JP2770892B2 - アルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法 - Google Patents

アルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体、これを有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα‐アミラーゼ活性の測定方法

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【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なアルコキシメチ
リデンマルトオリゴ糖誘導体、該誘導体を有効成分とす
るα‐アミラーゼ活性測定用試薬、及び該誘導体を用い
てα‐アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定する
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液
を対象とするα‐アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上
極めて重要であり、特に急性や慢性の肝炎、膵臓炎、膵
臓ガン、流行性耳下腺炎などの鑑別診断においては必須
の測定項目となっている。
【０００３】このα‐アミラーゼ活性の測定方法につい
ては従来より種々の方法が知られているが、近年、各種
置換フェニルマルトオリゴシド類の非置換末端グルコー
スが各種の置換基で修飾された物質［共役酵素系に耐性
（安定性）を有する特徴をもつ］を基質として利用し、
α‐アミラーゼにより切断を行い、次いで共役酵素系を
作用させ、生成する置換フェノール類をそのまま、ある
いは必要に応じてｐＨを変化させたのち、あるいは縮合
させたのちに比色定量する方法が広く用いられるように
なってきた。
【０００４】しかしながら、これらの基質は、共役酵素
に対する耐性が不十分である、水に対する溶解性が低
い、α‐アミラーゼに対する親和性が低い（Ｋｍ値が高
い）、α‐アミラーゼによる分解速度が低い、化学的や
生化学的に不安定で長期間保存することができないなど
の種々の欠点を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来のα‐アミラーゼ活性の測定用試薬及びそれを用い
る測定方法が有する欠点を克服し、α‐アミラーゼ活性
を効率よく、かつ正確に測定しうる試薬として好適な新
規化合物を提供するとともに、これを試薬とした新規な
α‐アミラーゼ活性の測定方法を提供することを目的と
してなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々研究を重ねた結果、α‐アミラーゼ
活性測定用試薬として、特定のアルコキシメチリデンマ
ルトオリゴ糖誘導体が極めて好適であり、これを用いて
α‐アミラーゼ活性を測定することにより、その目的を
達成しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を
完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、一般式
【化２】 （式中のＸ１はメトキシ基又はエトキシ基、Ｘ２は水素
原子、メトキシ基、エトキシ基又は置換若しくは非置換
の炭化水素基、Ｒは水素原子、芳香族発色性基又はグル
コース以外の単糖類の残基、ｎは２〜６の整数である）
で表わされるアルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導
体、このアルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体を
有効成分とするα‐アミラーゼ活性測定用試薬、及びα
‐アミラーゼ含有試料に、前記アルコキシメチリデンマ
ルトオリゴ糖誘導体とα‐アミラーゼ活性測定用共役酵
素を添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性
化合物又は単糖類を定量することを特徴とするα‐アミ
ラーゼ活性の測定方法を提供するものである。
【０００８】本発明の前記一般式（Ｉ）のアルコキシメ
チリデンマルトオリゴ糖誘導体におけるマルトオリゴ糖
部としては、α‐及びβ‐Ｄ‐マルトテトラオースから
α‐及びβ‐Ｄ‐マルトオクタオースに対応するものが
すべて使用できる。これらの中でもＤ‐マルトペンタオ
ース、Ｄ‐マルトヘキサオース、Ｄ‐マルトヘプタオー
スが最終的な基質の性質の点から好適である。
【０００９】また、前記一般式（Ｉ）で表わされるアル
コキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体におけるＸ１は
メトキシ基又はエトキシ基であり、そしてＸ２は水素原
子、メトキシ基、エトキシ基又は置換若しくは非置換の
炭化水素基である。この炭化水素基の例としては、メチ
ル基、エチル基、イソプロピル基、ブチル基、アリル
基、シクロヘキシル基のような直鎖状、枝分れ状の飽和
又は不飽和脂肪族炭化水素基や、ベンジル基、フェニル
基、トルイル基、ナフチル基、ビフェニル基などの芳香
族炭化水素基などを挙げることができる。これらの炭化
水素基は、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、
ニトロ基、アルキルシリル基、スルホニル基、ハロゲン
原子などで置換されていてもよい。
【００１０】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるア
ルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体は、そのＸ１
及びＸ２の少なくとも一方をメトキシ基又はエトキシ基
とすることにより、水溶性が著しく向上して、α‐アミ
ラーゼ活性測定用基質としての有効性が高められる。こ
の観点から、前記一般式（Ｉ）におけるＸ２もメトキシ
基又はエトキシ基であるのが望ましい。
【００１１】さらに、前記一般式（Ｉ）で表わされるア
ルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体におけるＲは
水素原子、芳香族発色性基又はグルコース以外の単糖類
の残基であるが、これらの中で特に芳香族発色性基が好
適である。
【００１２】該芳香族発色性基については、分光学的に
検出できるものであればよく、特に制限はないが、例え
ば、一般式
【化３】 （式中のＲ１ないしＲ５は水素原子、ハロゲン原子、ニ
トロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、アミ
ノ基、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それぞ
れ同一であってもよいし、異なっていてもよく、またＲ
１とＲ２、Ｒ２とＲ３とがそれぞれたがいに結合して、
縮合芳香環を形成してもよい）
【００１３】
【化４】 （式中のＲ６は水素原子又はアルキル基である）
【化５】 （式中のＲ７は水素原子又はハロゲン原子である）
【化６】 （式中のＲ８ないしＲ１５は水素原子、ハロゲン原子、
ニトロ基、アルキル基、アリール基、アラルキル基、ア
ミノ基、スルホン酸基又はカルボキシル基であり、それ
ぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよく、また
Ｒ８とＲ９、Ｒ１０とＲ１１とがそれぞれたがいに結合
して、縮合芳香環を形成してもよく、さらにＲ９とＲ
１０及び／又はＲ１３とＲ１４が共通の酸素原子となっ
て縮合エーテル環を形成してもよく、Ｚは窒素原子又は
Ｎ→Ｏである）で表わされる基などが好ましく挙げられ
る。
【００１４】また、グルコース以外の単糖類の残基とし
ては広義の単糖類あるいはその誘導体の残基、例えばフ
ラクトース、イノシトール、グルシトール、グルコース
‐６‐リン酸などの残基が挙げられる。
【００１５】前記一般式（Ｉ）で表わされるアルコキシ
メチリデンマルトオリゴ糖誘導体はα‐アノマー（α‐
配糖体）又はβ‐アノマー（β‐配糖体）のいずれであ
ってもよい。このような前記一般式（Ｉ）で表わされる
アルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体の代表例と
しては、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６５
‐Ｏ‐ジメトキシメチリデン‐β‐Ｄ‐マルトペンタオ
シド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６５‐
Ｏ‐（１‐メトキシ）エチリデン‐β‐Ｄ‐マルトペン
タオシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６
５‐Ｏ‐（１‐エトキシ）メチリデン‐β‐Ｄ‐マルト
ペンタオシド、４‐ニトロフェニル＝４５，６５‐Ｏ‐
ジメトキシメチリデン‐α‐Ｄ‐マルトペンタオシド、
２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６５‐Ｏ‐
（１‐エトキシ）ベンジリデン‐β‐Ｄ‐マルトペンタ
オシド、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４７，６７
‐Ｏ‐（１‐メトキシ）エチリデン‐β‐Ｄ‐マルトヘ
プタオシド、フェノールインド‐３′‐クロロフェニル
＝４５，６５‐Ｏ‐ジメトキシメチリデン‐β‐Ｄ‐マ
ルトペンタオシド、４‐メチルウンベリフェロニル＝４
５，６５‐Ｏ‐１‐エトキシ‐３‐ケトブチリデン‐α
‐Ｄ‐マルトペンタオシド、レザズリニル＝４６，６６
‐Ｏ‐１‐メトキシメチリデン‐α‐Ｄ‐マルトヘキサ
オシド、ルシフェリニル＝４４，６４‐Ｏ‐ジメトキシ
メチリデン‐β‐Ｄ‐マルトテトラオシド、４５，６５
‐Ｏ‐ジメトキシメチリデン‐Ｄ‐マルトペンタオー
ス、４７，６７‐Ｏ‐（１‐メトキシ）エチリデン‐Ｄ
‐マルトペンタオース、フラクトシル＝４４，６４‐Ｏ
‐ジメトキシメチリデン‐α‐Ｄ‐マルトテトラオシド
などが挙げられる。
【００１６】なお、上記において、記号６５‐、６
７‐、４５‐、４７‐などは、マルトオリゴ糖を構成す
るグリコース単位の還元末端側から、５番目、７番目の
グリコースの６位、４位の水酸基が置換されていること
を示す。
【００１７】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるア
ルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体は文献未載の
新規な化合物であって、その製造方法については特に制
限はなく、任意の方法を用いることができるが、例えば
次の方法によって製造することができる。
【００１８】すなわち、出発原料として、市販品や公知
の製造方法で得ることのできる、一般式
【化７】 （式中のＲ及びｎは前記と同じ意味をもつ）で表わされ
るＤ‐マルトオリゴ糖又はその誘導体、例えば２‐クロ
ロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ‐マルトペンタオシ
ド、４‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐マルトヘプタオシ
ド、フェノールインド‐３′‐クロロフェニル＝β‐Ｄ
‐マルトペンタオシド、Ｄ‐マルトペンタオース、Ｄ‐
マルトヘプタオース、フラクトシル‐β‐Ｄ‐マルトテ
トラオースなどを用い、一般式
【化８】 （式中のＸ１及びＸ２は前記と同じ意味をもつ）又は
【化９】 （式中のＸ１及びＸ２は前記と同じ意味をもち、Ｘ３及
びＸ４はそれぞれ炭素数１〜４のアルキル基であって、
それらは同一であってもよいし、異なっていてもよい）
で表わされるカルボニル化合物又はそのアセタール若し
くはケタールと反応させることにより、前記一般式
（Ｉ）で表わされるアルコキシメチリデンマルトオリゴ
糖誘導体が得られる。
【００１９】前記一般式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）で表わさ
れるカルボニル化合物又はそのアセタール若しくはケタ
ールとしては、例えばテトラメトキシメタン、テトラエ
トキシエタン、オルト酢酸トリエチル、オルト酢酸トリ
