶出した目的区分を濃縮
すると、オイル状の４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３
−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カ
ルバモイル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−
Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４
）］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グル
コピラノシド１．１７ｇ（０．７１５ｍｍｏｌ，収率４
６．４％）が得られた。　　紫外部・可視部吸収スペク
トル：吸収極大波長［λｍａｘ］（ｎｍ）＝２９０（ｌ
ｏｇε＝３．９９），２２７（ｓｈ），２０５（ｌｏｇ
ε＝４．２９） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４８０，２９５０
，１７４８，１５８４，１５２８，１４８８，１４３２
，１３７２，１３４８，１２４０，１０３４，９４４，
８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ｌ３）：１．１４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．
１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．００〜２．１
９（ｃａ．４０Ｈ，ｅａｃｈ　　ｓ），３．３２（３Ｈ
，ｓ），３．５５〜４．９０（ｍ），５．１０〜５．５
５（ｍ），７．０８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），８
．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスク（株）製
　　ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×
２５０ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニ
トリル／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
］：Ｒｔ＝７．７ｍｉｎ 元素分析：Ｃ６９Ｈ９２Ｎ２Ｏ４３として　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ　　
　　　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　　　Ｎ　
　　　　　理論値（％）　　　　　　５０．６１　　　
　　　５．６６　　　　　　１．７１　　　　　　実測
値（％）　　　　　　５０．８５　　　　　　５．５７
　　　　　　１．８０

【００６０】（２）　　４−ニト
ロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモ
イル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−マルトペンタオシドの
製造 前記（１）で得た４−ニトロフェニル＝Ｏ−（２，３−
ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カル
バモイル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシル
）−（１→４）−トリス［Ｏ−（２，３，６−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）
］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシド１．１７ｇ（０．７１５ｍｍｏｌ）を原料に
用いること以外実施例２の（２）と同様の操作を行い、
目的の４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−イソプロ
ピル）カルバモイル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ−マルト
ペンタオシド６１４ｍｇ（０．５８５ｍｍｏｌ，収率８
１．８％）が得られた。 紫外部・可視部吸収スペクトル：吸収極大波長［λｍａ
ｘ］（ｎｍ）＝２９８（ｌｏｇε＝４．０１），２２７
（ｓｈ），２０９（ｌｏｇε＝４．２５）赤外吸収スペ
クトル（ｃｍ−１）：３４００，２９３０，１６９６，
１５８２，１５２０，１４８６，１３５０，１２７４，
１２４８，１１５０，１０７８，１０２２，９３８，８
９４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ６）：１．０６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），
３．０５〜３．８５（ｍ），３．２５（３Ｈ，ｓ），４
．２５〜４．７０（ｍ），５．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３
．６Ｈｚ），５．０４（２Ｈ，ｂｒ　　ｄ，Ｊ＝３．６
Ｈｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），５．
２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ）、５．３０〜５．６
５（ｍ），７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８
．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）高速液体クロマト
グラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅｌ　　Ａｍｉｄ
ｅ−８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ），ＵＶ
２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル／水＝３：１
ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒｔ＝６．２ｍ
ｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ　　０．５１４，メタノール）；
＋８６．１° 元素分析：Ｃ４１Ｈ６４Ｎ２Ｏ２９として　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ　　
　　　　　　　　Ｈ　　　　　　　　　　Ｎ　　　　　
　理論値（％）　　　　　　４６．９５　　　　６．１
５　　　　２．６７　　　　　　実測値（％）　　　　
　　４６．８８　　　　６．２５　　　　２．５９

【０
０６１】実施例１０ （１）基質液の調製 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５
−Ｏ−（Ｎ−フェニル）カルバモイル−β−Ｄ−マルト
ペンタオシド（Ｍｗ１１０６）を０．９７５ｍＭの濃度
になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣ
ｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）
に溶解した。

【００６２】（２）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α−グルコシダーゼ及びアーモンド由来
のβ−グルコシダーゼをそれぞれ１１７Ｕ／ｍｌ，１３
Ｕ／ｍｌの濃度になるように４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２
ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．０）に混合して溶解した。なお、これら市販の
α−及びβ−グルコシダーゼは東洋紡績（株）製を使用
した。