メチル、α，α，α‐トリメトキシトルエンなどが挙げ
られる。
【００２０】前記一般式（Ｉ）で表わされるアルコキシ
メチリデンマルトオリゴ糖誘導体は、例えば前記一般式
（ＩＩ）で表わされるＤ‐マルトオリゴ糖又はその誘導
体に、前記一般式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）で表わされるカ
ルボニル化合物又はそのアセタール若しくはケタールを
２〜１００倍モル程度、好ましくは２〜１０倍モル程度
加え、通常非プロトン性極性溶媒中において、触媒の存
在下、２０〜１００℃、好ましくは２５〜５０℃の範囲
の温度で１〜２０時間程度、好ましくは２〜５時間程度
かきまぜながら反応させることにより、得られる。
【００２１】この際用いられる非プロトン性極性溶媒と
しては、例えばＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、Ｎ，Ｎ‐ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメ
チルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルホスホ
リックトリアミド（ＨＭＰＡ）などが、また触媒として
は、例えばｐ‐トルエンスルホン酸、塩化水素、硫酸、
無水塩化亜鉛、強酸性イオン交換樹脂などが挙げられ
る。
【００２２】この反応において、水分を除去するために
例えばモレキュラシーブス、ドライアライト、五酸化リ
ンなどの乾燥剤を共存させてもよいし、減圧下で水、ア
ルコールなどを留去しながら反応を行ってもよい。
【００２３】次いで、この反応液を常法例えばカラムク
ロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどによっ
て精製し、目的の化合物を得ることができる。このよう
にして得られた一般式（Ｉ）で表わされるアルコキシメ
チリデンマルトオリゴ糖誘導体は、α‐アミラーゼ活性
の測定に極めて有用であり、このアルコキシメチリデン
マルトオリゴ糖誘導体を用いてα‐アミラーゼ活性を効
率よく測定することができる。
【００２４】α‐アミラーゼ活性の測定に際しては、常
法によりα‐アミラーゼ活性測定用共役酵素の存在下
で、α‐アミラーゼと基質である前記一般式（Ｉ）で表
わされるアルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体を
作用させる。該基質と使用する共役酵素との関係につい
ては特に制限はなく、常法に従えばよい。
【００２５】また、前記したように、一般式（Ｉ）で表
わされるアルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体に
はα‐アノマーとβ‐アノマーが存在するが、この場合
のα‐アミラーゼ活性測定用共役酵素としては、例えば
（１）一般式（Ｉ）におけるＲが水素原子である化合物
（α‐アノマー及び／又はβ‐アノマー）の場合はα‐
グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼが、（２）
該Ｒが芳香族発色性基又はグルコース以外の単糖類残基
である化合物で、（イ）α‐アノマーのみの場合はα‐
グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼが、（ロ）
β‐アノマーのみ又はα‐アノマーとβ‐アノマーとの
混合物の場合はα‐グルコシダーゼ及び／又はグルコア
ミラーゼとβ‐グルコシダーゼとの組合せが用いられ
る。なお、前記のいずれの場合においても、必要に応じ
てβ‐アミラーゼを併用することができる。
【００２６】α‐アミラーゼ活性の測定するための有利
な系としては、例えば一般式（Ｉ）で表わされるアルコ
キシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体０．１〜１０ｍＭ
及び緩衝液２〜３００ｍＭを含有し、かつ共役酵素とし
てα‐グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼをそ
れぞれ５〜１０００単位／ｍｌ、さらにβ‐グルコシダ
ーゼを用いるときは０．５〜３０単位／ｍｌを含有する
ｐＨ４〜１０の系が挙げられる。この系に用いられる緩
衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、Ｇｏ
ｏｄ’ｓの緩衝剤、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグ
ルタル酸塩などが挙げられる。
【００２７】α‐グルコシダーゼは動物、植物、微生物
などいかなる起源のものを用いてもよいが、例えば酵母
由来のものが好ましい。また、グルコアミラーゼもいか
なる起源のものを用いてもよいが、例えばリゾプス属
（Ｒｉｚｏｐｕｓ ｓｐ）などに由来するものが好まし
い。さらに、β‐グルコシダーゼもいかなる起源のもの
を用いてもよく、例えばアーモンドの種子から得たもの
が用いられる。
【００２８】β‐アミラーゼもいかなる起源のものを用
いてもよいが、例えば細菌や植物由来のものを用いるこ
とができる。このような系に、前記成分以外に、本発明
の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じて慣用
の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤とし
て、グリセリン、牛血清アルブミン、α‐又はβ‐シク
ロデキストリン、トリトンＸ‐１００などを加えること
ができるし、α‐アミラーゼ活性化剤として、ＮａＣ
ｌ，ＭｇＣｌ２，ＭｇＳＯ４，ＣａＣｌ２，ＣａＣｌ２
・Ｈ２Ｏなどの形で用いられるＣｌ−イオン、Ｃａ２＋
イオン、Ｍｇ２＋イオンなどを加えてもよい。これらの
添加成分は１種用いてもよいし、２種以上を組み合わせ
て用いてもよく、また前記系の調製の適当な段階で加え
ることができる。
【００２９】また、一般式（Ｉ）で表わされるアルコキ
シメチリデンマルトオリゴ糖誘導体において、Ｒが水素
原子若しくはグルコース以外の単糖類の残基である基質
を用いる場合、酵素反応によって生成する単糖類例えば
グルコース、フラクトース、あるいはその他の単糖類を
吸光度法によって定量するときには、ＮＡＤ→ＮＡＤＨ
又はキノン系物質の生成などの酸化‐還元反応に伴う光
度変化測定系に通常用いられる酵素類、すなわち、グル
コース‐６‐リン酸デヒドロゲナーゼ（例えばＬｅｕｃ
ｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｃｉｄｅｓなどに由
来するもの）、マルトースホスホリラーゼ（例えばＬａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓなどに由来する
もの）、ヘキソキナーゼ（例えば酵母などに由来するも
の）、β‐ホスホムターゼ［例えば兎筋肉（ｒａｂｂｉ
ｔｍｕｓｃｌｅ）などに由来するもの］、ソルビトール
デヒドロゲナーゼ［例えば羊肝（ｓｈｅｅｐ ｌｉｖｅ
ｒ）に由来するもの］、グルコースオキシダーゼ（例え
ばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒなどに由来するも
の）、パーオキシダーゼ（例えばワサビなどに由来する
もの）及びＮＡＤ、ＡＴＰなどを加えればよい。
【００３０】なお、Ｒが芳香族発色性基である基質を用
いる場合には、α‐アミラーゼ反応に係わる共役酵素系
以外に、前記のように、吸光系に係わる酵素などを必要
としないで吸光度法を適用できるため、より好ましい。
【００３１】本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した
形で用いてもよいし、薄膜状の担体、例えばシート、含
浸性の紙などに含浸させて用いてもよい。このような本
発明の試薬を用いることにより、各種の試料に含有され
るα‐アミラーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感
度で測定することができる。
【００３２】次に、本発明方法の好適な実施態様を説明
する。まず、α‐アミラーゼを含む試料に、α‐アミラ
ーゼ活性測定用共役酵素としてのα‐グルコシダーゼ又
はグルコアミラーゼあるいはその両方をそれぞれ５〜１
０００単位／ｍｌ、好ましくは１０〜５００単位／ｍｌ
加え、前記一般式（Ｉ）で表わされるアルコキシメチリ
デンマルトオリゴ糖誘導体がβ‐アノマーを含むとき
は、さらにβ‐グルコシダーゼを０．５〜３０単位／ｍ
ｌ、好ましくは１〜１５単位／ｍｌ加え、これと同時又
はこれらの後に、該アルコキシメチリデンマルトオリゴ
糖誘導体０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．３〜５ｍＭ
を緩衝剤とともに添加したのち、温度２５〜４５℃、好
ましくは３５〜４０℃、ｐＨ４〜１０、好ましくは６〜
８の条件下で少なくとも１分間、好ましくは２〜１０分
間酵素反応させ、生成した芳香族発色性化合物を、常法
に従いそのままであるいは必要に応じｐＨを調整したの
ち、又は縮合反応を行ったのちに、適当な吸光波長で連
続的に又は断続的に吸光度変化量を測定し、あらかじめ
測定したα‐アミラーゼ標品の吸光度変化量と対比させ
て試料中のα‐アミラーゼ活性を算出する。また、生成
した芳香族発色性化合物の分子吸光係数から算出するこ
ともできる。
【００３３】なお、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合
物のＲが水素原子又はグルコース以外の単糖類の残基で
あるときは、吸光系に係る酵素その他必要な成分を適宜
添加し、Ｒが芳香族発色性基である場合と同様にして行
うことができる。
【００３４】本発明に用いられるα‐アミラーゼ含有試
料については、α‐アミラーゼ活性を含有するものであ
ればよく、特に制限はないが、具体的には微生物の培養
液、植物の抽出液、あるいは動物の体液や組織及びそれ
らの抽出液などを用いることができる。α‐アミラーゼ
含有試料が固体の場合には、いったん精製水又は前記し
たような緩衝液に溶解又は懸濁させるのがよい。また、
必要により、不溶物をろ過などの操作で除去してもよ
い。
【００３５】
【発明の効果】本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる
アルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体は新規な化
合物であって、α‐アミラーゼ活性測定用試薬として極
めて有用であり、このものを用いることにより、試料中
に含まれるグルコース、マルトース、ビリルビン、ヘモ
グロビンなどの影響を受けることなく、α‐アミラーゼ
活性を自動分析法、用手法などにより、精度よく短時間
で容易に測定することができる。
【００３６】また、本発明の前記一般式（Ｉ）の化合物
は、そのアルコキシメチリデン基が修飾基中にエーテル
構造を有するため、従来の修飾基に比して水溶性が極め
て高く、製剤化、試薬の調製などが容易であり、また該
アルコキシメチリデン基が、化学的にも生化学的にも安
定な官能基であるため、溶解して試薬を調製し共役酵素
を共存させても、長期にわたって初期状態を維持しうる
という利点がある。
【００３７】さらに、本発明の前記一般式（Ｉ）の化合
物は、α‐アミラーゼ活性測定用基質として有効な非還
元末端グルコースの６位、５位、４位の１又は２か所を
修飾若しくは変換したマルトオリゴ糖誘導体を製造する
ための中間体としても有用である。例えば本発明のアル
コキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体から４，６‐Ｏ
‐アルコキシメチリデン化アシルマルトオリゴ糖誘導体
に導き、これを脱アルコキシメチリデン化して相当する
部分アシル化マルトオリゴ糖誘導体としたのち、この誘
導体の非還元末端グルコースの６位、５位、４位の１又
は２か所を種々の基で修飾又は変換したアシル化マルト
オリゴ糖誘導体を得、次いで脱アシル化することによ
り、非還元末端グルコースの６位、５位、４位の１又は
２か所を修飾若しくは変換したマルトオリゴ糖誘導体な
どを製造することができる。
【００３８】そして、この中間体として用いる前記一般
式（Ｉ）で表わされるアルコキシメチリデンマルトオリ