【００６３】（３）標品α−アミラーゼ液の調製市販の
ヒトα−アミラーゼ（Ｐ：Ｓ＝１：１）に精製水を加え
、０，１４８，２８４，４０１，５２５ＩＵ／ｌの濃度
に溶解して標品α−アミラーゼ液とした。なお、この市
販のヒトα−アミラーゼは国際試薬（株）製キャリブザ
イムＡＭＹを使用した。

【００６４】また、α−アミラーゼ活性は、３７℃、１
分間に１μｍｏｌの２−クロロ−４−ニトロフェニル＝
β−Ｄ−マルトペンタオシド（市販品）を分解する酵素
量を１国際単位（ＩＵ）として定義した。

【００６５】（４）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とした。固体の場合は通常、試料５００ｍｇを正
確に秤量し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料液
とした。

【００６６】（５）検量線の作成 標品α−アミラーゼ液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍ
ｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温したのち、基
質液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、さらに３７℃で２分
間加温後からの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変
化量を測定した。各標品α−アミラーゼ液の活性と、吸
光度の変化量の関係より検量線を作成した。その結果、
検量線の式はＵ＝９．６６・ΔＡ×１０３＋１１．９［
Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、ΔＡ；吸光度の変化量］と
なった。そのグラフを図１に示す。

【００６７】（６）試料液中のα−アミラーゼ活性の測
定 試料液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍｌを加えてかき
まぜ、３７℃で１分間加温したのち、基質液２．０ｍｌ
を加えてかきまぜ、さらに３７℃で２分間加温後からの
２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した
。この測定値と（５）で作成した検量線から算出して試
料液中のα−アミラーゼ活性の測定を行うことができる
。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（
０〜５２５ＩＵ／ｌ）を越えた場合は精製水を用いて相
当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う。

【００６８】実施例１１ （１）基質液の調製 実施例２で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５
−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド（Ｍｗ１０６９）を０．８１２５ｍＭ
の濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−
ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７
．０）に溶解した。

【００６９】（２）共役酵素液の調製 実施例１０の（２）と同一の操作で共役酵素液の調製を
行った。

【００７０】（３）標品α−アミラーゼ液の調製実施例
１０の（３）と同様の操作で標品α−アミラーゼ液の調
製を行った。なお、各標品α−アミラーゼ液の活性は０
，１５０，３０２，４４７，５９２ＩＵ／ｌとした。

【００７１】（４）試料液の調製 実施例１０の（４）と同一の操作で試料液の調製を行っ
た。

【００７２】（５）検量線の作成 実施例１０の（５）と同様の操作で検量線の作成を行っ
た。その結果検量線の式はＵ＝９．０５・ΔＡ×１０３
−８．３［Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、ΔＡ；吸光度の
変化量］となった。そのグラフを図２に示す。

【００７３】（６）試料液中のα−アミラーゼ活性の測
定 実施例１０の（６）と同一の操作で試料液中のα−アミ
ラーゼ活性の測定を行った。

【００７４】実施例１２ （１）基質液の調製 実施例６で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５
，６５−ジ−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−
β−Ｄ−マルトペンタオシド（Ｍｗ１１５５）を１．６
２５ｍＭの濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び
２ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ＝７．０）に溶解した。

【００７５】（２）共役酵素液の調製 実施例１０の（２）と同一の操作で共役酵素液の調製を
行った。

【００７６】（３）標品α−アミラーゼ液の調製実施例
１１の（３）と同一の操作で標品α−アミラーゼ液の調
製を行った。

【００７７】（４）試料液の調製 実施例１０の（４）と同一の操作で試料液の調製を行っ
た。

【００７８】（５）検量線の作成 実施例１０の（５）と同様の操作で検量線の作成を行っ
た。その結果検量線の式はＵ＝８．９６・ΔＡ×１０３
−２．３［Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、ΔＡ；吸光度の
変化量］となった。そのグラフを図３に示す。

【００７９】（６）試料液中のα−アミラーゼ活性の測
定 実施例１０の（６）と同一の操作で試料液中のα−アミ
ラーゼ活性の測定を行った。なお、実施例５で得た２−
クロロ−４−ニトロフェニル＝６７−Ｏ−（Ｎ−イソプ
ロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトヘプタオシドに
ついても、上記と同様の操作を行えば、試料液中のα−
アミラーゼ活性の測定を行うことができる。