ゴ糖誘導体は、その４，６‐Ｏ‐アルコキシメチリデン
化アシルマルトオリゴ糖誘導体におけるアルコキシメチ
リデン基が極めて優れた極性（水溶性）による高い反応
性を有しているため、従来の４，６‐Ｏ‐アルキル若し
くはアリールメチリデン化アシルマルトオリゴ糖誘導体
の場合の脱アルキル若しくはアリール化反応に必要であ
った条件よりも非常に弱い条件、すなわちより低温、よ
り短時間でかつより弱い酸触媒により脱アルコキシメチ
リデン化を行うことができ、その結果、還元末端グルコ
ースの水酸基の水素原子と置換されたＲの分解や糖鎖の
切断などの副反応を防ぐことができ、したがって、最終
目的化合物が極めて高い収率で得ることができるという
利点を有している。
【００３９】
【実施例】次に実施例により、本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものではない。なお、各例中の吸収極大波長は特に示
されていないかぎり、メタノール中で測定した値であ
り、比旋光度は２５℃においてＤ線で測定した値であ
る。
【００４０】実施例１ ２‐クロロ‐４‐ニトロフェニ
ル＝４５，６５‐Ｏ‐ジメトキシメチリデン‐β‐Ｄ‐
マルトペンタオシドの製造 市販の２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ‐マル
トペンタオシド１．５０ｇ（１．５２ｍｍｏｌ）を無水
ＤＭＦ７．５ｍｌに溶解し、テトラメトキシメタン１．
５ｍｌ（１１．３ｍｍｏｌ）及びアンバーリスト（１５
Ｅ）０．７５ｇを加え、３５℃で４時間かきまぜながら
反応させた。次いで、この反応液を氷冷下１００ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）２．０ｌ中へ、かきまぜな
がらゆっくりと滴下した。この混合液をＯＤＳ（オクタ
デシルシリカゲル）カラムクロマトグラフィーにより精
製し、アセトニトリル‐水混液（容量比３：７）で溶出
した目的区分を濃縮し、イソプロパノール‐メタノール
から再結晶すると、２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝
４５，６５‐Ｏ‐ジメトキシメチリデン‐β‐Ｄ‐マル
トペンタオシドが１．０７ｇ（１．０１ｍｍｏｌ，収率
６６．５％）得られた。
【００４１】融点（℃）：９３．０〜９５．０（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λｍａｘ］（ｎｍ）＝２９５（ｌｏｇε
＝３．９５），２２７（ｓｈ），２０９（ｌｏｇε＝
４．１７） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４２０，２９４
０，１６４８，１５８８，１５２４，１４９０，１３５
２，１２７６，１２４６，１１５４，１０８２，１０５
０，１０２６，９３０，８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ６）：３．２５〜３．８５（ｍ），３．２３（３
Ｈ，ｓ），３．３０（３Ｈ，ｓ），３．８９（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），４．３０〜４．７０（ｍ）．
５．０４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．１０（１
Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．４Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈ
ｚ），５．２５〜５．７０（ｍ），７．４７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），８．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝
９．３Ｈｚ，２．７Ｈｚ），８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝
２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［ナカライテスク（株）製Ｃ
ＯＳＭＯＳＩＬＣ１８カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル
／水＝１：４ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒ
ｔ＝１０．２ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５０，５０ｍＭリン酸ｂｕ
ｆｆｅｒ）；＋８６．７° 元素分析：Ｃ３９Ｈ５８ＣｌＮＯ３０として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４４．３５ ５．５３ １．３３ 実測値（％） ４４．５５ ５．４３ １．３４
【００４２】実施例２ ２‐クロロ‐４‐ニトロフェニ
ル＝４５，６５‐Ｏ‐（１‐エトキシ）エチリデン‐β
‐Ｄ‐マルトペンタオシドの製造 オルト酢酸トリエチルを試薬に使用したこと以外は、実
施例１と同様の操作を行うことにより、目的の２‐クロ
ロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６５‐Ｏ‐（１‐エト
キシ）エチリデン‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシド５０９
ｍｇ（０．４８３ｍｍｏｌ，収率３１．６％）が得られ
た。 融点（℃）：２２０〜２２２（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λｍａｘ］（ｎｍ）＝２８９（ｌｏｇε
＝３．９７），２２７（ｌｏｇε＝３．９６），２０９
（ｌｏｇε＝４．１５） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４００，２９３
０，１６４８，１５８４，１５２０，１４８６，１３５
０，１２７４，１１５２，１１２４，１０８０，１０５
０，１０２２，９３２，８９２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ６）：１．１６（３Ｈ，ｔ，ｄ＝６．９Ｈｚ），
１．３８（３Ｈ，ｓ），３．１５〜３．８０（ｍ），
４．３５〜４．６５（ｍ），５．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈ
ｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．２
７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．２５〜５．７０
（ｍ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），８．
１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２．８Ｈｚ），
８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル
／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒ
ｔ＝４．８ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．４１６，メタノール）；＋
８５．２° 元素分析：Ｃ４０Ｈ６０ＣｌＮＯ２９として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４５．５７ ５．７４ １．３３ 実測値（％） ４５．１３ ５．８９ １．２８
【００４３】実施例３ ２‐クロロ‐４‐ニトロフェニ
ル＝４５，６５‐Ｏ‐（１‐メトキシ）エチリデン‐β
‐Ｄ‐マルトペンタオシドの製造 オルト酢酸トリメチルを試薬に使用したこと以外は、実
施例１と同様の操作を行うことにより、目的の２‐クロ
ロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６５‐Ｏ‐（１‐メト
キシ）エチリデン‐β‐Ｄ‐マルトペンタオシド３１５
ｍｇ（０．３０３ｍｍｏｌ，収率１９．９％）が得られ
た。 融点（℃）：８５．０〜８７．０（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λｍａｘ］（ｎｍ）＝２９５（ｌｏｇε
＝３．９５），２２７（ｌｏｇε＝３．９１），２０９
（ｌｏｇε＝４．１５） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４１０，２９３
０，１６３０，１５８６，１５２４，１４８８，１３５
０，１２７６，１１５２，１０８０，１０４４，１０２
２，９３４，８８６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ６）：１．１６（３Ｈ，ｔ，ｄ＝６．９Ｈｚ），
１．３８（３Ｈ，ｓ），３．１５〜３．８０（ｍ），
４．３５〜４．６５（ｍ），５．０３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．７Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．９Ｈ
ｚ），５．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．２
７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．２５〜５．７０
（ｍ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），８．
１８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２．８Ｈｚ），
８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル
／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒ
ｔ＝６．０ｍｉｎ 比旋光度［α］：（ｃ ０．５０８，５０ｍＭリン酸ｂ
ｕｆｆｅｒ）；＋９１．３° 元素分析：Ｃ３９Ｈ５８ＣｌＮＯ２９として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４５．０３ ５．６２ １．３５ 実測値（％） ４４．８９ ５．５１ １．１５
【００４４】実施例４ ４‐ニトロフェニル＝４７，６
７‐Ｏ‐（１‐エトキシ）エチリデン‐α‐Ｄ‐マルト
ヘプタオシドの製造 原料に市販の４‐ニトロフェニル＝α‐Ｄ‐マルトヘプ
タオシドを使用し、かつオルト酢酸トリエチルを試薬に
使用したこと以外は、実施例１と同様の操作を行うこと
により、目的の４‐ニトロフェニル＝４７，６７‐Ｏ‐
（１‐エトキシ）エチリデン‐α‐Ｄ‐マルトヘプタオ
シド５１１ｍｇ（０．３８０ｍｍｏｌ，収率３２．３
％）が得られた。 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λｍａｘ］（ｎｍ）＝２９８（ｌｏｇε
＝４．０１），２２７（ｓｈ），２０９（ｌｏｇε＝
４．２５） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−１）：３４１０，２９４
０，１６１２，１５９２，１５１８，１５００，１３４
６，１２５２，１１５４，１０８２，１０２２，９３
４，８７６，８５２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ‐ｄ６）：１．１５（３Ｈ，ｔ，ｄ＝７．１Ｈｚ），
１．３９（３Ｈ，ｓ），３．２０〜３．８０（ｍ），
４．３５〜４．６５（ｍ），５．０３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝
３．２Ｈｚ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．７Ｈ
ｚ），５．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），５．２
０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ），５．２５〜５．７０