【００８０】実施例１３ （１）基質液の調製 実施例９で得た４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−
イソプロピル）カルバモイル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ
−マルトペンタオシド（Ｍｗ１０４８）を１．６２５ｍ
Ｍの濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ
−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．０）に溶解した。

【００８１】（２）共役酵素液の調製 β−グルコシダーゼを加えないこと以外、実施例１０の
（２）と同一の操作で共役酵素液の調製を行った。

【００８２】（３）標品α−アミラーゼ液の調製実施例
１１の（３）と同一の操作で標品α−アミラーゼ液の調
製を行った。

【００８３】（４）試料液の調製 実施例１０の（４）と同一の操作で試料液の調製を行っ
た。

【００８４】（５）検量線の作成 実施例１０の（５）と同様の操作で検量線の作成を行っ
た。その結果検量線の式はＵ＝１７．７・ΔＡ×１０３
−４．４［Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、ΔＡ；吸光度の
変化量］となった。そのグラフを図４に示す。

【００８５】（６）試料液中のα−アミラーゼ活性の測
定 実施例１０の（６）と同一の操作で試料液中のα−アミ
ラーゼ活性の測定を行った。

【００８６】実施例１４ 本発明基質が測定系内で安定に存在することを実証する
ために、非還元末端非修飾体を対照として下記の方法に
従って、共役酵素液との反応を行った。 試験方法 （１）基質液（ア）の調製 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５
−Ｏ−（Ｎ−フェニル）カルバモイル−β−Ｄ−マルト
ペンタオシド（Ｍｗ１１０３）（以下本発明基質という
）を３．０ｍＭの濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣ
ｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。

【００８７】（２）基質液（イ）の調製市販の２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル＝β−Ｄ−マルトペンタオシド
（Ｍｗ９８４）（以下対照基質という）を３．０ｍＭの
濃度になるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−Ｍ
ｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）に溶解した。

【００８８】（３）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α−グルコシダーゼ及びアーモンド由来
のβ−グルコシダーゼをそれぞれ１０５３Ｕ／ｍｌ，１
５．５Ｕ／ｍｌの濃度になるように４０ｍＭ−ＮａＣｌ
及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ＝７．０）に混合して溶解した。なお、これら
市販のα−及びβ−グルコシダーゼは東洋紡績（株）製
を使用した。

【００８９】（４）共役酵素反応 共役酵素液１．０ｍｌを３７℃で５分間加温した後、本
発明基質液又は対照基質液をそれぞれ２．０ｍｌ加えて
よく混合し、３７℃で３分加温後から５分間の４００ｎ
ｍにおける吸光度の変化量を測定した。その結果を図５
に示す。図５において、Ａは基質液（ア）、Ｂは基質液
（イ）によるものである。本発明基質は共役酵素と反応
することなく、測定系内で安定に存在することが分かる
。

【００９０】実施例１５ 本発明基質が測定系内で安定に存在することを実証する
ために、非還元末端非修飾体を対照として下記の方法に
従って、共役酵素液との反応を行った。 試験方法 （１）基質液（ア）の調製 実施例２で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５
−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド（Ｍｗ１０６９）（以下本発明基質と
いう）を３．０ｍＭの濃度になるように、４０ｍＭ−Ｎ
ａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。以下基質液（イ
）の調製、共役酵素の調製、共役酵素反応を実施例１４
と同一の操作を用いて行った。その結果を図６に示した
。図６においてＡは基質液（ア）、Ｂは基質液（イ）に
よるものである。これより、本発明基質は共役酵素と反
応することなく、測定系内で安定に存在することが分か
る。なお、実施例５で得られた２−クロロ−４−ニトロ
フェニル＝６７−Ｏ−（Ｎ−イソプロピル）カルバモイ
ル−β−Ｄ−マルトヘプタオシドについても同様の結果
が得られた。

【００９１】実施例１６ 実施例９で得た４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−
イソプロピル）カルバモイル−４−Ｏ−メチル−α−Ｄ
−マルトペンタオシドを基質液（ア）として用い、また
４−ニトロフェニル＝α−マルトペンタオシドを基質液
（イ）として用い、共役酵素中にβ−グルコシダーゼを
加えないこと以外、実施例１４と同一の操作を用いて行
った。その結果を図７に示した。図７においてＡは基質
液（ア）、Ｂは基質液（イ）によるものである。これよ
り、本発明基質は共役酵素と反応することなく、測定系
内で安定に存在することが分かる。

【００９２】実施例１７ 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することにより
、試薬を調製した。 　　　　　　　　成　　　　　　　　分　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　濃　　　　度２−クロロ−４−ニ
トロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−フェニル）カルバモイ
ル−β−Ｄ−マルトペンタオシド　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２．００ｍＭα−グルコシダーゼ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　４０Ｕ／ｍｌβ−
グルコシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０
Ｕ／ｍｌβ−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｍＭ
ウシ血清アルブミン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．０５％

【００９３】測定用試料が液体の場合はそ
のまま試料液とし、また固体の場合は試料５００ｍｇを
正確に秤量し、精製水を加えて全量を５．０ｍｌとし、
これを試料液とした。この試料液２５０μｌにあらかじ
め３７℃で２分間加温した前記の試薬３．０ｍｌを加え
てかきまぜ、３７℃で２分間加温した後２分間の４００
ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。この測定値と
あらかじめ作成した検量線から算出して試料液中のα−
アミラーゼ活性の測定を行った。なお、試料液中の酵素
活性の値が検量線の適用範囲（０〜５２５ＩＵ／ｌ）を
越えた場合は精製水を用いて相当する倍数の希釈を行っ
たのち、再測定した。

【００９４】実施例１８ ２−クロロ−４−ニトロフェニル＝６５−Ｏ−（Ｎ−フ
ェニル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペンタオシドの
代りに２−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，６５−
ジ−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−β−Ｄ−マルト
ペンタオキシドを１．００ｍＭとする以外は前記実施例
１７と同様にして試薬を調製した。この試薬は実施例１
７と同様にして試料液中のα−アミラーゼ活性の測定に
用いることができた。

【００９５】参考例 前記した実施例で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝４５，６５−ジ−Ｏ−（Ｎ−エチル）カルバモイル−
β−Ｄ−マルトペンタオシド（ＤＥＧ５ＣＮＰ）及び２
−クロロ−４−ニトロフェニル＝４５，６５−ジ−Ｏ−
（Ｎ−イソプロピル）カルバモイル−β−Ｄ−マルトペ
ンタオシド（ＤＩＰＣＧ５ＣＮＰ）について、以下の方
法でＫｍ値、加水分解速度、水溶性及び加水分解部位の
測定を行った。その結果を表１及び表２に示す。なお、
対照基質としては、市販の２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−マルトペンタオシド（Ｇ５ＣＮＰ）を用
いた。

【００９６】（１）Ｋｍ値； （ｉ）基質液（ア）の調製 各基質を０．１６，０．３２，０．４８，０．６４，０
．８０，０．９６ｍＭの濃度になるように、４０ｍＭ−
ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 （ｉｉ）Ｋｍ値の概算 上記（１）の各基質液について、後記加水分解速度の測
定と同様の操作を行って速度を測定し、ラインウェーバ
ー・バークの逆数プロット［堀尾武一、山下仁平編「蛋
白質・酵素の実験法」第３８３頁、南江堂、１９８１年
発行参照］でＫｍ値の概算値を求めた。 （ｉｉｉ）基質液（イ）の調製 各基質を上記（ｉｉ）の概算Ｋｍ値の０．８〜１．６倍
の範囲で３種の濃度、１．６〜３．２倍の範囲で３種の
濃度となるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−Ｍ
ｇＣｌ２を含有した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）に溶解した。（ｉｖ）Ｋｍ値の測定上記（ｉｉ）と
同様の操作を行い、Ｋｍ値を算出した。