（ｍ），７．２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），８．
２３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィ［東ソー（株）製ＴＳＫｇｅ
ｌ Ａｍｉｄｅ‐８０カラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０
ｍｍ），ＵＶ２８０ｎｍ検出、溶離液：アセトニトリル
／水＝３：１ｖ／ｖ，流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ］：Ｒ
ｔ＝６．９ｍｉｎ 元素分析：Ｃ５２Ｈ８１ＮＯ３９として Ｃ Ｈ Ｎ 理論値（％） ４６．４６ ６．０７ １．０４ 実測値（％） ４６．２２ ５．９０ １．１８
【００４５】実施例５ α‐アミラーゼ活性の測定
（１） （１）基質液の調製 実施例３で得た２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝
４５，６５‐Ｏ‐（１‐メトキシ）エチリデン‐β‐Ｄ
‐マルトペンタオシド（Ｍｗ１０４０）を３．０ｍＭの
濃度になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐Ｍ
ｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
０）に溶解した。
【００４６】（２）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α‐グルコシダーゼ及びアーモンド由来
のβ‐グルコシダーゼをそれぞれ１１７ｕ／ｍｌ、１３
ｕ／ｍｌの濃度になるように４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２
ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．０）に混合して溶解した。なお、これら市販の
α‐及びβ‐グルコシダーゼは東洋紡績（株）製を使用
した。
【００４７】（３）標品α‐アミラーゼ液の調製 市販のヒトα‐アミラーゼ（Ｐ：Ｓ＝１：１）に精製水
を加え、０，１５４，３１０，４５９，５９１ＩＵ／ｌ
の濃度に溶解して標品α‐アミラーゼ液とした。なお、
この市販のヒトα‐アミラーゼは国際試薬（株）製キャ
リブザイム・ＡＭＹを使用した。また、α‐アミラーゼ
の活性は、３７℃、１分間に１μｍｏｌの２‐クロロ‐
４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ‐マルトペンタオシド（市
販品）を分解する酵素量を１国際単位（ＩＵ）として定
義した。
【００４８】（４）試料液の調製 α‐アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とした。固体の場合は通常、試料５００ｍｇを正
確に秤量し、精製水を加えて全量を５ｍｌとして試料液
とした。
【００４９】（５）検量線の作成 標品α‐アミラーゼ液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍ
ｌを加えてかきまぜ、３７℃で１分間加温したのち、基
質液２．０ｍｌを加えてかきまぜ、さらに３７℃で２分
間加温後からの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変
化量を測定した。各標品α‐アミラーゼ液の活性と、吸
光度の変化量の関係より検量線を作成した。その結果、
検量線の式はＵ＝１０．１・ΔＡ×１０３−２８．５
［Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、ΔＡ；吸光度の変化量］
となった。そのグラフを図１に示す。
【００５０】 （６）試料液中のα‐アミラーゼ活性の測定 試料液２５０μｌに共役酵素液１．０ｍｌを加えてかき
まぜ、３７℃で１分間加温したのち、基質液２．０ｍｌ
を加えてかきまぜ、さらに３７℃で２分間加温後からの
２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測定し
た。この測定値と（５）で作成した検量線から算出して
試料液中のα‐アミラーゼ活性の測定を行うことができ
る。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲
（０〜５４７ＩＵ／ｌ）を越えた場合は精製水を用いて
相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う。
【００５１】 実施例６ α‐アミラーゼ活性の測定（２） （１）基質液の調製 実施例４で得た４‐ニトロフェニル＝４７，６７‐Ｏ‐
（１‐エトキシ）エチリデン‐α‐Ｄ‐マルトヘプタオ
シド（Ｍｗ１３４４）を３．０ｍＭの濃度になるよう
に、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有
する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解し
た。
【００５２】（２）共役酵素液の調製 β‐グルコシダーゼを加えなかったこと以外は、実施例
５の（２）と同様の操作で、共役酵素液の調製を行っ
た。 （３）標品α‐アミラーゼ液の調製 （４）試料液の調製
【００５３】（５）検量線の作成 実施例５の（３）〜（５）と同様の操作で標品α‐アミ
ラーゼ液の調製、試料液の調製及び検量線の作成を行っ
た。その結果、検量線の式はＵ＝４．０４・ΔＡ×１０
4−６．８［Ｕ；酵素活性（ＩＵ／ｌ）、ΔＡ；吸光度
の変化量］となった。そのグラフを図２に示す。
【００５４】 （６）試料液中のα‐アミラーゼ活性の測定 実施例５の（６）と同様の操作で試料液中のα‐アミラ
ーゼ活性の測定を行った。
【００５５】実施例７ 耐共役酵素試験（１） （１）基質液（ア）の調製 実施例１で得た２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝
４５，６５‐Ｏ‐ジメトキシメチリデン‐β‐Ｄ‐マル
トペンタオシド（Ｍｗ１０５６）（以下本発明基質とい