【００９７】（２）加水分解速度； （ｉ）基質液の調製 各基質の濃度をＫｍ値の７〜９倍になるように、４０ｍ
Ｍ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。この濃度
は後記α−アミラーゼ反応時において、ヒトα−アミラ
ーゼに対してＫｍ値の約５倍に相当するため、最大反応
速度に達するには十分な基質量である。 （ｉｉ）共役酵素液の調製 前記実施例１０の（２）と同様にして調製した。 （ｉｉｉ）α−アミラーゼ液の調製 前記実施例１０の（３）と同様にして、約５００ＩＵ／
ｌの濃度の市販ヒトＰ型及びＳ型α−アミラーゼ液を調
製した。 （ｉｖ）加水分解速度の測定（α−アミラーゼ反応）上
記（ｉｉｉ）のα−アミラーゼ液２５０μｌに共役酵素
１．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温した
後、基質液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分
間加温した後からの２分間の４００ｎｍにおける吸光度
の変化量を測定した。対照基質のＧ５ＣＮＰを用いた場
合、加水分解速度、すなわち単位時間当りの吸光度の変
化量を１０とし、各基質の加水分解速度を相対値で示し
た。

【００９８】（３）水溶性；水１００ｍｌに基質２０ｇ
を添加し、その溶解状態を観察した。

【００９９】（４）加水分解部位；各基質の濃度を０．
５ｍＭになるように、４０ｍＭ−ＮａＣｌ及び２ｍＭ−
ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７
．０）に溶解し、この基質液１．０ｍｌに、上記加水分
解速度の項の（ｉｉｉ）のα−アミラーゼ液１００μｌ
を加えてよくかきまぜた後、３７℃で２０分間反応させ
た。この反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析す
ることにより加水分解生成物を定量した。なお、ＤＥＣ
Ｇ５ＣＮＰについて実施例１０と同様にして検量線の式
を求めたところ、次のとおりであった。 Ｕ＝７．５４・ΔＡ×１０３＋４．８ また、このものは、測定系内で共役酵素に反応すること
なく安定に存在することが確認された。

【表１】

【表２】

【０１００】これらの表において、Ａｉはヒトα−アミ
ラーゼアイソザイム、Ｐはヒト膵液由来のα−アミラー
ゼ、Ｓはヒト唾液由来のα−アミラーゼを意味する。

【０１０１】表１及び表２から、本発明の基質は、加水
分解部位が実質的に１か所であり、またアイソザイムに
よる加水分解部位及び加水分解率が同じであり、かつα
−アミラーゼに対する親和性が極めて強く加水分解速度
及び水溶性も良好であって基質として極めてすぐれたも
のであることがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　実施例１０におけるα−アミラーゼ活性の
測定に用いる検量線を示すグラフ。

【図２】　　実施例１１における検量線を示すグラフ。

【図３】　　実施例１２における検量線を示すグラフ。

【図４】　　実施例１３における検量線を示すグラフ。

【図５】　　実施例１４における本発明基質と対照基質
との測定系内での安定性を示すグラフ。

【図６】　　実施例１５における本発明基質と対照基質
との測定系内での安定性を示すグラフ。

【図７】　　実施例１６における本発明基質と対照基質
との測定系内での安定性を示すグラフ。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　一般式 【化１】 （式中のｎは２〜６の整数、Ｒは芳香族発色性基、Ｘは
   水素原子又は置換若しくは非置換の炭化水素基であり、
   Ｙは水素原子、置換若しくは非置換の炭化水素基、アル
   キル若しくはアリールスルホニル基又はアルキル若しく
   はアリールカルバモイル基である）で表わされる非還元
   末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の非還元末端カルバモイ
   ルマルトオリゴシド誘導体を有効成分とするα−アミラ
   ーゼ活性測定用試薬。
3. 【請求項３】　　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１
   記載の非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体
   のα−アノマーと、α−グルコシダーゼ及び／又はグル
   コアミラーゼを添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳
   香族発色性化合物を定量することを特徴とするα−アミ
   ラーゼ活性の測定方法。
4. 【請求項４】　　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１
   記載の非還元末端カルバモイルマルトオリゴシド誘導体
   のβ−アノマー又はα−アノマーとβ−アノマーとの混
   合物と、α−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラー
   ゼ並びにβ−グルコシダーゼを添加して酵素反応を行わ
   せ、遊離する芳香族発色性化合物を定量することを特徴
   とするα−アミラーゼ活性の測定方法。