う）を３．０ｍＭの濃度になるように、４０ｍＭ‐Ｎａ
Ｃｌ及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。
【００５６】（２）基質液（イ）の調製 市販の２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝β‐Ｄ‐マル
トペンタオシド（Ｍｗ９８４）（以下対照基質という）
を３．０ｍＭの濃度になるように、４０ｍＭ‐ＮａＣｌ
及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ＝７．０）に溶解した。 （３）共役酵素液の調製 酵母由来の市販α‐グルコシダーゼ及びアーモンド由来
のβ‐グルコシダーゼをそれぞれ１１００ｕ／ｍｌ、１
５．５ｕ／ｍｌの濃度になるように４０ｍＭ‐ＮａＣｌ
及び２ｍＭ‐ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ＝７．０）に混合して溶解した。なお、これら
市販のα‐及びβ‐グルコシダーゼは東洋紡績（株）製
を使用した。
【００５７】（４）共役酵素反応 共役酵素液１．０ｍｌを３７℃で５分間加温したのち、
本発明基質液又は対照基質液をそれぞれ２．０ｍｌ加え
てよく混合し、３７℃で３分間加温後から５分間、４０
０ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。その結果を
図３に示す。図３において◇印は基質液（ア）、□印は
基質液（イ）によるものである。図３から、本発明基質
は共役酵素と反応することなく、測定系内で安定に存在
することが分かる。
【００５８】実施例８ 耐共役酵素試験（２） 実施例３で得た２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝
４５，６５‐Ｏ‐（１‐メトキシ）エチリデン‐β‐Ｄ
‐マルトペンタオシド（Ｍｗ１０４０）を基質液（ア）
として用いたこと以外は、実施例７と同様の操作を用い
て行った。その結果を図４に示す。図４において◇印は
基質液（ア）、□印は基質液（イ）によるものである。
図４から、本発明基質は共役酵素と反応することなく、
測定系内で安定に存在することが分かる。
【００５９】実施例９ 測定試薬 （１）試薬の調製 精製水に以下に示す成分を、以下に示す濃度で溶解する
ことにより、試薬を調製した。
【００６０】 成 分 濃度 ２‐クロロ‐４‐ニトロフェニル＝４５，６５‐Ｏ‐ （１‐メトキシ）エチリデン‐β‐Ｄ‐マルトペンタ オシド １．５０ｍＭ α‐グルコシダーゼ ４０μ／ｍｌ β‐グルコシダーゼ ５．０μ／ｍｌ β‐グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０） ２０ｍＭ ウシ血清アルブミン ０．０５％
【００６１】（２）測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とする。固体
の場合は試料５００ｍｇを正確に秤量し、精製水を加え
て全量を５．０ｍｌとし、これを試料液とした。試料液
２５０μｌにあらかじめ３７℃で２分間加温した試薬
３．０ｍｌを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温した
のちの２分間の４００ｎｍにおける吸光度の変化量を測
定した。この測定値とあらかじめ作成した検量線から算
出して試料液中のα‐アミラーゼ活性の測定を行うこと
ができる。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適
用範囲（０〜５４７ＩＵ／ｌ）を越えた場合は精製水を
用いて相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行
う。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例５におけるα‐アミラーゼ活性の測定
に用いる検量線を示すグラフ。
【図２】 実施例６におけるα‐アミラーゼ活性の測定
に用いる検量線を示すグラフ。
【図３】 実施例７における本発明基質と対照基質との
測定系内での安定性を示すグラフ。
【図４】 実施例８における本発明基質と対照基質との
測定系内での安定性を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小谷 一夫 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一 化学薬品株式会社東京技術センター内 (72)発明者 齋藤 和典 東京都墨田区業平５丁目５番12号 第一 化学薬品株式会社東京技術センター内 (72)発明者 戸辺 光一朗 千葉県野田市野田339番地 盛進製薬株 式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07H 9/04 C07H 15/203 C12Q 1/40 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中のＸ１はメトキシ基又はエトキシ基、Ｘ２は水素
    原子、メトキシ基、エトキシ基又は置換若しくは非置換
    の炭化水素基、Ｒは水素原子、芳香族発色性基又はグル
    コース以外の単糖類の残基、ｎは２〜６の整数である）
    で表わされるアルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導
    体。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のアルコキシメチリデンマ
    ルトオリゴ糖誘導体を有効成分とするα‐アミラーゼ活
    性測定用試薬。
  3. 【請求項３】 α‐アミラーゼ含有試料に、請求項１記
    載のアルコキシメチリデンマルトオリゴ糖誘導体とα‐
    アミラーゼ活性測定用共役酵素を添加して酵素反応を行
    わせ、遊離する芳香族発色性化合物又は単糖類を定量す
    ることを特徴とするα‐アミラーゼ活性の測定方法。
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